GİRİŞ. Kandida türleri normal koşullarda, %30-50 si gastrointestinal

Transkript

1 GİRİŞ Kandida cinsi mantarlar, Deutromycota şubesinin Deuteromycetes sınıfında yer almaktadırlar 1. Bu bifazik mantarların konağa girmeden önceki maya fazına Y fazı (Yeast phase, saprofit faz), konağa temas ettikten sonra dokuya girerek blastosporlarıyla üreyen ve hastalık yapan fazına M fazı (Mycelial phase,hifal faz) denilmektedir 2. İnsanın deri, solunum, gastrointestinal ve kadın genital sistemlerinin flora elemanı olan, günümüzün çok önemli patojenlerinden kandida türleri ile konakçı arasında, karşılıklı olarak, dinamik bir ilişki bulunmaktadır. Böylece immun yeterli olanlarda kandida türlerinin çoğalması baskılanarak, kolonizasyon ve infeksiyon önlenmektedir 3,4. Nozokomiyal mantar infeksiyonları içinde, C. albicans ve albicans dışı kandidalar %85.7 gibi yüksek oranlara erişmiş bulunmaktadır. National Nosocomial Infection Surveillance (NNIS) nın verilerine göre kandidalar, 1992 de nosokomiyal patojenler içinde 7.sıradan 6.sıraya yerleşmiştir 5. Kandidoz etkenleri arasında ilk sırayı C. albicans almakla birlikte son yıllarda çoğu kez antifungallere dirençli non- albicans kandida türlerinde de artışlar olduğu dikkati çekmektedir. Bu nedenle kandida kökenlerinin tanımlanması, hastalığın prognozu ve tedavisinin planlanması için büyük önem taşımaktadır 6. Kandida türleri normal koşullarda, %30-50 si gastrointestinal 1

2 sistemde, %20-30 u kadınların genital florasında bulunmaktadır 7,8. Ağız boşluğundan soyutlananların %60-80 ini, genital yol izolatlarının %80-90 ını C. albicans oluşturabilmektedir 7,9. Sağlıklı bireylerin oral kavitelerinde kandida taşıyıcılığı çalışılan gruba ve yönteme bağlı değişkenlik göstermekle birlikte, %35-80 oranlarına işaret edilmektedir 10,11. Ağız boşluğunda en sık bulunan ve en invaziv olan maya türü, C.albicans olarak öne çıkmaktadır. Bu mayayı C. tropicalis, C. krusei, C. kefyr izlemektedir. Diş protezleri mukozaya kolonizasyonunu kolaylaştırarak, stomatite zemin hazırlayabilmektedir 12. Vajinal kandidozlu kadınlar, semptomatik hastalar ve asemptomatik taşıyıcılar şeklinde, ikiye ayrılmaktadır. Bu iki grupta vajinal akıntı ve vulvar kaşıntı gibi klinik yakınmaların başlaması ve şiddeti, Kandidanın koloni oluşturan ünite sayısı ile ilgili olmak üzere farklılıkları vardır. Kandidanın vajinal sıvı mililitresi başına 105 koloni oluşturan üniteden daha fazla olması, belirgin kandidoz göstergesi olarak kabul edilmektedir 13. Jinekoloji polikliniklerini en çok meşgul eden sağlık problemlerinden birisi vajinitislerdir 14. Erişkin kadınların yaklaşık %75 i hayatları boyunca bir kez, %45 i birden fazla vajinitis atağı geçirdiği bildirilmektedir 15. Vajinal akıntılı kadınların büyük bir grubunda bakteriyel vaginosis (Non-spesifik vulvovajinit) görülürken, kandida vajiniti (VVK=Vulvovajinal kandidoz) %20-25 oranı ile ikinci sıraya yerleşmekte ve üçüncü sırada Trichomonas vajinalis vajiniti gelmektedir 16. VVK un çocuklarda ve yaşlılarda daha seyrek görüldüğü bildirilmektedir 17,18. Tümbay ve ark 17 VVK olgularından %69.8 ini doğurganlık çağındaki kadınların oluşturduğuna işaret etmektedirler. Cengiz ve ark 18 ise en yüksek prevalansı yaş 2

3 diliminde saptamışlardır. Kandidalar ağız, barsak, üst solunum yolu, deri ve vajende kommensal olarak, hiçbir semptomatik infeksiyona neden olmaksızın kolonize olabilmektedirler. Ancak konak savunması bozulduğunda, invaze olarak, dokulara zarar verebilmektedirler. Bu nedenle normal floraların bir üyesi olan C. albicans, klinik örneklerden izole edildiğinde gerçek bir patojen mi yoksa floranın bir üyesi mi olduğunun her zaman ayırt edimesi kolay olmamaktadır. Ayrıca bu potansiyel patojenin nasıl olupta kolonizasyondan invazyon aşamasına geçtiği, hangi mekanizmalarla konakta hasara yol açabildiği konuları da önemini korumaktadır. Son yıllardaki çalışmalar, benzer soruları açıklar nitelikte verileri bildirmektedir. Böylece, kandidozda konağın savunma mekanizmasının ve kandidaya ait virulans faktörlerinin önemleri ortaya konulmuştur. Kandida virulans faktörleri ile ilgili çalışmalar, C. albicans prototipi üzerine yoğunlaştırılmıştır. C. albicans en sık görülen ve tıbbi açıdan en önemli maya türü konumundadır 19,20,21. İnsanların çoğunda, hayat boyunca kandidozlara karşı, doğal direnç vardır. Konak hücre hasarını kandidaların virulans faktörleri ile konak immün yanıtı belirlemektedir 22. Virulans faktörleri ise en iyi C. albicans türünde gösterilmiştir 23. Ayrıca kandidoz gelişiminde çok sayıda predispozan olumsuz faktörlerin varlığının da göz ardı edilmemesi gerekmektedir. Bu predispozan faktörler içinde sıklıkla ve uzun süreli olarak geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı, konağın immunolojik yanıtının azalması, immun baskılama (immunsupresyon), malignite için sitotoksik ve steroid verilmesi, 3

4 bazı metabolik ve endokrinolojik hastalıkların varlığı (diyabet gibi), gebelik, düşük doğum ağırlıklı bebek doğumu, lokal doku zedelenmeleri, tanı ve tedavi amaçlı tıbbi girişimler, öncelikli olarak, sayılabilmektedir 23,24,25,26,27. Büyük cerrahi girişimler, invaziv katater uygulamaları, HIV infeksiyonu fungal infeksiyonu arttıran diğer olumsuz koşullardandır 28,29,30. Kandidoz gelişiminde bu uygunsuz faktörler yanında, mantara ait virulans faktörlerininde birlikte değerlendirilmesi gerekir 31. Kandidaların virulans faktörleri arasında: 1.Enzimler: Salgısal asit proteinaz 4,32,33,34,35, Fosfolipaz 36,37,38, Esteraz 39,40 gibi enzimleri vardır. Kandida asit proteinazı, önemli virulans göstergesidir. Proteinaz sekresyonu ile aderens arasında kuvvetli bir korelasyonun varlığı saptanmıştır. Bu enzim epitelial dokulara kandidanın invazyonunu sağlamaktadır. Zira proteinaz pozitif kandidalar, daha zor fagosite edilmektedir. Proteinaz enzimi salan kandida türleri, vücutta pek çok koruyucu proteini de parçalayıp, kolayca invaze olmaktadır 41,42. Proteinazlı suşların daha virülan oldukları, invivo olarak da gösterilmiştir 43,44. Bu veriler C.albicans suşlarının proteinaz aktivitesinin özgül ve duyarlı bir patojenite kriteri olduğunu gösterir 43,44,45. 2.Toksinler 46 4

5 3.Fenotipik değişimler ve dimorfizm: Mayaların epitel hücresine tutunmasında, nötrofil kandidisal aktivitesine duyarlılık farklılıklarında, hidrofobisite ve proteinaz salgılanmasında fenotipik değişimler ve dimorfizm gibi özellikler etkin olmakta ve virulans faktörleri içinde yer almaktadır 4,47,48. 4.Hücre duvarı ve adezinleri: Kandida türlerinin virulansı, farklı hücre tipine adere olma yeteneği ile ilgili olup epitel ve endotel hücrelerine bağlanma adezinleri ile gerçekleşmektedir. Bunlar epitelial hücre glikoproteinlerinin fukoz kısımlarını tanıyan lektin benzeri hücre yüzey proteinleri, kompleman reseptör benzeri proteinler ve mannan olarak açıklanmaktadır 49,50. Adezyon kandida türü mayaların en önemli virulans faktörlerinden birisidir 51,52. Kalkancı ve ark 53 C.albicans ın vajinal epitel hücrelerine adezyonlarını göstermişlerdir. C. albicans epitel hücrelerine en çok adere olan türdür. Bunu C. tropicalis, C. stelloitedea, C. parapsilosis izler. C. krusei, C. guilliermondii, C. kefyr in adezyon etkinlikleri yok denecek düzeyde kalmaktadır 20,33. Kandida türleri hücreler arasında sentetik materyalede yapışma eğilimi içindedirler 54. Santral venöz kataterde biyofilm= slime faktörü oluşturan ilk üç mikroorganizma S. aureus, S. epidermidis, C. albicans olarak tanımlanmıştır 55. Ağızda kullanılan tüm akrilik protezler, yapay kalp kapakçık yüzeyler, kalıcı eklem protezleri kandida türlerinin tutunmasına uygun ortamları teşkil 5

6 etmektedir 55,56. Slime faktörü polisakkarit yapısında bir biyofilmdir 57,58. Çeşitli çalışma sonuçları slime faktörünün nonalbicans türlerde önemli bir virulans faktörü olduğunu ortaya koymuştur 59,60,61,62. Cevahir ve ark 63 C.albicans için slime pozitifliğini %36.1, albicans dışı kandidalarda ise %60.4 oranında vermişlerdir. Kalkancı ve ark 64 C.albicans için slime pozitifliğini %9.3, albicans dışı kandidalarda ise %20 oranında vermişlerdir. Yücesoy ve ark 65 C. albicans için slime pozitifliğini %10, albicans dışı kandidalarda ise %34 oranında vermişlerdir. Kandidalar ağız içi, barsak, üst solunum yolu, deri ve vajende hiçbir belirti göstermeksizin kolonize olduğundan insanın savunma mekanizmasının durumu kadar, kandida virulans faktörleride önem taşımaktadır. Bunun için, çeşitli klinik örnekler sağlanmış ve bu örneklerde, kandida izolasyonu ve identifikasyonu, yanında virulans faktörlerinden germ tüp ve klamidospor yapıları, serumda mannan antijeni, slaym faktörü ile asit proteinaz ve fosfolipaz enzimlerinin araştırılarak değerlendirimlerinin yapılması amaçlanmıştır. Bu amaçla birbirini izleyen aşamalardan oluşan bir program uygulamaya konulmuştur. 1.Klinik örneklerin sağlanması 2. Kandida spp. izolasyonu ve identifikasyonu 3. Kromojenik agarda koloni morfolojisi ve renginin değerlendirilmesi 6

