ÖZET. Anahtar Kelimeler: Misel, Paklitaksel, P-gp, çoklu ilaç direnci, siklosporin, elakridar, TAT peptit, 2C5 monoklonal antikor

Transkript

1

2

3

4 iv TEŞEKKÜR Tez çalışmalarımın her aşamasında bilimsel bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan, karşılaştığım sorunları çözmem için (n=6) beni büyük kalbi ve ince ruhu ile cesaretlendiren ve destekleyen, düşüncelerimin olgunlaşabilmesi için ihtiyaç duyduğum özgür bilimsel ortamı sağlayan değerli hocam Sn. Prof. Dr. İmran Vural a, doktora tezime ve bilimsel çalışmaya bakışıma derin katkılarını esirgemeyen Prof. Vladimir P. Torchilin e, doktora çalışmalarımın başından itibaren her zaman her konuda beni destekleyen Sn. Prof. Dr. A. Atilla Hıncal a teşekkürlerimi sunarım. Doktora tezim süresince bilimsel çalışmalarımı gerçekleştirebilmem için her türlü olanağı sağlayan anabilim dalımın başkanları Sn. Prof. Dr. A. Atilla Hıncal a, Sn. Prof. Dr. Yılmaz Çapan a, zamansız kaybı ile derin üzüntü duyduğum ve kendisini her zaman saygıyla anacağım Sn. Prof. Dr. Nurşen Ünlü ye ve Sn. Prof. Dr. Sema Çalış a içten teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmalarımda ihtiyaç duyduğum her an yanımda olan, bilimsel bilgisini ve desteğini her zaman cömertlikle bana sunan Sn. Doç. Dr. A. Lale Doğan a, ve hücre kültürü deneyleri ile akış sitometrisi çalışmalarında büyük yardımlarını gördüğüm Sn. Doç. Dr. Güneş Esendağlı ya, her zaman kapılarını çalabileceğimi hissettirdikleri için teşekkürlerimi sunarım. Tezimde AFM görüntülemelerini gerçekleştirebilmemi sağlayan Sn. Prof. Dr. Tuncer Değim e, yardımlarını benden esirgemeyen Sn. Prof. Dr. Erhan Palaska ya, tez çalışmalarımda bana her zaman yardımcı olan Sn. Dr. Ecz. Senem Sevtap Ölmez e ve Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı ndaki tüm arkadaşlarıma ve değerli hocalarıma teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmalarımı yürütmem için proje desteği sağlayan TÜBİTAK a (SBAG 109S106) teşekkür ederim. Sevgi, anlayış ve destekleri ile hep yanımda olan anneme, babama ve kardeşime teşekkür derim. Tezimi, bana hayatımı ne için yaşamam gerektiğini öğreten ve bir bakışı ile yüzlerce doktora tezi yapabileceğimi hissettiren eşim Yeliz Tunç a ithaf ederim.

5 v ÖZET Sarısözen, C. Kanser tedavisinde kullanılacak aktif hedeflendirilmiş farmasötik nanotaşıyıcılar, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmasötik Teknoloji Programı Doktora Tezi, Ankara, Hedeflendirilmiş çeşitli nanotaşıyıcıların kullanımı nanotıpta en önemli alanlardan biri durumuna gelmiştir. Bu taşıyıcılar, çeşitli ilaç ve/veya görüntüleme maddelerini taşıyan nanobüyüklükteki materyallerdir. Hedeflendirilmiş taşıyıcılar ile lokal ilaç konsantrasyonunu artırıp, kontrollü ilaç salımı sağlamak da mümkündür. Bu tür nanotaşıyıcılar için olası hedefler arasında tümörler en çok incelenen konudur. Güncel kanser tedavi yöntemleri, cerrahi uygulama ve sağlıklı hücreleri de öldüren ve hastada toksisiteye neden olan radyasyon ve kemoterapötik ilaç uygulamasını içermektedir. Bundan dolayı, bu tür ilaçların nanotaşıyıcı şeklinde kanser hücrelerine aktif hedeflendirilmesi önemlidir. Taxus brevifolia dan elde edilen bir diterpenoid olan Paklitaksel, baş-boyun, karaciğer, yumurtalık ve göğüs kanserlerinin tedavisinde kullanılan hücre replikasyonunu inhibe eden güçlü bir mitotik inhibitördür. Sudaki çözünürlüğü çok düşüktür. Bu nedenle günümüzde, Kremofor EL ve etanol 1:1 (h/h) oranındaki karışımları ile yapılan ve i.v. uygulamadan önce izotonik sodyum klorür ile seyreltilen formülasyonu kullanılmaktadır. Bununla birlikte, bu Kremofor EL:etanol karışımı nörotoksisite, nefrotoksisite ve aşırı duyarlılık gibi,istenmeyen ciddi yan etkilere neden olmaktadır. Bu sorunları azaltmak amacı ile çeşitli Paklitaksel ilaç taşıyıcı sistemler araştırılmaktadır. Bu tezde, Paklitaksel in sudaki çözünürlüğünü ve biyoetkinliğini artırmak için misel formülasyonları hazırlanmıştır. Ayrıca, Paklitaksel in alımı ve farmakolojik etkinliği spesifik ligandlar ile konjuge edilerek incelenmiştir. Paklitaksel yüklü misellerin hazırlanması için, polietilen glikol fosfatidiletanolamin kullanılmıştır. Bu misellerin hücre içerisine alımını kolaylaştırmak için hücre penetrasyonu sağlayan TAT peptit ve hedeflendirme için de 2C5 monoklonal antikoru formülasyonlara eklenmiştir. Bilindiği gibi, çoğu kanser hücrelerindeki çoklu ilaç direncinden dolayı, pek çok antikanser maddeler kemoterapide çok etkin değildirler. İn vitro hücre çalışmalarında MDR nin ana nedeni olarak P-gp nin tanımlanmasından sonra, P-gp nin inhibisyonu için daha etkin tedavi yöntemleri üzerinde çok yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Bu amaçla formülasyonlara P-gp inhibitörleri eklenmiştir. Misel büyüklüğü, zeta potansiyel, miseller çözünürlük, enkapsülasyon etkinliği ve in vitro salım gibi in vitro karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Hücre kültürü teknikleri kullanılarak, sitotoksisite ve antikanser etkinlik çalışmaları direnç gelişmiş ve gelişmemiş hücrelerde incelenmiştir. Paklitaksel ile birlikte farklı P-gp inhibitörleri miseller içerisine yüksek oranda yüklenebilmiştir. Paklitaksel in sudaki çözünürlüğü bu sayede 0,3 µg/ml den 1095 µg/ml ye çıkartılabilmiştir. İki etkin maddeyi birlikte içeren formülasyonlarda kanser hücrelerine karşı sitotoksisite, P-gp inhibisyonu sayesinde daha yüksek bulunmuştur. TAT peptit ile modifiye edilen miseller yüksek hücresel alım göstermiştir. Bununla birlikte, sitotoksisite 2C5 ile modifiye misellerde daha yüksek bulunmuştur. Elde edilen sonuçlara göre antikanser etkin madde ile birlikte bir P-gp inhibitörü içeren ve aktif hedeflendirme ligandı ile modifiye edilmiş olan misel formülasyonları ile Paklitaksel direncinin önüne geçilebilmiştir. Anahtar Kelimeler: Misel, Paklitaksel, P-gp, çoklu ilaç direnci, siklosporin, elakridar, TAT peptit, 2C5 monoklonal antikor Destekleyen Kurumlar: TÜBİTAK (SBAG 109S106)

6 vi ABSTRACT Sarısözen, C. Active targeted pharmaceutical nanocarriers to be used for the treatment of cancer, Hacettepe University Health Sciences Institute Ph.D. Thesis in Pharmaceutical Technology, Ankara, The use of various targeted nanocarriers has turned out to be one of the most important areas of nanomedicine. These carriers are nanosized materials that can carry various drugs and/or imaging agents. It is also possible to increase local drug concentration and to control drug release via targeted nanocarriers. Among the many possible targets for such nanocarriers, tumors have been most often investigated. Current cancer treatments include surgical intervention, radiation and chemotherapeutic drugs, which often also kill healthy cells and cause toxicity to the patient. Therefore, it is important to actively target of such drugs in the form of nanocarriers to cancerous cells. Paclitaxel, a diterpenoid extracted from Taxus brevifolia, is a strong mitotic inhibitor of cell replication used in various cancer treatments including breast, ovarian, liver, head and neck cancers. It has very low water solubility. Because of this, it is currently used in a formulation made with Cremophor EL and ethanol 1:1 (v/v) and subsequently diluted in saline solutions prior to i.v. administration. However, this Cremophor EL/ethanol mixture provokes serious undesirable side effects, such as hypersensitivity, nephrotoxicity, and neurotoxicity. In attempts to minimize these problems, a variety of paclitaxel drug delivery systems have been investigated. In this thesis, micelle formulations were prepared to increase the water solubility and bioefficiency of Paclitaxel. Furthermore, uptake and pharmacological effect of Paclitaxel was investigated by conjugating with specific ligands. Polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine was used for the preparation of Paclitaxel-loaded micelles. To facilitate the intracellular and targeted delivery of these micelles, a cell penetrating peptide (TAT) and 2C5 monoclonal antibody were added into the formulations. As it is well known, most antitumor agents are not very effective in chemotherapy because of multidrug resistance in various tumor cells. After identification of P-gp as a major cause of MDR in in vitro cell studies, tremendous efforts have been made for the identification of more effective treatment methods for the P-gp inhibition. For this purpose, P-gp inhibitors were added in the formulations. In vitro characterization studies such as micellar size, zeta potential, micellar solubilization, encapsulation efficiency and in vitro release studies were performed. Cytotoxicity and anticancer activity studies were also investigated on resistant/unresistant cells by using cell culture techniques. Paclitaxel together with different P-gp inhibitors were loaded at high amounts in the micelles. By this means, aqueous solubility of paclitaxel were increased from 0,3 µg/ml to 1095 µg/ml. Cytotoxicity against cancer cells was found to be higher in the formulations containing both active substances, due to the inhibition of P-gp. TAT peptidemodified micelles have shown high cellular uptake. However, cytotoxicity was found to be higher in the 2C5 modified micelles. The obtained results indicate that, Paclitaxel resistance could be reversed by an anticancer drug and P-gp inhibitor coloaded active targeted micelle formulations. Keywords: Micelle, Paclitaxel, P-gp, multiple drug resistance, cyclosporine, elacridar, TAT peptide, 2C5 monoclonal antibody This study was supported by grant 109S106 from TUBITAK

7 vii İÇİNDEKİLER ÖZET... iv ABSTRACT... vi İÇİNDEKİLER... vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ... x ŞEKİLLER DİZİNİ... xi TABLOLAR DİZİNİ... xiv 1. GİRİŞ GENEL BİLGİLER Paklitaksel (PTX) İlaç Taşıyıcı Sistem Olarak Miseller Farmasötik Nanotaşıyıcılar Miseller, Tanım ve Oluşum Mekanizmaları Polimerik Miseller ve Bileşimleri Poli(Etilen Glikol)-Lipit Konjugatları Misellere İlaç Yüklemesi ve Çözünürleştirici Etki Pasif Hedeflendirme ve Kanda Kalış Süresinin Uzunluğu Kanda Kalış Süresi Uzatılmış Nanotaşıyıcılarla Ligand Aracılı Hedeflendirme Misellerin Hücresel Alımı Misel Aracılı Hücresel Alımın Arttırılması Monoklonal Antikorlar ve 2C Antikorlar ve Monoklonal Antikorlar Otoantikorlar ve 2C Kanser ve Kanserde Çoklu İlaç Direnci Taşıyıcı Temelli İlaç Direnci ve P-gp PTX Direnci P-gp Aracılı Direncin Geri Döndürülmesi Hücre Kültürü Çalışmaları Hücre Kültüründe Kullanılan Terimler ve Tanımları Hücre Kültürünün Üstünlük ve Sakıncaları Hücre Kültürlerinin Kullanım Alanları Hücre Canlılığının Değerlendirilmesi Proteinlerin Analizlerinde Kullanılan Yöntemler Protein Konsantrasyon Tayini ve BCA ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Western Blot Yöntemi Akış Sitometrisi GEREÇ VE YÖNTEM Kullanılan Kimyasal/ Biyolojik Maddeler Kullanılan Cihazlar Çalışmalarda Kullanılacak Polimerlerin Sentezi ve Karakterizasyonu pnp-peg-pe Bileşiğinin Sentezi pnp-peg-pe Bileşiğinin 1 H-NMR ile Karakterizasyonu Analitik Miktar Tayini Yöntemleri PTX in Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile Miktar Tayini PTX ve CYC İçin HPLC ile Miktar Tayini PTX ve ELC için HPLC ile Miktar Tayini Kullanılan Analitik Yöntemlerin Validasyon Parametreleri... 58

8 3.5. Etkin Madde İçermeyen Misel Formülasyonlarının Hazırlanması Etkin Madde İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX ve CYC İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX ve ELC İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı Ligand ile Modifiye Edilen Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı Hazırlanan Misel Formülasyonlarının Karakterizasyonları Kritik Misel Konsantrasyonunun Belirlenmesi ve Misel Oluşumunun Doğrulanması Misellerin Partikül Büyüklüğü ve Zeta Potansiyeli Ölçümleri PTX in Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği ve Miseller Çözünürlüğünün Araştırılması PTX ve CYC nin Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği PTX ve ELC nin Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği Misel Formülasyonlarından PTX in In Vitro Salımı Misel Formülasyonlarının AFM ile Görüntülenmesi Modifiye Misellerde TATp Aktivitesinin ELISA ile Kontrolü Modifiye Misellerde 2C5 Aktivitesinin ELISA ile Kontrolü Hücre Kültürü Çalışmaları Kullanılan Hücrelerde P-gp Varlığının Western Blot Analizi ile Kontrolü Kullanılan Hücrelerde P-gp Varlığının Akış Sitometrisi ile Kontrolü Kullanılan Hücre Hatları ve Hücre Kültür Koşulları Geliştirilen Formülasyonların Sitotoksisitelerinin Araştırılması BULGULAR Çalışmalarda Kullanılacak Polimerlerin Sentezi ve Karakterizasyonu pnp-peg-pe Bileşiğinin Sentezi pnp-peg-pe Bileşiğinin 1 H-NMR ile Karakterizasyonu Analitik Miktar Tayini Yöntemleri PTX in Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile Miktar Tayini PTX ve CYC için HPLC ile Miktar Tayini PTX ve ELC için HPLC ile Miktar Tayini Etkin Madde İçermeyen Misel Formülasyonlarının Hazırlanması Etkin Madde İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX ve CYC İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX ve ELC İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı Ligand ile Modifiye Edilen Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı Hazırlanan Misel Formülasyonlarının Karakterizasyonları Kritik Misel Konsantrasyonunun Belirlenmesi ve Misel Oluşumunun Doğrulanması Misellerin Partikül Büyüklüğü ve Zeta Potansiyeli Ölçümleri PTX in Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği ve Miseller Çözünürlüğünün Araştırılması PTX ve CYC nin Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği PTX ve ELC nin Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği Misel Formülasyonlarından PTX in In Vitro Salımı Misel Formülasyonlarının AFM ile Görüntülenmesi Modifiye Misellerde TATp Aktivitesinin ELISA ile Kontrolü viii

9 4.8. Modifiye Misellerde 2C5 Aktivitesinin ELISA ile Kontrolü Hücre Kültürü Çalışmaları Kullanılan Hücrelerde P-gp Varlığının Western Blot Analizi ile Kontrolü Kullanılan Hücrelerde P-gp Varlığının Akış Sitometrisi ile Kontrolü Geliştirilen Formülasyonların Sitotoksisitelerinin Araştırılması TARTIŞMA Çalışmalarda Kullanılacak Polimerlerin Sentezi ve Karakterizasyonu pnp-peg-pe Bileşiğinin Sentezi pnp-peg-pe Bileşiğinin 1 H-NMR ile Karakterizasyonu Analitik Miktar Tayini Yöntemleri PTX ve CYC için HPLC ile Miktar Tayini PTX ve ELC için HPLC ile Miktar Tayini Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı Misel Formülasyonlarının Karakterizasyonları Kritik Misel Konsantrasyonunun Belirlenmesi ve Kanda Kalış Süresi Uzatılmış Miseller Misellerin Partikül Büyüklüğü ve Zeta Potansiyelleri Etkin Maddelerin Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği ve Miseller Çözünürlüğün Araştırılması Misel Formülasyonlarından PTX in In Vitro Salımı Modifiye Misellerde Ligandların Aktivitelerinin ELISA ile Kontrolü Hücre Kültürü Çalışmaları Kullanılan Hücrelerde P-gp Varlığının Kontrolü Geliştirilen Formülasyonların Sitotoksisitelerinin Araştırılması SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR EKLER... Ek 1: Özgeçmiş... Ek 2: Tez Çalışmasından Yapılan Yayınlar... ix

10 x SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ 1-OSA Oktan-1-sülfonik asit sodyum tuzu ABC ATP-bağlayıcı kaset AFM Atomik güç mikroskobu BCRP Meme kanseri direnci proteini CMC Kritik misel konsantrasyonu CPP Hücre penetrasyon peptitleri CYC Siklosporin A DAD Diod array dedektör DMF Dimetil formamid DMSO Dimetil sülfoksit DOPE 1,2-Dioleoil-sn-glisero-3-fosfoetanolamin ELC Elakridar ELISA Enzim-bağlı immünosorbent testi epc Yumurta fosfatidil kolini EPR Artmış geçiş ve tutulma FBS Fetal dana serumu HPLC Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi HRP Horseradish peroksidaz İTK İnce Tabaka Kromatografisi MDR Çoklu İlaç Direnci MTT Thiazolil mavisi tetrazolyum bromür MWCO Molekül ağırlığı geçirgenlik sınırı N/A Elde edilemedi NCS Neokarzinostatin P-gp P-glikoprotein PBS Fosfat tamponlanmış tuz çözeltisi PEG Poli(etilen glikol) PEG-PE 1, 2 distearoil sn glisero 3 fosfoetanolamin N [metoksi(polietilen glikol) PEG-PLLA Poli(etilen glikol)-poli(l-laktid) PLGA Poli(D,L-laktid-ko-glikolid) pnp p-nitrofenilkarbonil PTX Paklitaksel PVP Poli(N-vinil-2-pirolidon) RES Retikülo endotelyal sistem SDS Sodyum dodesil sülfat SMA Stiren maleik asit ko-polimeri SMANCS Konjuge SMA ve NCS SS Sodyum salisilat TATp Trans-aktivatör transkripsiyon aktivatör peptit TEA Trietil amin TPGS d-α-tokoferil polietilen glikol 1000 süksinat WST-1 4-[3-(4-iyodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolyo]-1,3-benzen disülfonat XTT 3'-[1-[(fenilamino)-karbonil]-3,4-tetrazolyum]-bis(4-metoksi-6- nitro)benzen-sülfonik asit hidrat

11 xi ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. PTX in moleküler yapısı Şekil 2.2. Misel oluşum şeması {(26) dan modifiye edilerek alınmıştır} Şekil 2.3. Amfifilik polimerler kullanılarak oluşturulan misel yapıları ve farklı polarlığa sahip ilaç moleküllerinin bu yapılar içerisinde dağılımının şematik olarak gösterimi (19) Şekil ,2 distearoil sn glisero 3 fosfoetanolamin-n- [metoksi (polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu) (68) Şekil 2.5. Farklı PEG zincir uzunluğuna sahip PEG-PE konjugatlarının molekül şekli gösterimi Şekil 2.6. epc kullanılarak PTX in PEG-PE miselleri içerisine hapsedilme miktarının arttırılması (52) Şekil 2.7. pnp-peg-pe sentezinin şematik gösterimi (103) Şekil 2.8. Miseller sistem içerisine hapsedilmiş ilaçların olası hücresel alım mekanizmaları (105) Şekil 2.9. Bir antikor molekülünün şekilsel gösterimi ((119) den modifiye edilerek hazırlanmıştır) Şekil PTX in P-gp ile hücre dışına atılımı (6) Şekil CYC nin moleküler yapısı ve üç boyutlu gösterimi Şekil ELC nin molekül şekli Şekil MTT nin aktif mitokondri tarafından formazana dönüştürülmesi Şekil BCA ile Cu+1 kompleksi oluşumu Şekil İndirekt ELISA (Ag=antijen) Şekil Sandwich ELISA (Ag=antijen) Şekil 3.1. Etkin madde içermeyen misel formülasyonlarının hazırlanışı Şekil 3.2. Ligand ile modifiye edilen misellerin hazırlanışı Şekil 3.3. Boyut ayırma kromatografisinde molekül büyüklüklerine göre ayırım Şekil 4.1. pnp-peg-pe bileşiğinin kolondan saflandırma sonucunda elde edilen fraksiyonlarının İTK ile analizi Şekil 4.2. pnp-peg-pe sentezine ait bileşiklerin 1 H-NMR spektrumları Şekil µg/ml konsantrasyonda PTX standart çözeltisinin örnek kromatogramı Şekil 4.4. PTX için kullanılan HPLC yönteminden elde edilen kalibrasyon doğrusu ve denklemi (n=6) Şekil µg/ml konsantrasyonda PTX ve CYC içeren standart çözelti kromatogramı Şekil 4.6. PTX ve CYC için kullanılan HPLC yönteminden elde edilen kalibrasyon doğrusu ve denklemi (n=6) Şekil µg/ml ELC ve 50 µg/ml PTX içeren standart çözeltiye ait kromatogramlar Şekil 4.8. PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminden PTX için elde edilen kalibrasyon doğrusu ve denklemi (n=6) Şekil 4.9. PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminden ELC için elde edilen kalibrasyon doğrusu ve denklemi (n=6) Şekil Ligandın (TATp ya da 2C5) yapısındaki NH 2 aracılığı ile misel yapısına girecek lipitler ile konjugasyonu Şekil PEG-PE misellerinin boyut ayırma HPLC analizi ile elde edilen kromatogramları

12 Şekil PEG-PE/Vitamin E (85:15) misellerinin boyut ayırma HPLC analizi ile elde edilen kromatogramları Şekil SS konsantrasyonuna bağlı olarak PTX çözünürlüğü (x ekseni logaritmik eksendir) Şekil SS konsantrasyonuna bağlı olarak PEG-PE misellerinin partikül büyüklüğü sonuçları (n=6) Şekil PTX misellerinden zamana bağlı PTX salımı (n=3) Şekil PTX ve ELC misellerinden PTX salımı (n=3) Şekil Etkin madde içermeyen misel formülasyonlarının AFM görüntüleri Şekil TATp ile modifiye edilmiş misellerin yüzeyinde bulunan TATp in aktivitesinin ELISA ile kontrolü Şekil C5 ile modifiye edilmiş misellerin yüzeyinde bulunan 2C5 ın aktivitesinin ELISA ile kontrolü Şekil MCF-7, MDCKII-MDR1 ve MDCKII-Parental hücrelerinin western blot analizi sonuçları Şekil MCF-7 hücrelerine ait akış sitometrisi ile P-gp kontrolü sonuçları Şekil MDCKII-Parental hücrelerine ait akış sitometrisi ile P-gp kontrolü sonuçları Şekil MDCKII-MDR1 hücrelerine ait akış sitometrisi ile P-gp kontrolü sonuçları Şekil PEG-PE:Vitamin E (85:15) misellerinin Caco-2 hücrelerinde sitotoksisiteleri (n=3) Şekil Ligand ile modifiye edilmemiş farklı misel formülasyonlarının MDCKII- MDR1 hücreleri üzerindeki 24 saatlik etkilerinin incelenmesi (n=3) Şekil Ligand ile modifiye edilmemiş formülasyonların MDCKII-MDR1 ve MDCKII-Parental hücreleri üzerindeki etkilerinin incelenmesi (n=3) Şekil MCF-7 hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 24 saatlik etkisinin incelenmesi (n=3). * işareti bulunan gruplarda her üç formülasyon cevabı arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0,01) Şekil MDCKII-MDR1 hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 24 saatlik etkisinin incelenmesi (n=3). * işareti bulunan formülasyonlar ve gruplarda cevaplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0,05) Şekil MCF-7 hücreleri üzerinde PTX ve ELC içeren modifiye edilmemiş misel formülasyonlarının 24 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6) Şekil MCF-7 hücreleri üzerinde PTX ve ELC içeren modifiye edilmemiş misel formülasyonlarının 48 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6) Şekil MDCKII-Parental hücreleri üzerinde PTX ve ELC içeren modifiye edilmemiş misel formülasyonlarının 12 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6) Şekil MDCKII-MDR1 hücreleri üzerinde PTX ve ELC içeren modifiye edilmemiş misel formülasyonlarının 12 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6) Şekil MCF-7 hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 24 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6). * işareti bulunan formülasyonların cevapları arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır ve P değeri grafikte verilmiştir Şekil MCF-7 hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 48 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6). * işareti bulunan xii

13 formülasyonlar ve gruplarda cevaplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır ve P değeri grafikte verilmiştir Şekil MDCKII-Parental hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 12 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6) Şekil MDCKII-MDR1 hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 12 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6). * işareti bulunan formülasyonlar ve gruplarda cevaplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0,05) xiii

14 xiv TABLOLAR DİZİNİ Tablo 2.1. PTX in değişik çözücülerdeki çözünürlük değerleri Tablo 2.2. Farklı misellerin hazırlanması için kullanılan polimerler ve hapsedilen etkin maddeler Tablo 2.3. Poli(etilen glikol)-poli(l-laktid) (PEG-PLLA) misellerinde PLLA blok uzunluğunun kritik misel konsantrasyonu ve misellerin büyüklüğü üzerine etkisi (54) Tablo 2.4. Farklı etkin maddeler yüklenmiş PEG-PE miselleri ve bunların hazırlama yöntemleri Tablo 2.5. Farklı nanotaşıyıcı formülasyonları ve bunlarda kullanılan CPP kombinasyonları (117) Tablo 2.6. Antikanser ilaçlar ve substratı oldukları mekanizmalar Tablo 2.7. PTX uygulamasıyla direnç geliştirilmiş ve gelişmemiş hücrelerde ilaca karşı hassaslık (146) Tablo 2.8. Birinci jenerasyon P-gp inhibitörleri kullanılarak tamamlanan klinik çalışmalar (130) Tablo 3.1. PTX miktar tayininde kullanılan HPLC yönteminin parametreleri Tablo 3.2. PTX ve CYC miktar tayininde kullanılan HPLC yönteminin parametreleri Tablo 3.3. PTX ve CYC için kullanılan gradient elüsyon HPLC yönteminde zaman bağlı mobil faz yüzde değişimi Tablo 3.4. PTX ve ELC miktar tayininde kullanılan HPLC yönteminin parametreleri Tablo 3.5. Etkin madde içermeyen PEG-PE ve PEG-PE/Vitamin E misel formülasyonları Tablo 3.6. PTX ve ELC içeren misel formülasyonlarının bileşimi Tablo 3.7. Misel oluşumunun doğrulanmasında kullanılan boyut ayırma kromatografisi şartları Tablo 4.1. PTX için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen tekrar edilebilirlik sonuçları (n=6) Tablo 4.2. PTX için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen tekrar elde edilebilirlik sonuçları (n=6) Tablo 4.3. PTX için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen doğruluk sonuçları (n=6) Tablo 4.4. PTX ve CYC için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen tekrar edilebilirlik sonuçları (n=6) Tablo 4.5. PTX ve CYC için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen tekrar elde edilebilirlik sonuçları (n=6) Tablo 4.6. PTX ve CYC için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen doğruluk sonuçları (n=6) Tablo 4.7. PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen tekrar edilebilirlik sonuçları (n=6) Tablo 4.8. PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminde PTX için elde edilen tekrar elde edilebilirlik sonuçları (n=6) Tablo 4.9. PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminde ELC için elde edilen tekrar elde edilebilirlik sonuçları (n=6) Tablo PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminde PTX için elde edilen doğruluk sonuçları (n=6)

15 Tablo PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminde ELC için elde edilen doğruluk sonuçları (n=6) Tablo mm lık misel formülasyonlarının karakterizasyonları (n=6, Ortalama±Standart Sapma) Tablo mm lık misel formülasyonlarının karakterizasyonları (n=6, Ortalama±Standart Sapma) Tablo PTX ve ELC içeren formülasyonlara ait partikül büyüklüğü, zeta potansiyeli ve polidispersite indeksi sonuçları (n=6) Tablo mm konsantrasyonda hazırlanan misel formülasyonlarına hapsedilen PTX miktarı (n=3) Tablo mm konsantrasyonda hazırlanan misel formülasyonlarına hapsedilen PTX ve CYC miktarları (n=3) Tablo Misel formülasyonların hapsedilen PTX ve ELC miktarları (n=3) xv

16 1 1. GİRİŞ Kanser tedavisinde karşılaşılan en büyük sorunlardan biri, Paklitaksel (PTX) gibi etkin maddelerin formülasyonunda yaşanan zorluklardır. PTX in suda çözünürlüğünün bulunmaması etkin bir formülasyon içinde verilmesini zorlaştırmaktadır. Günümüzde kullanılan ticari PTX preparatı, Cremophor EL ve etanolün hacimce 1:1 oranındaki karışımı içerisinde formüle edilmiştir. Bu formülasyonda kullanılan Cremophor EL (polietoksillenmiş hint yağı) noniyonik yapıda amfifilik bir sürfaktandır. PTX in çözünürlüğünü artırmak için kullanılmaktadır fakat bir çok hastada ciddi yan etkileri bulunmaktadır. Kendisi de sitotoksik bir ilaç olan PTX in yan etki profili yüksek bir yardımcı madde ile birlikte formüle edilmesi klinikte ciddi sorunlar yaşanmasına sebep olmaktadır. Antikanser etkin maddelerin, suda çözünürlük özelliklerini iyileştirmek ve kan dolaşımına uygulandıklarında tüm doku ve organlara dağılmalarından ziyade kanserli dokularda birikimlerini arttırmak için nanometre boyutlu ilaç taşıyıcı sistemler sıklıkla kullanılmaktadır. Boyutlarının küçüklüğü sayesinde EPR (Artmış geçiş ve tutulma) etkisinden faydalanan nano-taşıyıcılar pasif hedeflendirme ile kanserli dokularda birikebilmekte ve bu bölgelerde ilaç konsantrasyonunu arttırabilmektedir. Bu etkiden faydalanabilmek için taşıyıcıların boyutunun, farklı tümörlerdeki farklı damarlanmalar da göz önünde bulundurularak 200 nm den az olması gereklidir. EPR etkisinden faydalanabilmek için öncelikle bir nano-taşıyıcının kan dolaşımında uzun süre kalması gereklidir. Kan dolaşımından hızla uzaklaştırılmaması için, ilaç taşıyan sistemlerin vücut tarafından yabancı bir cisim olarak algılanmamaları, opsonizasyona uğramamaları ve retikülo endotelyal sistem (RES) tarafından tutulmamaları gereklidir. Bütün bu özellikler nano-taşıyıcının yüzeyinin poli(etilen glikol) (PEG) ile kaplanması ile aşılabilir. Kan bileşenlerinin taşıyıcı yüzeyine adsorpsiyonunu sterik olarak engelleyen PEG zincirleri taşıyıcıya hidrofilik bir özellik kazandırarak kan dolaşımında kalış süresini uzatmaktadır. Farmasötik miseller, kolloidal dağılımlar gösteren (partikül büyüklüğü nm aralığında olan) ve dispers faz ile dispersiyon ortamının birlikte

17 2 bulunduğu geniş bir gruba dahil olan sistemlerdir. Miseller, ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanıldıklarında, düşük çözünürlüğü olan nonpolar ilaçlar misel çekirdeği içerisinde hapsolmakta, böylece çözünürlük sorunu olan etkin maddelerin çözünürlükleri de arttırılmış olmaktadır. Polar moleküller misel yüzeyine adsorbe olurken ortalama polarlığa sahip moleküller de hidrofilik kılıf içerisinde hapsolmaktadır. Misellerin suda çözünürlüğü bulunmayan etkin maddeleri etkin bir şekilde enkapsüle ederek suda çözünürlüklerini arttırmaları ve küçük partikül boyutları, onları kanserli dokulara hedeflendirme için ideal sistemlerden biri yapmaktadır. Nano-taşıyıcılarda ve dolayısı ile misellerde de, pasif hedeflendirmeye ek olarak, sistemlerin hedef bölgeye ulaştıklarında hücresel alımlarını arttırmak ve sadece hedeflenen hücrelere içerdikleri etkin maddeyi ulaştırmak için aktif hedeflendirme stratejileri de uygulanmaktadır. Bu amaçla, hücresel alımı arttırdığı bilinen TAT peptit gibi peptitler ya da özgün bir şekilde sadece kanserli hücreler ile etkileşimlerini arttıran 2C5 gibi monoklonal antikorlar bu amaçla kullanılan aktif hedeflendirme ligandları arasındadır. Aktif hedeflendirme ile hücresel düzeylere taşımayı artırmak, ilaçların dolaşımda ya da diğer biyolojik sıvılardaki konsantrasyonunu ve salım kinetiklerini optimize etmek, düşük ya da yüksek dozlarda etkin ve güvenli tedavi sağlamak, ilaçların stabilitesini artırmak ve vücudun diğer bölgelerinde herhangi bir istenmeyen etkiye neden olmadan hedef bölgede istenilen düzeyde farmakolojik yanıt elde etmek mümkündür. Etkili bir kanser tedavisinin önündeki diğer bir büyük engel ise kanser hücrelerinin kullanılan antikanser ilaca karşı direnç geliştirmeleridir. Antikanser etkin maddelere karşı gelişen çoklu ilaç direnci (MDR), etkili bir şekilde hücrelere ulaştırılabilse bile etkin maddenin etkisini gösteremeden hücre dışına atılmasına yol açmaktadır. En sık görülen direnç mekanizması ise P-glikoprotein (P-gp) aracılı dirençtir. Kanserli hücrelerin membranlarında bulunan bu protein bir pompa gibi işlev gösterir ve hücre içindeki etkin maddeyi hücre dışına atar. Bu proteinin inhibitörlerinin kullanılması ise antikanser maddelerin hücre dışına atılımlarını azaltır ve tekrar etki göstermelerini sağlar.

18 3 Bu bilgiler ışığında tez çalışmasında geliştirilen varsayım; kanda kalış süresi uzatılmış miseller nano-taşıyıcı formülasyonlarının geliştirilmesi, bu yapılar içine PTX ile birlikte bir P-gp inhibitörünün hapsedilmesi ve bu sistemlerin yüzeyinin bir aktif hedeflendirme ligandı ile modifiye edilmesi ile direnç gelişmiş kanserli hücrelerde yüksek etkinlik görüleceği ve bu sayede gelişen direncin geri çevrilebileceğidir. Tez çalışmasının amacı, bu varsayımın doğruluğunun araştırılması için öncelikle kanda kalış süresi uzatılmış, PTX ve bir P-gp inhibitörünü birlikte hapsetmiş misel formülasyonlarının geliştirilmesi ve bu formülasyonların yüzeylerinin TAT peptit ya da 2C5 ile modifiye edilerek etkinliklerinin arttırılmasıdır. Bu varsayımın doğruluğunun araştırılabilmesi için deneysel çalışmalarla misel formülasyonlarının partikül büyüklüğü, zeta potansiyeli, PTX çözünürleştirici etkisi, enkapsülasyon etkinliği, in vitro etkin madde salımı araştırılacak ve incelenecektir. Ayrıca direnç gelişmiş ve gelişmemiş kanser hücreleri üzerinde yapılan çalışmalar ile hazırlanan bu formülasyonların değerlendirilmeleri yapılacaktır.

