Ayçiçeği (Helianthus annuus L.) Fidelerinin Toplam Çözünebilir Protein, Prolin ve Klorofil Miktarları Üzerine Civa Klorürün (HgCl 2 ) Etkileri

Transkript

1 Fırat Üniv. Fen ve Müh. Bil. Der. Science and Eng. J of Fırat Univ. 18 (1), 25-30, (1), 25-30, 2006 Ayçiçeği (Helianthus annuus L.) Fidelerinin Toplam Çözünebilir Protein, Prolin ve Klorofil Miktarları Üzerine Civa Klorürün ( ) Etkileri Fikriye KIRBAĞ ZENGİN ve Ömer MUNZUROĞLU F. Ü., Fen Edebiyat Fakültesi, Biyoloji Bölümü, 23169, Elazığ fzengin@firat.edu.tr Özet: Bu çalışmada, ayçiçeği (Helianthus annuus L.) fidelerinin klorofil, prolin ve toplam çözünebilir protein üzerine civa klorürün ( ) etkileri araştırıldı. Bir haftalık fideler on gün süreyle hoagland solusyonu ile hazırlanmış 0,03, 0,05 ve 0,07 mm konsantrasyonlarındaki civa klorür çözeltilerinde büyümeye bırakıldı. 17 gün sonra civa klorüre maruz bırakılan fidelerin toplam çözünebilir protein, prolin ve klorofil içerikleri tespit edildi. Civa klorüre maruz bırakılan fidelerin yapraklarındaki prolin içeriklerinde artma meydana gelirken, klorofil (a+b) ve toplam çözünebilir protein miktarında azalmanın olduğu belirlendi. Kritik civa klorür düzeylerinin fidelerin gelişmelerini negatif yönde etkilediği görüldü. Anahtar Kelimeler: Civa, klorofil, prolin, protein, ayçiçeği Effects of Mercury Chloride ( ) on the Total Soluble Protein, Proline and Chlorophyll Contents of Sunflower (Helianthus annuus L.) Seedlings Abstract: In this study, the effects of mercury chloride ( ) on the content of chlorophyll, proline and total soluble protein in sunflower (Helianthus annuus L.) seedlings were investigated. One-week-old seedlings were grown at mercury chloride concentration of 0,03, 0,05 ve 0,07 mm for ten days in Hoagland s solution. After 17 days exposure to the mercury chloride seedlings were determined in chlorophyll, proline and total soluble protein contents. An increase of proline in the leaves of seedlings exposed to mercury chloride occurred, as well as a decrease of chlorophyll (a+b) and total protein contents. Thus mercury chloride levels at certain critical points negatively affect seedlings growth. Key words: Mercury, chlorophyll, proline, protein, sunflower 1. Giriş Ağır metaller endüstriyel faaliyetler, kentsel atıklar, madencilik, tarımda gübre ve pestisid kullanılması, motorlu taşıtların eksoz gazları ve volkanik faaliyet gibi pek çok kaynaktan etrafa yayılmakta, tarım ve ziraat ile ormancılıkta büyük problemler oluşturmaktadır. Ağır metallerin çevrede yaygın bir şekilde birikmesi, bitkiden insana hemen her çeşit organizma için boyutları giderek artan bir tehlike oluşturmaktadır. Civa çevrede yaygın olarak bulunan, bitkilerde biriken ve düşük konsantrasyonlarda bile önemli toksik etkiler meydana getiren bir ağır metaldir. Civanın kök, gövde ve fide büyümesi [1, 2], çimlenme [2], fotosentez [3], enzimatik faaliyetler [4], protein sentezi [5] ve benzeri olayları önemli oranlarda ve genelde olumsuz yönde etkilediği anlaşılmıştır. Ağır metale maruz kalmış birçok bitkide strese cevap olarak serbest prolin birikiminin olduğu görülmüştür [6]. Oryza