KARBOHİDRAT, LİPİD ve PROTEİN TAYİNİ

Transkript

1 BİYOKİMYA BİY303A Prof. Dr. Figen Erkoç ve Doç. Dr. A. Eser Elçin KARBOHİDRAT, LİPİD ve PROTEİN TAYİNİ MATERYAL: Çeşme suyu - KONTROL Kuru bakla veya kuru fasulye Kuru soğan Üzüm suyu Portakal suyu Kuru üzüm Et suyu Süt Yapay (suni) tatlandırıcı Yer elması Hurma parçaları Mısır şurubu Nişasta çözeltisi (mısır nişastası ile hazırlanabilir) Yumurta akı Ceviz içi Fındık içi Yer fıstığı içi Bal Ayçiçek yağı Zeytinyağı Glukoz, sükroz, laktoz, nişasta (%2 ve %1), glikojen, selüloz un %1 lik test çözeltileri İyot çözeltisi veya Lugol reaktifi Sudan III Nitrik asit Bakır sülfat çözeltisi (%0.5 lik) çözeltisi veya Fehling A+ Fehling B Sodyum hidroksit Seliwanoff reaktifi (fruktoz ayıracı-indikatör) Konsantre H 2 SO 4 5 N NaOH Konsantre HNO 3 HCl %10 luk KOH çözeltisi %0.5 lik CuSO 4 Biüret Reaktifi Süzgeç Deney tüpleri Dereceli silindir Erlenmayer Hassas terazi Sıcak su banyosu Bek alevi Pens Havan Pipet 1

2 Monosakkarit ve disakkaritlerin tespiti: Deney tüplerine soğan, hurma, yerelması gibi meyveleri kaynatarak elde edilen sular, üzüm suyu, suni tatlandırıcı, mısır şurubu, bal koyunuz. %1 lik bilinmeyen karbohidrat çözeltisi hazırlamak için malzemenizin 0.25 g ını tartıp 25 ml distile suda çözünüz. Her örnekten birer mililitre olmasına özen gösteriniz. Her bir tüpe 2 ml olacak şekilde çözeltisi (veya fehling A + fehling B) ilave ediniz. Tüpleri sıcak su banyosunda renk değişimi gözlenene kadar ısıtınız. Başka bir tüpe aynı miktarlarda musluk suyu ve çözeltisi koyarak kontrol grubu olarak kullanınız. Not: Yer elmasında inülin vardır. İnülin in monomeri furuktoz dur. Monosakkaritlerin tespiti: Bir miktar kuru üzümü kaynatarak süzünüz. Bu süzüntüden iki adet deney tüpüne 5 er ml ilave ediniz. Tüplerden birine 5 ml ayıracı diğerine de 5 ml Seliwanoff ayıracı ekleyiniz. Kaynar su banyosunda 1-2 dak. bekletiniz. Seliwanoff ayıracı eklenilen tüpte renk kırmızıdan kiremit rengine dönüşür. Disakkaritlerin aranması: Bir deney tüpüne 5 ml şeker çözeltisi koyunuz ve üzerine bir iki damla %25 lik HCl ilave ederek hidroliz işlemini tamamlayınız. Nötralleştirme reaksiyonu için ise bir iki damla 1 M NaOH çözeltisi damlatınız. Bu karışımı iki deney tüpüne ayırarak birine Seliwanoff çözeltisi diğerine ise çözeltisi damlatınız. Polisakkaritlerin aranması: Soyulmuş bir patatesi rendeleyiniz ve bunu bir miktar suyla ıslatınız. Bu sudan bir miktar alarak deney tüpüne koyunuz. Tüpte mavi bir renk oluşana kadar Lugol çözeltisi ilave ediniz. Nişasta tanelerinin gösterilişi: Bir lam üzerine bir damla su damlatınız ve bunun üzerine bistüri ile patatesten aldığınız kazıntıyı ekleyiniz. Üzerine lameli kapatıp mikroskopta değişik büyütmelerde inceleyiniz. Daha sonra bu preparatın bir ucundan iyot çözeltisi ekleyiniz. Preparatın diğer ucundan kurutma kâğıdıyla suyu çekerek iyot çözeltisinin nişasta tanelerine ulaşmasını sağlayınız. Bir iki dakika bekledikten sonra meydana gelen değişikleri mikroskopta tekrar inceleyiniz. Bu deneyi buğday ve fasulye taneleriyle de aynı yöntem ile yapabilirsiniz. Nişasta tayininin yapılışı: Bir deney tüpüne bir miktar nişasta çözeltisi koyunuz ve üzerine aynı miktarda iyot çözeltisi ekleyiniz. 2