7 4.Konvansiyonel yöntemlerle fermentasyon özelliklerinin ve API 20CAUX kiti ile asimilasyon özelliklerinin belirlenmesi 5. C.albicans ve non albicans tür dağılımının belirlenmesi, epidemiyolojik verilerin saptanması 6. Kandida türlerinde bazı virulans faktörlerinin belirlenmesi -Germ tüp yapısının incelenmesi -Klamidospor oluşumunun incelenmesi -Salgısal asit proteinaz enziminin araştırılması - Salgısal asit fosfolipaz enziminin araştırılması -Serumda mannan antijeninin araştırılması -Slime faktörü varlığının araştırılması Böylece bu çalışmada, çeşitli klinik örneklerden üretilen kandidaların tür dağılımını belirlemeyi ve bazı virulans faktörleriyle sağlık sorunları arasındaki ilişkiyi değerlendirmeyi ve bu amaca yönelik olmak üzere konu üzerindeki bulguları değerlendirmek istedik. 7

8 GENEL BİLGİLER 2.1.Tarihçe: Kandida türlerinin neden olduğu oral lezyonlar, Hipokrat zamanından beri dikkati çekmiş ve fungal ajanlar ilk kez 1839 da Langenbeck tarafından gösterilmiştir 28. Sabouraud Dextrose Agar (SDA), 1804 de dermatofitlerin kültürü için Fransız dermatoloğu Raymond Saboroud tarafından kullanılmıştır 66. Pamukçuk etkeni C. albicans üzerideki çalışmalar, 1842 de Gruby ile başlar. Berkhoud 1923 de ilk kez C. albicans terimini kullanmıştır. C. tropicalis ve C. krusei 1923 te, C. stellatoidea ve C. guilliermondii 1938 de izole edilerek, isimlendirilmiştir 67. Kandida spp. İlk defa 1853 de Robin tarafından kültürü yapılan maya mantarıdır. Mayanın morfolojisi tanımlandıktan sonra Castellani saf kültürünü yapmış ve biyokimyasal özelliklerini de inceleyerek Monilia albicans adını vermiştir. Hücre dışı proteinazı ilk olarak 1965 de Staib tarafından saptanmış ve üç yıl sonra, Remold ve Fasold enzimi saflaştırararak, tiplendirmişlerdir. Hücre zarı fosfolipitlerini parçalayan fosfolipaz enzimleri ilk kez, Werner (1966) ve Costa ile ark (1967) tarafından gösterilmiştir 68,69,70. Banno ve ark 70 ise 1985 de fosfolipaz B yi ekstrakte etmişlerdir. Plass ve ark 71 vulvovajinal kandidoz (VVK) lu olgularda çeşitli antifungal maddelerin kandidalara etkinliğini araştırmışlar ve nonalbicans kandida türlerinin %65 oranı ile en fazla flukanozole 8

9 direnç oranını saptamışlar ve flusitozin ve ketakonozole için en yüksek duyarlılık oranını elde etmişlerdir. Bu araştırıcılar, vulvovajinal kandidozun bilimsel temellerini 1931 de Monilia vulvovaginitis başlıklı yayınları ile atmışlardır. C. famata infeksiyon nedeni olarak nadir görülen bir maya türüdür. Torulopsis famata ve debaryomyces hansenii olarak da adlandırılan bu tür, süt ürünlerinde bulunmuştur 72. C. famata ilk kez 1922 yılında Japonya dan Saita tarafından bildirilmiştir 73. Bu mayanın kan kültürü izolatları da açıklanmıştır Genel özellikler Morfolojik özellikler Kandida cinsi mantarlar, tek hücreli, küre veya yumurta şeklinde-oval, silindirik olabilen 2-8x3-15 mm boyutlarında mikroorganizmalardır. Tomurcuklanma ile meydana gelen yavru hücre, ana hücrenin aynısıdır. Ancak ana hücreden ayrılır veya ayrılmaz. Ayrılmayı başaramayan hücre tomurcukları, yalancı hif şeklinde bir ağ meydana getirirler. Hif oluşturmayan tek tür C. glabrata, gerçek hif oluşturan tek tip ise C. albicans tır. Bu özellik germ tüp testi ile C. albicans diğerlerinden kolaylıkla ayrılır 2,75,76. C. albicans insan ve tavşan serumunda 2 saatte germ tüp (çimlenme borusu) oluşturmaktadır. Y fazındaki kandidalar ovoid, iki kutbundan çıkıntılıdır. Limona benzer 2, kapsülsüz, hareketsiz ve zorunlu aeropturlar 75,76. 9

10 Blastoconidia (Blastospor) yuvarlak, oval, uzamış şekillerde, yaklaşık 4-6µ büyüklüğünde vejetatif ana hücreden tomucuklanarak gelişen esas yapılardır 1,31. Klamidospor da C. albicans ın önemli bir özelliğidir. Klamidospor hiflerin ucunda, yanında veya ortasında hücrelerin kalın bir duvarla çevrilmesi sonucu oluşan ve C.albicans ayırıcı tanısında önemi bulunan yapılardır 1. C. albicans ve C. stellatoidea klamidospor yaparlar 2, 75. C. albicans ın maya formu, serumda birkaç saat içinde germ tüp (çimlenme borusu) oluşturmaktadır. Bu yapı ise daha sonra gerçek hife dönüşür. Bu dönüşümde kitin sentetaz enziminin rolü vardır 77,78. Mantarlarda mitoz ile gerçekleşen eşeysiz ve/veya mayoz ile gerçekleşen seksüel üreme görülür. Üremeleri esnasında vejetatif gelişmenin yanısıra, dış ortama dayanıklı eşeysiz ve eşeyli sporlarıda aynı anda oluşturabilirler. Tablo-1 de mantarların eşeysiz ve eşeyli sporlarının özellikleri açıklanmıştır 1. 10

11 TABLO-1: Mantarların eşeysiz ve eşeyli sporlarının özellikleri EŞEYSİZ SPORLAR ÖZELLİKLERİ SPORANGİYOSPOR Sporangium kesesinde gelişen spor (Zygomyceteslerde) BLASTİK KONİDİYUMLAR BLASTOSPOR Vejetatif ana hücreden tomurcuklanarak gelişen spor (Maya ve maya benzeri mantarlarda) KONİDİYOSPOR Tek hücreli, küçük, yuvarlak mikrokonidiyumlar (Dermatofit ve aspergillus türlerinde) TALLİK KONİDİYUMLAR ARTROSPOR Küçük köşeli sporlar (Dermatofit türlerinde) KLAMİDYOSPOR Hiflerin ucunda, yanında veya ortasında, hücrelerin kalın bir duvarla çevrilmesi sonucu oluşan sporlar (C.albicans ın ayırıcı tanısını sağlar) EŞEYLİ SPORLAR Zigospor Askospor Kalın ve çok tabakalı spor Mayoz ve mitoz bölünmelerle oluşan sporlar Bazidiyospor Hif oluşan bazidiyumdan meydana gelen sporlar 11

12 Çoğaltılma ortamları ve üreme özellikleri: Maya mantarlarının bölünme süreleri 30 dakika kadar olup, besiyerinde 24 saatte gözle görünür koloniler yaparlar Oksijen gereksinimlerine göre genelde, aeropturlar Optimal üreme ısısı: C dir Nemli ortaları severler ve nem oranı % olan ortamlarda iyi ürerler pH:6 da iyi ürerler. Optimal ph ise dir. Kandidaların morfogenezi Şekil-1 de açıklanmıştır 79. Şekil-1: Kandida türlerinin büyüme formları A: Tüm türler maya olarak büyür B:C.dubliniensis ve C.albicans gerçek hifte oluştururlar. C:Bir çoğu bazı tip psödohif oluştururlar 12

13 Besiyerleri ve üretilme teknikleri: Eküvüyonla alınan materyalin bozulma riski olmadığından, transport besiyeri kullanmaya gerek yoktur. Kandida lar Sabouraud dekstrose agar, Mısır unlu agar, Patates nişastalı agar besiyerlerinde kolay ürer 1,2. Bazı durumlarda bu besiyerlerine antibakteriyeller veya antifungal etkili sikloheksimid ilave edilir. -Kloramfenikol 50 mikrogram/ml li SDA veya sikloheksimidli besiyeri: Mycobiotic agar gibi sikloheksimid içeren besiyerinde üremeyenler ve SDA dakine göre çok çok az oranda üreme gösteren bir suş, sikloheksimide duyarlı kabul edilir. C. parapsilosis ve C. krusei türleri, sikloheksimide duyarlıdır. C. tropicalis ise değişkendir. -Sıvı saboroud dekstroz veya glukozlu buyyon besiyeri (SSDB veya SSGB): 13

14 Kandidalar genelde aerop olduklarından, sıvı besiyeri yüzeyinde zar yapmaya yönelirler. Sıvı besiyeri yüzeyinde, yüzey geriliminin de etkisiyle, zar veya hava kabarcığı oluşturup oluşturmadıklarına bakılır. Kandida suşlarının SDA daki üç günlük kültürlerinden SDB ye ekim yapılıp 3 gün 37 0 C de inkübasyondan sonra, sonuçlar değerlendirilir. C. tropicalis besiyerinin yüzeyinde ince zar ve hava kabarcığı oluşturması, C. krusei nin besiyerinin yüzeyinde üreyerek, kalın zar oluştuması önemlidir. Kandidaların diğer türleri, ise besiyerinin dip kısmında ürerler. Kandida lar çoğunlukla C de saatte, krem renginde hamur kıvamında koloniler yaparlar. Bu koloniler düzgün grimsi, beyaz-nemli görünüşlü, yumuşak ve peynir kokulu olup, eskidikçe buruşuk ve çok büyük görünümlü olurlar 2, Boyanma özelliği: Gram olumlu boyanırlar ve bakteri hücresinden daha büyük, oval hücreler halinde gözükürler. Gram boyamasında blastosporlar yanında, gerçek ya da yalancı hifler görülür 1,2,75, Kandida türlerinin çeşitli özellikleri: C. albicans: SDA da iki-üç günlük kolonileri hamur kıvamında, krem renginde ve maya kokuludur. Küremsi, oval biçimde gram pozitif boyanırlar. Sıvı saboroud glikozlu buyyonda kalın veya ince herhangi bir zar oluşturmaz. 14

15 C. tropicalis: 25 0 C de üç günde krem-beyaz renkte, maya kokulu, yumuşak kıvamlı koloniler yaparlar. Sıvı saboroud glikozlu buyyonda, yüzeyde ince bir zar ve küçük kabarcıklar oluşturur. C. kefyr: SDA da üç günde krem renginde, kıvamlı, düz, S şeklinde koloniler yapar. Sıvı besiyerinde uzamış hücreler şeklinde görülür. C. krusei: Yassı, kuru, donuk, kirli, beyazımsı, çevresinde miçelleri belirgin koloniler meydana getirir. SGA da üç günde koloniler belirginleşir. Sıvı saboroud glikozlu buyyonda yüzeyde kalın ve tüpün kenarlarına yükselen bir zar oluşturur. C. glabrata (torulopsis glabrata): SDA da 25 0 C de üç günlük kolonileri küçük,yuvarlak,kapsülsüz görülür. C.kefyr: SDA da üç günde krem renginde, kıvamlı, düz, S şeklinde koloniler oluşturur. Sıvı besiyerine uzamış hücreler şeklinde görülür. C. parapsilosis: 25 0 C de 3 günlük koloniler yumuşak, düz beyaz görünümde olup, S koloni tipindedir. C. guillliermondii: 25 0 C de üç günde oluşan koloniler ince yassı, parlak, krem renginde veya pembemsi görünümdedir. Sıvı besiyerinin yüzeyinde halka ve adacıklar oluşabilir. C. famata (Torulopsis famata): Gri, beyaz, düz veya hafif buruşuk koloniler yaparlar. C. utilis: SDA da düzgün, krem renginde koloniler yapar. Cornmeal agarda tipik dallanmalar ve silindirik blastosporlar yapar. 15

