Tez Danışmanı : Yrd. Doç. Dr. Mustafa GÜMÜŞ. Bornova-İZMİR EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ)

Transkript

1 EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (YÜKSEK LİSANS TEZİ) İZMİR İLİ KİRAZ ÜRETİM ALANLARINDA GÖRÜLEN VİRÜS HASTALIKLARININ BELİRLENMESİ ÜZERİNDE ARAŞTIRMALAR İsmail Can PAYLAN Bitki Koruma Anabilim Dalı Bilim Dalı Kodu: Sunuş Tarihi: Tez Danışmanı : Yrd. Doç. Dr. Mustafa GÜMÜŞ Bornova-İZMİR

2 1 1. GİRİŞ Türkiye dünyada bahçe bitkileri yetiştirme potansiyeli çok yüksek olan ender ülkelerden birisidir yılı istatistiklerine göre; Türkiye dünyada kiraz ve kayısı üretiminde 1. sırada, vişne üretiminde 3. sırada, şeftali, bağ ve elma üretiminde 6. sırada, erik ve badem üretiminde ise 8. sırada yer almaktadır. Yıllara göre değişmekle birlikte ülkemiz dünya toplam kayısı üretiminin, ortalama %15 21 lik ve toplam kiraz üretiminin ise yaklaşık %15 lik kısmını karşılamaktadır (FAO, 2005). Dünyada kiraz üretiminde önde gelen ülkeler Çizelge 1.1 de görülmektedir. Çizelge 1.1. Dünyada kiraz üretiminde ilk on ülke (FAO,2005) Sıra Ülke Üretim (MT) 1 Türkiye 260,000 2 A.B.D. 250,000 3 İran 224,000 4 Almanya 120,000 5 Rusya 110,000 6 İtalya 107,922 7 İspanya 89,300 8 Ukrayna 85,000 9 Fransa 73, Suriye 39,700 *MT: Milyon ton

3 2 Dünya kiraz üretiminin tamamına yakın bölümü Kuzey yarım kürede gerçekleşmektedir. Üretimin yoğun olduğu ülkeler; Türkiye, İran, A.B.D., İtalya ve İspanya dır. Dünya da toplam hektar alanda kiraz üretimi yapılmakta ve üretim yıllara göre düzenli bir artış göstermektedir. Kiraz ülkemiz ekonomisi ve halkımız beslenmesi açısından önemli bir meyvedir. Türkiye de toplam kiraz ağacı bulunmakta ve ton ürün elde edilmektedir. Kiraz, Ege, Marmara ve İç Anadolu başta olmak üzere ülkemizin hemen hemen tüm bölgelerinde yetiştirilmektedir (Ertunç, 2005). İzmir ili başta Kemalpaşa ilçesi ile ülkemizin başta gelen kiraz yetiştirme bölgelerindendir. Şekil 1.1 de örneklerin alındığı İzmir ili ve ilçeleri görülmektedir. Şekil 1.1. İzmir ili ve ilçeleri. (

4 3 İzmir ili 2004 yılı Kiraz ağacı sayıları üretim ve yüzdeleri Çizelge 1.2 de görülmektedir. Çizelge 1.2. İzmir ili 2004 yılı Kiraz ağacı sayıları, üretim ve yüzdeleri (İzmirtarım, 2006) İlçeler Meyve Veren Yaşta Kiraz Ağacı Sayısı Üretim (ton) %Oran (üretim) Bornova ,2 Buca ,8 Konak ,07 Bayındır ,4 Bergama ,18 Beydağ ,49 Dikili ,03 Karaburun ,03 Kemalpaşa ,32 Kınık ,2 Kiraz ,85 Menderes ,1 Menemen ,07 Ödemiş ,2 Selçuk ,03 Tire ,5 Torbalı ,06 Urla ,06 Toplam Sert çekirdekli meyve ağaçları birçok tarım endüstrisinin ham maddesini sağladıkları gibi diğer bazı endüstri kollarını da besleyebilmektedir. Bu endüstriler arasında konserve, meyve suyu, reçel,

5 4 marmelat, jöle, şekerleme, pekmez, pasta, kek, bisküvi, alkollü içki, kurutma ve yakacak endüstrileri sayılabilir (Ülkümen, 1973). İç tüketim ve ihracatımız için çok önemli olan kiraz ağaçlarında tek başına veya birlikte zarar yapan çok sayıda hastalık etmeni ve zararlı bulunmaktadır. Kiraz üretimimizi dünyadaki değer ülkelerde de olduğu gibi tehdit eden ve büyük ekonomik kayıplara neden olan etkenlerin başında virüs hastalıkları gelmektedir. Kiraz ağaçlarında virüs hastalıklarının ağacın büyümesine engel olduğu, verimini ve ömrünü büyük ölçüde azalttığı bilinmektedir. Özellikle sert çekirdekli meyve ağaçlarında, polen ve bazı böcek vektörleriyle taşınan virüsler zamanla önüne geçilmesi olanaksız durumlar ortaya çıkarabilmektedir (Azeri, 1994). Kiraz ağaçlarında her yıl virüslerden kaynaklanan önemli ürün kayıpları olduğu bilinmektedir. Virüslerin neden olduğu zararın boyutu, meyvenin türüne, çeşidine, virüsün ırkı ile virülenslik durumuna göre değişebilmektedir (Myrta, 1996). Virüs ve virüs benzeri hastalıklar dünyada meyve yetiştirilen hemen her yerde bulunmaktadır. Bu durumun ana nedeni, üretim materyallerinin (anaç ve kalem) kontrolsüz bir biçimde dağıtılması ve bunun ardındın da bazı hastalıkların vektörlerle yayılmasıdır. Virüs, viroid ve fitoplazma gibi etmenlerin yol açtığı hastalıklar; ağaçların zayıflamasına ve ölümüne, ürünün kalite ve miktarının düşmesine, aşı tutma ve köklenme oranında azalmaya neden olabilmektedir (Candresse, 1995). Bu etmenlerin önemi; adı geçen etmenlere yönelik pratik olarak

6 5 uygulanabilir doğrudan kimyasal mücadele yöntemlerinin olmaması, kolayca tanılama yapılamaması, çoğunun vektörlerle, üretim materyali ve aşı ile kolayca taşınabilmesi gibi nedenlerden kaynaklanmaktadır (Baumgartnerova, 1996). Virüs hastalıklarında önce etmeni her yönüyle tanımak, ırklarını ve konukçu dizisini belirlemek ve hızlı tanı yöntemleri ile etmeni saptamak kontrol açısından önemlidir. Bitki virüs hastalıklarının tanısında biyolojik, serolojik ve moleküler yöntemlerden sıkça yararlanılmaktadır. Bu yöntemlerin virüslerin tanılanmasındaki duyarlılıkları birbirinden farklılık göstermektedir. Özellikle serolojik yöntemlerden ELISA, bazı bitki virüslerinin saptanmasında sıkça kullanılmaktadır. Fakat birçok durumda özellikle de odunsu konukçuların dokusunda virüsün homojen olmayan dağılımından ve mevsime bağlı konsantrasyon dalgalanmalarından dolayı ELISA testi ile saptanmasında sorunlar ortaya çıkabilmektedir (Torrance, 1981). Bu yüzden daha duyarlı ve güvenilir teknik olarak bilinen ve özellikle de mevsime bağlı farklı virüs konsantrasyonlarından az etkilenen PCR (Polymerase chain reaction) sayesinde ELISA da yaşanan birçok problem ortadan kalkmıştır. Sert çekirdekli meyve ağaçları hastalıkları arasında virüs hastalıklarının önemi çok büyüktür. Bunlardan özellikle Apple chlorotic leaf spot trichovirus (ACLSV), Apple mosaic ilarvirus (ApMV), Cherry leaf roll nepovirus (CLRV), Plum pox potyvirus (PPV), Prune dwarf ilarvirus (PDV), Prunus necrotic ringspot ilarvirus (PNRSV), Arabis mosaic nepovirus (AMV), Raspberry ringspot nepovirus (RRV),

