T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI KRONİK CEP TELEFONU RADYASYONU VE KORUMA AMAÇLI UYGULANAN MELATONİNİN OVARYUMA ETKİSİ YÜKSEK LİSANS TEZİ SİNEM YÜCEL Tez Danışmanı Doç. Dr. Gülnur TAKE KAPLANOĞLU ANKARA Şubat 2014

2 T.C. GAZİ ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HİSTOLOJİ VE EMBRİYOLOJİ ANABİLİM DALI KRONİK CEP TELEFONU RADYASYONU VE KORUMA AMAÇLI UYGULANAN MELATONİNİN OVARYUMA ETKİSİ YÜKSEK LİSANS TEZİ SİNEM YÜCEL Tez Danışmanı Doç. Dr. Gülnur TAKE KAPLANOĞLU Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından SBE 01/ proje numarası ile desteklenmiştir. ANKARA Şubat 2014

3 Kabul Onay Sayfası i

4 İÇİNDEKİLER Kabul Onay Sayfası... i İçindekiler... ii Şekiller... iv Resimler, Grafikler... v Grafikler... x Semboller Ve Kısaltmalar... xi 1. GİRİŞ VE AMAÇ GENEL BİLGİLER Ovaryum Gelişimi Oogenezis Ovaryum Un Anatomisi Ovaryum un Yapısı Ovaryum un Damarları Ovaryum un Lenf Damarları Ovaryumun un Sinirleri Ovaryum Un Histolojisi Ovaryum Follikülleri Korpus Luteum Ovaryum Un Fizyolojisi GnRH, Gonadotropinler ve Ovaryumlar Üzerine Etkileri Ovulasyonda LH nın Etkileri Östrojen lerin İşlevleri Progestin lerin İşlevleri Elektrik Ve Elektromanyetik Alan Radyasyon İyonize Olmayan Radyasyon , İyonize Radyasyon Cep Telefonu Radyasyonu Radyasyon Hasarı ii

5 2.8. Melatonin Melatoninin Etki Düzeneği Melatoninin Antioksidan Özelliği Ovaryum Melatonin Etkileşimi GEREÇ VE YÖNTEM Deney Hayvanları ve Gruplandırma Deneyin Yapılışı Işık Mikroskobik Yöntem Hematoksilen Eozin Boyama Yöntemi İmmünohistokimyasal Yöntem TUNEL Yöntemi PCNA Yöntemi İstatistiksel Yöntem BULGULAR Işık Mikroskobik Bulgular İstatistiksel Bulgular TARTIŞMA SONUÇ ÖZET SUMMARY KAYNAKLAR EKLER Etik Kurul Onay Formu TEŞEKKÜR ÖZGEÇMİŞ iii

6 ŞEKİLLER Şekil 1. EMA uygulama düzeneği iv

7 RESİMLER, GRAFİKLER Resim 1A,B. Kontrol grubuna ait resimlerde stromada ( ) yaygın stromal hücreler, primer folliküllerin ( ) yanı sıra atretik folliküller ( ) ve korpus luteum ( ) izleniyor. Küçük büyütmeli resimlerde primer folliküller ( ), sekonder ( ) ve Graaf folliküllerinin ( ) yanında atretik folliküller ( ) de görülüyor (Hematoksilen-Eozin 1a x400, 1b x100) Resim 2. Kontrol grubuna ait çok sıralı granüloza hücre katmanı ( ) içeren primer folliküllerde gelişkin zona pellusida ( ), çekirdek ( ) ve çekirdekçiği (<) belirgin oosit I (ӿ) izleniyor. Teka internanın ( ) hücresel yapısı ve damarlanması ayırt edilirken teka eksternanın ( ) ovaryum stromasıyla karıştığı görülüyor (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 3. Kontrol grubuna ait resimlerde antrumu ( ) belirginleşmiş sekonder folliküllerde oosit I (ӿ), zona pellusida ( ) ve granüloza katmanı ( ) izleniyor. Ayrıca korpus luteum da ( ) normal hücresel yapısıyla dikkati çekiyor (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 4. Kontrol grubuna ait resimlerde Graaf follikülünde kumulus ooforus ( ) ve stratum granulozum ( ) gözlemleniyor. Zona pellusida ( ) ve oosit (ӿ) normal görünümde izleniyor (Hematoksilen-Eozin x400). 46 Resim 5. Kontrol grubunda korpus luteumda luteal hücreler ( ) belirgin (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 6A,B. Radyasyon uygulanan grupta primordiyal folliküller ( ), korpus luteum ve germinal epitel ( ) normal yapıda izleniyor. Aynı zamanda atreziye giden ( ) gelişen folliküller de dikkati çekiyor. Küçük büyültmeli resimlerde bir sekonder follikül ve atreziye giden oldukça fazla sayıda follikül gözleniyor (Hematoksilen-Eozin 6a x400, 6b x100) Resim 7A,B. Radyasyon uygulanan grupta çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer ( ) ve antrumu ( ) oluşmaya başlayan sekonder v

8 folliküllerde granüloza hücre katmanlarının özellikle orta bölgesinde dejenerasyona giden hücreler ( ) ayırt ediliyor. Yine bu folliküllerde zona pellusidanın ( ) kalınlı inceli bir düzende olduğu da dikkati çekiyor (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 8A,B. Radyasyon uygulanan grupta primer folliküllerde atreziye gidişin ( ) ilk belirtisi olarak oositin (ӿ) ve zona pellusidanın ( ) düzenleniminin bozulduğu ve bol miktarda apoptotik cisimcikler ( ) içerdiği ilgiyi çekiyor. Korpus luteum ( ) normal yapıda izleniyor (8a). Ayrıca yine atreziye giden ( ) bir Graaf follikülünün de çok sayıda apoptotik cisim ( ) içerdiği dikkati çekiyor (8b) (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 9A,B. Melatonin uygulanan grupta küçük büyültmeli resimlerde tüm ovaryum yapılarının normal görünüm sergilediği izleniyor. Büyük büyültmeli resimlerde oosit (ӿ), zona pellusida ( ), germinal epitel ( ), kumulus ooforus ( ) gibi ovaryum yapılarının kontrol grubu ile eşdeş olduğu gözlemleniyor (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 10. Melatonin uygulanan grupta büyük büyültmeli resimlerde germinal epitel ( ) ve primordiyal folliküller ( ) ile normal yapıda korpus luteum ( ) ayırt ediliyor (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 11A,B. Melatonin uygulanan grupta çok sıralı granüloza hücre katmanı ( ) içeren antrumu ( ) oluşmuş sekonder folliküllerde oosit (ӿ), zona pellusida ( ), teka interna ( ) ve eksterna ( ) katmanı belirgin (11a). Yine çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde oosit (ӿ), zona pellusida ( ) ve granüloza hücre katmanları ( ) gözlemleniyor (11b) (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 12. Melatonin uygulanan gruba ait büyük büyültmeli resimlerde kumulus ooforus ( ) ve antrum ( ) ile Graaf follikülü izleniyor (Hematoksilen-Eozin x400) vi

9 Resim 13. Melatonin uygulanan gruba ait büyük büyültmeli resimlerde teka interna ( ) ve eksterna ( ), korpus luteum ( ) normal yapıda ayırt ediliyor (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 14A,B. Radyasyon+ melatonin uygulanan grupta küçük büyültmeli resimlerde atreziye giden folliküller ( ) ayırt ediliyor. Büyük büyültmeli resimlerde yüzey epiteli ( ), primordiyal ( )ve primer ( ) folliküller belirgin (Hematoksilen-Eozin 14a x400, 14b x40) Resim 15. Radyasyon + melatonin uygulanan grupta çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde oosit (ӿ), zona pellusida ( ) ve granüloza hücre katmanı ( ) ile teka interna ( ) ve eksterna ( ) normal yapıda izleniyor. Korpus luteum da ( ) belirgin (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 16. Radyasyon + melatonin uygulanan grupta, antrumu ( ) oluşmaya başlamış erken evre sekonder follikülde zona pellusida daki ( ) düzensiz yerleşimin sürdüğü ancak granüloza hücre katmanının ( ) normal yapıda olduğu izleniyor (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 17. Radyasyon+ melatonin uygulanan gruba ait büyük büyültmeli resimlerde kumulus ooforusu ( ) oluşmuş tersiyer folliküllerde zona pellusidadaki ( ) düzensizliğin sürdüğü izleniyor (Hematoksilen-Eozin x400) Resim 18A, B, C, D. TUNEL ile boyanan kontrol (18a) ve melatonin uygulanan (18c) gruplarda pozitif hücrelerin oldukça az olduğu, radyasyon grubunda (18b) ise atretik folliküllerin yoğunluğuna koşut tutulumun arttığı görülüyor. Radyasyon + melatonin uygulanan grupta ise pozitif hücre yaygınlığının azaldığı gözlemleniyor ( ): apoptotik hücre ve cisimler. (TUNEL- metilen yeşili x400) vii

10 Resim 19A, B. PCNA immünohistokimya boyaması yapılmış kontrol grubunda primordiyal ( ) ve tek sıralı hücre katmanı içeren primer folliküllerde ( ) boyanmanın oldukça yoğun olduğu izleniyor (19a). Çok sıralı hücre katmanı içeren folliküllerde de tutulumun ( ) yaygınlığı gözlemleniyor (19b) (antipcna -Hematoksilen x400) Resim 20A, B. PCNA boyaması yapılan kontrol grubuna ait kesitlerde sekonder (20a) ve Graaf folliküllerinde (20b) oosit (ӿ) ve granüloza hücrelerinde ( ) yoğun boyanma izleniyor. Korpus luteumda ( ) ise boyanmanın az sayıda hücrede olduğu dikkati çekiyor. ( ): yoğun boyanma gösteren hücre çekirdekleri (antipcna- Hematoksilen x400).. 62 Resim 21. Radyasyon uygulanan grupların PCNA boyanmalarında primordiyal ( ), çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde ( ) ve korpus luteumda ( ) tutulumun kontrol grubuna karşın daha az olduğu izleniyor (antipcna- Hematoksilen x400) Resim 22. Radyasyon uygulanan grupta atreziye giden folliküllerde ( ) hücrelerin daha PCNA pozitifliğe doğru gittiği, teka interna da ( ) da aynı görünüm sergilediği izleniyor (antipcna- Hematoksilen x400) Resim 23. Melatonin uygulanan grupta PCNA boyamasının, oosit (ӿ), teka interna ( ) ve eksternada ( ) kontrol grubuna eşdeş olduğu görülüyor (antipcna- Hematoksilen x400) Resim 24. PCNA ile boyanan melatonin uygulanan grupta büyük büyültmeli resimlerde oosit (ӿ), teka interna ( ) ve eksterna ( ), korpus luteumdaki ( ) boyanmanın kontrol grubu ile eşdeş olduğu görülüyor (antipcna- Hematoksilen x400) Resim 25. Melatonin uygulanan grubun PCNA boyanmalarında primordiyal folliküller ( ) ve primer folliküllerde ( ), oosit (ӿ) ve granüloza viii

11 hücre katmanındaki ( ) tutulumun kontrol grubuna eşdeş olduğu izleniyor (antipcna- Hematoksilen x400) Resim 26. Radyasyon + melatonin uygulanan grupta çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde PCNA tutulumunun granüloza hücrelerinde ( ) ve teka interna da ( ) arttığı izleniyor (antipcna- Hematoksilen x400) Resim 27. Radyasyon + melatonin uygulanan grupta PCNA tutulumu çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde oosit I (ӿ) ve granüloza hücre katmanında ( ) izlenirken, atretik folliküllerde ( ) de belirgin immünreaktivite görülüyor (antipcna- Hematoksilen x400) ix

12 GRAFİKLER Grafik 1. Gruplar arasında Wistar albino cinsi dişi sıçanların vücut ağırlıklarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Grafik 2. Gruplar arasında ovaryum dokusu ağırlıklarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Grafik 3A. Gruplar arasında zona pellusida kalınlığı ortalamalarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Grafik 3B. Gruplar arasında zona pellusida kalınlığı ortalamalarında %5 lik hata çubukları ile betimleyici istatistikler Grafik 4A. Gruplar arasında primordiyal follikül sayılarının ortalamalarının istatistiksel olarak değerlendirmesi Grafik 4B. Gruplar arasında primordiyal follikül sayılarının %5 lik hata çubukları ile betimleyici istatistikler Grafik 5A. Gruplar arasında gelişen follikül sayılarının ortalamalarının istatistiksel olarak değerlendirmesi Grafik 5B. Gruplar arasında gelişen follikül sayılarının ortalamalarında %5 lik hata çubukları ile betimleyici istatistikler Grafik 6A. Gruplar arasında atretik follikül sayılarının ortalamalarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Grafik 6B. Gruplar arasında atretik follikül sayılarının ortalamalarında %5 lik hata çubukları ile betimleyici istatistikler Grafik 7A: Gruplar arasında korpus luteum sayısı ortalamalarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Grafik 7B: Gruplar arasında korpus luteum sayısı ortalamalarında %5 lik hata çubukları ile betimleyici istatistikler x