3 Bir süre bekleyerek tüpte meydana gelen değişikleri gözlemleyiniz. Bu tüpten alınan örnekten bir preparat hazırlayarak mikroskopta değişik büyütmelerde inceleyiniz. Tablo 4.2.1: Deneyde Kullanılan Maddeler ve İndikatörler (Ayıraçlar) MADDELER İNDİKATÖRLER SONUÇ Soğan Hurma Yer elması Üzüm suyu Suni tatlandırıcı Çeşme suyu- KONTROL Bal Mısır şurubu Kuru üzüm Kuru üzüm Seliwanoff Şeker çözeltisi HCl + NaOH + Şeker çözeltisi Patates Nişasta çözeltisi HCl + NaOH + Seliwanoff Lügol İyot çözeltisi Selülozun tespiti: 500 ml lik bir erlene 50 ml konsantre H 2 SO 4 koyunuz. Bunun içine 2 g ham pamuk diderek asit içerisinde pamuğun erimesi sağlayınız. Başka bir erlene 150 ml musluk suyu koyunuz. Asitle hidroliz edilmiş selülozu sulandırmak için pamuklu çözeltiyi ikinci erlendeki suya damla damla olacak şekilde ilave ediniz. Bu işlem sırasında içine asit ilave edilen erleni musluk altında çeşme suyuna tutarak soğutunuz. İşlem bittikten sonra bu erlenden 10 ml alarak başka bir erlene koyunuz ve kaynatarak hidroliz işlemini tamamlayınız. İndikatör olarak üzerine 5 N NaOH ilave ederek nötralize ediniz (glukoz bazik ortamda reaksiyona girer). Bu karışımı ikiye ayırarak ayrı tüplere aktarınız. Tüplerin birine Fehling diğerine Seliwanoff reaktifi ilâve ediniz. Bir süre bekleyerek değişimi gözleyiniz. Tablo 4.2.2: Fehling ve Seliwanoff İndikatörleri Eklendiğinde Gözlenecek Değişim Seliwanoff Fehling Protein varlığının gösterilişi: Bir miktar et alınız ve küçük parçalara bölerek kaynatınız. Elde edilen et suyunu bir tüpe alınız. Diğer yandan bir yumurta akını sulandırarak elde ettiğiniz çözeltiyi başka bir tüpe alınız. Her iki tüpe de 2 şer ml olacak şekilde Biüret çözeltisi ekleyiniz. Karbohidratlara özgü reaktifi ile de test ederek sonucunu değerlendiriniz. Tüpleri sıcak su banyosunda hafifçe sallayarak ısıtınız. Meydana gelen menekşe rengi (pembelila) protein varlığının göstergesidir. Sütte protein aranması: 5 ml sütü deney tüpüne koyunuz. Üzerine %10 luk KOH çözeltisinden 5 ml ilâve ediniz. Bunun üzerine de % 0.5 lik bakır sülfat (CuSO 4 ) çözeltisini damla damla ilâve ediniz. 3

4 Tüpte leylak renginin oluşması protein varlığının göstergesidir. Fasulyede protein aranması: Kuru fasulyelerin tohum kabuklarını çıkartınız. Sonra boyuna olacak şekilde ortadan ikiye ayırınız. Bunları bir petri kabına alarak üzerlerine birer damla konsantre nitrik asit damlatınız ve bir süre bekleyiniz. Değişiklik meydana gelmemiş ise petri kutusunu su banyosuna alarak tohumları hafifçe ısıtınız. Böylece değişikliği 4-6 dak. içinde gözlemlemiş olacaksınız. Sarı rengin oluşumu protein varlığının göstergesidir. Tablo 4.2.3: Deneyde Kullanılan Maddeler ve İndikatörler MADDELER İNDİKATÖRLER SONUÇ Et suyu Biüret istenirse Yumurta akı Biüret istenirse Süt KOH + Cu 2 SO 4 Kuru fasulye HNO 3 Sudan Kırmızısı (Sudan III boyası ile) testi ile lipidlerin (yağlar) kalitatif gösterilişi: Bir miktar susam yağı, zeytin yağı, kanola yağı, margarin, tereyağ, içyağı, yerfıstığı, ceviz veya fındık yağı. Sıvı yağların 2 ml sini deney tüpüne koyunuz, üzerine 2 ml distile su ekleyiniz. Karışıma 2-5 damla Sudan III boyası damlatınız. Karıştırınız, yağ moleküllerinin boya tarafından turuncu renge boyandığını gözlemleyiniz. Değişik yağ oranı içeren süt ile deneyi ayrı ayrı tüplerde yapınız. Katı yağlar için- ceviz içi, fıstık içi veya fındık içini havanda iyice eziniz. Elde edilen maddeyi bir miktar suda süspanse ediniz. Bu süspansiyonu huniye yerleştirdiğiniz 4 kat gazlı bezden veya iki kat amerikan bezinden süzünüz ve süzüntüyü belli bir miktar olarak deney tüpüne alınız. Üzerine bir-iki damla sudan III damlatınız ve bir süre sıcak su banyosunda ısıtınız. Bu süre sonunda tüpün en üst tabakasında turuncu rengin oluşumu yağ moleküllerinin varlığının göstergesidir. Tablo 4.2.4: Deneyde Kullanılan Maddeler ve İndikatörü MADDELER İNDİKATÖR SONUÇ Ceviz içi / Fındık içi /Yer fıstığı içi Sudan III İndikatörler (Ayıraçlar): Belirli şartlarda belirli maddelerle reaksiyona girerek uğradığı değişiklikle o maddenin varlığını gösteren maddelere ayıraç veya indikatör denir. Fehling Reaktifi Alman kimyager Herman von Fehling tarafından geliştirilmiştir. Bir organik maddenin redüktör (kimyasal bir reaksiyonda başka maddelere elektron veren madde) olup olmadığını anlamak için kullanılır. Redükleyici şekerleri (glukoz gibi monosakkaritler ve maltoz, laktoz gibi disakkaritler) ve aldehitleri tayin eder. Deney çözeltisi taze hazırlanmış bakır (II) sülfat, sodyum hidroksit ve sodyum potasyum tartarat içeren çözelti ile muamele edilirse, redükleyici şeker varlığında tuğla kırmızısı renk verir. Proteinler için ayıraç olarak da kullanılır. İki çeşit fehling ayıracı vardır. Bunlardan birisi fehling A (Fehling I), diğeri de fehling B (Fehlig II) dir. Fehling ayıraçları glukoz veya fruktoz çözeltilerine ilave edildiklerinde mavi olan rengini kaybederek tuğla kırmızısı rengini alır. Proteinli çözeltilere ilave edildiğinde ise ısıtma işleminden sonra menekşe moru rengini alırlar. Fehling ayıracındaki mavi renkli Cu ++ redüklenip Cu + haline geçer. Bu arada şeker oksitlenerek şeker asiti oluşur. Dolayısıyla kırmızı renk meydana gelir. Zamanla Fehling ayıracı bozulacağından, her iki çözeltiyi birleştirerek oluşturulan ayıraç ihtiyaç kadar ve kullanılmadan hemen önce taze olarak hazırlanmalıdır. Fehling testi, redükleyici şekerlerin tayininde kullanılan, özgül ve yüksek hassasiyette bir testtir. Küpröz oksitin sarı veya kırmızı 4

