YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN KÜLTÜR FİLTRATLARI VE EKZOPOLİSAKKARİTLERİNİN (EPS) BİFİDOBAKTERİLERİN GELİŞİMİNİ DÜZENLEYİCİ (BGD) VE ANTİBİYOFİLM ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ Halime SARIKAYA YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ NİSAN 2014 ANKARA

2 TEZ BİLDİRİMİ Tez içindeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edilerek sunulduğunu, ayrıca tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü kaynağa eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. Halime SARIKAYA

3

4 iv LAKTİK ASİT BAKTERİLERİNİN KÜLTÜR FİLTRATLARI VE EKZOPOLİSAKKARİTLERİNİN (EPS) BİFİDOBAKTERİLERİN GELİŞİMİNİ DÜZENLEYİCİ (BGD) VE ANTİBİYOFİLM ETKİLERİNİN BELİRLENMESİ (Yüksek Lisans Tezi) Halime SARIKAYA GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Nisan 2014 ÖZET Bu çalışmada, gıda ve gaita kaynaklı bakteri suşlarından, daha önce yapılan çalışmalarda probiyotik özellikleriyle öne çıkmış 6 adet laktik asit bakterisi suşu (L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3, L. delbrueckii ssp. bulgaricus A12, L. fermentum LB69, L. paracasei LB8, L. plantarum GD2, L. rhamnosus GD11) kullanılmıştır. Bu suşların ekzopolisakkarit (EPS) üretimleri, EPS lerinin monosakkarit kompozisyonları, bifidobakterilerin (B. breve A28 ve BASO1) gelişimini düzenleyici (BGD) etkileri ve antibiyofilm yetenekleri araştırılmıştır. Kültür ortamında, en yüksek EPS üretim kapasitesi GD11, LB69 ve B3 suşlarında tespit edilmiştir. Kültür ortamından saflaştırılıp, liyofilize edilen EPS lerin monosakkarit kompozisyonları HPLC analizi ile araştırılmış ve tüm suşlarda baskın monomerin mannoz olduğu görülmüştür. En yüksek mannoz oranına sahip suşlar ise LB69 ve GD11 olarak belirlenmiştir. Laktik asit bakterilerinin kültür filtratları ve liyofilize EPS lerinin bifidobakterilerin gelişimini düzenleyici (BGD) etkisi, ticari bir prebiyotik olan inulin ile mukayese edilerek araştırılmıştır. Filtratların ve EPS lerin inulin ile benzer bir şekilde BGD etkisinin olduğu görülmüştür. En yüksek BGD aktivitesi GD11 suşunun kültür filtratında görülmüştür. Elde edilen verilerle yapılan istatistiksel analizlerde, suşların EPS üretim miktarı ile süpernatantlarının

5 v gösterdiği BGD aktivitesi arasında (p<0,05) ve EPS lerin içerdiği mannoz miktarı ile EPS lerin gösterdiği BGD aktivitesi arasında (p<0,05) pozitif bir korelasyon bulunmuştur Bu çalışmada, 13 patojen bakterinin biyofilm oluşturma yetenekleri belirlenmiş ve en yüksek biyofilm yapma yeteneğine sahip olan 4 suş (B. cereus RSKK-863, L. monocytogenes ATCC-7644, E. fecalis ATCC 25175, P. aeruginosa ATCC-72853) antibiyofilm çalışmaları için test bakterisi olarak seçilmiştir. 3 adet laktik asit bakterisinin kültür filtratları ve liyofilize EPS lerinin farklı konsatrasyonları antibiyofilm etkisi bakımından test edilmiştir. En yüksek antibiyofilm etkiyi, LB69 suşunun kültür filtratı B. cereus RSKK-863 suşu üzerinde % 93 biyofilm inhibisyonuyla, liyofilize EPS si de aynı suş üzerinde biyofilmi % 90 inhibe ederek göstermiştir. Elde edilen verilerle yapılan istatistiksel analizlerde, EPS lerin içerdiği mannoz miktarı ile kültür filtratlarının gösterdiği antibiyofilm aktivitesi arasında ve EPS lerin içerdiği mannoz miktarı ile EPS lerin gösterdiği antibiyofilm aktivite arasında güçlü bir korelasyon (p<0,01) bulunmuştur. Bu çalışmada, LB69 ve GD11 suşlarının kültür filtratları ve EPS lerinin hem BGD etkili hem de antibiyofilm etkili ajanlar olarak kullanılabileceği tespit edilmiştir. Bu ajanların oral yolla alınması durumunda, gastrointestinal alanda bulunan bifidobakterilerin gelişimi arttırılarak, konağa yararlı etkilerin sağlanmasının yanı sıra, zararlı bakterilerin biyofilm oluşturmaları engellenerek, hastalıkların önlenmesi ve tedavisi mümkün olabilecektir. Bilim Kodu : Anahtar Kelimeler : Laktik asit bakterisi, Bifidobakteri, Ekzopolisakkarit, Prebiyotik, Bifidobakterilerin gelişimini düzenleyici etki (BGD), antibiyofilm Sayfa Aded : 108 Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Belma ASLIM

6 vi DETERMINATION OF LACTIC ACID BACTERIAS FILTRATES AND THEIR EXOPOLISACCAHARIDES BIFIDOGENIC GROWTH STIMULATOR (BGS) AND ANTIBIOFILM ACTIVITIES (M.Sc. Thesis) Halime SARIKAYA GAZİ UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE April 2014 ABSTRACT In this study, we used 6 lactic acid bacterial strains (L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3, L. delbrueckii ssp. bulgaricus A12, L. fermentum LB69, L. paracasei LB8, L. plantarum GD2, L. rhamnosus GD11) that became prominent in the previous studies due to their probiotic properties, among food-borne and feces derived bacterial strains. This study investigated the exopolysaccharide (EPS) production of these strains, monosaccharide composition of the EPSs, regulatory effects of the EPSs on bifidobacteria development (B. breve A28 and BASO1) and their antibiofilm abilities. In the culture broth, highest EPS production capacity was detected in GD11, LB69 and B3 strains. Monosaccharide compositions of the EPSs that were purified and lyophilized in the culture medium were investigated and dominant monomer was found to be mannose in all strains. Strains with highest mannose concentrations were LB69 and GD11. Culture filtrate of the lactic acid bacteria and regulatory effect of lyophilized EPSs on bifidobacteria development (RBD, regulation of bifidobacteria development) were studied by comparing with a commercially available prebiotic, named inulin. It was seen that filtrates and EPSs showed a similar RBD effect. Highest RBD activity was seen in the culture filtrate of GD11 strain. In the statistical analyses based on the data obtained, positive

7 vii correlations were detected between the amount of EPS produced by the strains and RBD activity exhibited by the supernatants (p<0,05) and between the amount of mannose contained in EPSs and RBD activity shown by EPSs (p<0,05). In this study, the biofilm-forming capacity of 13 pathogen bacteria was determined and four strains with the highest biofilm-forming capacity (B. cereus RSKK-863, L. monocytogenes ATCC-7644, E. fecalis ATCC 25175, P. aeruginosa ATCC-72853) were selected as test bacteria for antibiofilm studies. Different concentrations of culture filtrates and lyophilized EPSs of three lactic acid bacteria were tested for antibiofilm effect. Highest antibiofilm effects were exhibited by the culture filtrate B. cereus RSKK-863 strain of the LB69 strain with a biofilm inhibition of 93% and by lyophilized EPSs that inhibited the biofilm by 90% on the same strain. In the statistical analyses performed using the available data, a strong correlation was found between the amount of mannose present in EPSs and the antibiofilm activity exhibited by the culture filtrates and between the amount of mannose present in EPSs and the antibiofilm activity exhibited by EPSs (p<0,01). In this study, it was concluded that the culture filtrates and EPSs of the LB69 and GD11 strains could be used as efficient agents with both RBD effect and antibiofilm effect. If these agents are taken via oral route, it would be possible to provide beneficial effects for the host by increasing the development of bifidobacteria present in the gastrointestinal tract as well as to prevent and treat the diseases by hindering the biofilm formation by harmful bacteria. Science Code : Key Words : Lactic Acid Bacteria, Bifidobacteria, Exopolisaccaharide, Prebiotic, Bifidogenic growth stimulator activity (BGS), Antibiofilm Page number : 108 Supervisor : Prof. Dr. Belma ASLIM

8 viii TEŞEKKÜR Yüksek lisans öğrenimim süresince ve tez çalışmamın her aşamasında engin bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren, her türlü araştırma olanağını ve desteğini sağlayan, bana gösterdiği sabır ve anlayışla güzel bir çalışma ortamı sağlayan değerli danışman hocam Sayın Prof. Dr. Belma ASLIM a, laboratuvar çalışmalarımı yaptığım Moleküler Biyoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi ile Biyoteknoloji Laboratuvarı ve çalışanlarına, beni bugünlere getiren, maddi ve manevi her türlü desteğiyle beni hiçbir zaman yalnız bırakmayan ve emeklerini asla ödeyemeyeceğim başta babam Ömer SARIKAYA olmak üzere aileme ve arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım.

9 ix İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET... iv ABSTRACT... vi TEŞEKKÜR... viii ÇİZELGELERİN LİSTESİ... xiii ŞEKİLLERİN LİSTESİ...xv RESİMLERİN LİSTESİ... xvi SİMGELER VE KISALTMALAR... xvii 1. GİRİŞ KAYNAK ARAŞTIRMASI Probiyotik Bakteriler Bifidobakterilerin Genel Özellikleri Morfolojisi Fizyolojisi Bifidobakterilerin bağırsak florasında kolonizasyonu Bağırsak florasının bozulması Bifidobakterilerin probiyotik özellikleri Prebiyotiklerin Genel Özellikleri Ticari olarak kullanılan prebiyotikler Prebiyotiklerin kullanım alanları Prebiyotik kullanımının avantaj ve dezavantajları: Prebiyotiklerde yapı-fonksiyon ilişkisi Laktik Asit Bakterileri Laktik asit bakterilerinin metabolitleri...25

10 x Sayfa Ekzopolisakkaritler (EPS) Laktik Asit Bakterilerinin Bifidobakterilerin Gelişimini Düzenleyici (BGD) Etkisi Filtratların BGD etkisi EPS nin prebiyotik olarak kullanımı Mikrobiyal Biyofilm Biyofilmin yapısı Biyofilm oluşumunun aşamaları Sinyal molekülüyle iletişim (quorum sensing) Biyofilm - hastalık ilişkisi Bağırsak mukozasında oluşan biyofilmler Biyofilm oluşumunun kontrolü ve engellenmesi Laktik asit bakterileri ile biyofilm oluşumunun kontrolü ve engellenmesi EPS nin antibiyofilm etkisinin mekanizması MATERYAL VE METOT Materyal Çalışmada kullanılan bakteriler: Çalışmada kullanılan besiyerleri ve çözeltiler Metot Bakterilerin aktifleştirilmesi ve gelişme ortamları Laktik asit bakterilerinden eps izolasyonu Laktik asit bakterilerinin EPS üretimlerinin belirlenmesi EPS lerin monomer kompozisyonunun araştırılması...53

11 xi Sayfa Filtratların BGD etkisinin belirlenmesi EPS'lerin bifidobakteriler tarafından fermente edilebilmelerinin belirlenmesi EPS lerin BGD etkisinin belirlenmesi Bazı patojen bakteri suşlarının biyofilm yapma oranlarının belirlenmesi Laktik asit bakteri kültürlerinin antibiyofilm etkisinin belirlenmesi İstatistiksel analizler DENEYSEL BULGULAR Çalışmada Kullanılan Bakteriler Kültürlerin Ekzopolisakkarit (EPS) Üretimleri EPS lerin Monomer Kompozisyonunun Araştırılması Kültür Filtratlarının Bifidobakterilerin Gelişimini Düzenleyici (BGD) Etkisinin Belirlenmesi EPS lerin Bifidobakteriler Tarafından Fermente Edilebilmelerinin Belirlenmesi EPS lerin Bifidobakterilerin Gelişimini Düzenleyici (BGD) Etkisinin Belirlenmesi Bazı Patojen Bakteri Suşlarının Biyofilm Yapma Oranlarının Belirlenmesi Kongo red yöntemi Mikro plak yöntemi Laktik asit bakteri kültürlerinin antibiyofilm etkisinin belirlenmesi TARTIŞMA VE SONUÇ...74 KAYNAKLAR...90

12 xii Sayfa EKLER EK-1. İstatistik Dökümleri ÖZGEÇMİŞ

13 xiii ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 2.1. Pobiyotiklerin başlıca özellikleri ve bu özelliklerin sağladığı yararlar.. 7 Çizelge 2.2. Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar... 8 Çizelge 2.3. Bifidobacterium cinsine ait türler ve izolasyon bölgeleri.. 9 Çizelge 2.4. Prebiyotiklerin gıda alanındaki uygulamarı Çizelge 2.5. Bakteriyel antibiofilm etkisi gösteren polisakaritler Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan laktobasillerin ve bifidobakterilerin türlerine ve kaynaklarına göre dağılımı Çizelge 3.2. Biyofilm çalışmasında kullanılan patojen mikroorganizma türleri.. 47 Çizelge 3.3. De Man Rogosa Sharpe (MRS) içeriği Çizelge 3.4. Nutrient broth besiyeri içeriği Çizelge 3.5. PBS (Phosphate Buffer Saline) tamponu Çizelge 3.6. Antibiyofilm deneyinde kullanılan laktik asit bakterileri ve patojen bakteriler Çizelge 4.1. Liyofilizasyon öncesi ve sonrasında suşların EPS miktarları Çizelge 4.2. Liyofilize edilmiş EPS lerin monosakkarit kompozisyonları ve yüzde oranları Çizelge 4.3. Laktobasilluslardan elde edilen filtratların B. breve BASO1 ve A28 suşlarının gelişimini düzenleyici etkisi Çizelge 4.4. B. breve A28 ve BASO1 suşlarının EPS yi fermente edebilme kapasiteleri

14 xiv Çizelge Sayfa Çizelge 4.5. Laktobasilluslardan izole edilen, liyofilize EPS lerin B. breve BASO1 ve A28 suşlarını geliştirici etkisi Çizelge 4.6. Bazı patojen bakterilerin kongo red yöntemi ile bulunan biyofilm yapma oranları...69 Çizelge 4.7. Bazı patojen bakterilerin mikro plak yöntemi ile bulunan biyofilm yapma oranları...71 Çizelge 4.8. Kültür filtratlarının % 5, 10 ve 20 oranlarında kullanılmasıyla oluşan yüzde biyofilm inhibisyonları...73 Çizelge 4.9 Liyofilize EPS lerin 0,1 ve 1 mg/ml konsantrasyonlarında kullanılmasıyla oluşan yüzde biyofilm inhibisyonları...73

15 xv ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Bifidobacterium sp. bakterisinin taramalı elektron mikroskobu görüntüsü Şekil 2.2. Bağırsak florası ve konak arasındaki ilişkiler Şekil 2.3. Lactobacillus sp. bakterisinin elektron mikroskobundaki görüntüsü 23 Şekil 2.4. B. cereus un biofilm oluşumu (SEM, 6330 büyütme, bar ¼ 5 mm) Şekil 2.5. Biyofilm oluşumunun aşamaları Şekil 2.6. Quorum-Sensing Sisteminde Reseptör Spesifik Molekül ilişkisi.. 36 Şekil 2.7. Ülseratif kolit bir hastanın kolon mukozasında bakteriyel biyofilmlerinin FISH light mikroskop görüntüsü Şekil 3.1. Glukoz standart eğrisi Şekil 4.1. Çalışmada kullanılan bazı bakterilerin ışık mikroskobundaki görüntüleri... 60

16 xvi RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 3.1. EPS İzolasyonu çalışmasında kullanılan evaporatör Resim 3.2. EPS lerin liyofilize edilmesi için kullanılan liyofilizatör cihazı Resim 3.3. EPS lerin monomer kompozisyonunun belirlenmesinde kullanılan HPLC cihazı Resim 3.4. Biyofilm çalışmalarında kullanılan mikroplak okuyucu Resim 4.1. Kongo red deneyinde gözlenen koloni morfolojileri Resim 4.2. Mikroplak okuyucuda okunmaya hazır bir mikroplak... 70

17 xvii SİMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış bazı simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler Açıklama nm ph μl Nanometre Asitlik bazlık birimi Mikrolitre Kısaltmalar Açıklama API ATCC BGD Cfu dk EPS GALT HPLC IgA mg/l ml OD PBS Analitik Profil Ġndeks Amerikan Kültür Koleksiyonu (American Type Culture Collection) Bifidobakterilerin Gelişimini Düzenleyici Etki Koloni Oluşturan Birim (Colony forming unit) Dakika Ekzopolisakkarit Barsak İliikili Lenfoid Doku Yüksek Basınçlı Sıvı Kromotografi (High Performance Liquid Chromotograpy) İmmünoglobulin A Miligram/litre Mililitre Optik dansite Fosfat tampon çözeltisi (Phosphate buffered saline)

18 xviii Kısaltmalar Açıklama rpm sp spp subsp TCA Devir sayısı Tür Türler Alttür Trikloroasetikasit

19 1 1. GİRİŞ Gastrointestinal sistem besinlerin sindirilerek, bileşenlerin absorbe edildiği, posa kısımlarının dışkı olarak atıldığı bir organ sistemi olmasıyla birlikte, baştan sona diffüz bir lenfoid doku özelliğinde olan mukozası ile mükemmel bir bağışıklık sistemi organıdır [Rahman ve ark., 2007]. Gastrointestinal alan 500 farklı mikroorganizma türünün bir arada yaşadığı kompleks bir ekosistemdir. Gastrointestinal sistem mikroflorası, vücudun dışı ile içi arasında bir köprü işlevi görmektedir [Palmer ve ark., 2007]. Bu ekosistemde bulunan mikrorganizmalar normal flora olarak tanımlanmakta olup, temelde yararlı ve zararlı olarak iki gruba ayrılmaktadır. Sağlıklı bir konakçının normal mikroflorasında bu gruplar dinamik bir denge halindedir. İntestinal ekosistemin fizyolojik dengesi hastalık, yaşlılık, stres, antibiyotik kullanımı, diyet alışkanlıklarının değiştirilmesi ve iklim koşullarında meydana gelen değişmeler nedeniyle zararlı mikroorganizmalar lehine bozulabilmektedir. Bu durumda bozulan denge etkili ve yararlı mikroorganizmalarla desteklenmelidir [Marteau ve Jian, 2002; Fuller, 1989]. Probiyotik olarak isimlendirilen bu mikroorganizmalar, yeterli miktarda verildiğinde konak üzerinde olumlu etki bırakan canlı mikroorganizmalar olarak tanımlanmıştır [FAO/WHO, 2001]. Probiyotik olarak en fazla kullanılan mikroorganizmalar laktik asit bakterileri (Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus, Enterococcus, Leuconostoc, Pediococcus cinsine ait türler) ile Propionibacterium cinsine ait türler ve Sacchoromyces boulardii dir [Ljungh ve Wadstrom, 2006]. Laktik asit bakterileri insan florasında doğal olarak bulunmaları ve faydalı ürünler üretmeleri nedeniyle oldukça dikkat çekmektedir [Wood, 1992]. Günümüze kadar laktik asit bakterilerinin insan sağlığını olumlu yönde etkileyebilecek bazı özellikleri araştırılmıştır. Bu bakteriler probiyotik mikroorganizmalar olarak önerilmiş ve ticari olarak kullanımı gündeme gelmiştir. Laktik asit bakterileri tarafından üretilen kompleks bir biyopolimer olan ekzopolisakkaritler (EPS), herhangi bir sağlık riski taşımamaları nedeniyle, özel önem kazanmış ve genellikle güvenli (GRAS) olarak kabul edilmiştir [De Vuyst ve Degeest, 1999]. EPS nin gıda endüstrisinde kullanılmasının yanı sıra sağlığa yararlı bazı özelliklerinin de olduğu gösterilmiştir.