13 SEMBOLLER ve KISALTMALAR 3G ELF EMA EMR GSM GHz FSH GnRH GSH GSH-Px GÜDAM Hz LH MEL MHz NAT NO PAS PBS PKC RF SOD SAR UV : Üçüncü nesil : Çok düşük frekans : Elektromanyetik alan : Elektro manyetik radyasyon : Global system for mobile communications : Gigahertz : Follikülleri uyarıcı hormon : Gonadotropin serbestletici hormonu : Glutatyon : Glutatyon peroksidaz : Gazi Üni. Laboratuvar Hayvanları Yetiştirme ve Deneysel Araştırma Merkezi : Hertz : Lüteinleştirici Hormon : Melatonin : Megahertz : N-Asetiltransferaz : Nitrik oksit : Periyodit Asit Scift : Phosphate Buffer Serum : Protein Kinaz C : Radyofrekans : Süperoksit Dismutaz : Spesifik Absorbsiyon Oranı : Ultra Viyole xi

14 1. GİRİŞ VE AMAÇ Günümüzde küreselleşme ve ilerleyen teknolojiye koşut; televizyon, radyo, baz istasyonu, cep telefonu, telsiz ve kablosuz telefonlar gibi iletişim araçlarının kullanımı da yaygınlaşmıştır. Son yıllarda özellikle cep telefonu kullanımının artışı sonucu, kapsama alanlarının genişletilmesi ereğiyle baz istasyonlarının sayısı ve yaygınlığı artmıştır. Zararlı düzeyde EMA (elektromanyetik alan) oluşturan bu kaynaklar, vücuda çok yakın aralıkta tutulduğu için başta insanlar olmak üzere tüm canlıları etkilemektedir. 1,2 Cep telefonları iletişimi, farklı elektromanyetik sinyaller kullanarak sağlar ve bu sinyaller bulunduğu çevrede yoğun bir EMA oluşturur. EMA nın insan sağlığı üzerine olumsuz etkilerinin olabileceği düşüncesiyle birçok çalışma yapılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda EMA nın oksidatif stres, kanser, Parkinson ve Alzheimer gibi nörodejeneratif hastalıkların artışına neden olduğu, bunların yanı sıra depresyon, davranış değişikliği gibi sinirsel fonksiyonlara etki ettiği, ayrıca bağışıklık, endokrin ve üreme sistemlerine de olumsuz etkilerinin olduğu bildirilmiştir. 3,4,5,6 Düşük şiddette EMA lara etkin kalmanın hücre bölünmesi, biyomoleküllerin sentezi ve kanser oluşumu üzerine etkili olduğu, protein metabolizmasının, vücuttaki hormonal ve immün yanıtın etkilendiği gözlemlenmiştir. 7,8,9 Tüm bu etkiler göz önüne alındığında cep telefonlarının neden olduğu EMA ile ilgili daha çok araştırma yapılıp bu konudaki mevcut bilgilerin daha üst noktalara taşınması gerekmektedir. Elektromanyetik alana etkin kalma sonucunda dokularda oluşan hasar, reaktif oksijen moleküllerinin aşırı üretimine ve dokuların prooksidant/antioksidant dengesinin değişmesine bağlıdır. Bu hasarların etkilerinin azaltılması ya da tümüyle ortadan kaldırılması için süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GSH-Px), glutatyon 1

15 (GSH), vitamin A, vitamin C, vitamin E ve melatonin gibi antioksidan maddeler kullanılmaktadır. 10,11 Melatonin, hücresel antioksidan savunma sistemini uyarır ve prooksidatif enzim miktarlarının azalmasını sağlar. 12 Melatonin yağda ve suda eriyebildiği için kolaylıkla dokulara girerek, hidroksil ve lipit radikallerini uzaklaştırır, aşırı toksik etkiye sahip hidroksil ve peroksil radikallerini detoksifiye eder. Serbest radikalleri doğrudan uzaklaştırabilme erki yanında diğer endojen antioksidan etki düzeneklerini de uyardığı bildirilmiştir. 10,11,13,14,15 Epifiz bezinin salgısı olan melatoninin (MEL) endokrin ve sirkadiyen ritim üzerine olan etkilerinden ayrıcalı olarak, in vivo in vitro antioksidan etkiye de sahip olduğu gösterilmiştir. MEL in antioksidanlar içerisinde en güçlü radikal tutucu olduğu ileri sürülmekte, bu nedenle ilgi giderek artmakta ve antioksidan özelliği gün geçtikçe önem kazanmaktadır. 10,11 Kaynak verilerinden yola çıkarak çalışmamızda elektromanyetik alana kronik olarak etkin kalmanın ovaryum dokusunda oluşturabileceği yapısal değişimler ve bunlara melatonin in koruyucu etkisinin incelenmesi amaçlandı. Bu erekle doku örneklerine hematoksileneozin, TUNEL ve PCNA immünohistokimya boyamaları yapılarak ovaryum dokusundaki yapısal değişimler incelendi. Ayrıca, follikül sayımı yapıldı ve Periodik Asit Schiff (PAS) boyaması yapılan kesitlerde zona pellusida kalınlığı ölçülerek istatistiksel veriler değerlendirildi. 2

16 2. GENEL BİLGİLER 2.1 Ovaryum Gelişimi Gonadlar başlangıçta kölom epitelinin çoğalması ve altındaki mezenşimin yoğunlaşmasıyla oluşan, bir çift gonadal kabartı şeklinde belirir. İlkel üreme hücreleri, gelişimin 2. haftasında epiblasttan (embriyonik primer endoderm) köken alırlar. Daha sonra epiblasttan ayrılarak ameboid hareketlerle önce embriyonun kaudalinde yerleşik ekstraembriyonik mezodermde ardından vitellus kesesi duvarı endoderminde izlenirler. 4. haftada son bağırsağın mezenterinin dorsali boyunca ilerleyerek 5.haftanın başında ilkel gonadlara ulaşırlar. Gelişimin 6.haftasına değin gonadal kabartılarda üreme hücreleri görülmez. 6. haftada gonadal kabartıları işgal ederler. Bu hücreler genital kabartılara ulaşamadıklarında gonadlar gelişemez. 16,17 İlkel üreme hücrelerinin gonadlara ulaşmasından hemen önce ve ulaşması sırasında, genital kabartının epiteli çoğalır ve epitel hücrelerinin altındaki mezenşimin içine gömülürler. Düzensiz şekilli ilkel cinsiyet kordonlarını oluşturur. Kordonlar yüzey epiteliyle bağlantılıdır ve bu evrede dişi ya da erkek gonadların birbirinden ayırt edilmesi olanaksızdır. Bu nedenle bu evreye farklanmamış evre, bu gonada ise farklanmamış gonad denir. 16 Embriyonun cinsiyeti, döllenme sırasında genetik olarak belirlenmiş olmasına karşın, gelişimin 7. haftasına değin gonadlar erkek ya da dişi yapısal özelliklerine sahip değillerdir. Cinsiyetin farklanması çok sayıda genin rol aldığı karmaşık bir süreçtir. Farklanmamış gonadlar, gelişimin 7. haftasında Y kromozomu üzerinde bulunan ve testis belirleyici faktörü kodlayan SRY geninin etkisiyle farklanırlar. Testis belirleyici faktörün yokluğunda ise gonadlar ovaryuma farklanır. 7. haftada yüzey 3

17 epitelinden köken alan hücre kordonları alttaki mezenşim içine gömülür. Bunlar yüzeye yakın yerleşirler ve ikincil kordonlar olarak adlandırılırlar. 4. ayda bu kordonlar bir ya da daha çok sayıda ilkel üreme hücresini çevreleyen izole hücre toplulukları haline gelirler. Bu üreme hücreleri zamanla oogonyumlara dönüşürken yüzey epitelinden aşağıya göç eden ve üreme hücrelerini çevreleyen epitel hücrelerinden de folliküler hücreler oluşur. 16, Oogenezis Doğum Öncesi (Prenatal) Olgunlaşma İlkel üreme hücreleri, dişi gonada ulaşır ulaşmaz genetik olarak oogonyumlara farklanırlar. Peşpeşe geçirdikleri mitotik bölünmelerle çoğalan oogonyumlar 3. ayın sonunda kümeler halinde dizilir, yüzey epitelinden köken alan yassı epitel hücreleriyle çevrelenirler. Bu yassı epitel hücreleri follikül hücreleri olarak isimlendirilir. Oogonyumların çoğu mitozla bölünürken, bir kısmıda büyüyerek primer oositlere farklanır. Primer oositler hemen DNA larını bir kat arttırarak birinci mayoz bölünmenin profaz evresine girerler. Birkaç ay içinde oogonyumların sayısı hızlı bir artış gösterir ve gelişimin 5. ayında ovaryum içindeki üreme hücrelerinin sayısı yaklaşık 7 milyona ulaşır. Bu evreden sonra başlayan hücre yozlaşmasıyla, oogonyumların ve primer oositlerin büyük çoğunluğu atretik hale gelir. 7. ayda yüzeye yakın yerleşen birkaçı dışında büyük kısmı yozlaşır. Canlı kalan primer oositlerin tamamı birinci mayoz bölünmeye girmiş ve her biri ayrı ayrı tek katlı yassı epitel hücreler ile çevrelenmiştir. Ortada bir primer oosit ve bunu çevreleyen tek katlı yassı epitel hücreleriyle çevrili yapı primordiyal follikül olarak isimlendirilir. Primordiyal follikül çevresindeki dokudan belirgin bir bazal lamina ile ayrılmıştır. 16,17,18,19 4

18 Doğum Sonrası (Postnatal) Olgunlaşma Doğumda, tüm primer oositler birinci mayoz bölünmenin profaz evresindedir. Primer oositler çekirdek kromatinin seyrek ve düzensiz bir yapılaşma gösterdiği birinci mayoz bölünmenin profaz evresinin diploten dönemine girerler ve puberteye değin dinlenme halinde kalırlar. Bu süre boyunca, oosit olgunlaşması follikül hücrelerince salgılanan oosit olgunlaşmasını baskılayan madde (OMI, oocyte maturation inhibitor) ile engellenir. Doğumda ovaryumlardaki primer oositlerin sayısının, yaklaşık ile arasında değişir. Puberteye değin primer oositlerin çoğu atretik hale geldiğinden, puberte başlangıcındaki bu sayı e düşer ve 500 den daha azı üreme döngüsü içinde ovulasyonla atılır. Geç olgunlaşan oositlerin bazıları 40 yıl süresince I. Mayoz bölünmenin profaz evresinde bekler. Pubertenin başlamasıyla dişi gonad primordiyal folliküllerden zengin bir havuz işlevi görür. Her ovariyal döngüde buradan seçilen 5 ile 15 arasında değişen primordiyal follikül, primer (preantral), sekonder (antral) ve tersiyer (Graaf, preovulatuar) olarak isimlendirilen 3 aşamadan geçerek olgunlaşmaya başlar. Pubertede GnRH salınımının başlaması hipofizden FSH ve LH salınımını uyarır. Hipofiz hormonlarının etkisiyle ovaryumda gün süren ovariyal döngü olaylanır. Her döngüde FSH etkisiyle 5-15 adet folikül gelişmeye başlasa da bunlardan ancak bir tanesi tam anlamıyla olgun hale gelir. Diğerleri atretik follikülleri oluşturur. Hangi folikülün o ay büyüme evresine gireceği ve hangisinin baskın folikül olarak seçileceğini belirleyen faktörler henüz bilinmemektedir. 20 Preovulatuar evre ortalama 37 saat sürer. En uzun evre ise antral follikül evresidir. Mayoz bölünmenin diploten evresinde dinlenme aşamasında olan primer oosit büyümeye başlar. Bu folliküle gelişen (unilaminar) primer follikül denir. Oositi çevreleyen yassı epitel hücreleri önce kübikleşir, daha 5

19 sonra kübik biçimli follikül hücreleri çoğalarak çok sıralı granüloza hücre katmanını (stratum granulozum) oluştururlar. Bu folliküle multilaminar (preantral) primer follikül denir. 16,21,22 Granüloza hücreleri bir bazal lamina üzerine oturmuşlardır. Bunun da çevresi teka foliküli katmanı ile sarılıdır. Bu süreçte, granüloza hücreleri ve oosit glikoprotein yapıda bir madde salgılayarak, homojen, koyu boyanan ve asidofilik özellikte bir katman olan zona pellusida yı oluştururlar. 21,22 Primer follikül çevresinde, stromal hücre ve bağ dokusu yoğunlaşarak teka follikülüyü yapar. Follikül büyümeyi sürdürürken teka folliküli hücreleri, dışta fibroblast benzeri hücreler içeren bağ dokusu yapılı, fibröz bir kapsül olan teka eksterna, içte salgı yapan hücrelerden oluşan teka interna denilen iki belirgin katman halinde farklanır. Aynı sürede oositin çevresindeki follikül hücreleri küçük sitoplazmik uzantılarını, zona pellusida yı geçerek oositin zarının mikrovilluslarıyla iç içe geçirir. 16,17,18,19 Gelişimin ilerleyen evrelerinde granüloza hücreleri arasındaki boşluklara sıvı (likör folikülü) birikmeye başlar. Bu boşlukların birleşmesiyle antrum oluşur. Bu hale gelen foliküle sekonder (veziküler) follikül denir. Olgun bir sekonder follikül içte steriot salgı yapan hücrelerden oluşan teka interna ve bunun dışında teka eksterna ile sarılıdır. Oositi çevreleyen granüloza hücreleri, antrumun bir yanında kalarak kümulus ooforus u oluştururlar. Follikül ovulasyona yaklaştıkça büyür ve tersiyer (Graaf, preovulatuar) follikülü ismini alır. 16,17,18,19,23 Sekonder follikül olgunlaştıktan sonra lüteinizan hormonun (LH) etkisiyle ovulasyon öncesi (preovulatuar ) evreye girer. Primer oosit I. Mayoz bölünmeyi tamamlayarak her biri 23 çift yapılı (2n DNA) kromozom içeren, büyüklükleri birbirinden farklı 2 yavru hücre oluşturur. Bu hücrelerden biri sitoplazmanın büyük kısmını alan sekonder oosit, diğeri ise az sitoplazma içeren 1. kutup cismidir. 1. kutup cismi oositin hücre zarıyla zona pellusida arasındaki perivitellin aralıkta bulunur. I. mayoz 6