19 4 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Paklitaksel (PTX) PTX ilk olarak 1960 lı yıllarda, Taxus Brevifolia nın yaprak ve kabuklarından ekstre edilmiştir. Antikanser etki gösteren bir diterpenenoid türevidir. Molekül formülü C 47 H 51 NO 14 ve molekül ağırlığı 853,91 g/mol dür. Antikanser etki göstermesinde yapısındaki taksan molekülü ve C13 e bağlı ester yan zinciri önemli rol oynamaktadır (1). AcO O OH Ph O H N S Ph OH R O O Me S Me S R S Me R S H S Me R S O H O OH O AcO Ph Şekil 2.1. PTX in moleküler yapısı. PTX in erime derecesi yaklaşık C arasındadır (2) ve suda pratik olarak çözünürlüğü olmayan bir moleküldür. Farklı kaynaklarda çözünürlüğü farklı değerlerde verilmiştir fakat bu farklılığın nedeni tam olarak açıklanmamıştır. Bununla birlikte yapılan çalışmalar 3 µg/ml 30 µg/ml arasında çözünürlük değerleri üzerinde yoğunlaşmaktadır (3). Ayrıca aşağıdaki tabloda PTX in farklı çözücülerdeki çözünürlük değerleri verilmektedir (4).

20 5 Tablo 2.1. PTX in değişik çözücülerdeki çözünürlük değerleri. Çözücü Çözünürlük (mg/ml) Metilen klorür 19 Asetonitril 22 Etanol ~ 39 İzopropanol ~ 12 Soya yağı 0,3 %75 Propilen glikol <1,4 Farelerde PTX in LD 50 değeri 10mg/kg olarak bulunmuştur (5). PTX in plazma proteinlerine bağlanma oranı %76 97 arasındadır. Terminal yarılanma ömrü 1,3 8,6 saat arasındadır ve büyük oranda sitokrom P-450 aracılı karaciğer metabolizasyonuna uğramaktadır. PTX suda çözünürlüğü çok düşük olan son derece lipofilik bir moleküldür ve hücre membranından difüzyon ile alınmaktadır. Hücreye transportu için özel bir taşıyıcı proteine ihtiyaç duymamaktadır. PTX mikrotübüllere bağlanarak tümör hücrelerinde mitoz bölünmeyi, kısaca tümör hücrelerinin çoğalmasını engellemektedir. Mikrotübüller son derece dinamik yapılardır ve α β heterodimerleri mikrotübüllerin yapıtaşlarıdır. Normal hücre olayları düzeninde bu dimerler bir uçtan diğerine bağlanarak doğrusal filamentler oluştururlar. Bu sayede düzenli olarak uzayan kısalan mikrotübül yapıları oluşur. Hücre bölünmesi sırasında kromozomların kendilerini kopyalamasından sonra sentrozomlardan çıkan mikrotübüller çiftler halinde duran kromozomların çekirdeklerinden karşılıklı olarak tutunurlar. Yukarıda bahsedilen dinamik yapıları sayesinde dimerler parçalanmaya başlar ve bu parçalanma sonucunda karşılıklı olarak kısalan mikrotübüller kromozomları birbirinden ayırarak uzaklaştırırlar. Antimikrotübül ajanların çoğu hücrenin G2/M fazında etki gösterir ve kromozomların karşılıklı kutuplara çekilmesini engellerler. PTX mikrotübüllere bağlanarak

21 6 onları polimerize eder ve bu sayede dinamik yapılarını bozarak tekrar parçalanmalarını, dolayısı ile fonksiyonlarını yitirmelerini sağlar (6). Ayrıca son yıllarda bir çok çalışmada PTX in mikrotübül stabilizasyonuna ek olarak mitokondriyel apoptozis yolağını aktive ederek tümörlü hücrelerde apoptozisi artırdığı da bildirilmiştir (7-12). PTX in şu anda dünyada ve ülkemizde ticari olarak kullanılan innovatör preparatı Taxol adı altında üretilmektedir. Ticari PTX formülasyonlarında Cremophor EL (polietoksillenmiş hint yağı) : etanol (1:1) karşımından oluşan sıvağ kullanılmaktadır. Bu karışımda kullanılan Cremophor EL non-iyonik yapıda amfifilik bir sürfaktandır. Cremophor misel yapıları oluşturarak suda çözünürlüğü bulunmayan PTX i içine hapsetmekte, alkol ise yardımcı çözücü olarak kullanılmaktadır. Bununla birlikte ticari formülasyonda kullanılan Cremophor EL : alkol karışımı hastalarda ciddi yan etkilere sebep olmaktadır. Bu etkiler arasında akut hipersensitivite, nefrotoksisite, nörotoksisite ve dislipidemi yer almaktadır (13). Ayrıca mevcut taşıyıcı sistemin kullanılması ile tümörlü bölgede etkili olabilecek PTX konsantrasyonuna ulaşıldığında bu doz non-spesifik toksisiteye yol açarak sağlıklı hücreleri de öldürmektedir. Bütün bu yan etkiler sebebiyle PTX in klinik uygulamasında oluşan ciddi sorunlar, bu ilacın kullanımına kısıtlamalar getirmekte ve hasta uyuncu ciddi oranda azaltmaktadır (14).

22 İlaç Taşıyıcı Sistem Olarak Miseller Farmasötik Nanotaşıyıcılar Nanoteknolojideki hızlı ilerleme, diğer alanlar ile birlikte sağlık alanında da önemli gelişmeleri beraberinde getirmiştir. Nanotıp (ya da nanoilaç) bir hastalığın tedavisi ya da hasarlı bir dokunun onarılması için moleküler düzeyde yüksek özgünlük gösteren bir medikal uygulama olarak tanımlanmıştır (15). Nanotaşıyıcılar, büyüklükleri nm arasında değişen, çözünmüş, hapsedilmiş veya adsorbe olan etkin maddeyi kontrollü olarak salan sistemlerdir (16). Bununla birlikte nanoteknoloji ve dolayısı ile de nanotıp alanının boyut sınırları olarak kabul edilen yaygın sınırlar nm arasıdır (15,17) Nanotaşıyıcılar içerisinde; farklı polimerik nanopartiküller, lipozomlar, miseller, kuantum noktaları, dendrimerler, mikrokapsüller, hücreler, lipoproteinler ve bir çok farklı nanoyapılar sayılabilir. Bu sayılan sistemlerin hepsi teşhis ve tedavide önemli roller oynamaktadırlar. Bu yapılar içerisinde özellikle miseller, lipozomlar ve nanopartiküller üzerlerinde çok sayıda çalışma yapılan sistemlerdir ve bir çok ilaç ve teşhis ajanının hapsedilmesi için en uygun özellikleri sağlamaktadırlar. Daha etkin tedavilerin geliştirilmesinde kullanılacak ilaçların absorpsiyon, dağılım, metabolizasyon ve eliminasyon (ADME) özelliklerinden birinde ya da birden fazlasında iyileştirilme yapılması bilim dünyasında uzun süredir üzerinde çalışılan bir konudur lü yılların başlarında (1906) Paul Ehrlich bu durum üzerinde çalışmalar yapmış ve toksisiteyi azaltırken aynı zamanda da etkinliği arttırmak için toksik özelliği bulunan ilaçların yüksek seçiciliği olan sistemlerle birleştirilmesini yani sihirli kurşun kavramını ortaya atmıştır (18). Bununla birlikte biyouyumlu ve biyoparçalanabilir, küçük partikül büyüklüğüne sahip, kanda kalış süresi uzun, vücut içerisinde istenen bölgelerde toplanabilme özelliğine sahip ve suda çözünürlüğü olmayan ilaçların taşınması için geliştirilebilecek ideal sistemlerin halen süregelen çözümlenememiş bir çok problemi de bulunmaktadır (19). Bu tür sistemlerin geliştirilmesi, hidrofobik ve suda çözünürlüğü çok az olan ilaçların terapötik

23 8 etkilerinin geliştirilmesi için son derece önemlidir. Çünkü sudaki düşük çözünürlük ilacın özellikle oral alım sonrası yetersiz absorpsiyonuna ve düşük biyoyararlanımına yol açmaktadır (20). Ayrıca intravenöz uygulama sonrası ilaçların agrege olması embolizasyon gibi bir çok istenmeyen etkiye yol açabilmekte, agregasyon olan bölgelerde yüksek ve toksik seviyelerdeki ilaç birikimi görülebilmektedir (21). Çözünürlük sorunu olan ilaçların formülasyonunda, klinik olarak kabul edilebilen çözücüler, Cremophor EL ve sürfaktanlar kullanılmaktadır. Bazı durumlarda tuz oluşturulması ya da ph ayarlanması eğer söz konusu ilaçların iyonize olabilen grupları varsa çözünürlüğü arttırmaktadır (22). Günümüzde ise daha yeni yaklaşımlar olan lipozomların, siklodekstrinlerin ya da mikroemülsiyonların kullanımı yaygınlık kazanmaktadır (23,24) Miseller, Tanım ve Oluşum Mekanizmaları Misel yapıları kolloidal dağılımlar gösteren (partikül büyüklüğü nm aralığında olan) ve dispers faz ile dispersiyon ortamının birlikte bulunduğu geniş bir gruba dahil olan sistemlerdir. Kendiliğinden oluşan misel sistemleri amfifilik polimerler kullanılarak oluşturulurlar. Kendi başına bu amfifilik polimer zincirlerine unimer adı verilir. Bu unimerlerin iki ucu da farklı özellik gösterir ve içinde olduğu ortama bu iki ucun afinitesi oldukça farklıdır (25). Unimerler sulu çözeltilerinde belirli bir konsantrasyona (kritik misel konsantrasyonu) ve sıcaklığa (kritik misel sıcaklığı) kadar tek başlarına polimer zincirleri halinde bulunurlar (Şekil 2). Bu konsantrasyon aşıldığında ise bu amfifilik polimerler kendi başlarına agrege olurlar ve misel yapıları oluştururlar (26).

24 9 Şekil 2.2. Misel oluşum şeması {(26) dan modifiye edilerek alınmıştır}. Miseller oluşurken hidrofobik kısımların sulu ortamda kendi içlerinde bir araya gelmesi ve hidrofilik kısımların sulu ortamda hidrojen bağları kurmaları ile sistemin serbest enerjisinde düşme meydana gelir. Elde edilen bu enerji fazlası da misel çekirdeğindeki hidrofobik kısımların kendi arasında Van der Waals bağları kurmasına olanak verir (27). Hidrofobik kısımlar miselin çekirdeğini oluştururken hidrofilik kısımlar da misel kılıfını oluştururlar (28). Bu kendiliğinden oluşum mekanizması geri dönüşümlü ve termodinamik bir olaydır. Amfifilik polimerlerin misel oluşturabilmeleri yapılarındaki hidrofobik ve hidrofilik grupların özelliklerine ve aynı zamanda da birbirlerine karşı olan kütlesel oranlarına büyük ölçüde bağımlıdır. Eğer hidrofilik kısmın oranı ya da uzunluğu çok fazla olursa sulu ortamda polimer unimer halinde kalır ve misel yapısı oluşturamaz (29). Bununla birlikte hidrofobik kısmın oranındaki artış da unimer yapılarının oluşturdukları agregatların misel dışı yapılara kaymasına yol açabilir (30). Miseller ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanıldıklarında, düşük çözünürlüğü olan nonpolar ilaçlar misel çekirdeği içerisinde hapsolurlar. Böylece çözünürlük sorunu olan etkin maddelerin çözünürlükleri de arttırılmış olur. Polar moleküller misel yüzeyine adsorbe olurlarken ortalama polarlığa sahip moleküller de hidrofilik kılıf içerisinde hapsolurlar (Şekil 2.3). Misel yapılarının bu çözünürlük arttırıcı etkisi bir çok çalışmada ayrıntılı olarak incelenmiştir (19).

25 10 Şekil 2.3. Amfifilik polimerler kullanılarak oluşturulan misel yapıları ve farklı polarlığa sahip ilaç moleküllerinin bu yapılar içerisinde dağılımının şematik olarak gösterimi (19). Yukarıdaki şekilden de görüleceği üzere hidrofobik yapıdaki ilaç molekülleri misel yapısının hidrofobik çekirdeği içerisinde hapsolurken, daha hidrofilik moleküller ise hidrofilik kılıf içerisinde dağılmaktadırlar. Bu şematik gösterim misel yapılarının ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanımlarında ilaç hapsetme yeteneklerinin açıklaması olarak kullanılabilir. Misel yapıları ilaç taşıyıcı sistemler olarak kullanıldıklarında bir çok üstünlük sunarlar. Suda çözünürlüğü az olan ilaçların yukarıda da açıklanan şekilde çözünürlüğünü arttırmaları ve buna bağlı olarak biyoyararlanımlarını iyileştirmeleri bunlar içerisinde en önemlilerinden birisidir. Özellikle belirli amfifilik moleküllerin misel yapısına katılması sonucunda intravenöz uygulamayı takiben miselin kandaki kalış süresinin arttırılması da mümkündür.

26 Polimerik Miseller ve Bileşimleri Son yıllarda zor çözünen ilaçların çözünürlüğünü arttırmak için amfifilik ko-polimerlerin kullanımı yaygınlık kazanmaktadır (31). Polimerik miseller hidrofilik ve hidrofobik monomer üniteleri olan blok ko-polimerler kullanılarak oluşturulmaktadırlar. Genellikle hidrofilik bloğun zincir uzunluğu hidrofobik gruptan daha uzun olmaktadır. Amfifilik ko-polimerlerin kendi kendilerine bir araya gelerek misel yapıları oluşturabilmelerinin arkasındaki mekanizma, hidrofobik parçaların sulu ortamda uzaklaşmalarına bağlı olarak sistemin serbest enerjisinde düşüş yaşanması ve hidrofobik çekirdek yapısını oluşturmaları, hidrofilik blokların ise sulu ortamla etkileşerek hidrofilik kılıf yapısını oluşturacak şekilde dizilmeleridir (19). Amfifilik polimerler bir çok farklı dizilimde olabilmektedirler. Örneğin farklı hidrofobisiteye sahip monomerler, her bir blok bir polimer içerecek şekilde ikili olarak sıralanabilirler (A-B tipi ko-polimerler) ya da farklı hidrofobikliğe sahip farklı dizilimler de gösterebilirler (A-B-A tipi ko-polimerler). Tıpkı konvansiyonel deterjanlar gibi miseller de hidrofilik grupların merkezinde yer alan hidrofobik bir çekirdekten oluşurlar. Bununla birlikte polimerik miseller genel olarak konvansiyonel deterjanlar ile hazırlanan misellerden çok daha stabil olurlar (32). Bazı polimerik misellerin kritik misel konsantrasyonu değerleri 10-6 M gibi son derece düşük değerlerdeyken Tween-80 gibi bir sürfaktanın kritik misel konsantrasyonu bu değerden 10 ile 100 kat daha yüksektir. Aşağıdaki tabloda farklı misel yapılarının hazırlanması için kullanılan ko-polimerler ve hapsedilen etkin maddeler bulunmaktadır (Tablo 2.2.).

27 12 Tablo 2.2. Farklı misellerin hazırlanması için kullanılan polimerler ve hapsedilen etkin maddeler Blok ko-polimer Hapsedilen etkin madde Uygulama Kaynak Pluronik Doksorubisin Fare (33) Karboplatin In vitro (34) Pluronik/Polietilenimin Antisens oligonükleotit In vitro (35) Polikaprolakton-b-PEG Siklosporin A In vitro (36) Sıçan (37) Polikaprolakton-b-metoksi-PEG Sisplatin In vitro (38) Paklitaksel In vitro (39) Poli(aspartik asit)-b-peg Doksorubisin Pre-klinik, klinik (40) Adriamisin Fare (41,42) Poli(glutamik asit)-b-peg Sisplatin Sıçan (43) Poli(D,L-laktid)-b-metoksi-PEG Paklitaksel Pre-klinik, Faz I (44) Griseofulvin In vitro (45) Poli(benzil-L-aspartat)-b-PEG Indometazin In vitro (46) Poli(L-lizin)-b-PEG DNA In vitro (47) PEG-lipid Paklitaksel In vitro (48) Kamptotesin In vitro (49) Vitamin K3 In vitro (50) PEG-PE/yumurta fosfatidilkolini karışık miselleri Poli(L-laktik asit)-b-peg (folataracılı) Paklitaksel In vitro (51,52) Doksorubisin Fare (53) Polimerik misellerin CMC değeri oluşan misel yapılarının stabilitesinin değerlendirilmesi açısından da son derece önemlidir. Bu amaçla özellikle polimerik misellerde CMC ve bu değerin etkilerinin anlaşılması da önem taşımaktadır. Amfifilik bir blok ko-polimerin kendiliğinden bir araya gelmesi termodinamik olarak yürüyen ve geri dönüşümlü bir işlemdir. Düşük konsantrasyonlarda misel oluşumu ko-polimer moleküllerinin tek başına sulu ortamda kalmaları nedeniyle gerçekleşmezken ko-polimer konsantrasyonu

28 13 belli bir değeri (CMC) geçtikten sonra kendi kendine bir araya gelme ve misel yapısı oluşturma gerçekleşir. Bir ko-polimerin CMC değeri hidrofilik ve hidrofobik blokların kimyasal yapısına ve aralarındaki uzunluk oranına da bağlıdır. Bu uzunluk oranının aynı zamanda misel morfolojisini de değiştirdiği bilinmektedir. CMC temel olarak hidrofobik bloğun uzunluğu ile kontrol edilmektedir (30). Sadece hidrofobik kısmın uzunluğunda yapılan artış kritik misel konsantrasyonunu ciddi oranda düşürürken (dolayısı ile miselin termodinamik stabilitesini arttırırken), sadece hidrofilik kısmın uzunluğunda yapılacak artış kritik misel konsantrasyonunda çok az bir değişmeye sebep olur (Tablo 2.3). Tablo 2.3. Poli(etilen glikol)-poli(l-laktid) (PEG-PLLA) misellerinde PLLA blok uzunluğunun kritik misel konsantrasyonu ve misellerin büyüklüğü üzerine etkisi (54). PEG-PLLA CMC (mg/l) CMC (µm) Misel çapı (nm) ko-polimer bileşimi , ,3 88, ,6 91,9 CMC misel yapılarının termodinamik stabilitesini tanımlayan bir parametredir. Bu özellikle ilaç taşıyıcı sistemler alanında son derece önemli bir özelliktir çünkü misel çözeltilerinin intravenöz enjeksiyonunu takiben bu sistemler çok yüksek oranlarda seyrelmeye maruz kalırlar (i.v. bolus enjeksiyonda genellikle 25 kat ve üstü). Eğer misel oluşturacak polimerin konsantrasyonu CMC değerinin altına düşerse, bu durum taşıyıcı sistemin daha hedefine ulaşmadan parçalanmasına ve buna bağlı olarak da hapsedilen ilacın salınmasına yol açar (55). Kanser tedavisinde etkin olarak kullanılan ilaçların suda çözünürlük özelliklerinin çok düşük olduğu düşünüldüğünde, böyle bir durum salınan ilacın kan dolaşımı içerisinde çökmesi olasılığını doğurabilir. Ayrıca ko-polimerin konsantrasyonunun belirli

29 14 bir değerin üzerine çıkması da istenen bir durum değildir. Bu durumda misel yapısını oluşturan ko-polimerin hidrofilik blokları kendi aralarında çapraz bağlanabilir ve yapı agregatlar oluşturabilir. Bu sebeple her bir ko-polimer için stabil ve güvenli bir misel oluşturabilme konsantrasyon aralığı bulunmaktadır. Misellerin kinetik stabilitesi düşünüldüğünde bu özelliğin termodinamik stabilitelerine göre daha da yüksek olduğu görülmektedir. Bazı sert çekirdekli, camsı geçiş sıcaklığı (T g ) fizyolojik sıcaklığın üzerinde olan miseller CMC altındaki seyreltmelerde saatlerce bazı durumlarda da günlerce yapılarını koruyabilmektedirler (56). Bununla birlikte Pluronic gibi yumuşak çekirdeğe sahip miseller CMC altındaki konsantrasyonlarda dakikalar içerisinde unimer yapılarına ayrılmaktadırlar (57) Poli(Etilen Glikol)-Lipit Konjugatları Genellikle misel oluşturan amfifilik unimerler uzunluğu 1 15 kda arasında değişen PEG zincirleri içerirler (58,59). PEG pahalı olmayan, düşük sitotoksisite gösteren, bir çok biyolojik aktif makromoleküllere karşı sterik koruma gösteren ve dahilen uygulama için yasal otoritelerden izin almış olan bir polimerdir (60-62). PEG e alternatif olarak bir çok farklı polimer seçeneği de kullanılmaktadır. Bunlar arasında poli(n-vinil-2-pirolidon) (PVP) (63), polivinil alkol (64) ya da polietilenimin ve poli(d,l-laktid-koglikolid) (PLGA) de yer almaktadır (65). Fakat PEG halen seçenekler arasında en çok kullanılan ve üstünlükleri en çok olan polimer olarak yerini korumaktadır. Bazı durumlarda, kısa ama bununla birlikte iki uzun zincirli yağ açil grubu içeren son derece hidrofobik fosfolipidler kullanılarak, hidrofobik çekirdek yapısına sahip miseller de oluşturulabilir. Hidrofilik yapıdaki PEG zincirlerinin ucunda yer alan bu fosfolipidler alışılagelmiş amfifilik misellere oranla daha yüksek stabilite göstermeleri bakımından kullanılırlar. Yağ açil zincirlerinin varlığı misel çekirdeğindeki hidrofobik polimer etkileşmelerini arttırmaktadır. Sonuçta PEG-diaçil lipit konjugatları, hidrofilik PEG zinciri ve kısa ama çok hidrofobik diaçil lipit kısmından ötürü amfifilik bir polimer gibi davranmaktadır. Bu özellikler sayesinde daha önce bahsedilen diğer kopolimerler gibi sulu ortamda misel yapıları oluşturabilmektedirler. 1994

30 15 yılında 1, 2 distearoyl sn glycero 3 phosphoethanolamine N [methoxy(polyethylene glycol) moleküllerinin (PEG-PE) bu özellikleri taşıdığı gösterilmiştir (66). PEG-PE konjugatlarının hepsi 7 35 nm arasında miseller oluşturabilmektedirler. PEG PE kullanılarak hazırlanan miselleri içeren bir çalışmada, yapıdan ayrılan ve tek başına olan polimer zincirlerine rastlanmamıştır (67). PEG bloklarının molekül ağırlığı 15 kda u geçmeye başladığında ise misel kararlılığında azalma başlamaktadır. Aşağıda örnek olarak seçilen PEG PE molekülünün şematik gösterimi yer almaktadır. Şekildeki mor atom fosforu, mavi atom ise azotu temsil etmektedir. Verilen şekil amonyum tuzu halinde piyasada bulunan PEG PE molekülü olduğu için ikinci ve küçük mavi atom ise NH + 4 grubunu temsil etmektedir. Şekil ,2 distearoil sn glisero 3 fosfoetanolamin-n- [metoksi (polietilen glikol)-2000] (amonyum tuzu) (68). Yukarıdaki şekilde görülebileceği üzere yapıda iki adet yağ açil zinciri ve uzun PEG zinciri (2000 Da luk molekül büyüklüğü olan) rahatlıkla görülebilmektedir. Aşağıda ise farklı PEG-PE konjugatlarının moleküler yapıları gösterilmektedir. Bütün yapılarda 1,2 distearoil sn glisero 3

31 16 fosfoetanolamin yapısı sabittir, değişen kısım ise PEG zinciri uzunluğudur. Verilen molekül yapıları ticari olarak satılan amonyum tuzları halinde değil protonize olan halleridir. PEG PE PEG PE PEG PE PEG 750 -PE Şekil 2.5. Farklı PEG zincir uzunluğuna sahip PEG-PE konjugatlarının molekül şekli gösterimi Misellere İlaç Yüklemesi ve Çözünürleştirici Etki Antikanser ilaçların çoğunluğunun suda çözünürlük problemi olduğu bilinmektedir. PTX gibi bu özellikteki ilaçların konvansiyonel dozaj formlarında ise bu sorunu çözmek için kullanılan yardımcı maddeler (Ör.: Kremofor EL) ciddi yan etkiler oluşturabilmektedirler. Misel yapıları kullanılarak bu tür ilaçların çözünürlüğünün arttırılması sıklıkla uygulanan bir yöntemdir. Konvansiyonel deterjanlar kullanılan misellere benzer olarak, polimerik miseller etkin maddeleri hidrofobik çekirdeklerine hapsederek biyoyararlanımlarını arttırmaktadırlar. Misellerin stabilitesi parenteral uygulamayı takiben enkapsüle edilmiş ilaçların uzun süreler boyunca sürüklenmesine olanak verir. Ayrıca polimerik misellerin kullanılması çoğunlukla istenen biyodağılıma, arttırılmış dolaşımda kalış süresine ve düşük toksisiteye ulaşılmasına olanak verir (27). Misel yapılarına ilaç yüklenmesine bakıldığında ilk baştaki çözünürleştirici etkinin çözücü (su) moleküllerinin misel çekirdeğinden uzaklaşması ile olduğu görülür. Sonrasında ise hidrofobik ilaç misel

32 17 çekirdeğinde birikmeye başlar ve hidrofobik blokları birbirinden uzaklaştırır. Önemli ölçüde çözünürlük artışı sağlanan durumlarda misel çekirdeğindeki hidrofobik grupların bu gevşeme yeteneğinin rolü olduğu görülebilir (69,70). Misellere ilaç yüklenmesi için bir çok farklı yol uygulanabilir. En sık kullanılan yöntemler özetlenebilir (54) ; a) Diyaliz: Bu teknikte blok ko-polimer ve ilaç su ile karışabilen bir organik çözücüde (DMF ya da DMSO) çözülür ve bu çözücü suya karşı diyaliz edilir. Organik çözücü çekirdek oluşturacak hidrofobik blok için çözücü olmayan su ile yavaş yavaş yer değiştirir ve ilacı da içine alacak şekilde misel oluşumunu tetikler. Yarı geçirgen zar misellerin dışarı çıkmasını engellerken serbest ilaç da ortamdan uzaklaştırılmış olur. b) Çözücü buharlaştırma metodu: İlaç ve polimer iyi bir organik çözücüde çözülür ve çözücü buharlaştırılır. Böylece ilaç içeren polimer filmi oluşturulmuş olur. Sulu fazın eklenmesinden sonra şiddetli çalkalama uygulanır ve bu sayede misel yapısı oluşturulur. Misel oluşumundan sonra serbest ilaç diyaliz ile uzaklaştırılabilir. c) Su içinde yağ emülsiyon metodu: Suda çözünmeyen ilaç iyi bir organik çözücüde çözülür. Misel oluşturacak polimer ise organik fazda ya da sulu fazda çözülebilir. Organik faz hızlı karıştırma altında sulu faza eklenir ve organik faz buharlaştırarak uzaklaştırılır. d) Dondurarak kurutma metodu: Bu teknikte polimer ve ilaç dondurarak kurutmaya uygun bir organik çözücüde çözülür. Çözelti su ile karıştırılır, dondurarak kurutulur ve sulu ortamla rekonstitüe edilir. Farklı hazırlama yöntemleri kullanılarak elde edilen PEG-PE miselleri ve hapsedilen etkin maddeleri içeren bir tablo aşağıda verilmiştir (Tablo 2.4). İlaç yüklü PEG-PE miselleri hazırlamak için en basit ve aynı zamanda uygun yöntem öncelikle PEG-PE yi ve ilacı birbiri ile karışabilen organik çözücülerde çözmektir. Ardından organik çözücüler buharlaştırarak uzaklaştırılır ve geriye kuruyan polimer filmi kalır. Elde edilen film sulu bir tampon varlığında hidrate edilir ve şiddetli çalkalama ile misel oluşumu sağlanır.

33 18 Tablo 2.4. Farklı etkin maddeler yüklenmiş PEG-PE miselleri ve bunların hazırlama yöntemleri. PEG-PE Hazırlama yöntemi Maksimum ilaç yükleme Boyut (nm) PEG 750 -PE Dispersiyon Klorin e6 trimetil 5-20 esteri, %32 (a/a) PEG PE Dispersiyon Vitamin K3, %50 (a/a) 2-5 Etanolden diyaliz N/A mg/mg N/A 7-20 oktilglukozidden diyaliz Dispersiyon Klorin e6 trimetil 7-20 esteri, %30 (a/a) Dispersiyon Tamoksifen, %25 (a/a) 7-20 Dispersiyon Paklitaksel, %1,5 (a/a) 7-20 Etanolden diyaliz Paklitaksel, %1,5 (a/a) mg/mg Paklitaksel, %1,5 (a/a) oktilglukozidden diyaliz Dispersiyon Vitamin K3, %30 (a/a) 7-20 epc/peg ,5 10 mg/mg N/A PE, 4/1 mol deoksikolattan diyaliz 2,5 10 mg/mg Paklitaksel, %4 (a/a) deoksikolattan diyaliz PEG PE 50 mg/mg N/A 7-30 oktilglukozidden diyaliz Dispersiyon Dequalinyum, %3 (a/a) 7-30 Dispersiyon Tamoksifen, %20 (a/a) Dispersiyon Paklitaksel, %1 (a/a) Dispersiyon Vitamin K3, %30 (a/a) 7-40 Tablodan da görülebileceği üzere PEG-PE misellerinde çalışılan bileşiğe bağlı olarak yükleme etkinliği %1,5 ile %50 arasında değişmektedir. Bununla birlikte bazı durumlarda PEG-PE misel yapılarının içerisine farklı maddeler de eklenebilir ve böylece yükleme etkinliği ve çözünürleştirici etki arttırılabilir (Ör.: Şekil 2.6). Bu bileşiklerden birisi yumurta fosfatidil kolinidir (epc). epc eklenen misel yapılarında PTX in çözünürlüğünün neredeyse iki kat arttırıldığı bildirilmiştir (71). PTX in çözünürlüğü epc eklenmesi ile misel materyalinin bir gramı başına 15 mg PTX den 33 mg PTX e yükselmiştir. Bu etkinin, PEG-PE nin aksine, epc nin büyük bir hidrofilik PEG grubu olmamasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Böylece misel yapısının daha geniş bir hidrofobik çekirdeği olmakta ve bu durum da yüklenebilen ilaç miktarını arttırmaktadır. epc kullanılarak hazırlanan karışık PEG-PE

34 19 misellerinin, sadece PEG-PE ile hazırlanan misellere oranla MCF-7 hücrelerine karşı daha yüksek sitotoksisite gösterdiği de ayrıca bildirilmiştir (52). Şekil 2.6. epc kullanılarak PTX in PEG-PE miselleri içerisine hapsedilme miktarının arttırılması (52). Karışık PEG-PE miselleri hazırlanmasında epc nin etkisinin anlaşılmasından sonra daha farklı bileşikler de misel yapılarının içerisine katılmıştır. Bunlardan birisi d-α-tokoferil polietilen glikol 1000 süksinat (TPGS) dır. Bir surfaktan olan TPGS kullanılarak PEG-PE miselleri hazırlanmış ve etkin madde olarak PTX kullanılmıştır. Bu sistemin karakterizasyonu yapılmış ve ayrıca kullanılan hücre serilerinde kanser hücrelerine karşı sitotoksik olduğu gösterilmiştir (70). Sawant ve diğ. (72) yaptığı bir çalışmada ise PEG-PE miselleri içerisine Vitamin E eklenerek karışık misel yapıları hazırlanmıştır. Her ikisi de suda çözünürlük göstermeyen PTX ve kamptotesin etkin maddeleri ile ayrı ayrı formülasyonlar geliştirilmiştir. Kullanılan Vitamin E, misel yapılarının hidrofobik çekirdeğini büyütmüş, buna bağlı olarak da daha fazla ilacın hidrofobik çekirdeğe hapsolarak çözünmesi ve yüklenmesi sağlanabilmiştir. Bu sayede 10 mm misel materyali konsantrasyonunda, her bir ml misel dispersiyonuna 850 µg PTX ve 35 µg kamptotesin hapsedilebilmiştir. Bu değerler her iki ilaç için de tek başlarına sulu ortamdaki çözünürlük değerlerinden yüzlerce kat daha yüksektir.