20 2 Bunlardan bazıları, kolesterol düşürücü aktivitesinin yanında immün düzenleyici özelliklerinin olmasıdır [Welman ve Maddox, 2003]. Probiyotik bakterilerin gastrointestinal alanda yaşarken, EPS üretmesi hem bu bakterileri olumsuz şartlara karşı korumakta hem de dolaylı olarak sağlığa yararlı özelliklerini göstererek bulunduğu konağa faydalı olmaktadır [De Vuyst ve Degeest, 1999]. Laktik asit bakterilerinin ekzopolisakkarit (EPS) üretim kapasitelerinin belirlenmesi ve yüksek oranda EPS üreten suşların probiyotik olarak önerilmesi bu bakterilere olan ilgiyi daha da artıracaktır. Bu nedenle çalışmamızda, bazı laktik asit bakterilerinin EPS üretim miktarlarının belirlenmesi ve EPS lerin prebiyotik ve antibiyofilm özelliklerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bifidobakteriler, bağırsakta kolonize olup fermantasyon yoluyla ürettikleri bazı organik asitlerle, buradaki epitel hücreleri için enerji kaynağı oluşturmakta ve epitel hücrelerinin gelişimesine ve farklılaşmasına katkıda bulunmaktadırlar [Leahy ve ark., 2005]. Aynı zamanda, bifidobakteriler ürettikleri bazı inhibitör maddeler ile gastrointestinal alanda bulunan patojen mikroorganizmaların gelişimini inhibe etmektedirler. Bifidobakteriler kolon kanserini önleyici bazı özellikleriyle de oldukça dikkat çekmektedirler ve bazı gastrointestinal hastalıkların tedavisinde de kullanılmaktadırlar [Picard ve ark., 2005]. Ayrıca, bu bakteriler intestinal alanda mikrobial homeostasiyi düzenlemek, vitamin sentezlemek, diyetle alınan birçok birleşiğin biyoaktif moleküllere dönüşümünü sağlamak, kan amonyak ve kan kolesterol seviyesini düşürmek ve antibiyotik tedavisi sonrası normal florayı geri kazanmada yardımcı olmak gibi birçok probiyotik özelliğiyle dikkat çekmektedir. Bilim adamları, bütün bu olumlu özellikleri nedeniyle bifidobakterilerin gastrointestinal alandaki canlılığını, sayısını ve etkinliğini artıracak çalışmalara yönelmişlerdir. İntestinal florada bulunan bir tür veya sınırlı sayıdaki birkaç tür mikroorganizmanın çoğalmasını ve/veya aktivitesini seçici olarak aktive ederek, konağın sağlığını olumlu yönde etkileyebilen, sindirilemeyen besin bileşenleri prebiyotik olarak adlandırılmaktadır. Prebiyotikler içerisinde, bifidobakteriler için sıklıkla kullanılanı inulindir [Gibson ve Roberfrold, 1995]. İnulin, bazı bitkilerden elde edililen, fruktoz birimlerinden oluşmuş doğal bir polisakkarittir. Diğer prebiyotiklere göre daha uzun zincirli bir molekül olan inulinin, etki göstereceği yer

21 3 olan gastrointestinal alana ulaşabilmesi için, mutlaka gıdalarla vücuda alınması gerekmektedir [Manning ve Gibson, 2004]. Prebiyotiklerin kullanımı ile intestinal florada konak için sağlıklı bir durum yaratarak hem bazı hastalıkların tedavisi hem de bazı hastalıkların önlenmesi mümkün hale gelmiştir. Dünya çapında bir piyasada çeşitli prebiyotikler olmasına ve bunların hepsinin titizlikle test edilmemesine rağmen yeni prebiyotik geliştirme potansiyeline çok ilgi vardır [Chou ve ark., 2013]. Ucuz ve bol malzemelerden yeni bir potansiyel prebiyotik geliştirmek için çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Bu bağlamda, çalışmada doğal bağırsak florasında bifidobakterilerin gelişimini düzenlemek için, probiyotik bakterilerden laktik asit bakterilerinin filtratlarının ve ekzopolisakkarit (EPS) lerinin kullanılması ve doğal florada bulunan, bakteri ürünlerinin prebiyotiklere alternatif olabileceğinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Bir yüzeye yapışarak, kendi ürettikleri polimerik yapıda jelsi bir tabaka içinde yaşayan mikroorganizmaların oluşturduğu topluluk olarak tanımlanan biyofilmler endüstrideki olumsuz etkileri nedeniyle, gıda sanayinde oldukça önemlidir [Leone ve ark., 2006]. Bunun yanında, mikrobiyal biyofilmlerin insan sağlığı üzerinde önemli etkileri vardır. Amerika Birleşik Devletleri ndeki ulusal sağlık enstitüleri, enfeksiyonların % 80 inden fazlasına biyofilmlerin neden olduğunu tahmin etmektedir [Donlan ve Costerton, 2002]. İnsan bağırsağında gelişen patojen bakterileri biyofilmleri, sadece ülseratif kolit ve crohn hastalığı gibi bağırsak hastalıklarına değil, pankreatit ve organ yetmezliği gibi sistematik rahatsızlıklara da neden olurlar [Lindsay ve Holy, 2006]. Biyofilm oluşumunun kontrolü ve engellenmesi için çeşitli araştırmalar yapılmış fakat istenilen başarı sağlanılamamıştır. Bu nedenle, alternatif uygulamalara olan ihtiyaç artmıştır. Son zamanlarda, bazı yararlı bakterilerin kültür filtratları ve EPS lerinin patojen biyofilmleri engellemekte olduğu bildirilmiştir [Kim ve ark., 2009; Sayem ve ark., 2011]. Buradan yola çıkarak çalışmamızda, laktik asit bakterilerilerinin kültür filtratlarının ve EPS lerinin intestinal sistemde antibiyofilm aktivitesi göstermesiyle, bu alandaki patojen biyofilmleri engellemek amaçlanmıştır.

22 4 Bu araştırmamız için, Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Biyoteknoloji Laboratuvarı Kültür Koleksiyonu nda bulunan, insan (bebek gaitası) ve gıda kaynaklı bakteri kültürlerinden, daha önce yapılan çalışmalarda probiyotik özellikleriyle öne çıkmış, moleküler ve klasik tanımlama yöntemleriyle tanımlanmış 6 laktik asit bakterisi ( L. fermentum LB69, L. rhamnosus GD11, L. casei LB8, L. delbrueckii ssp. bulgaricus A12, L. plantarum GD2, L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3 ) seçilmiştir ve bu çalışmada; 1) Biyofilm oluşturmada, kolonizasyonda ve tutunmada rolü olduğu düşünülen EPS üretimlerinin taranarak yüksek ve düşük EPS üreten suşların tespit edilmesi ve bifidobakterilerin EPS yi fermente edip edemediklerinin belirlenmesi, 2) EPS lerin monosakkarit kompozisyonlarının HPLC analizi ile araştırılması, 3) Bakteri kültürlerinin filtratları ve EPS lerinin olası prebiyotik özelliklerinin ortaya çıkarılması için, probiyotik özellik gösteren bifidobakterilerin gelişimini teşvik edip etmediğinin araştırılması ve inulin prebiyotiği ile mukayese edilerek, mevcut prebiyotik materyallere alternatif bulunması, 4) Patojen bakterilerin biyofilm yapma kapasitelerinin taranarak, yüksek biyofilm yapan suşların seçilmesi ve bu suşlara karşı laktik asit bakterilerinin filtratlarının ve EPS lerinin antibiyofilm aktivitelerinin belirlenmesi, 5) Daha etkin düzenleyici ve koruyucu ajan elde etmek için, filtratlarda suşlara göre; EPS lerde ise monomer yapı farklılıklarına göre, bifidobakteri gelişimini düzenleyici (BGD) veya antibiyofilm aktivitelerinde ne gibi farklılıkların oluştuğunun mukayese edilmesi amaçlanmıştır. Araştırmamız, ülkemizde ve dünyada doğal gastrointestinal mikroflora elemanı olan laktik asit bakterilerinin kültür filtratları ve EPS lerinin, bifidobakteriler üzerindeki prebiyotik etkisi ile birlikte patojenler üzerindeki antibiyofilm etkisinin, sinerjitik bir şekilde ortaya çıkarılmasında ilk çalışma olacaktır. Ayrıca, bu bakterilerin filtratları veya EPS leri ile doğal bağırsak florasını koruyucu ve dengeleyici daha etkin ajanlar elde etmek mümkün olabilecektir. Ülkemizde son yıllarda, bağırsak düzenleyici olarak, probiyotik katkılı gıda ürünleri yaygın olarak kullanılmasına rağmen, bu bakterilerin ürünlerinin (EPS gibi) gıda ve klinik kullanımı mevcut değildir.

23 5 Özellikle klinik uygulamalarda, canlı bakterilerin canlılığını florada koruyarak, etkisini sürekli göstermesi mümkün olmamaktadır. Bu gibi olumsuz durumlara karşı, filtratların ve liyofilize EPS lerin kullanımı daha avantajlı olacaktır. Böylece, gastrointestinal sistemde, hem doğal floranın düzenlenmesi hem de patojen biyofilmlerin neden olduğu (ülseratif kolit vd.) hastalıkların, profilaksisi ve aktif tedavisinde, mevcut tedaviye laktobasil kültür filtratlarının ve EPS lerinin eklenmesinin etkili olabileceği düşünülmektedir.

24 6 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1. Probiyotik Bakteriler Probiyotikler, insan ve hayvanların doğal mikroflorasına ait özellikleri geliştiren, tüketimleri sonucunda ağızda, sindirim sisteminde, ürogenital kanallarda ya da üst solunum yollarında yararlı etkileri ile konakçının sağlığını koruyan, buralarda oluşan enfeksiyonların iyileşmesine katkıda bulunan, tek veya karışık mikroorganizma kültürleridir [Marteau ve Jian, 2002; Fuller, 1989]. Probiyotikler mukus katmanı ve epitelyal hücrelerdeki sınırlı sayıdaki yerler için patojen bakterilerle yarışırlar. Aynı zamanda, patojen bakterilerin üremeleri için gereksinim duydukları besin maddelerini tüketerek ve hidrojen peroksit, organik asit ve bakteriyosin gibi antimikrobiyal maddeler üreterek, patojen bakterilerin üremelerini inhibe ederler. Kolonda yağ asidi profilini düzenleyerek, intestinal mikroflorayı değiştirebilirler [Holzapfel ve ark., 1998]. Bunun sonucunda, probiyotiklerin bağırsak fizyolojisi üzerine dolaylı veya doğrudan etkide bulunarak immun sistemi uyardığı, bu çerçevede konakçının ağız ve sindirim sistemi dahil, üst solunum yolu ve ürogenital sistem mukozal yüzeyini etkileyerek iyi hal ve sağlığı geliştirici, hastalık riskini azaltıcı potansiyel etkiye sahip olduğu bilinmektedir [Gill ve Guarner, 2004]. Bu mikroorganizmaların, insanlarda ve hayvanlarda hastalıklardan korunma ve tedavi amacıyla kullanılabilmeleri için bazı özelliklere sahip olmaları gerekmektedir. Probiyotik olarak kullanılacak mikroorganizmaların sahip olması gereken çeşitli özellikler ve bu özelliklerin sağladığı yararlar Çizelge 2.1' de verilmiştir [Kailasapathy ve Chin, 2000].

25 7 Çizelge 2.1. Pobiyotiklerin başlıca özellikleri ve bu özelliklerin sağladığı yararlar Özellik Pankreatik enzimler, asit ve safra tuzlarına direnç İntestinal mukozaya tutunabilme İnsan orijinli olma Dökümante edilmiş sağlık yararları Güvenlik İyi teknolojik özellikler Yarar İntestinal sistemde canlılığı sürdürebilme İmmün sistemin modülasyonu Patojenlerin tutunmasını önleme Hasarlı mukozanın iyileştirilmesi Kısa süreli kolonizasyonun uzatılması Konakçı ile spesifik interaksiyonlar Olası sağlık etkilerinin doğrulanması Tüketici için sağlık riskinin olmaması Stabilite Endüstriyel düzeyde üretilebilme Oksijene tolerans Probiyotik bakterilerin çoğunluğu Lactobacillus, Bifidobacterium, Propionibacterium, Streptococcus cinslerine ait türler ve Aspergillus niger, A. oryza gibi bazı küflerdir [Akalın ve ark., 2000; Yılsay ve Kurdal 2000]. Çizelge 2.2 de probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmaların cins ve tür adları verilmiştir.

26 8 Çizelge 2.2. Probiyotik olarak kullanılan mikroorganizmalar [Ljungh ve Wadstrom, 2006] Cinsler Lactobacillus Bifidobacterium Türler L. bulgaricus, L. cellebiosis, L. lactis, L. acidophilus, L. reuteri, L. brevis, L. casei, L. curvatus, L. fermentum, L. plantarum, L. johnsonii, L. rhamnosus, L. helveticus, L. salivarius, L. gasseri, L. crispatus B. adolescentis, B. bifidum, B. breve, B. infantis, B. longum, B. thermophilum Bacillus B. subtilis, B. pumilus, B. lentus, B. licheniformis, B. coagulans, B. cereus Pediococcus Streptococcus P. cerevisiae, P. acidilactici, P. pentosaceus S. cremoris, S. thermophilus, S. intermedius, S. lactis, S. diacetilactis Bacteriodes Propionibacterium Leuconostoc Aspergillus Saccharomyces Candida B. capillus, B. suis, B. ruminicola, B. amylophilus P. shermanii, P. freudenreichii L. mesenteroides A. niger, A. oryzae S. cerevisiae, S. boulardii C. torulopsis

27 Bifidobakterilerin Genel Özellikleri Bifidobakteriler, memelilerin gastrointestinal sisteminde doğal olarak yayılım göstermektedir. İlk kez 1899 yılında Pastör Enstitüsü nde Freshman Tissier tarafından anne sütüyle beslenen sağlıklı bebeklerin dışkısından izole edilmiş ve Bacillus bifidus sp. comminus olarak adlandırılmıştır [Bezkorovainy ve Miller, 1989; Mitsuoka, 1990]. Bugün ise Actinomycetaceae familyasına ait olan bu cins ekolojik orijinlerine göre gruplanmış 29 adet tür içermektedir [Holt ve ark., 1993]. Bifidobakterilerin büyük bir kısmı insanların ve hayvanların mide-bağırsak sistemlerinden, birkaç türü ise insanda diş çürüklerinden, lağımdan ve böceklerden izole edilmiştir [Klijn ve ark., 2005]. Bifidobacterium cinsine ait türlerin yaşam ortamları Çizelge 2.3 de gösterilmektedir [Leahy ve ark., 2005]. Çizelge 2.3. Bifidobacterium cinsine ait türler ve izolasyon bölgeleri Türler İzolasyon bölgeleri B. adolescentis Yetişkin insan dışkısı B. angulatum Yetişkin insan dışkısı, pis su B. catenulatum Yetişkin insan ve bebek dışkısı B. gallicum Yetişkin insan dışkısı B. longum Yetişkin insan ve bebek dışkısı, vajina B. bifidum Yetişkin insan ve bebek dışkısı, dana dışkısı B. breve Yetişkin insan dışkısı, vajina, dana dışkısı B. infantis Yetişkin insan dışkısı B. pseudocatenulatum Yetişkin insan ve bebek dışkısı, dana dışkısı B. dentium İnsan dışkısı, vajina, çeşitli apse ve yaralar B. merycicum Sığır rumeni B. ruminantium Sığır rumeni B. globosum Sığır rumeni, hayvan ve erkek dışkısı B. boum Sığır rumeni, domuz dışkısı B. thermophilum Sığır rumeni, domuz ve dana dışkısı B. pseudolongum Sığır rumeni, domuz dışkısı

28 10 Çizelge 2.3. (Devam) Bifidobacterium cinsine ait türler ve izolasyon bölgeleri Türler İzolasyon bölgeleri B. pullorum Tavuk dışkısı B. asteroides Arı bağırsağı B. indicum Arı bağırsağı B. coryneforme Arı bağırsağı B. choerinum Domuz dışkısı B. suis Domuz dışkısı B. cuniculi Tavşan dışkısı B. magnum Tavşan dışkısı B. saeculare Tavşan dışkısı B. minimum Pis su B. subtile Pis su Morfolojisi Bifidobakteriler karakteristik bir morfolojiye sahiptirler. Gram pozitif, spor oluşturmayan, hareketsiz, genellikle eğri çubuklar şeklinde ve çoğunlukla dallanmış olarak bulunan anaerobik mikroorganizmalardır. Yeni izole edilen suşlar mikroskopta düzensiz dallanan, Y ve V şeklinde çubuklar halinde görünürler. Şekil 2.1 de bifidobakterilerin taramalı elektron mikroskobundaki dallanmış formu görülmektedir [Biavati ve Mattarelli, 2001]. Bununla birlikte, normal habitatlarında sıklıkla çubuklar halinde olmalarına karşın, besiyeri koşulları pleomorfizm göstermelerine sebep olmaktadır [Poupard ve ark., 1973]. Plak yüzeyinde ise mukoid kremsi veya menekşe renginde görünüme sahiptirler [Leahy ve ark., 2005].

29 11 Şekil 2.1. Bifidobacterium sp. bakterisinin taramalı elektron mikroskobu görüntüsü. (Istituto di Microbiologia, Piacenza University, Italy) Fizyolojisi Bifidobakteriler anaerobik mikroorganizmalardır ve genellikle % 10 CO 2 li ortamda gelişirler. Ancak, bazı türleri oksijeni tolere edebilmektedir. Süperoksit dismutaz ve katalaz gibi enzimler, süperoksit ve hidrojen peroksitin toksik etkilerine karşı organizmaların korunmasına yardımcı olur [Picard ve ark., 2005]. Bu enzimler B. breve, B. infantis, B. longum ve B. adolescentis de çok düşük olup, süperoksit dismutaz aktivitesi suşlar arasında değişmektedir. NADH oksidaz ve NADH peroksidaz oksijen kullanımında gereken önemli enzimlerdir. Laboratuvarda, besiyerleri içerisinde geliştirildikleri zaman gelişme şartları ve substrata göre değişen oranlarda asetat ve laktat üretirler. Bunlar haricinde az miktarda formik asit, etanol ve suksinik asit de üretirler [Servin, 2004]. Çoğunlukla, bifidobakterilerin insanlarda optimal gelişim sıcaklığı o C olup, hayvanlarda ise o C arasındadır. Gelişim için optimum ph aralığı 6,5 7 arasında olup, ph 5 ten az ve 8 den yüksek ph da gelişim görülmemektedir [Biavati ve Mattarelli, 2001]. Bifidobakterilerin fermente sütlere ve diğer fermente süt ürünlerine eklenmesi yenidir. Yaklaşık yıl öncesinde, canlı bakteriler süt ürünlerine eklenmeye başlamıştır [Tannock, 2005]. Starter kültürlere zıt olarak bifidobakterilerin sütün asidifikasyonunda ya da doku ve

30 12 aromasının oluşmasında hiçbir rolü yoktur ancak tüketicinin sindirim sisteminde sağlığı destekleyici rol oynadığı düşünülmektedir [Leahy ve ark., 2005] Bifidobakterilerin bağırsak florasında kolonizasyonu Kolonik lümen içinde yüzlerce tür bakteri bulunur ve canlı mikrobiotanın ağırlığı birkaç yüz gramı bulabilir [Guarner ve Malagelada, 2003]. İnsan intestinal alanındaki toplam bakteri sayısı lere çıkabilir ve bu sayı vücutta bulunan doku hücrelerinin toplam sayısından kat daha fazladır [Suau ve ark., 1999]. İnsan intestinal florasındaki önemli bakteri cinslerinin toplam anaerop bakteri sayısının % 20'sini oluşturan Bifidobacterium cinsidir. Doğumdan hemen sonra, bağırsak florasında E. coli ve Streptococcus spp. baskındır. Bebek anne sütü aldıkça E. coli, Streptococcus ve Clostridia lar azalırken, Bifidobacterium cinsine ait türler artmaya başlar [Picard ve ark., 2005]. Anne sütünden kesildikten sonra, erişkin florası yönünde değişiklikler olmaya başlar ve ikinci yılın sonuna doğru erişkin florasının benzeri bir flora oluşur. Bu floradaki bakterilerin büyük çoğunluğu Clostridium, Eubacterium, cinsleri ve Bifidobacterium cinsi içerisindeki Bifidobacterium bifidum ve Bifidobacterium infantis gibi zorunlu anaeroblardan oluşmaktadır. Bifidobacterium cinsine ait türler dominant mikrobiotanın üyeleridir. Kantitatif PCR ve rrna hedefli problar kullanılarak yapılan moleküler hibridizasyon çalışmaları, çekal lümende ve insan feçesinde bu bakterilerin yoğunluğunu kanıtlamıştır. Bifidobakterilerin insan bağırsağındaki sayısı, kültür yöntemleriyle hesaplandığında cfu/g olarak bulunmuştur [Klijn ve ark., 2005]. Gastrointestinal alanda yoğun olarak bulunan bu bakterilerin insan sağlığına olan etkileri birçok bilim insanı tarafından araştırılmıştır. Bu çalışmalar sonucunda, bifidobakterilerin sağlığa yararlı birçok etkisinin olduğu bulunmuştur ve bu konudaki araştırmalar hala devam etmektedir.

