FEBR L NÖTROPEN L HASTALARDA KAND DAYA ÖZGÜL TAQ-MAN PZR'IN NVAZ V FUNGAL NFEKS YON TANISINDAK DE ER *,**

Transkript

1 ANKEM Derg 2007;21(1): FEBR L NÖTROPEN L HASTALARDA KAND DAYA ÖZGÜL TAQ-MAN PZR'IN NVAZ V FUNGAL NFEKS YON TANISINDAK DE ER *,** Fatma BUDAK*, Sema KEÇEL ÖZCAN*, Birsen MUTLU**, Haluk VAHABO LU** *Kocaeli Üniversitesi T p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal, Umuttepe, KOCAEL **Kocaeli Üniversitesi T p Fakültesi, Klinik Bakteriyoloji ve nfeksiyon Hastal klar Anabilim Dal, Umuttepe, KOCAEL ÖZET Kocaeli Üniversitesi T p Fakültesi Hastanesi'nde izlenen, 3 gün antibakteriyel tedaviye yan t vermeyen, European Organisation for Research and Treatment of Cancer/Mycosis Study Group (EORTC/MSG) kriterlerine göre olas ve yüksek olas l kl fungal infeksiyonu düflünülen febril nötropenik hastalarda, Taq-Man Polimeraz Zincir Reaksiyonu yöntemi (Taq-Man PZR) ile Candida türlerinin varl araflt r lm flt r y llar aras nda 33 hastadan, 8'i pediatrik olmak üzere 34 serum örne i al nm flt r. Tüm mantar türlerinde ortak olan 5.8S ve 28S rdna'ya yönelik primerler ve tüm Candida türlerini saptamaya yönelik probe (All-CAN-TET) kullan lm flt r. Serum örnekleri, primer ve SYBR Green I boyas kullan larak gerçek zamanl PZR metodu ile tekrar edilmifltir. Bu yöntem ile sadece bir (% 2.9) rabdomiyosarkomlu çocuk hastada Candida DNA's saptanm flt r. Hiç bir hastan n kan kültüründe üreme olmam flt r. nvaziv kandidozun tan s nda kültür ve serolojik testler ile birlikte hastal n erken döneminde yap lan Candida özgün PZR testi prognoz ve tedavide yol gösterici olacakt r. Anahtar sözcükler: Candida albicans, febril nötropeni, polimeraz zincir reaksiyonu, Taq-Man PZR SUMMARY The Value of Candida Specific Taq-Man PCR in Diagnosis of Invaziv Fungal Infections of Febrile Neutropenic Patients In the febrile neutropenic patients who were not responsive to antibiotic therapy for three days and suspicious of probable and high risk fungal infection were investigated for the presence of Candida spp. by Polimerase Chain Reaction (PCR) according to European Organisation for Research and Treatment of Cancer/Mycosis Study Group (EORTC/MSG). Totally 34 serum samples (8 pediatric) from 33 febrile neutropenic patients followed in the University Hospital of Kocaeli University were collected from 2002 to Candida DNA was investigated by Taq-Man PCR using common fungal primers that detect 5.8S and 28s rdna and a probe (ALL CAN-TET) that detects all Candida spp. All serum samples were also studied by real-time PCR using primer and SYBR Green I dye. Candida DNA was positive only in one (2.9 %) pediatric patient with rabdomyosarcoma. There was no growth in blood cultures of patients. In the diagnosis of invasive candidiasis, Candida spesific PCR tests which were carried out at early stages with culture and serologic tests will be helpful in prognosis and treatment. Keywords: Candida albicans, febrile neutropenia, polymerase chain reaction, Taq-Man PCR Yaz flma adresi: Fatma Budak. Kocaeli Üniversitesi T p Fakültesi, Mikrobiyoloji ve Klinik Mikrobiyoloji Anabilim Dal, Umuttepe Kampüsü, KOCAEL Tel.: (0262) , GSM: (0505) e-posta: fatma.budak@isbank.net.tr Al nd tarih: , revizyon kabulü: *Bu çal flma Kocaeli Üniversitesi T p Fakültesi Bilimsel Araflt rmalar Merkezi (Proje no.2003/41) taraf ndan desteklenmifltir. **XII. Türk Klinik Mikrobiyoloji ve nfeksiyon Hastal klar (KL M K 2005) Kongresi'nde sunulmufltur (16-20 Kas m 2005, Antalya) 14