20 bölünme ovulasyondan hemen önce tamamlanır ve sekonder oositin çekirdeği DNA eşleşmesi olmaksızın II. mayoz bölünmeye girer. Ovulasyondan 3 saat önce, kromozomlar metafaz plağında dizildiklerinde ovulasyon gerçekleşir ve oosit II ovaryumdan dışarıya atılır. Oosit II ancak bir spermiyumla döllendiğinde II. mayoz bölünme tamamlanır. Döllenme olmadığında ovulasyondan 24 saat sonra oosit II dejenere olur. Bu arada birinci kutup cismi de bölünebilir. 2.2 Ovaryum un Anatomisi Ovaryum un Yapısı Kadın üreme hücresini üreten esas üreme organı olan ovaryumlar uterusun her iki tarafında lateral pelvik duvarlara yakın konumda fossa ovarica (krause çukuru) denilen çukurlara yerleşmiş, cm uzunluğunda, 2-3 cm genişliğinde, cm kalınlığında ve 3-5 gr ağırlığında, iri badem büyüklüğünde bir çift organdır. 24 Fossa ovarica, a. iliaca externa, a. iliaca interna ve lig. latum uteri arasında yer alır. 25,26,27 Bu çukur, arkadan üreterler ve vasa iliaca interna, önden oblitere umblikal arterler, alt-ön taraftan lig. latum uteri nin tabanı, yukarı-ön taraftan a. iliaca externa sınırları içerisindedir. Peritoneum un altından a.-v.obturatoria ile n. obturatorius geçer. 28 Ovaryumlar puberteye değin en dıştan periton ile örtülüdür. Periton, tek katlı yassı epitel yapısında olup düz ve parlaktır. Puberteden sonra ovaryum ların periton yapısı değişir ve germinal (Waldeyer katmanı) epitel olarak adlandırılan kübik hücre katı ile sarılır. Epitel katmanının altında, yaş ilerledikçe kalınlaşan tunica albuginea bulunur. Ovaryumla içte medulla ovarii, dışta korteks ovarii denilen 2 bölümden oluşurlar. Medulla ovarii den gelen bağ dokusu uzantıları, hilum ovarii de damarların 7

21 çevresindeki bağ dokusu ile devam eder. Hilum ovarii den içeri giren damarların çoğu, korteks ovarii içine doğru dağılır. Burada gelişen folliküller çevresinde kapiller ağlar oluştururlar. Medulla ovarii korteks ovarii ye karşın daha gevşek bir yapıya sahiptir. Korteks ovarii, ovaryumun her tarafını bir kabuk şeklinde sarar. Korteks değişik gelişim evrelerindeki follikülleri içerir. 25,29 Embriyonal yaşamın başında ovaryumlar intraabdominal yerleşimli olmalarına karşın, 2. aydan itibaren pelvis boşluğuna inmeye başlarlar ve fossa ovarica ya yerleşirler. Gebelik süresince büyüyen uterus, ovaryumları karın boşluğuna doğru iter ve doğumdan sonra gevşemiş lig. latum uteri nin etkisiyle claudius çukuruna (fossa pararectalis) doğru sarkmış durumdadırlar. Fossa pararectalis üreterin arkasında, pelvis arka duvarının önünde yer alan kısımdır. 28,30 Ovaryumların anatomik olarak, facies medialis ve facies lateralis olarak iki yüzü extremitas tubaria ve extremitas uterina olarak iki ucu ile margo liber ve margo mesovaricus olmak üzere iki kenarı vardır. 25,26,27,30,31,32 Facies medialis: Pelvis boşluğuna bakan ve tuba uterina ile örtülü olan bu yüz, sigmoid kolon (colon sigmoideum) ve ince bağırsak (intestinum tenue) ile komşudur. Facies lateralis: Ovaryum un pelvis duvarına bakan yüzüdür. Paryetal periton( peritoneum parietale) aracılığıyla facies lateralis, fossa ovarica denilen çukurcuğa yerleşmiştir. 30 8

22 Margo liber: Serbest ve hareketli olan arka kenar, ön kenara karşın daha içbükey ve künttür. Margo liber a.iliaca interna, v. iliaca interna ve üreter ile komşuluk yapar. 25,30,32 Margo mesovaricus: Bu kenara lig. latum uteri nin bir bölümü olan mesovarium tutunur. Arka kenara karşın, daha ince olan bu ön kenarda, hilum ovarii bulunur ve a. umbilicalis in artığı ile komşudur. Mesovariumun iki yaprağı arasında bulunan damar ve sinirler ovaryum a, hilum ovarii den girer ve çıkarlar. 25,30,31,32 Extremitas tubaria: Tuba uterina nın infundibulum parçası ile komşu bu kısma fimbria ovarica ve lig. suspensorium ovarii tutunur. Lig. suspensorium ovarii, iliac damarların ön tarafında yukarı doğru uzanan bir periton katlantısı olup, elastik lifler ve düz kas lifleri içerir. İçinde a. ve v. ovarica gibi ovaryum un damarları ve sinirleri bulunur. 25,27,30,31,32 Extremitas uterina: Aşağı pelvis döşemesine doğru yönelerek, lig. ovarii proprium aracılığı ile uterus un cornu uteri sine tutunur. Lig. ovarii proprium gubernaculum artığının bir bölümü olup, lig. latum uteri içinde bulunur ve bol miktarda elastik ve düz kas lifleri kapsar. 25,30,32, Ovaryum un Damarları Ovaryum un Arterleri Ovaryumlar aorta abdominalisten çıkan sağ ve sol a. ovarica dan beslenirler. A. ovarica, lig. ovarii suspensorium içinde ilerler ve mesovarium a gelir ve a.uterina nın bir dalı olan ramus ovaricus ile anastomoz yapar. 33,34 Hilum ovarii den ovaryuma giren arter, folliküllerin 9

23 çevresinde zengin kapiller ağlar oluşturur. Damarlar folliküllerin gelişimi sırasında genişler, ovulasyondan sonra daralırlar Ovaryum un Venleri Venler, arterlerle birlikte hilum ovarii den çıkarlar. Lig. latum içerisinde plexus palpiniformis denilen venöz bir ağ oluştururlar. Bu venler birleşerek v. ovarica yı oluştururlar ve sağ v. ovarica v. cava inferior a, sol v. ovarica da v. renalis e açılır. 25, Ovaryum un Lenf Damarları Lenf damarları lenf kapillerleri olarak başlarlar ve a.-v. ovarica ile birlikte uzanırlar ve nodi Iymphatici preaortici ve nodi Iymphatici aortici lateralis lere açılırlar. 25,28, Ovaryumun un Sinirleri Ovaryum un sinirleri, plexus hypogastricus inferior ve a. ovarica nın çevresindeki plexus ovaricus tan gelir. Parasempatikleri 10. kafa çifti n. vagus tan, sempatikleri ise n. splanchnicus minör ve bir kısım torakal medulla spinalis segmentlerinden gelir Ovaryum un Histolojisi Ovaryum da dıştan içe doğru 3 katman gözlenir: 1- Epithel ( Epitel katı) : Ovaryumun dış yüzeyini örten bu katman puberte öncesi evreye değin çok katlı yassı epitel ile örtülüdür. Daha sonra, periton un mezotelinden farklanan bu epitel tek katlı kübik hale dönüşür ve germinal epitel (epithelium germinativum) olarak adlandırılır. Epitelin peritona bakan üst yüzeyinde çok sayıda mikrovillus 10

24 ve hücre sitoplazmasında çekirdek çevresinde iyi gelişmiş organeller gözlenir. Ayrıca hücrelerin yan yüzlerinde desmozom tipi bağlantı birimleri bulunur. 18,40,41,42,43 2- Tunika albuginea: Epitel de belirgin bir bazal membran ile ayrılan bu katman ovaryum a beyazımsı rengini veren sıkı bağ dokusu yapısındadır. Yaş ilerledikçe kalınlaşıp sertleşen tunika albuginea, damardan yoksundur ve ovaryum yüzeyine koşut yerleşmiş kollajen fibriller içerir. 18,40,41,43,44 altında bulunur. 3- Ovaryum stroması: Tunika albuginea katmanının Ovaryum lar, aralarında kesin bir sınır olmamakla birlikte, dışta korteks, içte medulla bölümlerinden oluşur. 41 a- Korteks (cortex ovarii) : Ovaryum un esas işlevsel bölümüdür. Hilus dışında ovaryum un tüm çevresini sarar, hücrelerden zengin sıkı bağ dokusu yapısındadır. Korteks, değişim gelişim aşamalarındaki ovaryum follikülleri, korpus luteum, korpus albikans ve atretik follikülleri içerir. Bu yapıların arasında kollajen, elastik lifler, retiküler lif ağları ve mekik şeklinde stromal hücreler bulunur. Stromal hücrelerin, fibroblastlardan ayrıcalı olarak hormon salgılayan teka interna hücrelerine dönüşebilme yetileri vardır. 34,41,42 b- Medulla (medulla ovarii) : Kan, lenf damarları, sinirler ve elastik liflerden zengin, düz kas hücreleri içeren fibroelastik gevşek bağ dokusu yapısındadır. Menstrüasyon öncesi insan ovaryum medullasında östrojen salgılayan epiteloit interstitial hücreler bulunur. Küçük adacıklar şeklinde hilusta gözlenen hilus hücreleri de bir diğer epiteloit hücre 11

25 grubunu simgelerler. Hilus hücreleri, testiste bulunan Leydig hücrelerine benzerler ve androjen salgılarlar. 22,34,42,45,46 bulunur. Bunlar; Ovaryum Follikülleri Ovaryum korteksinde histolojik olarak 3 esas tip follikül 1- Primordiyal Follikül 2- Büyüyen Follikül a- Primer Follikül Unilaminar( tek katmanlı) primer folliküller Multilaminar (çok katmanlı) primer folliküller b- Sekonder (Antral) Follikül 3- Olgun (Graaf) Follikül Primordiyal Folliküller Follikül gelişiminin en erken aşaması olan primoriyal folliküller fötal yaşamın 3. ayında belirirler. Oosit ve onu çevreleyen tek katlı yassı follikül hücrelerinden oluşan primordiyal folliküller, ovaryumda korteks stroması içinde bulunurlar. Follikül hücreleri, birbirlerine desmozomlarla tutunmuşlardır. Korteks stromasından belirgin bir bazal lamina ile ayrılmışlardır. Oosit çekirdeği ökromatiktir. Bir ya da daha fazla çekirdekcik içerir. Çekirdek periferal yerleşiktir. Oosit sitoplazmasında, Golgi kompleksi ve vezikülleri, endoplazmik retikulum tubulusları çok sayıda mitokondriyon ve lizozomların birikmesiyle oluşmuş Balbiani cisimciği bulunur. (19,44,46,47). 12

26 Büyümekte Olan Folliküller Puberte ile birlikte bir grup primordiyal follikül, foliküler büyüme olarak isimlendirilen; oosit, granüloza hücreleri ve follikülleri çevreleyen stromadaki hücresel değişimleri kapsayan bir sürece girer. Çok sayıda primordiyal follikül içinden, büyüme sürecine giren folliküllerin nasıl seçildiği henüz tam olarak bilinmemektedir. Folliküllerin büyümesi, hipofiz bezinden salgılanan FSH (follikül uyarıcı hormon) tarafından gelen uyarıyla folliküllerin bir kısmının follikül havuzunu terk etmesi ile başlar. Follikül büyümesi dişi üreme sürecinin herhangi bir evresinde başlayabilir Primer Folliküller Oosit büyümesinin en hızlı olduğu dönem folliküler büyümenin birinci evresidir. Bu süreçte oositte ve stromada değişimler oluşur. Öncelikle oosit çapı genişler ( mikrometre), oositi saran follikül hücreleri kübikleşir. Bu aşamadaki follikül unilaminar primer follikül ismini alır. İlerleyen zamanlarda mitoz bölünme ile çoğalan follikül hücreleri çok katmanlı bir yapı halini alırlar ve multilaminar primer follikülü oluştururlar. Çoğalan follikül hücrelerinin oluşturduğu katmana granüloza katmanı denir. Bu aşamadaki follikül hücreleri de granüloza hücreleri olarak isimlendirilir. 42,47,48,49,50,51 Granüloza katmanı hücreleri birbirleriyle sıkı bağlantılar oluşturmazlar. Burada oluklu bağlantılar bulunur. Kan damarları ile follikül sıvısı arasına madde alış verişi bu bağlantılarca gerçekleştirilir. Oosit ve follikülün normal gelişimi için bu madde alış verişi gereklidir. 19 Oosit olgunlaşırken organel dağılımında da değişimler olur. Çekirdek büyür, mitokondriyonların sayısı artar ve sitoplazmada eşit 13