7 6 Strawberry latent ringspot nepovirus (SLRSV), Tomato black ring nepovirus (TBRV) ve Tomato ringspot nepovirus (ToRSV) çeşitli ülkelerde yapılan çalışmalar sonucu önemli ekonomik kayıplara neden olmaları yüzünden en önemlileri olarak değerlendirilmektedir. Virüs hastalıkları gerek tek başlarına gerekse sinerjistik etkileşimleri sonucu ürünlerde ve ağaçlarda önemli zararlara yol açmaktadır. Sert çekirdekli meyve ağaçlarında görülen bu virüslerin ağaçlara olan olumsuz etkileri virüs, virüsün ırkı, ağaç yaşı, tür, çeşit, anaç ve beslenme durumuna bağlı olarak değişmektedir (Nemeth, 1986). Sert çekirdekli meyve ağaçlarının hemen hemen tümünde olduğu gibi kirazlarda da virüs hastalıkları için mücadele virüsten ari üretim materyali ile bahçe tesisi ve sonraki olası bulaşmaları engelleyici bir takım önlemler alma temeline dayanmaktadır. Serolojik kökenli bir test olan ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) nın güvenilirliği ve kullanımı, bazı sınırlamalara bağlıdır. Özellikle meyve ağaçları ya da daha geniş bir ifadeyle odunsu bitkilerde, düşük virüs konsantrasyonu ile virüsün ağaçtaki heterojen dağılımı gibi unsurlar dikkate alındığında bu yöntemin mevsimsel olarak yanlış sonuçlar vermesini mümkün kılabilmektedir (Dal Zotto and Nome,1999). ELISA yöntemi, bu nedenle örnekleme zamanına bağlı olarak işlevini gerçekleştirebilen bir test olup ayrıca, bir virüsün farklı ırkları ile infekteli olan örnekler, bu yöntemle incelendiğinde her ırkın belirlenmeme olasılığı da bulunmaktadır. Bu tip sınırlamalar nedeniyle bu yönteme alternatif olabilecek moleküler yöntemler, bitki virüs teşhisinde kullanılmaya başlanmıştır. Bunlardan özgül nükleik asit dizilimlerinin

8 7 çoğaltılması temeline dayalı PCR oldukça duyarlı bir yöntem olarak bitki virüslerinin teşhisinde gittikçe artan bir yaygınlıkta kullanılmaya başlanmıştır (Smith et al., 1998). Bu çalışma süresince de ELISA, PCR ve test bitkilerine mekanik inokulasyon yöntemleri birarada kullanılarak en doğru ve güvenilir sonuçlar ortaya konulmaya çalışılmıştır. Araştırma alanını, İzmir ilinin yoğun olarak kiraz yetiştirilen bölgeleri kapsamaktadır. Bu yörelerdeki kiraz bahçeleri gezilerek virüs hastalıkları belirtisi gösteren ağaçlarda gözlemler yapılarak, hastalık belirtisi gösterenlerden yaprak, sürgün, meyve ve dal örnekleri alınarak örnekleme yapılmıştır. Gezilen ve örnek alınan kiraz bahçeleri kaydedilerek, yeri ve mevkii belirtilmiş, ağaçlarda nasıl belirtiler gözlemlendiği kaydedilmiş ve gerekli durumlarda ağaçların ya da belirti olan kısımların fotoğrafları çekilerek kaydedilmiştir. Örneklemeye kirazın tüm vejetasyon süresi boyunca devam edilmiştir. Toplanan tüm belirtili örneklere; ApMV, ACLSV, CLRV, PPV, PDV, PNRSV virüslerinin varlığını saptamak amacıyla ELISA testleri ve Plum Bark Necrosis Stem Pitting Associated Virus, PDV, PNRSV, ACLSV virüsleri için PCR (polymerase chain reaction) testleri uygulanmıştır. Bu testler sonucunda virüslü çıkan örneklere veya virüslü olduğundan şüphe edilen bitki örneklerine biyolojik tanılama çalışmaları yapılmıştır. Test bitkilerine yapılan mekanik inokulasyon, ELISA ve PCR sonuçları birlikte değerlendirilerek kaydedilmiştir.

9 8 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Son yıllarda Akdeniz ülkelerinde sert çekirdekli meyve türlerinin üretimi gittikçe artmaktadır. Tarımsal alanlar hızla genişlerken, ekonomik olarak ülke gelirine büyük kazançlar sağlamaktadırlar fakat önüne geçilemeyen virüs hastalıkları büyük sorunlar yaratmaktadır. Sert çekirdekli meyve türlerinde yaklaşık 150 virüs hastalığı rapor edilirken (Dunez, 1988), bu hastalıkların sayısı kiraz ve vişne ağaçlarında diğer türlerde olduğundan daha fazladır (Kahn, 1976). Kiraz ağaçlarında görülen virüsler; Prunus necrotic ringspot virus, Prune dwarf virus, Plum line pattern virus, Apple mosaic virus, Raspberry ring spot virus, Arabis mosaic virus, Tomato black ring virus, Myrobalan latent ringspot virus, Strawberry latent ringspot virus, Cherry leaf roll virus, Tomato ringspot virus, Cherry rasp leaf virus, Apple chlorotic ringspot virus, Cherry mottle leaf virus tur (Dunez, 1988). Sert çekirdekli meyve ağaçlarında hastalık yapan virüslerin büyük çoğunluğu yaprakta ve meyvede renk bozulmalarına, gövdede deformasyona, üründe azalmalara, aşı uyuşmazlıklarına ve hatta ileri aşamalarında ağaç ölümlerine neden olurlar (Kahn, 1976). Sert çekirdekli meyve türlerinde hastalık yapan virüsler başlıca Ilarvirüs, Nepovirüs, Trichovirüs ve Potyvirüs cinslerine aittirler (Dunez, 1988). Ilarvirüs cinsindeki virüsler çok sayıda konukçuya sahiptirler ve Prunus cinsine ait bütün türlerde saptanabilirler. Genel olarak tohumla,

10 9 polenle ya da infekteli aşı gözleriyle taşınmaktadır. PNRSV, PDV ve ApMV bu grupda sert çekirdekli meyve ağaçlarında enfeksiyonlara neden olan virüslerdir (Dunez, 1988). Nepovirüs grubundaki virüsler toprakta bitki köklerinde ektoparazit olarak yaşayan Longidorus ve Xiphinema türü nematodlarla taşınırlar. İnfekteli aşı gözleri bu gruptaki virüslerin taşınmasına neden olan diğer bir yoldur. Bu grupta yeralan virüsler; Tomato ringspot virus, Tomato black ring virus, Strawberry latent ringspot virus, Cherry rasp leaf virus, Arabis mosaic virus, Raspberry ringspot virus ve Cherry leaf roll virus tur (Pallas et. al., 1991). Trichovirüs grubunda morfolojik üç alt grup vardır; A, B, C. Her alt grup farklı genom büyüklüğüne sahiptir. Alt grup A da bulunan ACLSV, sert çekirdekli meyve türlerinde önemli kayıplara yol açar (Dunez, 1988). Potyvirus grubunda bulunan virüsler ise, dünyada ılıman iklim bölgelerinden tropik bölgelere kadar geniş bir yayılım alanına sahiptirler. Ekonomik anlamda zarar oluşturan 100 den fazla virüs içermektedir. Tipik üyeleri afitlerle semi-persistent yolla, çok az bir kısmı da infekteli tohumlarla taşınırlar. Bu grup içerisinde sert çekirdekli meyve ağaçlarında Sharka adıyla bilinen hastalığa neden olan Plum pox virus bulunmaktadır (Dunez, 1988). ACLSV nun x12 nm boyutlarında, çok kıvrımlı ipliğimsi bir partiküle sahip olduğu ve virüsün RNA sının tek sarmallı ve tek parçalı olduğu bilinmektedir (Lister, 1970; German et al., 1990).

11 10 ACLSV nin önceden closterovirus A alt grubunun bir üyesi olarak sınıflandırıldığı, ancak virüsün günümüzde yeni tanımlanmış olan clestero benzeri virüslerin trichovirus cinsinin tip üyesi olarak kabul edildiği belirtilmektedir (Martelli et al., 1994; Candresse et al., 1996). ACLSV nin pek çok ırkının olduğu, ortaya çıkan belirtilerinde yüksek oranda virüs ırkına bağlı olarak değiştiği bildirilmekte; ırkların çoğunun bütün konukçuları enfekte edebildiği, ancak bazı elma ırklarının sert çekirdeklilere taşınmasının zor olduğu ifade edilmektedir. (Chairez and Lister 1973; Smith et al., 1998; Brunt et al., 1996). ACLSV nin konukçularının yetiştirildiği dünyanın heryerinde bulunduğu ve virüsün yumuşak çekirdekli meyve ağaçlarında çoğunlukla belirti vermeden taşınmaktayken, sert çekirdekli meyve ağaçlarında çok ciddi hastalıklara sebep olduğu kaydedilmiştir. (Nemeth, 1986; Poul and Dunez, 1988; Smith et al., 1998; Brunt et al., 1996). ACLSV tüm sert çekirdekli meyve ağaçlarını hastalandırabilmektedir. Kiraz ve vişnede birçok çeşitte latent olarak bulunmaktadır ancak Prunus necrotic ringspot ilarvirus ile birlikte meyvelerde nekrotik, çökük lekeler şeklinde belirtilere neden olmaktadır. (Dosba et al., 1986; Desvignes and Boye, 1988). Dunez et al., (1986), odunsu indikatör bitki olarak Prunus persicae GF 305 i, otsu indikatör olarak da C. quinoa ile C. amaranticolor u kullanmışlar ve odunsu bitkilerden otsu bitkilere mekanik inokulasyonu %2.5 lik nikotin solusyonu ile gerçekleştirmişlerdir.

