1.1. Köpeklerin Seksüel Siklus Özellikleri

Transkript

1 1 1. GİRİŞ Eğitim ve gösteri amaçlı köpek yetiştiriciliği günümüzde artan bir şekilde ilgi çekmektedir. Köpek yetiştiricileri mükemmel havyan yetiştirmek için zaman, enerji ve parasal açıdan önemli yatırımlar yapmaktadırlar. Sahipleri köpeklerinden çiftleşme sonrası maksimum sayıda yavru elde etmeyi istemektedirler. Gebe kalmamanın en önemli nedeni birazda hayvan sahibinin bilgisizliğinden kaynaklanmaktadır. Üreticiler tarafından köpeğin üreme kapasitesinin değerlendirilmesi ve bu anlamda öneriler verilmesi için köpek sahipleri sıklıkla veteriner hekimlere başvurmaktadırlar. Köpeklerde proöstrus akıntısı ve vulvadaki ödem ovulasyon zamanı ile genital sistemdeki değişikliklerin bir yansıması olmakla birlikte, çoğu köpek yetiştiricileri bu bilgileri sağlıklı değerlendirememekte, köpeklerini kendi klasik çiftleşme programına göre çiftleştirmektedirler. Bunun sonucu olarak, birçok dişi köpek uygun olmayan zamanda çiftleştirilir ve bu durum köpeklerin infertilmiş gibi kabul edilmesine sebep olur. Üremenin denetlenmesi ve çiftleşme açısından doğru zamanın tespit edilmesi veteriner hekimler ve yetiştiriciler açısından önem taşımaktadır. Köpeklerde ideal tohumlama veya çiftleşme zamanının belirlenmesinde erkeği kabul, vaginal ödem, akıntı süresi ve özelliği gibi klasik yöntemlere ek olarak son yıllarda serum progesteron konsantrasyonunun belirlenmesi, vaginal endoskopi uygulaması ve vaginal sitoloji gibi bilimsel metotlarda geliştirilmiştir. Köpeklerde infertilitenin en önemli nedeni ovulasyon zamanının tespitindeki hatalardır. Bu nedenle çoğu köpek uygun zamanda çiftleştirilememekte, bu nedenle gebe kalmamaktadır.

2 2 Reprodüktif açıdan 16. yüzyılda incelenmeye başlamış olan köpekler hakkında ilk çalışma Loewenhfook un köpek spermataozoanlarını incelemesiyle başlamıştır. İlk suni tohumlama 1979 yılında Spollanzani tarafından köpeklerde başarıyla uygulanmıştır. Bischoff, 1845 de köpeklerin reprodüktif özellikleri hakkında mevcut bilgileri, ovulasyonun spontan olarak foliküler bir büyüme periyodundan sonra östrus sırasında oluştuğu merkezine getirmiştir. Bindokuzyüz lerin başında, Stricht diğer türlerden farklı olarak köpeklerde oosit maturasyonunun oviduktta ovulasyondan bir süre sonra tamamlandığını bildirmiştir (Concannon, 1989b). Köpeklerin seksüel siklus özellikleri üzerindeki ana çalışmalar ve yayınlar 1931 de Evans ve Cole a ait olan siklus evrelerinin anatomik ve fizyolojik değişimlerinin incelenmesi şeklindedir. Anderson ve Simpson tarafından yayınlanan köpeklerin ovaryum siklusu adlı konu incelemesi, modern anlamda elde edilmiş olan ilk bilgilerdir. Host ve Phemister (1974) in yürüttüğü çalışmalar fertil siklus olaylarının radioimmunnoassay tekniği ile hormonal olarak izlendiği ilk örnekler olmuştur Köpeklerin Seksüel Siklus Özellikleri Köpekler pubertasa genel olarak aylarda erişirler. Pubertasa erişme yaşını başta ırk olmak üzere birçok faktör etkiler. Küçük ırkların ilk östrusları aylarda görülürken, bu süre büyük ırklarda aylara kadar uzayabilir (Shille, 1980; Lein, 1983; Concannon, 1993). Dişi köpekler, monoöstruk yapıda, mevsime bağlı olmayan spontan ovulasyon gösteren ve bir batında birden fazla yavru doğurabilen memelilerdir. Siklik döngü yılda bir veya iki kez tekrarlanmaktadır. İki siklus arasında geçen süre 4 9 ay olup, ortalama 7 aydır (Concannon, 1993). Mevsimin östrus üzerine etkisi yoktur. Yılda bir veya iki kez yavrulayabilen dişi köpekte, gebeliğin şekillenmemesi durumunda luteal fonksiyon yaklaşık iki ay süreyle

3 3 devam etmekte, gerek gebe, gerekse gebe olmayan hayvanlarda iki östrus arasındaki süre benzerlik göstermektedir. Evcil dişi köpeklerin üreme özellikleri, pek çok açıdan çiftlik hayvanlarından belirgin şekilde farklılıklar gösterir. Dişi köpek uzun bir anöstrus periyodunu izleyerek, her çiftleşme sezonunda belli bir süre çiftleştiği için monoostrik olarak sınıflandırılırlar. Çiftlik hayvanlarından ayrılan yönlerinden biri de, östrus siklusu sırasında köpeklerde uzun bir foliküler ve luteal evrenin olmasıdır. Ovulasyonun, östrus evresi içerisinde ve primer oosit aşamasında şekillenmesi, dişi köpeğin çiftlik hayvanlarından ayrıldığı bir diğer noktadır. Yaş ilerledikçe dişi köpeğin üreme yeteneğinin zayıflamasına rağmen, çoğu köpek hayatlarının sonuna kadar östrus siklusu gösterirler (Kalkan ve Horoz, 2001) Seksüel Siklusun Evreleri ve Endokrinolojik Düzeni Köpeklerde siklus evreleri proöstrus, östrus, diöstrus ve anöstrus olarak sınıflandırılmaktadır (Holst and Phemister, 1974; Concannon, 1983; Olson ve ark. 1984). Bazı kaynaklarda ise diöstrus devresi metaöstrus evresi olarak ta kabul edilmektedir (Olson ve ark., 1989; England, 1994). Proöstrus evresinin uzunluğu 2 22 gün arasında değişmekle birlikte, ortalama süresi 9 gündür. Köpeklerde proöstrus seksüel aktivitenin başlama periyodudur, bu evre pratikte vulvada ödem ve kanlı vaginal akıntı ile başlar, kanlı akıntının başladığı gün proöstrusun ilk günü olarak kabul edilir. Diapedez tarzında kanlı vaginal akıntı, artan östrojen etkisi altında subepitelyal kapillarlardan köken almaktadır. Bu dönemde dişi köpekler erkek köpek için çekicidir ama çiftleşmeyi bu dönemde kabul etmezler (Kalkan ve Horoz, 2001). Östrus, dişi köpeğin çiftleşmeyi kabul etmesi ile başlar, genelde süresi 2 20 gün arası değişir, ortalama 9 gün sürer. Bu evrede vulva ve perineal bölge yumuşamakta, uterus vaskülarizasyonundan kaynaklanan kanlı akıntı azalıp

4 4 durmakta ya da saman rengine dönüşmektedir. Feromon salgısının en yüksek seviyede olduğu bu dönemde, dişi köpek aktif olarak erkek köpeği aramaktadır. Proöstrus davranışları plazma östrojen artışına bağlı oluşurken östrus davranışları ise plazma progesteron konsantrasyonu artışıyla şekillenmektedir. Ovulasyon LH dalgasından saat sonra, spontan olarak östrus evresi içinde gerçekleşmektedir (Concannon, 1986). Dişi köpeğin hala erkek için çekici olmasına rağmen erkeği reddetmesi ile başlayan dönem diöstrus evresidir. Genelde bu dönemde plazma progesteron düzeyinin 1ng/ml civarındadır. Diöstrus evresi ortalama gün, gebelik süresine denk gelen 2 ay veya gebelikle beraber laktasyona denk gelen 3,5 ay sayılabilir (Concannon, 1986). Anöstrus, diöstrus ile sonraki proöstrus arasındaki gün, ortalama 120 gündür. Bu süre ırk, birey, beslenme, sağlık, yaş, mevsim ve çevre faktörlerine bağlı olarak değişiklik gösterir. Gebe bir köpekte ise, anöstrus doğum ile başlar ve proöstrus belirtilerinin oluşması ile sona erer. Dişi köpeklerde östrus, ovulasyon ve korpus luteum fonksiyonunun endokrin düzeni hakkında net görüşler bulunmakla beraber, anöstrustan proöstrusa geçişin kontrol mekanizması henüz tam olarak aydınlatılamamıştır. Reprodüktif siklusun diğer tüm evreleri gibi, anöstrusun da, hipotalamus hipofiz ve ovaryumun endokrin kontrolü altında olduğuna inanılmaktadır Köpeklerde Üreme Sürecine Etkili Hormonlar Gonadotropin Salınımı Köpeklerdeki gonadotropik hormonlar adenohipofizden sentezlenen, glikoprotein yapılı hipofizer luteotropik hormon (LH) ve folikül stimüle edici