35 Pasif Hedeflendirme ve Kanda Kalış Süresinin Uzunluğu Tümörlü bölgelerde bulunan kan damarları, normal dokulardaki kan damarlarından farklı ve kendilerine özgü özellikler göstermektedirler. Bu özellikler ((73) ve (74) de ayrıntılı olarak işlenmiştir) aşağıda verilmiştir. 1) Yüksek oranda damarlanma (anjiojenez) ve buna bağlı olarak yüksek damar yoğunluğu. 2) Çeşitli vasküler aracılar tarafından indüklenen artmış vasküler geçirgenlik (Ör.: Bradikinin, nitrik oksit, VEGF, MMP ler). 3) Hasarlı damar yapısı. 4) Tümör dokuların arasındaki boşluktan yetersiz lenfatik toplanma. Bu farklılık gösteren özelliklerin bilinmesi ve yeni antikanser uygulamalarda çözüm stratejileri içerisinde değerlendirilmeleri başarılı bir tedavinin anahtarlarından biridir yılında Maeda ve diğ. (75) antikanser protein neokarzinostatin (NCS) ile stiren maleik asit ko-polimerini (SMA) konjuge ederek bu sistemi SMANCS olarak adlandırdılar. Yapılan çalışmalarda SMANCS ların polimer ile konjuge edilmemiş türevlerine göre (NCS) tümörlü bölgelerde daha yüksek birikim gösterdiklerini buldular ve bu durumun diğer farklı plazma proteinleri için de geçerli olduğu gösterdiler (76). Süregelen çalışmalar 40 kda dan daha büyük proteinlerin seçici olarak tümörlü bölgelerde biriktiğini ve bu birikmeye ek olarak uzun süreler boyunca tümörlü bölgede kalabildiklerini göstermiştir. Bu bulgular antikanser ilaç geliştirilmesi sürecinde altın standart olarak da kabul edilen EPR etkisi olarak tanımlanmıştır (77). Bu etkiye göre, tümörlü bölgelerdeki kan damarları duvarlarının tümörlü hücrelere daha çok besin ve oksijen sağlamak amacıyla geçirgenliklerinin artması partikül büyüklüğü 400 nm den küçük olan partiküllerin bu damarlardan tümörlü dokulara geçişine izin verir. Yine EPR etkisinde tanımlandığı şekilde tümörlü bölgelerdeki azalan lenfatik sistem aktivitesi sayesinde, dokular arası boşluğa geçen bu partiküller ve

36 21 makromoleküller bu bölgeden uzaklaştırılamazlar ve seçici olarak normal dokulardan çok daha yüksek oranda tümörlü bölgelerde birikirler (74,78,79). Bu kendiliğinden birikim tümör tedavisinde pasif hedeflendirme yapılabilmesinin kapılarını açmıştır (80,81). Bununla birlikte herhangi bir modifikasyon yapılmamış olan ilaç taşıyıcı sistemler vücut tarafından yabancı partiküller olarak tanınır. Bu durum onların kolayca opsonize olmasına ve mononükleer fagositik sistem ya da RES tarafından kan dolaşımından uzaklaştırılmalarına yol açar. Tümöre hedeflendirilmiş bir sistemin EPR etkisinden faydalanabilmesi ve tümörlü bölgede birikim gösterebilmesi için öncelikle kan dolaşımında uzun süre kalabilmesi gereklidir. Bu amaçla yapılan kimyasal modifikasyonların en önemlilerden biri, ilk olarak lipozomlarda denenen ve başarılı olan PEGilasyon işlemidir (82,83). İlaç taşıyıcı sistemin yüzeyine yapılan PEG modifikasyonu ile kanda kalış süresi uzatılmış sistemlerin elde edilmesi her ne kadar lipozomlar ile başlamış olsa da bu yaklaşımın doğruluğu daha bir çok farklı sistem için de uzun süredir gösterilen durumdur (84-87). PEG moleküllerinin sağladığı koruma sterik olarak gerçekleşen bir korumadır. Ayrıca PEG molekülünün hidrofilik yapısı sistemin bir bütün olarak yabancı cisim gibi algılanmasının da önüne geçmektedir (88,89). PEG molekülleri partikül üzerine koruyucu bir tabaka oluşturur ve opsoninler gibi büyük moleküllerin geçişine izin vermeyerek sistemi opsonizasyondan korur. Bu sayede sistemin kan proteinleri ile etkileşmeleri azalır ve RES tarafından alımları yavaşlar. İlaç taşıyıcı sistemlerin kanda kalış süresinin uzunluğu ile hedef bölgeye ulaşması arasında doğru orantı gözlenmektedir (90-93). Misellerin boyutlarının küçüklüğü düşünüldüğünde, daha büyük partikül büyüklüğüne sahip nanotaşıyıcı sistemlere kıyasla EPR etkisi ile tümör dokularında birikme eğilimlerinin daha yüksek olduğu düşünülmektedir. PEG-PE kullanılarak hazırlanan misellerin, kullanılan PEG in molekül ağırlığına bağlı olmakla birlikte, 2 saatlik kan dolaşımında kalış yarı ömürlerinin olduğu bildirilmiştir (55). Sonuçta nanotaşıyıcıların tümörlü bölgelerde birikme eğilimleri büyük oranda tümör damar endotelinden geçiş yeteneklerine bağlıdır. Difüzyon ve birikme özelliklerinin tümör damar

37 22 duvarının geçirgenlik boyutuna bağlı olduğu ve bu boyutun da farklı tümörlerde farklılık gösterdiği bilinmektedir (94,95) Kanda Kalış Süresi Uzatılmış Nanotaşıyıcılarla Ligand Aracılı Hedeflendirme Daha iyi ve seçici hedeflendirme elde edilebilmesi için PEG ile modifiye edilmiş olan nanotaşıyıcılara aktif hedeflendirme amacıyla farklı ligandların eklenmesi sıklıkla uygulanan bir yöntemdir. Miseller ilaç taşıyıcı sistemlerde kullanılan ve aktif hedeflendirme amacıyla kullanılan bir çok farklı ligand bulunmaktadır. Bunlar arasında antikorlar (48,96), şeker parçaları (97,98), transferrin (99,100) çok sayıda örnekten bazıları olarak sayılabilir. Bununla birlikte, bir çok aktif hedeflendirme sağlayan ligandın hücre membranında bulunan reseptörleriyle etkileşebilmesi için, ilaç taşıyıcı sistemin yüzeyinde serbest halde bulunmaları gerekmektedir. PEGilasyon yapılmış ve kanda kalış süresi uzatılmış olan ilaç taşıyıcı sistemlerin aktif hedeflendirilmesi istendiğinde, yüzeyde bulunan PEG zincirlerinden dolayı bu durum sakıncalar yaratabilir. En uygun ve işlevsel yaklaşım PEG zincirlerinin ucuna aktif hedeflendirme ligandının bağlanması olarak karşımıza çıkmaktadır. Zira antikorların lipozom membranına bağlanması ile hazırlanan lipozomlar ile antikorların yapıdaki PEG zincirleri ucuna bağlandığı lipozomlar arasında yapılan karşılaştırmalar, gerek bağlanma etkinliği gerek ise hedef hücreler ile etkileşimler açısından PEG zinciri ucuna bağlı antikor içeren lipozomların daha üstün özellikler gösterdiğini göstermiştir (101,102). Bu durumun sebebi olarak, antikorların serbest PEG uçlarına bağlandıklarında aktivitelerini gösterebilmeleri için yeterli konformasyonel serbestliğe sahip olmaları ve PEG zincirleri tarafından sterik olarak engellenmemeleri gösterilebilir. Nanotaşıyıcıların yüzeyini modifiye etmek için kullanılan PEG türevleri genellikle metoksi-peg den türetilmişlerdir ve bu sebeple de fonksiyonel grup taşımamaktadırlar. Bu durum karşısında PEG zincirlerinin fonksiyonelleştirilmesi ve uzak uçlarına ligand bağlanabilmesi için bir çok farklı yöntem denenmiştir. Serbest tiyol grubu içeren PEG ucuna maleimid ile türevlendirilmiş antikorların bağlanması ya da PEG in serbest ucunda bulunan serbest karboksilik asit grupları kullanılarak karbodiimid bağı

38 23 yardımıyla amino grubu içeren ligandların bağlanması bunlar arasında sayılabilir. Misel yapılarının oluşturulacağı PEG-PE türevlerine fonksiyonellik katmak için geliştirilecek olan ko-polimerin genel olarak X-PEG-PE modeline uyması gerekmektedir. Torchilin ve diğ. (103) 2001 yılında bu amaçla pnp- PEG-PE bileşiğini sentezlemişlerdir. Bu bileşik taşıdığı fosfolipit yapısı ile misel ya da lipozom yapılarının içerisine kolaylıkla girebilmektedir. Yapısında bulunan pnp (pnitrofenilkarbonil) grubu ile amino grubu taşıyan herhangi bir bileşiğe stabil ve toksik olmayan üretan bağı ile bağlanabilmektedir. Amino grubu taşıyan ligand ile pnp grubu arasındaki reaksiyon ph 8,0 civarında kolaylıkla ve kantitatif olarak gerçekleşmekte, reaksiyon sonucu ortaya çıkan serbest pnp grupları da diyaliz ile ortamdan kolaylıkla uzaklaştırılabilmektedir. Aşağıdaki şekilde pnp-peg-pe bileşiğinin sentez şeması verilmektedir. Şekil 2.7. pnp-peg-pe sentezinin şematik gösterimi (103). pnp-peg-pe bileşiğinin kullanılmaya başlanması ile birlikte amino grubu taşıyan ligandların da misel yapılarında kullanımları kolaylaşmıştır. Bu ligandların içerisinde hedeflendirme için en sık kullanılan ve en başarılı sonuç veren bileşikler monoklonal antikorlardır. Polimerik misellere antikor konjugasyonu ile hazırlanan çok sayıda immunomisel sistemleri yer almaktadır (104). pnp-peg-pe içeren miseller hazırlanmak istendiğinde

39 24 antikorların pnp-peg-pe ile inkübasyonu yeterli olmaktadır. Sonrasında antikor bağlanmış olan lipit, misel yapısına girecek diğer polimerler ile daha önce verilen misel hazırlama yöntemlerinden birine uygun olarak kullanılmaktadır Misellerin Hücresel Alımı Biyolojik olarak aktif olan moleküllerin hücre içine ulaştırılması ilaç taşınması alanındaki önemli sorunlardan birisidir. Bir çok aktif molekül terapötik etkilerini göstermek için hücre içine girmek zorundadır. Örneğin gen ve antisens oligonükleotitler hücre çekirdeğine, proapoptotik bileşikler mitokondriye ve lizozomal enzimler lizozomal bölgeye ulaşmak zorundadırlar. Bununla birlikte hücre membranının yapısı bu tür bileşiklerin hücre içine alınmasına engel olabilmektedir. Ayrıca DNA gibi büyük moleküller hücre içerisine endositoz ile alınmakta ve bu durumda da endozomların içerisinde lizozomal enzimler yüzünden parçalanmaya uğramaktadırlar. Sonuçta etkisiz hale gelmeyen ilacın çok az bir kısmı sitoplazmaya ulaşabilmektedir. Miseller yapıların olası hücre içine alım mekanizmaları aşağıdaki şekilde verilmiştir. Şekil 2.8. Miseller sistem içerisine hapsedilmiş ilaçların olası hücresel alım mekanizmaları (105).

40 25 Yukarıdaki şekilden de görüleceği üzere ilaç misellerden salındıktan sonra serbest halde membrandan difüzlenebilir (a), misel yapıları ekstraselüler sıvıda ayrışabilir ve ilaç salındıktan sonra yine difüzyon ile hücre içine alınabilir (b), hücre membranına tutunan miseller pinositoz ya da sıvı endositozu ile bir bütün halinde hücre içine alınabilirler (c ve d). Hücre içine alınan ilaç yüklü miseller lizozomlar içine girerler ve burada ilacı difüzyon ile salabilirler (e) ya da lizozom içinde parçalanan misel yapısından serbest halde sitoplazmaya geçebilirler (f). Makromoleküller ve nanoboyutlu taşıyıcılar (polimer-ilaç kompleksleri, lipozomlar ve miseller gibi) hücre membranından bütün bir sistem halinde difüze olamazlar. Bu sebeple hücre içine girmek için fagositoz ya da pinositoz gibi bir mekanizmaya ihtiyaçları vardır. Bir çok durumda miseller hücre içine sıvı faz endositozu ile alınırlar (106,107). Endositoz mekanizmasının zaman, ph ve enerji bağımlı bir mekanizma olduğu bilinmektedir. Hücre içine endositoz ile alınan miseller ana olarak sitoplazmik kompartmanlarda toplanmaktadırlar. Bunlar arasında özellikle endozomlar ve lizozomlar önem taşımaktadır. Bu organellerin içerisindeki asidik ortam ve parçalayıcı enzimler içlerine ilaç taşıyıcı sistem ile birlikte yüklü halde bulunan etkin maddenin de parçalanmasına yol açabilmektedir (108). Bu sebeple endozomal alım yolaklarından kaçınmak önem taşımaktadır (109) Misel Aracılı Hücresel Alımın Arttırılması Antikanser etkili etkin maddelerin hücresel alımının arttırılması için misel yapılarının kullanılması her ne kadar belirgin üstünlükler sağlasa da, misel sisteminin bir bütün olarak hücre içine alımını arttırmak için çalışmalar halen devam etmektedir. Çünkü endositoz yolaklarından herhangi biri ile hücre içine alınan misel sistemleri er ya da geç lizozomlar içerisinde son bulmaktadırlar ve bu durumda da misel yapılarının parçalanması sonucu etkin maddelerin etkin olmayan hale gelebilmesi olasılığı tam olarak ortadan kaldırılamamıştır. Bu amaçla bir kaç farklı yaklaşım uygulanmaktadır. Bunlardan biri pozitif yüklü taşıyıcı sistemlerin hazırlanmasıdır. Net pozitif yükün hücreler tarafından moleküllerin alımını arttırdığı bilinmektedir. Bu sebeple geliştirilen pozitif yük taşıyan nanoboyutlu taşıyıcılar ile hücresel

41 26 alım önemli oranda arttırılmıştır. Bu taşıyıcılar arasında Lipofectin gibi katyonik lipid formülasyonları yer almaktadır. Lipofectin kullanılarak hazırlanan ve DNA yüklenen lipozom ve nanotaşıyıcı formülasyonlarında hücresel alımın önemli oranda arttığı farklı çalışmalarda gösterilmiştir (51,110). Son yıllarda virüslerin hücre içine girmelerini ve genetik materyali çekirdeğe ulaştırmalarını sağlayan mekanizma araştırmacılara hücresel alımın arttırılması için bir yol gösterici olmuştur. Özellikle ilgi bir grup viral protein üzerine yoğunlaşmıştır. Bu proteinlerden biri trans-aktivatör transkripsiyon aktivatör peptittir (TATp). TATp, hücre penetrasyon peptitleri (CPP) adı verilen, genellikle yirmi aminoasit ya da daha azını içeren ve bazik kalıntılar bakımından zengin bir peptit grubunun bir üyesidir (111). TAT proteini HIV-1 tarafından kodlanan 86 amino asitlik bir proteindir (112). TATp ise bu proteinin arasındaki amino asitlerinden oluşmuş (Tyr-Gly-Arg- Lys-Lys-Arg-Arg-Gln-Arg-Arg-Arg) ve sentetik olarak üretilen peptittir (113). TAT aracılı hücresel alımda ilk başlarda klatrin aracılı endositoz ya da kaveole endositoz mekanizmalarının etkin olduğu düşünülse de, Da dan daha büyük kargolara bağlı olan CPP lerin hücresel alımında makropinositozun rol aldığı anlaşılmıştır (114,115). Makropinositoz ile alımda sistem endozomdan kaçabilmekte ve hücre sitoplazmasına geçiş artmaktadır. Bununla birlikte tek başına CPP ler ya da CPP lere bağlı küçük moleküller ise elektrostatik etkileşimler ve hidrojen bağları kullanarak hücre içine alınmakta ve enerjiye ihtiyaç duyulmamaktadır. Her iki durumda da etkin bir hücresel alım için (116) TATp ve hücre membranının direk teması gereklidir. Tablo 2.5 de farklı nanotaşıyıcı sistemlerde CPP kullanımı ve hedef hücreler ile ilgili bilgi verilmiştir.

42 27 Tablo 2.5. Farklı nanotaşıyıcı formülasyonları ve bunlarda kullanılan CPP kombinasyonları (117). Taşıyıcı ve kullanılan CPP Lipozomlar, TAT peptit, Antennapedia, Oktarginin Lipozomlar, lipid-modifiye TAT peptidi Sterik olarak stabilize edilmiş lipozomlar, 200 nm, aracıya bağlı TAT peptit Lipozomlar, poliarginin CLIO (MION) partikülleri, 41 nm, TAT peptit PEG-Poli laktik asit miselleri, nm, TAT peptit ph-hassas polimerik miseller, nm, TAT peptit Altın partikülleri, 20 nm, TAT peptit Kuantum noktaları yüklü polimerik miseller, 20 nm, aracıya bağlı TAT peptit DNA ve polietileniminin nanokompleksleri, TAT peptit PEG-PEI konjugatları, TAT peptit Boron karbid nanopartikülleri, TAT peptit Dendrimerler, farklı CPP ler Hedef hücre ve çalışmanın amacı Havayolu hücreleri İnhalasyon yoluyla hücre içine ilaç taşınması Farklı hücreler Fare LLC, insan BT20, sıçan H9C2, farede LLC tümörü TAT-lipozomlarının hücre içine ilaç taşınması potansiyellerinin gösterilmesi ve in vitro-in vivo hücre içi gen hedeflendirilmesi Hücre içine sirna taşınması ve gen susturulması Fare lenfositleri, insan natural killer, HeLa, İnsan CD34+, fare nöral progenitor C17.2, İnsan lemfositleri CD4+, T hücreleri, B hücreleri, makrofajlar, immün sistem hücreleri, kök hücreleri Hücre içi işaretleme, MRI, homed hücrelerinin manyetik ayrımı, hücre görüntüleme Asidik katı tümörlere ilaç taşınması Farklı hücreler Tümöre özgü hücre içine ilaç taşınması NIH3T3, HepG2, HeLa, insan fibroblast HTERT-BJ1 Hücre içi lokalizasyon çalışmaları Fare endotelyal hücreleri, kemik iliğinden elde edilmiş progenitor hücreler Dinamik koşullar altında tumor patofizyolojisi çalışmaları, tumor damarlarının çevre matriks ve perivasküler hücrelerden ayırt edilmesi SH-SY5Y hücreleri Nörotipik hücrelere gen taşınması Fare akciğerine DNA taşınması Fare EL4 lemfoma hücreleri, B16F10 melanoma hücreleri Boron nötron tutunumu terapisi Farklı hücrelerin içine oligonükleotit taşınması

43 Monoklonal Antikorlar ve 2C Antikorlar ve Monoklonal Antikorlar Antikorlar (immünoglobulinler), humoral immünite veya antikora bağımlı immüniteden sorumlu olan, glikoprotein yapısında olan moleküllerdir. Antikorlar, antijen uyarımından sonra B lenfositlerinin farklılaşmasıyla oluşan plazma hücreleri tarafından üretilirler. İmmünoglobulin molekülleri birbirinin aynı olan iki ağır (H) ve iki hafif (L) polipeptid zincirinden oluşmaktadırlar (118). Aşağıdaki şekilde bir antikor molekülünün şekilsel gösterimi yer almaktadır. Şekil 2.9. Bir antikor molekülünün şekilsel gösterimi ((119) den modifiye edilerek hazırlanmıştır). Şekilden de görülebileceği gibi antikorlar Y şeklindedir. Her bir hafif ya da ağır zincir mavi veya gri ile gölgelendirilme yapılmış olan iki farklı bölgeye sahiptir. V H ve V L olarak belirtilen bölgeler antijen bağlanma bölgesi olarak da bilinirler ve aminoasit dizilimleri açısından yüksek farklılık göstererek farklı antijenlerin moleküle bağlanmasından sorumludurlar. Hafif zincirin değişken

44 29 bölgesinde kırmızı ile belirtilmiş olan kısımları ise antijenin bağlanmasından en yüksek oranda sorumlu olan bölgedir (119). İnsanlarda 5 farklı İmmünoglobulin sınıfı bulunur (IgG, IgA, IgM, IgD ve IgE) ve bu sınıflar birbirlerinden ağır zincirlerinin farklı olması ile ayrılırlar Bir kişinin kanında bulunan antikorlar bir karışımdır. Çeşitli antijenlerin çeşitli belirleyici gruplarına karşı oluşmuşlardır. Antikorların her biri belirli bir B hücre klonu tarafından oluşturulmuştur. Antikorların saf halde elde edilme çalışmaları çoklu myeloma ya (antikor salan plazma hücrelerinin monoklonal bir tümörü) sahip hastaların kanlarında biyokimyasal olarak aynı olan antikorların yüksek oranlarda bulunduğunun keşfedilmesi ile hızlanmıştır. Bununla birlikte normal B lenfositleri sonsuz bölünme olanağına sahip olmadıklarından, bu tek tipteki antikorların üretimleri için B hücrelerinin ölümsüz hale getirilmesi gerekmektedir. Kohler ve Milstein in 1975 yılında geliştirdikleri ilk yöntem (120), normal antikor üreten B hücresi ile bir myeloma hattının birleştirilmesine dayanmaktadır. Bu sayede oluşturulan ve antikor üreten ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarına hibridoma, onlar tarafından üretilen antikorlara da monoklonal antikorlar (mab) denilmektedir Otoantikorlar ve 2C5 Otoantikorlar organizmanın antijenik özellik gösteren yapılarına karşı gelişen antikorlar olarak tanımlanmaktadırlar. Bunlar hücre yüzeyi, sitoplazmik yapılar veya hücre nükleusuna karşı gelişebilmektedirler. Antinükleer otoantikorlar (ANA) ise kromatin olarak adlandırılan DNA-histon kompleksine, nükleer veya sitoplazmik ribonükleer proteinlere ve sitoplazmik diğer yapılara karşı oluşan antikorların genel ismidir. Kan dolaşımında bulunan ANA lara genel olarak otoimmün hastalıklarda rastlanırken, aynı zamanda kanserli hastalarda da bu antikorların bulunduğu gösterilmiştir (121). Bazı ANA lar nükleozoma spesifik aktivite göstermektedirler. Apoptotik olarak ölen kanserli hücrelerden salınan nükleozomlar, kanserli hücrelerin membran yüzeylerinde bulunan nükleozom bağlanma bölgeleri aracılığıyla yakın komşuluklarında bulunan diğer kanserli hücrelere bağlanırlar (122) ve bu sayede nükleozoma spesifik aktivite gösteren ANA lar için bir hedef haline gelirler. mab 2C5 bu grupta yer alan ANA lardan

45 30 birisidir. Terapötik dozlarda kullanıldığında antikor bağımlı hücresel sitotoksisite (Antibody-dependent cellular cytotoxicity-adcc) göstermekte, bununla birlikte terapötik dozunun altında etkin maddelerin ya da ilaç taşıyıcı sistemlerin tümöre özgün hedeflendirilmelerini sağlayabilmektedir (123). 2C5 in en büyük üstünlüklerinden birisi de, sadece bazı tümör hücrelerinin yüzeyinde bulunan spesifik reseptörlere bağlanan antikorlardan farklı olarak daha geniş bir yelpazedeki tümör hücrelerini tanıyabilmesi, bununla birlikte sağlıklı hücreler için bir aktivite göstermemesidir (124) Kanser ve Kanserde Çoklu İlaç Direnci Sadece ABD de 2012 yılında yeni kanser teşhisinin konacağı ve bunların ının kanser sebebiyle hayatını kaybedeceği öngörülmektedir (125). ABD de 2012 yılında günde insanın hayatını kaydetmesine yol açan ve kalp-damar hastalıklarından sonra en çok ölüme sebebiyet veren hastalık olan kanser vakalarının yaklaşık inin meme kanseri olacağı öngörülmektedir. Meme kanseri kadınlarda görülen bütün kanser türleri içerisinde de %29 luk bir oranı kapsamaktadır. İnsan meme kanseri çok sebepli, çok aşamalı bir kanser türüdür. Genetik, endokrin ve diyet faktörleri başlangıcını, ilerlemesini ve yayılmasını düzenleyen sebeplerdendir (126). Ne yazık ki yukarıda bahsedilen ve rakamları verilen kanser vakalarının yaklaşık üçte biri ilaca karşı dirençli kanser vakalarıdır (127). kanser hücreleri uygulanan antikanser ilaçlara karşı yüzeylerinde reseptör kaybı, ilacın hedefinde meydana gelen mutasyonlar ya da farklılaşan metabolizma gibi çok farklı direnç mekanizmaları geliştirebilirler. Bu tür direnç mekanizmalarının bir çoğu kombine ilaç tedavisi ile aşılabilir (128). Bununla birlikte bir çok kanser türevi yapısal ve fonksiyonel olarak birbirinden farklı etkin maddelere karşı da direnç geliştirirler. Bu durum MDR olarak tanımlanmıştır (129,130).

46 Taşıyıcı Temelli İlaç Direnci ve P-gp Hidrofobik etkin maddelerin hücrelere giriş ve çıkışı bir grup taşıyıcı aracılığı ile gerçekleşebilir. Bu taşıyıcılara ATP-bağlayıcı kaset (ABC) taşıyıcıları denmektedir. ABC ailesi klinik olarak öneme sahip membran ATPaz larıdır. ABC taşıyıcıları içerisinde ilaç direnci gelişmesi ile ilgili olanlarından birisi de P-gp dir (131). P-gp çoklu ilaç direnci geni 1 (MDR1) tarafından kodlanmış olan 170 kda luk bir membran proteinidir ( ). İki yarıdan oluşmaktadır ve her bir yarı 6 transmembran bölgesi ve bir ATP bağlayıcı bölge içerir. P-gp bir çok farklı hidrofobik bileşiği plazma membranına girdiklerinde tanır. Bu ilaçlar antiaritmikler ve antihistaminiklerden, kolestrol düşürücü ilaçlara ve HIV proteaz inhibitörlerine kadar geniş bir yelpazeyi kapsamaktadırlar. P-gp substratı olan ilaçların taşıyıcıya bağlanması ile ATP bağlayıcı bölgelerden biri aktive olur ve bir molekül ATP nin hidroliz olması ile P-gp nin şeklinde önemli bir değişiklik gerçekleşir. Bu değişiklik sonucunda ilaç hücre içerisinden ekstraselüler boşluğa atılır (135,136). Taşıyıcının tekrar eski haline dönmesi için bir ATP molekülü daha gerekir ve bu sayede tıpkı bir pompa gibi çalışmaya devam edebilir. P-gp aktivitesi sonucu hücre içerisinden dışarıya atılım sebebi ile ilacın hücre içindeki konsantrasyonu azalır. Doksorubisin, vinkristin, vinblastin ve PTX gibi bir çok kanser ilacı P-gp substratıdır ve ne yazık ki kanser vakalarının %50 ye yakını artmış P-gp ekspresyonu göstermektedir (137,138). P-gp ile yapılan çalışmalar bu transport proteininin karaciğer, böbrek, ince bağırsaklar, kolon, plasenta, uterus ve beyin gibi bir çok normal dokuda fonksiyonu olduğunu göstermektedir (139). Bu geniş dağılım P-gp nin fizyolojik bir rolü olduğunun göstergesi olmakla birlikte (140) bu proteinin küçük olmayan hücreli akciğer kanseri, meme, böbrek ya da yumurtalık gibi kanserlerde aşırı eksprese olması kullanılan antikanser ilaçların hücre içi konsantrasyonlarında düşüşe yol açmaktadır (141). Meta analizleri bütün meme kanserlerinin %40 ında MDR1 P-gp artışı olduğunu göstermektedir. Ayrıca yapılan çalışmalar kemoterapötikler ya da hormonlar ile temas sonucunda P-gp ekspresyonunun yaklaşık iki kat arttığını bildirmiştir

47 32 (137,142). MDR1 P-gp proteini sebebiyle görülen ilaç direnci bu proteinin olmadığı hastalara göre üç kat daha fazla dirence yol açmaktadır. Yine MDR1 geni tarafından kodlanan ve P-gp sentezine yol açan proteinin olduğu hastalar bir kemoterapötik ile temasta bulunurlarsa ya da tedavi görürlerse P- gp pompaları çoğalmakta ve direnç gelişimi diğer hastalara göre dört kat daha fazla olmaktadır (143) PTX Direnci Aşağıdaki tabloda P-gp substratı ya da diğer direnç mekanizmaları substratı olduğu bilinen, farklı etki mekanizmasına sahip farklı gruplardan antikanser ilaçlar sıralanmıştır. Görüleceği üzere bilinen ve etkinliği gösterilmiş olan bir çok antikanser etkin madde farklı pompa ve mekanizmalarının ve proteinlerin substratıdırlar. Tablodan da fark edilebileceği üzere P-gp en çok substrata sahip olan ve çoklu ilaç direncinin temel sebebi olan pompadır ve PTX de P-gp nin önemli substratlarındandır. Tablo 2.6. Antikanser ilaçlar ve substratı oldukları mekanizmalar. P-gp (MDR1) MRP1 BCRP MRP2 Antrasiklinler (doksorubisin, daunorubisin, mitoksantron) Antrasiklinler (doksorubisin, daunorubisin, mitoksantron) Antrasiklinler (doksorubisin, daunorubisin, mitoksantron) Topoizomeraz inhibitörleri (etoposit) Vinka alkoloitleri (vinkristin, vinblastin) Taksanlar (paklitaksel, docetaksel) Antitümör antibiyotikleri (Aktinomisin D, mitomisin C) Antimetabolitler (sitarabin) Antrasanlar (bisantren) (143) den uyarlanmıştır. Topoizomeraz inhibitörleri (etoposit) Vinka alkoloitleri (vinkristin, vinblastin) Antitümör antibiyotikleri (aktinomisin D) Antimetabolitler (metotraksat) Topoizomeraz inhibitörleri (topotekan) Antimetabolitler (metotraksat) Antrasanlar (bisantren) Antrasiklinler (doksorubisin, mitoksantron) Topoizomeraz inhibitörleri (etoposit) Vinka alkoloitleri (vinkristin, vinblastin) Antimetabolitler (metotraksat) Kısaltmalar: P-gp=P-glikoproteini, MRP= çoklu ilaç direnci proteini, BCRP= meme kanseri direnci proteini

48 33 Değişmiş PTX metabolizması, mikrotübüllerde meydana gelen mutasyon ve değişimler (144) olası direnç mekanizmaları arasında sayılsa da, P-gp aracılı direnç halen PTX direncinin temel nedeni olarak tanımlanmaktadır. Şekil PTX in P-gp ile hücre dışına atılımı (6). PTX direncinin daha iyi anlaşılması ve geri döndürülebilmesi için yapılan çalışmalarda hücre kültürü teknikleri sıklıkla kullanılmıştır. Bu amaçla uygulanan yöntemlerden biri, kanser hücresi serisinin MDR1 geni ile transfekte edilmesi ve bu sayede hücrelerin P-gp üretiminin arttırılmasıdır (145). Ayrıca bilinen bir kanser hücre serisinin farklı ve artan konsantrasyonlarda PTX e maruz bırakılarak P-gp ekspresyonunun artması da direnç gelişimine yol açmaktadır (146). Aşağıdaki tabloda (Tablo 2.7.) verilen değerler incelendiğinde PTX e maruz bırakılma sonucu gelişen direncin ne kadar etkili olduğu görülebilir. Aynı zamanda P-gp ekspresyonu ile gelişen bu direnç farklı özelliklerdeki ilaçlar için de etkinliği önemli ölçüde düşürmüştür.

49 34 Tablo 2.7. PTX uygulamasıyla direnç geliştirilmiş ve gelişmemiş hücrelerde ilaca karşı hassaslık (146) P-gp Aracılı Direncin Geri Döndürülmesi P-gp nin ilaç direncindeki rolü anlaşıldıktan sonra, kanser hücrelerinde P-gp aracılı direncin önüne geçilmesi ya da oluşan direncin ortadan kaldırılması için çalışmalar yapılmaya başlanmıştır. P-gp aracılı direncin önüne geçilebilmesi için uygulanabilecek çözümlerden biri P-gp nin substratı olmayan ilaçların kullanılmasıdır. Bununla birlikte antikanser etkinlik gösteren bir çok etkin madde son derece hidrofobik özellik göstermektedir ve bu durum onların P-gp substratı olmasına yol açmaktadır. P-gp aracılı direncin önüne geçilmesi için uygulanan bir diğer yaklaşım da P-gp inhibisyonudur. Bir çok farklı klinik gruba mensup, bir çok farklı bileşik P-gp nin pompa fonksiyonunu inhibe etmekte buna bağlı olarak da hücresel direnci geri çevirebilmektedir. Kalsiyum kanal blokörleri, koroner vazodilatörler, kuinolonlar, hormonlar, siklosporinler, yüzey aktifler ve antikorlar gibi bir çok gruba dahil olan bu P-gp inhibitörleri genel olarak birinci, ikinci ve üçüncü jenerasyon olarak sınıflandırılmaktadırlar. P-gp inhibitörü ile direncin geri çevrilmesinin altında yatan genel teori, inhibitörün P-gp ye bağlanarak onu bloke etmesidir. Böylece pompa, substratı olan etkin maddeyi hücre dışına atamaz ve hücre içi konsantrasyonunda düşüşün önüne geçilmiş olur. Genel anlamda birinci ve ikinci jenerasyon inhibitörler P-

50 35 gp yi yarışmalı olarak bloke ederken, üçüncü jenerasyon inhibitörler yapısal olarak P-gp ye bağlanarak onun fonksiyon görmesini engellerler. Birinci jenerasyon P-gp inhibitörleri Bir kalsiyum kanal blokörü olan verapamil in ilaç direncini tersine döndürücü etkisini ilk olarak Tsuro ve diğ. göstermişlerdir (147). Bu çalışmanın ardından gelen çalışmalar verapamil gibi kalsiyum kanal blokörü olan başka bileşiklerin de çoklu ilaç direncini tersine çevirici etkileri olduğu göstermiştir. Verapamil ilaç direncini geri çevirici etki gösterse de bu etkisini 5-50 µm gibi yüksek konsantrasyonlarda göstermektedir. Ne yazık ki bu konsantrasyonlarda normal hücrelerde artmış toksisite görülmektedir (130). Bu durum verapamil in kullanımını kısıtlayan en önemli etkendir. Birinci jenerasyon inhibitörler arasında verapamil kadar etkili olan bir diğeri de siklosporin A dır. Siklosporin A (CYC) bir immunosüpresandır ve organ nakillerinde sıklıkla kullanılmaktadır. Siklik bir polipeptit olup 11 amino asitten meydana gelmiştir (Şekil 2.11). Molekül ağırlığı 1202,61 g/mol dür ve oldukça hidrofobik bir bileşiktir. Bir çok organik çözücüde kolayca çözünür. CYC en etkili birinci jenerasyon p-gp inhibitörü olarak bilinmektedir. Bir çok antikanser bileşiğe karşı gelişen çoklu ilaç direncini geri çevirebildiği gösterilmiştir (139). Bununla birlikte bu bileşikler ilaç direncini geri çevirebildikleri dozlarda toksik etki göstermektedirler. Ayrıca kendi sitotoksisitelerine ek olarak birlikte kullanıldıkları antikanser ilacın toksik etkisini de arttırmaktadırlar. Bu etkilerden dolayı antikanser ilacın dozunun düşürülmesi gerekmektedir, bu durumda da klinik olarak yeterli etki görülememektedir (148).

51 36 Şekil CYC nin moleküler yapısı ve üç boyutlu gösterimi. Birinci jenerasyon P-gp inhibitörlerinin kullanımı ile çoklu ilaç direncinde üstünlük gösteren sonuçlar bildirilse de, P-gp aracılı direncin geri çevrilmesi için bu bileşiklerin etkili serum konsantrasyonlarında kullanılması ciddi yan etkilerinden dolayı son derece sınırlı kalmıştır. Aşağıdaki tabloda da görülebileceği üzere (Tablo 2.8) birinci jenerasyon inhibitörlerin kullanıldığı çalışmalarda alınan sonuçlar klinik olarak tatmin edici değildir.

52 37 Tablo 2.8. Birinci jenerasyon P-gp inhibitörleri kullanılarak tamamlanan klinik çalışmalar (130). Bitiş Yılı Çalışma Grubu Katılımcı Sayısı Kanser Tipi P-gp Modülatörü Antikanser İlaç Sonuç Meme Quinidin Epirubisin Yarar sağlanamadı NSCLC Verapamil Vindesin, İfosfamid Artmış genel yaşayabilirlik SCLC Verapamil CAVE Yarar sağlanamadı Miyeloma Verapamil VAD Yarar sağlanamadı SCLC Mejestrol Asetat CAV/EP Yarar sağlanamadı 1995 MRC 235 Nüksetmiş ve direnç gelişmiş AML Siklosporin ADE Yarar sağlanamadı 1998 SWOG 226 Düşük riskli AML, RAEB-t Siklosporin Daunorubisin, Sitarabin Siklosporin grubunda artmış genel yaşayabilirlik 1996 GFM 131 Yüksek riskli MDS Quinin Mitoksantron, Sitarabin Pgp pozitif hastalarda artmış genel yaşayabilirlik

53 38 İkinci jenerasyon P-gp inhibitörleri Birinci jenerasyon P-gp inhibitörlerinin hemen hemen hepsinin paylaştığı ortak özellik, P-gp inhibisyonu gösterdikleri konsantrasyonun farmakolojik etki konsantrasyonlarında ya da daha yüksek olması ve bu sebeple de sistemik etki ve hatta toksisite göstermeleridir. Bu sebeple, ilk jenerasyon inhibitörlerle elde edilen ümit verici çalışmaların ışığında, daha az toksik ve daha etkili P-gp inhibitörlerinin geliştirilmesi için çalışmalar artmıştır. İkinci jenerasyon P-gp inhibitörleri içerisinde en önemlilerinden birisi de Valspodar (PSC-833) dır. Valspodar siklosporin in immünosüpresif etki göstermeyen bir analoğudur. Valspodar ın MDR1 P-gp ye karşı gösterdiği afinite CYC den 4 kat daha fazladır. Valspodar P-gp tarafından son derece yavaş taşınmakta ve bu sayede de P-gp inhibisyonu daha uzun sürmektedir (149,150). Fakat Valspodar sitokrom P450 enzimleri ile de etkileşmektedir ve bu durum antikanser ilacın farmakokinetiğinde değişikliğe yol açmaktadır ( ). Üçüncü jenerasyon P-gp inhibitörleri Bu bileşikler özellikle yüksek taşıyıcı afinitesi ve düşük farmakolojik aktivite gösterecek şekilde geliştirilmişlerdir. Etkili direnç geri dönüşümü için çok düşük dozlarda kullanılırlar. İkinci jenerasyon P-gp inhibitörlerinin en büyük sakıncalarından biri olan sitokrom P450 enzimleri ile etkileşme bu jenerasyonda engellenmiştir. Bu sebeple birlikte verildikleri antikanser ilaçların farmakokinetik parametrelerinde önemli değişiklik yapmamaktadırlar. Bu grup içerisinde yer alan Elakridar (ELC) (154) ise artmış etkinliğe ve spesifik P-gp bloke edici özelliğe sahiptir (155). ELC (molekül ağırlığı 563,6 g/mol) 50 nm plazma konsantrasyonunun üzerinde P-gp yi inhibe etmekte ve 0,5 µm konsantrasyonda tam P-gp inhibisyonu sağlamaktadır (156). Son derece hidrofobik ve suda çözünürlüğü olmayan bir bileşiktir (157). Molekül yapısı ve şekli aşağıdaki şekilde verilmiştir. ELC nin artan dozlarda 1-5 gün arası verildiği ve üçüncü günde doksorubisin verilen hastalarda antikanser ilacın farmakokinetik ve hematolojik parametrelerinin, hastaların büyük çoğunluğunda değişmediği gözlenmiştir (158).