12 11 Meyer-Kahsnitz (1993), ACLSV nin bazı izolatlarının Cucumis sativus, Datura stramonium, Gomphena globosa, Nicotiana tabacum ve Petunia türlerini de enfekte edebildiğini bildirmektedir. Flegg ve Clark (1979), ELISA tekniğinin geniş indeksleme programlarında ve epidemiyolojik çalışmalarda virüsleri tanılamada çok uygun bir yöntem olduğunu ve klasik Das-ELISA yönteminin ACLSV nü zaman zaman tanımlayabileceğini kaydetmişler ve değişik bir prosedür geliştirmişlerdir. Barba ve Clark (1986), virüsün ağaçlarda düzensiz olarak dağıldığını, ağacın alt kısımlarındaki yaprakların daha fazla virüs içerdiğini ve özellikle vegetasyon periyodunun sonuna doğru kabuk dokularının ELISA için en uygun materyal olduğunu ve virüsün düşük konsantrasyon sorunu yüzünden virüsle enfekteli olduğu bilinen bitkilerde dahi ELISA ile negatif sonuç çıkabileceğinide belirtmiştir. Grüntzig et al., (1994), sert çekirdekli meyve ağaçlarında hastalık yapan pek çok virüsün (ApMV, ACLSV, PPV, PNRSV, CLRV ve PDV) ELISA ile kolaylıkla tanıyabilmişlerdir. ApMV (Elma mozaik ilarvirus) unun nm çapında yuvarlak bir partiküle sahip, tek sarmallı ve üç parçalı RNA içeren bir virüs olduğu ve virüs partikülünün % 16 sının nükleik asit, % 84 ünün de protein olduğu bildirilmiş ve ApMV nin daha önceleri ilarvirus (isometric labile) grubunun bir üyesi olduğu (Fulton, 1972; Brunt et al., 1996), son sistematiğe göre (Brunt et al., 1996) ise Bromoviridae familyasının 3. alt

13 12 grubu içerisinde Ilarvirus cinsinin bir üyesi olarak değerlendirildiği kaydedilmiştir. ApMV nün bazı bitkilerde polenle yayılması ve enfekteli ile sağlıklı bitkiler arasında kök kaynaşması dışında doğal taşınma yollarının bilinmediği ifade edilmektedir (Nemeth, 1986; Brunt et al., 1996). ApMV nün kiraz ve vişne ağaçlarında nadiren belirti gösterdiği ifade edilmektedir. ApMV nin virulent ırklarının üründe %20-40 a varan azalmalara yol açtığı da kaydedilmiştir. (Nemeth, 1986; Smith, 1998; Brunt et al., 1996). Yaprak bitlerinin beslenme zararından kaynaklanan mozaik, iz element eksikliklerinden kaynaklanan renk değişiklikleri ile mozayiğin ApMV enfeksiyonu ile karıştırılabileceği bildirilmektedir (Nemeth 1986). Nemeth (1986), ApMV ü odunsu indikatör bitkilerinin Malus pumila, Photinia villosa, otsu test bitkilerinin ise C. sativus, T. fournieri ve Cymamopsis tetragonoloba olduğu bildirilmektedir. Jawhar et al., (1996); Myrta et al., (1996) ve Zeramdini et al., (1996), sert çekirdekli meyve ağacı virüsleri ile yaptıkları çalışmalarda ApMV, ACLSV, AMV, CLRV, PDV, PNRSV, PPV, RRV, SLRSV, TBRV ve ToRSV adlı viral etmenleri dikkate almışlar ve tanıyı otsu indikatör bitkilere % 2.5 nikotin içeren 0.1M fosfat tamponu yardımıyla mekanik inokulasyon, GF 305 şeftali çeşidine kabuk aşısı ve ELISA testleriyle gerçekleştirmişlerdir. Cherry leaf roll nepovirus (Kiraz yaprak kıvrılma nepovirus) unun 28 nm çapında yuvarlak partiküllü, tek sarmallı ve iki parçalı RNA içeren

14 13 bir virüs olduğu, virüsün % 0-41 nükleik asit ve % protein içerdiği belirtilmiştir. CLRV nin daha önceden nepovirus grubu içerisinde yer aldığı, günümüzde Comoviridae familyası içerisinde nepovirus cinsinin bir türü olarak nitelendirildiği bildirilmektedir (Pallas et al., 1991; Brunt et al., 1996). CLRV nun kiraz ve vişne ağaçlarını enfekte eden tip ırkının Xiphinema coxi, X. diversicaudatum, X. vuittenezi nematodlarıyla, tohumla ve polenle taşındığı belirtilmiştir (Jones, 1985; Nemeth, 1986). CLRV ile enfekteli kiraz ve vişne ağaçlarında yapraklanma ve çiçeklenme gecikir, yaprak kenarları yukarı doğru kıvrılır, ilkbaharda yapraklar bazı çeşitlerde morumsu kırmızı olur ve fidanlarda açık yeşil halkalı lekeler görülür. Diğer belirtiler yapraklarda sarımsı yeşil lekeler, erken yaprak dökümü, enasyonlar, rozet oluşumu, meyve deformasyonları, meyvenin dikiş yerinde derin çatlaklar, verimde düşüklükler ve bir yıllık sürgünlerde zamk akıntılı kanser yaraları şeklindedir (Nemeth, 1986). Kegler et al., (1966), CLRV nün mekanik inokulasyonunda 0.02 M Na-DİECA içeren 0.1 M fosfat tamponunu (ph 7.5) kullanmışlardır. Torrance (1981), kış aylarında kiraz ağaçlarından aldıkları çeliklerdeki tomurcukları özel şartlarda uyandırarak ELISA yardımıyla CLRV, PDV ve PNRSV yi tanımlamıştır. Plum bark necrosis stem pitting-associated virüsü (PBNSPaV) Türkiye de ilk olarak Doğu Anadolu bölgesinde tespit edilmiştir. Nested- PCR yöntemiyle teşhiş edilen PBNSPaV kiraz ağaçlarında zamklanma,

15 14 gövdede incelme, kabuk dokusunda ve kabuk dokusunun alt kısmında şekil bozuklukları gibi belirtiler göstermektedir. Doğu Anadolu bölgesinde testlenen kiraz ağaçların %77 sinde bu virüs saptanmıştır (Sipahioğlu et.al., 2006). Plum pox potyvirus 760x20 nm boyutlarında çok kıvrımlı ipliksi bir partiküle sahip tek sarmallı RNA içeren bir virüs olduğu, virüs partiküllerinin %7 nükleik asit ve %93 oranında da protein içerdikleri kaydedilmiştir. PPV nin önceleri Potato virus Y (PVY) grubuna dahil edilmiş olmasına rağmen günümüzde Potyviridae familyasında Potyvirus cinsi altında değerlendirildiği bildirilmiştir (Kegler and Schade, 1971; Brunt et al., 1996). PPV nun kayısı, erik ve şeftalilerde enfeksiyonlara neden olduğu bilinirken (Brunt et al., 1996), son yıllarda bu virüsün bu bitkiler dışında badem, ceviz, kiraz ve vişneyi de enfekte edebildiği saptanmıştır (Gottwald et al., 1995; Baumgartnerova, 1996). PPV ü kiraz ve vişne ağaçlarında yapraklarda damar açılması, damar bantlaşması, klorotik meşe yaprağı formu ve bazı yapraklarda şekil bozukluğuna sebep olduğu ifade edilmektedir (Crescenzi et al., 1997). Zeramdini (1996), PPV ile enfekteli erik yaprak ve meyvelerini 0.03 M kafein ve M Na-DIECA içeren 0.02 M fosfat tamponunda ezerek N. clevelandii ile C. foetidum a aşılayarak virüse özgü belirtileri elde etmiştir. Kegler ve Schade (1971), PPV nun tanısında otsu indikatörlerden C. foetidum, N. clevelandii, odunsu indikatörlerden ise Prunus