5 5 hormon (FSH) ile protein yapılı prolaktindir (PRL). Bu hormonlar hipotalamus ve gonadal steroidlerin kontrolü altında fonksiyonlarını sürdürmektedir (Concannon, 1993) Luteotropik Hormon (LH) Hipotalamus kökenli olan GnRH, hipofizden LH ve FSH salınımını uyarmaktadır. GnRH nın LH salınışını uyarması birkaç dakika içerisinde olur. LH hormonu fizyolojik olarak, Graff foliküllerinde ovulasyon ve corpus luteum formasyonu ile progesteron sentezinde rol oynar. Preovulatör yükseliş genellikle proöstrustaki östrodiol pikinden 1 2 gün sonra başlar ve östrodioldeki düşüş preovulatör yükselmeyi başlatırken progesterondaki artış da bunu kolaylaştırır. Preovulatör LH dalgası saatte sona erer ve foliküllerin genişlemesini hızlandırarak luteinizasyon ve ovulasyona sebep olur. Genel olarak ovulasyonun LH pikinden saat sonra oluştuğu, bunun 96 saate kadar uzadığı bildirilmektedir (Concannon, 1986; Concannon, 1993; Jeffcoate ve England, 1997). 7-9 günler Östrojen LH Erkek köpeği kabulü Anöstrus Proöstrus Östrus Diöstrus Şekil 1.1. Östrus Dönemlerinde Östrojen ve LH Hormonu Seviyeleri (Bowen, 1998)

6 6 Yapılan çalışmalar, LH düzeyinin anöstrusta 1.2 ± 0.1 ng/ml, anöstrus sonuproöstrustan hemen önceki dönemde 1.8 ± 0.1 ng/ml, proöstrus ortalarında 0.7 ± 0.1 ng/ml, ovulatör LH pikinde ise 9.8 ± 0.5 ng/ml ve buna yakın değerlerde olduğunu göstermiştir (Olson ve ark., 1982 ; Concannon, 1986; Concannon, 1993). KÖPEKLERDE ÖSTRUS ENDOKRİN PROÖSTRUS ENDOKRİN ÖSTRUS LH DALGASI OVULASYON OOSİT MATURASYONU FERTİL PERİYOD FERTİLİTE PİK PERİYODU FERTİLİZASYON PERİYODU PROGESTERON < 1 ng/ml PROGESTERON YÜKSELİŞİ VULVA ÖDEM VE ŞİŞKİNLİK VULVA YUMUŞAKLIĞI VAGİNAL ÖDEM ARTIŞI VAGİNAL KATMANLAR Şekil 1.2. Köpeklerde Östrus ile Hormonal ve Sistemik Degişiklikler (England ve Concannon, 2002) Folikül Stimüle Edici Hormon (FSH) Dişi köpeklerde FSH, ovaryumlarda foliküler gelişmeyi ve gelişen foliküllerden östrojen salınımını kontrol eder. LH hormonu ile birlikte folikül uyarıcı etkisi

7 7 olup, pre-ovulatör LH yükselişi ile birlikte, ovulasyonun şekillenmesinde önemli rol oynamaktadır (Concanon, 1993). Conconan (1993), anöstrusta FSH yoğunluğunu 140 ± 8 µg/ml, erken proöstrusta 175 ± 15 µg/ml, proöstrus ortalarında 26 ± 6 µg/ml, preovulatör LH dalgasından 1 2 gün sonra 311 ± µg/ml olarak bildirmektedir. Köpeklerde anöstrusta ovaryum ve hipofizin işlevsel olmadığını gösteren çalışmalar, anöstrustaki FSH yoğunluğunun, pre-ovulatör LH dalgası sırasındaki değerine benzer olduğunu, köpeklerde anöstrusta foliküler gelişme için gereken miktarda FSH bulunduğu kanıtlamıştır (Olson, 1982). Anöstrustaki FSH tablosuna bakıldığında, genel olarak bir artış ve LH dalgalanmalarına paralel ancak LH nın aksine belirgin olmayan bir dalga bildirilmektedir. Anösturus sonunda belirgin LH artışına eşlik eden FSH artışlarının küçük çaplı oluşu, anöstrusun sona ermesinde söz sahibi olan asıl olayın LH artışı olduğunu göstermektedir (Concannon, 1986; Concannon, 1993). Kooistra ve ark. (1999) yaptıkları çalışma luteal faz ve anöstrusta LH ve FSH ın hızlı ve keskin bir kan plazma konsantrasyon artışı görülürken, daha sonra yavaş ve kademeli bir azalma bildirilmiştir Prolaktin (PRL) Metabolik ve laktojenik bir hormon oluşumunun yanında prolaktin aynı zamanda LH ile beraber hipofizer luteotropik gereksinimin bir parçasıdır. Hücrelerde luteinizasyon sağlamada progesteron ön maddesi olan kolesterol ün yanında prolaktine de gereksinim vardır. Progesteron salınımı, prolaktin sekresyonu ile bağlantılıdır. Serum prolaktin düzeyi, doğumdan önce progesteron düzeyi azaldığında yükselmektedir. LH hormonu gebeliğin geç döneminde prolaktin salgısını uyarmaktadır (Onclin ve ark. 2000).

8 8 Siliart (1998), anöstrustaki prolaktin yoğunluğunun 6 ng/mi nin altında, proöstrus, östrus, diöstrus, gebelik ve laktasyonda ise 6 ng/mi nin üzerinde olduğunu bildirmektedir. Fernandes ve ark. (1987) yaptıkları çalışmada proöstrustan geç diöstrusa kadar olan sürede kan prolaktin konsantrasyonunda bir değişiklik olmadığını bildirmiştir. Gebeliğin son haftası süresince, serum prolaktin seviyesi ortalama 40 ± 7 ng/ml seviyesindedir (Concannnon ve ark. 1978). Köpeklerde tirotropin salgılatıcı hormon (TRH) prolaktin salınımı uyarmaktadır. Buna bağlı olarakta TRH salınımı etkileyen faktörler, tiroid fonksiyonu ile beraber, prolaktin salınımını da etkilemektedir. Gebe olmayan dişilerde, progesteronun azalma sürecinde veya hemen sonrasında prolaktinde oluşan yükselme, yalancı gebelik gelişimine neden olmaktadır (Concannon, 1986) Gonod Kökenli Steroid Hormonların Salınımı Gonodal steroid hormonları köpeklerin üremesinde rol oynayan ovaryum, plasenta, adrenal korteks ve fötal gonadlardan salgılanan temel hormonlardır Östrojenler Dişi köpeklerde ovaryumlardan salınan östrojenler, östradiol ve östron olmakla birlikte, fonksiyonel açıdan östradiol 17β daha önemlidir. Proöstrus başlangıçından itibaren östrojen düzeyi artmaya başlamaktadır. Proöstrus sırasında foliküler 1 2 mm den 3 4 mm lik çapa ulaşmakta, vulvada ödem ile uterus kökenli serosanginöz akıntı görülmektedir. Proöstrus folikülerinden olgunlaşma ve östrodiol sekresyonu için hipofizer gonadatropin