sativa bitkisi CuSO 4 a maruz bırakıldığında prolin miktarının arttığı kaydedilmiştir [7]. Silene vulgaris in metale toleranslı olan ve olmayan ekotipleri bakır, kadmiyum ve çinkoyla muamele edildiğinde yapraklarda prolin miktarının oldukça attığı ve özellikle de metale toleranslı olan ekotipte bu miktarın toleranslı olmayan ekotipe göre 5-6 kat daha fazla olduğu tespit edilmiştir [8]. Buğday bitkisine çinko ve bakır uygulamasıyla prolin miktarının arttığı bildirilmiştir [9]. Ağır metallerin bitkilerdeki protein miktarını azalttığı hususunda çok sayıda rapor mevcuttur. Kurşun, çinko ve kadmiyumun Hordeum vulgare bitkisinde [10]; kobalt, krom ve bakırın karnabahar fidelerinde [11]; bakır ve kurşunun Zea mays bitkisinde [12] ve ayrıca bakır ve çinkonun Scenedesmus acutus da [13] protein miktarını azalttığı bildirilmiştir. Bakırın Triticum aestivum L. cv. Vergina da total,

2 F. Kırbağ Zengin ve Ö. Munzuroğlu protein ve çözülebilir azot miktarını azalttığı [14] görülmüştür. Ağır metaller bitkinin klorofil içeriğini de önemli oranlarda etkiler. Phaseolus vulgaris L. fidelerine 0,05-0,4 mm civa uygulandığı zaman klorofil içeriğinin azaldığı bildirilmiştir [15]. Lycopersicum esculentum fideleri µm uygulandığında klorofil miktarının azaldığı bildirilmiştir [16]. Phaseolus vulgaris L. fideleri farklı konsantrasyonlarda kurşun ve civa ağır metallerine maruz bırakıldığında total klorofil miktarının azaldığı ve bu azalmanın enzimlerin inaktive olması ile ilişkili olmasından dolayı olduğu rapor edilmiştir [17]. Bir tarım bitkisi olan ayçiçeği bütün dünyada olduğu gibi yurdumuzda da önemli besin maddeleri arasında sayılmakta ve geniş alanlarda tarımı yapılmaktadır. Ayçiçeği veriminin arttırılması diğer bazı faktörlerle birlikte toprak ve suyun kalitesine bağlıdır. Gerek toprak ve gerekse suyun kalitesini bozan etmenlerden biri de ağır metallerdir. Bu çalışmada civa klorür ( ) stresine maruz bırakılan ayçiçeği (Helianthus annuus L.) fidelerinin klorofil, toplam çözünebilir protein ve prolin miktarları kontrolleriyle mukayeseli olacak şekilde tespit edilip, bu ağır metalin belirtilen parametreler üzerinde etkisi belirlenmeye çalışıldı. Araştırmamızın bu konuda yapılmış çalışmalara katkı sağlayacağı ve yeni çalışmaların planlanmasına ışık tutacağı kanaatindeyiz. 2. Materyal ve Metot Araştırmamızda bitkisel materyal olarak, dikotil bir bitki olan ayçiçeği (Helianthus annuus L.) fideleri kullanıldı. Ayçiçeği tohumları Elazığ Tarım İl Müdürlüğü Çiftçi Eğitim ve Yetiştirme Şubesi nden temin edildi. Ağır metal olarak civa (Hg ++ ) nın klor tuzu ( ) kullanıldı. Ağır metaller ve diğer kimyasal maddeler Merck firmasından sağlandı. Ayçiçeği (Helianthus annuus L.) tohumlarından sağlıklı görünüme sahip olanlardan 300 adet alındı ve 2 dakika süreyle 0,001 M de bekletilerek steril edildi [18]. Daha sonra dakika saf su ile yıkanan tohumlar 1000 ml lik bir behere konularak üzerine 250 ml saf su ilave edildi ve o C lik karanlık ortamda 4 saat süreyle şişmeye bırakıldı. Bu sürenin sonunda şişme ortamından çıkarılan tohumlar çift katlı filtre kağıdı döşenmiş ve 10 ml saf su ile ıslatılmış petrilere