5 presipitatı oluşursa redükleyici şekerin varlığı gösterilir. Rochelle tuzu bu reaksiyonda selat yapıcı madde olarak görev alır. Reaksiyon; Deney 1: Hazırlanışı: CuSO 4 + 2KOH Cu(OH) 2 + K 2 SO 4 Cu(OH) 2 CuO + H 2 O D-glukoz + 2CuO D-glukonik asit + Cu 2 O Küpröz Oksit (Kırmızı çözelti) Fehling A: Standard cam kapta g bakır (II) sülfat (CuSO 4.5H 2 O) 500 ml distile su içinde eritilerek elde edilir. Rengi güzel bir mavidir. Fehling B: 173 g sodyum potasyum tartarat (Rochelle tuzu) bir miktar ılık suda eritilir. 125 g potasyum hidroksit bir miktar suda çözülür. İki çözelti standard cam kapta karıştırılarak, hacim 500 ml ye distile su ile tamamlanır. Çözelti renksizdir. Deney 2: Materyal: Kaynar su banyosu Fehling A çözeltisi: 35 g CuSO 4.5H 2 O suda çözülür, hacim 750 ml ye tamamlanır. Fehling B çözeltisi: 120 g KOH ve 173 g Na-K tartarat (Rochelle tuzu) suda çözülür, hacim 500 ml ye tamamlanır. Fehling reaktifi : Eşit hacimde A ve B çözeltisi kullanımdan HEMEN ÖNCE karıştırılarak hazırlanır. Reaktifi Glukoz ayıracıdır. Glukoz varlığında rengi kiremit kırmızısına döner. Fehling A + Fehling B den oluşur. Yukarıda yapılışı ve taze hazırlanmasının gereği anlatılmıştır. Reaktifi Fehling testinden daha stabil olduğundan yaygın kullanılır. Sodyum sitrat şelat yapıcı madde görevi yapar. Redükleyici şeker varlığında küpröz oksitin kırmızı çökeltisi (presipitat) oluşur. Reaksiyon; Na 2 CO 3 + 2H 2 O 2NaOH + H 2 CO 3 2NaOH + CuSO 4 Cu(OH) 2 + Na 2 SO 4 Cu(OH) 2 CuO + H 2 O D-glukoz + 2CuO D-glukonik asit + Cu 2 O (Kırmızı presipitat) Deney 1: Kalitatif Çözeltisinin Hazırlanışı: 173 g sodyum sitrat ve 100g anhidröz sodyum karbonat (Na 2 CO 3 ) 800 ml suda eritilir. Çözelti süzgeç kağıdından süzülerek 1000 mililitrelik bir ölçü kabına aktarılır. Distile su ile hacmi 850 ml ye tamamlanr g balır sülfat (CuSO 4.5H 2 O) 100 ml suda çözülür. Distile su ile hacim 150 ml ye tamamlanır. Önce hazırlanan çözelti 1 L lik behere konur ve yavaş yavaş karıştırarak bakır sülfat çözeltisi ilave edilir. Bulanıklık varsa tekrar süzülebilir. Deney 2: Kantitatif Çözeltisinin Hazırlanışı: 100 g anhidröz sodyum karbonat veya 200 g kristal sodyum karbonat 200 g sodyum sitrat ve 125 g postasyum sülfosiyanür 600 ml distile suda ısıtılarak eritilir. Soğutulup süzülür. 18 g bakır sülfat (CuSO 4.5H 2 O) 100 ml distile suda eritilip ilk karışıma eklenir. Ayrıca karışıma 5 ml %5 lik potasyum ferrosiyanür çözeltisi koyulur ve karışım 1 litreye distile su ile tamamlanır. Deney 3: MATERYAL: Kaynar su banyosu Çözelti 2: Reaktifi. 173 g sodyum sitrat ve 100 g anhidröz (susuz) Na 2 CO 3, 600 ml sıcak suda çözülür. 800 ml ye distile su ile hacim tamamlanır. 5