9 9 gereklidir. Birçok türde olduğu gibi FSH, granüloza hücrelerinde aktiviteyi başlatmakta ve bunu izleyerek LH da, progesteron ile androjen üretimini uyarmaktadır. Proöstrus sırasında ortalama plazma östrojen düzeyi artmakta, LH dalgasından önceki 1,3 ve 10. günlerde 26 ± 4, 43 ± 4 ve 62 ± 4 pg/ml olmakta ve LH dalgasını takiben östrojen düzeyi hızlı bir şekilde düşmektedir (Concannon ve Hansel, 1975). Östrus siklusunu başlama işareti kanlı vaginal akıntı tam olarak başlamadan önce, dişi köpeklerde östrojen seviyesi yükselir. Östrojen seviyesindeki bu yükselme kanlı akıntının başlamasından iki ay önce meydana gelir. Bu erken östrojen üretimi vulva ödemi ve feromon salınımını başlatır. Erkek için çekici olur ve östrus belirtileri gösterir (Concannon ve ark., 1979). Vulvadan akıntı geldiği zaman östrojen konsantrasyonu bazal değerlerin üzerinde ve LH pikinden önceki birinci güne kadar yavaşça 75 mg/mi ye yükselir ve sonra aniden azalır (Mestre ve ark., 1990). Zayıf bir östrojenik steroid olan östron düzeyinin de proöstrus sırasında yükselmekte ve genellikle LH yükselişinden önce ve sonraki östrodiol düzeyine paralel olduğu gözlenmektedir Progestagenler Köpeklerde ovaryum kökenli progestagenler arasında en önemlisi progesterondur. Gebelikle sonuçlanmayan bir östrus siklusu sonrası anöstrusun başı ve ortasında, progesteron salınımı yavaş biçimde azalır ve anöstrus boyunca da düşük kalır. Anöstrusun sonunda proöstrusun başlangıcına doğru progesteron

10 10 düzeyi 0,4 0,8 ng/ml arasında seyreder. Daha sonra foliküllerden kaynaklanan bir artış ile 0,6 1,0 ng/ml ye ulaşır. Proöstrusun ikinci yarısında foliküler, LH yükselişinden önce kısmen luteinleşir ve progesteron düzeyi belirli bir biçimde artar (Concannon, 1986). LH piki sırasında, progesteron konsantrasyonu düşük kalmakta (< 2 ng/ mi) ama LH pikinden sonraki 8. günde 16 ng/ mi ortalama değerle yavaşça artmaktadır (Mestre ve ark., 1990). Progesteron, LH dalgası başlangıcında, anöstrusa özgü düzeyinden kademeli olarak 1 ng/ml ye yükselir. Östrustaki LH yükselişi ile beraber 1 2 ng/ml civarına ve ovulasyon sırasında 2 5 ng/ml ye çıkar. Progesteron fertilizasyon süreci başında 6 8 ng/ml ye yükselir ve LH dalgasından gün sonrasına kadar ng/ml seviyesinde devam eder (Concannon, 1986; Jeffocate ve Lindsay, 1989). Eğer gebelik şekillenmezse, LH dalgasından sonraki 25 günde pik yapar ve yavaş yavaş azalarak günlerde 1 ng/ml ye, günlerde ise 0,3 0,6 ng/ml ye iner (Concannon, 1986) Androjenler Androjenler, östrojen hormonu sentezi sırasında açığa çıkıp, foliküler sıvıda yer almaktadır. Bu hormonlar arasında testesteron ve androstendion önemlidir ve seksüel siklus evrelerinde belirli düzeylere ulaşabilmektedir.

11 Optimal Çiftleşme Zamanını Saptama Yöntemleri Dişi köpeklerde optimal çiftleşme zamanını tespit etmek için birçok yöntem veya metot kullanılmaktadır. Gözle görülebilen semptomlar incelenebilirken, mikroskopik bulgular veya hormonal veriler de kullanılabilir. Gözlenebilen saptama yöntemleri hekimin veya hayvan sahibinin değerlendirilebileceği; vaginal akıntı, vaginal ödem veya ortamda bulunan erkek köpeği kabul etmesidir (England ve Concannon, 2002). Vaginal sitolojide optimal çiftleşme zamanını saptama yöntemleri arasında önemli bir yer tutmaktadır (Tamer ve ark., 1994; England ve Concannon, 2002). Yine kan serum progesteron ve LH hormonu düzeyinin tespiti de bu amaçla kullanılmaktadır. Plazma progesteron konsantrasyonunun ELISA yöntemi ile tespiti ve kullanımı Bouchard ve ark.,1990 tarafından incelenmiştir. LH piki ile ovulasyon arasında küçük değişimler olmakla beraber LH plazma düzeyi ovulasyon zamanının tespitinde en uygun yöntemdir (Holst ve Phemister, 1973). Optimal çiftleşme zamanının tespitinde tek bir semptom ya da muayene yeterli değildir, tanı bir muayeneden çok komplike muayeneye dayandırılarak konulur (Fay, 2003).

12 12 Çizelge 1.1. Köpeklerde Östrus Davranışlarının Şekillendiğinde Görülebilen Değişiklikler ile Östrus ve Proöstrus Sırasındaki Olayların Sıralaması (England ve Concannon, 2002) Fertilite Durumu, Fiziksel ve Klinik Değişimler Serum östrojen konsantrasyonunun artışının başlangıcı Proöstrus davranışlarının açıkça görülmesi ( vulvada ödem, akıntı ) Vaginal smeardaki kornifikasyonun en üst zamanı LH Pikinin Olduğu Zaman ( - 40 ) ( - 6 ) günler ( - 28 ) ( - 3 ) günler ( - 10 ) ( - 3 ) günler Maksimum vaginal hiperplazi ve kornifikasyon ( - 3 ) 0 günler Maksimum serum östrojen konsantrasyonu ve vulvada şişkinlik ( - 3 ) ( -1 ) günler Fertil periyod ( - 3 ) günler Serum östrojenin azalması ( - 2 ) 0 günler LH dalgasının meydana gelmesi (serum progesteron artışı 0,9 3 ng /ml) Östrus davranışlarının şekillenmesi Ovulasyonun oluşu (progesteron artışı 2 8 ng / ml) Oviduk'ta oositin maturasyonu Fertilizasyon periyodunun oluşumu Maksimum vaginal kıvrımlar ve vaginal katlarda açılanma Vaginal mukozadaki kornifiye epitel hücrelerinin desquamasyon piki Progesteron artışı 8-20 ng / ml Fertil periyodun sonu Kornifikasyon indeksinde azalma Östrus davranışlarının bitişi İmplantasyon Ultrasonografik muayene ile kalp atımlarının alınışı Doğum 0 gün Değişken ( - 3 ) 7 günler 2 gün 4 5 günler 4 5 günler 3 ( - 5 ) günler 4 6 günler 6 gün 7 10 günler 7 10 günler Değişken (Yaklaşık 9 gün) günler günler günler

13 Vaginal Akıntı Fizyolojik ve patalojik durumlarda vulvadan değişik özellikte akıntılar gelmektedir. Köpeklerde çiftleşme zamanını saptamak amaçlı akıntı, proöstrus kanamasıdır ki; bu proöstrusun başlangıcıdır. Birçok hayvan sahibi proöstrusun başlamasından sonra geçen süreye bakarak köpeklerini çiftleştirirler. Bu kişiler proöstrusun şekillenmesinden sonraki belirli bir günde ovulasyon olacağına inanırlar. Oysa bu her zaman doğru sonuç vermez ve bu süre köpekler arasında değişiklikler gösterir. Ovulasyon ortalama olarak köpeklerde proöstrus akıntısının gözlenmesinden sonraki 12 inci günde olurken (buna bağlı olarak ta çiftleşme günde yaptırılırken), bazı dişi köpeklerde ovulasyon 5 gün kadar daha erken görülür, diğerlerinde proöstrus başlangıcından 30 gün kadar geç şekillenebilmektedir. Bu yüzden, 12 ve 14. günlerde yapılan ve genel olarak üreme amaçlı çiftleştirmeler, sıklıkla döllenmenin başarısızlıkla sonuçlanmasına neden olmaktadır. Yapılan bir çalışmada 50 köpek proöstrusun başlamasından sonraki 10 ve 12. günlerde çiftleştirilmiş %78 oranında gebelik elde edilmiştir (England, 1992) Vaginal Ödem Köpeklerde optimal çiftleşme zamanının tespitinde bir klinik değerlendirme de, vulvanın görünüşüdür. Proöstrus sırasında üreme kanalında, vulva ve perineal dokuda ödematoz genişleme ve artan bir şişkinlik östrojen artışına cevap olarak meydana gelir. LH dalgası sırasında serum östrojen düzeyi oldukça yüksektir. Dişi köpeklerde bu olay optimum çiftleşme zamanına karar vermede klinik olarak değerlendirilebilir. Bu gözlemler ovulasyondan 1 2 gün önce olur.