2 Febril nötropenili hastalarda kandidaya özgül Taq-Man PZR n invaziv fungal infeksiyon tan s ndaki de eri G R fi nvaziv mantar infeksiyonlar, özellikle transplant ve hematolojik kanser hastalar olmak üzere önemli morbidite ve mortalite nedenidir. nvaziv mantar infeksiyonu etkeni olarak nötropenik hastalarda en s k Candida türleri gözlenmektedir (8,13). nvaziv Candida infeksiyonlar n n tan s kan kültürü, serolojik olarak Candida mannan antijenin gösterilmesi, histopatolojik preperatlarda Candida'ya ait hif, psödohif veya blastokonidiumlar n görülmesi, radyolojik olarak özgül görüntülerin saptanmas ve klinik bulgular n varl ile konmaktad r. Candida türleri kan kültürlerinin % 8-15'inden izole edilmektedir. Son y llarda, kültürde üretilemeyen mantar infeksiyonu etkenlerinin moleküler yöntemler kullan larak gösterilmesi önemli avantajlar getirmifltir. Bu çal flmada, hastanemizde yatan invaziv mantar infeksiyonu flüphesi olan febril nötropenili hastalarda bir gerçek zamanl Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) yöntemi olan Taq-Man PZR ile Candida DNA's n n gösterilmesi amaçlanm flt r. GEREÇ VE YÖNTEM Olgular: Vücut s s oral veya aksiller tek sefer 38.3 C ve üstü veya bir saat süreyle C aras olarak ölçülen ve nötrofil düzeyi 500/mm 3 alt nda olan hastalar febril nötropenik olarak kabul edilmifltir. Çal flmaya al nan hastalar European Organisation for Research and Treatment of Cancer/Mycosis Study Group (EORTC/MSG) rehberine göre s n fland r lm flt r (2). Buna göre; en az ndan bir konak kriteri ve infeksiyon ile iliflkili bir klinik kriteri (mikrobiyolojik kriter yok) olan hastalar olas veya düflük olas l kl invaziv fungal infeksiyon ( F ) olarak de erlendirilmifltir. Bunlardan toplam 34 serum örne i al nm flt r. Kocaeli Üniversitesi Etik Kurul Onay al nm flt r. Kocaeli Üniversitesi T p Fakültesi Hastanesi Çocuk Hematoloji-Onkoloji Servisi'nde y llar aras nda izlenen, febril nötropenik atak geçiren ve antibiyotik tedavisine yan t vermeyen 7 hastadan, birinden iki olmak üzere, 8 kan örne i al nm flt r. Yedi hastam z n 3'ünde akut lenfoblastik lösemi (ALL), 2'sinde rabdomiyosarkom, birinde akut miyeloblastik lösemi (AML), birinde non-hodgkin lenfoma tan s konmufltur. Hastalar n ataklar s ras nda sefepim, karbapenem ve seftazidim, gerekti inde glikopeptid ve antifungal kombinasyonlar uygulanm flt r. Kocaeli Üniversitesi T p Fakültesi Hastanesi ç Hastal klar Anabilim Dal Hematoloji Servisinde y llar aras nda izlenen febril nötropenik atak geçiren 26 hastadan kan örne i al nm flt r. Hastalar n 20'sine hematolojik malignensi, 6's na AML tan s konmufltur. Yirmialt hastaya febril nötropeni ata s ras nda piperasilin/tazobaktam+amikasin, gerekti inde glikopeptid ve antifungal kombinasyonlar uygulanm flt r. Kan kültürü: Üç gün antibiyotik tedavisi sonunda, atefli halen düflmeyen hastalardan antifungal tedaviye bafllamadan kan örne i al narak BACTEC (9050 B-D, Maryland, ABD) kan kültür fliflelerine ekim yap lm flt r. Al nan kan n 5 ml'si g'de 10 dak. santrifüj edilerek serumu ayr l p çal flma yap lana kadar -80 C'de saklanm flt r. Hemolizli serum örnekleri çal flma d - fl b rak lm flt r. DNA izolasyonu: Serumlardan ve pozitif kontrollerden fenol/kloroform yöntemi ile DNA izolasyonu yap lm flt r (14). Serum miktar - na eflit hacimde lizis tampon [6 M guanidyum siyanat 50 mm Tris-HCl (ph:8), % 20 sarkosil, 5 M sodyum asetat] konularak 10 dak. kaynar su banyosunda tutulmufltur. Üzerine fenol kloroform/izoamil alkol konmufl ve 10 dak g'de santrifüje edilmifltir. Daha sonra süpernatant al nm fl ve üzerine izopropanolol eklenerek 15 dak. oda s s nda beklenmifltir. Tekrar 10 dak g'de santrifüj iflleminden sonra süpernatant at lm flt r. Pelet üzerine % 70 alkolden 1 ml konularak 5 dak g'de santrifüje edilmifl ve süpernatant at lm flt r. Pelet oda s s nda 5 dak. kurutularak 30 µl TE tamponu ile çözülmüfltür. Taq-Man PZR yöntemi: Tüm mantar türlerinde ortak olan 5.8S ve 28S rdna'ya yönelik primerler ITS3 (5'GCATCGATGAAGAACG- 15