6 Çözelti 3: 173 g CuSO 4.5H 2 O 100 ml sıcak suda çözülür, soğutulur. Soğuyunca 100 ml ye hacim tamamlanır. Çözelti 4: çözelti 2 yi, çözelti 3 e devamlı karıştırarak yavaş yavaş ekleyiniz ml (1 L) ye hacmi tamamlayınız ml test çözeltisini veya numune ekstresini 2 ml reaktifine ekleyiniz. Tüpleri kaynar su banyosunda bekletiniz. Kırmızı presipitat oluşumunu gözleyiniz. Presipitat oluşumu numunede redükleyici şeker varlığını gösterir. İyot çözeltisi (I 2 + KI) Nişasta indikatörüdür. Kahverengi-kırmızı renktedir. Nişasta varlığında rengi lacivert-siyaha dönüşür. İyot, polisakkaritlerle renkli kompleks oluşturur. İyot nişasta ile muamele edilince mavi renk verir; glikojen reaksiyon sonucunda kırmızımsı kahverengi kompleks oluşturur. Amiloz, amilopektin ve glikojen varlığının gösterilmesi için uygun ve hızlı bir testtir. Deney 1: Hazırlanışı: 6 g KI 200 ml distile suda eritilir. Ayrı bir kapta 4 g iyot kristali (I 2 ) eritilerek KI çözeltisine ilave edilir. Hacim distile su ile 1000 ml ye tamamlanır. İyot suda zor, ancak konsantre KI çözeltisinde çabuk çözündüğü için çözeltinin kullanmadan 24 saat önce hazırlanması tavsiye edilir. Şayet çözücü olarak alkol kullanılırsa iyot tentürü hazırlanır, antiseptik olarak yaralarda kullanılır. Deney 2: MATERYAL: İyot çözeltisi [%3 (w/v) potasyum iyodür çözeltisi içinde N iyot çözeltisi hazırlanır] Glukoz, sükroz, nişasta, glikojen, selüloz, vs. nin %1 lik test çözeltileri 1 ml test çözeltisi veya örnekten ekstre edilmiş şeker numunelerini tüpe koyunuz. Üzerine 4-5 damla iyot çözeltisi damlatılıp, nazikçe karıştırınız. Renkli ürün oluşumu var mı? Ürünün rengini kaydediniz. Lugol çözeltisi Nişasta indikatörü olarak kullanılır. Konsantre iyot çözeltisidir. İçeriğindeki iyot nişasta ile absorpsiyon halindedir. Mavi renk oluşur. Isı etkisi ile bu yapı bozulur ve mavi renk kaybolur. Soğutmadan sonra mavi renk tekrar meydana gelir. Hazırlanışı: 1 g iyot (iyot kristalleri iyice ezilmelidir) ve 2 g KI 300 ml distile suda iyice çözülür. Alternatif olarak 1 g iyot (iyot kristalleri iyice ezilmelidir) ve 2 g KI, 5 ml distile suda iyice çözülür ve bunun üzerine 140 ml distile su ve %5 lik sulu karbonattan 60 ml ilave edilir. İyice karıştırdıktan sonra kullanılır. Nitrik asit Protein ayıracı olarak kullanılır. Sudan III Yağ ayıracı olarak kullanılır. Rengi kırmızıdır. Yağ varlığında rengi turuncuya dönüşür. Hazırlanışı: 0.1 g sudan III, 10 ml %96 lık alkol, 10 ml gliserin karışımı hazırlanır. Bu karışım filtre kağıdından süzülerek kullanılır. Seliwanoff Ketoz şekerlerin (örnek fruktoz) aldozlardan ayırt edilmesi için kullanılan indikatörüdür. Rengi berrak kahverengi-kırmızıdır. Seliwanoff aldehit grubu ile reaksiyona girmediği için glukoza özgü değildir. Isıtıldığında, ketozlar aldozlardan daha hızlı dehidrate olur. Dehidrate ketozlar hidroksimetil furfural gibi furfural türevlerini verir; bunlar resorsinol ile kondanse olarak kırmızı kompleks oluşturur. Keto grubunu redükleyip ketoosazon oluşturduğu için fruktoz ile reaksiyon verir ve rengi kiraz kırmızısına dönüşür; presipitat da oluşabilir. Aldozlar da hafif reaksiyon verip uçuk 6