14 14 Bu yüzden üreticiler bu dönemde doğal çiftleşmeyi veya suni tohumlamayı planlamalıdırlar (England ve Concannon, 2002) Vaginaskopik Bulgular Dişi köpeklerde vaginaskopik muayene tohumlama veya optimal çiftleşme zamanının belirlenmesinde kullanılır. Köpeklerde seksüel siklus dönemine göre vagina mukozasında meydana gelen değişiklikler salınan hormonların vagina mukozasının çok katlı yassı hücrelerinde değişikliklere yol açması ve vagina mukozasının su tutma kapasitesine bağlıdır. Dişi köpeklerde vaginaskopi yardımıyla siklus döneminin saptanmasında mukoza katlarının şekli, yoğunluğu, rengi ve sıvı olduğu durumlarda sıvının rengi değerlendirilmektedir. LH pikinden sonraki ortalama 2,4 ± 1,5. günlerde köşelenmelerle birlikte vaginal dürümlerde en üst düzeye gelmektedir (Jeffcoate ve England, 1997). Proöstrus döneminde vagina mukozası parlak, gül pembe renginde ve ödemlidir. Vaginal mukoza uzunlamasına ve enine dürümler içerir. Östrus döneminde mukoza solgun, porselen beyazına yakın bir renkte, kuru ve lüle taşı şeklinde yani buruşuk ve büzüşmüş bir hal almaktadır. Diöstrus döneminde mukoza pembemsi renkli ve parlaktır, bazen bulanık özellikte sıvıya da rastlanmaktadır. Mukoza dürümleri ise uzunlamasınadır. Anöstrus döneminde ise mukoza parlak pembe renkli ve katlanmalar uzunlamasınadır (Jeffcoate ve Lindsay, 1989; Jeffcoate ve England, 1997). Vaginaskopi amacıyla sert aletler ve soğuk ışık kaynakları kullanılmaktadır. Vaginaskopi bakışında tam mukozal katlanmanın olduğu dönem fertilizasyon periyodu olarak tanımlanır. Çiftleşme veya suni tohumlama bu

15 15 dönemde planlanabilir ki; bu dönem mukozal büzülme ve mukozal açılanmanın ilk tespit edildiğinden sonraki yaklaşık 4. günlerdir Erkek Köpeğin Kabulü Bazı evcil hayvanlarda, östrusun davranışsal işaretleri çiftleşmenin optimal zamanını tespit etmek için kullanılmaktadır. Bununla beraber dişi köpeklerde davranışsal olaylar ve endokrin düzey arasındaki bağlantı genellikle zayıftır. Laboratuvar ortamında tutulmuş köpekler üzerinde yapılmış çalışmalarda, bazı vakalarda, östrusun oluştuğu zamanın ortalaması ile LH dalgasının olduğu zaman yaklaşık olarak aynı zamanda olmuştur, diğer vakalarda ise LH dalgasından bir gün sonra olmuştur. Bu çalışmalar ışığında östrusun oluşmasından sonraki 3 ve 4. günlerde birçok dişi köpek için çiftleşmenin uygun zamanı oluşmaktadır (England ve Concannon, 2002). Dişi köpeklerde östrusun oluşma belirtileri açıkça görülmektedir, bu ovulasyondan önceki 3. gün ile ovulasyondan sonraki 5. güne kadar görülmektedir. Bu östrusun davranışsal belirtileri fertil periyodun bitmesinden 1 2 gün önceye kadar sürmesi vaginal sitoloji ve vaginoskopiye de dayandırılarak incelenmiştir (England ve Concannon, 2002). Dişi köpekler bu dönemde erkek köpekleri kabul ederler. Dişi köpekler bazı erkek köpekleri çiftleşmek için kabul ederlerken, bazı erkek köpekleri kabul etmezler. Üretimin yönetilmesi, dişi köpeğin erkeği kabul etmesine bağlıdır, bu yüzden köpekler mümkün olduğunca erken çiftleştirilmelidir. Bouchard ve ark. (1990), yaptıkları çalışmada; ovulasyon, östrusun devam ettiği birinci günden sonraki 2,1 ± 3,9 günlerde ve dişi köpeğin erkeği kabul ettiği son günden 8,8 ± 1,5 önce olmaktadır.

16 16 Yüksek plazma progesteron konsantrasyonuna rağmen LH pikinden sonraki 24 saat içinde dişi köpeğin erkek köpeği kabul ettiği bildirilmektedir (Mestre ve ark.,1990) Kanda ve İdrarda LH Hormonu Tespiti Plazma LH konsantrasyonunun ölçülmesi optimum çiftleşme zamanının tespitine tam ve güvenilir bir metottur. Birçok ülkede köpekte serum ve idrarda LH ölçümü için ticari bir kit kullanımda değildir ve bu yüzden ölçüm radioimnunoassay ile yapılmaktadır. Bu metot zaman harcadığı, pahalı olduğu ve sonuca ulaşmayı geciktirdiği için fazla tercih edilmez (Fresman, 1991; England ve Concannon, 2002). LH dalgasından sonraki 4 ve 6. günler arasında kritik suni tohumlama ve çiftleşme planlanıyorsa, LH serum konsantrasyonu ölçülebilir (Badinand ve ark., 1993; England ve Concannon 2002). Ovulasyon zamanını tespit etmek için köpek serumunda ELISA ölçüm kiti uygulanabilir. LH pikini tespit etmek için 1 ng/mi den az ve 1 ng/ml den yüksek değerler ELISA ile ölçülebilmektedir (Root Kustritz, 2001) Kanda Progesteron Hormonu Tespiti Plazma progesteron konsantrasyonu LH dalgası sırasında ovulasyondan önceki yaklaşık 2 gün içinde hızlı bir şekilde artmaya başlar. Bu hızlı yükseliş hormon ölçüm teknikleri ile belirlenebilir. Günlük plazma progesteron konsantrasyonun ölçümleri birçok vakada ovulasyonun 1 2 gün içinde tespit edilmesini sağlayabilmekte ve suni tohumlama ve çiftleşme zamanı tespiti amacıyla kullanılmaktadır. Kritik çiftleşme ve suni tohumlama plazma progesteron konsantrasyonun artışından sonraki 4 6. günler arasında planlanabilmektedir ve muhtemelen bu artış 2