27 olarak dağılırlar, serbest ribozomların, granülsüz endoplazmik retikulum tubuluslarının sayısı artar ve tubuluslar genişler. Golgi kompleksi hücre yüzeyinin hemen altına göç eder. 42,47,48,49,50,51 Granüloza hücreleri çoğalırken, stroma hücreleri de follikülü bağ dokusundan oluşan bir kılıfla sararak teka follikülü katmanını oluşturur. Teka follikülü 2 katmana ayrılır. Teka interna, iç tarafta bulunan, damardan zengin ve salgı yapan kübik hücrelerden oluşan kattır. Çok sayıda LH reseptörü içeren bu hücreler farklılaşarak steroid üreten hücrelere dönüşürler ve LH uyarımına yanıt olarak, östrojen öncülü androjenleri sentezler ve salgılarlar. Teka interna da, bunların dışında fibroblastlar, kollajen lifler ve zengin bir damar ağı bulunmaktadır. Teka eksterna, içerdiği kollajen demetler ve düz kas hücreleriyle kapsül işlevi gören, fibröz bağ doku yapısındaki dış tabakadır, derece derece ovaryum stromasıyla karışır. Damarsız granüloza hücre katmanıyla teka interna arasındaki sınır, bazal lamina ve sınır hücrelerinin yapısal farkları nedeniyle oldukça belirgindir. 19,42 Bu değişimlerle eş zamanlı olarak, follikül gelişimi sırasında oosit kendi çevresinde, kalın, amorf bir örtü olan, glikozaminoglikan ve glikoproteinlerden zengin zona pellusida (zp) yı oluşturur. Zona pellusida büyümekte olan oosit ve çevresindeki follikül hücrelerince sentezlenirler. Zona pellusida, oositin çapı mikrometreye ulaştığında ışık mikroskobunda görülebilen, homojen, asidofilik, PAS (+) ve jel kıvamında bir yapıdır. 19,43 Zona pellusida 3 farklı proteinden oluşur. Bu proteinler; 200kDa ağırlığında ve dimerik yapıda olan ZP1, 120kDa ağırlığında olan ZP2 ve 83 kda ağırlığında olan ZP3 tür. ZP2 ve ZP3 proteinleri düzenli aralıklarla ZP1 dimerleri aracılığıyla birbirlerine bağlanarak uzun filament 14

28 komplekslerini oluştururlar. Spermiyum bağlanması sırasında, ZP3 e bağlı olan oligosakkarit zincirleri spermiyum reseptörleriyle etkileşirler ve akrozomal tepkimeye girmiş spermiyum ZP3 e bağlanır. Böylece proteazlar, hiyalüronidazlar ve sperm akrozomunda bulunan diğer maddeler salınır ve spermiyum zona pellusida yı aşarak oositin plazma zarına ulaşır Sekonder ( Antral) Follikül Büyüme sürerken follikül içinde antrum olarak adlandırılan sıvı dolu bir boşluk oluşur. Follikül sıvısı (likör foliküli), kan damarlarından plazmanın sızması sonucu ortaya çıkan plazma bileşenlerini, büyüme faktörlerini, gonadotropinleri, glikozaminoglikanları, steroid bağlayıcı proteinleri ve yüksek yoğunlukta steroidleri kapsar. 22,35 Bu evredeki folliküle sekonder ya da antral follikül denir. Bu evrede oositler yaklaşık olarak 120mikrometre çapına ulaşırlar ve büyümeleri, granüloza hücrelerince antral sıvıya salınan oosit olgunlaşmasını baskılayan madde (OMI) tarafından engellenir. 52 Folliküler gelişim sürdükçe granüloza hücre katmanı oositi çevreleyen bölge dışında her yerde aynı kalınlıktadır. Oositi çevreleyen granüloza hücreleri ise daha yoğun bir şekilde birikerek kümülüs ooforus denilen bir tepecik oluştururlar. Ovulasyondan sonra kumulus ooforusun oosit evresindeki ilk sıra hücreler korona radiyatayı biçimlendirirler. Bu katman ile oosit, oluklu bağlantılarla sürekli iletişim halindedirler. Bu iletişim nedeniyle kümülüs-oosit bileşkesi (COC) ismini alırlar. Folliküller belli bir çapa ulaştıktan sonra gelişimlerini sürdürebilmek için gonadotropinlere gereksinim duyarlar ve canlı türüne göre değişiklik gösterecek şekilde yeterli hormonun etkisiyle follikül seçilerek gelişimini son aşamaya kadar sürdürür. 19,53 15

29 Graaf (Olgun- Preovulatuar) Follikül Olgun primer oosit içeren, yaklaşık 10 mm veya daha fazla çapa ulaşan folliküller Graaf ya da preovulatuar follikül olarak isimlendirilir. LH hormonunun etkisiyle teka interna hücrelerinde androjen üretimi tetiklenir. Östrojen öncülleri olan bu androjenler FSH ın etkisiyle östrojenlere dönüştürülürler ve artan östrojen düzeyi granüloza hücrelerinin çoğalmasını buna koşut olarak da follikülün genişlemesini artırır. Follikül gelişiminin son aşaması olan Graaf follikülü oldukça büyük olması nedeniyle ovaryum korteksinin tüm kalınlığınca uzanır ve bir miktar da ovaryum yüzeyinde çıkıntı yapar. Follikül en büyük boyutuna ulaşırken granüloza hücrelerinin mitotik erkinin azalmasına bağlı olarak antrum genişler, kümülüs-oosit bileşkesi ile folikülün geri kalan kısmı arasındaki bağlantı zayıflar ve böylelikle ovulasyona hazırlık başlamış olur. Ovulasyondan yaklaşık 24 saat önce hipofiz bezi ön lobundan LH salınımının tetiklenmesi sonucu, kandaki LH düzeyindeki aşırı artış granüloza hücrelerindeki LH reseptörlerinin duyarlılığını yitirmesine ve LH a yanıt olarak daha fazla östrojen üretilmesine engel olur. Yaklaşık olarak saat sonra da bu dalgalanma ile beklemede olan oosit I. mayoz bölünmeyi tamamlar ve ovulasyon gerçekleşmiş olur. Ovulasyon sekonder oositin Graaf follikülünden atılması olgusudur. Ovulasyondan hemen önce germinal epitelin Graaf follikülü ile ilişkide olan kısmında kan akışı durur ve stigma denilen bir çıkıntı oluşur, hemen sonrasında yırtılma ile follikül içeriğinin karın boşluğuna atılması sağlanır. 19 Ovaryum folliküllerinin ovulasyona gitmeyen büyük bir kısmı, follikül hücreleri ve oosit in ölümüyle birlikte dejenere olur. Bunlar fagositik hücrelerce ortadan kaldırılırlar. Atretik follikül denilen bu folliküller, 16

30 doğumdan önce başlayıp menopozun birkaç yıl sonrasına değin ovaryumda oluşurlar Korpus Luteum Ovulasyon olaylanınca boşalan follikül duvarı katlanır ve follikül boşluğu kanla dolar, bu kan pıhtılaşır ve bu hale gelen folliküle korpus hemorajikum denir. Daha sonra follikül ve teka interna hücreleri korpus luteumu oluştururlar. Korpus luteum LH uyarımıyla progesteron hormonu ve östrojen salgılar. 22,42,49 Gebelik oluşursa, embriyonun trofoblastik hücreleri tarafından sentezlenen, LH ile aynı etkiyi yapan insan koryonik gonadotropin hormon ( HCG), korpus luteumun dejenere olmasını engeller ve korpus luteum un daha da büyüyüp progesteron salgılamasını sağlar. Gebelikte oluşan bu yapıya gebelik korpus luteum u (corpus luteum graviditatis) denir. Gebelik korpus luteum u 4-5 aya değin etkindir. 42 Gebeliğin oluşmadığı durumlarda ise korpus luteum dejenere olur ve bulunduğu bölge fibroblastlar tarafından sıkı bağ dokusu ile kaplanır. Bu yapıya korpus albikans denir. 42, Ovaryum un Fizyolojisi Bunlar; Kadın hormonal sistemi, üç ayrı hormon grubundan oluşur. Hormon (GnRH) 1- Hipotalamus kökenli Gonadotropin- Serbestleştirici 2- Hipofiz bezi ön lobundan salgılanan Gonadotropinler; 17

31 Follikül Uyarıcı Hormon (FSH) ve Luteinize edici Hormon (LH). Bu hormonların her ikisi de hipotalamus ta sentezlenen GnRH a yanıt olarak salgılanır. 3- Ovaryum salgılanan östrojen ve progesteron Bunlar hipofiz bezi ön lobundan salgılanan iki hormona (FSH, LH) yanıt olarak salgılanır. Kadınlarda bu hormonların salgı miktarları, ergenlik evresinden başlayarak aylık ritmik değişiklikler gösterir. Döllenme ve gebelik için belli aralıklarla yapılan hazırlıklar olarak kabul edilen bu değişimlere Menstrual Döngü denir. Bu hormonlar menstrual döngünün farklı evrelerinde son derece farklı hızlarda salgılanırlar. 35, GnRH, Gonadotropinler ve Ovaryumlar Üzerine Etkileri GnRH, gonadotropin ve ovaryum döngüsünün düzenli çalışması menstrual döngü için esastır. 37 Menstrual döngü sürecinde ovaryum daki değişiklikler gonadotropinlerinlerin etkisiyle düzenli bir şekilde sürer. Gonadotropinlerin salgısı, hipotalamusun GnRH salgılaması ile düzenlenir. Gonadotropik hormonlarla uyarılmayan ovaryum lar inaktif durumdadırlar. Ovaryum lar fetal yaşam süresince plasentadan salınan koryonik gonadotropinin (hcg) uyarısıyla işlev görürler. Doğumdan sonra bu uyarı birkaç hafta içinde ortadan kalkar ve puberteye değin ovaryum lar inaktif durumda kalırlar. 36,38 Oositler puberte öncesi evrede tek sıralı follikül hücreleriyle sarılı primordiyal folliküller içinde yerleşiktir. Granüloza hücrelerinin salgıladığı oosit olgunlaşmasını baskılayan maddenin etkisi, 18

32 puberte sonrasında FSH ve LH salgılanmasıyla birlikte ortadan kalkar ve folliküller büyümeye başlarlar. 35 Ovulasyon öncesinde bu folliküllerden sadece bir tanesi tam anlamıyla olgunlaşır. Bu follikül bol miktarda östrojen salgılar ve östrojen hormonu hipotalamusa etki ederek hipofizden LH salgılanmasını uyarır ve LH düzeyindeki artışı FSH daki azalma izler. Bu şekilde diğer folliküllerin büyümesi baskılanmış olur. 35,36,37, Ovulasyonda LH nın Etkileri LH, ovulasyonda ve follikül büyümesinin son evrelerinde oldukça gerekli bir hormondur. LH olmadığında, yüksek miktarlarda FSH olsa bile follikül gelişemez. Ovulasyondan yaklaşık 2 gün önce, LH salgı hızı artar ve ovulasyondan yaklaşık 15 saat önce bu hız 5 ila 10 katına çıkar. Bu süreçte FSH da yaklaşık 3 kat artış gösterir. Böylece ovulasyon öncesi, iki hormonunda etkisiyle follikül yeterli olgunluğa ulaşır. 35,38 Olgunlaşan follikül genişler ve yüzeyinde bir kabarıklık oluşur. Kabarıklığın tam tepesinde stigma denilen damarsız bir alan biçimlenir. Follikül duvarında hızlı bir şekilde kan damarları oluşurken, folliküler dokuda prostoglandin miktarı artar ve bu ovaryum duvarında kasılmalara neden olur. Stigma nın dejenerasyonu ile follikül yırtılır ve kasılmaların etkisiyle oosit kümülüs ooforus bölgesinden etrafındaki bir miktar granüloza hücresiyle birlikte dışarıya atılır. Böylelikle ovulasyon gerçekleşmiş olur. 39 Oosit in atılmasından birkaç saat sonra LH nın etkisiyle geride kalan granüloza hücreleri ve teka interna hücreleri hızla luteal hücrelere dönüşür. Bu olaya luteinizasyon, oluşan yapıya ise korpus luteum denir. Luteinizasyonu, ovulasyon süresince denetleyen diğer madde follikül sıvısında bulunan, luteinizasyonu baskılayıcı faktördür. Bu nedenle ovulasyon gerçekleşene değin follikülde korpus luteum gelişmez. 19

33 Korpus luteum un granüloza hücreleri bol miktarda östrojen ve progesteron hormonu salgılarken, teka interna hücreleri granüloza hücrelerinde kadın hormonlarına dönüştürülen androstenedion ve testosteron gibi belirli androjenleri sentezler. 35,38 Döllenme olmaması durumunda, ovulasyonun 7-8. gününde korpus luteum maksimum boyuta ulaşır ve bundan sonra luteal hücrelerin dejenerasyonuyla giderek küçülür, salgı işlevini yitirir ve korpus albikans denilen skar dokusu haline gelir. Korpus luteumun dejenerasyonu sonucu östrojen ve progesteron hormon düzeyleri azaldığı için menstrüasyon başlar. 39 Menstrüal döngünün luteal evresinde, korpus luteum dan salgılanan östrojen ve progesteron hormonu hipofiz bezi ön lobunda geri bildirim etkisi yaratarak FSH ve LH nın düşük dozda salgılanmasını sürdürür. Luteal hücreler az miktarda da olsa inhibin hormonu salgılarlar. İnhibin hormonu da özellikle FSH nın salgılanmasını baskılar. Bu durumda kanda düzeyi düşen FSH ve LH hormonlarıkorpus luteumun dejenere olmasına neden olur. Bu olaya korpus luteum un gerilemesi (involusyon) denir. Korpus luteum dan FSH, LH ve inhibin hormonları salgılanmadığında hipofiz bezi ön lobu üzerindeki baskılayıcı geri bildirim etki kaybolur ve hipofiz bezi bir miktar FSH, birkaç gün içinde de yavaş yavaş LH salgılamaya başlar ve bu menstrual döngüde yeni folliküllerin büyümesini başlatır. Ancak östrojen ve progesteron hormon yokluğu menstruasyonu olaylattığı için folliküller yeterince gelişemezler. Gebelik durumunda, koryonik gonadotropinlerin (hcg) salgılanması korpus luteuma etki ederek gebeliğin 2-4 aylık evresinde aktif kalmasını sağlar. 35,38 Ovaryum lardan salgılanan dişi cinsiyet hormonları, steroid yapıdaki östrojen ve progestinlerdir