31 Bağırsak florasının bozulması Bağırsak florası bozulduğu yani probiyotikler azaldığı zaman patojen mikroorganizmalar hızla ürer. Patojen mikroorganizmaların kendileri veya toksinleri hastalık yapmaya başlar. İntestinal sistemde meydana gelen bu dengesizliklere disbiosis denir. Disbiosis bağırsak duvarını tahrip eder, yani probiyotiklerin bağırsak mukozası üzerinde oluşturduğu koruyucu tabakanın ortadan kalkması, bağırsağın geçirgenliğinin artmasına neden olur leaky gut syndrom (sızıntılı bağırsak sendromu) oluşur [Sharma, 2009]. Normalde bağırsak hücreleri bağırsaktaki her maddenin (özellikle sindirilmemiş gıdalar ve toksik maddeler) kana geçişine izin vermez, yani bir güvenlik duvarı oluşturur (bağırsak sızdırmazlığı). İlk bakışta, bağırsak geçirgenliği arttığı için birçok vitamin, mineral ve aminoasitin bağırsaktan kana geçmesi kolaylaşmış olacağı akla gelirse de durum bunun tam tersidir. Birçok vitamin, mineral ve aminoasitin bağırsaktan kana geçmesi bağırsak hücrelerinde bulunan taşıyıcı proteinlerin sayesinde olur. Bunlar olmadan taşınma çok az olacağı için, bir yığın besleyici maddelerin kana geçmesi de azalır. Yeteri kadar sindirilmemiş gıdalar ve nötralize edilmemiş toksinler kan dolaşımına geçer. Bağışıklık sistemi, yeteri kadar sindirilmemiş protein parçacıklarına karşı aşırı şekilde uyarılır. Bu yabancı protein parçacıklarının bazıları, vücudun kendi proteinlerine çok benzer. Bağışıklık sistemi aşırı uyarıldığı zaman kendinden olanı yabancıdan ayıramaz. Onu tahrip ederken kendinden olanı da tahrip eder. Bunlara otoimmün hastalıklar denir [Koca ve ark., 2011]. Bağırsak florasında bulunan bakteri grupları, bu bakterilerin yoğunluklarına göre bağırsaktaki işlevleri ve konağa etkileri Şekil 2.2 de gösterilmiştir. Buna göre, gaitanın her gramında arasında bifidobakterileri bulunması, bağırsaklarda protein ve vitamin sentezi, sindirim ve emilim takviyesi, immün sistemin uyarılması gibi yararlı etkiler sağlar. Bu etkilerin sonucunda konakta sağlıklı bir durum meydana gelir.

32 14 Şekil 2.2. Bağırsak florası ve konak arasındaki ilişkiler Bifidobakterilerin probiyotik özellikleri Kolonik fermantasyon Fermantasyon boyunca bakteriyel gelişme stimüle edilirken H 2, CO 2 ve CH 4 gazı ile birlikte organik asitler (laktik asit ve kısa zincirli yağ asitleri (Short-chain fatty acids, SCFA) üretilmektedir. Başta bifidobakteriler ve laktik asit bakterileri olmak üzere bağırsaklardaki birçok bakteri türü tarafından laktik asit üretilmektedir. SCFA lar (genellikle asetat, bütirat ve proponat) kolondaki bakteriyal fermentatif reaksiyonların majör son ürünleridir. Bütün SCFA ların sindirim kanalının alt kısımlarında absorbe edilmesi su ve tuz emilimi ile stimüle edilmektedir. Daha sonra, bu SCFA lar genellikle bağırsak epitelyumu, kaslar ve karaciğer tarafından metabolize edilmektedir. Bu bileşiklerin intestinal epitelyumdaki besleyici etkisi çok önemlidir. Bunların en ilgi çekici olanı, bütirat kolonik epitelyum için enerji

33 15 kaynağıdır ve hücre gelişimi ve farklılaşmasını düzenler. Eğer bifidobakteriler direk olarak bütirat üretmezse, laktat üretilir ve bu daha sonra bütirata dönüştürülür. Ayrıca, bifidobakteriler fermantasyon ürünlerine ek olarak, vitamin de (genelde B vitamini) sentezlemektedir [Prestamoa ve ark., 2003]. İnhibitör maddelerin üretimi Bifidobakteriler, sindirim kanalında beraber yaşadıkları bazı zararlı mikroorganizmalara karşı inhibitör maddeler üretmektedirler. Bu maddelerin üretimi sayesinde, hastalık yapıcı mikroorganizmaların bağırsaklardaki kolonizasyonu engellenmektedir. Örneğin, B. infantis türünün patojenlerin gelişimini inhibe eden, asit üretimiyle bağlantısı olmayan, geniş spektrumlu etkisi olan antimikrobiyal bir bileşik üretmektedir. Yapılan diğer çalışmalarda, bifidobakteri suşlarının kültür filtratlarındaki antimikrobiyal içeriklerin varlığı tespit edilmiştir. Fujiwara ve arkadaşları (1997), B. longum SBT 2928 suşunun, in vitro koşullarda enterotoksijenik E. coli Pb176 suşunun adhezyonunu inhibe eden bir protein molekülü sentezlediğini bulmuşlardır. Bifidobakteriler, epitel hücrelerindeki bağlanma bölgeleri için patojenik virüsler veya bakterilerle yarışarak, patojen bakterilerin bu bölgelere bağlanmalarını engellemekte, bu sayede dolaylı olarak da inhibitör etkilerini göstermektedirler. Bağışıklığın düzenlenmesi Sindirim yoluyla vücuda alınan bakterilerin immün sistem ile ilk etkileşimi gut bağlantılı lenfoid dokularla (gut associated lymphoid tissues, GALT) olur. İnsan bağırsağı vücuttaki en büyük lenfoid doku kütlesine sahiptir. Mukozal immün sistemin farklı içerikleri, ekzojen antijenlere karşı spesifik olarak odaklanarak rol oynar. Fazla miktarda antikor üreten bu savunmadaki ilk hat salgılanan IgA sistemidir. Salgılanan antikorların ana fonksiyonu immünolojik olmayan savunma mekanizmalarıyla birlikte yayılan patojenik mikroorganizmaların penetrasyonu ve epitelyuma tutunmayı engelleyerek, yabancı antijenlerin uzaklaştırılmasıdır. Antikorlar, toksinlerin nötralizasyondan ve viral çoğalmalardan sorumludur.

34 16 Gastrointestinal sistem florasının bağışıklıktaki rolü çok önemlidir. Bakteriler spesifik, sistemik ve lokal immün yanıtı ortaya çıkaran antijenleri oluştururlar [Fujiwara ve ark., 1997]. Birçok probiyotiğin immün sistemi spesifik olmayan şekilde düzenlediği, bir çok çeşit antijene karşı oluşan immün yanıta bakılarak anlaşılmıştır. 3 hafta boyunca 14 gönüllüye B. bifidum Bb-12 ( cfu/gün) ve L. acidophilus La-1 ( cfu/gün) verilmiş ve fagositik aktiviteli periferal beyaz kan hücrelerinin 2 katına çıktığı görülmüştür [Schiffrin ve ark., 1995]. Yapılan başka bir çalışmada ise, bu bakterilerin kolonik inflamatuar infiltrasyonu redüklediği görülmüştür [De Simone ve ark., 1992]. Gastrointestinal rahatsızlıklar üzerine etkisi Sindirim sisteminin akut enfeksiyonları genellikle kusma ve diyare ile karakterize edilir. Bunlara sebep olanlar virüsler ve bakterilerdir. Rotavirüs akut çocuk diyaresine neden olmaktadır. Birçok klinik çalışmada, özellikle çocuklarda rotavirüs ile ilişkili akut diyare üzerinde probiyotiklerin etkisi araştırılmıştır. Bifidobakteri eklenmiş süt ile beslenenlerin semptomatik rotavirüs enfeksiyonlarına karşı korunduğu ve bebeklerde diyarenin azaldığı görülmüştür [Saavedra ve ark., 1994]. Patojenik bakterilerin gelişiminin yol açtığı diyare, antibiyotik kullanımının en sık görülen yan etkisidir. Probiyotikler ürettikleri inhibitör içerikler ve bakteriyosinlerle bu gelişimi inhibe ederler. Ayrıca, bifidobakterilerin insan inflamatuar sindirim sistemi hastalıkları, poşit (ülseratif kolit hastalarında görülen cerrahi opsiyon), duyarlı sindirim sistemi sendromu (bağırsakarda oluşan aşırı hassasiyet) ve kolonik tümörler üzerine de yararlı etkilerinin olduğu yapılan çalışmalarda gösterilmiştir [Gomes ve Malcata, 1999]. Gastrointestinal alanda zaten var olan bifidobakterilerin sindirim kanalındaki sayısını, yoğunluğunu ve etkinliğini artırmak için birçok çalışma yapılmıştır. Bunun için canlı mikroorganizmaların genellikle süt ve süt ürünleriyle alınması veya

35 17 bağırsak floramızda var olan bifidobakterilerin sayısını artırabilecek katkılar alınmasıdır. Kolon bakterilerinden birinin veya az bir kısmının çoğalmasını veya aktivitesini etkileyerek yararlı bir etki oluşturan sindirilemeyen katkı maddeleri olarak tanımlanan prebiyotikler, sindirim kanalındaki bifidobakterilerin sayısını artırmak için kullanılmaktadır. Bu prebiyotikler içerisinden üzerine en çok çalışılmış olanlar fruktooligosakkaritler, oligofruktoz, inulin, galaktoligosakkaritler, laktuloz ve laktiloldur [Gibson ve Wang, 1994]. Bu prebiyotikler, genellikle bitkisel ürünlerde bulunmaktadır [Collins ve Gibson, 1999]. Bu prebiyotikler gıdalar yoluyla vücuda alındığında sindirim kanalında yerleşik olarak bulunan bifidobakterilerin üremesini stimüle etmektedirler. Son yıllarda yapılan çalışmalarda fermente süt ürünleri içerisinde bulunan laktik asit bakterilerinin kültür filtratları ve EPS lerinin de bifidobakterilerin gelişimini uyardığı belirlenmiştir [Yonezawa ve ark., 2010; Welman ve Maddox, 2003] Prebiyotiklerin Genel Özellikleri Probiyotik olarak adlandırılan bakterilerin selektif olarak büyüme ve gelişmesini sağlayan, aktivitelerini arttıran, sindirilemeyen besin bileşlenlerine prebiyotik adı verilmektedir [Gibson ve Roberfrold, 1995]. Bir disakkarit olan laktuloz, oligosakkaritler (maltoz, soya, ksiloz), inulin, oligofruktoz ve galaktoz içeren galaktooligosakkaritler (kurubaklagiller) prebiyotikler sınıfına girmektedirler [Cummings ve Macfarlane, 1997]. Prebiyotikler başlıca oligosakkaritler olup, bağırsak sisteminde bir veya sınırlı sayıdaki bakterilerin gelişimini veya aktivitesini teşvik ederek, insan ve hayvan sağlığını olumlu yönde etkileyen gıda bileşenleridir. Bir gıda bileşeninin prebiyotik olarak adlandırılması için; - Bağırsak sisteminin üst kısmında hidrolize ve absorbe olmamalı, - Bağırsakta bulunan yararlı bakterilerden tarafından kullanılabilmeli, - Sağlığı iyileştirici yönde bağırsak florasını değiştirebilmeli, - İnsan ve hayvan sağlığını olumlu yönde etkilemelidir [Perrin ve ark., 2001].

36 18 Bağırsak sisteminde bifidobakterilerin gelişiminin artırılması, çok spesifik karbonhidratlarla sağlanabilmektedir [Garsse ve ark., 2003]. Prebiyotikler inulin, frukto- ve galaktosakkarit gibi kısa zincirli karbonhidratlardır ve kolon bakterileri için substrat görevi görürler. İn vitro olarak yapılan çalışmalarda prebiyotikler olarak kullanılan oligofruktoz ve inulin, kolondaki yararlı mikroflora (Lactobacillus, Bifidobacterium gibi) tarafından selektif olarak kullanılırken, toksin üreten Clostridium lar, proteolitik Bacteriodes ler ve toksijenik E. coli gibi potansiyel patojen mikroorganizmaların gelişimini engellemektedir [Gibson ve Roberfrold, 1995; Modler, 1994]. Prebiyotikler üzerine yapılan çalışmalarda genelde inulin kullanılmaktadır. İnülin doğada yaygın olarak bitkilerin depo karbonhidratı formunda bulunan ve fruktoz polimerlerinin heterojen karışımına verilen addır [Perrin ve ark., 2001]. İlk olarak prebiyotiklerle yapılan çalışmalarda, inulin ve fruktooligosak-karitlerin kolonda bifidobakterilerin gelişimini teşvik ettiğine dair raporlar Roberfroid ve arkadaşları tarafından bildirilmiştir [Roberfroid ve ark., 1998]. Prebiyotikler üzerine yapılan çalışmalardaki en önemli bulgu, inulinin bifidobakterilerin gelişimini teşvik ettiği, buna karşın Bacteroides, Clostridia ve Escherichia coli gibi patojenler üzerinde inhibitör etki göstermesidir [Kruse ve ark., 1998]. Bunun üzerine çalışmalar, bifidobakteriler ile birlikte prebiyotik uygulamalarına çevrilmiştir yılında Sharp ve arkadaşları tarafından 2001 de yapılan bir çalışmada, bifidobakteriler ve E. coli de sindirilmeyen oligosakkaritlerin etkisi araştırılmıştır. Deneylerde, B. longum, B. adolescentis ve B. angulatum türlerinin baskın florayı oluşturduğu gözlenmiştir. Bununla birlikte, toplam bifidobakteri popülasyonunun sayısında da büyük farklılık belirlenmemiştir. Buna karşın, E. coli popülasyonunda oldukça belirgin bir azalma saptanmıştır. Bilim insanları prebiyotik çalışmaları genellikle in vivo koşullarda gerçekleştirmişlerdir. Prebiyotiklerin sağlığı iyileştirici rollerinden dolayı deney hayvanlarının bağırsak bölgelerinde oluşturulan hasarlardaki iyileştirici özelliği konusunda araştırmalar yapılmıştır [Wargovich ve ark., 1996; Furrie ve ark., 2005].

37 Ticari olarak kullanılan prebiyotikler Prebiyotik olarak kullanılan oligosakaritler, yaklaşık 2 ile 20 arasında monosakkarit birimlerinden oluşan kısa zincirli polisakaritlerdir. Meyve ve sebzelerde doğal olarak meydana gelen ve izole edilebilir olanlarının yanı sıra, polisakkaritlerin (örneğin diyet lifleri, nişasta) hidrolizi ile ya da enzimatik yolla ticari olarakta üretilebilirler [Gibson ve ark., 2004]. Aşağıdaki oligomerler ticari olarak kullanılan prebiyotiklerdir. - inulin - laktuloz - frukto-oligosakkaritler - galakto-oligosakkaritler - soya oligosakkaritleri - izomalto-oligosakkaritler - gluko-oligosakkaritler [Gibson ve Fuller, 2000] Prebiyotiklerin kullanım aanları Potansiyel gıda uygulamaları: Prebiyotikler yüzyıllardır insan besinlerinin bir parçası olmuştur ancak prebiyotiklerin besin özelliklerinin ortaya çıkması çok yenidir. Yararlı olarak görülen bağırsak bakterinin artışını sağlamak için oligosakkaridlerin kullanımı Japonya'da uzun yıllardır varlığını sürdürüyor. ancak 'prebiyotik' terimi 1990'larda icat edilmiştir [Gibson ve Roberfroid, 1995]. Prebiyotikler ısıya dayanıklı olmaları ve stabilitelerinin yüksek olması nedeniyle birçok fonksiyonel gıda da kullanılmaktadır. Aynı zamanda, bazı prebiyotikler tatları, düşük kalorili olmaları ve diğer yapısal yönleri ile gıda kalitesini artırabilirler. Lifler gibi diyet karbonhidratlarda aday prebiyotiklerdir ancak, hedef bakteri türleri için spesifik olan oligosakaritlerin (kısa zincirli şeker molekülleri) en etkili prebiyotikler oldukları kanıtlanmıştır. Prebiyotiklerin hayvan yemlerinde kullanılmasının yanısıra, mevcut piyasada

38 20 özellikle bağırsak enfeksiyonlarına karşı duyarlı olan insanların (örneğin; bebekler, yaşlılar, hasta kişiler) kullanımına daha fazla önem verilmektedir. Günümüzde, giderek daha fazla prebiyotik, fonksiyonel gıdalarda katkı maddesi olarak kullanılmaktadır [Chow, 2002; Huebner ve ark., 2007]. Çizelge 2.4 de prebiyotiklerin gıda uygulamaları ve bu gıdaların fonksiyonel özellikleri gösterilmiştir [Wang, 2009]. Prebiyotikler gıdalarda şeker, yağ ve un olarak kullanılabilmektedir. Bu durumda, gıda fonksiyonel olup, yararlı etkiler sağlamaktadır. Örneğin, yoğurt ve tatlılarda şeker yerine prebiyotiklerin kullanımı gıdaya tat ve kıvam kazandırmaktadır. Bu gıdaların oral yolla alınımı durumunda, konağa prebiyotikler alınmış olup, yararlı etkiler sağlanır. Çizelge 2.4. Prebiyotiklerin gıda alanındaki uygulamaları Uygulamalar Yoğurt ve Tatlılar İçkiler ve İçecekler Ekmekler Et Ürünleri Diyet Ürünleri Kek ve Bisküviler Çikolata Şeker Mamulleri Çorbalar ve Soslar Bebek Maması Fonksiyonel özellikleri Şeker yerine, doku, tat ve prebiyotikler Şeker yerine, tat, köpük stabilizasyonu ve prebiyotikler Yağ ya da şeker yerine, doku, lif ve prebiyotikler Yağ yerine, doku, istikrar, lif ve prebiyotikler Yağ ya da şeker yerine, lif ve prebiyotikler Şeker yerine, nem tutma, lif ve prebiyotikler Şeker yerine, ısı direnci ve lif Şeker yerine, lif ve prebiyotikler Şeker yerine, ve prebiyotikler Doku, tat, lif, istikrar ve prebiyotikler Potansiyel klinik uygulamaları: Prebiyotiklerin, bağırsak kaynaklı hastalıkların önlenmesi ve tedavisindeki etkisini belirlemek için yapılan klinik çalışmalar devam etmektedir. Prebiyotiklerin sağlığı teşvik edici faaliyetlerini kanıtlamak ve mekanizmalarını tanımlamak için insanlar üzerinde daha fazla deney yapılması gereklidir [Vulevic ve ark., 2004]. Çeşitli

39 21 uzmanlık alanları ve tekniklerin olmasına rağmen klinik hastalar üzerindeki çalışmalar hala risklidir. Avrupanın finanse ettiği projeler kapsamında prebiyotikler, - Diyet ve yaşlanma, - Konak-mikrop etkileşimleri, - Prebiyotikler için yeni işleme teknolojileri, - Güvenlik yönleri, - Kronik bağırsak hastalıkları, - İkinci nesil ürünler gibi alanlarda araştırılmaktadır [ uhealth]. Ayrıca, prebiyotikler ile ülseratif kolit, irritable barsak sendromu, kolon kanseri, gastroenterit, koroner kalp hastalığı, nekrozlu enterokolit, otizm, vajinal pamukçuk ve obezite gibi hastalıkların önlenmesi ve tedavisi yapılan araştırma örnekleri arasındadır [Rastal ve ark., 2005; Sanders ve ark., 2005] Prebiyotik kullanımının avantaj ve dezavantajları: Bağırsak mikrobiyotasının modifiyesinde prebiyotik kullanmak, probiyotik ya da antibiyotik kullanımının üzerinde bir çok avantaj sağlamaktadır [Collins ve ark., 2009]. Probiyotiklere göre avantajları: - Uzun raf ömürlü yiyecek ve içeceklerde kararlıdır; - Isı ve ph istikrarlı işlenmiş gıdalar ve içeceklerde geniş bir yelpazede kullanılabilir; - Gıda tadı ve dokusu için yararlı fizikokimyasal özelliklere sahiptir. - Asit, proteaz ve bağırsak geçişi sırasında safraya dirençlidir; - Düşük bağırsak ph sını sağlar ve bağırsaktaki ozmotik suyu tutar.