16 Besiyerinde 27 0 C de ve 37 0 C de ürer. Kolonileri, %0.01 sikloheksimidli besiyerinde duyarlı olduğundan, inhibe olur 80,81. C.utilis 30 0 C de 24 saatlik inkübasyondan sonra düzgün, krem rengi koloniler yapar. Germ tüp yapmaz. Mikroskobik incelemesinde ovoid hücreler şeklinde görülür. Dalmau yöntemi ile cornmeal inokülasyonundan sonra filamentöz-uzamış blastokonidiaları görülür. API 20 C AUX sistem ve ID 32 C Biomerieux sistemleri ile karbonhidrat asimilasyon - fermantasyon aktiviteleri gösterilebilmek tedir 80,81,82, Fermantasyon ve asimilasyon özellikleri: Asimilasyon bir karbonhidrat kaynağı veya maya azotu içeren sıvı ya da katı besiyerlerinde, 0 şekerin kullanılmasına bağlı olarak, ortaya çıkan üremenin, değerlendirimi ile anlaşılmaktadır. Kandida türleri kullandıkları şekerin etrafında, zon teşkil ederek ürerler ve besiyerinde bulanıklık oluşması, asimilasyon pozitifliğini yansıtır. C. albicans glukoz, galaktoz, maltoz, sükroz, trehaloz, D- ksiloz ve D-mannitolü asimile ederken laktoz, rafinoz, sellobiyozu asimile etmez. Bir karbonhidrat ve ph ayıracı bulunan sıvı ortamda, belli şekerlerden, asit ve gaz oluşturma özelliği fermentasyon reaksiyonları şeklinde ifade edilmektedir. Asit üretimine bağlı olarak ortam ph sı ve rengi değişir. Gaz oluşumu ise, durhaim tüpünde, gaz habbeciklerinin toplanması ile anlaşılır. 16

17 Mayaların identifikasyonunda asimilasyon ve fermentasyon deneylerine başvurularak, verilerin değerlendirimi yapılmaktadır 2, 31, 84, 85, 86. Bu testler kandida tür ayırımına da yardımcı olur 84, Ureaz aktivitesi: Bu test için Christensen üre besiyeri kullanılır. Besiyerinin renginin sarıdan kırmızıya dönüşmesi pozitiflik işaretidir. C. krusei de üreaz testi pozitiftir 75,76. Mayaların kültürel ve biyokimyasal özellikleri Tablo-2 de özetlenmiştir

18 Tablo-2:Mayaların kültürel ve biyokimyasal özellikleri Asimilasyon Fermantasyon Kandida Türleri Buyyonda zar teşkili Klamidospor oluşumu Germ tüp ouşumu Üreaz varlığı GLU MAL SÜK LAK GAL MEL SEL İNO KSİ RAF DUL GLU MAL SÜK LAK GAL C.albicans C.famata C.glabrata C.guilliermondi D - - C.krusei C. parapsilosis C.kefyr C.stellatoidea C.tropicalis Kromojenik agarda koloni morfolojisi ve renginin incelenmesi Kandidaların erken identifikasyonunun yapılabilmesi için, saatte tanıma yapabilen, kromojenik besiyerleri geliştirilmiştir Chromagar Candida Agar (CAC): Kandida suşları 90 mm petrilerde hazırlanmış ticari Chromagar besiyerine ekilerek, 35 0 C de, aerobik ortamda, saatlik inkübasyona bırakılır ve CAC daki renk değişikliklerine bakılır. (Resim-1). 18

19 Resim-1:CAC de kandida türlerinin görünümü C. albicans ve albicans dışı kandida türlerinin tanımlanmasını sağlayan seçici ve ayırtettirici bu besiyerinde gözlenebilecek renk değişiklikleri, Tablo-3 de özetlenmiştir 89,90,91. 19

20 TABLO-3: Kandidaların chromagar candida da üreme ve renk özellikleri CHROMAGAR KÜLTÜRÜ MAYA MANTARI GÖRÜNÜM RENK C. albicans Düzgün Yeşil C. tropicalis Düzgün Çelik mavi C. krusei Yassı, düz, kenarları beyazlaşmış, tüylü Toz pembe C. glabrata Yassı,düz, kenarları beyazlaşmış, tüylü Koyu pembe-mor C. parapsilosis Yassı,düz,kenarları beyazlaşmış,tüylü Parlak-beyaz C. guilliermondii Koloni yüzeyi kuru ve pürtüklü Pembe-leylak C. kefyr Koloni yüzeyi kuru ve pürtüklü Kirli beyaz renginde 20

21 Albicans ID 2 Agar: Kloramfenikol ve gentamisin antibiyotiklerini içeren, selektif bir besiyeridir. Hexosaminidase (Hekzozaminidaz) enzimi için kromojenik substrat olan Hexosamin (Hekzozamin) ihtiva eder. Bu kromojenik substratın, 37 0 C de 48 saatte hidroliz edilmesi prensibine dayanır. Tablo-4 de Albicans ID 2 besiyerinde kandida renkleri özetlenmiştir 91. Tablo-4:Kandidaların, Albicans ID 2 besiyerinde pigment- renk özellikleri KANDİDA TÜRLERİ CANDİDA ID 2 KÜLTÜRÜ C. albicans Mavi pigmentli C. dublininensis Mavi pigmentli C. tropicalis Çoğu kez pigmentsiz-beyaz ve bazen Mavi pigmentli koloniler yaparlar. Albicans dışı diğer Renksiz, beyaz türler 21

22 Biggy Agar Kromojenik bir besiyeridir. Bu besiyerinde renklendirici olarak Bismuth amonium sulphide vardır. Mayaların bismuth sulphidi, ekstrasellüler olarak etkileyerek, koyu renkli koloniler meydana getirirler. Kandidalar, Biggy Agar da kahverenginden siyaha giden pigmentli ve çevresi siyah çöküntülü koloniler yaparlar. Bu besiyerinde özellikle C. albicans, C. tropicalis, C. krusei ve C. kefyr identifiye edilebilir. Ancak kandida tür dağılımının belirlenmesinde, Biggy Agar tek başına yetersizdir. Kandidaların Biggy Agar da üreme, koloni ve renk özellikleri Tablo-5 açıklanmıştır. Bu kolonilerin Biggy Agarda görünümleri ise, Resim-2 de gösterilmiştir 92. Resim-2: Kandidaların Biggy agarda görünümleri 22

23 TABLO-5: Biggy agar da kandidaların üreme- koloni ve renk özellikleri KANDİDA TÜRLERİ ÜREME VE DİĞER ÖZELLİKLERİ C. albicans Düzgün, yuvarlak, kahverengi-siyah,mat, hafif çıkıntılı, besiyerine renk değişimi yapmayan koloniler, Koyu kahverengi C.albicans kolonilerinin çevresinde sarı bir zon bulunabilir. C. tropicalis Kahverengi veya koyu kahverengi- sarı zonlu koloniler. Düz, koyu kahverenkli ve siyah merkezli, hafif çıkıntılı. Besiyerine 72 saate siyah yayılım yapan koloniler oluşturur. C. dublininensis Koyu kahverengi- sarı zonlu koloniler. C. krusei Açıktan koyu kahverengine giden, zonsuz koloniler. Geniş, buruşuk, gümüşi- kahverengi, siyah merkezli ve kahverengi çevrelenmiş besiyerine sarı halka yapan koloniler C. kefyr Kırmızıdan- kahverengine giden, sonsuz koloniler. Orta boyda düz hafif, düzensiz kenarlı, yayılım yapmayan koloniler oluşturur. C. parapsilosis Koyu kahverengi- sarı zonlu koloniler. C. guilliermondii Kahverengi- sarı zonlu koloniler. C.stellatoidea Orta boyda, düz, hafif düzensiz kenarlı, koyu kahve, hafif çıkıntılı koloniler 23

24 2.2.3.Hücre yapısı: Y fazındaki kandidaların sitoplazmaları etrafında bir hücre membranı ve kalın bir hücre duvarı vardır. Hücre duvarı çok tabakalıdır (3-6 tabaka). Beta (B)- glukan ihtiva eden mikrofibriller demetlerle çevrilidir (Fibriller network= fibriller ağ) hücre duvarındaki mannoproteinler ve diğer proteinler için matrix görevini üstlenir 2. Mantar hücresinde içten itibaren nükleus ve organelleri içeren sitoplazma, sitoplazma zarı ve en dışta hücre duvarı bulunur. Hücre zarı (membran) iki tabakalı bir zardır. Sıvı ve besinlerin diffüzyonunu, aminoasit ve şekerlerin geçirgenliğini kontrol eder. Fosfolipit ve ergosterol ihtiva eder. Sitoplasmada nükleus zarı ile çevrili birden fazla nükleus vardır 1. C. albicans ın hücre duvar yapısı, Şekil-2 de gösterilmiştir 1. Kandida hücre duvarı tabakalarının kalınlığı, nanometre (nm) olarak, Şekil-3 de verilmiştir 93. Hücre zarının üç boyutlu halini ise, Şekil-4 yansıtmaktadır

25 Şekil-2: Kandida albicans ın hücre duvar yapısı Şekil-3: Kandida hücre duvarı tabakalarının kalınlığı 25

26 Şekil-4: Hücre zarının üç boyutlu hali Hücre duvarı: Elektron mikroskobisinde dış yüzeyi fibriller, iç yüzeyi düz yapıda görülür. Fibriler tabaka plastik yüzeylere ve diğer ökoryotik hücrelere tutunmayı sağlar. Hücre duvarının kuru ağırlığının %80-90 ı karbonhidratlardan, %10-20 si protein ve glikoproteinlerden oluşur. Karbonhidratlarını, Mannan, glukan, kitin, kitozan polimerleri oluşturur. C.albicans ın karbonhidrat içeriğinin %40 ı mannandır. C. albicans hücre duvarında ısı şok proteinleri, glikolitik enzimler ve laminin de vardır 1. 26