16 15 domestica, P. persicae ve P. armeniaca kullanmışlar, virüsün C. foetidum da sistemik olmayan klorotik veya nekrotik lokal lekelere; odunsulardan P. persicae de ise yapraklarda açık sarı renkte damar açılması, klorotik lekeler ve şekil bozukluğu şeklinde belirtileri gösterdiğini kaydetmişlerdir. Louro ve Corvo (1986), biyolojik indekslemede PPV ile enfekteli kayısı ağaçlarından aldıkları kabukları P. persicae (cv. GF 305) e kabuk aşısı yöntemiyle inokule etmişler ve bitki üzerinde yapraklarda damar açılması, büyük lekeler ve kıvrılma şeklinde lekeler gözlemişlerdir. Dosba et al., (1986), şeftalilerde ELISA ile en iyi sonuçları 1-2 yaşlı sürgünler, kabuklar ve genç yapraklarla, kayısılarda çok genç sürgünler, meyveler ve yapraklarla aldıklarını kaydetmişlerdir. Nemeth, (1986), PPV nun şeftali ağaçlarında ELISA ile tanısının ağustos ayından sonra uygun olmadığını bildirmektedir. PDV (Erik cücelik ilarvirüsü) partiküllerinin yuvarlaktan (19-26 nm çap) 73 nm boyunda kısa basil şeklinde kadar olabildiği bildirilmiştir. Virüs partiküllerinin tek sarmallı RNA içerdikleri, kılıf proteinin molekül ağırlığının dalton olduğu ve virüs partiküllerinin %14 nükleik asit ve % 86 protein içerdiği belirtilmektedir (Brunt et. al., 1996). PDV nin eskiden ilarvirüs grubunun bir üyesi olarak kabul edildiği (Fulton, 1970; Nemeth, 1986; Smith, 1998), fakat artık Bromoviridae familyasında Ilarvirus cinsinin 4. altgrubu altında incelendiği kaydedilmektedir (Brunt, 1996).

17 16 PDV nün konukçu bitkilerinin yetiştirildiği dünyanın heryerinde bulunduğu bildirilmiştir. Virüsün özellikle kiraz ve vişnede tohum ve polenle taşındığı ifade edilmektedir (Fulton, 1970; Smith et. al., 1988). Anonymous (1951), Fulton (1970), Nemeth (1986) ve Smith et al., (1998) e göre PDV tüm sert çekirdeklileri enfekte edebilmektedir. Virüsün simptomatoloji ve konukçu dizisi bakımından farklı pek çok ırkının bulunduğu, ırkların oluşturduğu zararın diğer virüslerle sinerjistik etki ile arttığı ifade edilmektedir. PDV nin kiraz ve vişnelerde yapraklarda klorotik halka ve lekelere beneklenmelere ve nekrotik lekelere yol açtığı bildirilmektedir. Kegler (1966), sert çekirdekli meyve ağaçlarından otsu indikatör bitkilere ilk virüs naklinin 1948 yılında vişneden hıyar bitkisine yapıldığını belirtmişler, yaptıkları çalışmada PDV ve PNRSV yi sert çekirdeklilerden hıyara 0.01 M fosfat tamponu (ph 7.5) yardımıyla nakletmişlerdir. Jones et al., (1985) PDV ve PNRSV nün tanılanmasında indirekt ELISA tekniğini kullanmışlardır. Crosslin et al., (1992), kiraz ve şeftalilerde PDV nü indirekt ELISA ile tanılamışlardır. Prunus necrotic ringspot ilarvirus (Prunus halkalı leke ilarvirus) unun 23, 25, 27 nm çapa sahip, üç farklı boyutta yuvarlak partiküle sahip tek sarmallı, üç parçalı RNA içeren bir virüs olduğu belirtilmekte, virüs partiküllerinin de % 16 nükleik asit ve %84 protein içerdikleri bildirilmektedir (Fulton,1970; Brunt et al.,1996). Bu virüsün

18 17 günümüzde Bromoviridae familyasının 4. alt grubunda Ilarvirus cinsinin bir üyesi olarak değerlendirildiği kaydedilmektedir (Brunt et. al., 1996). PNRSV nin tohum ve polenle taşındığı bildirilmektedir. ABD de yapılan bir çalışmada bal arılarında ELISA ile PNRSV tespit edilmiş, bunun nedeninin enfekteli polenler olduğu belirtilmiştir. (Fulton,1970; Hamilton et al., 1984; Brunt et. al., 1996). PNRSV nin konukçularının yetiştirildiği dünyanın her yerinde yayıldığı ve PDV ile birlikte Avustralya da sert çekirdekli meyvelerdeki en yaygın virüsler olduğu tespit edilmiştir (Brunt et al., 1996). PNRSV kiraz ve vişnelerde line pattern (çizgi deseni), rugose mosaic (kırışık mozaik), necrotic ringspot (nekrotik halkalı leke) hastalıklarına sebep olur. Virüsün şok devredeki belirtileri yapraklarda nekrotik ve klorotik hatlar, halkalar ve lekeler şeklindedir. Nekrotik halka ve lekelerin orta kısımlar sonradan düşer ki bu da yaprağa saçma deliği görünümü verir. Bu devrede genç ağaçlar ölebilir. Sour cherry line mosaic (vişne hat mozaik) ve sour cherry fruit necrosis (vişne meyve nekrozu) hastalıklarına PNRSV ile birlikte sırasıyla CLRV ve ACLSV nin neden oldukları bildirilmektedir (Kegler, 1965; Nemeth, 1986; Smith et al., 1998). Kegler (1960), PNRSV ü kiraz yapraklarından otsu indikatör bitkilere 0.07 M sörensen fosfat tamponunu (ph 7) kullanarak nakletmiştir. Ascui ve Alvarez (1988), PNRSV ile enfekteli kirazların dormant tomurcuklarında virüsü ELISA ile belirlemişlerdir.

19 18 Kiraz ağaçlarında hastalık yapan virüslerin teşhis edilmeleri, bu virüslerin sebep olduğu hastalıkların kontrol edilebilmeleri için gereklidir. Güvenilir teşhis yöntemlerinin önemi; sertifikasyon programlarındaki seleksiyon aşamasında, virüslerin ve virüs ırklarının tanınmasında, virüslerin karakterizasyonunda, virüslerin epidemiyolojilerinin araştırılmasında yaygın olarak kullanılmaktadır (Hansen et al., 1986). Sert çekirdekli meyve türlerinde görülen virüslerin teşhis edilmesi oldukça güçtür. Virüsler genellikle bitkide düzensiz olarak dağılırlar ve konsantrasyonları düşüktür. Genel olarak bu türlerde bulunan virüsler biyolojik (indeksleme ve mekanik inokulum) ve serolojik (ELISA) yöntemlerle, moleküler hibridizasyon ve PCR (Polymerase chain reaction) ile teşhis edilmektedirler (Fulton, 1976). Ülkemizde de bu yönde bazı çalışmaların yapıldığı görülmektedir. Blodgett et al., (1970), yaptıkları çalışmada Amasya Yeniceköy deki bütün kiraz ağaçlarının Amasya kiraz hastalığına yakalanmış olduğunu ve etmenin de muhtemelen viral kökenli olduğunu bildirmişlerdir. Bununla birlikte bu hastalığa Yeniceköy e 90 km uzaklıktaki Tokat ta rastlanmazken Bandırma, Bursa, Yalova, İstanbul çevresi ve İzmir de rastlandığını ortaya koymuşlardır. Demirören et al. (1971), Amasya kiraz hastalığı belirtileri gösteren kirazlardan serolojik testler, GF 305 şeftali çeşidine kabuk aşısı ve Chenopodium quinoa ya mekanik inokulasyon yaparak Raspberry ringspot nepovirus enfeksiyonu tespit etmişlerdir.