17 17 ng/ml dir; ki bu LH dalgasının olduğu gün ve takip edilen günlerdeki tipik gözlenen konsantrasyondur (England ve Concannon 2002). Ovulasyon plazma progesteron konsantrasyonunun 4.9 ± 1.0 ng/mi( ng/mi) olduğu zaman meydana gelmektedir (Bounchard ve ark., 1990). Östrustaki 24 köpekte östrojen düzeyi pikinden sonra en az 3 gün içinde maksimum vaginal keratinazasyonun şekillendiği ve östrustaki 17 köpekte ise ; plazma progesteron konsantrasyonun >5.44 ± 0.93 ng/mi olduğunda ovulasyonun gerçekleştiği yapılan bu çalışmalarda belirtilmiştir (Linde ve Karlsson, 1984; Arbeiter ve ark., 1991). Radioimnunoassay (RIA) veya ELISA gibi ölçümlerle plazma progesteron konsantrasyonu tam olarak ölçülebilmektedir (Bouchard ve ark.,1990; Van Klaveren ve ark., 2001). Bazı raporlar fertilizasyon periyodunun başlangıcının tipik olarak izlendiği 8 10 ng/ml değerlerini aştıktan sonraki günlerde üremenin tercih edilebileceğini önermektedirler. Post ve ark. (1990) da radioimmunoassay (RIA) ve enzim-linked immunoassay (ELISA) metodlarını karşılaştırmıştır ve ELISA nın daha hızlı, basit ve kullanım güvenliği olduğunu göstermiştir. Yine bu çalışmada progesteron konsantrasyonu eğer 5 ng/mi den az ise iki gün sonra yeniden değerlendirilme yapılmış, eğer 5 10 ng/mi ise ertesi gün çiftleştirilmiş ve eğer 10 ng/mi üstünde ise aynı gün çiftleştirilmiştir. Bu zamanlama ile köpekler sadece bir defa çiftleştirilerek yavru elde edilmiştir. Dişi köpekte eğer plazma progesteron konsantrasyonu 4 ng/ml nin altında ise diğer muayene iki gün sonrası için önerilmiş, plazma progesteron konsantrasyonu 4 ng/ml nin üzerinde ise diğer sonuçlarla da desteklenerek, hemen çiftleşme önerilmiş ve çiftleşmenin 2 şer gün ara ile yapılması sağlanmış ve gebelik elde edilmiştir (Laiblin, 1991; Fay ve ark., 2003). Eckersall ve Harvey (1987) de yaptıkları çalışmada progesteron ELISA kitinin equide, ovine ve canine türlerinde plazma progesteron

18 18 konsantrasyonunun ölçümünde kullanılabileceğini kanıtlamışlardır. Tam kan ve plazma progesteron konsantrasyon düzeyi ile ilgili yapılan çalışmalarda; tam kan ELISA sonuçlarının, plazma ELISA sonuçlarına göre güvenirliğinin daha az olduğunu, tam kan ELISA ölçümünün progesteron konsantrasyonunu ölçmekle beraber, çiftleşme zamanı tespitinde güvenilirliğinin az olduğu belirtilmiştir (England, 1991). Doğum zamanı dikkate alınarak yapılan çalışmalarda, vulvada şişkinlik; 0,006, vulvada akıntı; 0,003, vaginal smear; 0,25, vaginoskopi; 0,17, progesteron düzeyi; 0,29 ve tüm bu klinik belirtiler beraber değerlendirildiğinde ise 0,47 değerleri bulunmuştur, ki bu gözlem ve değerlere dayanılarak tespit edilen optimal çiftleşme zamanına göre en doğru sonucun, progesteron düzeyi ve tüm bu göstergelerin birlikte değerlendirildiğinde bulunduğu bildirilmiştir (Fay ve ark., 2003). Birkaç ticari kit, çeşidi son yıllarda köpeklerde ovulasyon zamanının belirlenmesinde kullanılabilmektedir Ultrasonografik Muayene ile Follikül Çapının Ölçülmesi Köpeklerin ovaryumları real time B mode ultrasonografik muayene kullanılarak tanımlanabilmektedir. Tekrarlayan ve dikkatli muayenelerde ovulasyon zamanının tespiti ve graff folikülünün görülmesi mümkündür. Bununla beraber yeni corpus luteum foliküllere benzediğinden ovulasyonun tespit edilmesi zordur. Ultrasonografide foliküller anekojenik gibi görülür. Anekojenik boşluk boyutu proöstrüs sırasında artar, bunların çapı proöstrus ortasında 2 3 mm, geç proöstrusta yaklaşık 5 mm ve ovulasyon günü ve LH dalgası günü arasında maksimum 7-10 mm çapa ulaşır (England ve Concannon, 2002).

19 19 Deneysel çalışmalarda, ovulasyon zamanı folikül çapı azalmakta ve anekojenik foliküller ya tamamen kaybolmakta ya da bunların çapı azalmış olarak tespit edilmektedir (England ve Concannon, 2002). Ovaryumlardaki anekojenik yapıların yokluğu ya da çapının küçülmesi ovulasyon olduğunu göstermektedir. Ovulasyondan sonra ovaryumlarda anekojenik yapılar tekrar görülmeye başlamaktadır. Anekojenik alanlar içinde sıvı bulunan corpus luteumlardır. Bununla beraber, bu teknik klinik alanda kullanım alanı bulmaktadır (England ve Concannon, 2002). Renton ve ark. (1992) yaptıkları çalışmada LH dalgası ile koordineli değerlendirmede ultrasonografik muayene ile ovulasyon zamanının tespitinde % 33 oranında başarı elde etmişler, yine bu çalışmada plazma progesteron konsantrasyonunun ultrasonografik muayene ile yapılan değerlendirmeden daha iyi sonuç verdiğini oraya koymuşlardır. Ultrasonografik muayene, LH dalgası ve plazma progesteron düzeyi ile ovulasyon tespiti değerlendirildiğinde, ultrasonografik muayene ve LH düzeyi kullanılarak ovulasyonu tespit etmek için günde birkaç kez test uygulamak gerekirken, plazma progesteron düzeyinin günde bir defa tespit edilip, 2 ng/ml veya daha yüksek olması ovulasyonun şekillendiğini göstermiştir (Hase ve ark., 1999). Ovaryum arterlerinde kan akımının ultrasonografik muayene ile ovulasyondan önceki ve sonraki 2 gün boyunca ölçülmesinden elde edilen sonuçlar ile diğer günlerde ölçülmesinden elde edilen sonuçlar arasında belirgin farklılıklar bulunmuştur (Köster ve ark., 2001).

20 20 Çizelge 1.2. Preovulatör LH Dalgasından Sonra ve Önceki Dönemlerde Normal Fertil Köpeklerde Çeşitli Klinik Parametreler (England ve Concannon, 2002). Preovulatör LH Dalgasından Sonra ve Önceki Dönemlerde Normal Fertil Köpeklerde Çeşitli Klinik Parametreler Parametreler LH dalgası öncesi 7 gün LH dalgasının olduğu zaman LH dalgası sonrası 4 5 günler, oosit olgunlaştığı zaman LH dalgası sonrası 8 11 günler Vaginal sitoloji kornifikasyon indeksi %30 - %100 %80 - %100 %80 - %100 %0 - %80 Smear'da lökosit Az Az ya da yok Az ya da yok Çok Vulva Vulva'da ödem Artarak devam eder. En üst noktadadır. Açıkça azalır yumuşak ama hala geniştir Vaginal mukozal katlar Pürüzsüz, yuvarlak, beyaz, ödemlidir. Beyaz, hafif büzülme ve kırışıktır. Beyaz, iri kıvrımlı ve köşelidir. Beyaz, pembemsi, lekeli, düzdür. Serum progesteron < 0.5 ng / ml 0.9 3,0 ng/ml ng/ml 8 25 ng/ml Serosangiöz akıntı ya da vaginal smear'da eritrosit Var Var Var/yok Var/yok Üreme durumu infertil Ovulasyon öncesi fertil periyod piki Ovulasyon sonrası 2 3 günler, fertil periyod İnfertil ya da çok az fertil

21 Vaginal Sitoloji Vaginal Sitolojinin Tarihçesi, Prensibi ve Uygulama Teknikleri Vaginal sitolojik muayene, dişi köpeklerde genital kanal organlarında şekillenen fizyolojik olayların tespitinde önemli bilgiler vermektedir. Vaginal mukoza hücrelerinin ovaryum kaynaklı hormonlardan etkilendiğini ilk olarak 1847 de Pouchet bildirmektedir. Papanicolaou ve Stockard ın 1917 de kobay vaginal smearları üzerinde yürüttükleri sistematik çalışmalarda, hücresel örneklerde, ovaryum hormonları için hedef organ olan vagina epitelinde değişimler belirlendiği, kandaki östrojenin yoğunluğu arttıkça vaginal smearda, vagina epitelindeki proliferasyon ve kornifikasyona karşılık gelen tutarlı ve sıralı değişimler saptandığı aktarılmaktadır (Rozsel, 1977). Bindokuzyüzyetmişli yılların başındaki çalışmalarda köpekteki vaginal sitoloji için yalnız tanımlayıcı nitelik taşımıştır. Arbeiter (1972) ve Roszel (1977) vaginal sitolojinin optimal çiftleşme zamanının saptanmasında kullanılabileceğini göstermişlerdir. Proöstrus başlangıcı ile birlikte artan östrojenik uyarıma bağlı olarak, vagina epitelinde proliferasyon şekillenir. Epitel dokusundaki profilerasyon, anöstrus evresinde kübik ve iki tabakalı konumdaki vagina epitelinin östrus evresinde sayısı 30 u aşan çok katlı yapıya dönüşümünü sağlar. Bunun sonucu vagina duvarı kalınlaşır. Östrojenin artışı ile birlikte bazal membranlardan başlayarak sayıları artan ve birbirleri üzerinde yığınlar oluşan hücreler submukozada bulunan kan damarlarından uzaklaşır ve hücresel anlamda ölüm gerçekleşir. Hücresel ölüm çok katlı epitelin yüzeysel tabakalarındaki hücrelerde gerçekleşir ve keratinizasyon, çekirdekte nükleer piknoz ve karyoreksis