40 22 Antibiyotiklere göre avantajları: - Uzun vadeli tüketim ve profilaktik yaklaşımlar (hastalık önleyici tıbbi girişimler) için güvenlidir; - Antibiyotik ilişkili ishal, UV radyasyon duyarlılığı ve karaciğer hasarı gibi yan etkileri teşvik etmezler. - Antimikrobiyal direnç genlerini teşvik etmezler. - Alerjik değillerdir. Prebiyotiklerin dezavantajları: - Probiyotiklerin aksine, aşırı doz bağırsakda şişkinlik, ağrı, gaz ve ishale neden olabilir. - Belirli patojenlerin giderilmesinde antibiyotikler kadar etkili değillerdir. - Aktif ishal sırasında basit şeker emilimi yan etkisini şiddetlendirebilirler [Lee ve Salminen, 2009] Prebiyotiklerde yapı-fonksiyon ilişkisi Karbonhidratların prebiyotik özelliklerinin monosakkarit kompozisyonu, glikozidik bağ yapısı ve molekül ağırlığı gibi faktörlerden etkilenmesi muhtemeldir Tanınmış prebiyotikler öncelikle glukoz, galaktoz, ksiloz ve fruktozdan meydana gelir. Diğer monosakaritlerden oluşan oligosakaritlerin prebiyotik potansiyelleri şu anda bilinmemektedir. Monosakaritler arasındaki bağ hem ince bağırsakta sindirilmeme hem de fermantasyondaki seçiciliği belirlemede önemli bir faktördür. FOS prebiyotiklerinin fermantasyonu, bifidobakterilerde bulunan β-fructofuranosidazdan dolayı seçicidir. Genellikle, polisakkaritler oligosakkaritler gibi prebiyotik özellik göstermezler. Ancak, inulin yüksek molekül ağırlığına sahip olmasına rağmen iyi bir prebiyotiktir. İnülinin prebiyotik özelliği, kısa zincirli frukto-oligosakkaritler lerin kalın bağırsakta daha hızlı fermente olmalarına karşın inulinin uzun zincirli yapısıyla daha uzak bölgelere kadar ilerleyebilmesi olabilir [Gibson ve ark., 2004].

41 23 Dünya çapında bir piyasada çeşitli prebiyotikler olmasına ve bunların hepsinin titizlikle test edilmemesine rağmen, yeni prebiyotik geliştirme potansiyeline çok ilgi vardır. Ucuz ve bol malzemelerden yeni bir potansiyel prebiyotik geliştirmek için çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Alternatif olabilecek prebiyotikler arasında, probiyotik olarak aktif olan Laktik asit bakterilerinin filtratlarının ve EPS lerin kullanılması mümkün olabilir Laktik Asit Bakterileri Laktik asit bakterileri, metabolizmaları sırasında laktozu parçalayarak laktik asit üreten mikroorganizmalar olarak tanımlanır. Laktik asit bakterileri, fermente gıdaların üretiminde yaygın olarak kullanılır, ticari açıdan önem taşıyan bir mikroorganizma grubunu teşkil eder [Kao ve ark., 2007; Naidu ve ark., 1999]. Laktik asit bakterileri gram pozitif, spor oluşturmayan, hareketsiz, fizyolojik karakterleri bakımından birbirine yakın ancak morfolojileri oldukça farklı olan cinsleri içerirler. Morfolojileri kok veya çubuklardan oluşan farklı uzunlukta zincir şeklindedir [Çakır ve Çakmakçı, 2004; Gismondo ve ark., 1999]. Şekil 2.3 de laktik asit bakterilerinin taramalı elektron mikroskobundaki görüntüsü bulunmaktadır. Şekil 2.3. Lactobacillus sp. bakterisinin elektron mikroskobundaki görüntüsü [www. dribrook.blogspot.com].

42 24 Laktik asit bakterileri sütte bulunan laktoz şekerini parçalayarak, galaktoz ve glukoz şekeri oluştururlar. Su ve toprakta hemen hemen hiç rastlanılmayan bu bakterilere, cins ve türe göre değişmek üzere süt ve süt ürünleri çalışma yerlerinde, bitki ve bitki atıklarında, insan ve hayvan barsak sistemlerinde rastlanır [Kleerebezem ve ark., 2003]. Laktik asit bakterileri antimikrobiyal maddeler, şeker polimerleri, tadlandırıcılar, aromatik bileşikler, yararlı enzimler ürettikleri ve sağlık geliştirici etki yarattıkları için probiyotik olarak kullanılırlar. Bu mikroorganizmaların spesifik özelliği şekerleri laktik asit ve asetik asite çevirmesi ile ortam ph sını düşürmesi ve salgıladıkları ürünlerle zararlı bakterilerin gelişimini baskılamasıdır [Tunail, 2009]. LAB ın doğada bulunması insan ve hayvanların yaşamlarını sürdürebilmeleri için çok önemlidir. Bu mikroorganizmalar, deride, sindirim sisteminde ve vajinal mukozada doğal olarak bulunur. Bu alanlarda birçok fonksiyon gerçekleştirir ve zararlı mikroorganizmalara karşı hareket ederler. Ayrıca, LAB laktoz kullanımı, proteinaz faaliyeti, bakteriyofaj savunma mekanizmaları, ve bakteriyosin üretimi gibi ekonomik öneme sahip çeşitli özelliklerede sahiptir [Mahony ve ark., 2005]. LAB bu yararlı özelliklerinden dolayı Probiyorik Mikroorganizma olarak tanımlanır. LAB ın probiyotik özellikleri aşağıdaki şekilde özetlenebilir: Glukozu laktik asite çevirerek çevrenin istenilen mikrobiyal dengeye gelmesini sağlarlar. Putrefaktif mikroorganizmaların hareketlerini sınırlarlar. Patojen bakterilerin gelişimini inhibe ederler. Laktozu hidrolize eder ve atarlarorganizmanın bu şekere karşı toleransı yoktur. Bağırsakta peristaltik hareketlerin oluşmasına katkıda bulunur ve boşaltımı hızlandırırlar. Bağırsak mukozasını kaplar ve patojen istilasına karşı korurlar. Makrofajları aktive ederek bağırsakları zararlı bakterilerden korurlar. Laktik asit bakterilerinin klinikte de; irritabl bağırsak sendromuna karşı yarar sağlama, alerjik durumlarda deri sağlığını savunma, dental sağlığı savunma,

43 25 tansiyonun düzenlenmesine yardımcı olma, immün sistemin ve karaciğer fonksiyonlarının düzenlemesi, ağrı kesici etkisi, vajinal enfeksiyonların iyileştirilmesi, anti ödem ajanı, kalp damar sağlığını koruma gibi birçok yararlı etkisi kanıtlanmıştır [Niel ve ark., 2002] Son yıllarda yapılan çalışmalar probiyotiklerin sağlık üzerindeki olumlu etkisinin sadece mikroorganizma hücrelerinden değil, metabolitlerinden de kaynaklandığını ortaya koymuştur [Mahony ve ark., 2005] Laktik asit bakterilerinin metabolitleri Laktik asit bakterileri, metabolizmaları sırasında laktozu parçalayarak, laktik asit oluşturan mikroorganizmalardır ve laktatın sentezinde rol alan laktat dehidrogenaz enzimine sahiptirler [Tekinşen ve Atasever, 1994; Nessler, 1994]. Laktik asit bakterileri, laktik asit fermantasyonu ile oluşturdukları ürünlerin cins ve miktarına göre sınıflandırılırlar. Homofermentatif laktik asit bakterileri glukozu, fruktoz difosfat yolu ile parçalayarak, fermantasyon sonunda % 99 oranında laktik asit, % 1 oranında ise diğer bileşikleri meydana getirirler. Heterofermentatif laktik asit bakterileri, glukozu heksoz mono-fosfat yolu ile parçalayarak fermantasyon sonucu % 70 laktik asit üretir. % 30 oranında da diğer molekülleri, özellikle asetik asit, etil alkol ve karbondioksiti oluştururlar. Buna ek olarak, bazı laktik asit bakterileri asetaldehit, diasetil, H 2 O 2, ekzopolisakkarit, bakteriyosin, bakteriyosin benzeri metabolitler ve şeker alkolleri gibi diğer yan ürünleri de sentezleyebilirler [Yetişmeyen, 1995; Daeschel, 1989; Drinan ve ark., 1976]. Bunlara laktik asit bakterilerinin metabolitleri denir. Ayrıca, bir çok LAB, B vitaminlerinden olan riboflavin, folat ve B12 vitaminleri üretmekte ve bakteriyel üretim sonucu fermente ürünler bu vitaminlerce zenginleşmektedir [Barba ve Diaz, 1995]. Yapılan bir çalışmada, Laktik asit bakterileri tarafından üretilen laktik asit metabolitinin, kalın bağırsakta skatol ve indol gibi fenolik bileşikler üreterek, canlı dokuya zarar veren bakterilere karşı engelleyici, bağışıklık sistemini güçlendirici, vücudu koruyucu ve enfeksiyonları engelleyici etkilerinin yanı sıra kadınlarda hamilelik süresince ve sonrasında kan basıncını düzenleyici etkisi olduğu belirtilmektedir [Canan ve ark., 2004]. Yapılan başka bir çalışmada, laktobasillerin ürettiği metabolitlerin

44 26 bifidobakteriler üzerinde BGD etkisi gösterdiği bildirilmiştir [Yonezawa ve ark., 2010] Ekzopolisakkaritler (EPS) Probiyotik mikroorganizmaların çoğalmaları sırasında ya da sekonder metabolit olarak ortama saldıkları EPS ler dallanmış tekrarlı şeker birimlerini ve şeker türevlerini içeren uzun zincirli, yüksek moleküler ağırlıklı polimerlerdir. Bu şeker birimleri genellikle farklı oranlarda glukoz, galaktoz ve ramnozdan oluşmaktadır [De Vuyst ve Degeest, 1999]. Hücresel lokasyonları, fiziksel ve kimyasal yapı özellikleri ile fonksiyonlarına göre mikrobiyal EPS leri üç ana grup altında toplamak mümkündür. Bunlar; hücre yüzeyine kovalent bağlarla bağlanan kapsüler polisakkaritler (CPS), hücre duvarının bir bileşeni olan polisakkaritler (Lipopolisakkarit, LPS) ve dış çevreye salınan ya da hücre yüzeyi ile gevşek bağlarla ilişkilenmiş polisakkaritlerdir (Ekzopolisakkarit, EPS) [Shoji ve ark., 2013; Leigh ve Walker, 1994]. Çeşitli mikroorganizmalar tarafından üretilmekte olan bu bileşikler, laktik asit grubuna dahil olan bir çok mikroorganizma tarafından üretilmektedir. LAB GRAS (genellikle güvenli kabul edilen) statüsünde bakteriler olup; bu bakteriler tarafından üretilen EPS ler de GRAS olarak kabul edilmektedir. Mikroorganizmaların çevrelerine salgıladıkları EPS lerin, hücreleri kurumadan, fagositozdan ve faj etkisinden koruduğu, yüksek oksijen gerilimi sağladığı, antibiyotiklere ve toksik maddelere (toksik metal iyonları, sülfür dioksit, etanol gibi) karşı hücreleri koruma, biyofilm oluşturma ve yüzey tutunmasında yapıştırıcı işleve sahip olduğu bilinmektedir [Schurr, 2013; Cerning ve ark., 1994]. EPS nin laktik asit bakterilerine sağlamış olduğu bu özellikler ve avantajlar dikkate alınırsa, yüksek EPS üretimi, bir suşun hem starter hem de probiyotik olarak kullanımının çok önemli bir avantajı olacaktır. Bakterilerde EPS üretimi suşlara göre değişkendir ve farklı LAB dan üretilen EPS lerin komposizyonları, üç boyutlu yapıları, sertlik, biyokimyasal ve biyofiziksel özellikleri, şeker bağları, polimer uzunluğu, şeker içerikleri, polimer dallanmaları, proteinlerle ilişkileri de birbirinden farklıdır [De Vuyst ve ark., 2001]. EPS nin

45 27 endüstride kullanılması bu molekülün kapsüler veya salgılanır olması, bileşimi, büyüklüğü ve şeker içeriği gibi özelliklerine bağlıdır [Dabour ve ark., 2005; Faber ve ark., 1998]. Gıda endüstrisinde mikrobiyal ekzopolisakkaritler (EPS) kıvam artırıcı, jelleştirici ajan olarak kullanılmaktadır [Sutherland, 1998; Duboc ve Mollet, 2001]. Bunun yanı sıra EPS sağlık için yararlı özellikleri ile de dikkat çekmektedir. LAB EPS lerinde antitümör, bağışıklık uyarıcı [Welman ve Maddox, 2003], antibiyofilm [Kim ve ark., 2009] ve antioksidan aktivite bildirilmiştir [Pan ve Mei, 2010]. Ayrıca, LAB EPS sinin gastrointestinal sistemde, probiyotik mikroorganizmaların gelişimini ve aktivitesini arttırmak gibi prebiyotik etkilerde doğrudan ya da dolaylı rolü olduğu bildirilmektedir [Welman ve Maddox, 2003] Laktik Asit Bakterilerinin Bifidobakterilerin Gelişimini Düzenleyici (BGD) Etkisi İnsan kalın bağırsağında bulunan bifidobakterilerin intestinal alanda birçok yararlı etkisinin olduğu tespit edilmiştir. İnsan sağlığı için bu kadar yararlı olan bir mikroorganizmanın gastrointestinal sistemdeki sayısının ve yararlı özelliklerinin artışının sağlanması için bugüne kadar çeşitli araştırmalar yapılmıştır. Gaita ya da gastrointestinal sistemin alt bölgelerindeki bifidobakteriyal populasyon emilemeyen fermente karbonhidratlar veya diğer ek besinlerin alımıyla artmaktadır [Picard ve ark., 2005]. Bu karbonhidratlar bifidobakteriler tarafından seçici olarak fermente edilir. Bifidogenik aktivite gösteren oligosakkaritler arasında: laktuloz, fruktooligosakkaritler, galakto-oligosakkaritler, soya oligosakkaritleri, izomaltooligosakkaritler, gluko-oligosakkaritler sayılabilir. Bu oligosakkaritlere alternatif olarak laktik asit bakterilerinin ürettiği ekzopolisakkaritler (EPS) gösterilebilir. Ayrıca, bifidobakeri gelişimi butirat, propionat gibi organik asitlerin yanısıra laktik asit bakterilerinin ürettiği laktat ve asetat gibi kısa zincirli yağ asitleri ve bazı serbest amino asitler tarafından da teşvik edilebilmektedir [Yamasaki ve ark., 1998].

46 Filtratların BGD etkisi İlk olarak Kaneko ve arkadaşlarının 1994 yılında yaptıkları çalışmada, propiyonik asit bakterilerinin bifidobakterilerin gelişimini düzenleyici bir molekül sentezlediklerini (BGD) belirlemişlerdir. Bu çalışmada, P. freudenreichii 7025 kültürünün hücresiz filtratının eklenmesiyle çalışmada kullanılan bütün bifidobakterilerin gelişimininin arttığı görülmüş ve bu hücresiz filtratın diğer intestinal bakterilerin gelişimini düzenlemediği gözlemlenmiştir. Araştırmacılar, bu etkiye bifidobakterilerin gelişimini düzenleyici (BGD) etki; bu etkiye sebep olan molekülleri de bifidobakterilerin gelişimini düzenleyen (BGD) moleküller olarak tanımlamışlardır. Propiyonik asit bakterilerinin ürettikleri asetat ve propiyonat gibi organik asitlerin bifidobakterilerin gelişimini düzenlemede etkilerinin olduğu rapor edilmiştir [Kaneko ve ark., 1994]. Laktik asit bakterilerinin ürettiği laktik asit ve asetat gibi organik asitlerde bifidobakterilerin gelişimini benzer şekilde düzenleyebilir. Ayrıca laktik asit bakterilerinin, bifidobakterileri geliştirici bir molekül olan B12 vitamini sentezlemelerinden dolayı da LAB kültür filtratları BGD etkisi gösterebilir yılında Mori ve arkadaşlarının yaptıkları çalışmada, P. freudenreichii nin üretmiş olduğu BGD molekülü izole edilmiş ve kimyasal yapısı belirlenmiştir. İzole edilen BGD molekülünün formülünün C 11 H 7 NO 4 olduğu ve kimyasal yapısının 2- amino-3-karboksi-1,4-naftokinon (ACNQ) olduğu belirlenmiştir [Mori ve ark., 1997]. Isawa ve arkadaşları 2002 de yaptıkları çalışmada P. freudenreichii ET-3 suşu tarafından üretilen yeni bir BGD molekülü bulmuşlar ve BGD nin kimyasal yapısının 1,4-dihidroksi-2-naftoik asit (DHNA) olduğunu tespit etmişlerdir [Isawa ve ark., 2002]. Bu çalışma sonucunda propiyonik asit bakterilerinin BGD etkisine ACNQ molekülü ile birlikte DHNA molekülünün de sebep olduğu ortaya çıkarılmıştır. BGD etkisi gösteren ACNQ ve DHNA gibi moleküller ya da aynı etkiyi gösteren spesifik moleküller laktik asit bakterileri tarafından da sentezleniyor olabilir. Ancak laktik asit bakteri metabolitlerinin BGD etkisi ile şimdiye kadar sadece bir çalışma

47 29 yapılmıştır. Yonezawa ve arkadaşlarının 2010 yılında yaptıkları bu çalışmada, laktik asit bakterilerinin bifidobakterilerin gelişimini düzenleyici (BGD) bir molekül ürettiklerini tespit etmişlerdir. Çalışmada, L. lactis türüne ait 19 adet suşun Bifidobacterium longum BB536 suşuna olan etkisi incelenmiş ve hücre duvarı bağlantılı proteinaz enzimine sahip olan suşların bifidobakteri gelişimini arttırdığı görülmüştür. Bu enzim proteinleri hidrolize etme ve azot kaynağı temin işlevleri yaparak bakteri gelişimi için serbest aa veya oligopeptitler gibi molekülleri oluşturmaktadır. Araştırmacılar, proteinaz enzimine sahip olan suşların hücresiz filtratlarını 6 farklı bifidobakteriye uygulamışlar ve filtratın bifidobakterileri geliştirici etki gösterdiğini bulmuşlardır. Bu çalışmanın sonuçları BGD aktivitesi ile ilişkili başlıca bileşenlerin metyonin ve lösin amino asitlerinin olduğunu göstermiştir EPS nin prebiyotik olarak kullanımı Bağırsak sisteminde bifidobakterilerin gelişiminin artırılması, çok spesifik karbonhidratlarla sağlanabilmektedir [Garsse ve ark., 2003]. Probiyotik olarak isimlendirilen bakterilerin selektif olarak büyüme ve gelişmesini sağlayan, aktivitelerini arttıran sindirilemeyen karbonhidrat bileşlenlerine prebiyotik adı verilmektedir [Gibson ve Roberfrold, 1995]. LAB EPS sinin gastrointestinal sistemde, probiyotik mikroorganizmaların gelişimini ve aktivitesini arttırmak gibi prebiyotik etkilerde doğrudan ya da dolaylı rolü olduğu bildirilmektedir. [Welman ve Maddox, 2003]. EPS nin bifidobakterilerin gelişimini arttırıcı etkisi daha önce yapılan iki çalışmada tespit edilmiştir [Bello ve ark., 2001 ve Korakli ve ark., 2002]. Bello ve arkadaşlarının 2001 de yaptığı çalışmada, Lactobacillus sanfranciscensis den elde edilen EPS nin insan fekal kültürlerinde bifidobakterilerin sayısını yaklaşık 100 kat arttırdığı gözlemlenmiştir. Ayrıca, bu fruktan benzeri EPS nin Bifidobacterium breve, Bifidobacterium bifidum, Bifidobacterium adolescentis ve Bifidobacterium infantis gibi birçok Bifidobacterium cinsine ait türlere aynı etkiyi gösterdiği rapor edilmiştir. Korakli ve arkadaşları 2002 de yaptıkları çalışmada, Lactobacillus sanfranciscensis den elde edilen EPS nin B.