34 2.4.3.Östrojen lerin İşlevleri 3 tip doğal östrojen vardır; östriyol, östron ve en önemlisi B- östradiyol dür. Ovaryumlar da östrojen üretimiyle yükümlü yapı; teka interna hücreleri, granüloza hücreleri ve korpus luteumu da içeren olgunlaşmış folliküllerdir. Östrojenler az miktarda da böbreküstü bezi korteksinden salgılanırlar. 35,36,37,39 Östrojen ler çocukluk evresinde çok az miktarlarda salgılanırken, puberte de gonadotropik hormonların etkisi altında daha yüksek miktarlarda salgılanırlar. Östrojenlerin en önemli özelliği, dişi üreme organlarının şekillenmesi ve ikincil dişi cinsiyet özelliklerinin oluşmasını sağlamaktır. Puberte sonrasında östrojenler; Endometriyal stromada belirgin şekilde hücre çoğalmasını tetiklerler, Endometriyal bezlerde büyümeyi sağlar ve bu şekilde ilerleyen günlerde implante olacak blastosist in beslenmesine yardımcı olurlar, Vajina epitelini, kübik şekilden çok katlı epitel haline dönüştürerek travma ve enfeksiyonlara karşı daha dayanıklı hale getirirler, Tuba uterina larda salgı yapan hücrelerin ve lümene uzanan silyalı epitel hücrelerinin çoğalmasını sağlarlar, Meme de stromal dokunun, kanal sistemlerinin gelişmesini ve yağ birikimini sağlarlar, Progesteron ve prolaktin hormonlarının desteği ile meme bezlerinde lobul ve alveollerin gelişimini uyarırlar, Meme uçları ve genital bölgede pigmentasyonu artırırlar, 21

35 Pubis ve aksillar bölgede kıllanmayı artırırlar, Osteoblastik erkin artmasını sağlarlar, Derinin yumuşak ve düzgün olmasını ayrıca daha fazla damarlanmasını uyarırlar, Hipotalamustaki ilgili nöronları etkiler ve cinsel isteği artırırlar, Aldosteron ve diğer adrenokortikal hormonlar gibi böbrek tübüllerinde su ve sodyumun geri emilimini sağlarlar, Plazma kolesterol miktarını düşürürler, Protein oluşumunu büyük ölçüde arttırırlar. 35,36,37, Progestin lerin İşlevleri Progestinler içinde en önemlisi progesteron hormonudur. Dolaşımda bulunan progesteron un yaklaşık olarak %2 si serbest halde bulunurken, %80 i albumine bağlı, %2 si de kortikosteriod bağlayıcı globuline bağlanarak taşınır. Yarı ömrü ortalama 5 dakikadır ve karaciğerde pregnandiole dönüştürülerek glukuronik asitle birleştirilir ve daha sonra idrarla atılır. 36,37 Progesteron nun en önemli işlevi menstrual döngünün ikinci yarısında uterus endometriyumunda salgı değişimlerini başlatarak, uterus u blastosist in implantasyonuna hazırlamaktır. Ayrıca uterus kasılmalarının şiddetini azaltarak implante olmuş blastosistin atılmasını engeller. Tüm bunların yanı sıra; Tuba uterina mukozasında, blastosistin implantasyon öncesi beslenmesi için gerekli salgılama ile ilgili değişimleri başlatır, 22

36 Servikste mukus yapımının azalmasını ve koyulaşmasını sağlar, Alveol hücrelerinin çoğalmasıyla memelerdeki lobül ve alveollerin gelişimini hızlandırır. Yüksek düzeydeki progesteron böbrek distal tübüllerinden sodyum, klor ve suyun geri emilimine, aldosteronun etkisine karşın çok daha az oranda yardımcı olur, Aldosteron hormonu ile arasındaki yakınlık, vücutta belirgin bir şekilde sodyum ve su yitiminin artmasına neden olur, Ovulasyon sırasındaki vücut sıcaklığı artışından sorumludur Elektrik ve Elektromanyetik Alan Elektrik, durağan ya da hareketli, aynı zamanda yüklü parçacıkların oluşturduğu fiziksel bir olgudur. Proton ve esas parçacık olan elektron, elektriğin yüklü parçacıklarıdır. Elektriksel olgular sayıca fazla elektronların birikmesi ya da hareket etmesiyle ortaya çıkarlar. Elektrik akımı, var olan elektrik yüklerinin bir yerden diğer bir yere hareketini tanımlar. 54,55 Elektromanyetik alan ise bir elektrik yükünün hareketi sonucu oluşan değişimlerdir. Elektromanyetik alanın bileşenleri olan elektrik ve manyetik alanın kökenleri yüklere dayanmaktadır. Yüklü parçacıklar durağan haldeyse çevresinde elektrik alanları, hareketliyse elektrik alanla birlikte manyetik alanı da oluştururlar. 56,57,58 23

37 Elektromanyetik alan belli frekansta yayılan dalgalardır. Frekans, elektromanyetik dalgaların saniyede yaptığı salınım hızıdır ve birimi Hertz (Hz) dir. Elektromanyetik dalgaların yayılmasında, dalganın aldığı yol dalga boyunu ifade eder birimi ise metredir. 54,55,58,59,60,61 Elektromanyetik dalgaların frekansını, dalgayı oluşturan kaynaklar belirler. Çok düşük frekanslı elektromanyetik alan (Extremetely Low Frequency- Electromagnetic Field, EMF-ELF), Hz frekansları arasındaki radyasyon bölgesini tanımlar ve parçacık özelliği göstermeyen yani iyonlaştırmayan radyasyon grubuna girer. Günlük yaşamda en sık karşılaşılan radyasyon türüdür. Küçük ev aletleri, televizyon, bilgisayar, buzdolabı, bulaşık makinesi, ısıtıcı, tıraş makinesi, saç kurutma makinesi gibi sık kullanılan aletler, evlere gelen şebeke elektriğinin oluşturduğu 50 Hz lik frekans bu bölgede yer alır. Bu nedenle çok düşük frekanslı elektromanyetik alana etkin kalma bilimsel ve toplumsal tartışmalara konu olmaktadır Radyasyon Radyasyon, doğal ve yapay radyoaktif çekirdeklerin kararlı yapıya geçmek için dışarı verdikleri parçacıklar, bunun yanında elektromanyetik dalga biçimindeki enerji yayılımı ve aktarımı olarak tanımlanır ve iyonize ve iyonize olmayan radyasyon olarak iki gruba ayrılır. 63,64, İyonize Olmayan Radyasyon Atomları, yeterli enerjiye sahip olmadığı için iyonlaştıramayan, kütlesiz elektromanyetik dalga şeklindeki radyasyon tipidir. Radyo dalgaları (RF), mikrodalga, görünen ışık (kırmızı, turuncu, 24

38 yeşil, mavi, mor,sarı), çok düşük frekanslar (ELF), kızıl ötesi ışınlar iyonize olmayan radyasyon tiplerine örnektir. 63,67, , İyonize Radyasyon İyonize radyasyon, partikül ya da dalgaların, bulunduğu ortamdaki atomlara çarparak elektron koparma ya da uyarılma yöntemi ile oluşan enerji salınımı ya da aktarımı şeklinde oluşan radyasyondur. İyonize radyasyonun, nötron, proton, alfa, beta taneciklerini içine alan parçacık tip radyasyon, X ve gamma ışınlarını içine alan elektromanyetik radyasyon olarak iki tipi vardır. Yüksek frekanslarda uv, X ve gamma ışınları da nötron, proton gibi tanecik özelliği gösterir ve taşıdığı enerjiye koşut olarak kimyasal bağları kırma etkisi gösterebilirler. 63,64, Cep Telefonu Radyasyonu Telefon, 1876 yılında Alexander Graham Bell tarafından bulunmuştur. İlk kablosuz telefon 1973 yılında üretilmiş bunu izleyerek on yıl içerisinde kullanım oranı artmıştır. Taşınabilir telefon (mobil) sistemlerinde, diğer mobil ve sabit telefonlarla görüşme baz istasyonu üzerinden yapılmaktadır. Tek baz istasyonu üzerinden sınırlı sayıda konuşma olanağı sağlandığından telefon ve baz istasyonunun çıkış güçlerinin arttırılması gerekmektedir. Arama sırasında, mobil telefondan baz istasyonuna yüksek çıkış gücüyle gelen elektromanyetik enerji, görüşme için bağlantı kurulduktan sonra en alt düzeye iner. Elektromanyetik dalgalar önüne engel çıkıncaya değin havada yayılarak ilerler. Önlerine çıkan bina gibi yapılardan geçerken enerjilerini yitirirler

39 Günümüzün en önemli elektromanyetik dalga kaynaklarından biri olan cep telefonları radyofrekans (RF) dalgaları ile yayın yaparlar. Cep telefonlarından yayılan RF dalgaları kullanılan telefonun frekansına bağlı olarak değişiklik gösterir. 450 ile 1800 Mhz frekans bandında değişiklik gösteren RF dalgaları, beklentilerin artmasına koşut artış göstermiş ve 2100 Mhz değerine ulaşmıştır. Taşınan enerji miktarındaki artışı da işaret eden bu olgunun dokularda oluşturabileceği hasar, emilen enerji miktarına ve etkin kalınma süresine bağlıdır. Dokularca emilen toplam enerji miktarına Spesifik Absorbsiyon Oranı (SAR) ( özgül soğurma yoğunluğu) denir. 69,70,71,72,73 Düşük frekanslı elektromanyetik dalgaların enerjileri, atomları ya da molekülleri iyonlaştıracak kadar güçlü değildir. Ortamda bulunan bu tip elektromanyetik dalgalar canlılara ısıya koşut ya da olmayan şekilde etki edebilirler. Isıya koşut etkide vücut tarafından emilen elektromanyetik enerji ısıya dönüşür böylelikle vücut sıcaklığı artar ancak düşük frekanslı elektromanyetik dalgaların oluşturduğu sıcaklık artışı vücudun normal düzenekleriyle etkisizleştirilebileceği kadar azdır. Yüksek dozlarda ve uzun süreli etkin kalma durumunda ısıya bağlı olmayan etkileri uyku bozuklukları, dikkat bozuklukları, baş ağrıları, halsizlik olarak belirlenmiştir Radyasyon Hasarı İyonize radyasyonlar dokuların içinden geçerken oluşturdukları iyon çiftleri DNA ve önemli yapıtaşlarıyla etkileşime girerek hasar verici özellik gösterir. Işınlar dokuların içinden geçerken önce bir dizi kimyasal tepkime başlar ardından fiziksel tepkimelerle süreç devam eder. İyonize radyasyonlar her ne tipte olursa olsun içinden geçtiği madde ya da dokuya enerjilerini aktarırlar. Herhangi bir kaynaktan gelen ışınsal enerjiye etkin kalan dokularda gerçekleşebilecek biyolojik etkiler çok kısa sürede 26

40 kendini gösterebileceği gibi uzun yıllar sonrasında da ortaya çıkabilir. İyonize radyasyonun oluşturduğu hasar serbest radikallerin oluşumuyla olabildiği gibi, DNA yı doğrudan da hasara uğratabilir. Serbest radikaller de nükleik asitlerle birleşerek mutasyona ya da hücre ölümüne neden olabilir. Bu süreçte dokularda oluşan hasar düzeyini, etkin kalınan ışınsal enerji, hücrelerin kendini yenileme yeteneği gibi faktörler belirler. 75,76,77 Radyasyon hasarı üç şekilde olabilir; uygun koşullarda onarımı olası olan subletal hasar tek başına hücre ölümüne neden olmaz ancak olumsuz koşullar süreklilik yaparsa hücre ölümüyle sonuçlanır. Letal hasar, onarılamayacak değin büyük hasarları belirtir ve hücreyi çok kısa sürede ölüme götürür. Potansiyel letal hasar ise hücre bölünmesi hemen gerçekleşmezse tamir edilebilir hasarı ifade eder. 71,78, Melatonin N- asetil-5- metoksitriptamin olarak da bilinen melatonin epifiz bezi tarafından salgılanan bir hormondur yılında dermatolog Lerner tarafından sığır epifiz bezinde belirlenen melatoninin günümüzde biyolojik ritmin düzenlenmesinde, ruhsal durum, uyku, üreme ve yaşlanma gibi birçok olayın biyolojik düzenlenmesinde etkili olduğu bildirilmiştir. 80, Melatoninin Etki Düzeneği Melatonin salınımında etkin denetim sistemi, ortamın aydınlık ya da karanlık olmasına bağlıdır. Melatonin sentezi, triptofanın pinealositler içine alınması ve orada epifiz bezinin bir enzimi olan N- asetiltransferaz (NAT) tarafından ve diğer bir enzim hidroksiindol-ometiltransferaz (HIOMT) aracılığıyla N- asetil seratonine dönüştürülmesi ile başlar. Gündüz saatlerinde az miktarda sentezlenen melatoninin karanlıkla birlikte sentez ve salınımı artar. 82 İlk araştırmalar sadece gün 27

