REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ

Transkript

1 REKOMBİNANT DNA TEKNOLOJİSİ

2 Rekombinant-DNA teknolojisinin gelişimindeki önemli atlama taşları: Gregor Mendel Bezelye çaprazlamaları ile döllere gen geçişini ilk kez ortaya çıkardı

3 1953 Watson ve Crick : DNA' nın çift iplikli sarmal yapısı keşfedildi Kornberg : DNA polimeraz izole edildi Nırenberg ve ark: Genetik kod çözümlendi Gellert : DNA ligaz izole edildi.

4 1970 Hamilton Smith Restriksiyon enzimlerini (DNA makasları) keşfetti DNA yı belli noktalardan kesebilen enzimler

5 Jackson ve ark : İlk r-dna molekülü oluşturuldu. Boyer ve ark : Gen klonlama tekniğinde plazmidler keşfedildi 1975 Southern : hibridizasyon tekniği geliştirildi. " Southern Blot " tekniği. Kan ve ark : ilk prenatal teşhis

6 1977 Walter Gilbert ve Allan Maxam, ayrıca Fred Sanger ayrı ayrı laboratuvarlarda DNA nın şifresini çözecek DNA baz dizisini ortaya çıkaran DNA dizileme metodunu geliştirdiler

7 1978 Yuet Wai Kan ve Andree-Marie Dozy restriction-fragment-length polymorphism (RFLP) yöntemini geliştirdiler

8 1979 Goeddel ve ark: ilk rekombinant insülin 1982 Palmiter ve Brinster : Transgenik fareler Spradling ve Rubin : Transgenik meyve sinekleri üretildi.

9 Kary Mullis arkadaşları polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) adı verilen, hızlı DNA klonlaması ve dizi tepitinde önemli bir teknik geliştirdiler

10 1994; İlk transgenik domates satış izni aldı 1986; İlk hastalık geni pozisyonel klonlama ile tayin edildi ;immun bir hastalık olan kronik granulomatos hastalığı. 1987; Rekombinant hepatit B aşısı üretildi. 1989; ABD de İnsan Genomu Araştırma Ulusal Merkezi kuruldu

11 1993 Stilman ve Hall : İnsan embriyosunun klonlanması çalışmaları Wilmut : Koyun klonlanması (Erişkin memeli hücrelerinden) 1998 İnsan Genom Projesi (İGP) başlatıldı 2000 li yıllar: İGP tamamlandı (2003) DNA çipleri Farmakogenetikte atılımlar Kök Hücre - tedavi

12 Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi DNA nın Klonlanması DNA - nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması Nukleik asit hibridizasyonu Genetik Mühendisliği

13 Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler - 1 Özel kesici enzimler kullanarak DNA molekülünün kesilmesi HpA I 5' G-T-T * A-A-C 3' 3' C-A-A * T-T-G 5' Eco RI 5' G *A-A-T-T-C 3' 3' C-T-T-A-A * G 5' Hind III 5' A *A-G-C-C-T 3' 3' T-T-C-G-G * A 5' Pst I 5' C-T-G-C-A * G 3' 3' G * A-C -G-T-C 5' Restriksiyon enzimleri (DNA makasları)

14 Restriksiyon enzimleri Enzim Elde edildiği kaynak Tanıma bölgesi BamHI Bacillus amyloliquefaciens H GGATCC EcoRI Escherichia coli RY13 GAATTC HaeIII Haemophilus aegyptius GGCC HindIII Haemophilus influenzae Rd AAGCTT HpaI Haemophilus parainfluenzae GTTAAC HpaII Haemophilus parainfluenzae CCGG MboI Moraxella bovis GATC NotI Nocardia otitidis-caviarum GCGGCCGC SfiI Streptomyces fimbriatus GGCCNNNNNGGCC TaqI Thermus aquaticus TCGA

15 Restriksiyon enzimi (DNA makası) olan EcoRI çembersel DNA molekülünü keserek yapışkan uçlara sahip doğrusal şekle getirir

16 RFLP (Parça uzunluk polimorfizmi)

17 Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler - 2 DNA - nukleotid dizisinin hızlı bir şekilde saptanması Enzimatik Yöntem (Sanger Yöntemi) Kimyasal yöntem (Maxam-Gilbert Yöntemi)

18 DNA dizileme yöntemi dideoksinukleotid, 2, 3 dideoksi CTP.

19 DNA dizileme yöntemi

20 Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler- 3 Nukleik asit hibridizasyonu: Southern transferi : DNA hibridizasyonu Nouthern transferi : RNA hibridizasyonu