48 30 breve, B. bifidum, B. adolescentis, B. minimum ve B. infantis türleri üzerinde gelişimi düzenleyici etkisinin olduğunu gözlemlemişlerdir. Bir gıda bileşeninin prebiyotik olarak adlandırılması için; bağırsak sisteminin üst kısmında hidrolize ve absorbe olmamalı, bağırsakta bulunan yararlı bakterilerden tarafından kullanılabilmeli, sağlığı iyileştirici yönde bağırsak florasını değiştirebilmeli ve konak sağlığını olumlu yönde etkilemelidir [Perrin ve ark., 2001]. LAB tarafından üretilen EPS'nin prebiyotik olarak önerilebilmesi için parçalanabilirliği, yararlı kolon bakterileri ile yıkılma özgüllüğü ve insan sağlığı üzerindeki temel etkileri üzerinde çalışmak gereklidir. Korakli ve arkadaşları 2002 de yaptıkları çalışmada, B. breve, B. bifidum, B. infantis ve B. adolescentis türlerinin gelişiminde kullanılan uygun besiyerinin gulukoz kaynağını çıkartıp, yerine L. sanfranciscensis TMW1.392 suşunun ürettiği EPS yi aynı oranda eklemişlerdir. 48 saat inkübasyon sonrasında bifidobakteri gelişimi ve kültür ph ları ölçülmüş ve EPS nin bifdobakteriler tarafından fermente edilebildiğini rapor etmişlerdir. Looijesteijn ve arkadaşları yaptıkları çalışmada, L. lactis subsp. cremoris NZ-4010 suşunun ürettiği EPS yapısının sindirim sisteminde bir değişikliğe uğramadığını bulmuşlardır. Deney insandaki sindirim sistemine benzer bir model oluşturularak, pepsin, pankreatik enzimlerin bir karışımı, kolik ve taurodeoxy asit içeren bir çözeltide 37 0 C de in vitro olarak yürütülmüştür. Aynı yazarlar, L.lactis subsp. cremoris B-40 tarafından üretilen EPS nin direncini, EPS içeren diyet ile 2 hafta beslenen sıçanlar kullanılarak, in vivo olarakta test etmişler ve EPS nin sindirime karşı neredeyse %100 oranında dirençli olduğunu bulmuşlardır [Looijesteijn ve ark., 2001]. LAB dan izole ettikleri birçok EPS nin biyojik parçalanmaya dayanıklılığı konusunda çalışan Ruijssenaars ve arkadaşları 2000 de EPS nin biyoparçalanmasını in vitro koşullarda bir fekal bulamaç süzüntü ile anaerobik koşullar altında ve 37 0 C de test edilmişlerdir. S. thermophilus Sfi-39 ve Sfi-12 suşları tarafından üretilen

49 31 EPS, L. lactis spp cremoris B-40, L. sake O-1, S. thermophilus Sfi-20 ve L. helveticus Lh-59 suşları tarafından üretilen EPS lerin aksine, mide-bağırsak mikroorganizmaları ile bozulmuştur. Yazarlar biyolojik bozulmayı EPS nin birinci yapısı ile doğrudan ilişkilendirmeye çalışmışlardır. Sfi 39 ve Sfi 12 EPS lerinin yan zincirde tek β-galaktozil kalıntısı içerdiğini oysa B-40 ve L. Sake 0 1 biri şarj (fosfat grup) diğeri ise doldurulmamış iki β-galaktozil kalıntısı içerdiğini. Bu özelliğin EPS yi parçalayıcı enzimlerden koruyor olabileceğini bulmuşlardır. Van Casteren ve arkadaşları (1998) L. lactis spp. cremoris B-40 EPS sine karşı çeşitli enzimler test etmişler ve hiçbir parçalanma gözlemlememiştir. LAB ın ürettiği EPS'nin kolesterol seviyelerini ayarlayabilme yeteneği ilk olarak hiper kolesterolemik diyet ve EPS üreten L. lactis subsp. cremoris SBT-0495 ile fermente edilen süt konbinasyonu ile beslenen farelerde gösterilmiştir. [Nakajima ve Hirota, 1992]. Toplam kolesterol oranı, EPS üretmeyen suşlarla fermente edilen süt ile beslenenlere göre bu farelerde daha düşük bulunmuştur. Benzer bir sonuçta Maeda ve diğerleri tarafından yapılan çalışmada (2004), EPS üreten L. Kefiranofaciens WT-2B suşu içeren kefir ile beslenen sıçanlarda kolesterol düşüşü görülmüştür. Ruas-Madiedo ve arkadaşları 2008 de Lactobacillus delbrueckii ve Streptococcus thermophilus gibi birçok türün EPS sinin kolik asit gibi serbest safra asitlerine bağlandığnı ve böylece sindirim sonrası atık olduğunu bulmuşlardır. Bu dolaşımdaki kolesterol seviyesini azaltabilmektedir. Çünkü karaciğer daha fazla safra tuzu sentezlenmesine ihtiyaç duymaktadır. Bağırsaktadaki lenfoid dokusunda yüksek yoğunlukta bağışıklık sistemi hücresi bulunur (vücuttaki B hücrelerinin %80 inden fazlası) buda bağırsağın insandaki en büyük bağışıklık organı olduğunu gösterir [Rahman ve ark., 2007]. EPS nin immün cevap yeteneği kimyasal bileşimi ile ilgilidir. Glikolitik enzimlerin özgüllüğü ve erişilebilirliğinin etkilediği şeker bağlantı türleri ve bu polimerlerin 3 boyutlu yapıları EPS nin prebiyotik yeteneğinde anahtar rol oynamaktadır [Ruas-Madiedo ve ark., 2008].

50 Mikrobiyal Biyofilm Biyofilmler, bir yüzeye yapışarak, kendi ürettikleri polimerik yapıda jelsi bir tabaka içinde yaşayan mikroorganizmaların oluşturduğu topluluk olarak tanımlanabilir [Donlan ve Costerton, 2002]. Bu jelsi tabaka, bakteri hücreleri tarafından üretilen terminolojide hücre dışı polimerik yapı, ekzopolisakarit ya da ekzopolimer (EPS) adı verilen polisakkarit bazlı bir ağ yapısıdır [Simoes, 2010]. Bir başka tanımlamaya göre biyofilm, birbirine ya da bir yüzeye yapışık bakterinin organik bir polimer matriks içine gömülmesidir [Macfarlane ve Mcbain, 1999]. Biyofilmler hem endüstriye, hem de sağlık üzerine olan etkileri nedeniyle gıda sanayinde oldukça önemlidir. Mikrobiyal biyofilmler; aletlerin üzerinde oluşturdukları hasarlar, ürün kontaminasyonları, enerji kayıplarının yanı sıra enfeksiyon hastalıklarına da neden olurlar. Şekil 2.4 de B. cereus un paslanmaz çelik üzerindeki biofilm oluşumuna ait SEM görüntüsü gösterilmiştir [Simoes ve ark., 2010]. Şekil 2.4. B. cereus un biofilm oluşumu (SEM, 6330 büyütme, bar ¼ 5 mm) [

51 Biyofilmin yapısı Biyofilm kütlesinin % 97 gibi büyük bir oranını su oluşturur. Matriks içindeki diğer bileşenler ise; % 1-2 EPS, % 1-2 globuler glikoproteinler ve diğer proteinler, % 1-2 nükleik asit, lipit ve fosfolipitlerdir. Ancak, bu oranlar mevcut mikroorganizmanın türüne, fizyolojik özelliklerine, gelişme ortamının doğasına, genel fiziksel özelliklere göre değişebilmektedir. Polisakkarit, protein, DNA ve sudan oluşan ekstra-selüler matriks biyofilm hücrelerinin tutunmasını sağlar [Simoes ve ark., 2010]. EPS jel ya da viskoe-lastik davranış sergileyebilmekte, biyofilm yapısı protein, Ca +2 iyonları ve polisakkaritler ile daha da sağlamlaşmaktadır [Stoodley ve ark., 2002]. Bununla birlikte hidrolaz, esteraz, glikozidaz, liyaz ve diğer enzimler biyofilmin bileşimine ve fiziksel özelliklerine etki edebilir. Biyofilm yapısındaki bu enzimlerin birçoğu düşük molekül ağırlıklı parçalanma ürünlerinin oluşumuna neden olmakta, bunlar da biyofilmde tutunan bakterilerin metabolizmasında karbon ve enerji kaynağı olarak kullanılmaktadır [Kelly ve ark., 1990]. Biyofilmler yoğun yüzeyler olarak bilinmekle birlikte, son yıllarda yapılan çalışmalarda, su ve besin maddesinin dağıtıldığı kılcal damar su kanallarının bulunduğu gözenekli bir yapısının olduğu tespit edilmiştir. Biyofilm yapısındaki su kanalları mikrokolonilerin hem altında hem de arasında bulunmaktadır. Besinlerin biyofilm tabanına taşınması bu özel kanallar ile mümkün olmaktadır. Hücresel atıklar da biyofilmin yüzeyine bu kanallar vasıtasıyla taşınır [Simoes ve ark., 2010]. Bakteriyel tutunmada, proteinler gibi organik moleküllerin yüzeye tutunmasının önemli bir rolü vardır. Yüzey proteinleri, biyofilm matriksi içinde düzenli bir şekilde oluşur. Bu proteinlerin bazıları, EPS varlığında biyofilm oluşumunu teşvik edebilmektedir. Biyofilm Birleşmiş Protein Yapısı (Biofilm associated protein, BAP), organizmanın yüzeye kolonize olması ve burada sürekli kalmasının sağlanması açısından da önemlidir [Jiang ve ark., 2011].

52 Biyofilm oluşumunun aşamaları Biyofilm oluşumu temelde 4 aşamada gerçekleşmektedir. Şekil 2.5 de bu aşamalar şematik olarak gösterilmiştir [O'Toole ve ark., 2000]. 1. Film tabakasının oluşması 2. Planktonik mikroorganizmaların adezyonu 3. Mikroorganizmaların polimerik matriks içinde kolonizasyonu 4. Mikroorganizmaların biyofilmin üst tabakasından koparak ayrılması Biyofilm oluşumu için, planktonik yani sıvı bir ortam içinde diğer bakterilerden bağımsız olarak serbest yüzen bakteriler, bir ön koşuldur. Bakterilerin biyofilm oluşturabilmeleri için öncelikle katı bir yüzeye tutunmaları gerekmektedir. Ancak, bunun öncesinde yüzeyin yapışmaya uygun hale gelmesi gerekmektedir. Bu aşamada, protein, glikoprotein ve bazı sekrete edilmiş mikrobiyal ürünler yüzeye yapışırlar ve ince bir film tabakası oluşturarak mikrobiyal biyofilm oluşumu için yüzeyi hazır hale getirirler. Film tabakasının oluşumundan sonra bakteriler yüzeye geri dönüşür özellikte tutunurlar. Film tabakası her zaman mikroorganizmaların bölgeye gelmesinden önce oluşur ve belirli mikroorganizmaların selektif olarak adezyonunu indükleyerek, biyofilmin mikrobiyal içeriğini etkiler. İkinci aşama, mikroorganizmaların adezyonunu içerir. Erken kolonileşen mikroorganizmalar diğer mikroorganizmaların adezyonu için önemlidir. Örneğin, streptokok türleri erken kolonileşenler arasındadır ve hem gram (+) hem de gram (-) bakterilerin adezyonu için önemli bir rol oynamaktadırlar. Üçüncü aşama, tutunan mikroorganizmaların çoğalmasını ve metabolizmasını kapsar ki bu durum, yapısal olarak organize olmuş biyofilmin en küçük birimi olan mikrokolonilerin oluşmasıyla sonuçlanır. Mikroorganizmaların kendine özgü karakteristikleri ve çevresel faktörler, biyofilm içindeki gelişimlerini ve dizilimlerini etkiler. Oluşan biyofilmin üst tabakasından mikroorganizmalar koparak ayrılır. Mikroorganizmaların yüzeyden ayrılmaları gelişim sırasında sürekli devam eden bir süreçtir. Mikroorganizmaların yüzeyden düzenli olarak ayrılmaları, başka alanlara yayılmaları ve kolonize olmaları anlamına gelir [Costerton ve ark., 1999; O'Toole ve ark., 2000]

53 35 Şekil 2.5. Biyofilm oluşumunun aşamaları Sinyal molekülüyle iletişim (quorum sensing) Quorum sensing (QS), bakterilerin salgıladıkları kimyasal maddeler aracılığı ile birbirleri ile haberleşmeleri ve iletişim kurmalarıdır. QS sözcük olarak, bir oturum veya toplantı için gerekli olan en az birey sayısının bir araya gelmesi anlamına gelmektedir. Biyoloji açısından ise, bir bakteri topluluğunda birey sayısı belli bir düzeye ulaştığında, ortaya çıkan özel bir tip hücreler arası iletişim anlamını taşır [Camara ve ark., 2007]. Quarum sensing bakterilerde; kümeleşme (swarming), antibiyotik sentezi, biyofilm oluşturma, konjugasyon, hareket, virülans (ekzoenzim ve proteaz üretimi) gibi pek çok fizyolojik olayın düzenlenmesinde görev alır. Bu düzenlenme sonucunda, bakteri ortamdaki besin maddelerinin daha rasyonel kullanımı, çevresel etkenlere karşı korunma, bulunduğu ortama uyum sağlama, aynı ortamdaki diğer mikroorganizmalarla yarışma veya populasyondaki birey sayısını ortamın gereklerine göre kontrol etme, konağın savunma mekanizması ile mücadele etme gibi fonksiyonları yerine getirme olanağı bulur. Bakterilerin salgıladıkları kimyasal maddeler aracılığı ile genetik mekanizmalar harekete geçer ve yeni davranışlar meydana çıkar [Sakuragı ve Kolter, 2007].

54 36 Quarum sensing, bakterinin bir sinyal molekülü sentezlemesi, ekstrasellüler ortama salması, eşik değer konsantrasyonuna ulaştığında onu algılamak üzere uygun reseptör ile bir kompleks oluşturması ve gen transkripsiyonu ile toplu bir yanıt geliştirmesidir. Quarum sensing sistemi bakterinin populasyon içinde yoğunluğunu saptamasını sağlayan bir sistemdir ve bakteri bu bilgiyi kullanarak uygun genetik materyalini kontrol eder (Şekil 2.6) [Bjarnsholt ve Gıvskov, 2007]. Şekil 2.6. Quorum-Sensing Sisteminde Reseptör Spesifik Molekül ilişkisi Biyofilm - hastalık ilişkisi Mikrobiyal biyofilmlerin insan sağlığı üzerinde önemli etkileri vardır. Amerika Birleşik Devletlerindeki Ulusal Sağlık Enstitüleri, enfeksiyonların % 80 inden fazlasına biyofilmlerin neden olduğunu tahmin etmektedir [Holland ve ark., 2000]. Doğal kapak endokarditi, kistik fibrozis, kronik bakteriyel prostatit, otitis media, periodontit gibi doğal seyirli hastalıklara biyofilm oluşturan bakterilerin neden olduğu bildirilmiştir. Bunun dışında, santral venöz katater, protez kapak, üriner kateter, kontakt lens, ortopedik protez, ve intrauterin cihazlar gibi yabancı cisim enfeksiyonları ile biyofilm arasındaki epidemiyolojik bağ artık kanıtlanmıştır. Bu

55 37 ilişkide değişik mekanizmaların rol oynadığı bildirilmiştir [Holland ve ark., 2000]. Bu mekanizmaların birincisi, hücrelerin ayrılması veya hücre agregatlarıdır. Hücrelerin büyümesi ve aynı zamanda çevreden gelen streslerin artması bazen biyofilm içindeki bakteriyi kopartabilmektedir. Ayrıca biyofilmin düzenleyicisi olarak bilinen açil homoserin lakton molekülü biyofilmin oluşumunu sağladığı gibi kopmaya neden olarak, dolaşım sisteminde enfeksiyona neden olabilir [Davies ve ark., 1998]. İkincisi endotoksin üretimidir. Biyofilm üreten gram negatif bakteriler endotoksin üretimini arttırarak hastada daha fazla immün yanıta da neden olmaktadır. Oluşan inflamatuar yanıtın büyüklüğü enfeksiyonun şiddetini de etkilemektedir [Rioufol ve ark., 1999]. Üçüncü mekanizma konağın immün yanıtına direncidir. Biyofilm oluşturan bakterilere karşı makrofaj fagositik aktivitesinin veya yapılan opsonik antikorların yetersiz olduğu gösterilmiştir [Meluleni ve ark., 1995]. Son mekanizma ise bakterilere direnç aktarımıdır. Bakteride bulunan direnç genlerinin, plazmidlerin biyofilmlere konjugasyonu ile türler arasında aktarılabildiği gösterilmiştir [Hausner ve Wuertz, 1999; Roberts ve ark., 1999] Bağırsak mukozasında oluşan biyofilmler Bağırsaklarda bulunan mukus fırsatçı patojenlere karşı önemli bir konak savunmasıdır. Patojenlerin kolonik mukusa tutunması çok zordur ancak Bacteroides, Fusobacterium, Spirochaetes, Escherichia coli ve gram pozitif kok lar bağırsak duvarına tutunmayı başararak biyofilm oluşturabilirler [Macfarlane ve Mcbain, 1999]. Kolonik biyofilmlerin üç boyutlu yapısının mikroskobik incelemesinde mukozal bakterilerin mukus tabakası boyunca dağılmış olduğunu görülmüştür, fakat sağlıklı kriptlerde bulunmamaktadırlar [Macfarlane ve ark., 2004]. Spesifik 16S rrna floresan probları kullanılarak In situ hibridizasyon çalışmalarıyla Enterokok, Bakteroides ve bifidobakteriler dahil olmak üzere birçok bakterinin mikrokoloniler meydana getirdikleri görülmüştür. Mikrokolonilerin ölü / canlı boyama tekniğiyle incelenmesi sonucunda özellikle mukozal yüzeye yakın olanlar olmakla birlikte, bir çok hücrenin canlı olduğu tespit edilmiştir. Bu bulgular, bakterilerin mukus tabakasında aktif bir şekilde geliştiğini gösterir [Macfarlane ve ark., 2004]. Epitel yüzeylerdeki mikrokolonilerde immünojenik bir bakteri türünün varlığı, çok fazla

56 38 bakterinin birlikte antijen, toksin ya da diğer zararlı salgı ürünlerini çok yüksek konsantrasyonda salgılamasıyla, ülseratif kolit (UC) ve crohn hastalığı gibi bağırsak hastalıklarını oluşturur [Furrie ve ark., 2005]. Ülseratif kolitli hastalarda patojen biyofilmlerin mukus katmanını büyük ölçüde azalttığı veya akut inflamasyon bölgelerinde tamamen yok ettiği görülür [Pullan ve ark., 1994; McCormick ve ark., 1990]. Ülseratif kolitte Bacteroides, Fusobacteria, Streptococcus ve Shigella cinslerinin etiyolojik patojenler olduğu düşünülmektedir. Çünkü bu mikroorganizmalar bağırsak epiteline tutunarak biyofilm oluşturabilmekte ve deney hayvanlarında benzer hastalık semptomlarını teşvik etmektedirler [Onderdonk, 1983]. Ayrıca, kolitik bağırsakta bifidobakterilerin sayısının düşük seviyelerde olduğu görülmüştür [Macfarlane ve Mcbain, 1999]. Şekil 2.7 de ülseratif kolit bir hastanın kolon mukozasında bulunan bakteriyel biyofilmlerin FISH light mikroskop (Flöresan mikroskobi) görüntüsü gösterilmiştir [Macfarlane ve Dilion, 2007]. Bu şekilde kolitli kolonda patojen biyofilmler ve bu alanlarda bifidobakteri sayısının çok az olduğu görülmektedir.