54 39 Şekil ELC nin molekül şekli Hücre Kültürü Çalışmaları Hücre kültürü, spontan migrasyon, mekanik veya enzimatik parçalanma ile bir dokudan ayrılmış olan hücrelerin in vitro üretilmesidir. Hücre kültürü bilimin birçok dalında vazgeçilmez bir teknoloji haline gelmiştir (159). Günümüzde hayvan deneylerinin yerine veya hayvan deneylerinin yanında ilave olarak rutin bir şekilde çalışılmaktadır Hücre Kültüründe Kullanılan Terimler ve Tanımları Hücre kültüründe kullanılan bazı terimler ve tanımları aşağıda verilmiştir (160). Primer kültürler, bütün halindeki dokulardan veya organ parçalarından elde edilir. Taze izole edilerek elde edilen kültürler subkültüre edilene kadar primer kültür olarak isimlendirilir. Primer kültürler genellikle heterojendir ve düşük büyüme fraksiyonuna sahiptir fakat geliştirildiği dokuya spesifik hücre tipinin karakteristiğini gösterir. Pasajlama (subkültür), kültürdeki hücrelerin yeni bir kültür kabına transfer edilmesidir, böylece hücre toplulukları daha fazla çoğaltılıp çalışılacak kültürlerin sayısı artırılır.

55 40 Hücre hattı (Cell line), primer kültürden kaynaklanan subkültürü oluşturan hücre topluluğudur. Bu toplulukların özellikleri belirlenirken sınırlı yaşam süresi olan veya sürekli (sınırsız büyüme potansiyeline sahip) hücre hatlarından bahsedilir. Tutunma bağımlı ya da yüzey bağımlı hücreler, yaşayabilmek, çoğalabilmek, farklılaşarak fonksiyonel özelliklerine yerine getirebilmek için bir yüzeye tutunma ihtiyacında olan hücrelerdir. Konfluensi (Confluency) terimi tutundukları yüzeyin tamamının hücre ile kaplanmasını ifade eder Hücre Kültürünün Üstünlük ve Sakıncaları Hücre kültürünün üstünlük ve sakıncaları aşağıdaki gibi özetlenebilir (159,161,162) : Üstünlükleri Canlı ortama göre fizikokimyasal koşulların (ph, sıcaklık, ozmotik basınç, oksijen ve karbondioksit kısmi basınçları) daha iyi kontrol edilmesi, Homojenisitesinin kontrol edilebilmesi, İlaçların permeabilitesinin ve metabolizmasının hızlı değerlendirilmesi, Kontrollü koşullar altında ilaç absorpsiyon mekanizmasını çalışma imkanı, Ön ilaç, absorpsiyon arttırıcı veya diğer farmasötik maddeler kullanarak ilaç absorpsiyonunu arttırma yöntemlerinin hızlı değerlendirilmesi, İlaçların sitotoksisitesini değerlendirme imkânı, Hayvan deneylerinde karşılaşılan yasal, ahlaki ve etik problemlerin giderilebilmesi Sakıncaları Deneyim gerektiriyor olması, Aseptik şartlarda çalışılması gereği,

56 41 Stabilite problemleri (çoğu sürekli hücre hattının stabil olmayan anoploid kromozomal bileşiminden kaynaklanan stabilite problemleri söz konusudur) Hücre Kültürlerinin Kullanım Alanları Hücre kültürlerinin kullanım alanları şu şekilde sıralanabilir ( ). Hormonlar, sitokinler, enzimler, antikorlar ve aşılar gibi çeşitli terapötik ve profilaktik protein ürünlerinin üretimi Doku mühendisliği Kök hücre çalışmaları İlaçların permeabilitesinin ve metabolizmasının değerlendirilmesi çalışmaları Sitotoksisite çalışmaları Hücre Canlılığının Değerlendirilmesi Hücre canlılığının değerlendirilmesi amacıyla aşağıdaki yöntemler kullanılabilir (166) ; Hücre İçine Madde Sızması Boyalar (tripan mavisi gibi) (167), floresan maddeler (propidyum iyodür) kullanılarak yapılabilir. ATP yokluğunda pompalar çalışamayacağından ölü hücreler boyayı dışarı atamaz ve boyanırlar. Sitoplazmik Enzimlerin Salımı Örneğin: Glutamat-bağımlı transaminaz veya laktat dehidrogenaz. Nükleotid Tutma Testi Nükleotit (3H-timidin, 125I iyododeoksiüridin, 32P fosfat, 14C glukoz, 3H amino asitler) (168,169) tutma testi DNA sentezinin izlenmesiyle hücresel çoğalmanın izlenmesinde kullanılır. İşaretli timidin çoğalan hücrelerin replike olan DNA sına inkorpore olur. Bu ölçüm maddelerin proliferatif veya sitostatik etkilerinin izlenmesini sağlar. MTT Tayini ( ) Çoğalma ve sitotoksisite çalışmalarında yaşayan hücre sayısını tespit için kullanılan, enzim aktivitesine dayalı kolorimetrik bir yöntemdir. Bu yöntem

57 42 canlı hücrelerin renksiz ya da az renkli MTT (3,(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5- difenil tetrazolyum bromid) yi, renkli formazan türevlerine dönüştürmesi esasına dayanır. Metot ilk kez 1983 yılında Mosmann tarafından immünolojik çalışmalar için hızlı bir kolorimetrik yöntem olarak tanımlanmıştır (173). MTT (sarı) mitokondriyal süksinik dehidrogenaz enzimi tarafından çoğalan hücrelerde formazana (kırmızı-mor) dönüşür. Sadece indirgenen şekil (formazan) spektrofotometrik olarak ölçülebilir, bu nedenle orijinal boya ile herhangi bir girişim olmaz. N N R R R N N N N MTT, sarı R R C N = N R formazan, kırmızı Şekil MTT nin aktif mitokondri tarafından formazana dönüştürülmesi. MTT testi ile suda çözünmeyen formazan oluşur, bu nedenle organik çözücü veya sürfaktanlar ile çözündürme basamağı gerekir. Bu sorunların önüne geçebilmek ve etkinliği arttırmak için testin modifikasyonları geliştirilmiştir. WST-1 (4-[3-(4-iyodofenil)-2-(4-nitrofenil)-2H-5-tetrazolyo]-1,3- benzen disülfonat), XTT (3'-[1-[(fenilamino)-karbonil]-3,4-tetrazolyum]-bis(4- metoksi-6-nitro)benzen-sülfonik asit hidrat), CCK-F, calcein-am, CCK8 ve WST-8 suda çözünebilir tetrazolyum türevleridir. Bu maddelerle yapılan deneylerde ölçüm prosedürü kolaylaşır ve yaşayan hücreler korunur.

58 Proteinlerin Analizlerinde Kullanılan Yöntemler Protein Konsantrasyon Tayini ve BCA Proteinlerin konsantrasyonlarının tayin edilebilmesi için doğrudan veya dolaylı bir çok yöntem geliştirilmiştir. Genel olarak yararlanılan teknikler, protein çözeltisinin UV absorpsiyonunun ölçülmesi veya bir belirteç ile reaksiyonu sonucu oluşan renkli bir bileşiğin görünür alanda spektral olarak belirlenmesi temeline dayanır (174). Tez çalışmalarımızda Bikinkoninik Asit Protein Tayin Yöntemi (BCA) kullanılmıştır. Bu metot, tek basamaklı olması ve kullanılan ajanın alkali koşullarda da dayanıklı olması ile tercih edilmektedir. Bu yöntem alkali koşullarda Cu +2 nin protein ile etkileşerek Cu +1 e indirgenmesi (biüret reaksiyonu) ve BCA içeren bir reaktifin Cu +1 ile seçici ve yüksek hassaslıkta etkileşmesi esaslarını birleştirmektedir (175). Bu etkileşim sonucunda iki molekül BCA ve bir Cu +1 iyonunun şelasyonu ile pembe renkli reaksiyon ürün oluşmaktadır (Şekil 2.14). Bu suda çözünür bileşiğin absorbansı 562 nm de ölçülür. Şekil BCA ile Cu+1 kompleksi oluşumu. Proteinlerin makromoleküller yapısı, peptit bağlarının sayısı ve özellikle dört amino asidin varlığı (sistein, sistin, triptofan ve tirozin) BCA ile renk oluşumundan sorumludur (176). Araştırılan proteinin konsantrasyonları genellikle çok kullanılan BSA gibi bir protein referans alınarak ölçülür. Buna göre BSA nın bilinen konsantrasyonlarında çözeltiler hazırlanır ve bu çözeltiler kullanılarak test gerçekleştirilerek konsantrasyona karşı absorbans

59 44 kalibrasyon doğrusu çizilir. Bilinmeyen protein için de test gerçekleştirilerek absorbans değerleri bulunan kalibrasyon doğrusunda yerine konur ve konsantrasyon BSA ya göre (ya da diğer bilinen ve yapıca benzer protein) bulunur. Testin hassasiyet sınırları normal BCA için µg/ml, mikro BCA için 0,5-20 µg/ml arasındadır. BCA testi son nokta testi olmadığı için pembe renk oluşumu reaktifle örneklerin inkübasyonu ile devam eder. Bu sebeple inkübasyon süresi önemlidir. Yöntemin en büyük üstünlüklerinden birisi iyonik ve non-iyonik deterjanlar ile uyumlu olmasıdır (177) ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) ELISA yöntemi antijen veya antikorları tespit etmek ve miktarları ile birlikte aktivitelerini de ölçmek için kullanılır. Yöntemde antijen ve antikorlar inkübe edildikten sonra oluşmuş olan antikor-antijen kompleksi çok sayıdaki farklı tekniklerden biri kullanılarak türevlendirilir ve birinin veya ikisinin de aktivitesi belirlenir (178). ELISA sıklıkla doğrudan bağlanma tayini olarak ifade edilir ve iki alt tipi vardır. Birincisinde, ilgilenilen antijen katı bir faza sabitlenir ve üzerine onunla özgün olarak etkileşme yeteneğine sahip primer antikor eklenir. Bu aşamanın sonrasında primer antikora bağlanma yeteneği olan ve bir enzim ile konjuge edilmiş sekonder antikor eklenir. Bu sayede sekonder antikor üzerindeki enzimin substratı eklenmesiyle oluşan renk tayin edilir. Bu yönteme indirekt ELISA adı verilir (179). Indirekt ELISA nın şematik gösterimi aşağıdaki şekilde verilmiştir (Şekil 2.15).

60 45 Şekil İndirekt ELISA (Ag=antijen) İndirekt ELISA kadar sıklıkla olmamakla birlikte yine de kullanılan bir diğer yöntem ise sandwich ELISA dır. Bu yöntemde ise öncelikle antijeni tanıma yeteneğine sahip bir antikor katı faza sabitlenir. Sonrasında antijen içeren örnek uygulaması yapılarak antijenlerin ilk antikor tarafından tutulmaları sağlanır. Bu aşamadan sonra yine antijene bağlanma yeteneği olan antikor uygulanır ve antijen iki antikor arasında kalır. Sonrasında enzimantikor konjugatı olan sekonder antikorun eklenmesi ve substrat ile renk oluşumu basamakları gelir. Yöntemin şematik gösterimi aşağıdaki Şekil 2.16 dedir (180). Şekil Sandwich ELISA (Ag=antijen)

61 Western Blot Yöntemi Western Blot yöntemi bir homojenat ya da ekstratta bulunan protein karışımı içerisinden, özgün olarak istenen proteinlerin tayini için kullanılan bir yöntemdir. Bu amaçla protein karışımındaki proteinler önce jel elektroforezi (SDS-PAGE) ile ayrılırlar. Bu sayede proteinler büyüklüklerine göre jel içerisinde sıralı pozisyonlara dizilirler. Jeldeki proteinlerin kapiler etki ya da elektroforez ile bir membrana (nitroselüloz ya da PVDF) geçirilmesi yöntemin bir sonraki basamağıdır. Böylece jel üzerinde ayrılarak sıralı bir şekilde dizilmiş olan proteinler, aynı diziliş ile destek materyali olan membrana geçmiş olurlar. Bu geçiş sırasında jelde SDS sebebiyle katlı yapıları bozulmuş olan proteinler, membrana geçiş sırasında tekrar doğal dolayısı ile aktivite gösterebilecek hallerine geri dönerler (181). Bu sayede istenen proteine özgün olarak bağlanabilecek bir antikorun eklenmesi ile proteinantikor kompleksi oluşturulabilir. Bu işlemler sırasında önemli olan özgün olmayan bağlanmanın önüne geçilmesi için BSA gibi bir protein çözeltisi ile bloklanması gereklidir. Bu sayede antikor eklendiğinde sadece ilgili proteine bağlanabilir ve çapraz etkileşimlerin önüne geçilebilir. Primer antikor ile bağlanmadan sonra, ELISA yönteminde olduğu gibi enzim konjuge edilmiş bir sekonder antikor ve sonrasında substrat eklenmesi ile membranda sadece ilgilenilen proteine ait bantların görüntülenmesi gerçekleştirilebilir (118) Akış Sitometrisi Akış sitometrisi (aynı zamanda akış mikroflorimetri ya da akış sitoflorimetrisi olarak da adlandırılabilir), sulu bir ortamda bir eksitasyon kaynağı önünden tek olarak geçen hücrelerin taranması esasına dayanır. Görünür ya da floresans dalga boylarında tek tek hücreler tarafından yapılan yayılım hücrelerin antijenik, biyokimyasal ya da biyofiziksel özellikleri hakkında bilgi edinilmesini sağlar. Akış sitometrisi genel olarak iki amaç için kullanılır; kantitaif analiz ya da hücrelerin ayrılması. Akış sitometrisi yardımıyla tek tek kaynak önünden geçen hücreler özelliklerine göre genellikle elektrostatik olarak birbirlerinden ayrılırlar. Tek başına incelenen hücreler üzerinde yapılan ölçümlerin grafiksel

62 47 olarak ifadesine histogram denir. Histogramdaki veriler hücre sayısını ve tek başına olan hücreler üzerinde yapılan ölçüm ya da ölçümlerin değerlerini içerir. Analizlerde genel olarak üç aşama bulunmaktadır. İlk aşama akış sitometrisi öncesi fazdır. Bu aşamada hücreler hazırlanırlar, protokoller geliştirilir ve daha sonrasında hücrelerin floresans problar ile boyanmaları gerçekleştirilir. İkinci aşama akış sitometrisi aşamasıdır. Her bir hücre cihazda bulunan kapillerden ve eksitasyon kaynağı önünden tek tek geçerler ve bu sırada yapılan ölçümler kaydedilir. Son aşama ise elde edilen verilerin incelenmesi ve değerlendirilmesidir (182).

63 48 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Kullanılan Kimyasal/ Biyolojik Maddeler (+/-)-α-tocopherol (Vitamin E) Sigma-Aldrich/ ABD 1,2-Dioleoyl-sn-glycero-3- phosphoethanolamine, 99.0% (10 mg fosfolipit/ml CHCl 3 (DOPE) 1,2 distearoyl sn glycero 3 phosphoethanolamine N [methoxy(polyethylene glycol)-2000] (amonyum tuzu) kopolimeri (PEG-PE) Amonyum asetat Asetonitril, HPLC için BCA Protein tayin kiti Caco-2 Hücreleri Dimetil formamid Dimetil sülfoksit, cell culture grade DMEM (Dulbecco s Modified Eagle s Medium), 4.5 g/l glukoz, sodyum pirüvat, stabil glutamin içeren Elakridar (GG918) (ELC) Fetal dana serumu (FBS) Glasiyel asetik asit Hidroklorik asit L-glutamin (200 mm) MCF-7 hücre hattı MDCKII-MDR1 hücre hatları Metanol, HPLC için Oktan-1-sülfonik asit sodyum tuzu, iyon çifti kromatografisi saflığında (1-OSA) Sigma-Aldrich/ ABD Avanti Polar Lipids Inc., Alabama-ABD Reidel-de Haen / Almanya Sigma-Aldrich/ ABD Pierce/ABD American Type Culture Collection (ATCC) / ABD Applichem GmBH / Almanya Applichem GmBH / Almanya Biochrom AG / Almanya Santa Cruz Biotechnology, Inc., Heidelberg, Almanya Biochrom AG / Almanya Merck / Almanya Merck / Almanya Biochrom AG / Almanya Şap Enstitüsü-Ankara The Netherlands Cancer Institute-Hollanda Sigma-Aldrich/ ABD Merck/Almanya

64 49 Paklitaksel (PTX) PEG (nitrophenyl carbonate) 2 Penisilin / Streptomisin Phosphate buffered saline (PBS) Applichem / Almanya SunBio, Inc., Güney Kore Biochrom AG / Almanya Biochrom AG / Almanya (ph 7.4, Ca ++ ve Mg ++ içermeyen) Pyrene Siklosporin A Sodyum bikarbonat Sodyum dodesil sülfat (SDS) Sodyum hidroksit TAT Peptit Thiazolyl blue tetrazolium bromide (MTT) Trietil amin (TEA) Tripan mavisi (tripan blue) Tripsin-EDTA çözeltisi (%0.05-% 0.02), Sigma-Aldrich/ ABD Sigma-Aldrich/ ABD Merck / Almanya Sigma-Aldrich/ ABD Merck / Almanya Innovagen/İsveç Applichem GmBH / Almanya Sigma-Aldrich/ ABD Sigma/ ABD Biochrom AG / Almanya PBS içinde, Ca ++, Mg ++ içermeyen WST-1 Clontech / ABD 3.2. Kullanılan Cihazlar 96 kuyucuklu steril plaka Grenier Bio-one / Almanya Biyogüvenlik kabini Faster BHG 2004, Class 2 / İtalya Enjektör ucu Filtre 0.2 µm, steril Enjektör ucu Filtre 0.45 µm, steril Hassas terazi Sartorius Stedim Biotech GmbH / Almanya Sartorius Stedim Biotech GmbH / Almanya Shimadzu Ax200/Japonya Hassas terazi Metler, Toledo Ad 104-5

65 50 Hemasitometre Marienfeld Haemacytometer Laboratory Glassware / Almanya HPLC Agilent Technologies 1200 / ABD HPLC Kolonu, C18, 150 x 4.6 mm, 3 µm HPLC Kolonu, C18, 150 x 4.6 mm, 5 µm Hücre kültür kapları (flask, 25 ve 75 cm 2 ) İnverted mikroskop Leica DMIL, DFC 320 kamera sistemi ve Leica Qwin software destekli Karbondioksit inkübatör Manyetik karıştırıcı Mikropipet Mikropipet ucu Mikroplaka okuyucu ph Metre Polipropilen tüp, kapaklı, 14 ml Santrifüj, soğutmalı, değişken rotorlu Spektroflorimetre Spektroflorimetre, plaka okuyuculu Su banyosu, dijital Ultra saf su cihazı Ultrasonik banyo UV Küveti Fortis Technologies Develosil ODS UG-5, Nomura Chemical Co. Ltd. / Japonya Grenier Bio-one / Almanya Leica / Almanya Sanyo / Japonya Heidolph / Almanya Eppendorf / Almanya Eppendorf / Almanya VersaMax, Molecular Devices Co. /ABD Sartorius Professional meter PP-20 Grenier Bio-one / Almanya Hermle, Z383K /Almanya Shimadzu RF-5301 PC, Japonya Spectramax M2, Molecular Devices Co. / ABD SB 300, Şimşek Laborteknik Ltd. Şti. / Türkiye Simplicity 185 Ultrapure water system, Millipore / ABD Bronson B 220 Smith Kline /ABD Hellma, 10 mm, tip no:104-qs

66 51 UV Spektrofotometresi Vorteks UV-1800, Shimadzu / Japonya IKa / Brezilya Yatay çalkalayıcı, dijital Memmert GmBH Co. KG / Almanya Zetasizer Nano Series ZS Malvern Ins./ İngiltere

67 Çalışmalarda Kullanılacak Polimerlerin Sentezi ve Karakterizasyonu pnp-peg-pe Bileşiğinin Sentezi Genel Bilgiler bölümünde de belirtildiği üzere, amin grubu taşıyan ligandların misel yapıları içerisine katılmaları için kolay, hızlı ve yüksek konjugasyon verimi sağlayan bir bileşik olması nedeni ile pnp-peg-pe sentezi büyük önem taşımaktadır. Tez çalışmalarımızda (103) de verilen yöntem modifiye edilerek ve geliştirilerek kullanılmıştır. Reaksiyon Yöntemi pnp-peg pnp bileşiği önce kloroformda çözülür (213 µmol, konsantrasyon 10 mg/ml olacak şekilde). Kullanılan miktar, DOPE bileşiğinden gelecek PE gruplarının mol oranının yaklaşık 5 katıdır. Kullanılan kloroform ekstra kuru kalitedir ve septum kapaklı olduğu için gerekli miktarlar alınırken cam enjektör kullanılır. 44 µmol DOPE çözeltisi eklenir. Manyetik karıştırıcıya yerleştirilir ve karıştırma yapılır. Gerekli miktar TEA (143 µmol) ortama eklenir ve çözünmesi sağlanır. Reaksiyon kabı mutlaka azot gazından geçirilmeli ve ortamda hava ve nem kalmadığından emin olunmalıdır. Oda sıcaklığında hafif manyetik karıştırma altında inkübasyona bırakılır. Reaksiyonun uygun bir şekilde ilerlediği, pnp-peg pnp bileşiğinin bir ucundan çıkan pnp den kaynaklı açık sarı renk takip edilerek kalitatif olarak görülür. Reaksiyonun sonlanıp sonlanmadığı ise ince tabaka kromatografisi (İTK) yapılarak doğrulanır. o İTK plağı olarak Silica Gel 60 F254 kullanılır. o İTK analizinde mobil faz olarak hacimce 65/25/4 ya da 80/20/2 oranlarında Kloroform/Metanol/Su karışımı kullanılır. o Genel görüntüleme için plaklar UV ışığı altında incelenir.

68 53 o PEG e ait noktanın görüntülenmesi için dragendorff reaktifi, lipide ait (PE) noktanın görüntülenmesi için ise vanilin/sülfürik asit reaktifi ile boyama yapılır. o Reaksiyonun sonlandığının anlaşılabilmesi için ürün örneğine ait PE noktasının tamamen kaybolması ve PEG/PE ye ait birleşmiş noktanın görülmesi gereklidir. Saflaştırma Yöntemi Çözücünün Uçurulması o Manyetik karıştırıcı çubuk uzaklaştırılır ve çözelti cam balona alınır. Cam balon rotavapora takılıp düşük dönme devrinde çalıştırılır. Uçurma işlemine, görünür çözücü kalmayıncaya kadar devam edilir. o Karışım azot gazı altında tutularak viskoz bir hale gelmesi beklenir. o Çözücü kalıntılarının tamamen uzaklaştırılması için 1 gece boyunca liyofilizatörde tutulur. Liyofilizatörün iç aksam ve vakum çemberi bölümlerinin organik çözücüden zarar görmemesi için teflon kaplı olması gereklidir. Sentezlenen PE-PEG-pNP' nin Jel Filtrasyonu ile Saflaştırılması o 45 ml CL-4B Sepharose içeren kolon (15 x 300 mm), 60 ml süspansiyon kullanılarak hazırlanır ve M HCl (ph 3,0) ile dengeye getirilir. o Kurutulmuş olan tepkime balonu (yaklaşık 180 mg ürün ve 630 mg reaksiyona girmemiş PEG içerir) liyofilizatörden alınır ve 4 fraksiyona ayrılır. İlk 200 mg ürüne 1 ml M HCl (ph 3,0) çözeltisi eklenir ve miseller (toplam PEG derişimi ~ 200 mg/ml) oluşturulur. o Jel ayırımının gerçekleşmesi için PEG ve PEG-PE nin çözelti içinde tamamıyla dağılmış olması gereklidir. Tam bir dağılma elde edilemediği durumda, çözeltiye dikkatli bir

69 54 o o o şekilde sonikasyon (su banyosu içinde 5 dakikadan fazla olmamak şartıyla 15 watt) uygulanabilir. 1 ml ürün çözeltisi kolona uygulanmış ve M HCl (ph 3,0) çözeltisi ile yürütülür. (Kolona uygulanan ürün yüklemesi yaklaşık % 1,8 (h/h) ve % 0,4 (a/h)) Fraksiyonlar 13x100 mm lik borosilikat cam tüpler içerisine toplanır. Mavi dekstran uygulanarak önceden hesaplanmış olan ölü hacim için fraksiyonların toplanmasına gerek yoktur (yaklaşık 11 ml). Fraksiyonlardaki ürünün doğrulaması için İTK kullanılır. Bu amaçla 20x20 cm alüminyum arkalı İTK plakalarının yarısı ve 80/20 CHCl3/MeOH karışımı kullanılır. Bütün ürünün elde edildiği doğrulandıktan sonra fraksiyonların toplanması işlemi durdurulur. Saflaştırılan pnp-peg-pe Ürününün Liyofilizatör ile İzolasyonu o Ürünü içeren bütün fraksiyonlar birleştirilir ve bir cam balon içine koyulur (balon hacminin yarısından çoğu boş kalacak şekilde). o Balon -80 C deki dondurucuya koyulur. o Dondurulmuş olan balon ve içeriği liyofilizatöre koyulur ve tamamen kuru bir toz haline gelinceye kadar kurutulur (en az 3 gün). o Elde edilen toz örnek kloroform içerisinde çözülerek stok çözelti hazırlanır ve sonrasında azot gazı geçirilerek -80 C lik soğutucuda saklanır pnp-peg-pe Bileşiğinin 1 H-NMR ile Karakterizasyonu Laboratuvarımızda pnp-peg-pe bileşiğinin sentezi için literatürde belirtilmiş ve bir çok farklı çalışma ve farklı grup tarafından doğrulanmış olan bir yöntem kullanılmış olmakla birlikte yapılan geliştirme ve değişikliklerin sonucu etkileyip etkilemediğinin araştırılması gereklidir. Her ne kadar pnp-

70 55 PEG-PE sentezi süresince eş zamanlı olarak alınan örnekler İTK ile analiz edilmiş olsa da, elde edilen saf ürünün 1 H-NMR analizi de yapılarak doğrulanması gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla Orta Doğu Teknik Üniversitesi Merkez Laboratuvarı nda bulunan Bruker Biospin 300 MHz NMR spektrometresi kullanılmıştır. Analizler cihaz teknisyeni tarafından gerçekleştirilmiştir Analitik Miktar Tayini Yöntemleri PTX in Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile Miktar Tayini PTX in tek başına, hazırlanan formülasyon içerisinde ve in vitro salım şartlarındaki tayininin özgün, hassas, güvenilir, doğru ve kısa analiz sürelerinde yapılabilmesi için aşağıdaki tabloda şartları verilen HPLC metodu kullanılmıştır. Tablo 3.1. PTX miktar tayininde kullanılan HPLC yönteminin parametreleri. Mobil Faz Metanol:Su karışımı Hacimce 68:32 oranında Analitik Kolon C18 RP, 4.6x150mm, 5 µm Develosil UG-5 (Japonya) Enjeksiyon hacmi 50 µl Akış hızı Dedektör 1 ml/dak. DAD 229 nm Analiz sıcaklığı 25 C Analiz süresi 10 dakika PTX ve CYC İçin HPLC ile Miktar Tayini Tez çalışmalarında CYC, PTX ile birlikte çözelti halinde uygulanacak ya da misel yapıları içerisine hapsedilecektir. Bu sebeple gerek salım ortamı, gerek miseller yapıları gerekse diğer ortamlarda tek başına CYC tayini değil PTX ile birlikte CYC tayini yapılması zorunluluğu doğacaktır.

71 56 PTX için kullanılan analitik tayin yöntemi, öncelikle herhangi bir değişiklik yapılmadan CYC için de kullanılmaya çalışılmış fakat her iki madde tayini için uygun bulunmamıştır. Bu sebeple yeni bir HPLC yöntemi geliştirilerek PTX ve CYC nin aynı anda tayini yapılması sağlanmıştır. Aşağıdaki tabloda bu amaçla geliştirilen ve gradient elüsyon esasına dayanan HPLC yönteminin parametreleri yer almaktadır. Mobil fazda organik faz olarak asetonitril kullanılmıştır. Tablo 3.2. PTX ve CYC miktar tayininde kullanılan HPLC yönteminin parametreleri. Analitik Kolon C18 RP, 4.6x150mm, 5µm Develosil UG-5 (Japonya) Dedektör DAD 229 nm (PTX) DAD 205 nm (CYC) Enjeksiyon hacmi 50 µl Akış hızı 1 ml/dak. Analiz sıcaklığı 40 C Analiz süresi 22 dakika Her iki etkin maddenin de yeterli bir ayırım ile analiz edilebilmesi için geliştirilen yöntemde, analiz süresine göre değiştirilen mobil fazdaki asetonitril ve ultra saf su yüzdeleri aşağıdaki tabloda verilmiştir. Tablo 3.3. PTX ve CYC için kullanılan gradient elüsyon HPLC yönteminde zaman bağlı mobil faz yüzde değişimi. Zaman (Dakika) % Su oranı

72 57 İki etkin maddenin de analitik yöntem validasyonu için, PTX in ve CYC nin asetonitril içerisindeki stok çözeltileri hazırlanmış ve gerekli standart çözeltiler, mobil faz ile seyreltme yapılarak hazırlanmıştır. Her bir standart çözelti hazırlanırken, her iki madde de standart çözelti içerisinde aynı konsantrasyonda olacak şekilde seyreltmeler yapılmıştır PTX ve ELC için HPLC ile Miktar Tayini ELC nin pka değeri yaklaşık 12,5 dur ve zayıf asidik yapıda bir bileşiktir. Bu durum, HPLC yönteminde iyon çiftleri oluşturmasına ve yetersiz ayrıma yol açacağı için HPLC yöntemin iyon çifti ajanı kullanılmıştır. PTX ve ELC nin birlikte analitik tayini için geliştirilen HPLC yönteminin ayrıntıları aşağıdaki Tablo 3.4 de verilmiştir. ELC nin tayini için hem UV hem de olası bir girişim ya da hassaslığın arttırılmak istenmesi durumunda floresan tayin yapılmıştır. Her iki tayin yöntemi için de kalibrasyon doğruları oluşturmuştur. Tablo 3.4. PTX ve ELC miktar tayininde kullanılan HPLC yönteminin parametreleri. Mobil Faz Asetonitril:Amonyum Asetat Tamponu (ph 3,1, 50 mm) Hacimce 60:40 oranında, 10 mm 1-OSA Analitik Kolon C18 RP, 4.6x150mm, 3µm Fortis Technologies (İngiltere) Koruyucu Kolon Develosil, kartuş tipi Enjeksiyon hacmi 50 µl Akış hızı Dedektör Analiz sıcaklığı 30 C Analiz süresi 9 dakika 0,5 ml/dak DAD 229 nm (PTX) DAD 258 nm (ELC) Floresans Ex:265, Em: 485 (ELC)

73 Kullanılan Analitik Yöntemlerin Validasyon Parametreleri Analitik yöntem validasyonu, analizi yapılacak olan maddenin miktar tayin yönteminin, amaçlanan uygulama bakımından güvenilirliğini ve tekrarlanabilirliğini göstermek ayrıca bilimsel bütünlük ve uygunluğun sağlanması için yapılan bir prosedürdür (183). Yukarıda verilen analitik tayin yöntemlerinin validasyonlarının yapılması için aşağıda verilen parametreler incelenir. Her bir parametre, her bir yöntem için açıklamasında verildiği şekilde araştırılır. Özgünlük (Seçicilik) Bir analitik yöntemin seçiciliği, araştırılan etkin maddenin belirtilen analiz şartlarında sisteme uygulandığında alınan cevabın, çalışmada kullanılacak diğer maddelerden kaynaklanan cevaplar ile girişim yapmamasıdır (184). Bu parametrenin araştırılması için etkin maddeler birlikte ve tek tek HPLC sistemine enjekte edilmiş ve, alınan cevapların hem birbirleri ile hem de çalışmalar sırasında kullanılacak diğer maddeler ile (PEG-PE, Vitamin E, sodyum salisilat, pnp-peg-pe) girişim yapıp yapmadığı araştırılmıştır. Doğrusallık Bir analitik yöntemin doğrusallığı deney bulgularının örnek içindeki madde konsantrasyonu ile orantılı olarak belirli bir aralıkta olmasıdır. Doğrusallık analizi yapılacak olan etkin maddeye ait cevap pik alanının, etkin maddenin kullanılan konsantrasyonları ile doğrudan orantılı olması olarak tanımlanabilir. Doğrusallık % 80 - % 120 oranındaki konsantrasyon uzunluğuna sahip beş ya da beşten fazla standarttan, üçten altıya kadar uygulama serisiyle sağlanır (185). Bu amaçla doğrusallık parametresinin sağlandığını göstermek için ilgili maddelerin uygun çözücüde hazırlanmış olan belirli konsantrasyondaki ana stok çözeltilerinden hareketle, altı adet standart çözelti hazırlanır. Doğruluk parametresinin incelenmesi için de her bir konsantrasyon noktasında altı çözelti hazırlanır. Ana stoktan yapılan seyreltmelerde HPLC sisteminde kullanılacak olan mobil faz kullanılır. Bu standart çözeltilerin HPLC analizi sonucunda elde edilen kromatogramlardaki

74 59 maddeye ait cevap piklerinin alanı ile madde konsantrasyonu arasında regresyon analizi yapılır. Sadece PTX için kullanılan yöntemde çalışılan konsantrasyon sınırları µg/ml dir. PTX ve CYC için kullanılan yöntemde çalışılan konsantrasyon sınırları PTX ve CYC için aynı ve 0,5-100 µg/ml dir. PTX ve ELC için kullanılan yöntemde çalışılan konsantrasyon sınırları PTX için 0, µg/ml, ELC için 0,05-10 µg/ml dir. Kesinlik Kesinlik bir yöntemin birbirini takip eden ölçümleri arasındaki yakınlığın derecesini ifade etmektedir. Yöntemin kesinliği, herhangi bir değerin tekrarlanabilme kabiliyeti veya bireysel test sonuçlarının birbirine yakınlığının bir derecesidir. Standart sapma ve varyasyon katsayısı ile ifade edilir. Kesinlik parametresi kendi içerisinde tekrar edilebilirlik, orta kesinlik ve tekrar elde edilebilirlik olarak ayrılır. Orta kesinlik uzun süreler boyunca, farklı operatörler ve farklı cihazlarla yapılan analiz sonuçlarının kesinliğidir. Tez çalışmaları sırasında tek bir cihaz, tek bir laboratuvar ve tek operatör tarafından analizler yapıldığı için bu parametre validasyon çalışmalarında incelenmemiştir. Tekrar Edilebilirlik Tekrar edilebilirlik, aynı kişi tarafından aynı şartlarda kısa zaman aralığında sabit bir örnekte belli bir yöntem kullanılarak yapılan bir dizi işlemin kesinliği olarak tanımlanır (186). Analitik yöntemin tekrar edilebilirliğinin incelenmesi için stok çözeltilerden hareketle, kalibrasyon doğrusu üzerinde yer alan belirli konsantrasyonda bir standart çözelti hazırlanır ve bu çözeltinin artarda altı kez HPLC ile analizi yapılır. Bu analizlerin sonucunda kalibrasyon doğrusu kullanılarak her bir analizdeki pik alanının karşılık geldiği konsantrasyon değeri bulunur. HPLC analizi ile bulunan konsantrasyon değerlerinin (µg/ml) ortalama (X), standart sapma (SS) ve varyasyon katsayısı (VK) hesaplanır. Analitik yöntemin tekrar edilebilirliğinin gösterilebilmesi için VK değerinin %2 den küçük olması gerekmektedir.