20 19 Kurçman (1977), yaptığı çalışmada Afyon ilinde vişne stecklenberger hastalığını (PNRSV nün bir ırkı), kiraz halka leke virüs hastalığını (PNRSV nin bir ırkı), kiraz pfeffinger hastalığını (RRV+PDV veya AMV+PDV) ve kiraz yaprak kıvrılma virüs hastalığını (CLRV) saptamıştır. Çıtır (1987), Amasya ilinde Amasya kiraz hastalığına neden olan etmenin tanımlanmasına ait ön çalışmaları yapmıştır. Dunez (1986), yaptığı çalışmada ACLSV, PNRSV, PDV, PPV ve SLRSV nin İzmir ve Yalova daki sert çekirdekli meyve ağaçlarında bulunduğunu bildirmiştir. Açıkgöz et al., (1994), çift sarmallı RNA (dsrna) analizi yöntemi ile Amasya kiraz hastalığına neden olan etmenin tanısına yönelik çalışmalar yapmışlardır. Azeri (1994), yılları arasında yaptığı surveylerde Çanakkale, Balıkesir, İzmir, Manisa ve Aydın bölgelerindeki fidanlık ve bahçelerde ApMV, Peach rosette mosaic nepovirus (PhRMV), PDV, PNRSV, PPV, RRV, SLRSV ve ToRSV enfeksiyonlarını simptomatolojik gözlemler ve ELISA testleriyle saptamıştır. Malatya da, bazı şeftali, kiraz, vişne ve güllerde serolojik olarak PNRSV belirlenmiş, ancak kayısılarda bu hastalık saptanmamıştır (Sipahioğlu, 2001). Türkiye den sağlanan izolatların da yer aldığı Akdeniz ülkelerinden sağlanan PNRSV izolatları ile yapılan bir serolojik çalışmada 35 serogrup

21 20 oluşmuş ve grupların konukçu türü, coğrafi orijini ve simptomları ile aralarında herhangi bir bağlantı bulunmamıştır (Myrta et al., 1996). Ülkemizin farklı bölgelerinde Plum pox virüs ünün belirlenmesi ve gelişmiş yöntemler ile PPV izolatlarının araştırılması amacı ile Malatya yöresi dışında kalan ülkemizin önemli yetiştirici bölgelerinde tesadüfi olarak seçilen bahçelerden PPV ye özgü belirtiler gösteren badem, erik, kayısı, kiraz, nektarin, şeftali ve vişne ağaçlarından yaprak örnekleri toplanmıştır. Toplam 52 örnekten iki adetinin PPV ile enfekteli olduğu ve bu iki kayısı izolatının Marcus ırkı (M straini) olduğu belirlenmiştir (Sertkaya ve ark., 2004). Van ve civarında yetiştiriciliği yapılan sert çekirdekli meyve türlerinde sorun olan viral ve fungal hastalıkların belirlenmesine yönelik yapılan bir çalışmada; PNRSV, ACLSV, ApMV, PDV ve PPV virüslerinin tespiti için yapılan surveyler kapsamında ELISA ile test edilen 306 ağaçtan 154 ünü kayısı, 45 ini kiraz, 23 ünü şeftali, 41 ini erik ve 32 sini vişne oluşturmuştur. Testlenen örneklerde PDV ve ACLSV infeksiyonları tespit edilmiştir. ELISA testleri ile ortaya konan virüslerden biri olan PDV nin neden olduğu infeksiyon oranı kayısıda %0.6, kirazda %7.1 ve vişnede ise %31.2 olarak belirlenmiştir. ACLSV infeksiyonuna sadece şeftalilerde %39.1 oranında rastlanılmıştır. Kayısı, erik, vişne, kiraz ve şeftali örneklerinin hiçbirinde PNRSV, PPV ve ApMV infeksiyonlarına rastlanmamıştır. Virüslerden kaynaklanan ortalama infeksiyon oranı ise %7.8 olarak belirlenmiştir (Sipahioğlu et al., 2004). Sert Çekirdekli meyve yetiştiriciliğinin Türkiye de, Doğu Anadolu Bölgesi dışında, yoğun olduğu bölgelerde Elma klorotik yaprak

22 21 lekesi virüsü (ACLSV) nün yaygınlığını araştırılmıştır. Toplanan tüm virüs simptomu gösteren kiraz, şeftali, nektarin, kayısı ve erik örnekleri DAS-ELISA ve revers transkripsiyon polimeraz zincir reaksiyonu (RT- PCR) tekniği ile test edilmiştir. 369 bitki örneğinin arasından 13 ağacın ACLSV ile enfekteli olduğu ELISA ile tespit edilmiştir. Diğer taraftan, RT-PCR 51 pozitif ortaya koymuştur (Ulubaş ve Ertunç, 2003). PNRSV ile infekteli Prunus mahaleb ve ACLSV ile infekteli Prunus persica L. yapraklarının farklı bölgelerinden alınan doku diskleri bu virüslerin yaprak dokusundaki yayılımlarını belirlemek amacıyla sırasıyla ELISA ve RT-PCR teknikleri ile analiz edilmiştir. Elde edilen bulgular ışığında PNRSV ile ACLSV nin konukçularındaki dağılımını belirlemede ELISA testi ile RT-PCR testi arasında bir korelasyon saptanmamıştır (Sipahioğlu et al., 2005). İki farklı teşhis yönteminin (DAS ELISA ve RT-PCR) odunsu konukçu P. mahaleb e transfer edilen Malatya izolatı Prunus necrotic ringspot virüs ünü (PNRSV) teşhisindeki başarısının karşılaştırmalı analizi yapılmıştır. ELISA testi ile karşılaştırıldığında lokal PNRSV izolatını teşhiste RT-PCR ın daha hassas olduğu tespit edilmiştir. (Usta et al., 2005). Sipahioğlu et al., (2006), yaptığı çalışmada Doğu Anadolu bölgesinde nested-pcr yöntemiyle testlediği 45 ağaçtan 35 inde PBNSPaV bulunduğunu bildirmiştir.

23 22 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Materyal ELISA testlerinde kullanılan bitki materyali Araştıma materyalini oluşturan virüs hastalığı belirtisi gösteren ve virüsler ile enfekteli olduklarından şüphe edilen bitki örnekleri (yaprak, meyve ve kabuk dokusu) İzmir ilinde kiraz yetiştiriciliğinin yoğun olarak yapıldığı Kemalpaşa, Ödemiş, Bayındır, Bornova, Beydağ, Kınık, Buca, Kiraz ve Tire ilçelerinden alınmıştır. Örnek alınacak ilçeler belirlenirken meyve veren ağaç sayısının en az 5000 olmasına dikkat edilmiş ve toplanması hedeflenen 400 örnek meyve veren ağaç sayıları göz önünde bulundurularak ilçelere dağıtılmıştır. Örnek sayıları ve alındığı ilçeler Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1. Elisa testi yapılan örnek sayısı ve örneklerin alındığı ilçeler İlçeler Toplanan Örnek Sayısı Bornova 15 Buca 15 Bayındır 20 Beydağ 10 Kemalpaşa 260 Kınık 10 Kiraz 20 Ödemiş 35 Tire 15 Toplam İndikatör Bitkiler

24 23 ELISA ve PCR testleri sonucunda virüslü çıkan örneklere ve virüslü olduğundan şüphe edilen bitki örneklerine biyolojik tanılama çalışmaları yapılmıştır. Bu çalışmalar indikatör (test) bitkilerine mekanik inokulasyon ve kabuk aşılama şeklinde olmuştur. Kullanılan indikatör bitkiler; Chenopodium amaranticolor Cucumis sativus Gomphrena globosa Chenopodium quinoa Nicotiana occidentalis Bu indikatör bitkiler Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü nde ve IAMB (Instituts Agronomiques Mediterraneesns Bari) de bulunan sera (Şekil 3.1) ve iklim odalarında yetiştirilmiştir.

25 24 Şekil 3.1. Mekanik inokulasyon yapılan test bitkilerinden bir görünüm ELISA Testlerinde Kullanılan Materyal İzmir ili kiraz üretim alanlarında virüs ile enfekteli oldukları düşünülen ağaçlardan alınan yaprak, meyve ve doku örnekleri ELISA yöntemiyle test edilmiştir. ELISA testinde Bioreba (Bioreba AG, Reinach, Switzerland) firmasına ait, ApMV, CLRV, PDV, PNRSV, PPV ve ACLSV ticari tanı kitleri kullanılmıştır. Testlemelerde kullanılan solüsyon ve çözeltiler, 96 çukurlu mikroplateler (Nunc F96 Maxisorp) yine aynı firmadan temin edilmiştir.