57 39 Şekil 2.7. Ülseratif kolit bir hastanın kolon mukozasında bakteriyel biyofilmlerinin FISH light mikroskop görüntüsü. (a-c) Fekal materyalden ekstre edilmiş dokular. (b d) Numunelerin cins ve türe özgü 16S rrna oligonükleotid floresan probları ile melezlenmesi Biyofilm oluşumunun kontrolü ve engellenmesi Planktonik hücrelerle kıyaslandığında, biyofilm oluşturan hücreler; antibakteriyel maddelere, iodin, iodinpolivinil-pirollidon kompleksi, klorin, monokloramin, peroksijenler ve gluteraldehit gibi biositlere ve ısıya karşı daha dayanıklıdır. Bu nedenle biyofilm üzerine yapılan araştırmaların bir diğer yönü de mikroorganizmalar tarafından oluşturulan ve her bir mikroorganizma için farklı kompozisyona sahip biyofilmin engellenmesi ve/veya ortadan kaldırılması üzerinedir [Kim ve ark., 2009]. Biyofilm oluşumunun kontrolü ve engellenmesinde ilk aşama biyofilm oluşmadan gerekli tedbirlerin alınmasıdır.

58 40 Biyofilmi önlemek amacı ile mikroorganizmalar arası iletişimi kesmek ve biyofilm gelişimini engellemek yolunda yapılan çalışmalara bakıldığında üç ana grup tanımlanabilmektedir. Birincisi, tercih edilecek antimikrobiyalin anti-inflamatuar, alginat sentez yolu inhibitörü, QS molekül blokörü özelliklerini taşımasıdır. Azitromisin bu amaçla en sık kullanılan ilaçdır. Ancak sonuçlar istenilen başarıları sağlayamamıştır. İkinci önlem yöntemi olarak patojen olmayan bakterinin ortama yerleştirilerek patojen olanlara yaşam alanı bırakılmaması olarak tanımlanabilir. Ancak bu çalışmalar patojen olmayan bakterilerin patojen özellik kazanması ile hayal kırıklığı yaratarak son bulmuştur. Bakteriler arası iletişimin engellenmesi için kimyasalların kullanılması üçüncü grup olarak özetlenebilir. Triklosan (sinyal molekülü yapımının engellenmesi), AHL laktanoz ve AHL açilaz (sinyal molekülün inaktive edilmesi), furanon (sinyal reseptör blokajı) bu amaçla kullanılabilecek kimyasallardır. Ancak doku içinde toksik oldukları için tercih edilmezler. Antimikrobiyal ajanlar ve biyositler de biyofilmlerden bir ölçüde kurtulmak için yararlı bir yaklaşım olmuştur fakat bu bileşiklerin doğada uzun süre kalması ve biyofilm içindeki mikroorganizmalar arasındaki hedef olmayan organizmalar ve dirence de toksisite oluşturduğu için daha yararlı bileşikler ile mücadele geliştirilmesi gerekir [Jiang ve ark., 2011; Hetrick ve ark., 2009] Laktik asit bakterileri ile biyofilm oluşumunun kontrolü ve engellenmesi Sayem ve arkadaşları 2011 de yaptıkları çalışmada, deniz süngerinden izole edilen Bacillus licheniformis bakterisinin hücresiz filtratının Escherichia coli PHL-628 üzerinde biyofilm inhibe edici olduğunu bulmuşlardır. Çalışmada, filtratlar Bacillus licheniformis SP1 ve SP3 suşlarından elde edilmiştir. Filtrat biyofilm oluşumunu % oranında inhibe etmiştir. Hücresiz filtrat farklı konsantrasyonlarda hazırlanarak E. coli PHL-628 ve Pseudomonas fluorescens suşların üzerinde antibiyofilm aktivitesi gösterip göstermediğini test etmek için mikro plak ve disk difüzyon yöntemleri kullanılmıştır. Anti-biyofilm etkinliğinin filtrat konsantrasyonunun artışına bağlı olarak yükseldiği görülmüştür. % 5 lik filtratta biyofilm oluşumu % oranında düşmüştür. On kat konsantre filtrat E. coli PHL-

59 ve P. fluorescens tarafından yapılan biyofilm oluşumunu tamamen inhibe etmiştir [Sayem ve ark., 2011]. Slama ve arkadaşlarının 2013 de yaptıkları araştırmada, Tunus un geleneksel fermente gıdalarından izole ettikleri Lactobacillus plantarum bakterisinin hücresiz filtratlarının L. monocytogenes üzerinde antibiyofilm aktivitesi gösterdiğini tespit etmişlerdir. Çalışmada fermente zeytin, peynir ve balık konservesinden 3 adet L. plantarum izole edilmiş ve bu suşların filtratının antibiyofilm aktivitesini belirlemek için mikro plak yöntemi kullanılmıştır. Bu araştırmanın sonucunda, L. plantarum filtratları L. monocytogenes biyofilm oluşumunu % 5-90 oranında inhibe etmiştir. Ayrıca, çalışmada filtratların antibiyofilm etkisi olgun biyofilmler üzerinde de araştırılmış ve filtratların olgun biyofilmleri % 5-80 oranında yok ettiği tespit edilmiştir [Slama ve ark., 2013]. Walencka ve arkadaşları 2008 yılında yaptıkları çalışmada, Lactobacillus acidophilus suşlarından izole ettikleri sürfaktanların Staphylococcus aureus ve S. epidermidis bakterilerinde biyofilm oluşumunu inhibe ettiğini bildirmişlerdir. Bu çalışmada, bakteriyel ilk tutunmayı, biyofilm oluşumunu ve dağılımını belirlemek için konfokal lazer tarama mikroskobu kullanılmıştır. S. epidermidis ve S. aureus suşlarının sürfaktanlar ile birlikte 3 saat inkübasyonundan sonra biyofilm oluşumunun (suşa ve doza göre degişen) % 5-56 oranında düştüğü görülmüştür [Walencka ve ark., 2008]. Biyofilmler doğal, endüstriyel ve klinik ortamlarda bakteri gelişmesinin üstün bir modudur. Biyofilmler, karışık türlerden bakteri hücrelerinin ve polimerik matrislerin bir doku ya da yüzeye bağlı olarak bulunmasıdır [Costerton ve ark.,1987; Stoodley ve ark., 2002]. Biyofilmler dış streslere çok dayanıklıdır ve antibiyotik veya başka biyositler ile bunların ortadan kaldırılması genellikle etkisizdir. [Hall-Stoodley ve Stoodley, 2009]. Biyofilm oluşumu endüstriyel korozyon, biyolojik kirlilik ve kronik hastane enfeksiyonları gibi alanlarda önemli bir sorundur [Francolini ve Donelli, 2010; Hoiby ve ark., 2011]. Yapılan litaratür araştırmalarına göre, bazı bakteri

60 42 polisakkaritlerin biyofilmleri inhibe ettiği görülmüştür. Çizelge 2.5 de bu çalışmalar özetlenmiştir Çizelge 2.5. Bakteriyel antibiofilm etkisi gösteren polisakaritler. Polisakkaritler Bileşenleri Türler ve Suşlar Referanslar Ec111p Mannoz Glukoz Galaktoz Glukuronik Asit E. coli Ec111 Rendueles ve ark. (2011) Ec300p Mannoz Glukoz Galaktoz Glukuronik Asit E. coli Ec300 Rendueles ve ark. (2011) K2 Galaktoz Gliserin Fosfat Asetat E. coli CFT073 Valle ve ark. (2006) Pam Galaktofuranaz K. kingae PYKK081 Bendaoud ve ark. (2011) Pel Glukoz-Açısından Zengin P. aeruginosa PAO1 Qin ve ark. (2009) Pı80 Eps Arabinoz S. phocae PI80 Kanmani ve ark. (2011) Psl Mannoz Ramnoz P. aeruginosa PAO1 Qin ve ark. (2009) R-Eps Bilinmiyor L. acidophilus A4 Kim ve ark. (2009) Sp1 Eps Galaktoz Gliserin Fosfat B. licheniformis SP1 Sayem ve ark. (2011)

61 43 Yeni çalışmalarda ticari fermente süt ''villi" den izole edilen EPS nin bazı patojenlerin biyofilm yapmasını engelleyici etkisinin olduğu görülmüştür [Kim ve ark., 2009]. Ancak çok az raporda probiyotik bakterilerden elde edilen EPS'nin antibiyofilm etkisi yer almaktadır. Valle ve arkadaşları abiyotik yüzeylerde patajenik biyofilmlerin polisakkaritler ile inhibe edildiğini bulmuşlardır. Ancak, biyotik yüzeylerde biyofilm inhibisyonu üzerine sadece birkaç çalışma vardır. Kim ve arkadaşları tarafından 2009 de yapılan çalışmanın amacı LAB dan izole edilen EPS nin serbest formunun biyofilm inhibitör özelliklerini karakterize etmektir. Çalışmada Lactobacillus acidophilus A4 suşundan izole edilen EPS nin Enterohemorajik Escherichia coli O157:H7 bakterisinin biyofilm oluşturmasını engelleyici etkisini test etmişlerdir. Çalışmada, EPS 0,1 ile 10 mg/ml konsatrasyonlarında kullanılmıştır. En çok biyofilm oluşumunu azaltan 1mg/ml konsantrasyonu, biyofilm oluşumunu % 87 oranında düşürmüştür. Bu sonuçlar EPS nin plastik yüzeylerde biyofilm oluşumunu engellemekte olduğunu gösteriyor. Buna ek olarak, EPS nin biyofilmi azaltabilir olup olmadığını belirlemek için biyofilm bir bağırsak modeli olarak insan epitel HT-29 hücreleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir ve EPS nin biyotik yüzeylerde de antibiyofilm etkisi olduğu görülmüştür EPS nin antibiyofilm etkisinin mekanizması EPS nin antibiyofilm aktivitesi bakteri gelişminin engellenmesine yol açmaz Sayem ve arkadaşlarının yaptığı çalışmada sünger kaynaklı B. licheniformis ten elde edilen hücresiz filtratın hedef suşlarda gelişime yönelik azaltıcı bir etki yapıp yapmadığını anlmak için % 5 lik filtratın olduğu ve olmadığı ortamda gelişen bakteriler için suşların gelişme eğrileri ölçülmüştür. Sonuçta, ortaya çıkan büyüme oranlarının aynı olduğu görülmüştür. Filtratın hedef suşlara karşı bir bakteriyosid etkisi göstermediği açıkça görülmüştür. Bu deney disk difüzyon yöntemi ile de teyit edilmiş ve filtratın bakteriyosit etkisinin olmadığı doğrulanmıştır. Filtratın antibiyofilm etkinliği mikroskobik görüntüleme ile filtratın E. coli de önemli ölçüde

62 44 yüzey hidrofobikliği meydana getirdiği gözlemlenmiştir ve bu yaklaşım doğrulanmıştır [Sayem ve ark., 2011]. EPS nin bakteriyel hücre yüzeyi ve hücre sinyal sistemlerinin üzerinde etkileri Son gözlemler patojenik bakterilerin ilk bağlanma ve agregasyonun önemli virulans mekanizmalar olduğuna güçlü destek verir. EPS hücre için hücre yüzey modifikasyonlarını ya da hücre içi etkileşimini zayıflatarak güçlü antibiofilm aktivite uygulayabilir. Kim ve arkadaşları tarafından yapılan deneyde, L. acidophilus A4 den izole edilen EPS biyofilm gelişimi sırasında bakteriyel yüzey özelliklerini etkileyerek EHEC O157:H7' in ilk bağlanma ve otoagregasyonunu inhibe ettiği bulunmuştur [Kim ve ark., 2009]. Ren ve meslektaşları (2004) furanon ve ursolik asitin AI-2 quarum sensing ile ilgili genleri inhibe ettiği dolayısıyla, furanon ve ursolik asitin biyofilm oluşumunu inhibe ettiği göstermişlerdir. EPS nin AI-2 quorum sensing sisteminin üzerinde etkisi olup olmadığını araştırmak için Kim ve arkadaşları (2009) EHEC in Al-2 benzeri aktivite gösteren hücresiz filtratı V. harveyi BB-170 kültürlere ilave etmiş ve EPS (0, 0.1, 1.0, ve 10.0 mg/ml) ile inhibisyonu incelenmiştir. Luxs insertinal mutant bir negatif kontrol olarak kullanılmıştır. EPS varlığında Al-2 aktivitesinde bir değişiklik gözlemlenmemiştir. Bu nedenle EPS nin biyofilm oluşumundaki azaltıcı etkisi Al-2 aktivitesini baskılaması nedeniyle olmadığı anlaşılmıştır. EPS varlığında spesifik gen regülasyonu Biyofilm oluşumunda, bağlanma ve mikro koloni oluşumu için kritik genlerin çeşitli mutasyonları sonucunda ilk bağlanmanın önemli ölçüde azaldığı görülmüştür. Kim ve arkadaşları (2009) EPS nin varlığında EHEC O157: H7 deki biyofilm genlerinin kontrolü için DNA microarray çalışması yapılmışlardır. EHEC O157:H7, 1.0 mg / ml EPS ile maruz kaldığında toplamda 25 genin 2 kat fazla bastırıldığı bulurken, 11 genin ise 2 kat daha fazla indüklendiği bulmuşlardır. Bu genler arasında Curli Üretim Genleri nden, Crl, (2.0-kat), CsgA (1.8-kat), ve CsgB (1.7-kat) ve kemotaksis

63 45 genlerinden Che Y (2.2-kat), EPS varlığında önemli ölçüde bastırılmıştır. Curli genleri özellikle bir majör (Csg A) ve minör (Csg B) alt birimlerinden oluşur ve E. coli suşlarında biyofilm özelliklerini belirler. EPS nin gram pozitif ve negatif bakteriler üzerindeki antibiyofilm aktivitesi Gram-pozitif ve negatif bakteriler aktif EPS nin antibiyofilm oluşumu üzerinde EPS inhibisyon spektrumunu değerlendirmek için, Kim ve arkadaşları (2009) çeşitli patojenik bakterilerin (Salmonella enteritidis, Salmonella typhimurium KCCM 11806, Yersinia enterocolitica, P. aeruginosa KCCM 11321, Listeria monocytogeness COTTA, ve Bacillus cereus) biyofilm formasyonu üzerinde EPS (1.0 mg / ml) etkisini araştırmışlardır. Bu deneyler sonucunda, EPS önemli ölçüde hem polistirorene hem de PVC yüzeylerin ikisinde de test edilen bütün bakterilerin biyofilm oluşumunu azalttığı göstermişlerdir. Bu sonuçlardan, gram-pozitif ve gram negatif bakterilerde biyofilm oluşumuna karşı EPS nin geniş bir spektrum gösterdiği anlaşılmıştır. Bu nedenle, L. acidophilus dan izole edilen EPS birçok gıda endüstrisinde biyofilm önleyici olarak kullanılabilir. Sayem ve arkadaşları (2011) Bacillus licheniformis SP1 in biyofilm önleyici etkisini değerlendirmek için patojeniteye bakılmaksızın birden fazla, suşu filtrat ile test etmişlerdir. Bütün suşların filtrattan etkilendiği bulunmuş ve suşlar arasında, 10 üzerinden 5 suşta biyofilm gelişim inhibisyonu % 50 den daha fazla olduğu ortaya çıkmıştır.

64 46 3.MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Çalışmada kullanılan bakteriler: Bu çalışmada, Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoteknoloji Laboratuvarı kültür koleksiyonu içerisinde bulunan gıda veya yeni doğan gaitasından izole edilmiş 6 adet laktobasillus ve 2 adet bifidobakteri kültürü ve 13 adet patojen bakteri kültürü kullanılmıştır. Bu bakterilerin fizyolojik testleri, biyokimyasal testleri (API 20A, 20E ve 50CH kitleri ile) ve 16S rdna dizilerine göre moleküler tanımlamaları farklı çalışmalar kapsamında yapılmıştır. Bu nedenle, suşların tanımlama yöntemleri bu tezde verilmemiştir. Çalışmada kullanılan laktik asit bakterilerinin ve bifidobakterilerin türlere göre dağılımı ve izole edildikleri kaynaklar Çizelge 3.1 de, patojen bakterilerin türlere göre dağılımı ise, Çizelge 3.2 de verilmiştir. Çizelge 3.1. Çalışmada kullanılan laktobasillerin ve bifidobakterilerin türlerine ve kaynaklarına göre dağılımı. Tür İsmi Suş Kodu Kaynak Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus B3 Gıda Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus A12 Gıda Lactobacillus paracasei LB8 Gaita Lactobacillus rhamnosus GD11 Gaita Lactobacillus plantarum GD2 Gaita Lactobacillus fermentum LB69 Gaita Bifidobacterium breve A-28 Gaita Bifidobacterium breve BASO-1 Gaita

65 47 Çizelge 3.2. Biyofilm çalışmasında kullanılan patojen mikroorganizma türleri Tür İsmi Suş Kodu *Bacillus cereus RSKK-863 *Listeria monocytogenes ATCC-7644 *Enterococcus faecalis ATCC *Pseudomonas aeruginosa ATCC Escherichia coli 0157:H7 Escherichia coli ATCC Staphylococcus aureus ATCC-2392 Staphylococcus aureus ATCC Staphylococcus aureus EB-1 Staphylococcus aureus EB-12 Staphylococcus aureus EB-18 Staphylococcus aureus EB36 Salmonella typhimurium BAST-01 *: antibiyofilm çalışmasında kullanılan suşlar Çalışmada kullanılan besiyerleri ve çözeltiler Laktik asit bakteri kültürlerinin geliştirilmesinde De Man Rogosa Sharpe (MRS) besiyeri kullanılmıştır (MRS, bkz. Çizelge 3.3). Çizelge 3.3. De Man Rogosa Sharpe (MRS) içeriği. Maddeler Miktar (g/l) Maddeler Miktar (g/l) Pepton 10 Sodyum asetat 5 Yeast extract 5 Magnezyum sülfat 0,2 Beef extract 10 Mangenez sülfat 0,05 Glukoz 20 Tween 80 1,08 ml Dipotasyum fosfat 2 Amonyum sitrat 2

66 48 MRS besiyeri için maddeler tartılıp, distile su ile 1000 ml ye tamamlanıp, maddelerin çözülmesi sağlandıktan sonra, ph 6,20 ± 0,02 ye ayarlanmıştır. Besiyeri otoklavda 121 C de 15 dk. steril edilmiştir. Bifidobakteri kültürlerinin geliştirilmesinde, MRS besiyeri % 0,05 g sistein ile modifiye edilerek kullanılmıştır. MRS-s (sisteinli MRS) besiyeri için maddeler tartılıp, distile su ile 1000 ml ye tamamlanıp, maddelerin çözülmesi sağlandıktan sonra ph 6,80 ± 0,02 ye ayarlanmıştır. Besiyeri otoklavda 121 C de 15 dk. steril edilmiştir. Araştırmada kullanılan patojen mikroorganizmaların geliştirilmesinde nutrient broth (Çizelge 3.4) besiyeri kullanılmıştır. Çizelge 3.4. Nutrient broth besiyeri içeriği. Maddeler Miktar (g/l) Pepton 10 Et özütü 10 Sodyum Klorür 5 Nutrient broth besiyeri için maddeler tartılıp, distile su ile 1000 ml ye tamamlanıp, maddelerin çözülmesi sağlandıktan sonra, ph 7,00 ± 0,02 ye ayarlanmıştır. Besiyeri otoklavda 121 C de 15 dk. steril edilmiştir. Çalışmada kullanılan PBS (Phosphate Buffer Saline) tamponu için Çizelge 3.5 de verilen maddeler tartılarak distile su ile 1000 ml ye tamamlanmıştır. ph 6,20 ± 0,02 ye ayarlandıktan sonra, otoklavda 121 C de 15 dk. steril edilmiştir.