konuldu. Ekimden hemen sonra kapağı kapatılan petriler C lik karanlık iklim dolabına kaldırılarak çimlenmeye bırakıldı. Bu arada içleri dere kumu ile doldurulan plastik saksılar hazırlandı [19]. Etüve kaldırıldıktan yaklaşık 60 saat sonra çimlenmiş ve radikula uzunlukları 2-2,5 cm ye ulaşmış tohumlardan bu saksılara ekim yapıldı. Bundan sonra saksılar sera koşullarına alınarak fideler büyümeye bırakıldı. Sera koşulları, ışık için 3600 lümen.m - 2, sıcaklık için C, fotoperiyot 16 saat ışık, 8 saat karanlık (uzun gün) olacak şekilde düzenlendi. Civa klorürün ( ) 1 mm lık stok çözeltisi, bu stok çözeltiden de 0,03 mm, 0,05 mm ve 0,07 mm konsantrasyonunda solüsyonlar hazırlandı. Daha sonra alüminyum folyo ile kaplı 500 ml lik kavanozlara civa tuzunun bu üç konsantrasyonundan 200 er ml (kontrol için hoagland solüsyonu) bırakıldı. Tohumların çimlendirilmesinden geliştirilen 7 günlük ayçiçeği fideleri saksılardan alınarak kökleri musluk suyunda iyice yıkandı. Civanın her bir konsantrasyonu ve kontrol grubu için 20 şer adet olacak şekilde bu fideler sünger kapaklar yardımıyla kavanozlara yerleştirildi (her kavanoza iki fide olacak şekilde). Bu şekilde hazırlanan düzenekler, koşulları yukarıda belirtilen seraya kaldırıldı. Fideler 10 gün boyunca sera ortamında gelişmeye bırakıldı. Bu 10 günlük sürenin sonunda fidelerden klorofil, toplam çözünebilir protein ve prolin analizi yapıldı. Ayçiçeği (Helianthus annuus L.) fidelerinden protein ekstraksiyonu Larson ve Beevers [20] metoduna göre yapıldı. Toplam çözünebilir protein miktarının saptanmasında Lowry ve ark. metodu [21] kullanıldı. 10 gün süreyle civanın değişik konsantrasyonlarında bırakılan ayçiçeği fidelerinin yapraklarındaki prolin ekstraksiyonu Bates ve ark. [22] metoduna göre yapıldı ve prolin konsantrasyonu µmol/g cinsinden tespit edildi. Klorofil ekstraksiyonu için yaprak dokusu alınarak %80 lik asetonda homojenize edildi. Santrifüj edildikten sonra 647 ve 667 nm de spektrofotometrede (CE-5502 Scanning Double Beam UV) absorbansları ölçüldü. Graan ve Ort [23] a göre klorofil a ve b nin µmol l -1 cinsinden hesaplaması yapıldı. 26

3 Ayçiçeği (Helianthus annuus L.) Fidelerinin Toplam Çözünebilir Protein, Prolin ve Klorofil Miktarları Üzerine Civa Bütün deneyler 3 tekerrürlü olarak gerçekleştirildi. Sonuçlar ortalamanın standart hatası alınarak ve varyans analizi yapılarak istatistik analize tabi tutuldu. Varyans analizi bilgisayarda SPSS 10.0 Windows programı kullanılarak çoklu karşılaştırma testi ile p<0.05 ve p<0.01 önem seviyelerinde yapıldı. 3. Sonuçlar Ayçiçeği fidelerindeki toplam çözünebilir protein miktarında, civa klorür uygulamasına bağlı olarak meydana gelen değişiklikler Şekil 1 de verilmiştir. Protein miktarı (mg/g) Kontrol 0,03 mm 0,05 mm 0,07 mm Şekil gün süreyle civa klorür uygulanan ayçiçeği fidelerinin toplam çözünebilir protein miktarı (mg/g taze ağırlık). Şekil 1 in incelenmesinden de anlaşılacağı gibi çeşitli konsantrasyonlarda civa klorür uygulanan fidelerin toplam çözünebilir protein miktarında bir azalma görülmüştür. 