26 25 Test sonuçlarının değerlendirilmesinde, 405 nm dalga boyunda okuma yapan Titertek Multiskan Plus MK II marka ELISA okuyucusundan yararlanılmıştır Total Nükleik Asit Ekstraksiyonunda kullanılan materyal İzmir ili kiraz üretim alanlarında virüs ile bulaşık olduğu şüphelenilen ağaçlardan alınan yaprak, meyve ve doku örnekleri, TNA ekstraksiyonunun materyalini oluşturmuştur. RNA ekstraksiyonu sırasında Sigma D37520 marka santrifuj, çözeltiler, ETG MBT 250 marka ısıtıcı, -30 o C ye kadar soğutabilen derin dondurucu kullanılmıştır cdna Sentez Aşamasında Kullanılan Materyal Daha öncene hazırlanmış olan TNA örnekleri, Fermantas marka cdna sentez kiti, ısıtıcı, shaker (Heidolph Unimax 2010) ve inkubatör (Nüve ES500) materyal olarak kullanılmıştır.

27 PCR Testlerinde Kullanılan Materyal Analytikjena Speedcycler marka thermocycler (Şekil 3.2), solüsyonlar, çözeltiler, ve deki primerler ve 96 hazneli 25 µl kapasiteli PCR plate materyal olarak kullanılmıştır. Şekil 3.2. PCR testlerinde kullanılan Analytikjena thermal cycle.

28 27 Şekil 3.3. PCR sonuçlarını değerlendirmede kullanılan DNR jel görüntüleme sistemi RT-PCR Testlerinde Kullanılan Primerler PDV için kullanılan spesifik primer; (I) 5 -TAG TGC AGG TTA ACC AAA AGG AT-3 (II) 5 -ATG GAT GGG ATG GAT AAA ATA AT-3 PNRSV için kullanılan spesifik primerler; (I) 5 -GAG GTC TGG TCC CAC TCA GG-3 (II) 5 -TCA CTC TAG ATC TCA AGC AG-3 (I) (II) 5 - TCA CTC TAG ATC TCA AGC AG-3 5 -CGT TTT TCT TTC TTT CTT CC-3

29 28 ACLSV için kullanılan spesifik primer; (I) (II) 5 -CAG ACC CTT ATT GAA GTC GAA-3 5 -GGC AAC CCT GGA ACA GA Nested PCR Testlerinde Kullanılan Primerler PBNSPaV için kullanılan spesifik primerler; (I) (II) (I) (II) ASP1 5 -CGG TAG GGC TGT GAC TAC CG-3 ASP2 5 -GTA GTC CGC TGG TAC GCT ACA AG-3 ASPn 5 -ACG AAT CCG AGT TTC GTC GC-3 ASPn 5 -AGG CAC TAC TGA CCT GTA GG Çoğaltılmış PCR Ürünlerinin Analizinde Kullanılan Materyal Owl A2 ve Owl B1 marka jel elektroforez düzeneği, Consort E815 marka güç kaynağı, örneklerin ve jellerin hazırlanmasında ve boyanmasında kullanılan kimyasallar, çözeltiler ve DNA markerı materyal olarak kullanılmıştır. Tüm jellerin fotoğrafları DNR Bioimaging Systems Minibis Pro marka jel görüntüleme cihazında çekilmiştir.

30 Metod Araştırma alanı ve Örneklerin Toplanması Araştırma alanını, İzmir ilinin kiraz yetiştirilen bölgeleri kapsamaktadır. Bu yörelerdeki kiraz bahçeleri gezilerek virüs hastalıkları belirtisi gösteren bahçelerde gözlemler yapılarak, hastalık belirtisi gösteren ağaçlardan yaprak, sürgün, meyve ve dal örnekleri alınarak örnekleme yapılmıştır. Gezilen ve örnek alınan kiraz bahçeleri kaydedilerek, yeri ve mevkii belirtilmiş, ağaçlarda nasıl belirtiler gözlemlendiği kaydedilmiş ve gerekli durumlarda ağaçların ya da belirtili organların fotoğrafları çekilerek kaydedilmiştir. Örnekler ilkbahar aylarında toplanmıştır. Hastalık belirtisi gözlemlenen bahçelerden toplanan örnekler polietilen torbalar içinde etiketlenerek buz kutusunda laboratuvara getirilmiş ve testleri yapılıncaya kadar -20 o C de derin dondurucuda saklanmıştır (Matthews, 1991) İndikatör Bitkilerin Yetiştirilmesi Çalışmada kullanılan indikatör bitkiler Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü nde ve CIHEAM Enstitüsü nde (İtalya- Bari) bulunan sera ve iklim odalarında yetiştirilmiştir. İndikatör bitkilerin tohumları serada büyük saksılara ekilmiştir ve daha sonra fideler küçük

31 30 boy (15 cm çaplı) saksılara şaşırtılmıştır. Yetiştirme ortamı olarak kullanılan harç 1:1 oranında karıştırılan toprak ve torf karışımından oluşmuştur. Elde edilen harç metilbromid ile sterilize edildikten sonra kullanılmıştır. Test bitkileri 2-3 yapraklı oldukları zaman, toplanan bitki örneklerinden hazırlanan ekstraktlar bu bitkilere mekanik inokulasyon yöntemi uygulanarak inokule edilmiştir (Matthews, 1991). Şekil 3.4. İndikatör bitkilerin tohumlarının ekildiği küvetler. Şekil 3.5. İndikatör bitkilerin şaşırtıldığı saksılar.

32 Virüslerin Test Bitkilerine Taşınması (Mekanik İnokulasyon Yöntemi) Test bitkileri belirli bir büyüme dönemine ulaştıkları zaman, toplanan bitki örneklerinden fosfat tamponu kullanılarak hazırlanan ekstraktlar bu bitkilere mekanik inokulasyon yöntemi uygulanarak inokule edilmiştir. Bu yöntemde örnekler steril porselen havan içinde 1/10 (ağırlık/hacim) oranında 0,01 M fosfat tamponu ilave edilerek ezilmiş ve tülbentten süzülerek bir beher içine alınmıştır. Elde edilen ekstrat, yapraklarına aşındırıcı serpilmiş test bitkilerine steril cam spatül yardımıyla dairesel hareketler yaparak fazla basınç uygulamadan ayrı ayrı inokule edilmişlerdir. İnokule edilen test bitkilerinin yaprakları yaklaşık 2 dakika beklendikten sonra su ile yıkanmıştır. Saksılar daha sonra 24 o C sıcaklık, nem, ışık şiddeti ve gün uzunluğu kontrol edilebilen iklim odasında tutularak bu bitkilerde belirti oluşup oluşmadığı gözlenmiş, oluşması durumunda belirti tipi değerlendirip, fotoğrafı çekilerek kaydedilmiştir (Matthews, 1991) ELISA Testinin Uygulanması

33 32 Toplanan tüm belirtili örneklere; ApMV, ACLSV, CLRV, PPV, PDV, PNRSV virüslerinin varlığını saptamak amacıyla ELISA testleri yapılmıştır (Clark, 1977). Virüslü olduğundan şüphe edilen örnekler Bioreba firmasının Ekstraksiyon tamponu ile hazırlanmıştır ve Bioreba firmasının kitlerinde bulunan hazır çözeltiler kullanılarak testlenmiştir. Buna göre testlerin uygulanması aşağıda belirtilen aşamaların izlenmesiyle gerçekleşmiştir. 1. ELISA platelerin her bir çukuruna kaplama tamponunda 1:1000 oranında seyreltilmiş olan IgG den 200 µl eklenerek 37 o C de 4 saat inkube edilmiştir. 2. ELISA plate yıkama tamponu ile yıkanarak 3 dakika beklenmiş ve bu işlem 4 kez tekrarlanmıştır. 3. Ekstraksiyon tamponu ile hazırlanan örnekler, pozitif ve negatif kontroller her bir çukura 200 µl eklenerek 4 o C de bir gece inkube edilmiştir. 4. ELISA plate ikinci aşamada açıklandığı şekilde tekrar yıkanmıştır. 5. Konjuge edilmiş IgG, konjuge tamponu içerisinde 1:1000 oranında seyreltilip her bir çukura 200 µl eklenerek 37 o C de 4 saat inkube edilmiştir. 6. ELISA plate ikinci aşamada açıklandığı şekilde tekrar yıkanmıştır.

34 33 7. Substrat çözeltisine 1mg/ml olacak şekilde substrat (paranitrofenilfosfat) her bir çukura 200 µl konularak oda sıcaklığında inkube edilmiştir. Sonuçlar iki şekilde değerlendirilmiştir. a) Sarı renk oluşumu gözlenerek b) 405 nm dalga boyunda absorbans değerleri ölçülerek. Çukurlardaki sarı renk oluşumu pozitif olarak değerlendirilmiştir. Ayrıca, sağlıklı örneğin 2 katı ve fazlası ya da 0,100 ün üzeri absorbans değerine sahip örnekler etmenlerle enfekteli olarak değerlendirilmiştir. Şekil 3.6. E.Ü. Ziraat Fakültesi Bitki Koruma Bölümü Viroloji laboratuarında yapılan ELISA testleri.