7 pembe renk oluşturabilir. Disakkaritler (örnek sükroz) kısmen hidroliz olduklarından pozitif reaksiyon verebilir. Diğer monosakkaritler uzun süre ısıtılınca renk oluşturur. Deney 1: Hazırlanışı: 100 ml, %50 oranında sulandırılmış HCl çözeltisi içinde 0.05 g resorsin (recorcinol) çözülür [3 N HCl içinde %0.05 (w/v) resorsinol olarak da hazırlanır; ancak %0.1 lik ile daha iyi sonuç]. Deney 2: MATERYAL: Karbohidrat numunesi (%1 lik karbohidrat çözeltisinden 0.1 ml) Seliwanoff reaktifi Deney tüpleri Kaynar su banyosu Deney tüplerine 2 ml Seliwanoff reaktifi koyunuz. Üzerine ml test çözeltisini ekleyiniz. Kaynar su banyosunda 1 dak. bekletiniz (iyi sonuç alınmadığında 5 dak. da beklenebilir). Kiraz kırmızısı rengin oluşumunu gözleyiniz. Renk oluşumu ketoz şeker varlığını gösterir. KARBOHİDRATLAR Sawhney, S. K. Ve Singh, R. (Eds.) (2001). Introductory Practical Biochemistry. Narosa Publishing House, Yeni Delhi, Hindistan. Şekerler gibi karbonhidratları içeren numuneler karışım halindeyse kalitatif ve kantitatif analizi, yapısal ve kimyasal benzerlikleri ve stereoizomerlerinin varlığından dolayı zor olabilmektedir. Verilen numunede bazı hızlı testler kullanılarak karbonhidrat olup olmadığı araştırılabilir. Bu testler genellikle reaksiyona göre oluşan renk reaksiyonlarına dayanır. Şeker çözeltileri, karışım olmadığında %0.1-1 konsantrasyon aralığında iyi sonuç verir. Nişasta için %2 lik çözelti de kullanılır. Sıra No Test Uygulanması 1 Molisch Testi CHO için genel 2 Antron Testi CHO için genel 3 İyot Testi Glikanlar için (Nişasta, glikojen) 4 Barfoed Testi Monosakkaritleri, redükleyici disakkaritlerden ayırmak için 5 Seliwanoff Testi Ketozlar için 6 Fehling Testi Redükleyici şekerler için 7 Testi Redükleyici şekerler için 8 Pikrik Asit Testi Redükleyici şekerler için 9 Mucic Asit Testi Galaktoz için 10 Bial Testi Galaktoz için 7

8 A) ANTRON (ANTHRONE) TESTİ: Karbohidratlar için için genel bir testtir; kalitatif ve kantitatif olarak kullanılabilir. Polisakkaritler için de kullanılır. Test, monosakkaritlerin furfural türevlerine dehidrasyonuna (örnek hidroksimetilfurfural) dayanır. Furfural türevleri antron ile reaksiyona girerek mavimsi yeşil renk veren bir kompleks oluşturur. Reaksiyon; O Antron D-Glukoz Kons. H 2 SO 4 3H 2 O Antron Deney 1: MATERYAL: Antron çözeltisi (%0.2, w/v, konsantre H 2 SO 4 içinde, 100 C 10 dak. bekletilip 630 nm'de absorbans okunur. 0.1 g/l konsantrasyonda da hazırlanabilmektedir.) Nişasta çözeltisi, %2 (mısır veya patates nişastasından da hazırlanabilir; Deney tüpü 8

9 Bir deney tüpüne 2 ml antron çözeltisi koyup üzerine 5 damla nişasta çözeltisi veya ml test çözeltisi ilave ediniz. Tüpü sallayarak iyice karıştırınız. Rengin mavimsi yeşil renge dönüşmesini gözlemleyiniz. Mavi veya yeşil renk oluşumu ortamda karbohidrat varlığını gösterir. Eğer renk oluşmadıysa emin olmak için kaynak su banyosunda 10 dak. tutup tekrar renk oluşumua bakınız. Deney 2: MATERYAL: Kaynar su banyosu Konsantre sülfürik asit Antron reaktifi (konsantre H 2 SO 4 içinde %2 lik w/v hazırlanmış) ml test çözeltisini 2 ml antron reaktifine ekleyiniz. İyice karıştırınız. Renk oluşumunu gözleyiniz. Rengin mavimsi yeşile dönüşünü takip ediniz. Renk oluşumu gözlemediyseniz, kaynar su banyosunda 10 dakika daha tutunuz. B) ALKALİLERİN KARBOHİDRATLAR ÜZERİNE ETKİSİ Redükleyici şekerler, NaOH veya KOH varlığında ısıtılırsa sarı renk oluşur. Daha sonra renk koyulaşarak önce portakal rengi, sonra koyu kahverengi olur. Renk değişimi ile birlikte karamelleşme kokusu duyulur. Redükleyici gruplar kapalı olduğunda redüksiyon olmaz, renk de oluşmaz. Moore testi ya da polimerleşme deneyinde sıcak bazik ortamda, glukoz ya da fruktoz moleküllerinin açık/serbest olan aldehit ve keton gruplarından serbest hale geçen aldehitlerin polimerizasyonundan polimer oluşur. MOORE TESTİ: Bu teste polimerleşme testi de denir. Serbest aldehit veya keton grupları bulunan şekerlere özel bir testtir. Sıcak alkali ortamda, şeker çözeltisi üzerine az miktarda NaOH veya KOH ilavesi ile sarı, portakal rengi ve kahverengi bir renk meydana gelmesi esasına dayanır. Renk reaksiyonu serbest hale geçen aldehitlerin polimerizasyonu sonucudur. MATERYAL: Glukoz, %1 Sükroz, %1 Fruktoz, %1 Nişasta çözeltisi, %1 NaOH, %10 Sıcak su banyosu Cam kalemi Beş deney tüpü alınız. Tüplerin her birine yukarıdaki karbohidrat çözeltilerinden 5 er ml koyup her tüpün üzerine karbohidratın ismini cam kalemi ile yazınız. Bunların üzerine birer ml NaOH çözeltisi ilave ederek tüplerin iyice karışmasını sağlayınız. Tüpleri sıcak su banyosuna alarak 5 dakika boyunca ısıtınız. Eğer sarı veya portakal rengi oluşmuş ise polimerizasyon gerçekleşmiştir. Karbohidratların varlığı bu renklere göre tespit edilir. C) REDÜKTÖR ŞEKERLERE AİT TESTLER Anormal durumda idrarda çıkan karbohidratların en önemlisi glukozdur. Bu nedenle glukoz aranmasında redüklenme deneyleri yapılır. Serbest aldehit (-CHO) ve keton (-C=O) grubu bulunan karbohidratlar alkali ortamda redükleyici özelliğe sahiptir. Redoks reaksiyonlarında redüksiyon ve oksidasyon birlikte yer alır (coupled). Yani redüktör karbohidratlar karşılarındaki maddeyi redüklerken kendileri oksitlenir. Monosakkaritler ve bazı disakkaritlerin serbest haldeki karbonil grupları (aldehit ve keton grupları) alkali ortamda bakır, gümüş, bizmut ve demir iyonlarını redükler. 9