0,03 mm, 0,05 mm ve 0,07 mm uygulanan fidelerin toplam çözünebilir protein miktarı kontrol grubuna göre, sırasıyla; % 21.5, % 31.6 ve % 47.1 oranlarında azalmıştır (p<0,01). Ayrıca bu parametre açısından deney gruplarının kendi aralarında da önemli (p<0,01) sayılabilecek farklılıklar görülmüştür (Şekil 1). On gün süreyle 0,03, 0,05 ve 0,07 mm civa klorür içeren Hoagland solüsyonlarında büyütülen ayçiçeği fidelerinin yapraklarındaki prolin miktarı Şekil 2 de gösterilmiştir. Şekil 2 de görüldüğü üzere civa klorürün kullanılan her üç konsantrasyonu fidelerin yaprak dokularının prolin düzeylerinde önemli artışlar meydana getirmiştir (p<0,05 veya p<0,01). 0,03 mm uygulanan ayçiçeği Prolin (mmol g -1 ) 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 Kontrol 0,03 0,05 0,07 Şekil gün süreyle civa klorür uygulanan ayçiçeği fidelerinin yapraklarındaki prolin miktarı (µmol/g taze ağırlık). bitkilerinin yaprakları kontrol bitkilerine göre %52.7 lik bir artış gerçekleşmiştir (p<0,01). Bu değer 0,05 ve 0,07 mm civa klorür uygulanan fideler için sırasıyla %72.2 ve %91.6 olarak ölçülmüş ve istatistik olarak önemli bulunmuştur (p<0,01) (Şekil 2). Civa ağır metalinin ayçiçeği fidelerindeki klorofil (a+b) miktarı üzerine olan etkisi Şekil 3 de verilmiştir. Klorofil a+b (mmol. g -1 ) Kontrol 0,03 0,05 0,07 Şekil gün süreyle civa klorür uygulanan ayçiçeği fidelerinin yapraklarındaki klorofil (a+b) miktarı (µmol/g taze ağırlık). Her üç civa klorür konsantrasyonu (0,03, 0,05 ve 0,07 mm ) da klorofil (a+b) miktarlarını kontrole göre önemli oranlarda (p<0,05) azaltmıştır. 0,03 mm uygulanan fidelerin yapraklarındaki klorofil (a+b) miktarı kontrol fidelerine göre sırasıyla %21.9; 0,05 ve 0,07 mm için ise bu değerler %28.2 ve %36 oranlarında azalmıştır (p<0,05) (Şekil 3). 27

4 F. Kırbağ Zengin ve Ö. Munzuroğlu Civa uygulamasına bağlı olarak fidelerin klorofil a/b oranlarında meydana gelen değişiklikler Şekil 4 de verilmiştir. Klorofil a/b 2,9 2,8 2,7 2,6 2,5 2,4 Şekil gün süreyle civa uygulanan ayçiçeği fidelerinin yapraklarındaki klorofil a/b oranları. 0,03, 0,05 ve 0,07 mm civa tuzu içeren Hoagland solüsyonlarıyla büyütülen ayçiçeği fidelerinin klorofil a/b oranı civa tuzunun konsantrasyonundaki artışla birlikte yükselmiştir. 0,03, 0,05 ve 0,07 mm civa uygulanan fidelerdeki klorofil a/b oranı kontrol bitkilerine göre, sırasıyla %5.7, %7.3 ve %9.2 daha fazla çıkmıştır (p<0,05) (Şekil 4). 4. Tartışma Kontrol 0,03 0,05 0,07 Ağır metal stresinin bitkide oluşturduğu önemli etkilerden biri senesensi teşvik etmek veya protein sentezini engellemek yoluyla bitkinin protein içeriğini azaltmaktır. Ağır metallerin bitkilerdeki protein miktarını azalmasına neden olduğu bulunmuştur. Örneğin civa uygulanan Bacopa monnieri bitkisinde protein içeriği azalma göstermiştir [24]. Bir siyanobakter olan Anacystis nidulans bakıra maruz bırakılmış ve bunun sonucu olarak protein miktarı azalmıştır [25]. Vigna unguiculata L. var. Pusa Falguni tohumları kadmiyum ve civaya maruz bırakılmış, protein ve amino asit içeriklerinde azalma, prolinde ise artma tespit edilmiştir [5]. Kurşun ve kadmiyum uygulanan Lemna minor bitkisinde proteaz ile katalaz aktivitesinin azaldığı, peroksidaz