21 Nukleik asit hibridizasyonu Southern Transferi

22 Rekombinant dna teknolojisinde kullanılan yöntemler - 4 DNA Klonlaması Vektör kullanarak canlı hücrede DNA çoğaltımı ; *Plazmid *Virus genetik materyeli Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) ile çoğaltım işlemi (tüpte)

23 Plasmid PBR322 nin genetik haritası. İki tane antibiyotik dirençlilik geni taşır

24 Kimerik DNA (veya Rekombinant- DNA) oluşturma: Plazmid DNA sının yabancı DNA molekülü ile birleştirilmesi

25 Bakteri kullanarak DNA veya Gen Klonlanması

26 Bakteri (E. coli) tarafından rekombinant memeli Proinsulin sentezi

27 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR veya PCR) Kalıp DNA DNA polimeraz (Yüksek ısıya dayanıklı) Primerler dntp ler ( CTP-ATP-GTP-TTP)

28 Rekombinant DNA teknolojisinde kullanılan yöntemler - 5 Genetik Mühendisliği Transgenik hayvan ve bitkiler üretmek Transgen: Yabancı gen (veya DNA) Transgenik: Yabancı geni taşıyan organizma Transgenik model oluşturmak: Hücrelere yeni gen nakli ( bir gen üzerinde değişiklik yaptıktan sonra -mutant gen- normal genin yerine sokulması) ile farklı özellikler taşıyan organizmaların üretilmesi.

29 Transgenik hayvan oluşturma yöntemleri; 1- Döllenmiş yumurtaya gen transferi ile transgenik hayvan (fare) üretimi 2- Embriyonik kök hücrelerine (EKH) gen transferi ile transgenik hayvan (fare) üretimi

30 Transgenik fare: Döllenmiş yumurta hücresine büyüme hormonu geni eklenen transgenik fare dev boyutlarda.

31 Rec- DNA Teknolojisinin Kullanıldığı Alanlar

32 Rekombinant DNA teknolojisinin biyomedikal önemi Birçok hastalığın moleküler temelini anlamak (ailesel hiperkolesterolemi, orak hücre anemisi, talessemi, kistik fibroz, müsküler distrofi) Rec-DNA teknolojisi kullanılarak tedavi etmek (örn: insülin, büyüme hormonu, plazminojen aktivatörü) Aşılar üretmek (hepatit B) Tanı (AIDS testi) Tedavi (gen tedavisi)

33 Prenatal tanıda Beta thalessemia, Duchenne müsküler distrofi, Frajil-X sendromu

34 Kanser teşhisinde retroviruslar Onkogenler Mutant genler

35 Aşı üretiminde Yenebilir aşıların üretimi Muz patates gibi ürünlere hepatit B, Kolera aşılarının klonlanması Çocuklar ölmesin Şekerde yiyebilsinler

36 Biyoteknolojik çalışmalarda Çevre mühendisliğinde biyolojik savaş süper bakteriler oktan, ksilen, naftalin ve karışık hidrokarbonlar gibi petrol artıklarını kullanabilen bakteri türlerinden, tüm bu özellikleri bir arada taşıyan mikroorganizma.

37 Hastalıkların moleküler seviyedeki patolojik tanıları Diyabet ateroskleroz ve koroner arter hastalıkları Alzheimer, şizofreni, parkinson

38 Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 1 proteinleri kodlayan genlerde meydana gelen mutasyonlar sonucu hasarlı veya eksik protein üretimine dayanır. Bu patolojilere göre genetik hastalıklar Bir proteinin alt gruplarını oluşturan proteinlerde mutasyon Thalessemia ler (Otosomal resesif) Enzim hasarları Aminoasidopatiler;Fenilketonuri, (Otosomal resesif) Lizozomal depo hastalıkları; Tay-Sacs hastalığı (Otosomal resesif). İnklüzyon hücre hastalığı (protein trafiğindeki hata)

39 Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 2 Reseptör proteinlerindeki hatalar ve eksiklikler Ailesel Hiperkolesterolomi (Otosomal dominant) Transport proteinlerindeki hatalar Kistik fibrozis (Otosomal resesif) Yapısal proteinlere bağlı hastalıklar Ducshenne Müsküler distrofi ( Kasta Distrophin protein eksikliği ) (X e bağlı) Osteogenesis imperfecta ve Ehlers Danlos ( kollogen sentez hataları ) (Otosomal dominant)