41 ışığının melatonin düzeyini baskıladığını bildirirken, son yıllarda yapılan çalışmalarda da yapay ışığın benzer etkiler gösterdiği ileri sürülmüştür. Işıkla birlikte retinadan başlayan nöronal uyarılar, hipotalamusta suprakiyazmatik çekirdek (SCN) ve diğer hipotalamik yapılara aktarılır ve buradan da superior servikal gangliyona geçer. Karanlığın başlaması ile postganglionik sempatik liflerden salınan noradrenalin β- 1 reseptörlerine bağlanarak seratonin ve NAT ın hücreiçi salıverilmesini sağlar ve böylelikle melatonin sentezi uyarılmış olur. 80,82,83 Endokrin bezler genelde oluşturdukları hormonları depolarken, pinealositler sentezlenen melatonini depolamadan komşu kapillerlere verirler. Melatonin lipofilik özelliği ile hızlı bir şekilde önce kana, anne sütüne, beyin omurilik sıvısını da içererek tüm biyolojik sıvı ve dokulara dağılır ayrıca plasentayı kolaylıkla geçebilir. 80,81,82,84 İnsanda bir çok biyokimyasal, fizyolojik değişkenler olduğu gibi plazmadaki melatonin yoğunluğu da 24 saatlik süreç içinde düzenli iniş çıkışlar gösterir. Salgılanma saat de başlar, saatleri arasında en üst düzeylere ulaşır, sabah de civarında da azalmaya başlar. Sağlıklı bireylerde plazma melatonin miktarı gündüz 0-20 pg/ml, gece pg/ml düzeylerinde seyreder ve ortalama olarak günde 30 mg melatonin üretilir. 80,82, Melatoninin Antioksidan Özelliği Melatoninin bir antioksidan olduğu, kaynaklarda ilk 1991 yılında Ianas ve arkadaşlarınca öne sürülmüş ardından yapılan in vivo ve in vitro çalışmalarla bu desteklenmiştir. 81,86 Antioksidan olarak etkili ve geniş bir hücre içi dağılım gösteren endojen antioksidanlar içinde, melatonin serbest radikalleri doğrudan tutucu özelliği olması nedeniyle diğerlerine karşın daha etkili bir antioksidandır. 28

42 Serbest radikaller ve hidroksil radikalleri yüksek reaktifliğe sahip oldukları için hücrelerdeki makromolekülleri büyük hasara uğratırlar. Glutatyon ve mannitol gibi serbest radikal tüketicilerine karşın melatoninin özellikle çekirdek DNA sı, membran lipitleri ve hücre içi proteinleri oksidatif hasarlardan korumada daha etkili olduğu ortaya konulmuştur. 80,83,87 Melatonin, güçlü bir antioksidan enzim olan glutatyon peroksidaz erkini de düzenler. 80,88 Melatoninin serbest radikallere dolaylı etkileri de bulunmaktadır. Melatonin, GSH-Px enzimini aktive edip, O2- radikalini H2O2 ye katalizleyen süperoksit dismutaz (SOD) erkini arttırarak ayrıca oksidatif stres sırasında katalaz aktivitesindeki azalmayı önler ve NO oluşumundan yükümlü nitrik oksit sentaz (NOS) enzimini baskılayarak dolaylı yoldan antioksidan etkisi gösterir. 89,90 Melatoninin serbest radikaller üzerindeki süpürücü etkisi güçlü bir antiinflamatuar ajan olduğunun göstergesidir. Melatonin, inflamasyon tepkimeleri sırasında makrofajların aktivasyonu ile oluşan toksik bir oksijen türevi olan HOCI e karşı süpürücü etki göstermektedir. 91 Melatonin diğer antioksidanlarla etkileşime girerek onların etkinliğini arttırır. İn vitro ortamda C vitamini ya da GSH ile inkübe edilen melatonin arasında sinerjik etki olduğu ve radikal oluşumunu azalttığı saptanmıştır. Melatonin doğrudan serbest radikalleri uzaklaştırır ayrıca dolaylı olarak da antioksidan işlev gösterir. Melatoninin doğrudan ve dolaylı yoldan etkileri şu şekilde sıralanabilir; İlaçların neden olduğu oksidan hasarlara ve yan etkilere karşı koruyucu etkisi belirlenmiştir. 92 İnflamasyon modellerinde (sepsis, yanık hasarı, iskemi/perfüyon gibi) nötrofil aktivasyonunun dokularda 29

43 neden olduğu oksidan hasarları anlamlı oranda geri döndürmektedir. 93 Kan hücrelerini kemoterapötik ilaçların toksik etkilerinden koruduğu gösterilmiştir. 82 Melatonin uygulamasının serum kalsiyum yoğunluğunu arttırdığı, kemik kaybını azalttığı belirlenmiştir. 94 Yüksek kan basıncının neden olduğu kalp damar sisteminde oluşan oksidan hasarda ortaya çıkan serbest radikallerin etkilerini anlamlı oranda geri döndürdüğü saptanmıştır. 95 Nörogenezi arttırdığı, kan beyin bariyerini koruduğu belirlenmiştir. 96 Hayvan modellerinde tümör büyümesini ve gelişimini yavaşlatıcı etkisi olduğu, pinealektomili hayvanlarda tümör oluşumunun hızlandığı buna karşılık melatonin uygulamasının bu gelişimi geri döndürdüğü bildirilmiştir. 97 Deneysel çalışmalarda immün hücrelerdeki apopitozisi baskıladığı ve kanser hücrelerindeki apopitozisi hızlandırıldığı, yani potansiyel antikanser özelliği olduğu belirtilmiştir. 98 Potansiyel bir epigenetik düzenleyici olan melatoninin bu yönüyle bazı nöropsikiyatrik hastalıklarda tedavi edici olabileceği de düşünülmektedir

44 2.9. Ovaryum Melatonin Etkileşimi Ovulasyon, LH artışı ve ona eşlik eden follikül değişimleriyle başlar. Ovulasyon mekanizmasıyla inflamatuar (yangı) tepkime karşılaştırılmış ve ovulasyonla ilgili raporlarda, reaktif oksijen türlerinin (ROS) inflamatuar tepkimelerin önemli aracıları olduğu bildirilmiştir. Çalışmalarda, ovulasyon sırasında makrofaj, nötrofil ve damar endotel hücreleri tarafından ROS üretildiği saptanmıştır. ROS un luteal hücrelerce progesteron üretimini engellediği bildirilmiştir. ROS aynı zamanda lipit peroksidasyonunun bir sonucu olarak luteal hücrelerin plazma zarını bozabilir ve hasarlı membran değişiklikleri genellikle gerileyen korpus luteumda izlenir. Diğer yandan foliküller, reaktif oksijen türlerinin hasarından, superoksit dismutaz (SOD), glutatyon peroksidaz ve katalaz gibi antiosidan enzimlerle, vitamin E, vitamin C ve glutatyon gibi enzimatik olmayan antioksidanlar aracılığı ile korunmaya çalışır. 99 Melatonin in hücreyi lipit peroksidasyonu, DNA ve protein hasarı gibi pek çok olumsuz durumdan koruduğu, ovulasyon sırasında lutinizasyona uğrayan granüloza hücrelerindeki progesteron üretimine katkıda bulunduğu belirtilmiştir. 99 Ayrıca folliküllerdeki melatonin düzeyinin serumdaki melatoninden daha fazla olduğu bundan yola çıkarak follikül büyüdükçe melatonin düzeyinin arttığı, bunun dışında insan follikül ve granüloza hücrelerinde progesteron hormon artışını sağladığı da izlenmiştir. IVF- embriyo transferi uygulanan kadınlarda follikül içi melatonin düzeyinin düşük olduğu, kötü oosit kalitesi ya da anovulasyonun nedeninin düşük melatonini yoğunluğu olduğu da belirtilmektedir. 99,100 31

45 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Deney Hayvanları ve Gruplandırma Çalışmada, Gazi Üniversitesi Laboratuvar Hayvanları Yetiştirme Deneysel Araştırma Merkezi (GÜDAM) den sağlanan ortalama gr ağırlığında 24 adet Wistar albino cinsi, dişi sıçan kullanıldı. Deney süresince laboratuvar ısısı ortalama 22 ±2 C, 12 saat aydınlık 12 saat karanlık olacak şekilde aydınlatılma sağlandı. Hayvanlara içme suyu olarak çeşme suyu verildi. Tüm denekler standart yem ile sınırsız beslendi. Denekler 4 gruba ayrıldılar; Grup: Kontrol grubu ( n=6 ) Grup: Melatonin uygulanan sham kontrol grubu ( n=6 ) Grup: Cep telefonu radyasyonuna etkin bırakılan grup ( n=6 ) Grup: Cep telefonu radyasyonu + Melatonin uygulanan grup ( n=6 ) 3.2. Deneyin Yapılışı Radyasyon uygulaması; Çalışmamızda EMA kaynağı olarak SAR değeri 0,24 kg/w 2100 MHz de çalışan EMA jeneratörü ( Rohde & Schwartz vektör sinyal jeneratörü, R&S, SMBV100A, Germany) kullanıldı. Uygulamalar horn antenle ( ETS Lindgren, Model , Frekans aralığı: 400 MHz-6 GHz, USA) yapıldı. Çalışma öncesi EMA jeneratörü ölçümleri EMA probu ( Marda-EMR 300, Tip 8.3 probu, Germany) ile gerçekleştirildi. İçine üçer 32

46 adet sıçanın konulduğu iki adet pleksiglas kafes üst üste yerleştirilerek horn antenin altına konuldu. Şekil 1. EMA uygulama düzeneği Melatonin hazırlanışı: 100mg melatonin, 100 µlt (%100 saf) alkol içerisinde çözüldü, üzerine 9900 µlt PBS (ph = 7.4 olmalı) eklendi. Elde edilen melatonin 10mg/kg dozunda derialtı uygulandı. 1.Grup normal kontrol grubu olup, hiçbir uygulama yapılmadı. İkinci gruba 3 ay süresince, her gün aynı saatte 10mg/kg melatonin derialtı uygulandı. Üçüncü grup ise 3 ay süresince, her gün aynı saatte 2100MHz radyasyona 30 dakika süreyle etkin bırakıldı. Dördüncü gruba ise radyasyon uygulamasından 40 dakika önce 10mg/kg melatonin verildi ve 33

47 30dakika radyasyon uygulandı. Çalışma süresince deneklerin vücut ağırlıkları her gün ölçülerek kaydedildi. Üç aylık süre bitiminde yüksek doz anestezi altında feda edilen deneklerden ovaryum dokuları alındı, ağırlıkları ölçüldü ve histolojik izleme yöntemlerinden geçirilerek parafin bloklar hazırlandı. Alınan kesitlere Hematoksilen-Eozin, Periyodik Asit Schiff (PAS), TUNEL ve PCNA boyaması yapıldı ardından ışık mikroskobunda incelenerek resimlendirildi Işık Mikroskobik Yöntem Tüm ovaryum doku örnekleri ışık mikroskobik inceleme için ilk olarak % 10 luk formaldehit solüsyonunda tespit edildi. Tespit işleminden sonra doku örnekleri kasetlere konularak akarsu altında 24 saat süresince yıkandı. Suyun uzaklaştırılması için dokular artan derecelerde alkol serilerinden ( %70, %80, %90, %100) geçirildiler. Sonrasında dokular parlatılmaları ereğiyle ksilolden geçirildi ve ardından erimiş parafine gömüldüler. Hazırlanan parafin bloklardan elde edilen 4-5 mikron kalınlığındaki kesitler Hematoksilen- Eozin, PAS, TUNEL ve PCNA boyandı. Kesitler Leica DCM 4000 (Germany) bilgisayar destekli görüntüleme sisteminde, Leica Q Vin 3 programında değerlendirildi ve resimleri çekildi Hematoksilen Eozin Boyama Yöntemi Boya Solüsyonlarının Hazırlanışı : 1- Harris Hematoksilen Solüsyonu Hematoksilen 1gr Alkol 10ml 34

48 Potasyum alum (alüminyum potasyum sülfat) 20gr Distile su 200ml Civa oksit 0.5gr Glasiyal asetik asit 8ml 2- Eozin Solüsyonu Eozin 1gr Distile su 100ml 1 küçük timol kristali Boyama Yöntemi : Deney gruplarından alınan kesitler 70 C etüvde 30 dakika bekletildikten sonra, 2x15 dakika ksilole alınarak parafinden arındırılmaları sağlandı. Daha sonra lamlar sırasıyla azalan alkol serilerinden geçirilip (%100, %96, %80, %70, %50) havada kurutuldu. 10 dakika akarsuda yıkandıktan sonra, Harris Hematoksilen de dakika boyandı ve 10 dakika akarsuda yıkandılar. % 70 alkol damla glasiyel asedik asit karışımına batırılıp tekrar 10 dakika akarsuda yıkandı. Lamlar 5-10 dakika Eozin de bekletilip 10 dakika daha akarsuda yıkandıktan sonra artan dereceli alkol serilerinden geçirilerek (%50, %70, %80, %96, %100), 2x15 dakika ksilole alındı ve entellan ile kapatıldı İmmünohistokimyasal Yöntem TUNEL Yöntemi DNA parçalanması ve apoptotik hücre ölümünün belirlenmesi için in situ apoptozis saptama kiti kullanıldı (Millipore Plus Peroxidase In Situ Apoptosis Detection Kit, Lot: Temecula, CA 92590). Parafin bloklardan elde edilen kesitler 37 ºC deki etüvde bir gece tutuldular, daha 35