3 F. Budak ve ark. CAGC-3') ve ITS4 (5'TCCTCCGCTTATTGA- TATGC-3') (18) ve tüm Candida türlerini saptamaya yönelik prob All-CAN-TET (5'TET-AGG- GCATGCCTGTTTGAGCGTC3'-P-TAMRA) (15) kullan larak Taq-Man PZR (Techne, Quantica) yöntemi ile Candida DNA's araflt r lm flt r. Her kuyucu a 5 µl örnek DNA's, 25 µl Taq-Man PZR kar fl m konmufltur. Her reaksiyonda C.albicans ATCC 90028, C.krusei ATCC 6258 ve C.parapsilosis ATCC sufllar 10 6 hücre/ml'den, 10 1 hücre/ml'e kadar seri suland r lm fl ve bu suland r mlardan izole edilen DNA'lar standart olarak kullan lm flt r. Sa l kl kiflilerin serumuna, kontrol sufllar n n dilüsyonlar direkt olarak konmufltur. Her reaksiyonda negatif kontrol eklenmifltir. Tüm örnekler, primer ve SYBR-Green I boyas kullan larak gerçek zamanl PZR metodu ile tekrar çal fl lm flt r. PZR sonuçlar kan kültür sonuçlar ile karfl laflt r lm flt r. BULGULAR Çal flmam za al nan hastalar n 34'ü EORTC/MSG rehberine göre olas F olarak de erlendirilmifltir. Rabdomiyosarkomlu bir çocuk hastada Taq-Man PZR ve SYBR-Green ile gerçek zamanl PZR yöntemiyle Candida DNA's saptanm flt r (% 2.9). Bu hastada mutlak nötrofil say s 10/mm 3 olarak bulunmufl, akci er mayenesinde raller duyulmufl ve Streptococcus pneumoniae bakteriyemisi saptanm flt r. Hasta teikoplanin ve lipozomal amfoterisin-b tedavisi görerek flifa ile taburcu edilmifltir. Taq-Man PZR ile kontrol sufllar n n dilüsyonlar direkt kondu unda 10 3 hücre/ml'ye kadar pozitiflik gözlenirken, DNA izolasyonu sonras 10 4 hücre/ml'e düflmüfltür. Hiçbir hastan n kan kültüründe üreme saptanmam flt r. TARTIfiMA nvaziv mantar infeksiyonlar, ba fl kl k sistemi bask lanm fl hastalarda morbidite ve mortaliteyi artt rmaktad r. Bu nedenle, bu hasta grubunda mantar infeksiyonlar n n erken tan ve tedavisi hayat kurtar c olmaktad r. nvaziv mantar infeksiyonlar n n etkeni olan mantarlar, s kl k s ras na göre Candida ve Aspergillus ve dimorfik mantar türleridir. nvaziv mantar infeksiyonlar n n tan s nda geleneksel yöntemler olan mikroskobik inceleme, kan kültürü, antijen veya antikor tayini gibi yöntemler kullan lmaktad r (4,12). Ayr ca, bütün infeksiyon hastal klar - n n tan s nda oldu u gibi mantar infeksiyonlar nda da moleküler yöntemler kullan larak önemli geliflmeler kaydedilece i vurgulanm flt r (1). Bununla birlikte, moleküler yöntemler geleneksel yöntemleri tamamlay c teknikler olarak kabul edilmektedir. Candida PZR yöntemi tan amaçl olarak az say da baz üniversite hastanelerimizde kullan lmaktad r. 1990'lar n bafl ndan itibaren, immunsüprese hastalarda Candida infeksiyonlar n tan s nda kullan lan moleküler yöntemler araflt rma laboratuvarlar n deneyimi olarak sunulmaya bafllanm flt r. Yap lan bir çal flmada, pozitif kan kültür fliflelerinde uygulanan PZR-EIA (Enzim Immun Assay) yöntemi ile Candida pozitifli i % 42.4 oran nda bulunmufltur (15). Hematolojik maligniteli hastalar n febril nötropenik ataklar s ras nda al nan serum örneklerinde restriksiyon enzim analizine dayanan PZR yöntemi ile % 43 oran nda Candida pozitifli i bulunmufltur (13). Bu yöntemin yüksek negatif prediktif de eri bulunmufltur (% 97.5). Baflka bir çal flmada ise invaziv mantar