22 22 şekillenir. Tüm bu değişimlerin birinci nedeni, çiftleşme sırasında vagina mukozasının korunmasıdır. Ölen hücreler, öldükçe daha geniş daha düzensiz şekilli ve solgun boya alan hücrelere dönüşürler. Hormonlarca uyarılan değişimleri yansıtan döküntü hücreler uygun biçimde toplandığı takdirde mikroskobik olarak inceleme olanağı sağlamakta ve siklik evre belirlenerek dişi köpeklerde optimum çiftleşme zamanı tespit edilmektedir (Aslan ve ark., 1995; Rozsel, 1975; Post, 1985; Concannon, 1986; Wright ve Parry, 1989; Feldman ve Nelson, 1996). Dişi köpeklerde fertil periyodun tespitinde vaginal sitoloji önemli bir yer tutmaktadır. Vaginal sitoloji sonuçlarına dayanılarak yapılan çiftleştirmelerde kontrol grubunda %78 olan gebelik oranı; %92 ye varan oranlarda dikkate değer artışlar göstermiştir (England, 1992). Bounchard ve ark. (1990) yaptıkları bir çalışmada vaginal sitolojiye dayanarak ovulasyonun süperfisiel hücrelerin %80 oranında görülmesinden sonraki 6,9 ± 1,6 günde meydana geldiğini bildirmişlerdir. Folliküler fazda 35 köpekte yapılan çalışmada haftada üç kez vaginal sitoloji yapılmış ve sitolojik bulgulara göre %28 oranında tam çiftleşme zamanı tespit edilmiştir (Hiemstra ve ark., 2001). Yirmi dört dişi köpekte vaginal epitelinde maksimum keratinizasyon östrojen düzeyi pikinden sonraki 3-6 günlerde gözlemlenmiştir ki; bu sonuç ovulasyon zamanının hesaplanmasında kullanılabilir (Linde ve Karlson, 1984). Wright (1990), 11 dişi köpek üzerinde yaptığı çalışmada vaginal sitoloji ve plazma progesteron konsantrasyonunun normal üremenin denetlenmesinde ve reprodüktif sistem hastalıkların tanısında dikkate değer yardımı olduğunu göstermiştir. Vaginal sitoloji kullanılarak, optimum çiftleşme zamanının tespiti yanında, anovulasyon, bölünmüş östrus, vaginal kanamanın kaynağı, yangı,

23 23 lenfosakrom, TVT, vaginal hiperplazi gibi problemlerde tespit edilebilmektedir (Baştan ve ark, 2003; Post, 1985; Wright ve Parry, 1989; Erünal-Maral ve ark., 2000) Vaginal Smear Örneklerinin Alınması Vaginal smear alınırken çeşitli yöntemler kullanılmaktadır. Smear alınırken kullanılan yöntem basit, ucuz ve kullanılabilir olmalıdır. Vaginal smear, tek başına mikrobiyolojik amaçlı swap yardımı ile alınabileceği gibi, spekulumla beraber swap, spatula veya aspirasyon tekniklerinden herhangi biri kullanılarak da alınabilir. Smear alma işlemi sırasında pamuklu swap, spatula veya vaginaskop, antiseptikli solüsyon, pipet gibi gereçler kullanılmaktadır (Roszel, 1975; Concannon, 1986; Feldman ve Nelson, 1996). Vaginal smear anterior vaginanın tabanından alınmalıdır. Smear alınırken kullanılan gereç, dorsal kommisura yönünde ilerletilerek klitarol fossa ve vestibuler kontaminasyon önlenmeli, bu amaçla bir vaginaskop veya spekulum kullanılmalıdır. Uygun ve doğru olmayan vaginoskop veya spekulum gibi yardımcı bir alet kullanılmaksızın gerçekleştirilen smear alma işlemi, travma nedeniyle eritrositler, kontaminasyon nedeniyle idrar kristalleri veya fungal sporların bulunması nedeni ile yanlış tanıya veya smear içeriğinin yanlış yorumlanmasına yol açabilmektedir (Roszel, 1975). Alınan smear materyali, vaginal mukozanın yüzeyindeki hücrelerin lam üzerine aktarılmasını sağlayacak şekilde, dikkatle lam üzerine yayılmalıdır Fikzasyon ve Boyama Alınan smear boyamadan önce, farklı özellikler taşıyan sıvı veya aerasol fiksatörler kullanılarak fikse edilebilir. Taşınabilirlik ve kolay kullanım aerasol

24 24 fiksatör için tercih sebebidir. Sıvı fiksatör kullanılmadığı zamanlarda suyun buharlaşmaması için sıkıca kapalı tutulmalıdır. Alkol veya alkol-eter karışımları içinde fikse edilen ya da aerosol fiksatörlerin kullanıldığı smearlar, çabuk boyama yöntemleri ile iyi boyanmazlar. Havada kurutulmuş smearların hücre yoğunluğu açısından sulu fiksatörlerden daha iyi sonuç verdiği bildirilmiştir (Shidham ve ark., 2000; Sivaraman ve ark., 2001). Eksfoliatif vaginal sitoloji değerlendirilmesi için hazırlanan preparatlar, Papanicolaou, Wright, Giemsa Wright, Diff-Quik, New Methylene-blue, Methylene-blue, Sanotrychrom, Shorr, çabuk Shorr, Toluidine- blue, Leishman boyama yöntemi gibi pek çok boyama yöntemi ile boyanabilir. Bunlar arasında seçimi etkileyen faktörler, kullanım kolaylığı, boya ekipmanın uzun süre saklanabilirliği ve preparatların kalıcılığıdır (Papanicolaou, 1942; Conconan 1989; Feldman ve Nelson, 1996). Papanicolaou ve Shorr gibi özel trikrom boyama yöntemleri, dolaşımındaki östrojenin etkisi ile epitel hücrelerinin sitoplazmalarında gelişen keratin öncülerinin varlığını belirleyebilmektedir. Romanowsky tip boyalar, hücre çekirdeğini koyu mavi yani bazofilik boyamakta, bazofilinin derecesi hücresel olgunlaşma ile ilgili olup, en az olgun yani en az kornifiye hücrelerde bazofili en yüksek olarak gözlenmektedir (Wright ve Parry, 1989; Tamer ve ark., 1994). Diff-Quik boyama, çabuk olması tutarlı sonuçlar vermesi nedeniyle kullanım alanı bulunurken, fiksatörün hızla buharlaşması ve solüsyonların sık sık değiştirilme gerekliliği pratik değerini azaltmaktadır. Boya, keratin spesifik bir element içermediğinden yöntem kornifikasyon derecesine ilişkin bir bulgu vermemekte, bu yüzden boyama ile kısmi yada tamamen kornifiye hücreler arasındaki farklılıklar belirlenememektedir (Concannon, 1986). Papanicolaou yönteminin ise birçok üstünlüğe sahip olduğu bildirilmektedir (Papanicolaou,1942). Bu boyama yönteminde epitel hücreleri ve eritrositler daha şeffaf gözlenmektedir. Pek çok patolojik olguda, vaginal akıntı lam