49 sonra deparafinizasyonu kolaylaştırmak için etüv ısısı 57 ºC ye çıkarılarak bu ısıda 1 saat tutuldular. Camlar deparafinizasyonu tamamlamak ereğiyle 2 kez 15 er dakika ksilol e etkin bırakıldılar. Daha sonra 10 ar dakika sırasıyla %100, %96 ve % 80 lik etil alkol serilerinden geçirildiler. Kesitler alkolden arındırılmak ereğiyle iki kez 5 er dakika distile sudan geçirildikten sonra 15 dakika 20 µg/ml proteinaz K ile inkübe edildiler. Distile su ile yıkama aşamasından sonra 5 dakika %3 lük hidrojen peroksit ile etkin bırakılan dokularda endojen peroksidaz aktivitesi bloke edildi. PBS ile yıkanan kesitler 5 dakika dengeli tamponda ve 60 dakika 37 C nemli ortamda TdT enziminde (77 μl Reaksiyon Buffer + 33 μl TdT Enzim, 1 l TdT enzim) inkübe edildiler. Ardından oda sıcaklığında önceden ısıtılmış durdurma/yıkama tamponunda 10 dakika bekletildi ve Anti-Digoxigenin de 30 dakika inkübe edildiler. Her aşamada PBS ile dikkatle yıkama yapıldı. Yıkamanın ardından TUNEL pozitif hücreleri belirleyebilmek için DAB ile boyama yapıldı. Zemin boyaması için 5-10 dakika süreyle Metilen yeşili uygulandı. Boyanan camlar artan alkol serilerinden geçirilerek suyu alındıktan sonra 20 dakika şeffaflaştırmak için ksilolde bekletildiler. Ardından entellan ile kapatıldı PCNA Yöntemi Kesitler 37ºC deki etüvde bir gece tutulduktan sonra deparafinizasyonu kolaylaştırmak amacıyla etüv ısısı 57ºC ye çıkarılarak 1 saat daha bekletildi. Camlar deparafinizasyonu tamamlamak için 2 kez 15 er dakika ksilolde bırakıldıktan sonra sırasıyla %100 lük, %96 lık ve %80 lik alkol serilerinden 10 ar dakika geçirilerek sudan, 2 kez 5 er dakika distile sudan geçirilerek alkolden kurtarıldı. 36

50 Kesitler doku içerisinde formaldehitin kapattığı reseptör bölgelerinin açığa çıkarılmasını sağlamak amacıyla mikrodalga fırında 1 M sitrat tamponuna (ph: 6. 0) (Cat: AP , Lot: 9003LT13610, Lab Vision, Fremont, USA) etkin bırakıldı. Oda ısısında 20 dakika soğutulduktan sonra 15 dakika süreyle hidrojen peroksit (Cat: TA-125-HP, Lot: 125HP14119, Lab Vision, Fremont, USA) uygulandı ve endojen peroksidaz aktivitesi bloke edildi. PCNA primer antikoru immün boyamasında retriver aşaması gerekmediğinden bu aşama uygulanmadı. Daha sonra, camlar 3 kez 3 er dakika PBS (Phosphate Buffer Saline) (ph: 7.4) ile yıkandıktan sonra özgün olmayan bağlanmaların engellenmesi amacıyla 5 dakika Ultra V Block (Cat: TA-125-UB, Lot: AUB120522A, Lab Vision, Fremont, USA) uygulandı. Bloklama aşamasının ardından kesitler yıkanmadan PCNA Ab-1 (PC10) (Cat: MS- 106-P, Lot: 106P1203E), primer antikoruna etkin bırakılarak 60 dakika bekletildi. Camlar 60 dakikanın sonunda 3 kez 3 er dakika PBS ile yıkandıktan sonra 20 dakika biyotinli sekonder antikor (Cat: TM-125-BN, Lot: MBN110810, Lab Vision, Fremont, USA) uygulanarak primer antikora bağlanması sağlandı. Tekrar PBS ile yıkandıktan sonra dokular enzimin biyotine bağlanması amacıyla 20 dakika streptavidin peroksidaz enzim kompleksine (Cat: TS-125- HR, Lot: SHR120127, Lab Vision, Fremont, USA) etkin bırakıldı. Camlar tekrar PBS ile yıkandıktan sonra kromojen olan AEC (3-amino-9-ethylcarbazole) (Cat:TA-007-HAC, Lot: HAC20947, Lab Vision, Fremont, USA) uygulanarak gözle görülebilen immün reaksiyonun açığa çıkması sağlandı. Zemin boyamasında Mayer in Hematoksileni (Cat: TA- 125-MH, Lot: AMH70809, Lab Vision, Fremont, USA) kullanıldı ve camlar Ultramount (Cat: TA-125-UG, Lot: VM13518, Lab Vision, Fremont, USA) ile kapatıldı. Kesitler Leica DM 4000 (Germany) bilgisayar destekli görüntüleme sisteminde, Leica Q Vin 3 programında değerlendirildi ve fotoğraflandı. 37

51 3.5. İstatistiksel Yöntem İstatistiksel değerlendirme yapabilmek erkiyle tüm kontrol grupları ve deney gruplarının vücut ağırlıkları, deney başlangıcından sonuna dek her gün ölçüldü, deney bitiminde ise ovaryum kuru ağırlıkları ölçülerek kaydedildi. Verilerin analizi Windows için SPSS 18.0 paket programında yapıldı. Gruplar arasındaki vücut ağırlığı ve ovaryum kuru ağırlıklarının verileri karşılaştırılarak, sürekli ölçümlü değişkenlerin dağılımının normale uygun olup olmadığı Shapiro Wilk testi ile araştırıldı. Tanımlayıcı istatistikler ortanca (25-75) yüzde olarak gösterildi. Her denekten Hematoksilen Eozin ile boyanan kesitlerden gelişigüzel seçilen altı alanda follikül sayımı yapıldı, PAS yöntemi ile boyanan tüm kesitlerden zona pellusida kalınlıkları ölçüldü. Gruplar arasında follikül sayısı ve zona pellusida kalınlıkları ortanca değerleri yönünden farkın önemliliği için Kruskal Wallis testi ile değerlendirildi. Normalite testinin sonuçlarına göre parametrik (ANOVA, Post hoc: Bonferroni) ya da parametrik olmayan (Kruskal Wallis Varyans Analizi, POST HOC: Bonferroni Düzeltmeli Mann Whitney U) testler uygulandı. p<0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. 38

52 4. BULGULAR 4.1. Işık Mikroskobik Bulgular Hematoksilen- Eozin Bulguları: Kontrol grubu ovaryum dokusuna ait küçük büyültmeli resimlerde; Graaf, sekonder ve primer folliküllerin yanı sıra atretik folliküller ve korpus luteum izleniyordu (Resim 1b). Büyük büyültmeli resimlerde germinal epitel tek sıralı kübik ve prizmatik yapısıyla ilgiyi çekerken, primordiyal folliküller yassı follikül hücreleri ve ortada oositleri, primer folliküller ise tek sıralı kübik follikül hücreleriyle ve yine ortalarında oositleri ile üst korteks bölümünde yaygındı. Bir atretik follikül ve gelişkin korpus luteum da ilgiyi çekiyordu. Stroma da yaygın stromal hücreler ve bağ doku hücreleri ile damarlanma belirgindi ( Resim 1a,1b). Çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküller de gelişkin zona pellusida, çekirdek ve çekirdekçiği belirgin oosit I ile izleniyordu. Teka interna nın oldukça gelişkin olduğu, hücresel yapısı ve damarlar ayırt edilirken, teka eksterna nın ovaryum stromasıyla karıştığı belirgindi (Resim2). Antrumu belirginleşmiş sekonder folliküllerde oosit I, zona pellusida ve granüloza katmanı belirgin olarak ayırt ediliyordu. Teka interna ve eksterna gelişkindi. Korpus luteum hücresel yapısıyla ayırt edilirken stroma da yaygın damarlanma ilgi çekiciydi (Resim 3). Graaf follikülünde, kumulus ooforus ve stratum granulozum gözlemleniyordu. Zona pellusida ve oosit normal yapıdaydı. Teka interna ayırt ediliyodu (Resim 4). Korpus luteumda luteal hücreler belirgindi (Resim 5). 39

53 Radyasyon uygulanan gruba ait küçük büyültmeli resimlerde, bir sekonder follikül ve buna karşılık atreziye giden oldukça fazla sayıda follikül ilgiyi çekiyordu (Resim 6b). Büyük büyültmeli resimlerde, germinal epitel normal yapıdayken, primordiyal folliküllerin üst korteks bölgesinde yerleştiği ve normal yapı sergilediği ilgiyi çekiyordu. Yine atreziye giden gelişen folliküller belirgindi. Korpus luteum normal yapıdaydı (Resim 6a). Çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer ve antrumu oluşmaya başlayan sekonder folliküllerde, granüloza hücre katmanlarının özellikle orta bölgede dejenerasyona gittiği belirgin olarak ayırt ediliyordu. Yine bu folliküllerde zona pellusida nın kalınlı inceli bir düzende olduğu da dikkati çekiyordu (Resim 7a, 7b). Yine çok sıralı granüloza hücre katmanı ile primer folliküllerde atreziye gidişin ilk belirtisi olarak oositin ve zona pellusida nın düzenleniminin bozulduğu ve bol miktarda apoptotik cisimler içerdiği ilgiyi çekiyordu. Teka interna da da aynı yapısal değişimler belirgindi. Korpus luteum da normal yapıda izleniyordu (Resim 8a, 8b). Melatonin uygulanan grupta küçük ve biraz daha ileri büyültmelerde tüm ovaryum yapılarının normal görünüm sergilediği, kontrol grubu ile eşdeş olduğu dikkati çekiyordu (Resim 9b). Germinal epitel ve primordiyal folliküller ile normal yapıda korpus luteum ayırt ediliyordu (Resim 10). Çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer (Resim 11b) ve antrumu oluşmuş sekonder folliküllerde yine oosit, zona pellusida ve granüloza hücre katmanı ile teka interna ve eksterna katmanı belirgindi (Resim 9a, 11). Graaf follikülünde; kumulus ooforus, oosit, zona pellusida, granüloza hücre katmanı, teka interna ve eksterna (Resim 13) gözlemleniyordu. Büyük büyültmeli resimlerde korpus luteum normal yapıdaydı (Resim 9a, 12, 13). 40

54 Radyasyon + melatonin uygulanan grupta atreziye giden folliküller (Resim 14b) ile korpus luteum belirgin olarak ayırt edilirken, yine aynı gruba ait biraz daha ileri büyültmelerde, yüzey epiteli ve üst korteks bölgesinde bulunan primordiyal folliküller ile gelişen folliküller belirgindi (Resim 14a). Bu folliküllerde radyasyon uygulanan grubun aksine, atrezi ayırt edilmiyordu. Çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde oosit, zona pellusida ve granüloza hücre katmanı ile teka interna ve eksterna oldukça normal yapılarıyla izleniyordu. Korpus luteum yapısı belirgindi (Resim 15). Antrum oluşmaya başlamış erken evre sekonder follikülde zona pellusida daki düzensiz yerleşimin hala sürdüğü ancak granüloza hücre katmanının normal yapıda olduğu ayırt ediliyordu (Resim 16). Yine kumulus ooforusu oluşmuş tersiyer folliküllerde zona pellusida daki düzensizlik sürerken diğer yapısal değişimlerin normal yapıya yakınlaştığı ayırt ediliyordu (Resim 17). TUNEL Bulguları: TUNEL uygulama yapılmış kontrol ve melatonin gruplarında apoptotik cisim ve hücreler oldukça az olmasına karşın (Resim 18a, 18c); radyasyon uygulanan grupta özellikle atreziye giden folliküllerin yoğunluğuna koşut olarak; apoptotik hücre ve cisimlerin ağırlıklı olarak granüloza hücre katmanında yaygın olduğu belirgindi (Resim 18b). Radyasyon + melatonin uygulanan grupta ise apoptozisin yaygınlığının azaldığı ayırt edildi (Resim18d). PCNA Bulguları: PCNA immünohistokimya boyaması yapılmış kontrol grubunda, primordiyal folliküller ile tek sıralı ve çok sıralı hücre katmanı içeren primer folliküllerde ağırlıklı olarak çekirdek boyanmasının yaygınlığı 41