40 Genetik hastalıkların moleküler nedenleri 3 Nörodejenaratif hastalıklar Alzheimer Hastalığı (Otosomal dominant veya çok nedenli) Büyüme veya farklılaşma proteinlerinde hasarlar Kalıtsal meme ve ovaryum kanserleri : ( BRCA1- BRCA2 mutasyonlarına bağlı ) (otosomal dominant)

41 Viral ve bakteriyal enfeksiyonlarda patojenin tespitinde Tüberküloz bakterisinin tespiti m. tuberculosis (PCR ile ) ayrıca alt tiplerinin tayini Hepatit virusu Herpes simplex onko-virusların tayini

42 DNA çipleri

43 Biyoteknolojik çalışmalarda İlaç sanayisinde; Antitripsin Kistik fibrozda

44 Adli Tıpta şüpheli suçlunun tayini veya babalık tayini

45 Gen Tedavisi AMAÇ: Mutant fenotipi düzeltmek

46 Gen tedavisi için kullanılan vektörler: Viral Vektörler: * Retroviruslar * Adenoviruslar Viral Olmayan Vektörler : * Çıplak DNA (plazmid içine sokulmuş hedef DNA) * Lipozomlar içine sokulmuş DNA paketleri * Protein-DNA bileşenleri (hücre yüzey reseptörlerine bağlanan protein ve DNA bileşeni) * Yapay kromozomlar

47 Retroviruslar: viral genom, konak hücre DNA sına katılır. Adenoviruslar: viral genom, konak hücre DNA sına katılmaz kromozom dışında sitoplazmada genetik materyal olarak bulunur. insersiyonal mutasyona neden olmaz.

48

49 Gen transferinde çeşitli yöntemler vardır: Rekombinant- DNA'nın lipid vezikülleri (lipozomlar) ile hücreye sokulması. Virus genomu içine ilgili DNA parçasının sokularak tranfeksiyon Nukleus içine mikroenjeksiyon ile rekombinant- DNA'nın sokulması.

50 Gen tedavisi Vektörler iki yoldan organizmaya verilir Ex vivo: Organizma dışına alınan mutant hücrenin düzeltilerek yeniden organizmaya verilmesi In vivo: Dışarıda hazırlanan normal geni taşıyan vektörün organizmaya verilmesi

51 Ex vivo Gen tedavisi örnekleri SCID: Ciddi kombine immun yetmezlik hastalığı Adenozin deaminaz (ADA ) mutasyonu Kemik iliğinden kan kök hücreleri çıkarılır. Sağlam gen bir vektör yardımı ile kök hücreye nakledilir. Kök hücre organizmaya geri sokulur. DMD : Duchen müsküler distrofi : Distrofin proteini mutant.

52 Gen tedavisi örnekleri 1 Ailesel Hiperkolesterolemi ;LDLR: Düşük dansiteli lipoprotein reseptör geninde mutasyon. (LDLR: Karaciğerde sentezlenir ) Kalp ve damar hastalıklarına yatkınlık nedeni LDLR- / LDLR- hastaların karaciğer hücreleri alınır, normal gen retroviruslar ile hepatositlere sokulur, düzeltilmiş hücreler portal ven ile vücuda verilir.

53 Gen tedavisi örnekleri 2 İn vivo Kistik fibroz: Klor kanal proteini mutant. Adenoviruslara normal gen sokulup sprey yolu ile burun mukozasına verilir.

54

55 Homolog rekombinasyon ile gen inaktivasyonu

56 Klonlama

57

58 DNA mikroenjeksiyonu; klonlanmış plazmid DNA sının mikroenjeksiyon ile döllenmiş fare yumurta hücresindeki erkek pronukleusu içine aktarılışı

59 Dolly 1996 da Keith Campbell and Ian Wilmut tarfından Roslin enstitüsünde, (Edinburgh, İskoçya) da klonlandı

60

61 Mikroenjeksiyon

62

63

64 İnsan Genom Projesi

65 1990 da ABD de İnsan Genom Projesi başlatıldı (US Department of Energy and the National Institutes of Health) 15 yıllık plan içinde bitirilmesi planlandı Teknolojideki hızlı gelişmeler ile 4 yıl önce bitirildi

66 İGP ile ilk başta 3 milyon DNA baz çiftinin % 97.7 sinin dizilenmesi amaçlandı ilerleyen yıllarda 2000 yazında % 90 nının çözülmesi amaçlandı ancak 1 Mayıs 2000 de; 2,540,358,000 bazlık dizi (% 79.1) tespit edildi Sonuç olarak 2003 te %100 lük dizi tespiti amaçlandı %18.6 (598,586,000 baz) tespit adildi