27 C. albicans ta hücre duvarı esas itibariyle: Mannoprotein: %20-23, Beta glukan:%48-60, Protein:%3-6, Lipit: %2, Kitin: % den oluşur. Mannoprotein en dış tabakada yer alır. İç tabaka ise kitin ve beta 1,6 glukandan zengindir. Bu yapı hücre duvarına sağlamlık ve sertlik verir 84,95,96,97, Hücre zarı Hücre zarının lipit ve protein molekülleri birbirlerine nonkovalen bağlarla bağlanır. Lipit molekülleri amfibiliktir. Yani hidrofilik (su seven / polar), hidrofobik (su sevmeyen / non-polar) uçları vardır. Hücre zarı lipitlerinden en fazla bulunan fosfolipit lerdir. Hücrenin yüzeyinin hidrofobik özelliği önemlidir 97,98,99, Antijenik yapı: C. albicans ın hücre duvarında, güçlü antijeniteleri olan üç yapı vardır (2). 1. Mannoproteinler: Şekere bağlı proteinler 2.Kitin: Hücre duvarına sertlik veren protein, 3. Beta glukan: Fibriler ağı oluşturan yapıdır. Hücre duvarının membrana bakan yüzeyinde Con A adı verilen reseptörler vardır. Sitoplazmik membranın hemen altından, periplazmik boşluğa salınan enzimler bu resptörlere tutunarak kitin yapıyı gevşetmek ve sitoplazmik genişlemeyi kolaylaştırmak üzere litik etki gösterirler. Con A reseptörleri sadece tomurcuklanmanın 27

28 olacağı bölgede yer alırlar. Con A reseptörlerine tutunan litik enzimler: a.zymoliaz: Kandida hücre duvarında bulunan mannoproteinler, alkalide çözünebilir yapıdadır ve fibriler ağa kovalent bağlarla tutunurlar. Zymoliaz enzimi fibriler ağı oluşturan B-glukanı ve buna bağlı olan mannoproteinleri birbirinin eşiti olmayan 2 parçaya ayırır kda ağırlığında mannoprotein kda ağırlığında mannoprotein Bunlar serbest kalarak konak dokuya yayılırlar. 260 kda ağırlığında mannoprotein 180 kda ağırlığında mannoproteinin prekürsörüdür. Geriye kalan protein artifaktlar minor antijenlerdir. Her birisi 50 kda dan hafif en az 4 polipeptid antijen şeklindedirler. b.kitinaz: Hücre duvarında bulunan ve glukana glikosidik bağlarla tutunmuş olan kitini parçalar 2. Fibriler ağın yapısında olan bu madde, zymoliaz ile yerinden koparıldığında, alkali de çözünen, asitte çözünen (1-6 beta polimer) ve hiçbirinde çözünmeyen (1,6-B ve 1,3-B polimer) olmak üzere üç farklı tipte olarak konak dokuya yayılır. Konak doku için özellikle çözünmeyen glukan kuvvetli antijenik etki gösterir. Mannoprotein ve glukan antijenleri, kandida immunolojisinde önemli yer tutar. Bunlara karşı oluşan özgül IgG antikorlarının 28

29 koruyuculuk değeri vardır. Kandidozda ilk oluşan antikorlar T hücrelerine bağımlı olarak kandida yüzeyindeki mannoprotein ve glikoproteinlere karşı gelişir Virulans ve kandida türlerinde virulans faktörleri: Normal koşullarda kommensal flora, kandidaların bağlanma (Aderens) bölgelerini azaltmaktadır. Endojen mikroorganizmalar ve mukozal defans, kandidanın tutulumunu ve kolonizasyonunu önlemektedir. Kandidalar aynı florada bulunan bakterilerle belirli bir antogonizma içinde yaşamaktadır. Bakteri sayısında ve çeşitliliğinde bir azalma kandidaların florada baskın duruma geçmesine neden olup, Bakteriyel diskordans başlatabilir. Konakçı-kandida ilişkisi oldukça karmaşık olup, bir dizi faktörün etkinliği söz konusu olmaktadır. Kandida türlerinin virulansı ile ilgili faktörler aşağıda özetlenmiş bulunmaktadır 2,101,102,103. Bunlar, 1.Miçelyum (Hif) yapımı (Maya-hif dimorfizmi) 2.Fenotipik değişim 3.Adezinleri ile konak hücre yüzeyine tutunma 4.Toksin ve hidrolitik enzimlerin etkinliği 29

30 5.Hücre duvar yapısı 6.Fagositoza direnç gösterme Hifler, kandidial bir lezyonu ya da önemli bir kolonizasyonun varlığını yansıtır 77. Germ tüple dokulara yayılım olmakta ve blastospora dönüşümle, fagositlerin yenilgiye uğratılmasına çalışılmaktadır Adezyon: Dokulara kolonizasyon için, ana basamak, adezyondur. C. albicans ın, epitel ve endotel hücrelere, fibrin ve platelet matrikslere, nötrofillere ve farklı konak yüzeylerine tutunma yeteneklerinin bilinmesi infeksiyon patogenezini anlamak için faydalıdır 33. Kandidiyal mannoproteinler, bukkal ve vajinal hücrelere tutunmayı düzenlemede önemli olan adezinlerdir. Vajinal epitelyum hücrelerinin yüzeyindeki veya ekstasellüler matriksteki fibronektinde kandida için reseptör olarak davranmaktadır 49, Maya-hif dimorfizmi: C. albicans ın hifal fomu virulansla ilgilidir. 30

31 Fenotipik değişimler: Bu değişiklikler, kandidoz gelişiminde doğrudan etkin olmaktadır Germ tüp yapımı: Germ tüp yapan kandidalar dokulara daha çok ve daha hızlı yayılım göstermektedir Klamidospor oluşturma: C. albicans klamidospor oluşturan türdür. C. dubliniensis dışında, diğerleri, klamidospor oluşturmaz Kandida toksinleri Kandida enzimleri: C. albicans ın sekrete ettiği proteinazlar peptid bağlarını hidrolize ederken, fosfolipazlar fosfogliseridleri ve lizofosfolipazlar lizofosfogliseridleri hidrolize ederler 103,104, Kandida asit proteinazı: Proteinazlar, asit ph da (ph:2.5-4) aktivasyon göstermesi ile asit proteinaz, çok miktarda aspartik asit rezidüleri içerdiğinden aspartat proteinaz ve pepstatin A ile inhibe olduğundan karboksil proteinaz gibi isimlerle anılırlar. Patojen kandidalar 31

32 tarafından salınan proteinaz, vücuttaki pek çok koruyucu proteini parçalayarak mayanın invazyonunu kolaylaştırmaktadır 98,106,107, 108. Proteinazlar, bazı biyokimyasal farklılıkları olan izoenzimlerdir ve patolojik aktiviteleri bakımından farklılıkları olmadığından Asit proteinaz adı altında toplanmışlardır. Bu enzim glikoprotein yapısında olup N ucunda triptofan ve C ucunda lösin bulunan bir polipeptid zincirine sahiptir. Proteinaz hem hücre dışına sekrete edilen hemde daha patojen kandida suşları tarafından baskın olarak ifade edilen, hücre duvarı ile ilişkili, aspartil proteinaz şeklindedir 33. Bu enzim üretiminin en çok olduğu kandida kökeni, C.albicans olarak açıklanmıştır. C.tropicalis ve C.parapsilosis kültür filtratlarında proteinaz enzimi saptanmıştır. Proteinaz salınımı sadece C.albicans ta vardır. Diğer iki türde ise, salınım olmaksızın sığır albuminini parçalamaktadır 87,109,110,111. Kandida asit proteinaz enziminin fiziksel ve kimyasal özellikleri Tablo-6 da açıklanmıştır 35,112,113,114 32

33 Tablo-6: Kandida asit proteinazının fiziksel ve kimyasal özellikleri Moleküler Ağırlık kda Optimal ph (4-4.5) İzoelektrik nokta 4.4 Isı stabilitesi 50 C ph duyarlılığı 7.5 de inaktive ve denatüre olur. Pepstatin A %15-93 inhibisyon Chymostatin %23-46 inhibisyon EDTA Etkisi yok Alfa2-Makroglobulin(10-100mikrogram/ml) ph:4 %23-35 inhibisyon ph:6.8 %27-95 inhibisyon Substrat duyarlılığı Aktivite inhibisyonu Kollagen (Denatüre) Duyarlı (ph:4.5) Keratin (Azure) Etki yok (ph:3.5) Bovine keratin Duyarlı (ph:4.5) Bovine serum albumin Duyarlı (ph: ) Hemoglobin Duyarlı (ph:4.5) Kazein Duyarlı (ph:4.5) 33

34 Kandida asit proteinazı IgM, IgA1, IgA2 ve siga yı parçalar. Bu immunoglobulinlerin (Ig) ağır zincirlerini parçalayan proteinaz, sadece IgM de hafif zincirini de birlikte parçalamaktadır 104,106,115. Asit proteinaz enziminin tripsinojen aktivitesi vardır. Proteinaz prokoagülan madde olarak işlev görmekte ve faktör X bu enzim aktivitesine duyarlı hale gelmektedir 115,116. Ruechel ve ark 115,116 C. albicans ın anjiotensin-1 ve serin proteinaz ürettiklerini bildirmişlerdir. Bunlar invitro koşullarda koagülasyon faktörü IX ve X un bir konvertazı olarak davranmakta ve renine benzer bir aktivite koymaktadır. Kandida asit proteinazı (CAP) hem invitro olarak, hem de invivo olarak vazoaktif bradikinin üretimi ile plazmakinin sistemini aktive etmektedir. Faktör XII Hageman faktör ünün sınırlı proteolizi ile prokoagülan etki ortaya çıkmaktadır 33. Epidemidisin en üst tabakasında bulunan ve savunma işlevi olan epidermal sistein, kandida proteinazı tarafından yıkılmaktadır 117,118,119. Bu enzim invivo koşullarda da salgılanarak, antikor oluşturmaktadır. Kandidozlu kişilerde bu antikor titreleri sağlıklı bireylerinkine göre daha yüksek olmaktadir 110,116, Kandida fosfolipaz enzimi: Fosfolipaz enzimi, hücre dışı salgılanan ve virulans faktörü olan bir enzimdir. Schimizu ve ark 120 izole ettikleri C.albicans suşlarının %73 ünün hyaluronidaz, kondroidin sulfataz, proteinaz ve fosfolipaz ürettiklerini saptamışlar ve dört enzimi de bulunduran suşların, fare deneylerinde, %100 mortaliteye neden olduğunu 34

35 göstermişlerdir. Enzimlerden herhangi birinin eksikliğinde virulansın azaldığını ve proteinaz üretmeyen suşların, fosfolipaz üretmeyenlere göre, virulanslarının daha az olduğunu görmüşlerdir. Fosfolipaz aktivitesinin varlığı ilk olarak lesitin içeren vasatta üreyen C.albicans ta gösterilmiştir. Arslan ve Fındık 35 ın yumurta sarılı agarda fosfolipaz varlığını araştıran çalışma sonuçları, fosfolipaz pozitif ve negatif suşların görünümü şeklinde, Resim-3 de verilmiştir. Resim-3: C.albicans ın yumurta sarılı agardaki fosfolipaz pozitif ve negatif suşların görünümü Esteraz enzimi: Kandida türlerinin esteraz aktivitesi, tween 80 opasite testi ile gösterilmektedir 38,39,40. Çeşitli kandida türleri tarafından salgılanan esteraz enzimi besiyerindeki tween i hidrolize edebilmekte ve açığa çıkan yağ asitleri kalsiyum ile bileşikler oluşturarak inokülasyon bölgesinin etrafında görünür bir hale meydana getirmektedir 119,121,