67 49 Çizelge 3.5. PBS (Phosphate Buffer Saline) tamponu. Maddeler Miktar (g/l) NaCl 8,0 K2HPO4 1,21 KH2PO4 0, Metot Bakterilerin aktifleştirilmesi ve gelişme ortamları Lactobacillus cinsine ait bakterilerin geliştirilmesinde MRS Broth ve MRS agar besiortamları kullanılmıştır. MRS Broth içinde 37 o C de 24 saat geliştirilen kültürler, en az iki kez aktifleştirildikten sonra çalışmaya alınmıştır. Bifidobakteriler, MRS-s besiyerine % 2 oranında aşılandıktan sonra, anaerobik jar (Oxoid, Anaerobik jar) içerisinde 37 C de ortamın % 10 CO 2 li olmasını sağlayan anaerobik kit (Oxoid, Anaerobik Generating Kit) kullanılarak 48 saat geliştirilmiştir. Biyofilm ve antibiyofilm çalışmalarında kullanılan patojen mikroorganizmalar, nutrient besiyeri içerisinde 37 C de 24 saat geliştirilmiştir. Yapılan tüm çalışmalarda iki kez aktifleştirilmiş kültürler kullanılmıştır Laktik asit bakterilerinden EPS izolasyonu Aktif kültürlerin optik yoğunlukları spektrofotometrede (Digilab Hitachi U-1800) 600 nm dalga boyunda 0,600 ± 0,002 ye ayarlanarak, 800 ml MRS besiyerlerine % 2 oranında aşılanmıştır. 24 saat inkübasyondan sonra, % 4 oranında % 80 lik TCA eklenerek, 2 saat manyetik karıştırıcıda karıştırılmıştır. Karışım rpm de 15 dk. santrüfüj edilmiştir. Santrüfüj sonrası elde edilen filtratlar toplanmış ve sıvının yarısı kontrollü sıcaklık (70-80 C) ve düşük basınçla dönen evaporatörde (BUCHI) uzaklaştırılmıştır (yaklaşık 6 8 saat) (Resim 3.1).

68 50 Resim 3.1. EPS İzolasyonu çalışmasında kullanılan evaporatör Sıvının uzaklaştırılmasından sonra, örnekler oda sıcaklığına gelinceye kadar soğutulmuş ve hacmin iki katı kadar % 96 lık etil alkol eklenerek, 24 saat +4 C de bekletilmiştir. Bu karışım rpm de 15 dk. santrifüj edilmiş ve EPS ler toplanmıştır [Tsuda ve ark., 2008]. Toplanan EPS ler 1 ml steril distile suda çözündükten sonra, liyofilizasyon tüplerine (vial) alınıp, liyofilizatör cihazında liyofilize edilene kadar -80 o C de bekletilmiştir. Saflaştırılmış EPS ler liyofilizatör cihazında, dondurulup kurutularak toz haline getirilmiştir (Resim 3.2). Liyofilizasyondan sonra viallerin içinde bulunan EPS ler çalışmaya alınmıştır.

69 51 Resim 3.2. EPS lerin liyofilize edilmesi için kullanılan liyofilizatör cihazı Laktik asit bakterilerinin EPS üretimlerinin belirlenmesi Kültür ortamında EPS miktarı Aktif kültürlerin optik yoğunlukları spektrofotometrede (Digilab Hitachi U-1800) 600 nm dalga boyunda 0,600 ± 0,002 ye ayarlanarak, MRS besiyerlerine % 2 oranında aşılanmıştır. Bir gün inkübasyon sonunda kültürlerden 1 er ml ependorf tüplerine alınarak benmari usulü ile 15 dk. kaynatılmıştır. Örnekler oda sıcaklığına geldikten sonra, üzerine % 17 oranında % 85 lik TCA çözeltisi eklenerek rpm de 25 dk. santrifüj edilmiştir. Filtratlar yeni ependorf tüplerine alınarak, üzerlerine 1 er ml etanol eklenmiştir. Örnekler 15 dk rpm de santrifüj

70 52 edilmiş ve EPS nin presipite olması sağlanmıştır [Tsuda ve ark., 2008]. Presipite olan örnekler 1 ml distile suda çözüldükten sonra, üretilen EPS miktarının tayini için fenol sülfirik asit metodu uygulanmıştır. Fenol sülfirik asit metodu: Örneklerin üzerine 0,5 ml fenol (Sigma) ve 5 ml sülfirik asit (Merck) eklenerek, oda sıcaklığında 10 dk. bekletildikten sonra, iyice karıştırılmış ve 37 C de dk. bekletilmiştir. Örneklerin optik yoğunlukları, 490 nm dalga boyunda spektrofotometrik olarak ölçülmüştür. Kültürlerin ürettiği EPS miktarlarını hesaplamak için mg/l arasında değişen oranlarda glukoz çözeltisi kullanılarak bir standart (Bkz. Şekil 3.1) çıkarılmış ve bu standarta göre üretilen EPS miktarı mg/l cinsinden belirlenmiştir [Dubois ve ark., 1956]. Şekil 3.1. Glukoz standart eğrisi Liyofilize edilmiş EPS miktarı de anlatıldığı gibi izole edilip, liyofilizasyon işlemi ile toz haline getirilen EPS lerin miktarlarını ölçmek için, her bir vialde bulunan EPS ler 1 ml distile suda

71 53 çözülmüştür. Miktar ölçümü için yukarıda anlatılan fenol-sülfirik asit metodu kullanılmıştır EPS lerin monomer kompozisyonunun araştırılması 6 adet laktobasilden deki gibi izole edilen EPS lerin liyofilizasyon işleminden sonra HPLC (high performance liquid chromatography) analizi yapılmıştır. Kromatografik çalışmada Agilent Technologies 1200 Series HPLC (Agilent, Waldbronn, Germany) sistemi kullanılmıştır (Bkz. Şekil 3.3). Analiz aşağıdaki koşullarda yapılmıştır [Huebner ve ark., 2007]. Sistem Koşulları: Kolon: C 87 Mobil Faz: Su Akış Hızı: 0,6 ml/dk. Kolon Sıcaklığı: 80 o C Dedektör: Refraktif İndeks Dedektörü

72 54 Resim 3.3. EPS lerin monomer kompozisyonunun belirlenmesinde kullanılan HPLC cihazı Filtratların BGD etkisinin belirlenmesi Bu çalışmada, BGD etksinin belirlenebilmesi için 6 farklı laktik asit bakterisi kullanılmıştır (Bkz. Çizelge 3.1). MRS besiyerine 5 (~8,4 log cfu/ml) ve 10 (~10,5 log cfu/ml) McFarland yoğunluğunda ayarlanan aktif laktik asit bakteri kültürleri aşılanmıştır. 24 saat İnkübasyon sonunda, kültürler rpm de 15 dk. santrifüj edilmiştir. Filtrat 0,2 µm por çaplı disposable filtrelerden geçirilerek, içerisinde 5 ml steril MRS-s sıvı besiyeri bulunan deney tüpleri üzerine 3 er ml ilave edilmiştir. Pozitif kontrol için besiyerine filtrat yerine 3 ml steril MRS besiyeri ve 0,5-1 mg

73 55 konsantrasyonlarında inulin eklenmiştir. Kontrol grubundaki tüplere, filtrat yerine 3 ml steril MRS besiyeri aktarılmıştır. Aktif bifidobakteri kültürlerinin optik yoğunlukları, 600 nm dalga boyundaki spektrofotometrede 0,600 e ayarlanmış ve hazırlanan tüplere % 2 oranında aşılanmıştır. Örnekler 37 C de ve % 10 CO 2 li ortamda 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda kültürlerin canlılık değerleri seri dilüsyonlar yapılarak cfu/ml cinsinden hesaplanmıştır EPS lerin bifidobakteriler tarafından fermente edilmesinin belirlenmesi Bifidobakterilerin EPS yi fermente edip edemediklerini araştırmak için, MRS-s besiyerinin karbon kaynağı % 75 oranında azaltılmış ve aynı miktarda liyofilize EPS eklenmiştir. Kontrol gruplarında ise normal MRS-s besiyeri kullanılmıştır. Aktif bifidobakteri kültürlerinin optik yoğunlukları, 600 nm dalga boyundaki spektrofotometrede 0,600 e ayarlanmış ve hazırlanan tüplere % 2 oranında aşılanmıştır. Örnekler 37 C de ve % 10 CO 2 li ortamda 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda kültürlerin canlılık değerleri seri dilüsyonlar yapılarak cfu/ml cinsinden hesaplanmıştır EPS lerin BGD etkisinin belirlenmesi 6 adet laktik asit bakterisinden izole edilen EPS ler 0.5 ve 1 mg tartılarak, 5 ml steril MRS-s besiyerine eklenmiştir. Kontrol grubundaki tüplere sadece 5 ml streil MRSs, pozitif kontrol tüplerine ise 0,5 ve 1 mg inulin eklenmiştir. Aktif bifidobakteri kültürlerinin optik yoğunlukları, 600 nm dalga boyundaki spektrofotometrede 0,600 e ayarlanmış ve hazırlanan tüplere % 2 oranında aşılanmıştır. Örnekler 37 C de ve % 10 CO 2 li ortamda 48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda kültürlerin canlılık değerleri seri dilüsyonlar yapılarak cfu/ml cinsinden hesaplanmıştır.

74 Bazı patojen bakteri suşlarının biyofilm yapma oranlarının belirlenmesi Kongo red yöntemi Kongo red yöntemiyle, 13 patojen bakterinin biyofilm yapma yeteneklerinin fenotip olarak değerlendirilmesinde, Arciola ve arkadaşlarının 2002 de kullandıkları metot uygulanmıştır. Bu yöntemde, Brain Heart İnfusion Broth besiyerine 50 g sakaroz ve 10 g agar ilave edilmiştir. 121 C de 15 dk. steril edilmiş ve sıcaklığı 55 C ye düştüğünde, 8 g/l olarak çözünmüş ve steril edilmiş Kongo red solisyonu besiyerine ilave edilmiştir. 13 patojen bakterinin aktif kültürleriyle, kırmızı agar üzerine çizgi ekim yapılmıştır. 37 C de 24 saat aerobik ortamda inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda, kırmızı agar üzerinde siyah koloni oluşturan bakteriler güçlü (+++), kırmızı koloni oluşturanlar zayıf (+), hem kırmızı hem de siyah koloni oluşturanlar ise orta derecede biyofilm pozitif (++) olarak değerlendirilmiştir. Mikro plak yöntemi Bu çalışmada, 13 patojen bakterinin biyofilm yapma oranlarının belirlenebilmesi için Sayem ve arkadaşlarının 2011 de kullandığı metot, bazı modifikasyonlar yapılarak uygulanmıştır. Patojen kültürlerin optik yoğunlukları spektrofotometrede (Digilab Hitachi U-1800) 600 nm dalga boyunda 0,05 e ayarlanıp, 96 kuyulu plağa 200 µl er eklenmiştir. Kontrol grubu olarak steril nutrient broth besiyeri kullanılmıştır. Plaklar statik bir ortamda inkübasyona bırakılmıştır. Biyofilm oluşumunu tespit edebilmek için, inkübasyon sonrasında kuyucuklardaki sıvı faz uzaklaştırılmış ve zayıf bağlanmış bakterileri uzaklaştırmak için kuyular steril distile su ile 5 kez yıkanmıştır. Plak 45 dk. havada kurumaya bırakıldıktan sonra, her bir kuyuya 200 µl %1 lik kristal viyole solüsyonu eklenmiş ve 45 dk. boyunca boyanması sağlanmıştır. Boyama sonrasında, boya kuyulardan atılmış ve kuyular 5 kez steril distile su ile yıkanmıştır. Kuyuların boyayı bırakması için, kuyulara 200 µl etanol-aseton solüsyonu (4:1) eklenmiş ve 15 dk. bekletilmiştir. Bu süre sonunda, plaklar mikroplak okuyucuda (Epoch, Biotek) (Bkz. Resim 3.5) 570 nm de okutulmuştur. Bakterilere ait OD değerlerinden kontrol grubunun OD değeri çıkartılarak biyofilm

75 57 oluşumu belirlenmiştir. Bakterilerin biyofilm yetenekleri kendi aralarında kuvvetli, orta düzeyde ve zayıf biyofilm oluşturanlar olarak gruplandırılmıştır. Resim 3.4. Biyofilm çalışmalarında kullanılan mikroplak okuyucu Laktik asit bakteri kültürlerinin antibiyofilm etkisinin belirlenmesi Antibiyofilm madde olarak en yüksek EPS üretimine sahip olan 3 laktik asit bakterisinin (Bkz. Çizelge 3.6) filtratları ve liyofilize edilen EPS leri kullanılmıştır. Mikroplak yöntemine göre biyofilm yapma oranları belirlenen patojen bakteri suşlarının içinde en yüksek biyofilm yapma yeteneğine sahip 4 suş (bkz. Çizelge 3.6) antibiyofilm deneyinde kullanılmıştır.

76 58 Çizelge 3.6. Antibiyofilm deneyinde kullanılan laktik asit bakterileri ve patojen bakteriler Laktik asit bakterileri Patojen bakteriler L. fermentum LB69 L.monocytogenes ATCC-7644 L. rhamnosus GD11 E. fecalis ATCC L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3 B.cereus RSKK-863 P. aeruginosa ATCC Laktik asit bakterilerinin kültür filtratları 96 kuyulu plaklara 10, 20 ve 40 µl aktarılmıştır. Bunların üzerlerine aktif kültürlerinin optik yoğunlukları spektrofotometrede (Digilab Hitachi U-1800) 600 nm dalga boyunda 0,05 e ayarlanan patojen bakteri kültürleri sırasıyla 190, 180 ve 160 µl ilave edilmiştir. Kontrol gruplarında 10, 20 ve 40 µl MRS besiyeri kullanılmıştır. Laktik asit bakterinden izole edilen liyofilize EPS ler 0.1 ve 1 mg tartılarak 1 ml steril distile su içerisinde çözülmüştür. 96 kuyulu plaklara 20 µl aktarılmıştır ve üzerlerine aktif kültürlerinin optik yoğunlukları spektrofotometrede (Digilab Hitachi U-1800) 600 nm dalga boyunda 0,05 e ayarlanan patojen bakteri kültürleri 180 er µl ilave edilmiştir. Kontrol gruplarında 20 şer µl steril distile su kullanılmıştır. Yukarıdaki gibi hazırlanan deney ve kontrol grupları 24 saat statik bir ortamda inkübasyona bırakılmıştır. Biyofilm oluşumunun, planktonik gelişim ile korelasyonunu hesaplayabilmek için, kuyulardaki planktonik hücre fraksiyonu yeni bir plak içerisine aktarılıp, mikroplak okuyucuda 570 nm de ölçüm yapılmıştır. Biyofilm oluşumunu tespit edebilmek için de anlatılan yöntem kullanılmıştır. Biyofilm inhibisyonunun yüzde oranını hesaplamak için aşağıdaki formül kullanılmıştır.

77 59 % Biyofilm İnhibisyonu = K = D = B d : Deney gruplarının biyofilm OD değeri (570 nm) B k : Kontrol gruplarının biyofilmi OD değeri (570 nm) P d : Deney gruplarının planktonik OD değeri (570 nm) P k : Kontrol gruplarının planktonik OD değeri (570 nm) İstatistiksel Analizler İstatistiksel analizlerde SPSS Inc. Software (16.0 Versiyonu; SPSS Inc., Chicago, IL) kullanılmıştır. Pearson un korelasyonuna göre, suşların EPS üretimi filtratların BGD aktivitesi, EPS nin mannoz miktarı - EPS nin BGD aktivitesi, EPS nin mannoz miktarı filtratların antibiyofilm aktivitesi, EPS nin mannoz miktarı - EPS nin antibiyofilm aktivitesi, filtratların BGD aktivitesi EPS lerin BGD aktivitesi, filtratların antibiyofilm aktivitesi EPS lerin antibiyofilm aktivitesi arasında korelasyon olup olmadığı incelenmiştir. Bu programda, P değerinin 0,05 den küçük olması değerler arasında anlamlı ve doğrusal bir korelasyon olduğunu, 0,01 den küçük olması yüksek derecede bir korelasyon olduğunu, 0,05 ten büyük olması ise anlamlı ve doğrusal bir korelasyon olmadığını göstermektedir. Örneklerin normal bir dağılıma sahip olup olmadığı bu analiz öncesinde tek örnekli Kolmogorov-Smirnov testi ile belirlenmiştir. Tüm çalışmalar, her çalışma için paralel sayısı değişmekle birlikte, üçer tekrarlı olarak yapılmıştır. Bu çalışmalardan elde edilen veriler bu tekrarların ortalaması ± standart sapma (SD) şeklinde verilmiştir.

78 60 4. DENEYSEL BULGULAR 4.1. Çalışmada Kullanılan Bakteriler Bu çalışmada, Gazi Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoteknoloji Laboratuvarı kültür koleksiyonu içerisinde bulunan, gıda veya yeni doğan gaitasından izole edilmiş 6 adet laktobasillus, 2 adet bifidobakteri kültürü ve 13 adet patojen bakteri kültürü kullanılmıştır (Bkz. Çizelge 3.1 ve 3.2). Bu bakterilerin fizyolojik testleri, biyokimyasal testleri (API 20A, 20E ve 50CH kitleri ile) ve 16S rdna dizilerine göre moleküler tanımlamaları farklı çalışmalar kapsamında yapılmıştır. Bu nedenle, suşların tanımlama sonuçları bu tezde verilmemiştir. Bu çalışma kapsamında kullanılan tüm bakteri suşlarının, kontrolleri mikroskobik inceleme yapıldıktan sonra, çalışmaya alınmıştır. Çalışmada kullanılan, laktik asit bakterilerine ve bifidobakterilere ait bazı suşların gram boyama sonucunda ışık mikroskobundaki görüntüleri Şekil 4.1 de gösterilmiştir.