55 ilgi çekiciydi (Resim 19a, 19b). Oosit hücre çekirdeğinde de yoğun boyanma ayırt ediliyordu (Resim 20a). Korpus luteum da ise boyanmanın az sayıda hücrede ve zayıf olduğu dikkati çekiyordu. Yine sekonder ve tersiyer folliküllerde de boyanma aynıydı (Resim 20a, 20b). Radyasyon uygulanan grupların PCNA boyamalarında ışık mikroskop düzeyinde görülen değişimlerin belirginliğinin yanı sıra primordiyal, gelişen ve çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde ve korpus luteum da tutulumun, kontrol grubuna karşın daha az sayıda hücrede zayıftan ortaya değiştiği izlenirken (Resim 21); atreziye giden folliküllerde hücrelerin daha PCNA pozitifliğe doğru gittiği dikkati çekiyordu (Resim 22). Aynı durum teka interna da da dikkati çekiyordu. Tutulumun kontrol grubu ile karşılaştırıldığında zayıf iken, aynı gruba ait atretik folliküllere oranla kuvvetli olduğu izleniyordu (Resim 22). Melatonin uygulanan grupta PCNA tutulumu tüm yapılarda kontrol grubuna eşdeşti (Resim 23, 24, 25). Radyasyon + melatonin uygulanan grupta, sadece radyasyon uygulanan gruba karşın, PCNA tutulumunun oldukça belirgin olarak arttığı dikkati çekti. Tutulum granüloza hücrelerinde, oositte, teka interna hücrelerinde (Resim 26) ve atretik folliküllerde de belirgindi (Resim 27). 42

56 Resim 1A,B. Kontrol grubuna ait resimlerde stromada ( ) yaygın stromal hücreler, primer folliküllerin ( ) yanı sıra atretik folliküller ( ) ve korpus luteum ( ) izleniyor. Küçük büyütmeli resimlerde primer folliküller ( ), sekonder ( ) ve Graaf folliküllerinin ( ) yanında atretik folliküller ( ) de görülüyor (Hematoksilen-Eozin 1a x400, 1b x100). 43

57 Resim 2. Kontrol grubuna ait çok sıralı granüloza hücre katmanı ( ) içeren primer folliküllerde gelişkin zona pellusida ( ), çekirdek ( ) ve çekirdekçiği (<) belirgin oosit I (ӿ) izleniyor. Teka internanın ( ) hücresel yapısı ve damarlanması ayırt edilirken teka eksternanın ( ) ovaryum stromasıyla karıştığı görülüyor (Hematoksilen-Eozin x400). 44

58 Resim 3. Kontrol grubuna ait resimlerde antrumu ( ) belirginleşmiş sekonder folliküllerde oosit I (ӿ), zona pellusida ( ) ve granüloza katmanı ( ) izleniyor. Ayrıca korpus luteum da ( ) normal hücresel yapısıyla dikkati çekiyor (Hematoksilen-Eozin x400). 45

59 Resim 4. Kontrol grubuna ait resimlerde Graaf follikülünde kumulus ooforus ( ) ve stratum granulozum ( ) gözlemleniyor. Zona pellusida ( ) ve oosit (ӿ) normal görünümde izleniyor (Hematoksilen-Eozin x400). 46

60 Resim 5. Kontrol grubunda korpus luteumda luteal hücreler ( ) belirgin (Hematoksilen-Eozin x400). 47

61 Resim 6A,B: Radyasyon uygulanan grupta primordiyal folliküller ( ), korpus luteum ve germinal epitel ( ) normal yapıda izleniyor. Aynı zamanda atreziye giden ( ) gelişen folliküller de dikkati çekiyor. Küçük büyültmeli resimlerde bir sekonder follikül ve atreziye giden oldukça fazla sayıda follikül gözleniyor (Hematoksilen- Eozin 6a x400, 6b x100). 48

62 Resim 7A,B. Radyasyon uygulanan grupta çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer ( ) ve antrumu ( ) oluşmaya başlayan sekonder folliküllerde granüloza hücre katmanlarının özellikle orta bölgesinde dejenerasyona giden hücreler ( ) ayırt ediliyor. Yine bu folliküllerde zona pellusidanın ( ) kalınlı inceli bir düzende olduğu da dikkati çekiyor (Hematoksilen-Eozin x400). 49

63 Resim 8A,B. Radyasyon uygulanan grupta primer folliküllerde atreziye gidişin ( ) ilk belirtisi olarak oositin (ӿ) ve zona pellusidanın ( ) düzenleniminin bozulduğu ve bol miktarda apoptotik cisimcikler ( ) içerdiği ilgiyi çekiyor. Korpus luteum ( ) normal yapıda izleniyor (8a). Ayrıca yine atreziye giden ( ) bir Graaf follikülünün de çok sayıda apoptotik cisim ( ) içerdiği dikkati çekiyor (8b) (Hematoksilen-Eozin x400). 50

64 Resim 9A,B. Melatonin uygulanan grupta küçük büyültmeli resimlerde tüm ovaryum yapılarının normal görünüm sergilediği izleniyor. Büyük büyültmeli resimlerde oosit (ӿ), zona pellusida ( ), germinal epitel ( ), kumulus ooforus ( ) gibi ovaryum yapılarının kontrol grubu ile eşdeş olduğu gözlemleniyor (Hematoksilen-Eozin x400). 51

65 Resim 10. Melatonin uygulanan grupta büyük büyültmeli resimlerde germinal epitel ( ) ve primordiyal folliküller ( ) ile normal yapıda korpus luteum ( ) ayırt ediliyor (Hematoksilen-Eozin x400). 52

66 Resim 11A,B. Melatonin uygulanan grupta çok sıralı granüloza hücre katmanı ( ) içeren antrumu ( ) oluşmuş sekonder folliküllerde oosit (ӿ), zona pellusida ( ), teka interna ( ) ve eksterna ( ) katmanı belirgin (11a). Yine çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde oosit (ӿ), zona pellusida ( ) ve granüloza hücre katmanları ( ) gözlemleniyor (11b) (Hematoksilen-Eozin x400). 53

67 Resim 12. Melatonin uygulanan gruba ait büyük büyültmeli resimlerde kumulus ooforus ( ) ve antrum ( ) ile Graaf follikülü izleniyor (Hematoksilen-Eozin x400). 54

68 Resim 13. Melatonin uygulanan gruba ait büyük büyültmeli resimlerde teka interna ( ) ve eksterna ( ), korpus luteum ( ) normal yapıda ayırt ediliyor (Hematoksilen-Eozin x400). 55

69 Resim 14A,B. Radyasyon+ melatonin uygulanan grupta küçük büyültmeli resimlerde atreziye giden folliküller ( ) ayırt ediliyor. Büyük büyültmeli resimlerde yüzey epiteli ( ), primordiyal ( )ve primer ( ) folliküller belirgin (Hematoksilen- Eozin 14a x400, 14b x40). 56

70 Resim 15. Radyasyon + melatonin uygulanan grupta çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde oosit (ӿ), zona pellusida ( ) ve granüloza hücre katmanı ( ) ile teka interna ( ) ve eksterna ( ) normal yapıda izleniyor. Korpus luteum da ( ) belirgin (Hematoksilen-Eozin x400). 57

71 Resim 16. Radyasyon + melatonin uygulanan grupta, antrumu ( ) oluşmaya başlamış erken evre sekonder follikülde zona pellusida daki ( ) düzensiz yerleşimin sürdüğü ancak granüloza hücre katmanının ( ) normal yapıda olduğu izleniyor (Hematoksilen-Eozin x400). 58

72 Resim 17. Radyasyon+ melatonin uygulanan gruba ait büyük büyültmeli resimlerde kumulus ooforusu ( ) oluşmuş tersiyer folliküllerde zona pellusidadaki ( ) düzensizliğin sürdüğü izleniyor (Hematoksilen-Eozin x400). 59

73 Resim 18A, B, C, D. TUNEL ile boyanan kontrol (18a) ve melatonin uygulanan (18c) gruplarda pozitif hücrelerin oldukça az olduğu, radyasyon grubunda (18b) ise atretik folliküllerin yoğunluğuna koşut tutulumun arttığı görülüyor. Radyasyon + melatonin uygulanan grupta ise pozitif hücre yaygınlığının azaldığı gözlemleniyor ( ): apoptotik hücre ve cisimler. (TUNEL- metilen yeşili x400) 60

74 Resim 19A, B. PCNA immünohistokimya boyaması yapılmış kontrol grubunda primordiyal ( ) ve tek sıralı hücre katmanı içeren primer folliküllerde ( ) boyanmanın oldukça yoğun olduğu izleniyor (19a). Çok sıralı hücre katmanı içeren folliküllerde de tutulumun ( ) yaygınlığı gözlemleniyor (19b) (antipcna - Hematoksilen x400). 61

75 Resim 20A, B. PCNA boyaması yapılan kontrol grubuna ait kesitlerde sekonder (20a) ve Graaf folliküllerinde (20b) oosit (ӿ) ve granüloza hücrelerinde ( ) yoğun boyanma izleniyor. Korpus luteumda ( ) ise boyanmanın az sayıda hücrede olduğu dikkati çekiyor. ( ): yoğun boyanma gösteren hücre çekirdekleri (antipcna- Hematoksilen x400). 62

76 Resim 21. Radyasyon uygulanan grupların PCNA boyanmalarında primordiyal ( ), çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde ( ) ve korpus luteumda ( ) tutulumun kontrol grubuna karşın daha az olduğu izleniyor (antipcna- Hematoksilen x400). 63

77 Resim 22. Radyasyon uygulanan grupta atreziye giden folliküllerde ( ) hücrelerin daha PCNA pozitifliğe doğru gittiği, teka interna da ( ) da aynı görünüm sergilediği izleniyor (antipcna- Hematoksilen x400). 64

78 Resim 23. Melatonin uygulanan grupta PCNA boyamasının, oosit (ӿ), teka interna ( ) ve eksternada ( ) kontrol grubuna eşdeş olduğu görülüyor (antipcna- Hematoksilen x400). 65

79 Resim 24. PCNA ile boyanan melatonin uygulanan grupta büyük büyültmeli resimlerde oosit (ӿ), teka interna ( ) ve eksterna ( ), korpus luteumdaki ( ) boyanmanın kontrol grubu ile eşdeş olduğu görülüyor (antipcna- Hematoksilen x400). 66

80 Resim 25. Melatonin uygulanan grubun PCNA boyanmalarında primordiyal folliküller ( ) ve primer folliküllerde ( ), oosit (ӿ) ve granüloza hücre katmanındaki ( ) tutulumun kontrol grubuna eşdeş olduğu izleniyor (antipcna- Hematoksilen x400). 67

81 Resim 26. Radyasyon + melatonin uygulanan grupta çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde PCNA tutulumunun granüloza hücrelerinde ( ) ve teka interna da ( ) arttığı izleniyor (antipcna- Hematoksilen x400). 68

82 Resim 27. Radyasyon + melatonin uygulanan grupta PCNA tutulumu çok sıralı granüloza hücre katmanı içeren primer folliküllerde oosit I (ӿ) ve granüloza hücre katmanında ( ) izlenirken, atretik folliküllerde ( ) de belirgin immünreaktivite görülüyor (antipcna- Hematoksilen x400). 69

83 4.2. İstatistiksel Bulgular Çalışmamızda istatistiksel olarak vücut ağırlıkları ile ovaryum dokusu kuru ağırlıkları karşılaştırıldı. Yapılan ölçümler sonucunda vücut ağırlıkları ve ovaryum kuru ağırlıkları değerlendirildiğinde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark görülmedi (p>0,05) (Grafik 1-2). Zona pellusida kalınlıkları yönünden yapılan değerlendirmede ise gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olduğu belirlendi; radyasyon uygulanan grupta zona pellusida kalınlığının diğer gruplarla karşılaştırıldığında artmış olduğu izlendi (p 0.05) (Grafik 3a,b). Primordiyal follikül (Grafik 4a,b) ve korpus luteum (Grafik 7a,b) sayısı yönünden yapılan değerlendirmede gruplar arasında anlamlı bir fark yoktu (p>0,05). Gelişen folliküller (Grafik 5a,b) ve atretik (Grafik 6a,b) folliküllerin sayısı yönünden yapılan istatistiksel değerlendirmede gruplar arasında farklılık saptandı (p 0.05); Radyasyon uygulanan grupta gelişen follikül sayısının istatistiksel olarak anlamlı olarak azaldığı, atretik follikül sayısının ise arttığı belirlendi (p 0.05). 70

84 Grafik 1. Gruplar arasında Wistar albino cinsi dişi sıçanların vücut ağırlıklarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Grafik 2. Gruplar arasında ovaryum dokusu ağırlıklarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi 71

85 Grafik 3A. Gruplar arasında zona pellusida kalınlığı ortalamalarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Grafik 3B. Gruplar arasında zona pellusida kalınlığı ortalamalarında %5 lik hata çubukları ile betimleyici istatistikler 72

86 Grafik 4A. Gruplar arasında primordiyal follikül sayılarının ortalamalarının istatistiksel olarak değerlendirmesi Grafik 4B. Gruplar arasında primordiyal follikül sayılarının %5 lik hata çubukları ile betimleyici istatistikler 73

87 Grafik 5A. Gruplar arasında gelişen follikül sayılarının ortalamalarının istatistiksel olarak değerlendirmesi Grafik 5B. Gruplar arasında gelişen follikül sayılarının ortalamalarında %5 lik hata çubukları ile betimleyici istatistikler 74

88 Grafik 6A. Gruplar arasında atretik follikül sayılarının ortalamalarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Grafik 6B. Gruplar arasında atretik follikül sayılarının ortalamalarında %5 lik hata çubukları ile betimleyici istatistikler 75

89 Grafik 7A: Gruplar arasında korpus luteum sayısı ortalamalarının istatistiksel olarak değerlendirilmesi Grafik 7B: Gruplar arasında korpus luteum sayısı ortalamalarında %5 lik hata çubukları ile betimleyici istatistikler 76