36 Slaym faktörü (Kandidial biyofilm): Biyofilm, canlı veya cansız bir yüzeye yapışarak, kendi ürettikleri polimerik yapıda jelsi bir tabaka içinde, yaşayan mikroorganizmaların oluşturduğu, bir topluluk şeklinde tanımlanabilmektedir. Bu bağlanma geri dönüşümsüzdür. Mikroorganizmalarca sentezlenen ekstrasellüler polisakkaritler, koruyucu şeklinde bir yapı oluştururlar. İlk kez 1982 de Christensen tarafından Staphylococcus epidermidis (S.epidermidis) için tanımlanan slime faktörü, protein hekzosaminler, nötral şekerler ve fosforlu bileşikler gibi bir çok maddenin oluşturduğu karışık bir yapıdır. Glikokaliks yapısında hücre dışı bir oluşumdur 123. Slaym (Slime) faktörü, kandida ların biyomateryallere, prostetik aygıtlara, plastik araçlara, dış yüzeylere yapışmadan büyük ölçüde sorumlu tutulur. Katater yüzeyinde oluşan fibrin, fibronektin ve slaym faktörünün birlikte oluşturduğu biofilm tabakası içinde, C. albicans ın varlığı gösterilmiştir Kandidozlarda bazı risk faktörleri: İnvaziv kandidozlar, immun direnci kırılmış olanlarda, mortalite ve morbiditenin önemli nedeni olmaya devam etmektedir. Kanser kemoterapisi ve organ nakillerindeki artışlarına paralel 36

37 olarak, kandidemiler ve sistemik kandidozlar daha da çoğalmıştır 32,122. İmmunosupresif ilaç kullanımları da risk altındaki hasta populasyonlarını ve dolayısıyla maya infeksiyonlarını artırıcı etki yapmaktadır 30,125. Hematolojik maligniteli olgularda ki infeksiyon riski, doğrudan granülosit sayısı ile ilişkiilidir. Granülosit sayısı 500/ml altına düşmeye başladığında, infeksiyon insidansı yükselmeye başlar, 100/ml altına düştüğünde çok ciddi ve bakteriyemi ile seyreden infeksiyonlar gelişir. Lenfomalı ve lösemili hastalarda kandidoz riski, granülosit sayısı kadar, hastanede yatış süresi ile ilgilidir. Bu risk hastaneye kabulde en az oranda iken, hastanede yattığı süre boyunca, giderek artmakta ve hayatı tehdit eder hale gelmektedir. Kandida türleri hastanede yatan hastalarda, sistemik ve lokal infeksiyonlara neden olan, çok yaygın bir patojendir lerde büyük eğitim hastanelerinde %500, küçük eğitim hastanelerinde ve diğer hastanelerde % gibi büyük oranlara ulaşan nozokomial kandidoz sıklığı saptanmıştır 126,127,128. Kandidoz gelişiminde, a. Normal vücut florasının bozulması (Uzun süreli geniş spektrumlu antibiyotik kullanımı ve kemoterapi) b. Mekanik bariyerlerin bozulması ve çeşitli obstruktif durumlarda (Bronş, prostat karsinomları, safra yolları tümörleri) c. Medikal uygulamalar (İdrar sondası, venöz kataterler, bulaşlı damar içi inflüzyon setlerinin kullanımı, kemik iliği 37

38 aspirasyonu gibi) d. Hücresel ve hümoral immunite bozukluğu, malnütrisyon, fagositoz fonksiyon defektleri gözardı edilemeyecek önemli risk faktörleridir 127,128, 129,130,131. Endojen ve eksojen bu konak risk faktörleri, Tablo-7 de özetlenmiştir. TABLO- 7: Kandida infeksiyonları için endojen ve eksojen faktörler A.ENDOJEN FAKTÖRLER B.EKSOJEN FAKTÖRLER Aşırı kilo veya kaşeksi Diyabet Dejeneratif hastalıklar Kronik infeksiyonlar Fiziksel ve kimyasal travma Radyasyon uygulaması Aşırı stres Kötü beslenme Kanser Uykusuzluk Dünyada sık görülen enfeksiyonlardan olan vulvovajinal kandidoz (VVK), her 4 kadından 3 ünü ömründe bir kez veya daha fazla etkilemektedir. 38

39 Vulvovajinal kandidoz içinde bazı risk faktörleri : Oral kontraseptifler: Oral kontraseptif kullanımı vagen sıvısının glikoz kontrasyonunu artırarak, kandida kolonizasyonunu sağlar. Oral kontraseptif kullanmayanlarda ph: iken, kullananlarda ise ph: bulunmuştur. C.albicans varlığında ph üç katına çıkar Gebelik: Gebelik, maya vulvovajinitleri için predispozan faktördür 132. Gebelik ilerledikçe, kandida kolonizasyon oranı, artmaktadır Diyabet veya glukozdan zengin diyetle beslenme Geniş sprektrumlu antibiyotik, kortikosteroid ve sitostatik ilaç kullanımı Radyoterapi İmmunolojik yetmezlik Sık sık vajina lavajı ve travma sayılabilir Cinsel bulaş 39

40 Kandidozun patogenezi: Giriş kapısı: Lösemi ve lenfomalarda infeksiyona neden olan mikroorganizmaların çoğu vücutta bulunan mevcut floradan kaynaklanmaktadır. Nötropenik hastalarda farenks, dolayısıyla akciğerler ve rektal bölge, çoğunlukla, infeksiyon kaynağı olarak kabul edilebilir. Ayrıca intravenöz sıvı veriş yerleri, üriner kataterler, nazotrakeal kataterler, trakeostomi kanülleri, beslenme kataterleri, kan transfüzyonları mikrorganizmaların giriş kapıları ve hazırlayıcılarıdır Kandidoz gelişimi: Kandida lar deri lezyonları yanında, ağız, vulva, vajen, akciğer, sindirim sistemi, kalp ve böbreklerde de enfeksiyon oluşturmaktadır. Kandidaların üremesi için ortamda glukoz, demir, ph düzeyi ve diğer mikrorganizmaların varlığı etkin olmaktadır. C.albicans ın diyabetlilerin tükrüğünde daha rahat ürediği gösterilmiştir. Demir de önemli bir faktördür. Seruma demir eklenmesi, bu mikroorganizmaların üremesini, hızlandırır. Kandidoz patojenezisinde germ tüp ve hif geliştirmesinin yanında, endotoksinleri, epitel hücrelerine ve akrilik yüzeylere yapışma, insan fibrinojenini bağlama özellikleri, pekçok hücre içi ve salgısal enzimleri, patojenite de rol oynamaktadır

41 Proteinaz ve fosfolipaz enzimlerinin yapımı, doku hasarı penetrasyon ve dokuda inflamatuar yanıta yol açmaktadır. Bu arada asidik metabolitlerde doğrudan mukozal yüzeyleri irrite etmektedir. Fosfolipazların aktivasyonu ile hücre membranları tahrip edilmektedir Epidemiyoloji: Vulvovajinal kandidoz sık görülen bir hastalık olup, tüm vulvovajinitlerin %30 unu oluşturur 134,135. VVK da, birinci sıradaki etken, C. albicans tır. Hilmioğlu ve ark 136 VVK etkeni olarak saptanan 106 kandida kökenini, C. albicans 45 (%42.5), C. glabrata 44 (%41.5), C. tropicalis 10 (%9.4), C. krusei 5(%4.7), C. kefyr 2(%1.9) dağılımında bulmuşlardır. İlkit ve ark (137) VVK lı olgulardan, 72 kandida kökeni soyutlamışlar ve C. albicans 38(%52.8), C. glabrata 23 (%32), C. tropicalis 5(%6.9), C. krusei 5(%6.9), C. lipolytica 1(%1.4) dağılımını elde etmişlerdir. Aşcı ve ark vajinal akıntı örneğinden 246 sında (%13.5) kandida izole etmişler ve bunlardan 100 tanesinde tür ayırımı yapmışlar: C. albicans 58 (%58), C. tropicalis 16 (%16), C. krusei 12 (%12), 6 (%6) C. kefyr, 5 (%5) C. glabrata, 3 (%3) C. parapsilosis saptamışlardır. Aydın ve ark vajinal sürüntü örneğinden 47 sinde (%11.7) maya varlığını belirleyerek, C. albicans 16(%34), C. tropicalis 10 (%21.2), C. glabrata 7(%14.8), C.pseudotropicalis, 5 (%10.6), C. krusei 2 (%4.2), C. guilliermondii 1 (%2.1), C.stellotoidea 1 (%2.1), S. cerevisae 5(%10.6) tür dağılımını belirlemişlerdir. 41

42 VVK, her yaşta görülmekle birlikte cinsel etkinlik dönemindeki kadınlarda daha sıktır 140,141. Erişkin kadınların %75 inin yaşamları boyunca en az bir kez kandida vulvovajiniti geçirdiği bildirilmiştir 142. Mantar vajinitleri çocuklarda ve yaşlılarda daha seyrektir. Tümbay ve ark 17 vulvovajinal kandidoz olgularının %69.8 ini doğurganlık çağındaki kadınların oluşturduğunu bulmuşlardır. Cengiz ve ark 18 en yüksek prevalansı yaş grubunda bulmuşlardır Kandidoz kliniği: Kandidozlar yüzeyel ve derin şeklinde iki bölüm halinde incelenmektedir. Bu ayrımın alt grupları ise, Tablo-8 de özetlenmiştir 143,144. Tablo-8: Kandidoz kliniği 1.Yüzeyel kandidozlar 2.Derin kandidozlar Kutanöz infeksiyonlar Orofaringeal infeksiyonlar Göz ve kulak infeksiyonları Vulvovaginitler Lokal infeksiyon Gastrointestinal sistem kandidozu Üriner sistem kandidozu Peritonit Artrit 42

43 Yüzeyel kandidoz: Kutanöz infeksiyonlar: Yüzeyel kandidoz genellikle vücudun nemli kısımları olan koltuk altları, kasıklar, intergluteal bölge ve göğüs altı gibi bölgelerinde ortaya çıkar 143. Özalp ve Yuluğ 144 yüzeyel mikoz tanılı 206 olgudan 20 sinde kandida ve bunların 11 inin C. albicans olduğunu bildirmişlerdir VVK: Kaşıntı ve vajinal akıntı bulgularını verirken, perianal kandidoz ise anüs ve çevresinde kaşıntılı, beyaz ve masere lezyonlar göstermektedir Onikomikoz: Tırnak çevresi lezyonlarıyla tanınır Intertrigo: Koltuk altı, meme altı, göbek çevresi ve kasıklarda, eritamatöz lezyonlar yapmaktadır Derin kandidozlar: İmmun defektli bireylerde, fungemi sonrası tüm organları tutabilen kandidalar endokardit, menenjit, pnömoni, pyelonefrit, özofajit ve sistit klinik tablolarını, oluşturabilmektedir Oral kandidoz kliniği Akut pseudomembranöz kandidoz (pamukçuk) Akut atrofik kandidoz Kronik atrofik kandidoz 43