79 61 Şekil 4.1. Çalışmada kullanılan bazı bakterilerin ışık mikroskobundaki görüntüleri. (a) Lactobacillus fermentum LB69. (b) Bifidobacterium breve BASO Kültürlerin Ekzopolisakkarit (EPS) Üretimleri Çalışmada kullanılan suşların kültür ortamındaki EPS üretimleri de anlatıldığı şekilde belirlenmiştir. Buna göre tüm suşların ürettiği EPS miktarları Çizelge 4.1 de gösterilmiştir. EPS üretim kapasitesi yüksek olan suşlar GD11 (289 1 mg/l), LB69 (248 2 mg/l), B3 (211 3 mg/l), GD2 ( mg/l) iken, düşük EPS üreten suşlar; A12 (43 1 mg/l) ve LB8 (37 1 mg/l) olarak belirlenmiştir. Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus B3 (211 3 mg/l) suşunda yüksek EPS üretimi görülürken, Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus A12 (43 1 mg/l) suşunda düşük EPS üretimi görülmesi, EPS üretiminin aynı tür içerisinde suşlara göre değişebildiğini ve EPS üretimi yüksek olan bakterilere karar verebilmek için türlere göre değil suşlara göre bir seçim yapılmasının gerektiğini göstermektedir. Ayrıca, EPS üretim yeteneğinin izolasyon kaynağına göre değişiklik göstermediği dikkat çekmektedir. Örneğin, gaita kaynaklı GD11 (289 1 mg/l) suşunda ve gıda kaynaklı B3 (211 3 mg/l) suşunda yüksek EPS üretim kapasitesi görülürken, gaita kaynaklı LB8 (37 1 mg/l) suşunda ve gıda kaynaklı A12 (43 1 mg/l) suşunda

80 62 düşük EPS üretim kapasitesi görülmüştür. Çalışmada, laktobasillerden izole edilen EPS lerin liyoflizasyon sonrasında da EPS miktarları belirlenmiştir (Çizelge 4.1). Sonuçlara göre, suşların kültür ortamında belirlenen EPS miktarı ile liyofilizasyon sonrası EPS miktarları paralellik göstermiştir ve tüm suşlarda liyofilizasyon sonrası EPS miktarının daha fazla olduğu dikkat çekmektedir. Bunun nedeni, liyofilizasyonda yüksek hacimde kültürlerin kullanılması ve yüksek hacimde EPS nin kısmi olarak saflaştırılarak elde edilmesidir. Çizelge 4.1. Liyofilizasyon öncesi ve sonrasında suşların EPS miktarları Suşlar Kaynak EPS 1 (mg / L) EPS 2 (mg / L) L. delbrueckii ssp. bulgaricus B3 Gıda L. delbrueckii ssp. bulgaricus A12 Gıda L. fermentum LB69 Gaita L. paracasei LB8 Gaita L. plantarum GD2 Gaita L. rhamnosus GD11 Gaita :Kültürlerin inkübasyon sonrası EPS üretim miktarı 2 : Saflaştırılmış ve liyofilize edilmiş toz halindeki EPS nin miktarı 4.3. EPS lerin Monomer Kompozisyonunun Araştırılması Laktik asit bakterilerinden izole edilen EPS nin monosakkarit kompozisyonu ve oranları de anlatıldığı şekilde belirlenmiş ve sonuçlar Çizelge 4.2 de gösterilmiştir. Tüm suşların EPS lerinin mannoz ve glukozdan oluştuğu ve ağırlıkla mannoz içerdikleri belirlenmiştir. En yüksek mannoz oranına sahip suşlar LB69 (% 96) ve GD11 (% 95) iken, en düşük mannoz içeren suşlar ise A12 (% 83) ve GD2 ( % 88) olarak tespit edilmiştir.

81 63 Çizelge 4.2. Liyofilize edilmiş EPS lerin monosakkarit kompozisyonları ve yüzde oranları. EPS leri Test Edilen Suşlar Yüzde Oran (%) Mannoz Glukoz L. delbrueckii ssp. bulgaricus B L. delbrueckii ssp. bulgaricus A L. fermentum LB L. casei LB L. plantarum GD L. rhamnosus GD Kültür Filtratlarının Bifidobakterilerin Gelişimini Düzenleyici (BGD) Etkisinin Belirlenmesi Laktik asit bakterisi kültür filtratlarının bifidobakterilerin gelişimini düzenleyici etkisinin araştırılması için de belirtilen yöntem kullanılmıştır. Filtratların B. breve A28 ve BASO1 suşlarına gösterdikleri BGD etkisi Çizelge 4.3 te gösterilmiştir. Bu çalışmada test bakterisi olarak kullanılan B. breve A28 ve BASO1 suşlarının aynı türe ait olması nedeniyle, ilave edilen filtratlar suşların gelişimi üzerinde paralel BGD etkisi göstermiştir. Tüm suşların kültür filtratlarının, bifidobakterilerin gelişimini düzenlediğini belirtmekle birlikte, en yüksek BGD aktivitesi GD11 suşunun filtratında gözlenmiştir. GD11 suşunun (10 McFarland ~10,5 log cfu/ml) kültür filtratı ilave edildiğinde, B. breve A28 suşunun canlılığı 8,26 log cfu/ml den, 10,56 log cfu/ml ye artış göstermiştir. Aynı şekilde, B. breve BASO1 suşunun canlılığı 8,46 log cfu/ml den, 10,75 log cfu/ml ye artış göstermiştir. Bu artışın inulin ilavesine göre daha fazla olduğu, inulin ilave edilmiş B. breve A28 suşunda, canlılığın 8,26 log cfu/ml den, 8,94 log cfu/ml ye, B. breve BASO1 suşunda ise 8,46 log cfu/ml den, 9,07 log cfu/ml ye arttığı görülmüştür. GD11 suşunun filtratı inuline göre % 20 daha fazla BGD aktivitesi göstermiştir. Eklenen filtratların, bakteri yoğunluklarının BGD aktivitesini etkilediği görülmektedir. 10 McFarland (~10,5 log cfu/ml) yoğunluğundaki bakterilerden elde

82 64 edilen filtratların 5 McFarlanda (~8,4 log cfu/ml) göre BGD etkinliklerinin daha fazla olduğu tespit edilmiştir. Aynı zamanda, EPS üretimi yüksek olan suşların BGD etkisinin diğerlerine göre yüksek olması dikkat çekicidir. Suşların EPS üretim miktarları ile filtratların BGD aktivitesi arasında pozitif bir korelasyon bulunmuştur (p<0,05). Örneğin, BASO1 suşu üzerinde, GD11 suşunun (289 ± 2) filtratı % 27 BGD aktivitesi gösterirken, EPS üretimi en düşük olan LB8 suşunun (37 ± 1) filtratı % 13 BGD etkisi göstermiştir. Çizelge 4.3. Laktobasilluslardan elde edilen filtratların B. breve BASO1 ve A28 suşlarının gelişimini düzenleyici etkisi. Filtratı kullanılan suşlar BASO1 (log cfu/ml) A28 (log cfu/ml) A: MRS-s Besiyerine 5 McFarland (~8,4 log cfu/ml) yoğunluğunda ayarlanmış suşlardan elde edilen filtrat eklenmiştir. B: MRS-s Besiyerine 10 McFarland (~10,5 log cfu/ml) yoğunluğunda ayarlanmış suşlardan elde edilen filtrat eklenmiştir. 1 : Pozitif kontrol (MRS-s besiyerine filtrat yerine 0,5 ve 1 mg inulin ve steril MRS besiyeri eklenmiştir.) A B A B B3 9,00 1,28 10,15 1,07 8,76 1,28 9,82 1,07 A12 8,90 1,61 9,74 1,09 8,50 1, ,25 LB69 9,12 1,14 10,50 2,18 8,80 1,43 10,00 2,09 LB8 8,80 1,05 9,61 1,45 8,48 1,27 8,96 1,05 GD2 8,95 1,19 10,05 1,45 8,56 1,21 9,50 1,12 GD11 9,15 1,25 10,75 2,26 8,90 1,17 10,56 1,52 İnülin 1 9,07 1,35 9,07 1,35 8,94 1,15 8,94 1,15 Kontrol 2 8,46 1,24 8,46 1,16 8,26 1,14 8,26 1,61 2 : Kontrol grubu (MRS-s besiyerine sadece steril MRS besiyeri eklenmiştir.

83 EPS lerin Bifidobakteriler Tarafından Fermente Edilebilmelerinin Belirlenmesi EPS nin BGD etkisi test edilmeden önce, de anlatılan yönteme göre bifidobakterilerin EPS yi fermente edip edemedikleri araştırılmıştır. Karbon kaynağı % 75 oranında azaltılan MRS-s besiyerine aynı oranda EPS eklenmiş ve bifidobakteriler % 2 oranında aşılanmıştır. 48 saat inkübasyon sonrasında, kültürlerin canlılık değerleri seri dilüsyonlar yapılarak cfu/ml cinsinden hesaplanmıştır. Sonuçlar Çizelge 4.4 de gösterilmiştir. Sonuçlara göre, karbon kaynağı % 75 oranında azaltılıp, yerine liyofilize EPS eklenen MRS-s besiyerinde bifidobakterilerin gelişiminde bir miktar düşüş görülsede, MRS-s besiyerindeki gelişime yakın bir şekilde gelişebildikleri gözlenmiştir. Karbon kaynağı yerine EPS ilave edilmiş besi ortamında, B. breve A28 suşunun 8,9 ± 1,6 log cfu/ml ye kadar ve B. breve BASO1 suşunun 9,0 ± 2,0 log cfu/ml ye kadar geliştiği tespit edilmiştir. Bu sonuçlar, bifidobakterilerin EPS yi başarılı bir şekilde fermente edebildiklerini göstermektedir. Çizelge 4.4. B. breve A28 ve BASO1 suşlarının EPS yi fermente edebilme kapasiteleri. Suşlar Canlılık (log cfu/ml) EPS 1 Kontrol 2 B. breve A28 8,9 ± 1,6 9,4 ± 2,0 B. breve BASO1 9,0 ± 2,0 9,2 ± 1,7 1 : Karbon kaynağı % 75 oranında azaltılmış MRS-s besiyerine liyofilize EPS eklenmiş besi ortamında gelişen bakteri canlılığı. 2 : MRS-s besi ortamında gelişen bakteri canlılığı.

84 EPS lerin Bifidobakterilerin Gelişimini Düzenleyici (BGD) Etkisinin Belirlenmesi Laktik asit bakterilerinden saflaştırılarak liyofilize edilmiş EPS ler ile bifidobakterilerin gelişimini düzenleyici etkisinin araştırılması için de belirtilen yöntem kullanılmıştır. Bu çalışmada test bakterisi olarak B. breve A28 ve B. breve BASO1 suşları kullanılmış, laktik asit bakterilerinden saflaştırılmış liyofilize EPS ler 0,5 ve 1 mg/ml olacak şekilde kültür ortamına ilave edilmiştir. EPS lerin B. breve A28 ve B. breve BASO1 suşuna gösterdikleri etki Çizelge 4.5 de verilen tabloda gösterilmiştir. En yüksek BGD aktivitesi gösteren GD11 ve LB69 suşları olmuştur. BGD etkisi ise en fazla B. breve BASO1 suşu üzerinde tespit edilmiştir. LB69 suşundan izole edilen EPS, besiyerine 0,5 mg/ml konsantrasyonunda eklendiğinde B. breve BASO1 suşunun canlılığını 9,31 log cfu/ml den, 9,91 log cfu/ml ye, 1 mg/ ml eklendiğinde ise 9,31 log cfu/ml den, 10,70 log cfu/ml ye yükseltmiştir. Aynı şekilde GD11 suşundan izole edilen liyofilize EPS BASO1 suşunun canlılığını 0,5 mg/ml ilave edildiğinde 9,31 cfu/ml den, 10,10 log cfu/ml ye, 1 mg/ml ilave edildiğinde ise 9,31 cfu/ml den, 10,59 log cfu/ml ye yükselttiği belirlenmiştir. B. breve A28 suşu üzerinde en yüksek BGD etkisini LB8 suşu (8,48 log cfu/ml den 9,42 log cfu/ml ye) göstermiştir. BASO1 suşu üzerinde tüm suşların EPS leri inulinden daha yüksek BGD etkisi göstermişler ve LB69 suşunun BGD etkisinin inulinden % 19 daha fazla olduğu belirlenmiştir. A28 suşunun üzerinde ise 3 suşun (A12, GD2 ve B3) EPS si inulinden daha düşük BGD aktivitesi göstermiştir. Sonuçlara göre, EPS lerin 1 mg/ml konsatrasyonlarının etkisinin 0,5 mg/ml konsatrasyonlarına göre yüksek olduğu tespit edilmiştir. Liyofilize EPS lerin içerdiği mannoz miktarı ile EPS nin BGD aktivitesi arasında pozitif bir korelasyon bulunmuştur (p<0,05). BGD aktivitesi, mannoz oranı yüksek olan LB69 (% 96) suşunda % 15 iken, mannoz oranı düşük olan A12 (% 83) suşunda % 7 oranındadır.

85 67 Çizelge 4.5. Laktobasilluslardan izole edilen, liyofilize EPS lerin B. breve BASO1 ve A28 suşlarını geliştirici etkisi. EPS si kullanılan suşlar BASO1 (log cfu/ml) A28 (log cfu/ml) 0,5 1 mg/ml 0,5 mg/ml 1 mg/ml mg/ml B3 9,60 ± 1,50 10,10 ± 1,78 9,13 ± 1,04 9,05 ± 1,08 A12 9,60 ± 1,84 10,00 ± 1,10 8,79 ± 1,09 8,92 ± 1,45 LB69 9,91 ± 1,20 10,70 ± 1,02 9,13 ± 1,97 9,19 ± 1,07 LB8 9,79 ± 1,89 10,50 ± 1,16 9,11 ± 1,05 9,42 ± 1,09 GD2 9,69 ± 1,20 10,35 ± 1,84 8,79 ± 1,20 8,91 ± 1,20 GD11 10,10 ±1,05 10,59 ± 1,89 8,80 ± 1,35 9,22 ± 1,25 İnülin 1 9,49 ± 1,55 9,98 ± 1,55 8,96 ± 1,04 9,19 ± 1,04 Kontrol 2 9,31 ± 1,35 9,31 ± 1,35 8,48 ± 1,35 8,48 ± 1,35 1 : Pozitif kontrol için EPS yerine 0,5 ve 1 mg/ml inulin eklenmiştir. 2 : Kontrol grubuna liyofilize EPS eklenmemiştir Bazı Patojen Bakteri Suşlarının Biyofilm Yapma Oranlarının Belirlenmesi Çizelge 3.2 de verilen 13 adet farklı cinse ait patojen suşun biyofilm yapma kapasitelerinin belirlenmesi için, kongo red ve mikro plak yöntemi olmak üzere iki farklı yöntem esas alınmıştır Kongo red yöntemi Kongo red yöntemi ile biyofilm oluşumunu belirlemek için deki yöntem kullanılmıştır. Biyofilm oluşumunda, bakteriler jelsi bir tabaka meydana getirmek için ekzopolisakkaritler üretirler. Bu yöntemde, kullanılan kongo red boyası bu polisakkaritler ile doğrudan etkileşime girerek, renkli kompleksler oluşturur. Buna

86 68 göre, siyah renk oluşturan bakteriler güçlü (+++), kırmızı renk oluşturanlar zayıf (+), hem kırmızı hem de siyah renk oluşturanlar ise orta derecede biyofilm pozitif (++) olarak değerlendirilmiştir. Resim 4.1 de kongo red ilave edilmiş, Brain Heart besi ortamındaki koloni morfolojileri gösterilmiştir. Bu değerlendirmeye göre elde edilen sonuçlar Çizelge 4.6 da gösterilmiştir. Sonuçlara göre, L. monocytogenes ATCC- 7644, E. fecalis ATCC 25175, B. cereus RSKK-863, S. aureus EB-1 ve S. aureus EB-12 suşlarında güçlü biyofilm oluşumu (+++), E. coli 0157:H7, S. aureus ATCC ve S. aureus ATCC suşlarında orta düzeyde biyofilm oluşumu (++) görülürken, S. aureus EB36, E. coli ATCC-35218, P. aeruginosa ATCC-72853, S. aureus EB-18 ve S. typhimurium MU80 suşlarında ise zayıf biyofilm oluşumu (+) belirlenmiştir. Resim 4.1. Kongo red deneyinde gözlenen koloni morfolojileri. (a)- B. cereus RSKK-863 suşunda görülen siyah koloniler (güçlü biyofilm oluşumu: +++); (b)- E. coli ATTC suşunda görülen kırmızı koloniler (zayıf biyofilm oluşumu: +)

87 69 Çizelge 4.6. Bazı patojen bakterilerin kongo red yöntemi ile bulunan biyofilm yapma oranları Suşlar Biyofilm L. monocytogenes ATCC E. fecalis ATCC B. cereus RSKK S. aureus EB S. aureus EB E. coli 0157:H7 ++ S. aureus ATCC S. aureus ATCC S. aureus EB36 + E. coli ATCC P. aeruginosa ATCC S. aureus EB-18 + S. typhimurium MU : Güçlü biyofilm oluşumu. ++ : Orta düzeyde biyofilm oluşumu. + : Zayıf biyofilm oluşumu Mikro plak yöntemi Mikro plak yönteminin prensibi, spektrofotometrik olarak yoğunluğun ölçülmesine dayanır. 96 kuyucuklu plaklarda geliştirilen bakteriler, kuyucuk içersinde biyofilm oluşturarak tutunur. Planktonik kısım kuyucuklardan çıkarılıp yıkama işlemi yapıldığında kuyucuklarda sadece biyofilm yapan bakteri hücreleri kalır. Kristal viyole ile boyama işlemi sırasında biyofilmde yaşayan bakteri hücreleri boyayı alır. Boyama sonrasında yıkama yapıldığında, boya plaktan atılır ve sadece bakteri hücrelerindeki boya kalır. Etanol-aseton solüsyonu hücrelerin içindeki boyanın dışarı salınmasını sağlar. Böylece biyofilmdeki hücre yoğunluğuna göre mavi tonlarında renkler oluşur. Bu renkler mikroplak okuyucuda 570 nm de okutulup, OD değerleri 4,000-2,000 arasında olanlar kuvvetli, 1,999-1,000 arasında olanlar orta ve 0,999-0 arasında olanlar zayıf biyofilm oluşturma kapasitesi olarak değerlendirilmiştir. Şekil 4.2 de mikroplak okuyucuda okunmaya hazır bir mikro plak gösterilmiştir. Bu plakta, biyofilm oluşumuna bağlı olarak gözlenen renk değişimleri görülmektedir. Sol alt bölümdeki kuyucuklarda koyu mavi tonları yüksek, sol üstte menekşe tonları

88 70 orta, sağ bölümdeki açık mavi-şeffaf renkler ise zayıf biyofilm oluşumundan kaynaklanmaktadır. Resim 4.2. Mikroplak okuyucuda okunmaya hazır bir mikroplak. Elde edilen sonuçlar Çizelge 4.7 de tablo olarak verilmiştir. Bu yönteme göre B. cereus RSKK-863, L. monocytogenes ATCC-7644, E. fecalis ATCC ve P. aeruginosa ATCC suşlarının güçlü (+++); E. coli 0157:H7 ve E. coli ATCC suşlarının orta (++); S. aureus EB-1, S. aureus ATCC-25923, S. aureus EB- 12, S. aureus ATCC-2392, S. typhimurium BAST-01, S. aureus EB-18 ve S. aureus EB36 suşlarının ise zayıf (+) derecede biyofilm yapma kapasitelerinin olduğu tespit edilmiştir.