infeksiyonu olan 36 hastan n 214 serum örne inde % 14.9 oran nda Candida gerçek zamanl PZR pozitifli i (duyarl l % 95, özgüllü ü % 97) bulunmufltur (17). Einsele ve ark. (5) Candida ile kolonize olan hastalarda, 28S rrna'ya yönelik moleküler prob kullan larak PZR ile % 1.5 oran nda pozitiflik saptam fllard r. Bu yöntemin duyarl l % 100, özgüllü- ü % 98 olarak belirlenmifltir. Gerçek zamanl PZR yöntemleri k sa sürede sonuç vermesi ve fungal yükün saptanmas ile tedavinin izlenmesi aç s ndan önemlidir (10). Ayr ca gerçek zamanl PZR ile yap lan bir çal flmada Candida spp. için amplifikasyonun % 100 spesifik oldu u belirtilmifltir (9). Ülkemizde yap lan bir çal flmada gerçek zamanl PZR ile ba fl kl k sistemi bask lanm fl 50 hasta serumunun % 26's nda fungal patojen pozitifli i saptanm flt r (6). Ifl k ve ark. (7) 16

4 Febril nötropenili hastalarda kandidaya özgül Taq-Man PZR n invaziv fungal infeksiyon tan s ndaki de eri gerçek zamanl PZR yöntemi kullanarak SYBR- Green I boyas ile hastalar n % 25'inde DNA miktar n n artt n gözlemifllerdir. Çal flmam zda Candida'ya özgün prob ve mantarlara yönelik primerler ile Taq-Man PZR yöntemi çal fl ld ktan sonra primerlerle SYBR- Green I boyas kullan larak örnekler tekrar çal - fl lm flt r. Her iki yöntemle de rabdomiyosarkom tan l febril nötropenili bir (% 2.9) pediatrik hastada pozitiflik bulunmufltur. Çal flmam zdaki bu düflük pozitiflik oran, belki hasta say m - z n az oluflu; hastalar m zdan do ru zamanda örnek al namamas veya antifungal tedaviye erken bafllanmas veya kültür pozitifli inin olmamas nedeniyle olabilir. Ayr ca hasta say s n artt rmak özellikle yüksek olas l kl F hasta grubunu çal flmaya almak bize yol gösterici olacakt r. Düflük pozitifli in bir baflka nedeni de, örnek olarak serumun tercih edilmesi olabilir. Yap lan bir çal flmada, kandidemi tan s nda kullan lacak klinik örne in serum veya kan m olaca konusunda farkl görüfller bulunmaktad r (3). Buna göre, yap lan baz çal flmalarda; tam kan örne inde, hücre içeren pelet haz rlanarak mantar DNA's n n araflt r lmas n n daha duyarl oldu u gösterilmifltir (16). Bunun d fl nda hastam zda örnek al nmas s ras nda deriden kontaminasyon, laboratuvarda çal fl lan ortamda kullan lan laboratuvar malzemelerinden dolay yalanc pozitiflik de söz konusu olabilir. Morace ve ark. (13) 'n n çal flmas nda bu oran % 25 olarak bulunmufltur. Bunun için negatif kontrol say s - n art rmak ve malzemeleri ultraviyoleye tutmak gereklidir. Günümüzde moleküler yöntemlerin kullan m nda baz standardizasyon sorunlar yaflanmaktad r. Bunlar n ilki uygulanan yöntemin do rudan kendisinin zay f yönlerinden, di eri ise Candida'n n genom yap s ndan kaynaklan r (11). Gerçek zamanl PZR yöntemi, ancak tan sal moleküler biyoloji laboratuvar nda yap labilmektedir ve bu konuda e itim alm fl elemanlara gereksinim vard r. Ayr ca, ökaryotlarda görülen do al rekombinasyonlardan dolay oluflan allelik de iflkenlikler sonucu ve Candida'lar n dimorfik yap da olmalar ndan kaynaklanan sorunlar vard r. Bunun yan nda gerçek zamanl PZR yöntemi ile uyumlu olan çeflitli ticari mantar DNA izolasyon yöntemleri vard r (11). Erken tan ve tedavinin prognoza etkisini izlemek invaziv mantar infeksiyonu olan hastalarda hayat kurtar c d r. Tan n n erken yap lmas sonucu toksik yan etkileri olabilen antifungal tedaviye karar vermek daha gerçekçi olacakt r. nvaziv kandidozun tan s nda kültür ve serolojik testler ile birlikte hastal n erken döneminde yap lan Candida özgün PZR testi prognoz ve tedavide yol gösterici olacakt r. KAYNAKLAR 