44 Kronik kandida keliosis i (perleş) Protez stomatitleri : Ağızda mevcut iltihablı alan Newton sınıflamasına göre, üç klinik şekilde görülür 145 : Pin-point hiperemi: Küçük iltihablı sahalar, kazımakla ağrı yapmaz Diffüz hiperemi: Geniş iltihap alanı ve eritem vardır. En ufak travma bile ağrı yapar, mukoza kanar Granüler hiperemi: Mukoza kıpkırmızıdır. Kanar ve ağrılıdır. Ergüven ve ark 146 protez stomatitli 31 hastadan 11 inde C.albicans ürettiklerini bildirmişler. Mısırlıgil ve ark 147 protez stomatitli olgulardan %76 C.albicans, %9 C.tropicalis, %7 C.krusei, %2 C.kefyr, %1 C.guilliermondii, %1 C.stellotoidea, %1 C.gastricus izole etmişlerdir Diğer kandidozlar: Burun ve paranazal sinusların mantar infeksiyonları enderdir. Aytimur ve ark 148 maksiler sinuzitli 30 olgudan 8 inde kültürde C. albicans ürettiklerini bildirmişlerdir. Diabetli olgularda mantar infeksiyonlarının önemi büyüktür. Öztürkcan ve ark 149 diyabetik 52 hastanın dil sürüntüsünden, 33 ünde, kandida üremesi saptamışlar ve 21 inin C. albicans olduğunu bildirmişlerdir. 44

45 Laboratuar tanı: Klinik örneklerden mayaların tanısında, genellikle 3 farklı yol izlenmektedir Direkt preparat: Direkt mikroskopide maya hücreleri, yalancı ve gerçek hifler, %20 KOH ve gram boyaması ile görülebilirler. Kandidalar oval, kapsülsüz, hareketsiz, gram pozitif mikroorganizmalardır Kültür:Saboroud dekstroz agar (SDA) en sık kullanılan besiyeridir. Kandida cinsi mantarlar, aerop koşullarda, 26 0 C de ve/veya 37 0 C de SDA da 1-2 gün inkübe edildiğinde mayamsı kokulu hamur kıvamında, kirli beyaz ve krem renginde koloniler oluşturur (Resim 4-5). Resim 4-5: SDA da görülen mantar kolonileri 45

46 Serolojik yöntemler: İnvaziv mantar infeksiyonlarının tanısında, serolojik çeşitli yöntemlerden yararlanılmaktadır. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) testleri üzerindeki çalışmalara da ağırlık verilmektedir. Bu arada galaktomannan antijen testi ve beta glukan testi son yıllarda rutin tanı yöntemleri arasına hızla girmektedir. Kandidemili olgularda, ateşin yükseldiği sırada kan örneği PBact/ Alert sistemi ve Pediatric plus F hemokültür besiyeri: BACTEC(9050 B-D) kullanılmaktadır. İnkübasyon için 10 gün bekletildikten sonra SDA ve koyun kanlı agar pasajları yapılır, maya kolonileri belirlenir ve API 20 C AUX asimilasyon testi ile, tür tesbiti yapılır. Şekil-5: API değerlendirme fomları 46

47 3.GEREÇ VE YÖNTEM: Bu çalışma Ocak 2007 Ekim 2008 tarihleri arasında, hastanelerin çeşitli Ana Bilim Dalı klinik ve poliklinikleri nde yürütülmiştür. Bu amaçla: Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı, Çocuk Sağlığı ve Hastalıkları Ana Bilim Dalı, İç Hastalıkları Ana Bilim Dalı- Hematoloji Bilim Dalı, Deri Hastalıkları Ana Bilim Dalı, Cerrahi Ana Bilim Dalı- KBB Bilim Dalı, Radyolojik Onkoloji Bilim Dalı, Yoğun bakım üniteleri polikliniklerine başvuran, ayaktan ve kliniklere yatırılarak tedavileri yapılan hastalar içinden, bir grup, incelemeye alınmıştır. Bu hastaların düzenli kayıtları için Tablo-9 da olduğu gibi (FORM) hazırlanmıştır. 47

48 Tablo-9:Hasta formları Hastanın Adı-Soyadı: Yaşı: Cinsiyeti: Mesleği: Adres ve telefon: Sağlık sorunu: A.Vajinit: -Vajinal akıntı: -Vajinal kaşıntı: -Diğer: B.Glossit-stomatit: -Boğaz ağrısı: -Yutma güçlüğü: -Ateş: -Diğer C.Hematojenik malignite -Nötropeni -Enterit -Ateş: -Diğer D.Organ transplantasyonu E-Dermatit F-Diğer HASTANIN BAŞVURDUĞU BİRİM Klinik Poliklinik TANI: SONUÇ (MİKOLOJİK): Hastalara ilaç kullanıp kullanmadığı, radyoterapi-kemoterapi uygulaması yapılıp yapılmadığı ve kadın hastaların oral kontraseptif kullanım durumları ile gebelik varlığı titiz şekilde 48

49 sorgulanmış olup, ilgili forma ayrı ayrı kayıt edilmiştir Klinik örneklerden izolasyon ve identifikasyon: Hastanın öz ve soy geçmişi, sağlık sorununu yansıtan bilgileri içeren ve uygulamalarımıza yönelik işlemleri yansıtan formlar doldurularak, kuru-steril eküvüyonlarla sağlık kuruluşunun ilgili birimlerine gidilmiştir. Çalışma grubumuza giren hastalar uzmanlarca değerlendirilmiş ve hasta başında, klinik örnekler elde edilmiştir. Klinik örnek elde edilmesi: a. Vajinal akıntı, kaşıntı ve yanma yakınmaları olan ve VVK olduğu düşünülen olgulardan, kuru-steril spekulum kullanılarak, vajina arka forniksinden sürüntü örneği alarak ve bekletmeden laboratuvara ulaştırıldı. b. Boğaz sürüntüsü için eküvyonlar, her iki tonsilla ve farenks arka duvarına sürüldükten sonra, ağız mukozası ve tükrükle temas ettirmeden, besiyerli tüpe konarak incelenmeleri için, laboratuvara getirildi. Benzer şekilde kulak akıntısı, steril koşullarda orta idrar, apse materyali, deri sürüntüsü- kazıntısı örnekleri de sağlanmıştır. Bunlardan kandida izolasyonu ve virulans faktörleri belirlenirken, Sabouraud Dekstroze Agar (Difco), Cornmeal agar ( Salubris), Chromagar candida (Salubris),Mycobiotic Agar (Difco) besiyerleri, proteinaz aktivitesinin incelenmesinde Sığır serum albümin agar, fosfolipaz aktivitesinde ise yumurta sarılı agar kullanılmıştır. 49

50 3.1.1 Kandidaların Saboroud dekstroz agar (SDA) da üreme özellikleri Klinik örneklerden primer izolasyon için tüpte Saboroud dekstroz agar (SDA)- Difco) besiyerlerinde kültürler yapılarak C de etüve bırakılarak, 72 saat sürenin sonunda üreme olmayan tüpler, çalışmamızın dışında bırakıldı. Bu besiyerlerinde: Hamur kıvamında, 0.5 mm- 1 mm çapında ve kendine özel maya kokusu bulunan, krem rengi kolonilerin, SDA ya subkültürleri yapılarak ileri incelemelerini yapmak ve çalışmamızı sürdürmek üzere +4 0 C de saklanmış ve düzenli aralıklarla pasajları kontaminasyonu engellemek açısından yapılmıştır 66,69,77. Kandida türlerinin belirlenmesinde, aşağıdaki uygulamalar yapılmıştır. Şöyleki: -Kültür, izolasyon, identifikasyon, germ tüp yapısının araştırılması, cornmeal agarda klamidospor oluşumu, karbonhidrat fermantasyon reaksiyonları, ureaz testi 32,69,91,150. -Asimilasyon özelliklerinin API 20C AUX ile incelenmesi 1,78, Kandida türlerinin kromogenik agarda morfolojisi ve renginin incelenmesi Klinik örneklerden izole edilen mayaların SDA daki 24 saatlik 50

51 kültürlerinden Chromagar Candida besiyerine ekilen örnekler, saatlik inkübasyonlarından sonra, koloni morfolojileri ve renk değişimleri not edildi. Parlak- yeşil olanlar C.albicans, koyu pembe- mor olanlar C.glabrata, metalik mavi olanlar C.tropicalis, toz pembe olanlar C.krusei ve beyaz renkli olanlar diğer kandidalar olarak isimlendirildi 89,90, Sikloheksimidli tüpte yatık SDA da üreme Çalışmamızda sikloheksimidli besiyerinde kandidaların üreme özellikleri incelenmiştir. Bunun için sikloheksimid içeren Mycobiotic agar (Difco) besiyerine kültürler yapıldı. Bu besiyerinde hiç üreme göstermeyenlerle veya SDA dakine göre çok az oranda bir üreme gösteren suş, sikloheksimide duyarlı olarak değerlendirilmiştir. C. parapsilosis ve C. krusei türleri sikloheksimide duyarlı iken, C. tropicalis ise değişken sonuçlar vermektedir Karbonhidrat fermantasyon testi Kandida türlerinin fermantasyon etkinliğini göstermek üzere peptonlu su (%1), karbonhidrat (%2) (glukoz, sükroz,laktoz, maltoz, galaktoz, rafinoz, mellibiyoz, sellobiyoz, trehaloz), durhaim tüpü, brom timol mavisi (%0.1) den oluşan içerik, steril tüplerde ph: olacak şekilde, ayrı ayrı hazırlandı. Test edilecek suşların, SDA daki maya kültürlerinden besiyeri bulunan 51

52 tüplere ayrı ayrı aktarıldı. Bu kullanılan şekerlerden 30 0 C de 14 gün sonra asit oluşumu, ortam renginin sarıya dönüşmesi ile gözlemlendi. Durhaim tüpü içinde, hava kabarcıklarının görülmesi gaz:+ sonucuna ulaştırdı. C.albicans glukoz, galaktoz, maltozu fermente ederken, laktoz, mellibiyoz, rafinoz ve inülini fermente etmez. Sükrozdan gaz yapmaz. Bazı suşları asit pozitif iken bazıları ise negatiftir 18,75,151,152,153. Bu testin verileri, Tablo-10 da verilmiştir. 52

53 Tablo-10:Kandida türlerinde karbonhidrat fermantasyon aktiviteleri KANDİDA TÜRLERİ KARBONHİDRAT FERMANTASYONU GLU GAL LAK MAL SÜK RAF MEL SEL TREH A G A G A G A G A G A G A G A G A G C.albicans , -, ,- -,- - C.stellotoidea , -, C.kefyr C.krusei C.parapsilosis , C.tropicalis ,- - C.glabrata C.guilliermondi , ,- - - Devamı arka sayfada 53