75 60 Tekrar Elde Edilebilirlik Tekrar elde edilebilirlik parametresinin incelenmesi için ise aynı stoktan hareketle yine kalibrasyon doğrusu üzerinde yer alan üç farklı konsantrasyon seçilir. Bu konsantrasyon noktalarının her biri için altı adet farklı standart çözelti hazırlanır ve her bir çözelti HPLC ile bir defa analiz edilir. Bu analizler sonucunda kalibrasyon doğrusu ile konsantrasyon hesaplanarak X, SS ve VK değerleri bulunur. Doğruluk Bir analitik yöntemin doğruluğu, yöntem kullanılarak elde dilen sonuçların gerçek değere yakınlıklarıdır. Tez çalışmalarında kullanılan analitik yöntemlerin doğruluklarının gösterilmesi için üç farklı konsantrasyon seçilir ve her bir konsantrasyon değerinde üç adet standart çözelti hazırlanır (186). Doğruluk için kabul edilebilir değer, nominal değerden ±%15 den fazla sapmanın olmamasıdır (184). Miktar tayini için kullanılan analitik yöntemin doğruluğunun araştırılması için aşağıdaki eşitlik kullanılmıştır (Eşitlik 3.1): Doğruluk % ortalama bağıl hata = (!!!) 100 (Eşitlik 3.1.)! X= Ölçülen konsantrasyon (µg/ml) Y= Hazırlanan konsantrasyon (µg/ml)

76 Etkin Madde İçermeyen Misel Formülasyonlarının Hazırlanması Polimerik PEG-PE misellerinin hazırlanmasında 2000 Da luk zincir uzunluğuna sahip PEG içeren polimer kullanılır. Misel formülasyonları hazırlanırken tek başına PEG-PE ile birlikte karışık misel formülasyonları için Vitamin E de kullanılır. Etkin madde içermeyen misel formülasyonları hazırlanmasında film oluşturma yöntemi kullanılır (31,48,52,67,70,72). Kloroform içerisindeki 20 mg/ml lik PEG-PE stok çözeltisi içerisinden gerekli miktar alınır ve armut dipli balon jojeye ya da borosilikat cam tüp içerisine alınır. Azot gazı altında ya da rotavapor kullanılarak organik faz uçurulur ve polimer filmi oluşturulur. Organik çözücü kalıntılarından tamamen kurtulmak için 1 saat liyofilizatörde kurutma yapılması gereklidir. Vitamin E içeren miseller için ise, Vitamin E nin kloroformdaki stok çözeltisinden gerekli miktar alınarak başlangıçtaki PEG- PE çözeltisi ile karıştırılır. Sonrasında aynı işlemler tekrarlanır. Polimer filmi oluşturulduktan ve tamamen kurutulduktan sonra, PBS ile film hidrate edilir ve vorteks kullanılarak şiddetli karıştırma uygulanır. Böylece misel dispersiyonları hazırlanmış olur. Hazırlama yönteminin şekilsel gösterimi Şekil 3.1 de verilmiştir. Miseller hazırlanırken, karakterizasyon parametreleri üzerinde etkili olan etkenlerin farklı oranları da araştırılır. Vitamin E nin misel formülasyonları üzerindeki etkisinin incelenmesi için farklı Vitamin E oranları denenmiştir. Misel materyallerinin son dispersiyon içerisindeki konsantrasyonlarının enkapsülasyon ve boyut üzerine etkisinin incelenmesi için ise lipit konsantrasyonu 1 ve 10 mm olan miseller hazırlanır. Tablo 3.5 de etkin madde içermeyen misel formülasyonlarının içerikleri verilmiştir.

77 62 Şekil 3.1. Etkin madde içermeyen misel formülasyonlarının hazırlanışı. Tablo 3.5. Etkin madde içermeyen PEG-PE ve PEG-PE/Vitamin E misel formülasyonları. 10 mm 1 mm Formülasyon PEG-PE Vitamin E (µmol) (µmol) PEG-PE 3,44 - PEG-PE/Vitamin E (85:15) 3,44 0,607 PEG-PE/Vitamin E (95:5) 3,44 0,181 PEG-PE 0,344 - PEG-PE/Vitamin E (85:15) 0,344 0,0607 PEG-PE/Vitamin E (95:5) 0,344 0,0181

78 Etkin Madde İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı Formülasyonlar hazırlanırken PEG-PE ve Vitamin E nin kloroformdaki stok çözeltileri, PTX in ise metanoldeki stok çözeltisi (1 mg/ml konsantrasyonda) kullanılır. Etkin maddenin hapsedilme etkinliğinin ve miseller çözünürleştirici etkinin araştırılabilmesi için formülasyonlara eklenen PTX miktarı, polimerin ağırlıkça farklı yüzdelerdeki miktarı olarak hesaplanır. Buna göre polimer ağırlığının %1, 2,5, 5 ve 10 u kadar PTX formülasyonlara eklenir. Hazırlama yönteminde etkin madde içermeyen misellerin hazırlanması için kullanılan yöntem takip edilir. Gerekli miktarlardaki çözeltiler (PEG-PE, Vitamin E ve PTX) stoklardan alındıktan sonra bir balona ya da borosilikat tüpe konulur ve rotavapor/azot gazı kullanılarak organik çözücüler uzaklaştırılır. Tam bir kurutma yapılabilmesi için oluşturulan polimer filmini içeren kaplar liyofilizatöre yerleştirilir ve vakum altında gerekli süre tutulur. PTX içeren formülasyonlarda PTX in ışıktan bozunma göstermesi sebebiyle kaplar alüminyum folyo ile kaplanmalı ve mümkün olduğunca karanlık ortamda çalışılmalıdır. Elde edilen film, PBS ph 7,4 çözeltisi kullanılarak hidrate edilir ve vorteks ile şiddetli çalkalama yapılarak misel oluşumu sağlanır. Oluşan misel dispersiyonu 0,2 µm lik filtreden süzülür PTX ve CYC İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı Bölüm de verilen ve PTX içeren misellerin hazırlanması için kullanılan yöntem PTX ve CYC yi birlikte içeren miseller için de kullanılır. PTX in yanı sıra CYC nin de misel yapılarına enkapsülasyonu için CYC nin metanoldeki stok çözeltisinden (1 mg/ml), PEG-PE polimerinin ağırlıkça %1, 2,5, 5 ve 10 u kadar CYC olacak şekilde gerekli miktarlar alınır ve baştaki karışıma eklenir, diğer işlemler sırası ile takip edilir PTX ve ELC İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX ve ELC yi birlikte içeren misel formülasyonlarının hazırlanmasında yüksek enkapsülasyon etkinliği ve istenen partikül büyüklüğü özelliklerinin sağlanabilmesi için Bölüm ve de verilen

79 64 hazırlama yöntemlerinde kullanılan miktarlarda değişikliklere gidilmiştir ama hazırlama yöntemi korunmuştur. Buna göre PTX in metanol içerisindeki stok çözeltisinden polimerin ağırlıkça %5 ve 10 u olacak şekilde gerekli miktar alınır. Vitamin E içeren misel formülasyonlarda, PEG-PE:Vitamin E mol oranı 90:10 olacak şekilde sabit tutulur. ELC nin asetonitril:metanol karışımı (hacimce 1:1) içerisinde 0,5 mg/ml konsantrasyondaki stok çözeltisinden, son misel dispersiyonundaki konsantrasyonu 25 µm olacak şekilde gerekli miktar alınır ve karışıma eklenir. Misel materyalinin son konsantrasyonu 1 mm olacak şekilde sabit tutulmuştur. Hazırlanan formülasyonların kodları ve bileşimleri aşağıdaki tabloda sunulmuştur. Tablo 3.6. PTX ve ELC içeren misel formülasyonlarının bileşimi. Formülasyon Kodu Vitamin E PTX Miktarı (Polimerin % si olarak) ELC Miktarı (Teorik son konsantrasyon µm) A B C D Ligand ile Modifiye Edilen Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı Misel yapılarına ligand olarak kullanılacak TATp ya da 2C5 mab un katılması için sentezlenen pnp-peg-pe bileşiğinin sentez işlemleri Bölüm 3.3 de verilmiştir. Ligand konjuge edilmiş misellerin hazırlanması iki aşamada gerçekleştirilir. İlk aşamada kullanılacak olan ligand (TATp ya da 2C5), pnp-peg-pe ile konjuge edilir. Sonrasında ise, misel yapısını oluşturacak diğer bileşikler ve etkin maddeler kullanılarak hazırlanmış olan misel formülasyonları ile, Ligand-PEG-PE miselleri bir araya getirilerek aktif hedeflendirilmiş miseller hazırlanır. Aşağıda verilen yöntem ligand içeren misellerin hazırlanması için genel olarak kullanılan yöntemdir (48,52,72,103,187,188). Tez çalışmalarında TATp ya da 2C5 ı tek başına içeren ayrı misel formülasyonları hazırlanmış, karakterizasyonları ve etkinlikleri araştırılmıştır. İki ligandı da aynı anda içeren misel yapıları hazırlanmamıştır. Bu işlemlerin ayrıntıları aşağıda verilmiştir.

80 65 İlk basamakta, pnp-peg-pe bileşiğinin kloroformdaki stok çözeltisinden 0,048 µmol için gerekli miktar alınır ve üzerine PEG-PE nin stok çözeltisinden 0,192 µmol eklenir. Bu sayede pnp-peg-pe:peg-pe mol oranı 1:4 olarak sabit tutulur. Çözücünün rotavaporda uzaklaştırılmasını takiben liyofilizatöre yerleştirilen örnekler 4 saat boyunca kurutulurlar. Sonrasında hazırlanan polimer filmleri, pnp gruplarının ligand ortama eklenmeden önce hidroliz olmaması için, ph 5,0 sitrat tamponu ile hidrate edilirler ve vorteks kullanılarak çalkalanırlar. Bu sayede oluşan miseller asidik ortamda oluşturulmuş olur. Ardından gerekli miktarda ligand misellere eklenir. Tez çalışmalarında ligand olarak kullanılan 2C5 ve TATp stokları PBS ph 7,4 içerisinde hazırlanırlar. Eklenen miktarlar aşağıda her biri için ayrı ayrı verilmiştir. Ligand çözeltileri eklendikten sonra pnp gruplarının hidrolize olarak ligand PEG-PE arasında konjugasyonun olması için ortamın ph sı yavaş yavaş PBS ph 10,0 tamponu ve 0,1 N sodyum hidroksit çözeltileri eklenerek 8-8,5 aralığına getirilir. Sonrasında miseller +4 C de gece boyunca karıştırılır. Ortamda hidroliz olan serbest pnp gruplarının uzaklaştırılması için ligand bağlı olan miseller 1 L PBS ph 7,4 e karşı diyaliz edilirler. TATp kullanılan miseller molekül ağırlığı geçirgenlik sınırı (MWCO) 1000 Da olan selüloz ester diyaliz keselerinden diyaliz edilirken 2C5 kullanılan miseller MWCO değeri 300 kda olan diyaliz keselerinden diyaliz edilirler. Bu sayede hem ph değişimi, hem ortamdaki serbest pnp gruplarının uzaklaştırılması hem de serbest halde bulunan bağlanmamış ligand moleküllerinin uzaklaştırılması sağlanmış olur. İkinci aşamada, etkin madde/maddeleri ve gerekli miktarlarda diğer formülasyon bileşenlerini içeren filmler hazırlanır. Her bir grup misel hazırlanırken ilgili bölümde ayrıntıları verilen misel formülasyonları kullanılır. Özetle, gerekli miktarda PEG-PE bileşiği ve eğer kullanılacaksa Vitamin E alınır. Etkin madde içeren formülasyonlar için PTX ve gerekli miktarlarda P- gp inhibitörleri (CYC ve ELC) bu karışıma eklenerek organik çözücüler uzaklaştırılır ve polimer filmi oluşturulur. Liyofilizatörde tam olarak kurutmayı takiben oluşturulan bu polimer filmi, bir önceki basamakta hazırlanan ve

81 66 Ligand-PEG-PE içeren misel karışımı ile hidrate edilir. Böylece TATp ya da 2C5 ile yüzey modifikasyonu yapılmış olan misel formülasyonları hazırlanmış olur. pnp-peg-pe nin PEG-PE ye oranı ağırlıkça %6 dır. Verilen hazırlama yönteminin şematik gösterimi aşağıda verilmiştir. Vitamin E (Bazı formülasyonlarda) P-gp inhibitörü PTX 2C5 YA DA TATp Ligand PEG-PE Etkin madde Şekil 3.2. Ligand ile modifiye edilen misellerin hazırlanışı.

82 Hazırlanan Misel Formülasyonlarının Karakterizasyonları Kritik Misel Konsantrasyonunun Belirlenmesi ve Misel Oluşumunun Doğrulanması Hazırlanan misellerinin kritik misel konsantrasyonları Pyrene metodu ile bulunur (72, ). Buna göre her biri, içerisinde pyrene kristalleri içeren deney tüpleri hazırlanır. Bu deney tüplerinin içerisine 0, mm konsantrasyonlardaki misel dispersiyonları eklenir. Karışımlar 24 saat boyunca oda sıcaklığında ve karanlıkta hafif karıştırma altında inkübe edilir. İnkübasyon sonunda misel yapıları içerisine alınmayan pyrene kristallerinin uzaklaştırılması için çözeltiler 0,2 µm lik filtrelerden süzülür. Süzülmüş örneklerin floresans spektrumları 339 nm (eksitasyon) ve 390 nm (emisyon) değerlerinde okunur. Kritik misel konsantrasyonu floresans absorbsiyon şiddetindeki ani artışa karşılık gelen değer olarak kabul edilir. Hazırlanan misellerin, misel yapılarını oluşturduğu pyrene metoduna ek olarak aynı zamanda boyut ayırma (size-exclusion) kromatografisi ile de araştırılır. Boyut ayırma kromatografisinde ayırım, analizi yapılacak olan materyallerin molekül büyüklüklerine göre gerçekleşmektedir. Boyut ayırma kromatografisinin şematik açıklaması aşağıdaki şekilde verilmiştir. Pyrene metodunda kullanılan konsantrasyon aralığında çalışılmıştır. Şekil 3.3. Boyut ayırma kromatografisinde molekül büyüklüklerine göre ayırım.

83 68 Yukarıda verilen bilgiler ışığında tez çalışmalarında aşağıdaki tabloda ayrıntıları verilen boyut ayırma kromatografisi yöntemi kullanılmıştır. Tablo 3.7. Misel oluşumunun doğrulanmasında kullanılan boyut ayırma kromatografisi şartları. Mobil Faz ph 7,0 Fosfat Tamponu (100 mm Fosfat, 150 mm Sodyum Fosfat) Kolon Shodex Protein KW-804 kolonu, Protein KW-G koruyucu kolon ile birlikte (Shodex, Japonya) Enjeksiyon hacmi 50 µl Akış hızı 1 ml/dak. Dedektör DAD 220 nm Analiz sıcaklığı 25 C Analiz süresi 20 dakika Misellerin Partikül Büyüklüğü ve Zeta Potansiyeli Ölçümleri Hazırlanan misellerin partikül büyüklüklerinin ve zeta potansiyellerinin ölçülmesinde anabilim dalımızda kullanılan Malvern NanoZS cihazı kullanılmıştır. Ultra saf su içerisinde hazırlanan misel dispersiyonları tek kullanımlık ölçüm küvetlerine konulur ve önce partikül büyüklükleri sonrasında da zeta potansiyelleri ölçülür. Aynı zamanda misel oluşumunun doğrulanması için yine 0, mm konsantrasyon aralığında seyreltmeler yapılır ve partikül büyüklükleri ölçülür. Her bir ölçüm üç defa tekrarlanır PTX in Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği ve Miseller Çözünürlüğünün Araştırılması Misel yapılarının Bölüm de belirtildiği şekilde hazırlanmasını takiben, misel dispersiyonları 0,2 µm lik filtrelerden süzülür. Böylece misel yapıları içerisine hapsedilemeyen ve sulu tampon ortamında çözünürlüğü olmadığı için kristaller halinde çöken etkin madde molekülleri ortamdan uzaklaştırılır. Elde edilen süzüntü, hacimce 70:30 Metanol:Su karışımı ile seyreltilir. Ortama eklenen metanol misel yapılarını bozarak hapsolan PTX i serbest

84 69 hale getirir. Çözeltiler HPLC ile analiz edilerek formülasyonların içerisine hapsolan PTX miktarları tayin edilir. Analizler üç tekrarlı olarak yapılır PTX ve CYC nin Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği PTX ile aynı ağırlık oranlarında misel formülasyonlarına eklenen CYC nin de enkapsülasyonu PTX ile birlikte araştırılır. Buna göre, iki etkin maddeyi birlikte içeren misel formülasyonları hazırlandıktan ve süzüldükten sonra, hacimce 70:30 Asetonitril:Su karışımı ile seyreltilerek HPLC ye uygulanır. Analizler üç tekrarlı olarak yapılır PTX ve ELC nin Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği PTX ve ELC yi birlikte içeren miseller ile yapılan çalışmalarda hazırlanan ve filtre edilen miseller hacimce 70:30 oranında Asetonitril:Su karışımında çözündürülür ve HPLC de analiz edilir. Analizler üç tekrarlı olarak yapılır. Tüm yükleme etkinliği çalışmalarında elde edilen sonuçlar misel yapıları içerisindeki madde konsantrasyonları ve yükleme etkinliği değerleri olarak verilir. Yükleme etkinliği bulunurken aşağıdaki eşitlik kullanılır (Eşitlik 3.2). Yükleme Etkinliği % =!ü!"#$#$!"#$%!"##$ (!")!"#$ü!"#$%&"!"#$#!"#$%!"##$ (!") 100 (Eşitlik 3.2) Misel Formülasyonlarından PTX in In Vitro Salımı PTX in Çözünürlük Çalışması Misel yapılarından in vitro PTX salımının değerlendirilmesi için öncelikle çözünürlük çalışması yapılır. Bu çalışmada, PTX in suda ve farklı konsantrasyonlarda sodyum salisilat (SS) çözeltilerindeki çözünürlüğü bulunur. SS ın, hidrotropik etki ile PTX çözünürlüğünü arttırdığı literatürde gösterilmiştir (188, ). Buna göre 0,5, 1, 2, 3 ve 4 molar (M) konsantrasyonda SS içeren çözeltiler hazırlanır. Bu çözeltiler amber renkli viallere konulur ve her bir viale

85 70 fazlası üzerinden PTX eklenir. Viallerin ağzı kapatılır ve manyetik karıştırıcıda, 37 C de 24 saat boyunca karanlık bir ortamda karıştırılır. 24 saatin sonunda örnekler alınır ve zaman kaybetmeden 0,2 µm lik filtrelerden süzülerek HPLC de analiz edilirler. SS in Misel Stabilitesi Üzerine Etkisi PTX çözünürlük çalışmasında kullanılan ve PTX misellerinden in vitro salım deneylerinde salım ortamı olarak kullanılacak olan SS çözeltisinin konsantrasyonunun belirlenmesi için, aynı zamanda bu maddenin miseller üzerindeki olumsuz etkileri de incelenmelidir. Bu amaçla, misel formülasyonları için hazırlanan etkin madde içermeyen polimer filmleri, son basamakta tampon yerine çalışılan farklı SS çözeltilerinde hidrate edilir. Oluşan misellerin partikül büyüklükleri Malvern NanoZS cihazında ölçülerek, misel yapısında bozulmalara ve büyümeye sebep olan konsantrasyon belirlenir. In Vitro Salım Deneyleri Misel formülasyonlarının hazırlanmasını takiben PTX enkapsülasyon etkinlikleri HPLC ile tayin edilir ve in vitro salım çalışmalarında kullanılacak misellerin içerisindeki etkin madde miktarı/miktarları deney öncesinde tam olarak bulunur. Bulunan miktarlar göz önüne alınarak 0,5 mg PTX içeren misel dispersiyonu miktarı belirlenir ve diyaliz membranının içerisine yerleştirilir. Diyaliz membranı olarak Da MWCO değerine sahip, %0,05 sodyum azid içerisinde saklanan rejenere selüloz membran kullanılır. Membran kullanılmadan önce ultra saf su ile en az üç defa yıkanarak sodyum azid kalıntıları uzaklaştırılmalıdır. Salım ortamı olarak 100 ml, 1M SS içeren çözelti kullanılır. Belirlenen zaman aralıklarında ortamdan 1 ml örnek alınır ve sink koşulların devamının sağlanması için örnek alımını takiben 1 ml taze ortam tekrar salım ortamına eklenir. Örnekler 0,2 µm lik filtrelerden süzüldükten sonra HPLC ile analiz edilir ve ortama salınan PTX miktarı kümülatif olarak bulunarak grafiğe geçirilir. In vitro salım çalışmaları üç tekrarlı olarak gerçekleştirilir.

86 Misel Formülasyonlarının AFM ile Görüntülenmesi Hazırlanan misel yapılarının görüntüleme çalışmalarında Gazi Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı nda bulunan AFM cihazı kullanılmış ve görüntülemeler Prof. Dr. Tuncer Değim tarafından gerçekleştirilmiştir. Görüntüleme çalışmaları etkin madde içermeyen miseller üzerinde gerçekleştirilmiştir Modifiye Misellerde TATp Aktivitesinin ELISA ile Kontrolü TATp ile modifiye edilen misellerde peptidin aktivitesinin korunduğunun gösterilmesi için ELISA protokolü kullanılmıştır. TATp i tanıması ve ona özgül olarak bağlanabilmesi için TATp poliklonal antikoru kullanılır. Bu antikorlar, diğer başka protein yapılarına değil sadece TATp e bağlanma özelliği göstermektedirler. Bu amaçla, belirtilen peptit ve antikoru kullanılarak, hızlı, doğru ve tekrar edilebilen sonuç veren ELISA yöntemi, denemeler sonucunda optimize edilerek aşağıda verilmiştir. Plakların Kaplanması 96 kuyucuklu plakların (Yüksek Bağlanma Kapasiteli ELISA Plakları, Greiner Bio-One, Almanya) her bir kuyucuğuna 100 µl TATp çözeltisi (PBS ph 7,4 içerisinde, 1 µg/ml konsantrasyonda) eklenir. Gece boyunca +4 C de inkübe edilir. 3 defa 200 µl yıkama tamponu (PBS+%0,05 (a/h) Tween 20) ile kuyucuklar yıkanır. Bloklama Her bir kuyucuğa 150 µl bloklama tamponu (yıkama tamponu içerisinde %0,5 (a/h) lik sığır serum albümini (BSA) çözeltisi) eklenir. Plaklar 1 saat boyunca oda sıcaklığında bloklama işlemi için inkübasyona bırakılır. Bu işlem sonrasında her bir kuyucuk 3 defa 200 µl yıkama tamponu ile yıkanır.

87 72 Primer Antikor ile Bağlanma TAT poliklonal antikoru bloklama tamponu içerisinde 1 µg/ml konsantrasyonda olacak şekilde dilüe edilir. Başka bir ilk kuyucuğa 300 µl antikor çözeltisi eklenir. Altındaki diğer kuyucuklara ise 200 µl bloklama tamponu eklenir. İlk kuyucuktan 100 µl alınır ve ikinci kuyucuğa eklenerek iyice pipetleme yoluyla iyice karıştırılır. Sonrasında ikinci kuyucuktan 100 µl alınarak 3. kuyucuğa eklenir ve bu işlem sırası son kuyucuğa kadar devam ettirilerek seri dilüsyonlar gerçekleştirilir. Dilüsyonların yapıldığı her bir kuyucuktan 100 er µl alınarak bloklama işlemi sonrasında yıkanan kuyucuklara eklenir. Plaklar oda sıcaklığında 2 saat boyunca inkübasyona bırakılır. Bu işlem sonrasında her bir kuyucuk 3 defa 200 µl yıkama tamponu ile yıkanır. Sekonder Antikor ile Bağlanma Her bir kuyucuğa 100 µl HRP (Horse Radish Peroxidase) konjuge Goat Anti-mouse IgG (Thermo Scientific, Rockford, IL, ABD) sekonder antikoru (1:2000 dilüsyon oranında) eklenir. Dilüsyon bloklama tamponu içerisinde yapılmıştır. Plaklar oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır. Bu işlem sonrasında her bir kuyucuk 3 defa 200 µl yıkama tamponu ile yıkanır. Görüntüleme Her bir kuyucuğa 100 µl TMB substrat çözeltisi (Thermo Scientific, Rockford, IL, ABD) eklenir. 605 nm de okuma yapılır. TATp in misellerin yüzeyine eklendikten sonra da aktivitesini koruduğunun gösterilmesi için ELISA plakalarının kuyucuklarına modifiye miseller konulmuş ve gece boyunca +4 C de inkübe edilmişlerdir. Sonrasında yukarıda verilen ELISA protokolü takip edilerek aktivite kontrolü gerçekleştirilmiştir.

88 Modifiye Misellerde 2C5 Aktivitesinin ELISA ile Kontrolü 2C5 monoklonal antikorunu ve bu antikor ile modifiye edilmiş misellerdeki aktivitesini kontrol etmek için aşağıda ayrıntıları verilen ELISA yöntemi kullanılır. 96 kuyucuklu plakların (Yüksek Bağlanma Kapasiteli ELISA Plakları, Greiner Bio-One, Almanya) her bir kuyucuğuna 200 µl bloklama tamponu (yıkama tamponu içerisinde %0,5 (a/h) lik sığır serum albümini (BSA) çözeltisi) eklenir. Plaklar 1 saat boyunca oda sıcaklığında inkübasyona bırakılır. Kuyucuklar 3 defa 200 µl yıkama tamponu (PBS+%0,05 (a/h) Tween 20) ile yıkanır. Her bir kuyucuğa bloklama tamponu içerisinde olan 50 µl nükleohiston çözeltisi (40 µg/ml) eklenir ve oda sıcaklığında 1 saat inkübe edilir. Kuyucuklar 3 defa 200 µl yıkama tamponu ile yıkanır. 2C5 içeren örnekler (antikor ya da miseller) bloklama tamponu içerisinde 10 µg/ml konsantrasyonda hazırlanır. İlk kuyucuğa 73 µl antikor çözeltisi eklenir. Bunu takip eden kuyucuklara ise 50 µl bloklama tamponu konur. İlk kuyucuktan 23 µl alınır ve sonraki kuyucuğa konarak karıştırılır. Sonrasında bu kuyucuktan 23 µl çekilir ve bir sonraki kuyucuğa konur. Aynı işlemler son kuyucuğa kadar tekrarlanır. En son kuyucuktan da 23 µl alınır ve atılır. Böylece her kuyucuğa 50 µl örnek uygulaması yapılır. 1 saat oda sıcaklığında inkübasyon yapılır. Kuyucuklar 3 defa 200 µl yıkama tamponu ile yıkanır. Her bir kuyucuğa 100 µl HRP (Horse Radish Peroxidase) konjuge Goat Anti-mouse IgG (Thermo Scientific, Rockford, IL, ABD) sekonder antikoru (1:5000 dilüsyon oranında) eklenir. Dilüsyon bloklama tamponu içerisinde yapılmıştır. Plaklar oda sıcaklığında 1 saat boyunca inkübasyona bırakılır.

89 74 Bu işlem sonrasında her bir kuyucuk 3 defa 200 µl yıkama tamponu ile yıkanır. Her bir kuyucuğa 100 µl TMB substrat çözeltisi (Thermo Scientific, Rockford, IL, ABD) eklenir. Renklenmenin başlangıcı beklenir ve sonrasında uygun bir absorbans değeri (0,2 ile 0,8 arası) elde edilene kadar beklenir. 605 nm de okuma yapılır Hücre Kültürü Çalışmaları Kullanılan Hücrelerde P-gp Varlığının Western Blot Analizi ile Kontrolü Tez çalışmalarında kullanılan MCF-7, MDCKII-MDR1 ve MDCKII- Parental hücre hatlarında P-gp varlığı ve aktivitesi araştırılması için Western Blot yöntemi kullanılır. Bu amaçla, belirtilen hücre hatları proteaz inhibitör kokteyli içeren RIPA tamponunda +4 C de parçalanır. Kullanılan RIPA tamponu ve proteaz inhibitör kokteyli bileşimi aşağıda verilmiştir. RIPA Tamponu Proteaz İnhibitör Kokteyli (Sigma, Katalog No: R0278) (Sigma, Katalog No: P2714) 50 mm Tris-HCl, ph 8,0 AEBSF [4-(2-Aminoetil) benzensülfonil florid hidroklorür] 150 mm sodyum klorür Aprotinin %1 NP-40 Bestatin hidroklorür %0,5 sodyum deoksikolat E-64 %0,1 sodyum dodesil sülfat EDTA Leupeptin hemisülfat tuzu Bu işlemi takiben hücreler, hücre kültürü kaplarının içerisinden hücre kazıyıcılar ile kaldırılır ve yine +4 C de rpm de 10 dakika santrifüj edilir. Her bir hücre hattından süpernatant toplanır ve -20 C de dondurularak analizlere kadar saklanır. Analiz yapılmak istendiğinde hücre eriyikleri çözündürülür, ve analizlerden önce BCA kiti kullanılarak içerdikleri protein miktarı bulunur. Her bir hücre hattından elde edilen eriyikler içerisindeki toplam protein miktarının bilinmesi önemlidir. Ayırım yapılacak olan jelin her bir uygulama kuyucuğuna

90 75 uygulanabilecek toplam protein miktarının bir sınırı vardır ve bu sınırın üzerindeki uygulamalarda kapasite aşımı sebebiyle uygun olmayan ayırım görülebilir. Hücre eriyikleri Laemmli tamponu (2x) içerisinde hacimce 1:1 seyreltilir. %8 lik SDS-PAGE jellerinin (Precise Protein Gels, Pierce, ABD) her bir kuyucuğuna µg protein gelecek şekilde uygulama hacmi hesaplanır ve uygulama yapılır. Ayırım için MiniProtean-III sistemi kullanılır ve ayırım boyunca voltaj 100 V da sabit tutulur. Örnekler ile birlikte molekül ağırlığı standartları da jele uygulanmıştır (Blue Prestained Molecular Weight Marker, Katalog No: 26681, Pierce, ABD). Ayırımın sonlanmasını takiben, jeller western blot analizi için hazırlanır. Jellerde yer alan proteinlerin transfer membranlarına (0,45 µm, Nitroselüloz membran, Pierce, ABD) aktarılması için ıslak transfer yöntemi kullanılır. Bu amaçla öncelikle transfer tamponu +4 C ye soğutulur ve jeller bu tampon içerisinde 10 dakika inkübe edilerek dengeye getirilir. Filtre kağıtları ve transfer membranı da transfer tamponu ile ıslatılır ve sonrasında aşağıda verilen sıra ile süngerler arasına dizilir; Katot (- yük ucu) Sünger 2 adet filtre kağıdı Jel Transfer membranı 2 adet filtre kağıdı Sünger Anot (+ yük ucu) Transfer işlemi +4 C de gece boyunca 30 V da yapılır. Transfer sırasında tankın içerisine yerleştirilen manyetik balık ile düzenli karıştırma uygulanır ve bu sayede transfer tamponunun homojen bir şekilde dağılması sağlanır. Transfer işleminin sonunda membran dikkatlice jelden ayrılarak transfer tamponu ile yıkanır. Bu işlemi takiben membran %5 BSA içeren

91 76 PBS-T tamponu içerisinde (hacimce %0,1 Tween 20 içeren PBS) bloklama işlemine tabi tutulur. 1 saat sonunda membran PBS-T ile yıkanır. Primer antikor olarak Anti Human P-gp Antikoru (C219, Calbiochem, ABD) bloklama tamponunda 1:500 oranında seyreltilerek uygulanır. Membran 1 saat boyunca primer antikor ile inkübe edilir ve sonrasında 3 defa PBS-T ile yıkanır. Primer antikor ile inkübasyondan sonra membran 1:2000 oranında bloklama tamponunda seyreltilmiş olan sekonder antikor ile (Anti Mouse IgG, HRP konjuge, Dako, Hollanda) 1 saat boyunca inkübe edilir. 3 defa PBS-T ile yıkamayı takiben membran ultra saf su ile yıkanır ve TMB substrat çözeltisi ile inkübe edilerek renk oluşumu sağlanır Kullanılan Hücrelerde P-gp Varlığının Akış Sitometrisi ile Kontrolü Analizi yapılacak olan MCF-7, MDCKII-MDR1 ve MDCKII-Parental hücre hatları çoğaltıldıktan ve konfluent hale geldikten sonra tripsinize edilerek kaldırılır ve sayılır. 2x10 5 adet hücre 25 cm 2 lik yüzey alanına sahip olan T25 hücre kültürü kaplarına ekilir ve 24 saat 37 C de tutulur. İnkübasyondan sonra hücreler hücre kültürü kaplarının içerisinde hücre kazıyıcılar ile kazınır ve süspansiyon haline getirilir. PBS ile yıkandıktan sonra 1800 rpm de beş dakika boyunca santrifüj edilirler. Çöken hücreler 200 µl PBS kullanılarak süspande edilirler ve sonrasında iki ayrı akış sitometrisi tüpüne ayrılırlar. Tüplerden biri özgün antikor uygulaması için diğeri de izotip kontrolü için kullanılır. Özgün antikor uygulanacak tüpe PE konjuge Anti-Human P-gp Antikoru (klon C219, Calbiochem, ABD), diğer tüpe ise PE konjuge IgG (klon ebr2a) izotip kontrol antikoru gerekli miktarlarda eklenir. Hücreler antikorlar ile +4 C de 30 dakika boyunca inkübe edilirler. İnkübasyonu takiben tüplere 2 ml PBS eklenir ve yine +4 C de 1800 rpm de santrifüj edilirler, sonrasında elde edilen süpernatant atılır. Hücre pelleti 500 µl PBS ile süspande edilir ve akış sitometrisi cihazında analizleri yapılır. Boyama yapılmış örneklerin analizinde FACSAria II akış sitometrisi cihazı (Becton Dickinson, ABD) kullanılmıştır. Pozitif hücrelerin yüzdesi ilgili izotip kontrolünün yüzdesiyle karşılaştırmalı olarak verilir.

92 Kullanılan Hücre Hatları ve Hücre Kültür Koşulları Tez çalışmalarında formülasyonların kanser hücreleri üzerindeki sitotoksisitelerinin araştırılması için farklı hücre hatları üzerinde çalışmalar yapılmıştır. Bu hücre hatları Caco-2, MCF-7, MDCKII-MDR1 ve MDCKII- Parental hücre hatlarıdır. Caco-2 hücreleri, membranlarında P-gp proteinini yüksek miktarda bulunduran hücrelerdir. Bu sebeple P-gp aktivitesi yüksektir ve bu durum P-gp substratı olan antikanser etkin maddelerin etkinliğini önemli ölçüde etkilemektedir. Caco-2 hücreleri model hücre olarak PTX ve CYC yi birlikte içeren misel yapılarının sitotoksisite çalışmalarında kullanılmışlardır. MCF-7 hücreleri ise son derece yaygın olarak kullanılan iyi karakterize edilmiş meme kanseri hücreleridir ( ). Tez çalışmalarımızda, MDR olmayan bir hücre hattı olması sebebiyle negatif kontrol grubu olarak kullanılmıştır. MDCKII-MDR1 hücreleri, MDCKII-Parental (wild type) hücre hattının insan P-gp proteinini kodlayan MDR1 geni ile transfekte edilmesi ile elde edilirler (198). İyi karakterize edilmiş ve üzerinde bir çok çalışma yapılmış olan MDCKII-MDR1 hücre hattı (199), transfekte edildiği gen sayesinde membranında P-gp nin aşırı ekspresyonuna sahiptir. Bu sebeple, her ne kadar insan kaynaklı bir hücre hattı olmasa da ilaç direnci çalışmalarında ve diğer hücre kültürü uygulamalarında geniş kullanım olanağı bulmuştur (200). MDCKII-Parental hücre hattı ise membranında P-gp içermediği için ilaç direnci göstermeyen ve MDCKII-MDR1 hücreleri için uygun bir pozitif kontrol grubu olan hücrelerdir ve bu sebeple çalışmalara dahil edilmiştir. MDCKII hücreleri Hollanda Kanser Enstitüsü nden Prof. Piet Borst ve Prof. ALfred Schinkel tarafından çalışma grubumuza hediye edilmiştir. Aşağıda kullanılan her bir hücre hattının büyütülmesinde kullanılan hücre kültürü ortamları verilmiştir. Hücreler bu ortamlar içerisinde 25 ya da 75 cm 2 lik yüzey alanına sahip T25 ya da T75 hücre kültürü kaplarında, 37 C de %5 CO 2 içeren inkübatörlerde büyütülür ve konfluent hale geldiklerinde pasajlanırlar.