35 34 Şekil 3.7. ELISA testlerinden görünüm Total Nükleik Asit (TNA) Ekstraksiyonu TNA ekstraksiyonunda kullanılan tüm malzemeler yapısına uygun olarak ekstrakte edilmiştir. Her izolat için yaklaşık 100 mg yaprak kullanılarak, 1 ml %1 mercapto-ethanol içeren ekstraksiyon tampon çözeltisi varlığında steril örnek poşetleri içinde homojenize edilmiştir. Tüpler ısıtıcıda 70 0 C 10 dakika inkube edildikten sonra 5 dakika buzda bekletilmiştir. Daha sonra örnekler rpm de 10 dakika santrifüj edilmiş, üst sıvıdan 300 µl alınarak yeni tüplere aktarılmıştır. Tüplere 150 µl ethanol, 300 µl 6M NaI, 25 µl silika süspansiyonu eklenerek 10 dakika oda sıcaklığında inkubasyona bırakılmıştır. Tüpler 6000 rpm de 1 dakika santrifüj edildikten sonra üst sıvı atılmış tüpün içinde kalan silika partiküllerinin yıkanması için 500 µl yıkama tampon çözeltisi eklenmiştir. Bu işlemden sonra tüpler 6000 rpm de santrifüj edilmiştir. Yıkama işlemi iki kere yapılmıştır. Yıkamadan sonra silika partikülleri içeren tüplere 150 µl RNAse dan ari steril su eklenmiştir. Tüpler 70 o C de 4 dakika ısıtıcıda inkube edilen tüpler rpm de 3 dakika santrifüj edilmiştir. Tüpün üst kısmında kalan sıvıdan 145µl alınarak yeni tüplere aktarılmış ve TNA ekstraksiyonu tamamlanmıştır. Örnekler cdna sentez

36 ve PCR uygulamaları yapılıncaya kadar -20 o C de derin dondurucuda saklanmıştır (Foissac et al., 2001) Komplementer DNA (cdna) Sentezi TNA ekstraksiyonu yapılmış olan örneklere komplementer DNA (cdna) sentezi gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla Fermentas firmasından temin edilen cdna sentez kiti firmanın belirttiği prosedür kullanılarak sentez gerçekleştirilmiştir. Bu yönteme göre ilk olarak ependorf tüplerin içerisine 0,1 5 µg total RNA, 1 µl random hexamer primer konulmuş ve DEPC su ile 12 µl ye tamamlanmıştır. 70 o C de 5 dakika inkubasyon uygulandıktan sonra tüpler buz üzerine konulmuş ve içlerine sırasıyla 4 µl 5X reaction buffer, 1 µl Ribolock Ribonuclease inhibitor, 2 µl 10mM dntp mix eklenmiştir. Kısa süreli santrifüj uygulandıktan sonra 25 o C de 5 dakika inkubasyon uygulanmıştır ve tüplerin içine 1 M-MuLV reverse transcriptase eklenerek toplam 20 µl hacme ulaşılmıştır. Karışım daha sonra 25 o C de 10 dakika, 42 o C de 60 dakika ve 70 o C de 10 dakika inkubasyon uygulanarak cdna sentez aşaması tamamlanmıştır PCR Yöntemi

37 36 PCR işlemi Fermentas firmasının önerdiği prosedüre göre 50 µl hacimde yapılmıştır. RT-PCR testlerinde kullanılan primerler ve de verilmiştir. Steril PCR tüplerine 25 µl 2x PCR master mix, 1 µl primer1, 1 µl primer 2, 2 µl cdna ve 21 µl nuclease free su eklenmiştir. Tüpler PCR cihazına yerleştirilerek test edilecek virüs için spesifik olan program uygulanmıştır (Candressa ve ark., 1995). Tüm işlemler boyunca eldiven kullanılmış ve herhangi bir kontaminasyon olasılığını belirlemek için de nükleik asit eklemeden sadece karışımın yeraldığı bir tüpte (kontrol) PCR programında çoğaltma işlemine alınmıştır. Çizelge 3.2. PCR testlerinde uygulanan sıcaklık aralıkları ve döngü sayıları PCR testlerinde kullanılan programlar PNRSV 1X 94 o C 3d 41X 92 o C 30s 1X 72 o C 5d PBNSPaV (nested 1) PBNSPaV (nested 2) 54 o C 30s 72 o C 60s 1X 94 o C 1.5d 30X 94 o C 20s 58 o C 30s 72 o C 45s 1X 92 o C 1.5d 30X 94 o C 20s 58 o C 30s 72 o C 45s 1X 72 o C 5d 1X 72 o C 5d

38 37 ACLSV 1X 94 o C 5d 40X 94 o C 30s 1X 72 o C 10d 55 o C 45s 72 o C 60s PDV 1X 95 o C 5d 35X 94 o C 60s 1X 72 o C 7d 60 o C 60s 72 o C 120s Şekil 3.8. PCR reaksiyonunun şematik olarak gösterilmesi.* *

39 38 1. Basamak (Denaturation): PCR reaksiyonu içinde yer alan çift zincirli kalıp DNA nın 95 o C de denatürasyonu, 2. Basamak (Annealing): Birbirinden ayrılmış DNA zincirlerine primerlerin o C de bağlanması, 3. Basamak (Extension): Taq polimeraz enziminin maksimum aktivite gösterdiği sıcaklık olan 72 o C de yeni sentezlenen DNA zincirinin uzaması Agaroz Jel Elektroforez Yöntemi 100 ml 1X TAE tamponu içine 1,5 g agaroz konularak mikrodalga fırında 3.5 dakika tutulmuş ve eriyik haline getirilmiştir. Stok TAE 50X çözeltisi; 40mM Tris-acetate (ph 8), 57.1 ml Glacial Acetic Acid, 100 ml 0.5 M EDTA (ph 8) den oluşmaktadır. Bu karışım 1000 ml ye tamamlanarak stok solüsyon oluşturulmuştur. Stok çözeltiden 20 ml alınarak distile H 2 O ile 1000 ml ye tamamlanarak 1X TAE konsantrasyon hazırlanmıştır. Elektroforez koşumu, 100 V da, yatay düzenekte 60 dakika süreyle ve 1X TAE çözeltisi içerisinde uygulanmıştır. Jel yükleme yapılmadan önce örneklere (10µl örneğe) 2µl yükleme tamponu eklenmiştir.

40 Jel Görüntüleme Cihazında PCR Sonuçlarının Değerlendirilmesi Ethidium bromide ile boyanan jel, DNR Bio-Imaging marka Jel Dokümantasyon ve Analiz Sistemi ile fotoğrafı çekilerek kayıt edilmiştir. a c b d

41 40 Şekil 3.9. RT-PCR testlerindeki aşamalar. a) PCR tüplerinin hazırlanması, b) PCR ürünlerinin agar jele konulması, c) PCR ürünlerinin 80V da koşumu, d) ethidium bromide uygulaması. 4. ARAŞTIRMA SONUÇLARI 4.1. SURVEY SONUÇLARI Toplanan örneklerde görülen belirtiler İzmir ili ve ilçelerinde önemli kiraz yetiştiriciliği yapılan bölgelerde 2004 ve 2005 yıllarında yapılan surveylerde bölgeyi temsil edebilecek bahçeler seçilmiş ve bu bahçelerden virüs belirtisi gösteren ve belirti göstermeyen ağaçlardan örneklemeler yapılmış örneklenen ağaçlar etiketlenmiş ve GPS cihazı ile yeri belirlenmiştir. Gerçekleştirilen çalışmada kiraz üretim alanlarında sert çekirdekli meyve ağaçlarında hastalık oluşturan virüslerin, özellikle de PDV, PNRSV, ACLSV ve PBNSPaV gibi virüslerin tipik belirtileri gözlenmiştir.