aktivitesi arttığı ve protein miktarının azaldığı [26] rapor edilmiştir. Peroksidaz enzimi aktivitesinin artışının metal etkisiyle fenol, tiol, hidrojen peroksit gibi sekonder metabolitlerin oluşmasıyla (bitki senesensi) ilgili olduğu ileri sürülmüştür. Katalaz ve proteaz gibi enzimlerin aktif bölgelerine metal iyonlarının bağlanarak enzimin aktivitesini engellediği görülmüştür. Bu ağır metaller tarafından azot metabolizmasının engellendiği ve protein miktarının azaldığı ileri sürülmüştür [11]. Aynı zamanda hücresel seviyede ağır metallerin en önemli etkilerinden biri de membran bütünlüğünü değiştirerek aktif oksijen türlerinin (AOT; O - 2, H 2 O 2,.OH) oluşmasını sağlamaktır [27]. Oluşan bu aktif oksijen türlerinin proteinlerin parçalanmasına neden olduğu rapor edilmiştir [28]. Yapılan çalışmalarda değişik stres koşullarında prolin miktarının arttığı rapor edilmiştir. Farklı konsantrasyonlarda kurşun ve kadmiyuma maruz bırakılan iki buğday varyetesinde (Triticum aestivum L. cv. Gerek-79 ve Bolal-2973) prolin birikiminin olduğu tespit edilmiştir [29]. Trebouxia erici likenine bakır uygulandığında prolin miktarının arttığı belirtilmiştir [30]. Phaseolus vulgaris L. bitkisine değişik ağır metaller uygulandığında prolin içeriğinin arttığı tespit edilmiştir [31]. Bakır ve çinkoya maruz bırakılan Lemna minor da prolin birikiminin olduğu görülmüştür [32]. Çevresel stres faktörlerinin bitkiler üzerindeki etkilerini anlamak maksadıyla sıkça başvurulan yollardan biri organizmadaki klorofil içeriğini belirlemektir. Çeşitli araştırıcılar tarafından metal kirliliğine bağlı olarak değişik bitki türlerinde klorofil miktarının azaldığı rapor edilmiştir. Mesela metal kirliliği (Ni-Cu) olan topraklarda yetişen Empetrum nigrum un klorofil içeriğinde % oranında azalma tespit edilmiştir [33]. Ağır metal stresine bağlı olarak klorofil içeriğinde görülen azalma, klorofil biyosentez yolunda iş gören enzimlerin ağır metaller tarafından engellenmesinin bir sonucu olabilir. Kadmiyumun klorofil biyosentezi üzerine etki yaptığı ve protoklorofil reduktaz ile aminolevulinik asit (ALA) sentezini engellediği kaydedilmiştir [34]. Pennisetum typhoideum ve Phaseolus vulgaris bitkilerine yüksek konsantrasyonda kurşun uygulandığında ALA miktarının değişmediği fakat aktivitesinin azaldığı, bunun sebebinin ise enzimin aktif bölgesindeki sülfidril (SH) gruplarıyla kurşunun birleştiği ve böylece aktivitesini engellediği rapor edilmiştir [17]. Kadmiyum uygulanması 28

5 Ayçiçeği (Helianthus annuus L.) Fidelerinin Toplam Çözünebilir Protein, Prolin ve Klorofil Miktarları Üzerine Civa sonucu ALA sentezinin ve dolayısıyla klorofil biyosentezinin engellendiği bildirilmiştir [35]. Ağır metallerin serbest radikal oluşumuna neden olduğu ve bu yolla tilakoid membran lipitlerinin oksidatif yıkımına sebep olduğu anlaşılmıştır [36]. Bu ve benzeri durumlarda klorofil yıkımının artması veya sentezinin engellemesi yoluyla klorofil miktarı azalmış olabilir [37]. Civa uygulaması ile ayçiçeği yapraklarındaki klorofil a/b oranı artmıştır. Stres indikatörü olarak bilinen klorofi a/b oranı Cu-Ni topraklarda yetiştirilen Empetrum nigrum bitkisinde metal etkisiyle bu oranın arttığı rapor edilmiştir [33]. Sonuç olarak civa ayçiçeği fidelerinin klorofil ve toplam protein miktarında önemli azalışlar meydana getirirken, fidelerin yapraklarındaki prolin miktarını tam aksine önemli oranlarda artırmıştır. 