1. Alexander BD: Diagnosis of fungal infection: new technologies for the mycology laboratory, Transplant Infect Dis 2002;4(Suppl 3): Ascioglu S, Rex JH, de Pauw B et al and Invasive Fungal Infections Cooperative Group of the European Organization for Research and Treatment of Cancer; Mycoses Study Group of the National Institute of Allergy and Infectious Diseases: Defining opportunistic invasive fungal infections in immunocompromised patients with cancer and hematopoietic stem cell transplants: an international concensus, Clin Infect Dis 2002;34(1): Bougnoux M, Dupont C, Mateo J et al: Serum is more suitable than whole blood for diagnosis of systemic candidiasis by nested PCR, J Clin Microbiol 1999;37(4): Brandt ME, Warnock DW: Laborator aspects of medical mycology, Dismukes WE, Pappas PG, Sobel JD (eds): Clinical Mycology kitab nda s.1-22, Oxford University Press, New York (2003). 5. Einsele H, Hebart H, Roller G et al: Detection and identification of fungal pathogens in blood by using molecular probes, J Clin Microbiol 1997;35(6): Ifl k N, A açfidan A, A rbafll H ve ark: Ba fl kl k sistemi bask lanm fl hastalarda real time polimeraz zincir reaksiyonu ile mantar infeksiyonlar n n tan ve takibi, nfeksiyon Derg 2004;18(1): Ifl k N, Mills K: Using PCR and Real-Time PCR (Light Cycler) for diagnosis and follow up of invasive fungal infections in patients with hematological malignancies and transplantation, Turk J Haematol 2003;20(2): Jones ME, Fox AJ, Barnes AJ et al: PCR-ELISA for the early diagnosis of invasive pulmonary aspergillosis infection in neutropenic patients, J Clin Pathol 1998;51(9): Klingspor L, Jalal S: Molecular detection and identification of Candida and Aspergillosis spp. from clinical samples using real time PCR, Clin Microbiol Infect 2006;12(8): Loeffler J, Hebart H, Henke N, Schmidt K, Einsele H: Quantification and specification of fungal DNA in clinical specimens using the light cycler instrument, Reischl U, Witter C, Cockerill F (eds): Rapid Cycle Real-Time PZR. Methods and Applications kitab nda s , Springer Verlag, 17

5 F. Budak ve ark. New York (2002). 11. Maaroufi Y, Ahariz N, Husson M, Crokaert F: Comparison of different methods of isolation DNA of commonly encountered Candida spp. and its quantitation by using a realtime PCR-based assay, J Clin Microbiol 2004;42(7): McLintock LA, Jones BL: Advances in the molecular and serological diagnosis of invasive fungal infection in haemato-oncology patients, Br J Haematol 2004;126(3): Morace G, Pagano L, Sanguinetti M et al: PCR-restriction enzyme analysis for detection of Candida DNA in blood from febrile patients with hematological malignancies, J Clin Microbiol 1999;37(6): Sandhu GS, Kleine BC, Stockman L, Roberts GD: Molecular probes for diagnosis of fungal infections, J Clin Microbiol 1995;33(11): Shin JH, Nolte FS, Morrison CJ: Rapid identification of Candida species from blood culture using a clinically useful PCR method, J Clin Microbiol 1997;35(6): Taylor JW, Geiser DM, Burt A, Koufopanou V: The evolutionary biology and population genetics underlying fungal strain typing, Clin Microbiol Rev 1999;12(1): White PL, Archer AE, Barnes R: Comparison of non-culture based methods for detection of systemic fungal infections, with an emphasis on invasive Candida infections, J Clin Microbiol 2005;43(5): White TJ, Burns TD, Lee SB, Taylor JW: Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics, Innis MA, Helfand DH, Sninsky JJ, White TJ (eds): PCR Protocols kitab nda s , Academic Press Inc, San Diego (1990). 18