25 25 üzerinde kalın bir tabaka oluşturmaktadır. Kanamanın yoğun olduğu olgularda da kan hücrelerinin yoğunlaşması smearlarda hücrelerin üst üste gelmesine neden olmaktadır. Bu tür preparatlarda yöntem hücrelerin ayırt edebilmesine olanak sağlamaktadır. Papanicolaou yönteminde asidofilik hücrelerin rengi kırmızıdan turuncuya kadar değişir. Bu nitelik smear tiplerinin kesin tanısına yardım etmektedir. Bazofilik hücreler yeşil veya mavi boyanırlar. Kana tutunmuş doku parçaları veya hücreler eritrositler açıkça gözlenmese de özgün bir turuncu veya turuncu yeşil renk alır. Ayrıca nükleer detaylarda da bu boyama yöntemi ile oldukça iyi gözlenir (Papanicolaou, 1942) Vaginal Sitoloji Hücre Tipleri Vaginal sitoloji hücre tipleri zaman içinde farklı şekilde adlandırılsalar da yaygın olarak kullanılan sınıflandırılmada hücreler, vaginal mukozanın çok katlı epitel katının en derin tabakasında başlayarak lümene doğru bazal, parabazal intermedier ve süperfisiyel hücre olarak sıralanmaktadır. Süperfisiyel hücrelerin üzerini kaplayan çekirdeksiz materyal ise squame, kornifiye veya keratinize olarak adlandırılmaktadır Bazal Hücreler Bazal ve parabazal hücreler vaginal epitel hücrelerinin en küçükleri ve sağlıklıları olup, küçük µn büyüklükte, bazofilik boya alan nukleusu silindirik ve bazal konumlu olan hücrelerdir (Christie ve ark., 1972; Roszel, 1975; Wright ve Parry, 1989).

26 Parabazal Hücreler Yuvarlak oval şekilli, büyük ve merkezi yerleşimli nukleus ile buna bağlı olarak küçük olan hücrelerdir. On beş 25 µm büyüklükte olan hücrelerin 3 13 µm nukleusu vezikuler yapıdadır. Nukleus düşük metabolik aktiviteden ötürü Papanicolaou, Wright ve bazı çabuk boyama yöntemleri ile mavi (bazofilik) boyanırken sitoplazmanın soluk renkli olduğu gözlenir (Concannon, 1986; Wright ve Parry, 1989; Feldman ve Nelson, 1996) İntermedier Hücreler Büyüklüğü değişken, şekli oval veya yuvarlak olup nukleus, parabazal hücre nukleusunda daha küçüktür. Hücre genişlediği için göreceli olarak sitoplazması daha büyük ve çekirdeği daha küçük görünür. Morfolojideki bu değişim hücre ölümünde birinci aşamayı yansıtır. Tanımlayıcı amaçlar için küçük intermedier ve büyük intermedier veya aşağı-yukarı intermedier olarak ikiye ayrılabilirler. Küçük intermedier hücreler büyüyen küresel parabazal hücreler ile olgun hücreler arasındaki geçiş hücreleridir. Bu yüzden erken intermedier hücreler olarak adlandırılırlar. Çapları µm dır. Biçimsel olarak yuvarlaktan ovale dek değişen ve çoğu kez elipsoid yapıda olan hücrenin dış sınırı düzgündür. Çekirdek parabazal hücrede olduğu gibi, uzunca ve elipsoid, veziküler, fakat daha az bazofiliktir. Geniş sitoplazma normal-solgun mavi arasında boyanır (Christie ve ark., 1972; Concannon, 1986; Feldman ve Nelson, 1996). Büyük intermedier hücreler şekil olarak düzgün değişken ölçülü küçük intermedierler ile düzensiz şekilli süperfisiyel hücreler arasında bir geçiş aşaması olarak görülür. Aynı zamanda geç intermedier ya da süperfisiyelintermedier hücreler olarak da adlandırılır. Östrojen etkisine girmiş olan

27 27 hücreler olup, periferleri köşeli, keskin kıvrımlı olabildiği gibi bazen de dış sınırları düzenlidir. Genişlikleri en çok µm dir. Sitoplazma, bazofilik fonda boyanır, aktif nukleus tri-krom boyadadır. Mor veya turuncu boyanır (Christie ve ark., 1972; Concannon, 1986; Wright ve Parry, 1989; Feldman ve Nelson, 1996) Süperfisiyel Hücreler Vaginal sitolojide görülen en büyük hücrelerdir. Pürüzsüz, köşeli sınırdadırlar ve zayıf boya alırlar. Çekirdek formu küçük piknotik veya solgundur. Sitoplazmanın asidofilik görünümündedir. Sitoplazmik boyanın yoğunluğu aynı zamanda kornifikasyon ve dejenerasyonun derecesine bağlı olarak değişebilir. Süpersifiyel hücrelerin koyu-piknotik veya soluk boya almış normal yapılı çekirdeğe sahip olanları kısmen kornifiye hücre kategorisine; çekirdeksiz, veya çekirdeği belli-belirsiz olanları ise tamamıyla kornifiye hücre kategorisine dahil edilir. Süpersifiyel hücreler aşırı derecede köşeli, kıvrımlı, düzensiz şekilli ve çapları µm arasında değişmektedir (Christie ve ark., 1972; Roszel, 1975; Concannon, 1986) Çekirdeksiz Döküntüler Çekirdeksiz (anükler) döküntüler, ölü, geniş, düzensiz, köşeli sınırlı hücreler olup sağlıklı yuvarlak parabazal hücreler ile başlayan bir oluşumun son basamağıdır. Bunlar vaginal duvardaki kalınlaşma nedeni ile ölü olan ve kan dolaşımı ile uzaklaşan hücrelerdir. Boyayı absorbe etmede başarısız olan bu yaşlı ve keratinize hücreler, hemen hemen şeffaf görünür ve çekirdek kalıntısı içermezler. Yaklaşık µm çapındadır (Feldman ve Nelson, 1996).

28 Metaöstrus ve Köpük Hücreleri Sitoplazmaları kırmızı kahve veya mavi olup içerisinde bir ya da daha fazla nötrofil içeren geniş intermedier hücrelere metaöstrus hücreleri, belirgin sitoplazmik vakuollü parabazal ve intermedier hücrelere ise köpük veya foam hücreleri adı verilmektedir (Christie ve ark., 1972; Rozsel, 1975; Feldman ve Nelson, 1996) Kan Hücreleri Eritrositler yuvarlak veya hafifçe tırtıklı, yarı şeffaf, solgun turuncu ile solgun mavi boyanır. Görünüşü, kırılmış gölge ya da hücre parçaları biçimindedir. Nötrofiller, koyu renkli, multilobuler nukleuslu, düzgün ana hatlı, temiz sitoplazmalı olarak görülürler.

29 29 Çizelge 1.3. Köpeklerde Siklusun Değişik Dönemlerinde Şekillenen Değişikler(England ve Concannon, 2002) Siklus Dönemi Uzunluğu Hormonol Değişiklik Baskın Hücre Tipleri Eritrosit Nötrofil Davranış Değişikleri Klinik Bulgular Erken Erken Erken Dönem: Dönem: Dönem: Proöstrus ~9 gün Östrojen Her çeşit hücre vardır. Geç Dönem: Büyük İntermedier ve + Geç Dönem: + Geç Dönem: Erkeğe ilgi gösterir fakat çiftleşmeye izin vermez. Vulvada ödem ve kanlı akıntı vardır. Superficial ± Azalır. hücreler. Süperficial Östrus ~9 gün LH (Dalgası) Östrojen Progesteron hücre oranı %90 veya daha yukarıdır. Bakterilere genelde ± Yoktur. Erkeği kabul eder, yani çiftleşir. Vulva ödem azalmış ve akıntının rengi açılmıştır. rastlanır. Süperficial Diöstrus ~60 gün Progesteron hücre oranı %20 oranına düşmüş, intermedier hücre sayısı ± Olabilir. Çiftleşmeye izin vermez. Akıntı çok az ve vulva ödemi gerilemiştir. artmıştır. Gebelik durumuna Anöstrus bağlıdır gün sonra CL geriler ve 130 gün sonra Progesteron Parabazal ve İntermedier hücreler vardır. Yoktur ve varsa çok azdır. Sayıları çok azdır. Dış bellekler yoktur. Koyu, yapışkan bir sekresyon vardır. endometrium yenilenir