5.Kaynaklar 1. Mor, I.R., Gokani, S.J., Chanda, S.V. (2002). Effect of mercury toxity on hypocotyl elongation and cell wall loosening in Phaseolus seedlings. J. of Plant Nutrition, 25 (4), Alhelal, A.A. (1995). Effect of cadmium and mercury on seed-germination and early seedling growth of rice and alfalfa. J. The Univ. Kuvait- Sci., 22 (1), Bernier, M., Popovic, R., Carpentier, R. (1993). Mercury inhibition at the donor side of photosystem II is reversed by chloride. FEBS, 32 (1), 19-23, 4. Prasad, D.D.K., Prasad, A.R.K. (1987). Effect of lead and mercury on chlorophyll synthesis in mung bean seedlings. Phytochemistry (Oxf), 26, Nagoor, S. (1997). A study of influence of cadmium and mercury on growth and protein metabolism in cowpea seedlings. J. Phsiol. Research, 10, Alia-Saradhi, P.P. (1991). Prolin accumulation under heavy metal stress. J. Plant Physiol., 138, Chen, C.T., Chen, L-M., Lin, C.C., Kao, C.H. (2001). Regulation of proline accumulation in detached rice leaves exposed to excess copper. Plant Sci., 160, Schat, H., Sharma, S.S., Vooijs, R. (1997). Heavy metal-induced accumulation of free proline in a metal-tolerant and a nontolerant ecotype of Silene vulgaris. Physiol. Plant., 101, Bassi, R., Sharma, S.S. (1993). Proline accumulation in wheat seedlings exposed to zinc and copper. Phytochemistry, 33, Stiborova, M., Doubravova, M., Brezinova, A., Friedrich, A. (1986). Effect of heavy metal ions on growth and biochemical characteristics of photosynthesis of barley (Hordeum vulgare L.). Photosynthetica, 20, Chatterjee, J., Chatterjee, C. (2000). Phytotoxicy of cobalt, chromium and copper in cauliflower. Environmental Pollution, 109, Stiborova, M., Hromadkova, R. Leblova, S. (1986). Effect of ions of heavy metals on the photosynthetic characteristics of maize (Zea mays L.). Biol. Plantarum., 4 (12), Abd-El Monem, H., Corradi, M., Gorbi, G. (1998). Toxicity of copper and zinc to two strains of Scenedesmus acutus having differen t sensitivity to chromuim. Environ. Exp. Bot., 40, Lanaras, T., Moustakas, M., Symeonidis, L., Diomantoglov, S., Karataglis, S. (1993). Plant metal content growth responses and some photosynthetic measurements of field-cultivated wheat growing on one bodies enriched in Cu. Physiol. Plant., 88, Parmar, N.G., Vithalani, S.D., Chanda, S.V. (2002). Alteration in growth and peroxidase activity by heavy metals in phaseolus seedlings. Acta Physiol. Plant., 24 (1), Prasad, D.D.K., Prasad, A.R.K. (1987). Effect of lead and mercury on chylorophyll synthesis in mung bean seedlings. Phytochemistry, 26 (4), Cho, U-H., Park, J-O. (2000). Mercury-induced oxidative stress in tomato seedlings. Plant Sci., 156, 1-9. Sresty, T.V.S., Madhova, K.V. (1999). Ultrastructural alterations in response to zinc and nickel stress in the root cell of pigeonpea. Environ Exp. Bot., 41, Rovira, A.D. (1956). Plant root excretions in relation to the rhizosphere effect. Plant and Soil 2,