54 KANDİDA TÜRLERİ KARBONHİDRAT FERMENTASYONU GLU GAL LAK MAL SÜK RAF MEL SEL TREH A G A G A G A G A G A G A G A G A G C.utilis C.famata A:Asit, G:Gaz, +:Pozitif, -:Negatif, +,-:Değişken Glu:Glikoz, Gal:Galaktoz, Lak:Laktoz, Mal:Maltoz, Sük:Sükroz, Raf:Rafinoz, Mell: Mellibiyoz, Sell:Sellibiyoz, Trehal:Trehaloz Karbonhidrat asimilasyon testi Karbonhidrat asimilasyonu, aerop koşullarda, tek karbon kaynağı olarak bir şekerin kullanabildiğinin göstergesidir. Maya tanımlamasında en önemli adımlardan birisidir. Bu test, karbonhidrat fermentasyon testine göre, daha duyarlıdır. Asimilasyon testi, fermentasyonla birlikte tür ayırımında da yararlanılmaktadır 75,154,155,156. Bütün kandida suşları glukozu asimile etmektedir. Galaktoz, ksiloz, maltoz, sükroza çoğunun etki ettiği, inositolü ise hiçbirisinin asimile etmediği gösterilmiştir. C.glabrata glukozu asimile ederken, laktoz, galaktoz, maltoz, sükroz, rafinozu asimile etmez. Kandida türlerinden sadece C.kefyr laktoz asimilasyonu yapmaktadır. Utilizasyon besiyeri kullanılarak, asimile edilen şekerin etrafında 54

55 bulanıklık tarzında üreme olup olmadığı araştırılır. Tablo-11 de kandidaların karbonhidrat asimilasyon özellikleri gözükmektedir. Tablo-11: Kandidaların karbonhidrat asimilasyon özellikleri KANDİDA TÜRLERİ KARBONHİDRATLAR GLU GAL LAK MAL SÜK RAF MEL SEL Tre C.albicans C.stellotoidea C.kefyr C.krusei C.parapsilosis C.tropicalis C.glabrata C.guilliermondii C.famata ,- + C.utilis :pozitif, -:negatif Glu:Glikoz, Gal:Galaktoz, Lak:Laktoz, Mal:Maltoz, Sük:Sükroz, Raf:Rafinoz, Mell: Mellibiyoz, Sell:Sellibiyoz, Trehal:Trehaloz 55

56 3.1.6.API 20 CAUX kiti ile asimilasyon testi Kandida tür dağılımında identifikasyon için standart Wickerman karbonhidrat yöntemi nin güvenilir olmasının yanısıra en önemli dezavantajı, inkübasyon süresinin gün gibi uzun süreli olması ve kontaminasyon riskinin fazla olmasıdır. Bu nedenlerde rutin olarak, kullanımı sınırlı olmakta beraber, referans çalışmaları için, değerli bir yöntem olma özelliğini taşımaktadır. Günümüzde araştırmaların çoğunda bu standart yöntemin yerini, yine karbonhidrat asimilasyon esasına dayanan ve saatte tanımlama yapabilen ticari kitler almıştır. Çeşitli araştırmalarda referans testi olarak, bunlara başvurulmaktadır 35,156,157. API 20 CAUX (Biomerieux- France) kitinde saatlik olan saf maya kültürlerinden, 2 Mac Farland'a göre süspansiyonları hazırlandı. Bunlardan şekerlerin bulunduğu kısımlara inokülasyonlar yapıldı ve saat sonra değerlendirmeler yapılarak, tür tayinine gidildi. API 20 CAUX stribi 19 asimilasyon testinin performansını gösterebilen ve dehidrate substratlar içeren 20 küpülden oluşmaktadır. Bir küpül boştur 148,158,159. API 20C AUX strip bileşimi Tablo-12 deki gibidir. Deneyin uygulanışı ise Şekil-6 da verilmiştir. 56

57 Tablo-12: API 20CAUX strip aktif karbonhidratları TESTLER AKTİF MADDELER 0 Boş GLU GLY 2KG ARA XYL ADO XLT GAL INO SOR MDG NAG CEL LAC MAL SAC TRE MLZ RAF D-Glucose Glycerol Calcıum 2-Keto-Gluconate L-Arabınose D-Xylose Adonitol Xylitol D-Galactose Inositol D-Sorbitol Methyl-x D- Glucopyranoside N-Acetyl- Glucosamıne D-Celıobiose D-Lactose D-Maltose D-Sacchorose D-Trehalose D- Melezitose D-Raffınose 57

58 Şekil-6:API 20C AUX un yapılışı 58

59 3.2.Germ tüp yapımının incelenmesi Germ tüp (Çimlenme borusu), C.albicans ın hızlı tesbitini sağlar. SDA besiyerinde üreyen maya kolonilerinden öze ucu ile alınarak, steril tüplerde 0.5 ml insan serumu ile homojenize edildi C de 2-4 saat inkübe edildi. Bir damla süspansiyon örneği alınarak, lam-lamel arasında, ışık mikroskobisinde 40X ile incelendi. Ana hücreden çıkış kısmında darlık olmayan, hücrenin yarısı genişliğinde ve ondan 3-4 kez daha uzun gelişen borucuklar Germ tüp olarak kabul edildi 148,150,155, Hif/hifa oluşturma Gerçek hif oluşturan tek tür, C. albicans tır. C. glabrata hif oluşturmaz. C. tropicalis ise yalancı hif oluşturur. Resim-6: Yalancı hifa oluşturmuş bir maya hücresinin gram boyama ile görünümü 59

60 3.4. Klamidosporların incelenmesi Klamidospor, dinlenme sporudur. Bu yapı C.albicans için belirginken, C.dubliniensis te klamidospor oluşturabilmektedir. C.stellatoidea da ise çok seyrek gözlenebilmektedir. Diğer kandida türlerinde klamidospor oluşturma özelliği yoktur. Klamidospor oluşumunun incelenmesi için Klamidospor agar (Difco besiyeri, PT-80 agar, cornmeal agar ) kullanılmaktadır. Test edilen suşa ait koloniler 1 cm aralıklarla 2-3 paralel çizgi halinde, hafifce besiyerine batırılarak Oxoid- Dalmau Plate tekniği ile cornmeal agara inoküle edildi. Ekim çizgilerinin üzeri lamelle kapatıldıktan sonra, oda ısısında ( C) saat bekletildikten sonra, mikroskobun 10X ve 40X objektifleri ile lamel kaldırılmaksızın, incelendi. Resim-7: C.albicans ın klamidospor oluşturmuş görünümü. 60

61 3.5. Slaym testi Mikroorganizmaların slaym üretimini araştırmak için kalitatif ve kantitatif çeşitli yöntemler geliştirilmiştir 35,161,162. Bunlar arasında: -Christensen yöntemi (Kalitatif, makro tüp yöntemi) -Kantitatif mikrodilüsyon plak yöntemi (Mikroplayt yöntemi) -Kongo kırmızılı agar yöntemi 163,164,165,166 sayılabilir. Bu çalışmada slaym üretimini saptamak üzere uygulanış ve değerlendirim kolaylıkları nedeniyle Kongo Kırmızılı Agar: KKA yöntemi kullanılmıştır 161,167,168. Test suşlarımızın saatlik taze kültürlerinden Kongo kırmızılı brain heard infüzyon agar a aktarımlar yapılmıştır. Bu besiyerinde tek koloni düşecek şekilde yapılan ekimler, 37 0 C de bir gece inkübe edildikten sonra koloniler incelendi. Koyu kırmızı renkli koloniler: slaym pozitif ve açık pembe- beyaz koloniler slaym negatif değerlendirimi yapıldı 161,167. Resim-8:Slaym pozitif ve negatif kolonilerin KKAA da görünümü 61

62 3.6. C.albicans izolatlarında proteinaz enziminin araştırılması Çalışmamızda proteinaz varlığını araştırmak üzere, -Triklorasetik asit -Jelatin besiyeri kullanılmış ve birlikte uygulamaya konulmuştur.. Kwong-Chung ve ark 43, Kuştimur ve ark 45 nin tarif ettiği gibi %5-10 luk triklorasetik asit ve 37 0 C de dakikalık reaksiyon süreleri seçilerek, kandida kökenlerinde proteinaz araştırılabilmek tedir Triklorasetik asit kullanımlı proteinaz yöntemi SDA da üreyen C. albicans kökenleri, 3 ml steril Saboroud dekstroz buyyon (SDB) içeren tüplere alındı. Oda ısısında 48 saat bekletildi. Buyyonda üreyen C. albicans suşları santrifüj edildi. Dipte kalan çökelti steril fosfat tamponu ile 3000 devirde 15 dakika santrifüj edilerek, üç kez yıkandı. Yıkama sonrası çökelti steril distile su ile iki Mac Farland olacak şekilde ayarlandı. Bundan sonra Sığır serum albumin agar (SSAA) besiyerine tek koloni ekimi yapılarak, oda ısısında, saat bekletildi. 120 saat inkübasyondan sonra, besiyerinin üzerini örtecek şekilde %20 triklor asetik asit eklendi ve dakika bekletildikten sonra döküldü. ph sı 6 olan PBS ile yıkandı. Plaklar %0.06 amidoblack 62

63 boyası ile boyandı. Amidoblack boyası (Merck, 45:10:45 oranlarında metanol, asetik asit, distile su) (10 dakika),daha sonra çözücü (boyasız, 45:10:45 oranlarında metanol, asetik asit, distile su) ile yıkanarak, distile su çıkarıldı. PBS ile tekrar yıkandı boya çıkartıldı ve kurumaya bırakıldı. Koloni etrafında seffaf zonu olmayanlar negatif, 1-2 mm lik şeffaf zonu olanlar +, 3-5 mm lik şeffaf zonu olanlar ++ olarak değerlendirildi 35. Resim-9:C.albicans suşlarında proteinaz aktivitesinin görünümü Jelatin hidrolizinin gösterilmesi Jelatin hidrolizi için SDA da üreyen kolonilerden, jelatin besiyerine ekildi C de 48 saat inkübe edildikten sonra bir gece buzdolabında bekletilerek yalancı pozitiflikler elimine edildi. Buzdolabında 1 gece bekletilen ve jelatin hidrolize etmeyen koloniler tekrar katı hale geçerler. 63

64 3.7. C.albicans izolatlarında fosfolipaz enziminin araştırılması Kandida kökenlerinde fosfolipaz aktivitesi, hem mikrobiyolojik hemde biyokimyasal olarak saptanabilmektedir. Biyokimyasal yöntemlerin zaman alıcı olması nedeniyle, pratik ve güvenilir sonuçlar veren plak yöntemi de geliştirilmiştir (35). Bu yöntemde fosfolipaz kaynağı olarak ortama yumurta sarısı eklenmekte ve plak üzerine ekilen kandida kökenlerinde fosfolipaz enzimi varsa, yağ asitleri + kalsiyum kompleksi çevresinde bir presipitasyon zonu oluşturmaktadır 35,36,37,168,169,170. Bu çalışmada da kandida kökenlerinin fosfolipaz aktivitesinin saptanmasında yumurta sarılı agar (YSA) plak yöntemini uygulanmıştır. Bir M sodyum klorür (NaCl), M kalsiyum klorür (CaCl 2 ) ve %8 steril yumurta sarısı eklenmiş SDA besiyerini kullanıldı. Yumurta sarısı 1000 devirde 15 dakika santrifüje edildikten sonra, üstteki sıvı atıldı. Steril distile su ile süpernatant, ilk hacmine getirildi C ye soğutulmuş SDA ya eklendi. Eşit miktarda sitrik asit ve disodyum hidrojen tamponu eklenerek, besiyeri ile karıştırıldı. ph: 4.3 e ayarlandı. 64