93 78 Caco-2 hücreleri: RPMI 1640 %10 FBS (h/h) 50 U/mL Penisilin 50 µg/ml Streptomisin 2 mm L-Glutamin MDCKII (MDR1 ve Parental) ve : DMEM MCF-7 hücreleri %10 FBS (h/h) 50 U/mL Penisilin 50 µg/ml Streptomisin 2 mm L-Glutamin Hücreler konfluent hale geldiklerinde (kabın yüzeyinin %80 ini kapladıklarında) pasajlanır. Hücrelerin kapların yüzeyinden kaldırılmaları için tripsinizasyon işlemi uygulanır. Bu işlemde hücrelere %0,005 tripsin ve %0,002 EDTA içeren çözelti uygulanır ve inkübatörde hücreler kabın yüzeyinden ayrılana kadar bekletilir. Hücreler kabın yüzeyinden ayrıldıktan sonra ortamdaki tripsin ve EDTA yı inaktive etmek için, hücre süspansiyonu ortam içeren tüplere koyularak santrifüj edilir. Süpernatant atıldıktan sonra kalan hücre pelleti gerekli miktarda ortam ile süspande edilir ve hücreler yapılacak işleme göre ya yeni hücre kültürü kaplarına alınarak çoğaltılmaya devam edilir ya da gerekli analizler uygulanır Geliştirilen Formülasyonların Sitotoksisitelerinin Araştırılması Tripsinizasyon uygulanan hücreler sayılarak 96 kuyucuklu hücre kültürü plaklarının her bir kuyucuğa 5000 hücre/100 µl olacak şekilde ekim yapılır. Hücreler bir gün boyunca plakların tabanına tutunmaları için inkübatörde tutulurlar. Bu süre sonunda hücrelerin üzerlerindeki ortam atılır. Hazırlanan misel formülasyonları ya da etkin madde çözeltileri hücreler için kullanılan ortamlar içerisinde gerekli konsantrasyonlarda seyreltilir ve 100 µl hacminde hücrelere uygulanır. Kontrol grubu olarak sadece ortam uygulanan hücreler kullanılır.

94 79 Tez çalışmalarında kullanılan etkin maddeler (PTX, CYC ve ELC) suda çözünürlüğü olmayan etkin maddeler oldukları için, bu maddelerin çözeltileri %1 (hacimce) DMSO içeren ortam içinde hazırlanır. Kontrol grubu olarak da sadece %1 DMSO içeren ortam ile uygulama yapılmış hücreler kullanılır. Hücrelere uygulama sonrasında MCF-7 hücreleri için 24 ve 48 saatlik, Caco-2 hücreleri için 24 saatlik ve MDCKII-MDR1 hücreleri için 12, 24 ve 48 saatlik inkübasyon süreleri uygulanır. Bu sürelerin sonunda kullanılan canlılık tayin yöntemine göre işlemlere devam edilir. MTT ile canlılık tayini yapılan deneylerde, formülasyon ve etkin maddeler ile inkübasyon süresi sonunda kuyucuklara 25 µl MTT (Metil Tiazol Tetrazolyum Bromür) çözeltisi ilave edilmiştir (PBS içinde, 5 mg/ml). 4 saat inkübasyonu takiben kuyucukların üzerine 80 µl %45 dimetil formamid (DMF) içinde çözülmüş sodyum dodesil sülfat (SDS) çözeltisi (% 23, ph 4,7) ilave edilmiş ve bir gece inkübatörde bırakılmıştır. Bu sürenin sonunda plakalar alınmış ve mikroplaka okuyucuda 570 nm de kuyucuklardaki çözeltilerin absorbansları okunmuştur. WST-1 ile canlılık tayini yapılan deneylerde ise, inkübasyon süresi sonunda WST-1 karışımı (Clontech, CA, ABD) 1:10 seyreltme olacak şekilde (10 µl) kuyucuklara ilave edilmiştir. Plaklar yeterli renklenme olana kadar inkübatörde (37 C, %5 CO 2 ) tutulmuş ve sonrasında mikroplaka okuyucuda 440 nm de absorbans okumaları yapılmıştır. Sonuçlar değerlendirilirken, kontrol grubunun canlılığı %100 kabul edilerek karşılaştırmalı olarak grafiklenmiş ve gerekli istatistiksel analizler yapılarak gruplar arasındaki farklılıklara bakılmıştır. Analizlerde α serbestlik derecesi 0,05 olarak alınmış ve Mann-Whitney U testi kullanılmıştır.

95 80 4. BULGULAR 4.1. Çalışmalarda Kullanılacak Polimerlerin Sentezi ve Karakterizasyonu pnp-peg-pe Bileşiğinin Sentezi Bölüm de verilen yönteme göre, pnp-peg-pe bileşiğinin sentez işlemi gerçekleştirilebilmiştir. Reaksiyon süresince azot gazı altında çalışılmış ve reaksiyon gerçekleşirken ortaya çıkan sarı renk düzenli olarak gözlenmiştir. Reaksiyon süresince belirli aralıklar ile reaksiyon kabından örnekler alınmış ve İTK analizleri uygulanarak sentezin takibi yapılmıştır. PE ve PEG standartları İTK kolonuna örnek ile birlikte uygulanmış ve PE bileşiğine ait noktanın üründe kaybolması ve PEG ile PE standartlarına ait noktaların arasında yeni bir noktanın belirmesi ile reaksiyonun tamamlandığı anlaşılmıştır. Sentez işlemi bittikten sonra saflandırma basamakları uygulanmıştır. Aşağıda verilen örnek Şekil 4.1 de bu saflaştırma işlemi sonrasında elde edilen fraksiyonların İTK ile incelendikten sonra plağın önce iyot ardından Dragendorff reaktifi ile boyanması sonucu elde edilen sonuçları göstermektedir PEG Standart Şekil 4.1. pnp-peg-pe bileşiğinin kolondan saflandırma sonucunda elde edilen fraksiyonlarının İTK ile analizi.

96 81 Bu sonuçlara göre toplanan fraksiyonlardan 3-6 arası saf bileşiği içerirken, 7-12 arası saf pnp-peg-pe ve serbest PEG bileşiğini içermektedir pnp-peg-pe Bileşiğinin 1 H-NMR ile Karakterizasyonu Sentezi yapılan pnp-peg-pe bileşiğinin 1 H-NMR spektrumları Şekil 4.2 de verilmektedir. Polimer sentezinin hem sentez süresince hem de sentez ve ardından saflandırma sonrasında İTK ile kontrolüne ilave olarak gerçekleştirilen bu karakterizasyon çalışmasında, reaksiyona giren her bir bileşik ve ürün için spektrumlar incelenmiştir. Şekil 4.2 de bu spektrumlar pnp-peg pnp, DOPE ve pnp-peg-pe için sırasıyla (A), (B) ve (C) olarak gösterilmiştir. pnp-peg pnp bileşiğine ait spektrumda 7-7,5 ppm aralığında bileşikte yer alan fenil grupları kaynaklı aromatik H ler görülmektedir. 4 ppm de gelen O-CH 2 ye ait H ler de spektrumda görülebilmektedir. DOPE nin spektrumu incelendiğinde, 1-5 ppm aralığında gelen alkil zinciri H leri görülebilmektedir. pnp-peg-pe ürününe ait son spektrumda ise hem yaklaşık 7 ppm de gelen aromatik H lere ait pikler, hem de DOPE nin alkil zincirleri H lerine ait pikler spektrumda yer almaktadır.

97 82 Şekil 4.2. pnp-peg-pe sentezine ait bileşiklerin 1H-NMR spektrumları.

98 Analitik Miktar Tayini Yöntemleri PTX in Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatografisi (HPLC) ile Miktar Tayini Bölüm de verilen şartlar kullanılarak yapılan miktar tayininde öncelikle PTX standart çözeltisi (1 100 µg /ml, metanol içerisinde) sisteme verilerek mobil fazın bileşimi ayarlanmış ve bu sayede PTX e ait cevap pikinin 10 dakikalık analiz süresi içerisine çekilmesi sağlanmıştır. Aşağıdaki şekilde PTX e ait cevap pikinin bulunduğu örnek bir kromatogram verilmiştir. Şekil µg/ml konsantrasyonda PTX standart çözeltisinin örnek kromatogramı. Aşağıda sırası ile Bölüm içerisinde verilen yöntemlere göre incelenen validasyon parametreleri ile ilgili bulgular verilmiştir. Özgünlük (Seçicilik) Kullanılan yöntemin araştırılan etkin madde PTX i özgün bir şekilde tayin edip etmediğinin araştırılması için bakılan bu parametrede formülasyonlarda kullanılan yardımcı bileşenler, yardımcı maddeler ve salım ortamı HPLC sistemine enjekte edilmiş ve herhangi birine ait cevap pikinin PTX ile çakışmadığı görülmüştür. Bu sayede kullanılacak analitik yöntemin, analizi yapılacak etkin maddeyi özgün bir şekilde ve yeterli hassaslıkla tayin edebildiği gösterilmiştir.

99 84 Doğrusallık Hazırlanan standart çözeltilerin sisteme enjekte edilmesi ile elde edilen cevap piklerinin alanları kullanılarak PTX için hazırlanan kalibrasyon doğrusu ve denklemi Şekil 4.4 te verilmiştir y = 18,514x + 6,4988 R² = 0,9999 Pik alanı (mau) Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.4. PTX için kullanılan HPLC yönteminden elde edilen kalibrasyon doğrusu ve denklemi (n=6). Şekilden de görülebileceği üzere kalibrasyon denkleminin R 2 (regresyon katsayısı) değeri 1 e çok yakın bir değerdir. Bu durum PTX konsantrasyonu ile pik alanı arasındaki ilişkinin incelenen konsantrasyon aralığında doğrusal olduğunu göstermektedir. Kesinlik Tekrar edilebilirlik ve tekrar elde edilebilirliğin incelendiği kesinlik parametresine ait sonuçlar ve yorumları aşağıda verilmiştir. Tekrar Edilebilirlik Analitik yöntemin tekrar edilebilirliğini göstermek için yapılan çalışmadan elde edilen sonuçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir. % varyasyon katsayısı % 2 den düşük bulunmuştur. Buna göre yöntem tekrar edilebilirdir.

100 85 Tablo 4.1. PTX için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen tekrar edilebilirlik sonuçları (n=6). Konsantrasyon (µg/ml) X±SS %VK 1 0,92 ± 0,01 1, ,03 ± 0,06 0, ,22 ± 0,45 0,45 Tekrar Elde Edilebilirlik Yöntemin tekrar elde edilebilirliğini göstermek için çalışılan 1, 10 ve 100 µg/ml lik konsantrasyonlara ait sonuçlar Tablo 4.2 de verilmiştir. Tablo 4.2. PTX için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen tekrar elde edilebilirlik sonuçları (n=6). Konsantrasyon (µg/ml) X±SS %VK 1 0,93± 0,02 1, ,39± 0,15 1, ,67± 0,55 0,53 Tablo 4.1 ve 4.2 den de görülebileceği üzere kesinlik parametreleri için bulunan %VK değerlerinin hepsi kabul sınırı olan %2 den küçük bulunmuştur. Bu sonuçlara göre analitik yöntemin kesinliği gösterilmiştir. Doğruluk Deneylerden elde edilen sonuçlar ve Bölüm de verilen denklemden elde edilen değerlerin özetlendiği tablo aşağıda verilmiştir. Tablo 4.3. PTX için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen doğruluk sonuçları (n=6). Konsantrasyon (µg/ml) X±SS % Ortalama Bağıl Hata 1 0,93 ± 0,02 7, ,39 ± 0,15 3, ,67± 0,55 3,67

101 86 Tabloda verilen değerlerden görülebileceği üzere nominal değerden ±%15 in üzerinde bir sapma bulunmamıştır. Bu sonuçlar ışığında yöntemin doğruluğu gösterilmiştir PTX ve CYC için HPLC ile Miktar Tayini PTX ile CYC nin birlikte tayin edilebilmesi için geliştirilen analitik yönteme ilişkin sonuçlar aşağıda verilmiştir. Kullanılan gradient elüsyon yöntemi ile her iki etkin madde de yeterli rezolüsyon ile birbirinden ayrılmış ve cevap pikleri elde edilebilmiştir. Paklitaksel Siklosporin A Şekil µg/ml konsantrasyonda PTX ve CYC içeren standart çözelti kromatogramı. Yukarıdaki şekilden de görülebileceği gibi her iki etkin madde de keskin ve simetri faktörü yüksek olan cevap pikleri vermiştir. Şekilde kırmızı ile belirtilen eğriler sistemin basınç eğrileridir. Kromatogramlarda verilen sistem basıncı incelendiğinde gradient elüsyondaki mobil faz değişiminin yol açtığı basınç farkının, etkin maddelerin pik verdiği noktaları etkilememesi

102 87 sağlanmıştır. Bu sayede analitik açıdan uygun bir analiz ve ayırım elde edilebilmiştir. Özgünlük İki madde için kullanılan tayin yönteminde öncelikle her iki maddenin birbiri ile girişim yapmasını önlemek için mobil faz bileşimi ve gradient elüsyon şeması belirlenmiştir. Sonrasında ise, formülasyon bileşenleri, yardımcı maddeler ve salım ortamı sisteme enjekte edilmiş ve bu maddelerden gelen piklerin analizi yapılacak etkin madde pikleri ile girişim yapmadığı görülmüştür. Doğrusallık PTX ve CYC nin, sadece PTX için kullanılan yöntemden farklı olarak 0,5-100 µg/ml konsantrasyon aralığında hazırlanan standart çözeltileri kullanılarak yapılan doğrusallık çalışmasında elde edilen sonuçlar ve grafik aşağıda verilmiştir. Her iki madde için de kullanılan kromatografik sistemde ve çalışılan aralıkta sonuçlar doğrusal olarak bulunmuştur. Şekil 4.6. PTX ve CYC için kullanılan HPLC yönteminden elde edilen kalibrasyon doğrusu ve denklemi (n=6). Şekilden de görülebileceği üzere PTX ve CYC için elde edilen R 2 değerleri 1 çok yakındır. CYC için 205 nm de PTX için de 229 nm de elde

103 88 edilen cevap konsantrasyon ile doğru orantılıdır ve doğrusallık göstermektedir. Kesinlik Yöntemin kesinlik parametresi hem PTX hem de CYC için incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar aşağıda sunulmuştur. Tekrar Edilebilirlik Tablo 4.4. PTX ve CYC için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen tekrar edilebilirlik sonuçları (n=6). PTX CYC Konsantrasyon (µg/ml) X±SS %VK 0,5 0,57 ± 0,01 1, ,92 ± 0,14 1, ,04 ± 1,22 1,21 1 1,08 ± 0,02 1, ,10 ± 0,21 2, ,75 ± 0,99 1,01 Elde edilen sonuçlar incelendiğinde varyasyon katsayılarının %2 den küçük oluşu yöntemin tekrar edilebilir olduğunu göstermektedir. Tekrar Elde Edilebilirlik Tablo 4.5. PTX ve CYC için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen tekrar elde edilebilirlik sonuçları (n=6). PTX CYC Konsantrasyon (µg/ml) X±SS %VK 0,5 0,55 ± 0,01 1, ,91 ± 0,08 0, ,14 ± 1,00 0,99 1 1,11 ± 0,06 5, ,66 ± 0,19 1, ,00 ± 1,41 1,44 Doğruluk PTX ve CYC için kullanılan HPLC yönteminde 1, 10 ve 100 µg/ml lik konsantrasyonlar kullanılmış ve doğruluk değerleri hesaplanarak aşağıdaki tabloda sunulmuştur.

104 89 Tablo 4.6. PTX ve CYC için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen doğruluk sonuçları (n=6). PTX CYC Konsantrasyon (µg/ml) X±SS % Ortalama Bağıl Hata 0,5 0,55 ± 0, ,91 ± 0,08 0, ,14 ± 1,00-0,14 1 1,11 ± 0, ,66 ± 0,19 3, ,00 ± 1, PTX ve ELC için HPLC ile Miktar Tayini PTX ve ELC nin birlikte tayini için geliştirilen analitik tayin yönteminde özellikle ELC ye ait cevap pikinin kuyruklanma göstermemesi ve her iki maddenin de simetri oranı yüksek cevap pikleri vermesi sağlanmıştır. ELC için hem UV hem de floresans dedektör kullanılarak tayin yapılmıştır. Aşağıdaki şekilde örnek olarak seçilen konsantrasyonlarda uygulanan PTX ve ELC ye ait cevap piklerini içeren kromatogram yer almaktadır. Şekil µg/ml ELC ve 50 µg/ml PTX içeren standart çözeltiye ait kromatogramlar.

105 90 Özgünlük Kullanılan analitik yöntemin PTX ve ELC ye ait cevap piklerini özgün bir şekilde tayin edip etmediğinin araştırılması için bakılan özgünlük parametresinde formülasyonlarda kullanılan yardımcı bileşenler, yardımcı maddeler ve salım ortamı HPLC sistemine enjekte edilmiş ve herhangi birine ait cevap pikinin PTX ya da ELC ile çakışmadığı görülmüştür. Bu sayede kullanılacak analitik yöntemin, analizi yapılacak etkin maddeyi özgün bir şekilde ve yeterli hassaslıkla tayin edebildiği gösterilmiştir. Doğrusallık Bölüm te verilen konsantrasyon aralığında hazırlanan PTX (0, µg/ml) ve ELC (0,05 10 µg/ml) standart çözeltileri HPLC sistemine enjekte edildikten sonra elde edilen cevap piklerinin alanı, konsantrasyona karşı grafiklenmiş ve aşağıdaki grafiklerde verilen doğrular elde edilmiştir. Yapılan regresyon analizi sonucunda bulunan korelasyon katsayılarının yüksekliği yöntemin son derece doğrusal olduğunu göstermektedir. PTX için 229 nm de elde edilen pik alanları kullanılmıştır. ELC için ise hem 258 nm de hem de floresans dedektörü kullanılarak elde edilen pik alanları kullanılarak yöntemin doğrusallığı araştırılmış ama daha doğrusal sonuç vermeleri ve cevap şiddetinin daha yüksek olması sebebiyle floresans dedektörü ile Eksitasyon 265 nm/emisyon 485 nm kullanılarak tayin edilen değerler ile çalışmalara devam edilmiştir.

106 91 Şekil 4.8. PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminden PTX için elde edilen kalibrasyon doğrusu ve denklemi (n=6). Şekil 4.9. PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminden ELC için elde edilen kalibrasyon doğrusu ve denklemi (n=6).

107 92 Kesinlik Kesinlik parametresi için tekrar edilebilirlik ve tekrar elde edilebilirlik değerlendirilmiştir. Elde edilen sonuçlar aşağıdaki tablolarda verilmiştir. Tekrar Edilebilirlik PTX için 10 µg/ml, ELC için ise 0,05 µg/ml konsantrasyonu seçilmiştir. Tablo 4.7. PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminde elde edilen tekrar edilebilirlik sonuçları (n=6). PTX ELC X±SS %VK X±SS %VK 9,91 ± 0,08 0,83 0,053 ± 0,0007 1,48 Tekrar Elde Edilebilirlik Tekrar elde edilebilirlik parametresi için ise PTX in 0,5, 10 ve 50 µg/ml konsantrasyonları, ELC için ise 0,05, 0,5 ve 10 µg/ml konsantrasyonları kullanılmıştır. Her bir konsantrasyondaki çözeltiler 6 şar defa ayrı ayrı hazırlanmış ve birer kez HPLC ile analiz edilmiştir. Elde edilen bulgular aşağıdaki tablolarda gösterilmiştir. Tablo 4.8. PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminde PTX için elde edilen tekrar elde edilebilirlik sonuçları (n=6). Konsantrasyon (µg/ml) X±SS %VK 0,5 0,52 ± 0,01 1, ,69 ± 0,02 0, ,68 ± 0,10 0,19

108 93 Tablo 4.9. PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminde ELC için elde edilen tekrar elde edilebilirlik sonuçları (n=6). Konsantrasyon (µg/ml) X±SS %VK 0,05 0,053 ± 0,001 1,527 0,5 0,479 ± 0,004 0, ,968 ± 0,015 0,150 Hem tekrar edilebilirlik hem de tekrar elde edilebilirlik sonuçlarından elde edilen bulgular değerlendirildiğinde, bütün sonuçların kesinlik parametresi için uygun olduğu sonucuna ulaşılabilir. Doğruluk Hesaplanan doğruluk verileri aşağıdaki tablolarda verilmiştir. PTX ve ELC için yapılan doğruluk çalışmasında, tekrar elde edilebilirlik çalışmasında kullanılan konsantrasyonlar kullanılmıştır. Tablo PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminde PTX için elde edilen doğruluk sonuçları (n=6). Konsantrasyon (µg/ml) X±SS %Ortalama Bağıl Hata 0,5 0,52 ± 0,01 4, ,69 ± 0,02 3, ,68 ± 0,10 5,30 Tablo PTX ve ELC için kullanılan HPLC yönteminde ELC için elde edilen doğruluk sonuçları (n=6). Konsantrasyon (µg/ml) X±SS %Ortalama Bağıl Hata 0,05 0,053 ± 0,001 6,00 0,5 0,479 ± 0,004 4, ,968 ± 0,015 0,32

109 Etkin Madde İçermeyen Misel Formülasyonlarının Hazırlanması Kullanılan polimerlerin tek başına ve/veya Vitamin E ile birlikte oluşturacağı misel yapılarının optimizasyonunun sağlanması için formülasyon geliştirme çalışmaları yapılmıştır. Hem formülasyona giren Vitamin E nin etkisi hem de farklı son misel konsantrasyonları çalışılmıştır. Sadece PEG-PE ya da farklı molar oranlarda Vitamin E içeren boş misel yapıları Bölüm 3.5 de açıklanan yönteme göre sorunsuz üretilebilmişlerdir. Polimer filmlerinin oluşturulmasını takiben tampon ile hidrate edilen formülasyonlar, şeffaf, saydam ve renksiz misel dispersiyonları oluşturmuşlardır Etkin Madde İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı Etkin madde olarak sadece PTX içeren misel formülasyonları üretiminde Bölüm de verilen yöntem izlenmiştir. Polimerin ağırlıkça farklı yüzdelerine denk gelen miktarlar PTX in eklenmesi ile oluşturulan misel yapılarında üretim esnasında bir sorun ile karşılaşılmamıştır. Her farklı yüzdede PTX misel yapıları içerisine alınabilmiştir. Bununla birlikte hapsedilemeyen PTX in 0,2 µm lik filtrelerden süzülerek uzaklaştırılabilmesi mümkün olmuştur PTX ve CYC İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX ve CYC yi birlikte içeren misel formülasyonlarının hazırlanması gerçekleştirilmiş ve Bölüm de verilen üretim yöntemi başarı ile uygulanabilmiştir. PTX ile aynı yüzdelerde başlangıç yüklemesi olan CYC nin işleme katılması, bir soruna ya da üretim yönteminde bir iyileştirme yapılmasına yol açmamıştır PTX ve ELC İçeren Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PTX ve ELC yi birlikte içeren misellerin hazırlanmasında Bölüm te verilen yöntem kullanılmıştır. Sadece PTX ya da PTX ve CYC yi birlikte

110 95 içeren formülasyonlardan farklı olarak, PTX için sadece iki farklı yükleme oranı denenmiştir (polimer ağırlığının %5 ve %10 u kadar). ELC için ise teorik son konsantrasyon 25 µm olacak şekilde sabitleme yapılarak misel formülasyonları hazırlanmıştır. Formülasyonların hazırlanmasında herhangi bir zorlukla karşılaşılmamış ve önceki bölümlerde verilen şekilde formülasyonlar üretilebilmiştir Ligand ile Modifiye Edilen Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı Bölüm 3.7 de hazırlanan pnp-peg-pe bileşiğine ligand (TATp ya da 2C5) konjugasyonu ve sonrasında misellerin hazırlanışı ayrıntılı olarak anlatılmıştır. pnp-peg-pe bileşiğinde yer alan pnp grubunun bazik ortamda hidroliz olması ile birlikte yerine serbest amin grubu içeren ligand (TATp ya da 2C5) girebilmiş ve bu sayede TATp-PEG-PE ya da 2C5-PEG-PE bileşiği oluşturulabilmiştir. Ayrıca konjugasyon sonrası gerçekleştirilen diyaliz işlemi ile hem serbest hale geçen pnp grupları hem de konjuge olmamış ligand ortamdan uzaklaştırılabilmiştir. Konjugasyon süresince açığa çıkan açık sarı renk, pnp gruplarının hidrolizinin ve buna bağlı olarak yer değiştirme reaksiyonu sonucu ligandın PEG-PE molekülünün ucuna tutunduğunun göstergesi olarak kabul edilmiştir. Reaksiyon sonucunda herhangi bir agregat oluşumu gözlenmemiş ve Ligand-PEG-PE miselleri oluşturulabilmiştir. Bu misel yapıları daha sonra hazırlanan ve yine PEG-PE ve etkin maddeleri içeren polimer filminin hidrate edilmesinde başarı ile kullanılabilmiştir. Ligand ile modifiye edilmiş misel yapılarının hazırlanmasında her bir P-gp inhibitörünü içeren misellerin hazırlanmasında kullanılan formülasyonlar kullanılmıştır. Bu bakımdan Ligand-PEG-PE misellerinin hazırlanması kısmı her bir formülasyon için aynı olmakla birlikte, etkin maddeleri içeren ana misel yapılarının hazırlanması farklılık göstermektedir.

111 96 Şekil Ligandın (TATp ya da 2C5) yapısındaki NH 2 aracılığı ile misel yapısına girecek lipitler ile konjugasyonu Hazırlanan Misel Formülasyonlarının Karakterizasyonları Kritik Misel Konsantrasyonunun Belirlenmesi ve Misel Oluşumunun Doğrulanması Pyrene metoduna göre gerçekleştirilen çalışmada, hem sadece PEG- PE miselleri hem de PEG-PE/Vitamin E misel formülasyonlarının kritik misel konsantrasyonları araştırılmıştır. Bu amaçla Bölüm de verilen misel konsantrasyonu aralığı kullanılmıştır. Pyrene metodu ile yapılan analizlerde PEG-PE misellerindeki ani floresans şiddeti artışı 0,01 mm konsantrasyonda görülürken, PEG-PE/Vitamin E misellerinde bu artış 0,001 mm konsantrasyonda görülmüştür. Misel oluşumunun doğrulanması için yine Bölüm de verilen boyut ayırma kromatografisi şartları da kullanılmıştır. Bu analizde belirli molekül ağırlığındaki materyallerin geçişine izin veren por büyüklüğüne sahip bir analiz kolonu kullanılarak, HPLC sistemine enjekte edilen örnekte yer alan farklı molekül büyüklüğüne sahip bileşiklerin sırası ile farklı zamanlarda sürüklenmeleri esası temel alınmıştır. Büyük molekül ağırlığına sahip olan moleküller kolonun porları arasına girmeyerek hızla kolon boyunca ilerler ve kolonu daha erken terk ederler. Bununla birlikte küçük molekül ağırlığına sahip olan moleküller, kolon porları arasında girerek takılırlar ve mobil faz ile

112 97 yavaş yavaş porlar arasından sürüklenerek kolonu daha geç bir sürede terk ederler. Aşağıdaki şekillerde PEG-PE miselleri ve PEG-PE/Vitamin E (85:15) misellerinin analizi sonucunda elde edilen kromatogramlar verilmiştir. Şekillerden de görülebileceği üzere misel yapıları büyüklüklerine bağlı olarak kolondan daha erken çıkmış ve cevap piki görülebilmiştir. Şekil 4.11 de yaklaşık olarak 9,5 dakikada gelen pik, oluşan PEG-PE misellerine ait piktir. 0,01 mm konsantrasyonda misel içeren çözeltide misellere ait pik halen görülebilirken, 0,001 mm lık çözeltide misel pikinin kaybolduğu gözlenmektedir. Bu durum pyrene metodu ile PEG-PE miselleri için elde edilen kritik misel konsantrasyonu değerleri ile uyumlu bir sonuç olarak karşımıza çıkmaktadır. Şekil 4.12 de yer alan kromatogramlar ise PEG-PE/Vitamin E (85:15) misellerine ait analiz sonuçlarıdır. Aynı şekilde kromatogramlar incelendiğinde 0,001 mm lik konsantrasyonda bile halen misel oluşumuna ait pik gözlemlenebilmektedir. Bu sonuçlara göre misel yapılarına katılan Vitamin E nin kritik misel konsantrasyonunu düşürdüğü ve daha düşük konsantrasyonlarda bile misel oluşumunu sağlayabildiği anlaşılabilir.

113 98 10 mm 1 mm 0,1 mm 0,01 mm 0,001 mm 0,0001 mm Şekil PEG-PE misellerinin boyut ayırma HPLC analizi ile elde edilen kromatogramları.

114 mm 0,1 0,01 mm 0,001 0,0001 0,00001 mm Şekil PEG-PE/Vitamin E (85:15) misellerinin boyut ayırma HPLC analizi ile elde edilen kromatogramları.

115 Misellerin Partikül Büyüklüğü ve Zeta Potansiyeli Ölçümleri PTX içeren misellerin üretiminde kullanılan formülasyon ile hazırlanan misel filmlerinin hidrate edilmesi ile oluşan, 1 ve 10 mm konsantrasyondaki misel dispersiyonlarının partikül büyüklüğü sonuçları aşağıda verilmiştir. Tablodan da görülebileceği üzere daha yüksek oranda Vitamin E içeren misellerin partikül büyüklükleri istatistiksel olarak anlamlı bir farkla daha yüksek bulunmuştur (P<0.05). Etkin madde olarak kullanılan PTX in yükleme oranı polimerin ağırlıkça %10 udur. Karşılaştırma Mann-Whitney U testi ile gerçekleştirilmiştir. Tablo mm lık misel formülasyonlarının karakterizasyonları (n=6, Ortalama±Standart Sapma). Partikül Büyüklüğü Zeta Potansiyeli Formülasyon (nm) (mv) PEG-PE (Boş) 11,2 ± 1,2-11,6 ± 3,1 PEG-PE/Vit. E (85:15) (Boş) 23,9 ± 2,0-7,7 ± 1,2 PEG-PE/Vit.E (95:5) (Boş) 20,1 ± 0,3-9,0 ± 0,4 PEG-PE 14,5 ± 3,5-22,9 ± 0,4 PEG-PE/Vit. E (85:15) 23,1 ± 0,3-24,6 ± 0,2 PEG-PE/Vit.E (95:5) 21,4 ± 0,2-34,4 ± 3,0 Aynı zamanda son misel materyali konsantrasyonundaki değişikliğin de misellerin partikül boyutu ve zeta potansiyelleri üzerine etkileri de incelenmiştir. Ayrıca etkin madde olarak sadece PTX değil, aynı zamanda CYC de misel yapılarına yüklenmiş ve istenen amaç için hazırlanan misel formülasyonlarının partikül büyüklükleri analizleri yapılmıştır. Buna göre elde edilen sonuçlar aşağıdaki tabloda (Tablo 4.13) özetlenmiştir. Tabloda verilen değerler en yüksek yükleme etkinliğinin elde edildiği formülasyon olan, polimerin ağırlıkça %10 u kadar PTX ve CYC yüklenen misellere ait değerlerdir.

116 101 Tablo mm lık misel formülasyonlarının karakterizasyonları (n=6, Ortalama±Standart Sapma). Formülasyon Partikül Büyüklüğü (nm) Zeta Potansiyeli (mv) PEG-PE (Boş) 10,5 ± 0,1-12,0 ± 0,6 PEG-PE/Vit. E (85:15) (Boş) 23,5 ± 1,3-6,9 ± 2,5 PEG-PE/Vit.E (95:5) (Boş) 21,2 ± 1,2-9,3 ± 0,8 PEG-PE 11,3 ± 0,8-19,1 ± 2,4 PEG-PE/Vit. E (85:15) 21,7 ± 1,5-19,9 ± 0,8 PEG-PE/Vit.E (95:5) 19,0 ± 1,8-21,2 ± 1,1 Tablo 4.12 ve 4.13 de verilen ve etkin madde içermeyen misel formülasyonlarının partikül büyüklükleri karşılaştırıldığında, 1 ve 10 mm lık misel materyali konsantrasyonları arasında anlamlı bir fark olmadığı görülmüştür. Bu sebeple 10 kat daha fazla polimer kullanımının önüne geçmek için 1 mm lık misel son konsantrasyonu elde edilecek şekilde hazırlanan misellere PTX ve CYC birlikte yüklenerek partikül büyüklükleri ölçülmüştür. Hazırlanan bütün formülasyonların partikül büyüklükleri ortalama 25 nm den düşüktür. Tek başına PTX ya da PTX ile CYC içeren misel formülasyonlarının hepsinde polidispersite indeksi değerleri 0,2 nin altında bulunmuştur. Ayrıca Tablo 4.12 ve 4.13 de verilen sonuçlar, hem etkin madde içermeyen misellerin hem de etkin madde içerenlerin net bir negatif yük taşıdığını göstermektedir. PTX ile birlikte ELC içeren misellerin hazırlanmasında ise farklı bir yöntem kullanılmıştır. Yapılan ön denemeler ışığında Vitamin E nin farklı konsantrasyonları kullanılarak hazırlanan formülasyonlar içerisinden PEG- PE:Vitamin E mol oranı 90:10 olan miseller seçilmiş ve sonuçlar aşağıdaki tabloda verilmiştir. PTX ve ELC yi birlikte içeren misel formülasyonlarında da son misel materyali konsantrasyonu 1 mm dır. Hazırlanan formülasyonların kodları ve bileşimleri ise Bölüm de yer almaktadır.

117 102 Tablo PTX ve ELC içeren formülasyonlara ait partikül büyüklüğü, zeta potansiyeli ve polidispersite indeksi sonuçları (n=6). Formülasyon Partikül Boyutu (nm, X±SS) PDI (X±SS) Zeta Potansiyeli (mv, X±SS) A 25.48± ± ,60 ± 7,70 B 18.97± ± ,40 ± 2,10 C 16.33± ± ,60 ± 5,80 D 16.31± ± ,30 ± 8,20 Sonuçlara bakıldığında A ve B formülasyonlarının (Vitamin E içeren formülasyonlar) partikül büyüklüğü ve polidispersite indeksi bakımından istenmeyen değerlere sahip oldukları görülmüştür. C ve D formülasyonlarından (Vitamin E içermeyen) elde edilen sonuçlar bu iki parametre açısından daha uygun bulunmuştur. Ligand ile modifiye edilen miseller (TATp ya da 2C5 modifiye) partikül büyüklüğü ya da zeta potansiyeli açısından modifiye olmayan misellerden istatistiksel olarak anlamlı bir fark göstermemişlerdir. Bu durum, ligand modifikasyonunun misel yapılarında herhangi bir olumsuz etkiye ya da yüzeyde yük değişimine neden olmadığını göstermektedir PTX in Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği ve Miseller Çözünürlüğünün Araştırılması Misel yapıları içerisine tek başına PTX yüklemesi ile elde edilen sonuçlar aşağıda Tablo 4.15 de verilmiştir. PTX in başlangıç yükleme oranı olarak Bölüm de verilen yükleme % leri kullanılmıştır. Miseller hazırlandıktan sonra enkapsüle olmayan PTX in ortamdan uzaklaştırılması için 0,2 µm lik filtrelerden süzme işlemi misel yapıları üzerinde herhangi bir olumsuz etkiye yol açmamıştır.