30 Siklus Süresince Vaginal Sitoloji Bulguları Proöstrus Proöstrus başlangıcında tüm epitel hücre tipleri bulunurken, giderek parabazal ve küçük intermedier hücrelerin sayısı azalır. Büyük intermedier hücrelerde geçici, süperfisiyel hücrelerde giderek artan bir değişiklik olur. LH yükselişinden önceki 7 ile 10. günler arasında tipik değişimler görülmektedir. LH yükselişinden önceki 4 veya 5. günde, tüm hücrelerin %5-30 unu oluşturan parabazal hücrelerin oranı %5 e düşer ve yükselişten önceki 2 3 günde tümüyle ortadan kalkar. LH yükselişinden 5 6 gün önce, büyük intermedier hücreler %5 25 oranında artıp, daha sonra sayıcı azalır ve yükseliş anında ortadan kalkar. Süperfisiyel hücreler, LH yükselişinden 1 5 gün önceki smearlarda epitel hücrelerin %30-60 ını oluşturacak şekilde artarlar (Post, 1985; Feldman ve Nelson, 1996). Eritrositler proöstrusun ilerlemesine paralel olarak azalmakla beraber genellikle mevcuttur preparatın arka planında mukus yoktur. Normal florada bulunan E.coli bakterilerine rastlanmaktadır (Aslan ve Fındık, 2003). Geç proöstrusta ise nötrofil sayısı azalmış süperfisiyel hücre sayısı oldukça artmıştır Östrus LH dalgasından sonraki 6 8 günlerde vaginal smear hemen hemen tamamen süperfisiyel epitel hücrelerden oluşur. Zeminde çoğunlukla döküntü yoktur ve zeminin aniden temizlenmesi genellikle LH yükselişinin olduğununun göstergesidir (Post, 1985). Eritrosit yoğunluğu orta derecededir. Nötrofiller diğer dejenere polimorf nukleuslu kalıntılara kıyasla enderdir. Keratenize

31 31 tabiattaki epitel hücrelerinin geçişi engellemesi nedeniyle polimorf nükleer lökositler (PNL) östrus sırasında bulunmaz. Erkek köpeği kabul isteği azaldıkça, lökositler ve nükleer epitel hücreleri yeniden görülmeye başlar (Conconan, 1986). Östrus başlangıcında, süperfisiyel hücre kornifikasyonu artar. Östrus sürecinde %68 in altına düşmez ve genellikle % civarındadır. Süperfisiyel hücrelerin sınırları, LH yükselişinden 4 6 gün sonra, daha karışık ve ayırt edilemez hale gelir (Conconan, 1986). Östrusun bitimindeki saatlik zaman içinde, süperfisiyel hücrelerin % 20 oranında düşmesi, vaginal sitolojide oluşan ani dönem değişikliği gösterir (Holst ve Phemister, 1974; Feldman ve Nelson, 1996) Diöstrus Sitolojik olarak östrusun sonu ve diöstrusun başlangıcı, smear da daha önce az bulunan parabazal ve intermedier hücrelerin yeniden görülmesi ile belirlenir. Östrus sonunda süperfisiyel hücrelerin arasında az sayıda parabazal ve intermedier hücreler görülürken, diöstrus ilerledikçe artan intermedier ve parabazal hücre oranı epitel hücrelerin %1-40 ını oluşturarak şekilde artar ve %95 e dek ulaşır (Holst ve Phemister, 1974; Post, 1985). Bazen diöstrustan 1 gün kadar önce süperfisiyel hücrelerin kümeler veya geniş tabakalar halinde görüldüğü, bunların bir kerede atılan çok sayıda hücreyi temsil ettiği ifade edilmektedir. Bu dönemin ilk 10 gününde, lökosit sayısı artar sonra azalır ve yaklaşık 20 gün sonra ortadan kalkar. Smear zemini çok miktarda döküntü içerir. Bazen evreye eşlik eden özgün metaöstrus ve köpük hücreleri de görülür (Holst ve Phemister, 1974; Feldman ve Nelson, 1996).

32 Anöstrus Anöstrusa ilişkin vaginal sitoloji bulguları göreceli olarak sabittir. Başlıca parabazal ve küçük intermedier epitel hücreleri görülür. Nötrofiller nadiren bulunur. Bazen görülebilen bakteriler, genellikle normal florayı temsil eder, zemin temiz ya da kirli olabilir. Mukus içerisinde görülebilen epitel hücre sayısı değişken olup, birkaç süperfisiyel hücre ve önceki siklustan kalma döküntüler bulunabilir (Post, 1985; Conconan, 1986; Feldman ve Nelson, 1996). Çizelge 1.4. Siklusun Farklı Dönemlerinde Saptanan Hücreler ve % Oranları (England ve Concannon, 2002) SİKLUSUN FARKLI DÖNEMLERİNDE SAPTANAN HÜCRELER VE % ORANLARI Hücre Tipleri Proöstrus Östrus Erken Metaöstrus Geç Anöostrus Eritrosit Nötrofil Keratinize Süperfisiyel Hücreler Nonkeratinize Süperfisiyel Hücreler İntermedier Hücreler Parabazal Hücreler %10 %90 %30 %0 %0 %30 %8 %20 %10 %2 %50 %2 %20 %30 %3 %10 %0 %30 %60 %95

33 33 2. GEREÇ VE YÖNTEM 2.1. Gereç Hayvan Materyali Bu araştırmada toplam 35 adet safkan Alman çoban köpeği kullanıldı. Köpeklerin yaşları 2 5 arası değişmekle birlikte ortalama yaş çalışmada grubunda 3,8 ve kontrol grubunda ise 3,6 idi. Çalışma ve kontrol grubundaki köpekler besin maddesi olarak aynı tip kuru mama ile beslenmekte olup, iç ve dış gezinti alanlı, kapalı ve ısıtma sistemli olan tek köpeklik barınakta barınmaktaydı. Ayrıca tüm köpeklere çalışma öncesi antiparaziter ilaç yapıldı ve düzenli aşılamalar yapılmıştı. Çalışma grubundaki köpekler, proöstrus kanamasının başlamasından itibaren 2 gün aralıklarla vaginal sitoloji yapılarak değerlendirildi. Vaginal sitolojide % 80 ve daha yukarı oranda süperfisiyel hücre görüldüğünde köpekler çiftleştirildi. Kontrol grubu köpeklerde ise proöstrus kanamasından itibaren izlendi ve kanlı akıntını renginin değişmeye başladığı ve akıntının rengi açık sarı olduğu dönemlerde erkek köpekler bir araya getirildi ve erkeği kabul eden köpekler çiftleştirildi. Her iki grupta köpekler çiftleşmeyi izleyen 25. günde ultrasonografi ile gebelik yönünden değerlendirildi. Gebe olan köpekler kaydedildi.

34 34 Ayrıca her iki gruptaki köpeklerde gebelik süresi, çalışma grubundaki köpeklerde ise bu parametreye ilaveten vaginal sitolojik muayene ile ortalama proöstrus ve östrus süreleri belirlendi. Sadece akıntının özelliğine bakarak elde edilecek bilgilerin çok sağlıklı bir bulgu olamayacağı düşüncesiyle kontrol grubundaki köpeklerde ortalama proöstrus ve östrus süreleri takip edilmedi. Bu çalışmada istatistiki hesaplamalar SPSS 14.0 Windows Evaluation Version ve Discriptive Statistics yöntemi ile belirlendi.

35 35 Çalışmada yer alan kontrol grubu köpeklerin yaş ortalamaları 3.6 dır. Köpeklerin Yaşlarına Göre Dağılımı (Kontrol Grup) 5; 23% 5; 23% 3; 14% ; 40% Şekil 2.1. Köpeklerin Yaşlarına Göre Dağılımı (Kontrol Grubu) Çalışmada yer alan çalışma grubu köpeklerin yaş ortalaması 3.8 dır. Köpeklerin Yaşlarına Göre Dağılımı (Çalışma Grup) 4; 31% 0; 0% 4; 31% ; 23% 2; 15% Şekil 2.2. Köpeklerin Yaşlarına Göre Dağılımı (Çalışma Grubu)