10 Karbohidratların bu özelliğinden faydalanılarak tanımlanmaları amacıyla farklı testler geliştirilmiştir. Bunlardan en çok kullanılan testler ve Fehling testleridir (yukarıda açıklanmıştır). Bu deneylerdeki reaksiyonlar: Bir bakır sülfat çözeltisi baz ile ısıtılırsa siyah renkli bakır II hidroksit meydana gelir; CuSO 4 + 2NaOH Cu(OH) 2 + Na 2 SO 4 Oluşan Na 2 SO 4 suda erir, bakır II hidroksit [Cu(OH) 2 ] ise mavi renklidir ve kabın dibine çökelek halinde çöker. Kaynatmaya devam edildiğinde bir mol su çıkar. Siyah renkli çökelek haline döner, bu bakır II oksittir. Cu(OH) 2 CuO + H 2 O Bu reaksiyon redoks reaksiyonundan ayrı olarak Cu(OH) 2 ve/veya CuO serbest aldehit veya keton grubu taşıyan bir karbohidratla, alkali ortamda kaynatılınca, bakır +2 (II) değerden +1 (I) değere iner ve kırmızı renkli Cu 2 O (bakır I oksit) çökeleği oluşur. 2R-CHO + 2Cu(OH) 2 Cu 2 O + 2H 2 O + 2R-COOH Aldoz +2 bakır +1 bakır asit KALİTATİF BENEDİCT TESTİ MATERYAL: çözeltisi Hazırlanışı: 173 g sodyum sitrat ve 100g sodyum karbonat 800 ml suda eritilir. Çözelti süzgeç kâğıdından süzülerek 1000 mililitrelik bir ölçü kabına aktarılır. Distile su ile hacmi 850 ml ye tamamlanr g CuSO 4.5H 2 O 100 ml suda çözülür. Distile su ile hacim 150 ml ye tamamlanır. Önce hazırlanan çözelti 1 L lik behere konur ve yavaş yavaş karıştırarak bakır sülfat çözeltisi ilave edilir. Eriyebilen nişasta çözeltisi, %2 Glukoz çözeltisi, %2 Sükroz çözeltisi, %2 Laktoz çözeltisi, %2 Üç deney tüpü alarak her birine 2 şer ml çözeltisi koyunuz. Birinci tüpe 5 damla nişasta, ikinci tüpe 5 damla glukoz, üçüncü tüpe 5 damla sükroz, son tüpe de 5 damla laktoz çözeltisi ilave ederek tüpleri kaynar su banyosunda 5 dak. bekletiniz. Meydana gelen değişiklikleri gözlemleyerek sonuçları bir yere kaydediniz. KANDA ENZİMATİK METOD İLE GLUKOZ TAYİNİ Penicillum notatum un ürediği besi yerine glukoz oksidaz enzimi bırakması enzim kaynağını oluşturur. Reaksiyon; Glukoz oksidaz D-glukoz + O 2 + H 2 O H 2 O 2 + D-Glukonik asit Peroksidaz H 2 O 2 + O-toulidin Okside toulidin (mavi renkli ürün) MATERYAL: Glukometre şeritleri (strip) Lanset, steril Pamuk Alkol, %70 10