118 103 Tablo mm konsantrasyonda hazırlanan misel formülasyonlarına hapsedilen PTX miktarı (n=3). Formülasyon Yükleme etkinliği (%) Misel içerisindeki ilaç miktarı (%) ml misel dispersiyonundaki ilaç miktarı (µg) PEG-PE 20,3 ± 3,8 0,96 ± 1,3 292,1 PEG-PE/Vit. E (85:15) PEG-PE/Vit.E (95:5) 77,0 ± 4,7 3,62 ± 0,1 1095,7 66,7 ± 3,9 3,14 ± 0,7 948,5 Tabloda verilen sonuçlar polimerin ağırlıkça %10 u kadar PTX kullanılan formülasyona ait verilerdir. Bu başlangıç konsantrasyonu en yüksek yükleme etkinliğine ve misel tarafından tutulabilen etkin madde miktarına ulaşmayı sağlamıştır. Tablodan görülebildiği gibi sulu ortamda çözünürlüğü sadece 0,3 µg/ml olan PTX in çözünürlüğü miseller çözünürleştirici etki ile, tek başına enkapsüle edildiği formülasyonlarda yaklaşık 1 mg/ml değerine kadar çıkartılabilmiştir. Yüksek oranda vitamin E kullanılması PTX in enkapsülasyonunu da arttırmıştır PTX ve CYC nin Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği Tablo 4.16, 1 mm konsantrasyonda ve hem PTX hem de CYC nin aynı anda yüklendiği formülasyonlara ait yükleme etkinliklerini göstermektedir. Suda çözünürlüğü olmayan PTX ve CYC, hem misel yapıları içerisine etkin bir şekilde enkapsüle edilebilmiş, hem de çözünürlükleri miseller çözünürleştirici etki ile önemli oranda arttırılabilmiştir. İki etkin maddeyi de içeren misel formülasyonları hazırlandıktan sonra miseller hacimce 70:30 asetonitril:su karışımında çözülmüşlerdir. İki etkin maddenin birlikte miktar tayini için kullanılan gradient HPLC yönteminde başlangıç oranı hacimce 52:48 asetonitril:su olmasına karşılık, bu karışım misel yapıları etkin bir şekilde çözememiştir. Bu sebeple misel yapılarını çözmek için kullanılan organik faz oranı arttırılmıştır.

119 104 Tablo mm konsantrasyonda hazırlanan misel formülasyonlarına hapsedilen PTX ve CYC miktarları (n=3). ml misel dispersiyonundaki Yükleme etkinliği (%) Formülasyon ilaç miktarı (µg) PTX CYC PTX CYC PEG-PE 58,0±4,9 28,3±2,5 110,9±7,8 40,2±9,1 PEG-PE/Vit.E (95:5) 70,3±3,0 40,4±0,8 199,8±6,6 114,8±10,3 PEG-PE/Vit. E (85:15) 96,6±5,8 58,6±1,1 274,4±11,2 166,4±21,6 Elde edilen sonuçlar incelendiğinde her ne kadar CYC nin enkapsülasyonu PTX in tek başına enkapsüle edildiği formülasyonlardan daha düşük yükleme değerlerine yol açsa da, her iki etkin maddenin de misel formülasyonlarına yüklendikleri miktarlar, 1 mm lık düşük misel materyali konsantrasyonlarında bile sudaki çözünürlükleri ile kıyaslandığında son derece yüksektir PTX ve ELC nin Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği PTX ile birlikte ELC nin birlikte enkapsüle edildiği misel formülasyonlarının hazırlanışında Bölüm de verilen yöntem ve formülasyon kodları kullanılmıştır. Hazırlanan formülasyonlarda misel materyallerinin konsantrasyonu 1 mm dır. Aşağıdaki tabloda hazırlanan farklı formülasyonlar ve bu formülasyonlara ait yükleme etkinlikleri verilmiştir. Tablo Misel formülasyonların hapsedilen PTX ve ELC miktarları (n=3). PTX ELC Formülasyon Enkapsülasyon Etkinliği (%) ml misel dispersiyonundaki madde miktarı (µg) A 81,34±11,46 115,50±16,20 B 78,90±9,70 224,31±27,70 C 83,28±2,52 118,22±3,54 D 86,50±0,58 245,58±1,70 A 27,42±3,41 0,77±0,07 B NA NA C 23,20±11,92 0,65±0,33 D 50,94±13,48 7,33±1,66

120 105 Her iki etkin madde için de en yüksek yükleme etkinliği D formülasyonunda elde edilmiştir. Bu sonuçlar incelendiğinde, partikül büyüklüğü analizi ile birlikte düşünülerek, ileride yapılacak çalışmalarda D formülasyonunun kullanılması uygun görülmüştür Misel Formülasyonlarından PTX in In Vitro Salımı PTX in Çözünürlük Çalışması In vitro salım çalışmaları için kullanılacak yöntem seçimine karar verilmesi için, öncelikle suda çözünürlüğü bulunmayan PTX için çözünürlük çalışması yapılmıştır. Bu çalışmada, PTX in sulu ortamdaki çözünürlüğünü hidrotropik etki ile arttıran farklı konsantrasyonlardaki SS çözeltileri kullanılmıştır. Bölüm da açıklanan yönteme göre gerçekleştirilen bu çalışmada elde edilen sonuçların grafiği aşağıda verilmiştir. Şekil SS konsantrasyonuna bağlı olarak PTX çözünürlüğü (x ekseni logaritmik eksendir). Yukarıdaki grafikten de görülebileceği üzere, SS konsantrasyonu arttıkça PTX in çözünürlüğünde de önemli bir artış olmaktadır. Yapılan

121 106 çalışmada PTX in sudaki çözünürlüğü 0,32 µg/ml olarak bulunmuşken, 4 M lık SS çözeltisinde bu değer 5,81 mg/ml ye çıkmıştır. SS in Misel Stabilitesi Üzerine Etkisi Yukarıda elde edilen sonuçlar, her ne kadar PTX in çözünürlük değerlerinde cesaret verici bir artışı gösterse de, yüksek SS konsantrasyonlarının misel stabilitesi üzerine herhangi bir etkisinin olup olmadığının da incelenmesi ve buna göre uygun SS konsantrasyonunun seçilmesi gereklidir. Hazırlanan polimer filmlerinin SS çözeltileri ile hidrate edilmelerini takiben yapılan partikül büyüklüğü ölçümlerinin sonuçları aşağıda verilmiştir. Şekil SS konsantrasyonuna bağlı olarak PEG-PE misellerinin partikül büyüklüğü sonuçları (n=6). Bu sonuçlar göz önüne alındığında, PTX in in vitro salım deneyleri için seçilecek uygun SS konsantrasyonunun, misel stabilitesinde önemli bir değişime sebep olmayan, fakat bununla birlikte PTX in çözünürlüğünde de artış yaratabilecek konsantrasyon olan 1 M olarak seçilmesine karar verilmiştir.

122 107 In Vitro Salım Deneyleri Uygun salım ortamının seçilmesinden sonra sadece PTX içeren misellerden yapılan in vitro salım çalışmasında, misel yapıları içerisinden salınan PTX miktarına ait grafik aşağıda verilmiştir. Kullanılan SS ın PTX in çözünürlüğünü arttırması ile birlikte, PTX in misel yapılarından salımı kolaylaşmıştır. 48 saat sonunda, PTX in yaklaşık %73 ü ortama salınmıştır. Salım deneylerinde açık bir patlama etkisi gözlenmemiştir. Şekil PTX misellerinden zamana bağlı PTX salımı (n=3). PTX ile birlikte CYC nin enkapsüle edildiği misel formülasyonlarında kullanılan analitik yöntem SS içeren ortam ile çözülemeyen bir girişim yapmış ve salım ortamından PTX in sağlıklı bir şekilde tayininde güçlükler yaşanmasına sebep olmuştur. Bu sebeple PTX ve CYC yi birlikte içeren misel formülasyonlarından in vitro salım çalışması gerçekleştirilememiştir. PTX ve ELC yi birlikte içeren misel formülasyonlarından izlenen PTX salımına ilişkin elde edilen grafik aşağıda verilmiştir (Şekil 4.16). her iki salım çalışmasında da PTX in salım ortamındaki kimyasal stabilitesi HPLC ile takip edilmiş ve salım deneyleri boyunca PTX stabilitesinde anlamlı bir kayıp olmamıştır.

123 108 Şekil PTX ve ELC misellerinden PTX salımı (n=3) Misel Formülasyonlarının AFM ile Görüntülenmesi Etkin madde içermeyen misel formülasyonunun görüntülemesi amacıyla yapılan çalışmalarda elde edilen örnek AFM görüntüleri aşağıdaki şekilde verilmiştir. Hazırlanan misel yapıları, ultra saf su içerisindeki dispersiyonları halinde mika tabakalara damlatılmış ve suyun buharlaştırılarak uzaklaştırılmasını takiben görüntüleme yapılmıştır. Şekilde görülen küresel ve 50 nm den küçük yapılar misel oluşumunu görsel olarak destekler niteliktedir. Şekil Etkin madde içermeyen misel formülasyonlarının AFM görüntüleri.

124 Modifiye Misellerde TATp Aktivitesinin ELISA ile Kontrolü TATp in tek başına ve misel yapısına katıldıktan sonra aktivitesini koruduğunun gösterilmesi için Bölüm 3.9 da verilen ELISA yöntemi kullanılmıştır. Karar verilen ve kullanılan konsantrasyonlar ile miktarlar sonucunda elde edilen yöntem, TAT peptidin aktivitesinin gösterilmesi için kullanılmaya uygun ve yeterli hassaslıkta bulunmuştur. Aşağıda verilen şekil, kullanılan ELISA yöntemi sonucunda elde edilen sonuçları göstermektedir. Şekil TATp ile modifiye edilmiş misellerin yüzeyinde bulunan TATp in aktivitesinin ELISA ile kontrolü. Elde edilen sonuç, TATp in misel yapılarına katılması sırasında maruz kaldığı işlemlerin aktivitesini olumsuz yönde etkilemediğini göstermektedir. Ayrıca, 500 kat seyreltilmiş olan misellerde TATp aktivitesi azalmış olmakla birlikte hala korunmaktadır. Aşağıdaki şekil elde edilen aktivite cevabının grafiksel gösterimini içermektedir.

125 110 Şekil TATp ile modifiye edilmiş misellerin yüzeyinde bulunan TATp in aktivitesine ait grafik Modifiye Misellerde 2C5 Aktivitesinin ELISA ile Kontrolü 2C5 antikorunun misel yapılarına katılmasından sonra aktivitesinin koruduğunun gösterilmesi için Bölüm 3.10 da verilen ELISA protokolü kullanılmıştır. Bu sayede, modifiye edilen misellerin aktivitesi araştırılmış ve elde edilen sonuçlar aşağıdaki şekilde (Şekil 4.20) verilmiştir. Şekil C5 ile modifiye edilmiş misellerin yüzeyinde bulunan 2C5 ın aktivitesinin ELISA ile kontrolü.

126 111 Yukarıdaki şekilden de görülebileceği üzere, kırmızı ile belirtilen sütunlara 2C5 ile modifiye edilmiş miseller uygulanmış ve her bir sütunda yukarıdan aşağıya doğru seyreltme yapılmıştır. Aşağıdaki şekilde ise, 2C5 standardı ve 2C5 ile modifiye edilmiş miseller için elde edilen aktivite cevabının grafiği bulunmaktadır. Şekil C5 ile modifiye edilmiş misellerin yüzeyinde bulunan 2C5 ın aktivitesine ait grafik Hücre Kültürü Çalışmaları Kullanılan Hücrelerde P-gp Varlığının Western Blot Analizi ile Kontrolü Bölüm de ayrıntıları ile verildiği şekilde gerçekleştirilen western blot analizlerine ait sonuçlar aşağıdaki şekilde (Şekil 4.22) verilmiştir. Analiz sırasında bantların ilerlemesinde herhangi bir sorun yaşanmamış ve düzgün protein bantları elde edilmiştir. Ayrıca P-gp ye ait bandın doğrulanması için molekül ağırlığı standartları da kullanılmıştır.

127 112 Şekil MCF-7, MDCKII-MDR1 ve MDCKII-Parental hücrelerinin western blot analizi sonuçları. Yukarıdaki şekilde yer aldığı üzere, MDCKII-MDR1 hücrelerinin yüzeyinde yer alan P-gp pompa varlığı doğrulanmıştır. Aynı zamanda çok az da olsa MCF-7 hücrelerinde de P-gp ye ait bantlar bulunmaktadır fakat P-gp pozitif hücre hattıyla karşılaştırıldıklarında bu varlık ihmal edilebilecek kadar düşüktür. MDCKII-Parental hücrelerinde ise herhangi bir bant görülememiştir Kullanılan Hücrelerde P-gp Varlığının Akış Sitometrisi ile Kontrolü MCF-7, MDCKII-MDR1 ve MDCKII-Parental hücre hatlarının membranlarında bulunan P-gp proteinin akış sitometrisi ile kontrolü sonucunda elde edilen grafikler ve sonuçlar aşağıdaki şekillerde (Şekil 4.23, 4.24 ve 4.25) verilmiştir. elde edilen sonuçlar izotip kontrolüne göre normalizasyon yapıldıktan sonra elde edilen sonuçlardır.

128 113 Şekil MCF-7 hücrelerine ait akış sitometrisi ile P-gp kontrolü sonuçları. Şekil MDCKII-Parental hücrelerine ait akış sitometrisi ile P-gp kontrolü sonuçları. Şekil MDCKII-MDR1 hücrelerine ait akış sitometrisi ile P-gp kontrolü sonuçları.

129 114 Akış sitometrisi sonuçları da western blot analizlerinden elde edilen sonuçları doğrulamaktadır. MDCKII-MDR1 hücrelerinde P-gp ekspresyonu, kontrole göre %90 dan daha yüksek oran ile doğrulanmıştır. Bununla birlikte MDCKII-Parental ve MCF-7 hücrelerinde bu oran %15 civarındadır. Sonuçlar MDCKII-MDR1 hücrelerinin P-gp eksprese eden, MDCKII-Parental hücrelerinin ise membranlarında P-gp eksprese etmeyen hücreler olduğunu göstermektedir Geliştirilen Formülasyonların Sitotoksisitelerinin Araştırılması PTX ve CYC İçeren Modifiye Edilmemiş Miseller PTX ve CYC yi birlikte içeren misel formülasyonlarının kullanılmasıyla elde edilen sitotoksisite sonuçları bu bölümde verilmiştir. aşağıdaki şekilde Caco-2 hücrelerinde elde edilen sonuç yer almaktadır. Caco-2 hücrelerinde kullanılan formülasyon, en yüksek yükleme etkinliğine sahip olan 85:15 mol oranında PEG-PE:vitamin E içeren formülasyondur. Şekil PEG-PE:Vitamin E (85:15) misellerinin Caco-2 hücrelerinde sitotoksisiteleri (n=3). Kontrol grubu herhangi bir formülasyon uygulanmayan hücrelerdir. Görülebileceği üzere, kontrol grubuna oranla boş miseller sitotoksisite

130 115 göstermemektedir. Sadece PTX içeren miseller ise kontrol grubuna oranla hücre canlılığını %80 e indirmiştir. PTX ve CYC yi birlikte içeren miseller ise Caco-2 hücrelerinin canlılığını %64 e düşürmüştür. TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmemiş misellerin aşırı P-gp eksprese eden MDCKII-MDR1 hücrelerindeki sitotoksisiteleri de incelenmiştir (Şekil 4.27). Şekil Ligand ile modifiye edilmemiş farklı misel formülasyonlarının MDCKII-MDR1 hücreleri üzerindeki 24 saatlik etkilerinin incelenmesi (n=3). Sadece PTX içeren misel formülasyonları PTX çözeltisine göre hücre canlılıklarında daha yüksek azalma sağlamıştır. PTX ile birlikte CYC nin de formülasyona eklendiği misellerde toksisite ileri düzeyde artmış olup hücre canlılığının %32 yi aşmaması dikkate değerdir. Vitamin E nin formülasyonlara girmesi ile yükleme etkinliği artmış olmakla birlikte, uygulanan formülasyonlardaki PTX miktarları aynı olduğu için, sitotoksisite üzerinde Vitamin E nin bir etkisi bulunmamıştır. PTX ve

131 116 CYC yi birlikte içeren misel formülasyonlarında, farklı Vitamin E oranlarının sitotoksisiteye etkisi anlamlı bulunmamıştır. Bu sonuçların elde edilmesinden sonra, hücrelere uygulanacak misel formülasyonlarında yüksek oranda Vitamin E (PEG-PE:Vitamin E mol oranı 85:15) kullanılmasına karar verilmiştir. Aşağıdaki şekilde, MDCKII-MDR1 ve MDCKII-Parental hücrelerine uygulanan formülasyonların sitotoksisite sonuçları yer almaktadır. Şekil Ligand ile modifiye edilmemiş formülasyonların MDCKII-MDR1 ve MDCKII-Parental hücreleri üzerindeki etkilerinin incelenmesi (n=3). PEG-PE mol oranı 85:15 olan PEG-PE:Vitamin E miselleri ve Vitamin E siz PEG-PE miselleri kullanılarak elde edilen sonuçlara göre, MDCKII- MDR1 hücrelerinde PTX misellerinin sitotoksisitesi, PTX çözeltisinden daha yüksek bulunmuştur. En yüksek sitotoksisite ise PTX ve CYC yi birlikte içeren misellerde gözlenmiş ve hücre canlılığı %10 olarak bulunmuştur (Vitamin E li ve Vitamin E siz miseller için). MDCKII-MDR1 ve MDCKII- Parental hücrelerinde elde edilen sitotoksisite sonuçlarına göre, bütün

132 117 formülasyonlar için hücre dizileri arasında istatistiksel olarak anlamlı fark bulunmuştur (P<0,001). Aynı hücre dizisinde ise, Vitamin E içeren ve içermeyen misel formülasyonlarının hücre canlılığına etkileri arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır (P>0,05). PTX ve CYC İçeren Ligand ile Modifiye Edilmiş Miseller PTX ve CYC içeren ve ligand ile modifiye edilmiş misel formülasyonları Bölüm 3.7 de anlatıldığı şekilde hazırlanmıştır. Ligand olarak kullanılan TATp veya 2C5 ile modifiye edilen miseller, Bölüm de verildiği şekilde hücre hatlarına uygulanmış ve sitotoksisiteleri araştırılmıştır. MCF-7, MDCKII-MDR1 ve MDCKII-Parental hücreleri üzerinde sitotoksisite çalışmaları yapılmış ve sonuçlar aşağıdaki şekillerde verilmiştir. Şekil 4.29 da misel formülasyonlarının MCF-7 hücrelerinin canlılığı üzerindeki etkisi bulunmaktadır. PTX in modifiye olmayan misellere hapsedilmesi, hücre canlılığı üzerinde serbest PTX çözeltisine göre anlamlı bir düşüş sağlamamıştır. Modifiye olmamış misellerde sadece PTX içeren formülasyonlar hücre canlılığını yaklaşık %20 oranında düşürmüşlerdir. Bununla birlikte, modifiye misel formülasyonlarında modifiye olmayan eşdeğerlerine göre hücre canlılığında istatistiksel olarak anlamlı azalma izlenmiştir.

133 118 Şekil MCF-7 hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 24 saatlik etkisinin incelenmesi (n=3). * işareti bulunan gruplarda her üç formülasyon cevabı arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0,01). Şekil MDCKII-MDR1 hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 24 saatlik etkisinin incelenmesi (n=3). * işareti bulunan formülasyonlar ve gruplarda cevaplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0,05).

134 119 Şekil 4.30 dan elde edilen sonuçlara göre, 2C5 ile modifiye edilen misel formülasyonları arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır (P>0,05). PTX in tek başına ya da CYC ile birlikte enkapsülasyonu, 2C5 ile modifiye edilmiş miseller ile sitotoksik etkide artışına yol açmamıştır ve bütün 2C5 modifiye misellerin yaklaşık %75 oranında hücre ölümüne yol açması dikkat çekmektedir. TATp ile modifikasyon, modifiye edilmemiş misel formülasyonlarına göre hücre canlılığında anlamlı azalmaya yol açmış (P<0,05), ancak bu fark 2C5 ile elde edilen sonuçlardan daha az bulunmuştur. PTX ve ELC İçeren Modifiye Edilmemiş Miseller Bölüm de verildiği şekilde hazırlanan PTX ve ELC içeren misel formülasyonlarının etkin madde yüklemesi ve partikül büyüklüğü analizleri sonucunda, geliştirilen formülasyonlar içerisinden D formülasyonu hücre kültürü çalışmaları için seçilmiştir. Hem yüksek etkin madde yükleme etkinliğine sahip olması hem de tek bir partikül büyüklüğü dağılımı göstermesi bakımından en uygun formülasyon olarak değerlendirilen D formülasyonu ile öncelikle modifiye edilmemiş miseller hazırlanmıştır. MCF-7, MDCKII-MDR-1 ve MDCKII-Parental hücre hatları kullanılarak Bölüm de verildiği şekilde sitotoksisite çalışması gerçekleştirilmiştir. Buna göre elde edilen sonuçlar aşağıdaki grafiklerde (Şekil ) verilmiştir. Grafiklerde gruplar arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olursa bu durum yıldız ile gösterilmiş ve farkın derecesi (P değeri) parantez içerisinde (*) verilmiştir.

135 120 Şekil MCF-7 hücreleri üzerinde PTX ve ELC içeren modifiye edilmemiş misel formülasyonlarının 24 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6). Şekil MCF-7 hücreleri üzerinde PTX ve ELC içeren modifiye edilmemiş misel formülasyonlarının 48 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6).

136 121 Şekil 4.31 ve 4.32 den görülebileceği üzere kontrol grubu ve boş miseller arasında 24 ve 48 saatlik etki açısından fark bulunmamıştır. Serbest PTX çözeltisi hem 24 hem de 48 saat sonunda hücre canlılığında kontrol grubuna göre yaklaşık %10 luk bir düşüş göstermiştir. PTX in misel formu serbest formu ile kıyaslandığında hücre canlılığında anlamlı bir düşüşe yol açmıştır. Sadece PTX içeren miseller hücre canlılıklarını 24 saat sonunda yaklaşık %15, 48 saat sonunda ise yaklaşık %42 oranında azaltmıştır. Bununla birlikte, PTX ve ELC yi birlikte içeren misel formülasyonlarının sitotoksik etkisi ise 24 saat sonunda %43 ve 48 saat sonunda da %58 olmak üzere en yüksek düzeyde saptanmıştır MDCKII-Parental ve MDCKII-MDR1 hücrelerine ait ligand ile modifiye edilmemiş misel formülasyonlarına ait hücre canlılığı sonuçları sırasıyla Şekil 4.33 ve Şekil 4.34 de verilmiştir. P-gp ekspresyonu olmayan MDCKII- Parental hücrelerinde formülasyonların etkisi açısından bir farklılık bulunmamıştır. Şekil MDCKII-Parental hücreleri üzerinde PTX ve ELC içeren modifiye edilmemiş misel formülasyonlarının 12 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6).

137 122 Şekil MDCKII-MDR1 hücreleri üzerinde PTX ve ELC içeren modifiye edilmemiş misel formülasyonlarının 12 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6). MDCKII-MDR1 hücrelerinde, kontrol grubu ve boş misellerin etkileri arasında fark bulunmamıştır. Serbest PTX, hücre canlılığını %19 oranında azaltmış olup, PTX in misel formülasyonunda ise hücre canlılığı %27 oranında azalmıştır. PTX ile ELC ın birlikte kullanıldığı misel formülasyonları en güçlü etkiyi göstererek hücre canlılığını %35 oranında azaltmıştır. PTX ve ELC İçeren Ligand ile Modifiye Edilmiş Miseller PTX ve ELC içeren ve bir ligand ile modifiye edilmiş misel formülasyonları Bölüm 3.7 de verildiği şekilde hazırlanmıştır. Ligand ile modifiye edilen formülasyon, Bölüm de verilen formülasyonlardan D kodlu olanıdır. MCF-7, MDCKII-Parental ve MDCKII-MDR1 hücrelerinde gerçekleştirilen sitotoksisite çalışmalarının sonuçları aşağıdaki şekillerde verilmiştir.

138 123 Şekil MCF-7 hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 24 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6). * işareti bulunan formülasyonların cevapları arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır ve P değeri grafikte verilmiştir.

139 124 Şekil MCF-7 hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 48 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6). * işareti bulunan formülasyonlar ve gruplarda cevaplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır ve P değeri grafikte verilmiştir. Şekil 4.35 de verilen 24 saatlik hücre canlılığı sonuçları incelendiğinde, PTX içeren modifiye edilmemiş misel formülasyonlarının hücre canlılığını %21 oranında azalttığı görülürken, TATp ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarında bu oran %30, 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarında ise %39 dur. Sadece PTX içeren misel formülasyonları ile karşılaştırıldığında ligand ile modifikasyon, misel yapılarının etkinliğini anlamlı ölçüde arttırmıştır. PTX ve ELC yi birlikte içeren misel formülasyonlarında ise 24 saat sonunda ligand ile modifikasyon ile artan bir etkinlik görülmemiştir (P>0,05). Misel formülasyonlarının MCF-7 hücreleri üzerindeki 48 saatlik etkileri incelendiğinde ise, sadece PTX içeren modifiye edilmemiş misel formülasyonlarında canlılık %67 bulunurken, TATp ile modifiye edilenler formülasyonlarda %50, 2C5 ile modifiye edilen formülasyonlarda ise %54 canlılık gözlenmiştir. PTX ile ELC nin birlikte hapsedilmesi ile canlılık, modifiye edilmemiş misellerde bile %51 e düşmüştür ve iki etkin maddenin birlikte hapsedilmesi ile elde edilen bu sonuç dikkat çekicidir. Aynı zamanda ligand ile modifikasyon ile hücre

140 125 canlılığı daha da düşürülebilmiş ve TATp ya da 2C5 ile modifikasyon sonucunda bu oran %40 olarak bulunmuştur (P<0,05). PTX ve ELC yi birlikte içeren miseller TATp ya da 2C5 ile modifiye edildikten sonra MDCKII-MDR1 ve MDCKII-Parental hücrelerinde de sitotoksisiteleri araştırılmıştır. Elde edilen sonuçlar aşağıdaki şekillerde verilmiştir. Şekil MDCKII-Parental hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 12 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6). MDCKII-Parental hücrelerinin membranlarında P-gp bulunmaması, serbest PTX çözeltisi ve misel formülasyonları ile elde edilen hücre canlılıkları arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark olmamasına yol açmıştır. Bütün hücre canlılıkları yaklaşık %60 olarak bulunmuştur (P>0,05). Aşağıdaki Şekil 4.38 de ise TATp ya da 2C5 ile modifiye edilen ve PTX ya da PTX ile birlikte ELC hapsedilmiş misellerin MDCKII-MDR1 hücrelerinin hücre canlılıkları üzerindeki etkileri görülmektedir. Sonuçlar altı denemenin ortalaması ve standart sapmaları olarak verilmiştir.

141 126 Şekil MDCKII-MDR1 hücreleri üzerinde TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonlarının 12 saatlik etkisinin incelenmesi (n=6). * işareti bulunan formülasyonlar ve gruplarda cevaplar arasındaki fark istatistiksel olarak anlamlıdır (P<0,05). MDCKII-MDR1 hücrelerine formülasyonların uygulanması ile, 12 saat sonunda serbest PTX ve modifiye edilmemiş PTX içeren misel formülasyonları arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır (P>0,05). Sadece PTX içeren modifiye edilmemiş misellerin hücrelere uygulanması ile hücre canlılığında sadece %5 oranında bir düşüş elde edilebilmiştir. Bununla birlikte, sadece PTX içeren misellerin TATp ile modifikasyonunu takiben hücrelere uygulanması ile hücre canlılığı %19, 2C5 ile modifikasyonunu takiben hücrelere uygulanması ile hücre canlılığı %24 azaltılabilmiştir. Sadece PTX içeren misellere kıyasla, PTX ile ELC nin misel yapılarına aynı anda hapsedilmesi ile hücre canlılığı %96 dan %83 e düşürülebilmiştir. MDCKII-MDR1 hücrelerine iki etkin maddeyi de içeren modifiye misellerin uygulanması ile hücre canlılığı TATp ve 2C5 grupları için %74 olarak bulunmuştur.

142 TARTIŞMA 5.1. Çalışmalarda Kullanılacak Polimerlerin Sentezi ve Karakterizasyonu pnp-peg-pe Bileşiğinin Sentezi Bölüm de sentez işlemleri verilen pnp-peg-pe polimerinin sentezi, misel formülasyonlarına ligandların bağlanabilmesi için büyük önem taşımaktadır. Verilen yöntem ile tekrarlanabilir bir şekilde polimer sentezi ve saflaştırılması yapılabilmektedir. Deneysel çalışmalarda kullanılacak olan polimerin saf halde bulunması son derece büyük bir önem arz etmektedir. Üründeki safsızlığın nedeni ise sentez sonrasında ortamda kalan serbest PEG molekülleridir. Bu sebeple kullanılacak olan polimerin içerisinde serbest PEG bulunmaması için ürün kolondan geçirilerek saflaştırılmıştır. Ürünün saflaştırılmasında çapraz bağlı sefaroz jel türevi olan sefaroz CL-4B materyali kullanılmıştır µm arasında çapa sahip boncuklardan oluşan bu ayırım materyali sayesinde kolona uygulanan ürünün içerisindeki maddeler molekül büyüklüklerine göre ayrılmışlardır. Molekül büyüklüğü sentez ürününe göre daha küçük olan serbest PEG molekülleri, jelin porları arasında sıkışarak kolonda ilerledikleri için kolonu daha geç terk etmiş ve pnp-peg-pe bileşiği kolondan ilk çıkan bileşik olmuştur. Sentez gerçekleştirildikten sonra elde edilen ürünün bir seferde saflaştırılmasındansa, 4 parçaya bölünerek, daha küçük bir kolon kullanılarak saflaştırılması hem verimi arttırmış hem de işlemlerde kolaylık sağlamıştır. Şekil 4.1 de bu saflaştırmadan sonra elde edilen İTK plağı görülmektedir. Bu sonuçlara göre daha erken gelen 3-6 arası fraksiyonlar sadece saf pnp- PEG-PE bileşiğini, sonrasında toplanmaya devam edilen 7-12 arası fraksiyonlar ise saf bileşik yanında serbest PEG moleküllerini de içermektedir. Sadece saf bileşiği içeren 3-6 arası fraksiyonlar toplanmış ve deneylere bunlar kullanılarak devam edilmiştir. Bununla birlikte madde kaybı olmaması için 6-12 arası fraksiyonlar da birleştirilmiş ve tekrar kolondan geçirilerek saflandırılmıştır. Bu işlem serbest PEG içermeyen saf ürün elde

143 128 edilene kadar devam ettirilmiştir. Bu sayede mümkün olan en yüksek miktarda saf ürün elde edilebilmiştir pnp-peg-pe Bileşiğinin 1 H-NMR ile Karakterizasyonu Bölüm de verilen Şekil 4.2. de, (A) ile belirtilmiş olan spektrum pnp-peg pnp bileşiğine aittir ve spektrumda yaklaşık 7 7,5 ppm de gelen aromatik H ler rahatlıkla görülebilmektedir. Aynı zamanda yaklaşık 4 ppm de de O-CH2 ye ait H ler bulunmaktadır. İkinci spektrum (B) DOPE ye aittir ve 1 5 ppm arasında alkil zincirlerine ait H leri içerir. Son spektrumda (ürün) hem yaklaşık 7 ppm de aromatik H ler hem de 1 5 ppm arasında alkillere ait H ler görülmüştür. Spektrumların karşılıklı olarak karşılaştırması sonucunda da polimer sentezinin başarı ile gerçekleştirilebildiği anlaşılmaktadır Analitik Miktar Tayini Yöntemleri PTX ve CYC için HPLC ile Miktar Tayini Bölüm de sonuçları verilen validasyon parametreleri incelendiğinde, sadece PTX için geliştirilen analitik miktar tayini yönteminin µg/ml konsantrasyon aralığında doğrusal, kesin, doğru ve özgün bir yöntem olarak valide edildiği görülmektedir. Bununla birlikte, tez çalışmasında geliştirilen formülasyonlarda PTX ile birlikte bir P-gp inhibitörü de enkapsüle edileceğinden tek başına PTX için geliştirilen bir analitik tayin yöntemi yetersiz kalacaktır. Bu sebeple PTX ile birlikte CYC yi de içeren formülasyonların ve çözeltilerin miktar tayin yönteminin de geliştirilmesi ve valide edilmesi gereklidir. Bölüm de verilen sonuçlar göz önüne alındığında, PTX için valide edilen alt sınırın 0,5 µg/ml ye çekildiği görülebilir. Geliştirilen yöntemde kolon sıcaklığı olarak 40 C de çalışılmıştır. Literatürde de yer alan bir çok çalışmada bildirildiği üzere, CYC nin ayrımı ve özellikle pik simetrisi, diğer şartlar sabit tutulduğunda bile kolon sıcaklığı ile önemli oranda artmaktadır ( ). Bu çalışmalarda kullanılan HPLC yöntemlerinde kolon sıcaklıkları 60 C ve üzerinde tutulmuştur. Tez çalışmalarında geliştirilen yöntemde (Bkz. Bölüm 3.4.2) kullanılan kolon

144 129 sıcaklığının 40 C de tutulmasının sebebi, yüksek sıcaklıklarda misel yapısını oluşturan lipitlerin parçalanması ve buna bağlı olarak oluşan parçalanma ürünlerinin hem girişim yapması hem de baseline ı bozmasıdır. Ayrıca geliştirilen gradient elüsyon yöntemi görece uzun süren analiz sürelerine sahip olsa da (22 dakika), sonuçlar ve tam bir ayırımın elde edilebilmesi açısından ideal bir süre olarak kabul edilmiştir. Verilen sonuçlarda (Tablo 4.5) bir tek CYC için incelenen tekrar elde edilebilirlik parametresinde 1 µg/ml lik konsantrasyonda varyasyon katsayısı %2 den yüksek bulunmuştur. Bu durum dışında geliştirilen gradient elüsyon yöntemi başarı ile valide edilebilmiş ve çalışmalarda kullanılmıştır PTX ve ELC için HPLC ile Miktar Tayini ELC nin pka değerinin yüksek olması ve zayıf asidik yapı göstermesi, HPLC yönteminde iyon çifti ajanı kullanılmasına yol açmıştır. Yöntem geliştirme çalışmaları sırasında ELC ye ait piklerin bir çok farklı mobil faz sisteminde ve farklı kolonlarda ikiye ayrılmış olarak geldiği fark edilmiş, bu durumun araştırılması için İTK İle analiz yapılmıştır. Bu sayede kimyasal yapısı aynı olan ama sabit faz üzerinde farklı tutulma özelliği gösteren bu sebeple birbirine çok yakın iki pik halinde kolonda ayrılan ELC nin iyon çifti oluşturduğu bulunmuştur. Aynı zamanda ELC nin çözünürlüğünün son derece düşük olması ve örneklerde PTX ile birlikte bulunacak oluşu HPLC yöntemi geliştirilirken çok yönlü düşünülmesi gerekliliğini doğurmuştur. Literatürde ELC nin bu özelliklerinden dolayı, kullanılan yöntemlerde baseline düzeltici ve ayırımı arttırıcı bileşiklerin mobil fazlara eklendiği görülmektedir (206,207). Ayrıca mobil fazın ph sının mümkün olduğunda asidik tutulması da ELC nin iyon çifti oluşumunu azaltmıştır. Bu bilgiler ışığında iyon çifti ajanı olarak 1-oktan sülfonik asit kullanımı ve asidik mobil fazla çalışılmasına karar verilmiştir. Yapılan ön çalışmalarda en uygun ayırım ve hassaslığın 10 mm iyon çifti ajanı konsantrasyonu ve ph 3,1 de elde edildiği görülmüştür. Bu sayede yeterli çözünürlüğe sahip, özgün, kesin ve doğruluğu valide edilmiş bir yöntem geliştirilebilmiştir.