65 SDA ya pasajlanarak 35 0 C de 24 saat inkübe edilen suşların distile su ile Mc Farland 1 e uygun bulanıkta süspansiyonları hazırlandı. Bu süspansiyonların 10 mikrolitresi her plağa 4 örnek olacak şekilde ekimler yapıldı. Plaklar 30 0 C de nemli ortamda 4 gün bekltildi. Kolonilerin etrafında, bu süre sonunda meydana gelen belirgin halka şeklindeki presipitasyon zonu ölçümleri yapıldı. Presipitasyon zonu: Koloni çapı/ Koloni çapı +presipitasyon zonu çapı denkleminden fosfolipaz aktiviteleri (PZ) belirlendi. Pz:1.0 negatif, Pz<1.0 pozitif olarak değerlendirildi 35,36,68,170,171. Pz değeri küçüldükçe fosfolipaz aktivitesi artmakta Pz =1.0 değeri negatif fosfolipaz aktivitesini yansıtmaktadır. Buna göre de (+, ++, +++, ++++) şeklinde, pozitifliğin düzeyi de, verilebilmektedir. Resim-10: Kandida izolatlarında fosfolipaz aktivitesinin görünümü 65

66 3.8. Serumda kandida mannan antijeninin elisa ile gösterilmesi Kandida hücre duvarı ana antijenik yapısını, en dışta bulunan Mannoprotein oluşturmaktadır. Epitel-endotel hücrelerine bağlanmada rolü olan mannan antijenine karşı antikorlar gelişmekte ve kandidozlar sırasında titre artışları gözlenmektedir. Mannan erken ve çabuk tanı için uygun bir antijendir. Bu antijen kandida tür ve alt türlerin ayırımını sağlamakta, hücresel ve hümoral cevabı uyarmakta veya baskılamakta ve infeksiyonun sürmesine de neden olabilmektedir. Bu yöntem (Platelia Kandida ag) insan serumunda mannan antijeninin kalitatif ve kantitatif olarak saptanmasını sağlayan, tek taraflı bir sandviç immuno-enzimatik teknik olarak tanımlanmıştır 172. Bu çalışmada Bıo-Rad marka Platelia Candida Ag adlı hazır ELISA test kiti kullanılarak kandida üretilen hastalardan alınan serum örneklerinde mannan antijenine bakılmıştır. 66

67 4.BULGULAR 4.1.Kandida tür dağılımı ve bazı virulans faktörleri ile ilgili bulgular Bu çalışmada incelenen bireylerin özgeçmiş bilgileri not edildikten sonra, kandida izolasyonu yapılan hastaların yaş ve cinsiyet dağılımları, antibiyotik-steroid ilaç ve oral kontraseptif kullanımı olup olmadığı, ayrıca değerlendirmeye alınmıştır. Çalışma grubundan maya üretilen olguların, yaş grubuna göre, dağılımları Tablo-13 da gösterilmiştir. Tablo-13:Klinik örneklerinden kandida üretilen olguların yaş ve cinsiyete göre dağılımları CİNSİYET YAŞ GRUBU KADIN ERKEK 10 Yaş altı O nin üstü 2 1 TOPLAM

68 varlığı Çalışma grubundaki olgulardaki bazı risk faktörlerinin Vajinal akıntı ve sürüntü örnekleri incelenen 132 olgudan 105 inin gebe olduğu anlaşılmıştır. Ayrıca 14 kadının değişik süreli oral kontraseptif kullandığı veya kullanmakta olduğu anlaşılmıştır. Yoğun bakım ve onkoloji hastalarına ait klinik örneklerden kandida üremesi olanlarda da buna benzer bilgilerde kayda alınmıştır. Klinik örneklerden 150 sinde maya izolmanı yapılmıştır. Bu identifikasyonda kültür, boyanma, fermentasyon ve asimilasyon deneyleri yapılmış, germ tüp ve klamidospor oluşturma, SDA da üreme özelliği, üreaz aktivitesi, CAC da renkli koloni oluşumu not edilerek, tür ayırımı yapılmaya çalışılmıştır Germ tüp yapımının incelenmesi C. albicans ı çabuk tanımlamak üzere 37 0 C de 2 saatte germ tüp Çimlenme borusu oluşturabilme yeteneğine bakıldı. Bu çalışmadaki albicans ve non - albicans kandida türlerinin germ tüp inceleme sonuçları Tablo-14 de verilmiştir 68

69 TABLO-14: Kandida türlerinde germ tüp yapımının incelenmesi KANDİDA TÜRÜ GERM TÜP TOPLAM POZİTİF NEGATİF C.albicans C.kefyr C.tropicalis C.utilis C.famata C.glabrata C.parapsilosis TOPLAM Klamidosporlarla igili bulgular Klamidosporlar, mayaların değişik koşullarda canlılığını korumaya yönelik, kalın duvarlı ve C.albicans ın en belirgin özelliklerinden birisidir. Kandida türlerinden C.stellotoidea ve çok az da olsa C.dubliniensis de klamidospor oluşturabilmektedir. 69

70 Çeşitli klinik örneklerden mayaların varlığının araştırıldığı bu çalışmada, 108 C. albicans ve 42 non-albicans kandida türünde klamidospor varlığı irdelenmiş ve Tablo-15 deki klamidospor pozitiflik oranlarına ulaşılmıştır. TABLO-15:Kandida türlerinde klamidospor varlığının belirlenmesi KLAMİDOSPOR VARLIĞI KANDİDA TÜRÜ POZİTİF NEGATİF TOPLAM C.albicans C.kefyr C.tropicalis C.utilis C.famata C.glabrata C.parapsilosis TOPLAM

71 4.1.5.Chromagar kandida da üreme ve koloni rengi ile ilgili bulgular Bu çalışmada incelemesi yapılan klinik örneklerden elde edilen 150 kandida türünün Chromagar kandida agar (CAC) besiyerindeki renk tonları tek tek not edilmiştir. Bu besiyerinde C.albicans yeşil, C.tropicalis çelik mavisi, C.krusei tüylü ve toz pembe ve C.glabrata koyu pembe mor renginde koloniler oluşturmaktadır. C.parapsilosis parlak-beyaz ve C.kefyr kirli-beyaz veya krem renginde üremektedir 87,89,90,91. Resim-11:Çalışılan kandida izolatlarının CAC deki görünümü Mayaların izolasyonu için CAC besiyerinin kullanımı, klinik olarak önemli kandida türlerinin izolasyonuna izin vermesi, laboratuvar iş yükünü ve maliyetini düşürmesi, antifungal seçimini 71

72 hızla yaptırarak, hasta mortalite ve morbiditesini düşürmesi açısından önemli kabul edilmektedir. Otağ ve ark 173 çeşitli klinik örneklerden CAC besiyerinde C.albicans ve non-albicans türlerini belirlemişler ve bu besiyerinin tanı değerine işaret etmişlerdir. Bizim çalışmamızda chromagar candida besiyerindeki renk değişimlerine göre; 108 i C. albicans, 32 si C. kefyr, 5 i C. tropicalis, 2 si C. utilis, 1 i C. famata, 1 i C.glabrata ve 1 i ise C. parapsilosis olarak belirlenmiştir Kandidaların bazı kültürel, biyokimyasal, asimilasyon, fermentasyon özellikleri Bu çalışmada da çeşitli izolasyon ve identifikasyon yöntemleri yanında CAC besiyerinde kandida üreme özellikleri ve koloni renkleri belirlenerek tür ayırımına gidilmiştir. Böylece 150 kandidanın 108 i C.albicans, 5 i C.tropicalis, 37 tanesi ise diğerleri dağılımını göstermiştir. Bu çalışmadaki 150 kandida izolatından tamamında üreaz aktivitesi saptanmamış, sikloheksimide duyarlılık gözlenememiştir. Bu çalışmada üreaz poziifliği ve sikloheksimid duyarlılığı olan C.krusei bulunamamıştır. C.tropicalis izolatlarından üçünde ve C.parapsilosis te sikloheksimid duyarlılığı saptanırken C.albicans, C.kefyr, C.glabrata da bu test sonucunun negatif olduğu anlaşılmıştır. Bu son üç tür kandida ile C.famata da klamidospor germ tüp testleri de negatiftir. Bu konudaki bilgiler Tablo-16 da özetlenmiştir. 72

73 ilgili bulgular Tablo-16: Kandida türlerinin bazı makroskobik ve mikroskobik özellikleri ile Türler C.albicans C.kefyr C.tropicalis Testler 37 0 C'de üreme Sikloheksimid duyarlılığı Klamidospor Germ tüp Üreaz aktivitesi Asimilasyon Glukoz Maltoz Sükroz Laktoz Galaktoz Mellibiyoz Sellibiyoz İnositol Ksiloz Rafinoz Dulcitol Trehaloz Fermentasyon Glukoz Maltoz Sukroz Laktoz Galaktoz Rafinoz Trehaloz

74 Türler C.parapsilosis C.famata C.glabrata Asimilasyon Fermantas yon Testler 370C'de üreme Sikloheksimid duyarlılığı Klamidospor Germ tüp Üreaz aktivitesi Glukoz Maltoz Sükroz Laktoz Galaktoz Mellobiyoz Sellobiyoz İnositol Ksiloz Rafinoz Dulcitol Trehaloz Glukoz Maltoz Sukroz Laktoz Galaktoz Rafinoz Trehaloz Kandida tür dağılımında farklı yöntemler arasındaki uyumluluk düzeyi Konvansiyonel karbonhidrat fermantasyon testi ile birlikte API 20 CAUX hızlı asimilasyon kitleri kullanılmış ve kandida tür ayırımı yapılmıştır. Bu verilerle birlikte 108 C.albicans (%72) ve 42 non-albicans (%28) dağılımı elde edilmiştir. C.kefyr (%21.3), 74

75 C.utilis (%1.3), C.tropicalis (%3.3), C.famata (%0.7), C.glabrata (%0.7), C.parapsilosis (%0.7) oranlarına ulaşılmıştır. Çalışmamızdaki klinik örneklerden izole edilen kandida türlerinin farklı yöntemlerle dağılımı TABLO-17 de gösterilmiştir. TABLO-17: Kandida tür dağılımının farklı yöntemlerle belirlenmesi Kandida türleri Germ tüp Klamidospor CAC API 20 (n) (n) (n) CAUX (n) N P N P C.albicans C.kefyr C.tropicalis C.utilis C.famata C.glabrata C.parapsilosis TOPLAM

76 Şekil-7:Kandidaların tür dağılımı 4.2. Slaym faktörünün araştırılması Çalışmada C.albicans ve albicans dışı kandidalarda slaym faktörü varlığı incelenmiştir. C.albicans için 108 izolattan 72 sinde (%67) slaym pozitifliğine ulaşılmıştır. Non albicans türlerden 42 sinin 24 ünde (%57) slaym pozitif olarak saptanmıştır. Böylece 150 kandida susunun 96 sında (%64) slaym pozitif olarak saptanmıştır. Resim-12:Çalışılan kandidalarda slaym pozitif izolatlar 76