42 41 Araştırma alanlarını kapsayan Kemalpaşa, Ödemiş, Tire, Bornova, Buca, Bayındır, Beydağ, Kınık ve Kiraz ilçe ve köylerindeki bahçelerde görülen belirtiler Şekil 4.1 de verilmiştir. Belirti Tipi Yapraklarda Gözlenen Belirtiler Meyvelerde Gözlenen Belirtiler Gövde ve Dallarda Gözlenen Belirtiler Şekil bozukluğu ve deformasyonlar Şekil bozukluğu ve deformasyonlar Genel görünümde anormallikler Renk değişiklikleri Biçimsiz meyve oluşumu Gövdede zamk akıntısı Mozaik belirtisi Renk değişiklikleri ve lekeler Kabuk dokusu altında girintiler Yaprak ayasında daralma Aşı bölgesinde anormallikler Nekrotik alanlar Dallarda şekil bozuklukları Yapraklarda delikler Biçimsiz yaprak oluşumu Halka şeklinde lekeler

43 42 Şekil 4.1. İzmir ili ve ilçelerinde araştırma alanlarındaki kiraz bahçelerinde gözlenen belirti tipleri. Yapraklarda gözlenen renk değişiklikleri ve halka şeklinde lekeler gibi belirtiler ELISA testlerinde PDV enfekteli olarak saptanmıştır (Şekil 4.2), saçma deliği şeklinde shot hole belirtileri gösteren yaprakta ise PNRSV saptanmıştır (Şekil 4.3). Şekil 4.2. Yapraklarda klorotik halka lekeler.

44 43 Şekil 4.3. Yapraklarda saçma deliği (shot hole) belirtisi. PBNSPaV adlı virüsle enfekteli olduğu saptanan, gövdede zamk akıntısı, kabuk dokusunda girinti ve çıkıntılar gibi belirtiler gösteren ağaçlardan çekilmiş fotoğraflar Şekil 4.2 ve Şekil 4.3 te görülmektedir. Şekil 4.4. Gövdede zamk akıntısı.

45 44 Şekil 4.5. Kabuk dokusu altında girinti ve çıkıntılar ELISA Testleri Sonuçları Toplanan örneklere; ApMV, ACLSV, CLRV, PPV, PDV, PNRSV virüslerinin varlığını saptamak amacıyla ELISA testleri yapılmıştır. Elisa testleri sonucunda testlenen 400 örneğin 86 sının virüslerle enfekteli olduğu saptanmıştır. Enfekteli 86 örneğin 49 unda PDV, 9 unda ACLSV, 24 ünde PNRSV ve 3 ünde birden fazla virüs saptanmıştır. (Çizelge 4.1.) Çizelge 4.1. İzmir ili ve ilçelerinde ELISA yöntemiyle testlenen örnek sayısı, belirlenen virüsler ve oranları Bölge Örnek Sayısı Saptanan Virüsler Test edilen Enfekteli Enfeksiyon Oranı % PDV ACLSV PNRSV PDV ACLSV PDV ACLSV PNRSV Kemalpaşa Ödemiş Kiraz Bayındır

46 45 Tire Bornova Buca Beydağ Kınık İzmir Toplam Test Bitkilerine İnokulasyon Sonuçları ELISA testlerinde pozitif çıkan örnekler mekanik inokulasyon yöntemiyle test bitkilerine inokule edilmiş, belirtiler gözlemlenerek kaydedilmiştir. (Çizelge 4.2) Çizelge 4.2. Test bitkilerine mekanik inokulasyon sonuçları ve oluşan Örnek belirtiler Cucumis sativus İnokulasyon Yapılan Test Bitkileri ve Oluşan Belirtiler Nicotiana occidentalis Gomphera globosa Chenopodium amaranticolor Kemalpaşa 4 DRA O O O Kemalpaşa 9 YŞB RD, YŞB O O Kemalpaşa 10 DRA,YŞB O O YŞB, B Kemalpaşa 14 O YŞB O O Kemalpaşa 18 O YŞB O B Kemalpaşa 48 DRA,YŞB O RD B Kemalpaşa 51 O O O YŞB Kemalpaşa 84 O YŞB, RD O O Kemalpaşa 92 O O RD O Kemalpaşa 93 DRA,YŞB O O O Kemalpaşa 96 O O O O Kemalpaşa 97 O O O YŞB Kemalpaşa 105 DRA RD O YŞB Kemalpaşa 107 O O RD, YŞB O Kemalpaşa 116 YŞB O O O Kemalpaşa 147 DRA, YRD RD, YŞB YŞB O Kemalpaşa 163 DRA O O B Kemalpaşa 179 DRA, YŞB O O B Kemalpaşa 199 YŞB O O O

47 46 Kemalpaşa 216 DRA, YŞB O YŞB O Kemalpaşa 230 DRA O O O Kemalpaşa 242 O O O O Ödemiş 3 O YŞB O O Ödemiş 9 DRA O O O Kiraz 3 O YŞB, RD O O Kiraz 18 DRA, YŞB,B O O O Bayındır 10 DRA O O O Bayındır 17 DRA O O O Tire 3 DRA, RD O O O Tire 15 O O O YŞB, RD Bornova 3 YŞB, RD O O O Bornova 4 DRA, YŞB O O O Buca 7 O O O YŞB, RD Beydağ 3 DRA, RD O O O DRA: Damarlarda renk açılması, YŞB: Yapraklarda şekil bozukluğu, RD: Renk değişikliği, B: Beneklenme, O : Belirti yok Şekil 4.6. Mekanik inokulasyon sonucu Cucumus sativus ta oluşan damar aralarında açılma ve yaprakta şekil bozukluğu belirtisi.

48 RT-PCR Testleri Sonuçları ELISA testlerinde pozitif çıkan veya pozitif olduğundan şüphe edilen ya da stem pitting belirtisi gösteren örneklere PCR testleri uygulanmıştır. RT-PCR testleri sonucunda 2 örnekte PBNSPaV, 42 örnekte PDV, 17 örnekte PNRSV, 11 örnekte de ACLSV tespit edilmiştir. Çizelge 4.3 te RT-PCR testleri sonuçları görülmektedir. Çizelge 4.3. Araştırma süresince gerçekleştirilen PCR testleri ve sonuçları Virüs İsmi Örnek Sayısı Test edilen Enfekteli Enfeksiyon Oranı % PBNSPaV ,5 PDV PNRSV ACLSV İzmir Toplam PBNSPaV için örneklerin tamamı Kemalpaşa ilçesinden toplanmıştır. 2-PDV, PNRSV ve ACLSV için yapılan PCR testlerinde kullanılan örnekler ELISA testlerinde (+) çıkan ve pozitif olduğundan şüphe edilen örneklerdir. 3-PCR testleri sonucunda ELISA testlerinde saptanamayan 2 PDV li ve 1 ACLSV li örnek tespit edilmiştir.

49 48 Şekil 4.7. ACLSV için uygulanmış olan RT-PCR testi sonucunun Jel görüntüleme sisteminde çekilmiş fotoğrafı. Şekil 4.8. ACLSV için uygulanmış olan RT-PCR testi sonucunun Jel görüntüleme sisteminde çekilmiş fotoğrafı.

50 49 Şekil 4.9. PDV için uygulanmış olan RT-PCR testi sonucunun Jel görüntüleme sisteminde çekilmiş fotoğrafı. Şekil 4.10 PDV için uygulanmış olan RT-PCR testi sonucunun Jel görüntüleme sisteminde çekilmiş fotoğrafı.

51 50 Şekil PBNSPAV için uygulanmış olan Nested PCR testi sonucunun Jel görüntüleme sisteminde çekilmiş fotoğrafı. Şekil PNRSV için iki ayrı primer dizini ile uygulanmış olan PCR testi sonucunun Jel görüntüleme sisteminde çekilmiş fotoğrafı.

52 51 5. TARTIŞMA ve SONUÇ ELISA, Test bitkilerine mekanik inokulasyon ve PCR testlerinin birlikte değerlendirilmeleri sonucunda, İzmir ili ve ilçelerinde kiraz alanlarında yapılan bu çalışmada 400 örneğin 51 inde PDV, 11 inde ACLSV, 24 ünde PNRSV ve 3 ünde de birden çok virüs tespit edilmiştir, Nested-PCR yöntemi ile test edilen 80 örneğin 2 sinde PBNSPaV tespit edilmiştir. Testlenen 400 örnekte CLRV, PPV ve ApMV enfeksiyonları saptanmamıştır. Bu verilere göre İzmir ili ve ilçelerinde kiraz yetiştiriciliği yapılan bölgelerde PDV %12.75, PNRSV %6, ACLSV %2.75, PBNSPAV %2.5 ve birden fazla virüsle bulaşık (mixed infection) %0.75 oranlarda saptanmıştır, %68.5 lik kısımda herhangi bir virüs tespit edilmemiştir. Çizelge 5.1 de araştırma sonuçları, Şekil 5.1 de İzmir ili ve ilçelerinde kiraz yetiştiriciliği yapılan bölgelerdeki virüsler ve yaygınlık oranları görülmektedir.