6 F. Kırbağ Zengin ve Ö. Munzuroğlu 20. Larson, L.A., Beevers, H. (1965). Amino acid metabolism in young pea seedlings. Plant Phys iol., 40, Lowry, O.H., Rosebrough, N.S., Randall, R.J. (1951). Protein measurement with folin phenol reagent. Journal of Biological Chemistry Bates, L.S., Waldren, R.P., Teare, I.D. (1975). Rapid determination of free proline for water stress studies. Plant Soil, 39, Graan, T., Ort, D.R. (1984). Quantitation of the rapid electron donors to P700, functional plastoquinone pool, and the ratio of the photosystems in spinach chloroplasts. J. of Biol.Chem. 259, Sinha, S., Gupta, M., Chandra, P. (1996). Bioaccumulation and biochemical effects of mercury in the plant Bacopa monnieri L. Env. Tox. and Water Qual., 11 (2), Gupta, S.L. (1986). Copper uptake and inhibition of growth, photosynthetic pigments and macromolecules in the cyanobacterium Anacystis nidulans. Photosynht., 20 (4), Mohan, B.S., Hosetti, B.B. (1997). Potential phytotoxicity of lead and cadmium to Lemna minor grown in sewage stabilization ponds. Environ. Pollut., 98, Dietz, K.-J., Krämer, U., Baier, M. (1999). Free radicals and reactive oxygen species (ROS) as mediators of damage during heavy metal stress. In: Prasad, M.N.V., Hagemeyer, J. (Eds.), Heavy Metal Stress in Plants: Molecules to Ecosystem. Springer-Verlag, 73-97s. 28. Solomon, M., Belenghi, B., Delledonne, M., Menachem, E., Levine, A. (1999). The involvement of cysteine proteases and protease inhibitor genes in the regulation of programmed cell death in plants. Plant Cell, 11, Öncel, I., Keleş, Y., Üstün, A.S. (2000). Interactive effects of temperature and heavy metal stress on the growth and some biochemical compounds in wheat seedlings. Environt. Pollut. 107, Bockar, M., Fahselt, D., Wu, C.T. (2004). Free proline content is positively correlated with copper tolerance of the lichen photobiont Trebouxia erici. Plant Sci, 167, Zengin, F.K., Munzuroğlu, Ö. (2005). Effects of some heavy metals on content of chlorophyll, proline and some antioxidant chemicals in bean (Phaseolus vulgaris L.) seedlings. Acta Biologica Cracoviensia, 47/2, Bassi, R., Sharma, S.S. (1993). Changes in a proline content accompanying the uptake of zinc and copper by Lemna minor. Annals of Botany, 72, Monni, S., Uhling, C., Hansen, E., Magel, E. (2001). Ecophysiological responses of Empetrum nigrum to heavy metall pollution. Environ. Pollut., 112, Stobart, A.K., Griffiths, W.T., Amcen-Bukhari, +2 I., Sherwood, R.P. (1985). The effect of Cd on the biosynthesis of chlorophyll in leaves of barley. Physiol. Plant., 63, Allan, K., Stobart, W., Griffiths, T., Ameen- Bukhori, I., Sherwood, R.P. (1985). Effect of Cd +2 on the biosynthesis of chlorophyll in leaves of barley. Physiol. Plant., 63, Sandmann, G., Böger, O. (1980). Coppermediated lipid peroxidation processes in photosynthetic memranes. Plant Physiol., 66, Luna, C.M., Gonzales, C.A., Trippi, V.S. (1994). Oxidative damage caused by an excess of copper in oat leaves. Plant Cell Physiol., 35,