11 Glukometre Parmak ucundan alkolle temizledikten sonra steril lanset ile bir damla kan alınır. Glukometrenin striplerine emdirilir. Glukometreye yerleştirilerek glukoz miktarı okunur. PROTEİNLER BİÜRET TESTİ-Kalitatif Proteinleri oluşturan amino asitlerin arasındaki peptid bağlarının özgül indikatör Biüret testi kullanılarak gösterilmesi. Bu test proteinlerin hem kalitatif hem de kantitatif tayinine uygundur. Deney alkali çözeltide Cu 2+ iyonları ile proteinlerde görülen iki komşu peptid bağının reaksiyonuna dayanır. Proteinler arasındaki amino asit kompozisyonundan etkilenmez. Serumda bulunan toplam protein miktarı proteinlerin biüret reaktifi ile verdiği reaksiyon sonucu oluşan rengin kolorimetrik ölçülmesi ile tayin edilir. MATERYAL: Muhtelif sıvı ve katı gıda maddeleri veya serum Havan NaOH veya KOH, %10 Biüret reaktifi (bakır sülfat, %0.5) Deney tüpleri Gıda maddeniz katı ise bezelye büyüklüğünde bir parçayı havanda iyice ezip çok az distile su ekleyiniz. Bilinmeyen gıda maddesi çözeltisinin 1 ml sini (NOT: bazen 2-3 ml si daha iyi sonuç verebilir. Sıvı ise 1 ml veya 1 damlalık dolusu da olabilir) tüpe koyarak üzerine eşit miktarda (1 ml veya 1 damlalık dolusu) %10 luk NaOH ilâve ediniz. Tüpü yanlara doğru sallayarak karıştırınız. %0.5 lik bakır sülfat çözeltisinden damla damla ekleyiniz. Yaklaşık 5 damla ile renk oluşması beklenmektedir. Damlalar arasında çalkalayınız. Üç dak. bekleyiniz. Rengin pembeden mora (lila) sonra da maviye dönüşümünü izleyiniz. Renk aşırı koyu olup tanımlaması zor olursa %0.05 lik bakır sülfat çözeltisi ile deneyiniz. MATERYAL: Yağsız süt, 500 ml HCl, %2, 100 ml ph metre Manyetik karıştırıcı Büchner hunisi, büyük boy Süzgeç kâğıdı Beher 1 L AgNO 3, %1, 10 ml Etanol, %95, 150 ml Dietil eter, 150 ml NaOH, 0.01 N, 100 ml SÜTTEN KAZEİN İN İZOLASYONU Yarım litre yağsız sütü 1.5 litre çeşme suyu ile sulandırınız. Sulandırdıktan 30 dakika sonra %2 lik HCl ekleyerek ph ı 4.8 e ayarlayınız. ph ayarlama işlemini phmetre ile yapınız. 11

12 Bu noktada kazeinin çökmeye başladığını göreceksiniz. Çözeltiyi manyetik karıştırıcıda 10 dakika karıştırdıktan sonra yarım saat bekletin ve üstteki sıvıyı dökün. Çökeleği (çökeltiyi) her defasında 1 L distile su kullanmak üzere iki kere yıkayın ve üstteki sıvıyı atın. Filtre kâğıdını Büchner hunisine yerleştiriniz, kazeini vakum pompası veya kuvvetli su trompu altında süzün ve kurutun. Bunu 1 L lik behere koyun ve 150 ml distile su ile birkaç defa yıkayın ve klorür iyonu kalıp kalmadığını kontrol edin (0.5 ml lik numuneye birkaç damla %1 lik AgNO 3 damlattığınız zaman eğer çözeltide klorür iyonu varsa çözeltinin rengi bulanacaktır). Klorürden temizlenen çökelek santrifüjle toplanabilir. Şimdi çökeleği %95 lik alkolün 75 ml si ile sulandırın, 5 dakika karıştırın ve süzün. Alkol ekstraksiyonunu bir kere daha tekrarladıktan sonra iki defa 75 ml eterle aynı yolla ekstraksiyon yapın. Süzüldükten sonra vakum pompasına bağlayarak kurutun. Böylece beyaz pudra halinde kazeini elde etmiş olacaksınız. Hazırladığınız kazeinden 0.01N NaOH içinde %1 lik çözelti hazırlayın, üzerini işaretleyin ve soğukta saklayın. DENEYİN ADI: YUMURTA ALBUMİNİNİN KRİSTALLENMESİ MATERYAL: Yumurta akı (günlük 3 adet) Mezür Sodyum klorür, %0.9 Asetik asit, 1N Manyetik karıştırıcı Tülbent bezi Doymuş amonyum sülfat Santrifüj Üç yumurta akını bir mezüre koyun ve hacmini ölçün, iyice karıştırın. 1/10 hacım 1 N asetik asit ilâve ettikten sonra tekrar karıştırınız. Karışımı tülbent bezinden cam baget ile kuvvetlice karıştırarak geçirin. Karışıma eşit hacimde doymuş amonyum sülfat ilâve edin ve dakika sonra ovoglobin çökeleğini santrifüjle ayırın. Bu çökelekte, glikoprotein olan ve yumurta akına vizkoz özellik veren ovomusin de bulunmaktadır. Geri kalan berrak (sarı) sıvıya yavaş yavaş karıştırarak doymuş amonyum sülfat ilave edin, bir bulanıklık meydana gelecek ve sonra bu çözülecektir. Bu durumda amonyum sülfat ilâvesini durdurun ve çözeltiyi karıştırın. İyice karışmış çözeltiyi soğuk odada 2-3 gün bekletin ve albumin kristallerini santrifüj ederek ayırın. Albumini %0.9 luk NaCl içinde tekrar çözerek %1 lik çözeltisini hazırlayın ve soğukta saklayın. LİPİDLER Lipidler polar olmayan (APOLAR) biomoleküller olduğundan suda hemen hemen hiç çözünmezler. Apolar çözücüler olan eter, kloroform veya benzen de ise iyi çözünürler. Kompleks lipidler alkali hidrolizi sonucunda sabun oluştururlar, bu özelliklerinden dolayı SAPONİFİYE LİPİDLER denir. Basit lipidler yağ asidi içermediğinden SAPONİFİYE-OLMAYAN LİPİDLER denir. Terpen ve steroller bu gruba örnektir. Lipidlerin Kalitatif Testleri Detaylı analizleri zor olduğundan lipitlerle ilgili genel amaçlı, hızlı ve kolay uygulanabilen kalitatif testler geliştirilmiştir. 12

13 SOLUBİLİTE (ÇÖZÜNÜRLÜK) TESTİ Triaçilgliserollerin kısa zincirli yağ asidi taşıyanları suda bir miktar çözünür: Ancak uzun apolar yağ asidi zinciri taşıyanlar suda çözünmediğinden EMÜLSİYON oluşturur. Bütün triaçilgliseroller dietil eter, kloroform ve benzende çözünür. Metanol, etanol ve asetonda az çözünür ancak ısıtılarak çözünürlüğü artırılabilir. Çözünürlük özelliklerinin bilinmesi, biyolojide materyalden çeşitli lipidlerin ekstraksiyonu için etkili yöntemler geliştirilmesini mümkün kılar. MATERYAL: Yağ asitleri (bütirik, palmitik ve oleik asit) Katı yağlar ve sıvı yağlar, tereyağı, margarin, marina balığının karaciğer yağı, fosfolipidler Solvanlar (Su, metanol, etanol, aseton, kloroform, dietil eter, heksan) Deney tüplerine değişik lipidlerden az miktarda koyunuz. Üzerine su ekleyip iyice karıştırınız, çözünürlüğünü kaydediniz. Sıcak su banyosunda 50 0 C de 5 dakikada ısıtarak çözünürlüğünün değişip değişmediğini kaydediniz. Değişik çözücüler kullanarak testi tekrarlayınız. Çözünürlüklerini kaydedip tartışınız. YAĞ ASİTLERİNİN VARLIĞI İÇİN TİTRİMETRİK METOD KULLANILARAK KALİTATİF TEST Numunede non-esterifiye yağ asitlerinin varlığı, alkali ile titre edilerek, fenolfitaleyn indikatörü kullanılarak, tayin edilir. MATERYAL: Lipid numuneleri [tereyağ, zeytinyağ, stearik asit (%50 alkolde çözülmüş)] Fenolfitaleyn (alkolde hazırlanmış %1 lik) NaOH, 0.1 N Erlenmayerler 0.1 N NaOH in 10 ml sini erlene koyunuz. 1 damla fenolfitaleyn çözeltisi ekleyerek daimi pembe renk oluşturunuz. Bu çözeltiye test çözeltinizi, kabı devamlı karıştırarak DAMLA DAMLA ekleyiniz. Pembe rengin yok olması serbest yağ asitlerinin, numunede varlığını gösterir. Bütün lipid numuneleri ile tekrarlayınız. Sonuçları numunelerinizin serbest yağ içeriği hakkında size herhangi bir bilgi verdi mi? LİPİDLERİN EKSTRAKSİYONU VE AYRILMASI Yağlı tohum numunelerinin toplam lipid muhtevasının ekstraksiyonu ve hesaplanması amaçlanmaktadır. Lipidler bazı organik çözücülerde çözünür. Bu özelliklerinden faydalanılarak dokulardan lipidler ekstre edilir. Biyolojik materyallerde lipidler proteinlere bağlı olabildiğinden, etanol ve dietil eter karışımı veya kloroform ile metanolden oluşan karışımlarla (solvan) ekstre edilir. Solvanda metanol veya etanol bulunması lipidlerle proteinler arasındaki bağların yıkılmasını kolaylaştırır. MATERYAL: İyodometrik kaplar Ayırma hunisi Yağlı tohumlar (ayçiçek, yer fıstığı, soyafasülyesi) Anhidröz (susuz) sodyum sülfat Kloroform: metanol karışımı (2:1, v/v) Sodyum klorür, %1 13

14 1 g yağlı tohum tartılarak 5 g anhidröz saodyum sülfat varlığında havanda ezilir. 20ml kloroform-metanol karışımı eklenerek, hava geçirmeyen iyodometrik tüpe alınır. Mekanik karıştırıcıda 1 saat karıştırılır, cam filtreden geçirilir. Ekstraksiyon işlemi iki defa kalıntıya uygulanarak; ekstreler havuzlanır (birleştirilir). Solvanı vakum altında distil ederek uzaklaştırılır. Kaşıntıda kaba (ham) lipidler bulunduğundan tekrar 10 ml, %1 sodyum klorür çözeltisinden 1 ml eklenmiş, kloroformmetanol karışımı ile ekstrakte ediniz. Havuzlanmış fraksiyonları ayırma hunisine koyunuz. İyice karıştırınız ve 5 dakika beklemeye bırakınız. Lipidler alttaki kloroform tabakasında; sabun, gliserol ve diğer suda çözünmeyen saflıklar üst tabakada bulunur. Alt tabakayı musluğu açarak toplayınız. Üst tabakayı tekrar 3-4 defa 5-10 ml kloroformmetanol karışımı ile muamele ederek, kalıntı lipidleri de geri kazanınız. Önceden tanıttığınız bir behere lipidleri toplayınız. Solvanı, ılık su banyosuna (50 0 C) beheri koyup üzerine sıvı azot gazı üfleyerek, uçurunuz. Beherin ağırlığını kaydediniz. Ham lipidlerin numunedeki miktarını bulmak için beherin ağırlığını toplam ağırlıktan çıkartınız. Sonuçlarınızı verilen yağlı tohumda % ham lipid olarak veriniz. Aşırı sıcaklık ve ışıktan numunelerini koruyunuz. 14