145 Misel Formülasyonlarının Hazırlanışı PEG-PE bazlı misel formülasyonlarının hazırlanmasında film oluşturma yöntemi kullanılmış ve yöntemin ayrıntıları Bölüm 3.5 de verilmiştir. Yöntemin hızlı, kolay ve tekrarlanabilir oluşu, etkin maddelerin hapsedilmesinde girişim yapmaması ve en az cihaz-kimyasal-sarf malzemesine gereksinim duyulması, bu yöntemin seçimini sağlamıştır (19,54,72,208,209). Misel yapılarına farklı ligandların konjuge edilebilmeleri için literatürde farklı yöntemler uygulanmıştır. Fakat bütün yöntemlerde önemli olan, konjuge edilen ligand yapısının hedef reseptörü ile etkileşebilmesi ve aktivitesini koruyabilmesi için PEG zincirleri içerisine hapsolmaması, serbestliğini koruyabilmesidir. Bu sebeple gerek lipozom gerek ise misel yapılarının yüzeyine yapılacak olan ligand modifikasyonlarında PEG zincirlerinin ucuna ligand bağlanması gerekmektedir (101). Allen ve diğ. (102) lipozomların yüzeyindeki PEG zincirlerinin tiol grubu içeren açık uçlarına maleimid ile modifiye edilmiş antikorları bağlamışlardır. Hansen ve diğ. de (102) ucunda hidrazid grubu içeren PEG ile aldehit grubu içeren okside edilmiş antikorları bağlamışlardır. Bendas ve diğ. ise (210) immünolipozom hazırlamak için yeni bir PEG-PE bileşiği geliştirmişlerdir. Bu bileşikte PEG in ucunu siyanürik asit ile modifiye ederek siyanurik klorür-peg-pe bileşiği elde etmişlerdir. Bu bileşik ph 8,8 in üzerinde nükleofilik yer değiştirme reaksiyonu aracılığı ile antikor ve PEG-PE bileşiğinin konjuge olmasını sağlamaktadır. Tez çalışmalarında ise benzer bir yaklaşım ile pnp-peg-pe bileşiği sentezlenmiş ve kullanılmıştır. Bazik ph larda ortamda bulunan serbest amino grubu içeren proteinler ya da antikorlar ile pnp grupları arasında stabil üretan bağı aracılığı ile konjugasyon sağlanır ve Ligand-PEG-PE elde edilir (103). Bu reaksiyon ph 8 civarında hafif bazik ph larda gerçekleşmektedir. Bu bakımdan Bendas ve diğ. lerinin kullandığı yöntemde olduğu gibi, protein yapısını zorlayacak kadar yüksek ph değerlerine çıkılmasına gerek kalmamaktadır. Ayrıca pnp-peg-pe bileşiği konjuge edilecek antikor ya da protein yapılarının, bir ön işleme ve modifikasyona tutulmasına gerek yoktur. Bu durum özellikle yüksek maliyetli antikorlar ile çalışıldığında önem

146 131 kazanmakta ve kaybı azaltmaktadır. Reaksiyon için toksik ya da sonradan uzaklaştırılması zorluk yaratabilecek yardımcı maddeler kullanılmadığı için, diyaliz yolu ile artıklar kolayca ortamdan uzaklaştırılabilmektedir. Ligand ile pnp-peg-pe bileşiğinin konjugasyonu sırasında, pnp-peg-pe nin molce 4 katı oranında PEG-PE kullanılması ile olası agregasyonların önüne geçilmiştir. Bu sayede dışarıdan eklenen PEG-PE yardımı ile misel yapılarının oluşumu ve dayanıklılığı arttırılmıştır. Ligand (TATp ya da 2C5)-PEG-PE ve PEG-PE içeren miseller hazırlandıktan sonra bu sulu misel dispersiyonu, etkin maddeleri ve ana misel yapısı için PEG-PE yi içeren polimer filminin hidrate edilmesi için kullanılmıştır. Geliştirilen misel formülasyonlarında kullanılan PEG-PE bileşiğindeki PEG zincirlerinin molekül büyüklüğü 2000 Da dur. pnp-peg- PE bileşiğinde ise 3400 Da büyüklüğünde PEG zincirleri bulunmaktadır. Bu sayede misellerin modifiye edildiği antikor ya da peptit, daha uzun bir PEG zincirinin ucuna bağlı halde bulunmaktadır. Böylece yüzeydeki TATp ya da 2C5 antikoru hem 2000 Da luk PEG zincirleri tarafından gölgelenmeyecek hem de hücre membranları ve reseptörler ile daha rahat etkileşime geçebilecektir Misel Formülasyonlarının Karakterizasyonları Kritik Misel Konsantrasyonunun Belirlenmesi ve Kanda Kalış Süresi Uzatılmış Miseller Bölüm de hazırlanan misel formülasyonlarının CMC tayin yöntemleri verilmiştir. Elde edilen bulgular hem standart olarak uygulanan pyrene yönteminin hem de boyut ayrıma kromatografisinin aynı CMC değerlerini tayin edebildiğini göstermektedir. PEG-PE miselleri için bu değer yaklaşık M iken, PEG-PE:Vitamin E miselleri için M dır. Elde edilen sonuçlar literatürde daha önce bu sistemler için belirtilen değerler ile uyumludur (72,81). Bu düşük CMC değerleri bir çok alışılagelmiş yüzey aktif maddenin CMC değerlerinden 100 kat daha düşüktür. Pyrene metodu CMC araştırılmasında kullanılan en güvenilir yöntemlerden biri olarak tanımlanmıştır (189). Bununla birlikte bazı

147 132 çalışmalarda, çok düşük CMC değerine sahip polimerlerin CMC değerleri araştırılırken pyrene metodunun gerçek CMC değerlerinden daha yüksek sonuçlar verdiği de bildirilmiştir (211). Bu nedenle kullanılan pyrene metodu aynı zamanda boyut ayırma kromatografisi ile doğrulanmak istenmiştir. Yapılan analizler her iki yöntemin de birbirlerine oldukça yakın sonuçlar verdiğini göstermektedir. CMC değerleri misellerin özellikle in vivo stabilitelerinin önemli bir göstergesidir. Zira parenteral uygulanan her formülasyon en az 25 kat ve daha yüksek oranlarda seyreltmeye maruz kalmaktadır. Lukyanov ve Torchilin (69) düşük CMC değerlerinin seyreltmeye karşı daha yüksek dayanıklılığın bir göstergesi olduğunu belirtmişlerdir. Formülasyonlardan elde edilen düşük CMC değerleri, misel formülasyonlarının kan dolaşımına uygulandıktan sonra karşılaşacakları seyreltmeye rağmen unimerler halinde dağılmayacaklarını ve misel yapılarını koruyacaklarını göstermektedir (55,212). Düşük CMC değerlerine sahip geliştirilen formülasyonlar, olası bir parenteral uygulamada misel yapılarını koruyacakları için hapsolan ilacın erken salımının önüne geçilebileceği ve aynı zamanda kan dolaşımında uzun süre kalabilecek formülasyonların elde edilebildiğini düşündürmektedir. Hazırlanan misel yapılarının hepsi, ilgili bölümlerde verilen sonuçlardan görülebileceği üzere 25 nm nin altındadır. Bu düşük boyut, özellikle EPR etkisinden faydalanılabilmesi için önem taşımaktadır. Fakat bunun için sadece düşük partikül büyüklüğü yeterli olmamakta, aynı zamanda sistemin kan dolaşımında uzun süreler kalabilmesi gereklidir. Tez çalışmalarında hazırlanan miseller PEG-PE bazlı misellerdir ve dolayısı ile yüzeylerinde PEG zincirleri içermektedirler. Bu PEG yapıları, genel bilgilerde de verildiği üzere sistemi yabancı bir cisim olarak algılanmaktan ve opsonizasyondan korur, bu sayede kan dolaşımında kalış sürelerini uzatır. PEG ile modifiye edilmiş lipozomların kanda kalış sürelerinin, PEG ile modifiye edilmemiş lipozomlara oranla daha uzun olduğu ve bu sayede EPR etkisinden yararlanarak tümör dokularında daha yüksek birikim gösterdiği uzun yıllar önce gösterilmiştir (82,213). Bununla birlikte Parr ve diğ. (214) PEGilasyon yapılmış olan lipozomların kanda daha uzun süre kalış

148 133 göstermelerine rağmen LLC tümörlerinde arttırılmış bir birikim sağlamamışlardır. Yaklaşık 100 nm lik bu lipozomların tümörlü dokuda yeterli birikim gösterememesi, LLC ve diğer bazı tümörlerde tümör damar duvarlarının geçirgenlik boyutunun daha düşük olmasıdır. Bu gibi durumlarda partikül büyüklüğü daha düşük olan ve kanda kalış süresi uzatılmış sistemlere gerek duyulmaktadır. Weissig ve diğ. (212) bu durumu göz önünde bulundurarak PEG bazlı lipozom ve misel formülasyonları geliştirmiş ve biyodağılım çalışması yaparak kanda kalış sürelerini ve tümörde birikme eğilimlerini karşılaştırmışlardır. Her iki nanoboyutlu ilaç taşıyıcı sistem de kan dolaşımında uzun süreler kalabilmişlerdir. Bununla birlikte 1 saat sonunda uygulanan lipozomların %75 i kan dolaşımında iken misellerin sadece %30 u kan dolaşımında bulunmuştur. Misel formülasyonlarının kan dolaşımında kalış yarı ömürleri yaklaşık 2 saat bulunmuştur. Bu süre görece kısa olmakla birlikte, tümör dokusundaki birikim incelendiğinde misellerin lipozomlara oranla çok daha yüksek birikim gösterdiği bulunmuştur. Bu sonuçların sebebi olarak LLC tümörlerinin damar duvarlarının geçirgenliğinin daha az oluşu gösterilmiştir. Lipozomlardan daha küçük partikül büyüklüğüne sahip olan miseller tümörlü dokularda daha çok birikebilmektedirler. Benzer bir çalışma Lukyanov ve diğ. (55) tarafından gerçekleştirilmiştir. Farklı uzunlukta PEG zincirleri içeren PEG-PE miselleri geliştirmişler ve bu misellerin kanda kalış sürelerini incelemişlerdir. PEG PE, PEG PE ve PEG 750 -PE misellerinin kan dolaşımında kalış yarı ömürleri sırasıyla 2,1, 2 ve 1,2 saat bulunmuştur. PEG zincir uzunluğu 2000 Da dan 5000 Da a çıktığında kanda kalış süresinde önemli bir artış görülmezken 2000 Da dan 750 Da a indiğinde bu süre önemli ölçüde kısalmıştır. Ayrıca PEG PE misellerinin tümörlü dokuda birikimlerinin de son derece yüksek olduğu ve en uzun süre tümörde kalış gösterdiği bulunmuştur. Bütün bu bilgiler incelendiğinde, tümörlü dokulara EPR etkisi ile pasif hedeflendirme yapılabilmesi ve tümörde yüksek miktarda misel kalışının sağlanabilmesi, taşıyıcının boyutuna, PEGilasyon yapılıp yapılmadığına ve

149 134 aynı zamanda farklı tümörlerin geçirgenliği gibi bir çok etkene bağlıdır. Bu bilgiler ışığında tez çalışmamızda misel formülasyonlarının hazırlanmasında bulgularda da verilen düşük CMC değerine sahip PEG PE polimerinin kullanılmasına karar verilmiştir Misellerin Partikül Büyüklüğü ve Zeta Potansiyelleri Bölüm de tez çalışmalarında geliştirilen misellerin partikül büyüklüğü ve zeta potansiyeli sonuçları verilmiştir. PEG-PE miselleri geliştirilirken, misel formülasyonlarında PEG-PE konsantrasyonu 1 ve 10 mm olan formülasyonlar geliştirilmiş ve misel materyali konsantrasyonunun partikül büyüklüğü üzerine etkileri incelenmiştir. Tablo 4.12 de 10 mm konsantrasyonda misel materyali içeren formülasyonlara ait sonuçlar yer almaktadır. Sonuçlardan görülebileceği üzere, etkin madde içermeyen ya da PTX içeren misellerde, Vitamin E nin formülasyona girmesi misellerin partikül büyüklüğünde artışa yol açmıştır. Bu durum, kendisi de oldukça hidrofobik olan Vitamin E nin misellerin hidrofobik çekirdeği içerisine yerleşmesi ve bu sayede hidrofobik çekirdek hacmini arttırmasına bağlanmıştır (72,104,215). Büyüyen hidrofobik çekirdek partikül büyüklüğünde artış olarak sonuçlara yansımıştır. Mol oranı olarak %5 ve %15 oranında Vitamin E içeren misellerde görülen artış istatistiksel olarak anlamlıdır. Bununla birlikte Vitamin E içeren misellerde PTX yüklemesi ile partikül büyüklüğünde anlamlı bir artış olmamıştır. Bu durum, Vitamin E nin hidrofobik çekirdeği gevşetmiş olması ve PTX in bu geniş çekirdeğe yerleşmiş olması ile açıklanabilir. Vitamin E içermeyen misellerde PTX yüklemesi ile birlikte artan partikül büyüklüğü istatistiksel olarak anlamlı olmamakla birlikte (P>0,05) yukarıda verilen teori ile açıklanabilir. Misellerin partikül büyüklükleri daha önce bu polimer kullanılarak hazırlanan misellerin boyutları ile uyumlu bulunmuştur. Sawant ve diğ. (72) etkin madde içeren PEG-PE/Vitamin E misellerinin boyutlarını nm arasında, Dabholkar ve diğ. (70) 14 nm civarında, Gao ve diğ. (52) ise nm aralığında bulmuşlardır. Sezgin ve diğ. (67) farklı zincir uzunluklarında PEG içeren PEG-PE miselleri hazırlamış ve PEG PE kullanarak hazırladıkları misellerin partikül büyüklüklerini (etkin madde yüklü olmayan ve

150 135 etkin madde yüklü olanlar) nm arasında bulmuşlardır. Benzer sonuçları içeren bir tablo da Bölüm de verilmiştir. Bölüm de verilen tabloda ise 1 mm lık misel formülasyonlarının partikül büyüklükleri verilmiştir. Etkin madde yüklemesi ile misel boyutunda artış gözlenmediği için, PTX ve CYC yi birlikte içeren misellerin partikül büyüklükleri tabloya konulmuştur. 1 mm konsantrasyonda misel materyali içeren etkin madde yüklemesi yapılmamış misel formülasyonlarına bakıldığında 10 mm lık konsantrasyonda hazırlanan misellere göre istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamamıştır (P>0,05). Yukarıda Bölüm de tartışıldığı üzere, geliştirilen formülasyonlar 0,01 mm konsantrasyona kadar misel yapılarını koruyabildikleri için, partikül büyüklüğünde artış ya da azalma olmaması açıklanmış olmaktadır. PEG-PE polimerleri, tek tabakalı misel yapıları oluşturdukları için, CMC değerlerinin üzerindeki her konsantrasyonda, benzer partikül büyüklüklerine sahip olmaktadırlar. Etkin madde içeren ve 1 mm konsantrasyonda misel materyali içeren formülasyonlara bakıldığında ise, yine Vitamin E oranındaki artışın partikül büyüklüğü üzerinde anlamlı bir etkisi olduğu gözlenmektedir. PTX ile birlikte CYC misel yapılarına yüklendiğinde, PTX in ve CYC nin büyük ve halkasal yapılarına rağmen, partikül büyüklüklerinde bir artış gözlenmemiştir. Tablo 4.12 ve 4.13 de verilen bütün misel formülasyonlarının polidispersite değerleri 0,2 nin altında çıkmıştır. Bu durum, onların monodispers yani sadece tek bir partikül büyüklüğüne sahip dağılımdan oluştuklarını göstermektedir. PTX ve ELC içeren misellerde ise formülasyonda optimizasyon yapılmıştır. PTX ve PTX-CYC içeren miseller ile yapılan çalışmalar ışığında, son misel materyali konsantrasyonu 1 mm olan formülasyonlar ile çalışılmıştır. Misel yapılarında kullanılan PEG-PE:Vitamin E mol oranı ise 90:10 olarak sabit tutulmuştur. Vitamin E içeren formülasyonların partikül büyüklükleri ile Vitamin E içermeyen formülasyonların partikül büyüklükleri incelendiğinde, Vitamin E varlığının yukarıda açıklanan mekanizma ile partikül büyüklüğünde artışa yol açtığı görülmektedir. Bununla birlikte, formülasyonlar incelendiğinde polidispersite indekslerinin 0,2 nin üzerinde

151 136 olduğu, ayrıca partikül büyüklüğü dağılımlarında ikinci bir pik varlığı farkedilmiştir. Vitamin E içermeyen formülasyonlar ise hem partikül büyüklüğü daha küçük hem de monodispers bulunmuştur. Vitamin E içeren misel formülasyonlarında iki farklı misel dağılımının oluşması ile polidispersite değerlerinin yükselmiş olabileceği düşünülmektedir. Formülasyonlara iki farklı etkin madde yüklemesi yapıldığı için bu durum özellikle önemlidir, çünkü misel popülasyonlarından birine PTX in diğerine ise ELC nin enkapsüle olmuş olması olasılığını doğurmaktadır. Bu durum PTX in ve CYC nin birlikte yüklendiği misellerde görülmemiş olmakla birlikte, Jule ve diğ. (216) misel formülasyonlarında iki farklı miktarda etkin madde içeren iki farklı misel dispersiyonu bulunabileceğini bildirmiştir. Ayrıca Bae ve diğ. de (217) iki farklı etkin maddenin yüklendiği misel formülasyonlarında etkin maddelerin birinin bir misel yapısı içerisine diğerinin de diğer misel yapısı içerisine alınabileceği bildirilmiştir. Tez çalışmasında elde edilen sonuçlar düşünüldüğünde, ELC nin partikül büyüklüğü farklı bir misel dağılımına hapsolduğu, PTX in ise diğer misel dağılımına hapsolduğu düşünülmektedir. Bu olasılık, A ve B formülasyonlarının elenmesine ve çalışmalara C ve D formülasyonları ile devam edilmesine yol açmıştır. Misel formülasyonlarının ligand ile konjugasyonu partikül büyüklüklerinde anlamlı bir farka yol açmamıştır. Ligand ile modifikasyon ile partikül büyüklüğünün değişmediği literatürde de bildirilmiştir (52,72,187). Geliştirilen PEG-PE temelli misellerin zeta potansiyelleri incelendiğinde net bir negatif yük taşıdıkları rahatça görülebilmektedir. Etkin madde içermeyen miseller, Vitamin E varlığında bağımsız olarak -10 mv civarında bir negatif yük taşımaktadırlar. Daha önce bu polimer kullanılarak hazırlanan misellerin de negatif yüke sahip oldukları literatürde yer almıştır. Sezgin ve diğ. (67) yaptıkları çalışmada PEG-PE polimerindeki PEG zincirinin uzunluğunun artmasıyla birlikte zeta potansiyelinin düştüğünü ve ayrıca formülasyonların zeta potansiyellerinin -11 ile -34 arasında değiştiğini bildirmiştir. Dabholkar ve diğ. De (70) PTX yüklü misellerin zeta potansiyellerini -16 mv civarında bulmuşlardır. Bu negatif yük, misel

152 137 yapılarının olası hücresel etkileşmelerinde bir kısıtlayıcı olarak düşünülebilir. Bu sebeple bazı çalışmalarda katyonik yapıda lipitler içeren miseller hazırlanarak hücresel alım arttırılmaya çalışılmıştır (218,219). Örneğin Wang ve diğ. (51) PEG-PE misellerinin bu özelliğini maskelemek ve hücresel alımını arttırmak için katyonik Lipofectin lipidini PTX hapsedilmiş misel yapılarına eklemişler ve misellerin -31 mv olan zeta potansiyeli değerlerini -6 ya kadar indirebilmişlerdir. Tez çalışmalarımızda PEG-PE misellerinin taşıdığı bu negatif yük, sitotoksisite deneylerinde bir olumsuzluğa yol açmamıştır. Ayrıca hücresel alımı arttırma stratejisi olarak aktif hedeflendirme ajanlarının kullanılması yaklaşımı uygulanmıştır Etkin Maddelerin Misel Yapılarına Yükleme Etkinliği ve Miseller Çözünürlüğün Araştırılması Bölüm de verilen Tablo 4.15 incelendiğinde PTX enkapsüle edilmiş misellere ait yükleme etkinliği değerleri görülecektir. Verilen değerler 10 mm son misel materyali konsantrasyonu yani 10 mm PEG-PE konsantrasyonuna sahip misellere ait değerlerdir. Sonuçlardan görülebileceği üzere PEG-PE misellerine etkin madde yüklenmesi, yapıya giren Vitamin E oranı arttıkça yükselmektedir. Bu durum, partikül büyüklüğü sonuçlarının tartışıldığı Bölüm de de açıklandığı üzere Vitamin E nin misel hidrofobik çekirdeğinde büyümeye yol açarak çözünürlük arttırıcı etki göstermesinden kaynaklamaktadır. Misel yapılarına katıldığında, misellerin hidrofobik çekirdeğine yerleşerek bu çekirdeği büyüten ve bu sayede daha çok etkin madde molekülünün misel çekirdeğinde hapsolmasını sağlayan farklı bileşikler bulunmaktadır. Örneğin Krishnadas ve diğ. (71) misel yapıları içerisine yumurta fosfatidil kolini eklemişler ve bu sayede PTX in miseller çözünürlüğünü daha da arttırmayı başarabilmişlerdir. Gao ve diğ. (52) ise PEG-PE misellerine yumurta fosfatidil kolini eklemişler ve 1 g misel başına 15 mg PTX olan yükleme etkinliğini 33 mg PTX e çıkartabilmişlerdir. Aynı amaçla kullanılan bir başka bileşik de d-α-tokoferil polietilen glikol 1000 süksinat tır (TPGS). Mu ve diğ. (215) TPGS bileşiğini kullanarak PEG- PE miselleri hazırlamışlar ve kamptotesini bu misellerin içerisine

153 138 hapsetmişlerdir. TPGS kullanılması ile birlikte kamptotesinin yükleme etkinliği sadece PEG-PE miselleri ile karşılaştırıldığında %50 daha yüksek bulunmuştur. Sawant ve diğ. de (72) Vitamin E nin bu bahsedilen çözünürlük arttırıcı etkisinden faydalanmışlar ve PEG-PE bazlı misellere PTX yüklemişlerdir. Tablo 4.15 de yer alan sonuçlar incelendiğinde literatürde yer alan veriler ile uyumlu sonuçlar alındığı görülmektedir. Bununla birlikte özellikle yüksek Vitamin E içeren formülasyonda elde edilen etkinlik son derece yüksektir. Misel formülasyonlarına yüklenen PTX in misellerin ağırlıkça % si hesaplandığında sadece PEG-PE misellerinde bu değerin yaklaşık %1, yüksek oranda Vitamin E içeren PEG-PE misellerinde ise yaklaşık %3,5 olduğu hesaplanmıştır. Bu değerler Gao ve diğ. (52) çalışmasında ve Krishnadas ve diğ. (71) çalışmasında elde edilenler ile yakındır. Bununla birlikte Krishnadas ve diğerleri benzer miktarlara ancak 15 mm son misel materyali konsantrasyonunda ulaşabilmişlerdir. Ayrıca Sawant ve diğ. (72) PTX i PEG-PE/Vitamin E misellerine hapsetmişler fakat ml misel başına ancak 850 µg PTX hapsedebilmişlerdir. Tez çalışmalarında elde edilen yaklaşık 1 mg/1 ml misel konsantrasyonu, 0,3 µg/ml olan PTX in suda çözünürlüğünden yaklaşık 3000 kat daha yüksektir. PTX ve CYC yi birlikte içeren misellerde elde edilen yükleme etkinlikleri incelendiğinde, kullanılan misel materyali konsantrasyonunun 1 mm a indirildiği unutulmamalıdır. Tablo 4.16 de verilen sonuçlar her iki etkin maddenin de misel yapıları içerisine aynı anda hapsedilebildiğini göstermektedir. PEG-PE bazlı miseller ile yapılan çalışmalar incelendiğinde bu durum literatürde daha önce rapor edilmemiştir. PTX ve CYC nin farklı oranlardaki başlangıç yüzdeleri içerisinde en yüksek değerleri polimerin %10 u oranı vermiştir. Yüksek oranda Vitamin E içeren misellere bakıldığında PTX in misellere hapsedilen miktarının 1 mg/1ml misel değerinden 0,27 mg/1ml misel değerine düştüğü görülmektedir. Bununla birlikte, yüklenen miktarda azalma görülse de yükleme etkinliği %77 den %97 ye çıkmıştır. Bu durumda 10 mm misel materyali konsantrasyonunda yüklenen PTX oranı misel ağırlığının yaklaşık %3,5 u iken, 1 mm konsantrasyonda misellerde bu

154 139 oran iki kat arttırılmış ve yaklaşık %6 değerine çıkmıştır. Ayrıca yüklenen PTX miktarları hücre kültürü çalışmalarında kullanılması için yeterlidir. Benzer bir şekilde CYC nin de yükleme etkinliği artan Vitamin E ile artmıştır. Böylece iki etkin maddeyi de aynı anda içeren misel formülasyonları hazırlanabilmiştir. Bu sonuçlar ışığında 1 mm lık misel materyali konsantrasyonun diğer çalışmalar için de uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Bu sayede kullanılan polimer miktarları da azaltılabilmiştir. PTX ve ELC yi birlikte içeren miseller söz konusu olduğunda, elde edilen yükleme etkinliği ve miktarları Tablo 4.17 de sunulmuştur. PTX enkapsülasyon etkinliği açısından A, C ve D formülasyonları arasında istatiksel bir fark bulunmamaktadır. Fakat asıl farklılık ELC enkapsülasyon değerlerinde göze çarpmaktadır. Misel formülasyonlarına başlangıçta yüklenen ELC miktarı 25 µm da sabit tutulduğu ve tek değişken PTX başlangıç yüklemesi olduğu halde (%5 ve 10), ELC nin hapsedilen miktarları ve enkapsülasyon etkinliği önemli oranlarda farklılık göstermektedir. Daha önce PTX ve diğer bir çok madde için gösterilmiş olan Vitamin E nin çözünürlük arttırıcı etkisi, bu çalışmada ELC için görülmemiştir. Vitamin E içeren misel formülasyonlarında elde edilen değerler, Vitamin E içermeyen formülasyonlarda elde edilenlerden anlamlı ölçüde düşüktür. Genel bir kabullenme yapılamayacak olmakla birlikte elde edilen sonuçlar, artan başlangıç PTX yükleme konsantrasyonunun Vitamin E içermeyen misellerde artan ELC enkapsülasyonuna yol açtığını göstermektedir. C ve D formülasyonları karşılaştırıldığında bu sonuç açıkça görülmektedir. Bu durumun açıklaması olarak, Vitamin E ile ELC arasında molekül yapısı ve şekline bağlı olarak bir yarışma olabileceğini düşündürmüştür. PTX ile birlikte ELC misel yapılarına enkapsüle edildiğinde, halkasal ve büyük bir molekül olan PTX hidrofobik çekirdeğe yerleşmekte ve ELC molekülleri de PTX molekülleri arasındaki boşluklara yerleşebilmektedirler. Bu yapıya ek olarak Vitamin E eklenmeye çalışıldığında ise PTX ve ELC ile birlikte enkapsüle olmaktansa misel yapısının bozulduğu görülmektedir. Bu durum formülasyonların partikül büyüklüğü sonuçlarında da görülmüştür. PTX ile CYC misellerinde ise, iki molekülün de büyük halkasal moleküller olmaları ve

155 140 Vitamin E ile bir benzerlik göstermemeleri bu tür bir soruna yol açmamış ve bu sayede Vitamin E, maddelerin enkapsülasyon etkinliklerini arttırmış olabilir. Misel formülasyonu gibi son derece küçük partikül büyüklüğüne sahip ve termodinamik olarak dayanıklı sistemlerde iki farklı etkin madde yüklendiği durumlarda, etkileşim olasılığı her zaman bulunmaktadır. Bu tür etkileşimler sadece PEG-PE misellerine özgü bir durum değildir. Örneğin son derece yeni bir çalışmada Han ve diğ. (220) yeni bir polimer olan Poli(2-oksazolin) kullanarak misel yapıları hazırlamışlar ve bu yapılara aynı anda iki farklı etkin madde yüklemesi yapmışlardır. Bununla birlikte tek bir etkin madde içeren misellere göre iki etkin madde içeren misellerin partikül büyüklüklerinin daha düşük olduğunu gözlemlemiş, benzer durumun yükleme etkinlikleri için de geçerli olduğunu ama sonuçların sebebi ile ilgili bir açıklama yapamamışlardır. PTX ve ELC içeren misellerde partikül büyüklükleri sonuçlarından dolayı Vitamin E içeren formülasyonlar elenmiş, yükleme etkinlikleri açısından da C formülasyonu elenmiş ve ileri çalışmalarda sadece D formülasyonunun, yani en yüksek yükleme etkinliği ve en uygun partikül büyüklüğü gösteren formülasyonun kullanılmasına karar verilmiştir. Partikül büyüklüğü sonuçlarında olduğu gibi enkapsülasyon etkinliği sonuçlarında da, ligand ile modifikasyonun etkin maddelerin enkapsülasyon oranlarında anlamlı bir değişiklik yaratmadığı gözlenmiştir Misel Formülasyonlarından PTX in In Vitro Salımı PTX gibi suda çözünürlüğü olmayan etkin maddeleri içeren nano boyutlu ilaç taşıyıcı sistemlerden in vitro salım deneyleri her zaman büyük güçlükler içermektedir. PTX için sink koşulların sağlanması için salım ortamının hacminin arttırılması durumunda ortamdan tayin edilecek etkin madde konsantrasyonunda da ciddi bir düşme olmaktadır. Bu durum özellikle salım ortamından yapılacak miktar tayini yöntemlerinin alt sınırlarına inilmesine ve yöntemlerin yetersiz kalabilmesine yol açmaktadır. Bu sebeplerle genellikle salım ortamında modifikasyona gidilmektedir. En sık kullanılan yöntemler salım ortamına yardımcı çözücü eklenmesi (221,222), albümin gibi çözünürlüğü arttıran proteinlerin eklenmesi (223) gibi

156 141 yöntemlerin hepsi, miseller söz konusu olduğunda ciddi problemler içermektedir. Salım ortamına eklenen yardımcı çözücüler, etkin maddeler ile birlikte misel yapılarını da çözerek olumsuz etkiye yol açabilmektedirler. Proteinlerin ortamda oluşu da misel yapılarına adsorbe olarak hem salım kinetiklerini değiştirebilmekte hem de misel yapılarının dağılmasına yol açabilmektedirler. Yine sıklıkla kullanılan bir yöntem olan salım ortamına yüzey aktif maddelerin eklenmesi de kullanılamamaktadır. Kendisi de yüzey aktif özellik gösteren misel polimerleri ile ortama ilave olarak eklenen yüzey aktif maddeler girişim yapabilmektedirler. Bütün bu sayılanları PTX için ortadan kaldırmak amacıyla Cho ve diğ. (193) misel yapılarından PTX salımı için yeni bir yöntem önermişlerdir. Bu yöntemde PTX in sulu ortamdaki çözünürlüğünü hidrotropik etki ile arttıran bileşiklerin kullanılması denenmiştir. Hidrotropik etki ile çözünürlük artışının mekanizması tam olarak aydınlatılamamakla birlikte, PTX in çözünürlüğünü arttıran bir grup bileşik bulunmaktadır. Bu bileşikler ve kimyasal yapı-aktivite ilişkileri Lee ve diğ. (192) tarafından incelenmiştir. İncelenen bileşikleri içinden seçilen SS tez çalışmalarında kullanılmıştır. Son yıllarda SS kullanılarak yapılan salım çalışmaları literatürde yer almaya başlamıştır (48,188,194). SS in gösterdiği hidrotropik etki ne yazık ki sadece PTX için geçerlidir, suda çözünürlüğü olmayan farklı etkin maddelerde aynı çözünürlük artırıcı etkiyi yapamamaktadır. SS nin salım ortamı olarak kullanılması için PTX in SS içindeki çözünürlüğünün bilinmesi gereklidir. Bu sayede sink koşulların sağlanması için gerekli olan salım ortamı miktarı hesaplanabilecektir. Yapılan çözünürlük çalışmasının sonucu Bölüm da yer alan Şekil 4.13 de verilmiştir. PTX in sudaki çözünürlüğü 0,3 µg/ml gibi son derece düşük bir değer bulunmuştur. Bununla birlikte, artan SS konsantrasyonları ile PTX in çözünürlüğü de artmış ve en yüksek konsantrasyon olan 4 M lık SS çözeltisinde 5,81 mg/ml ye kadar yükselmiştir. Bu artış PTX in sudaki çözünürlüğünün yaklaşık katıdır. Bu sonuçlara rağmen SS in PTX içeren PEG-PE miselleri üzerindeki etkisinin de araştırılması gereklidir. Bu sebeple yapılan çalışmanın sonucu da

157 142 Şekil 4.14 de sunulmuştur. Şekildeki grafikten de görülebileceği üzere, 1 M konsantrasyondan sonra SS misel yapılarının partikül büyüklüklerinde artışa yol açmaktadır. Bu durum 1 M ın üzerindeki konsantrasyonlarda SS nin misel yapılarında bozulmaya yol açtığının bir göstergesi olarak kabul edilmiştir. Misel yapıları üzerinde istatistiksel olarak anlamlı bir etkiye yol açmayan iki konsantrasyon olan 0,5 ve 1 M lık SS çözeltilerinden, daha yüksek PTX çözünürlüğüne sahip olması nedeniyle 1 M lık SS çözeltisi salım ortamı olarak alınmıştır. Benzer sonuçlar SS kullanılarak yapılan in vitro PTX salım çalışmalarında da belirtilmiştir (188,193). In vitro salım yöntemi olarak diyaliz membranı yöntemi seçilmiştir. Bu yöntemde salım ortamı ile ilaç taşıyıcı sistem arasında fiziksel bir ayırım bulunmaktadır. Bu sayede örnek alımı esnasında taşıyıcı sistemden kaynaklanan girişimler olmamaktadır. Bu durum özellikle santrifüj gibi yöntemler ile çöktürülemeyecek boyutlarda olan misel formülasyonları açısından üstünlük sağlamaktadır. Bu yöntem sadece miseller için değil bir çok farklı ilaç taşıyıcı sistem için de kullanılmış olan bir salım yöntemidir ( ). PTX içeren misel formülasyonlarından yapılan in vitro salım çalışmasının sonuçları Şekil 4.15 de verilmiştir. Grafikten görülebileceği üzere 48 saatin sonunda PTX in yaklaşık %73 ü misel yapılarının içerisinden salınmıştır. Grafikten de görülebileceği üzere açık bir patlama etkisi bulunmamaktadır. Bununla birlikte PTX ve ELC yi birlikte içeren misel yapılarından PTX salımı, Şekil 4.16 dan da görülebileceği üzere daha hızlı bulunmuştur. İlk 24 saatin sonunda formülasyonlardan PTX salımı tamamlanmıştır. Ayrıca grafik incelendiğinde, PTX in %80 inin 6. saatte salındığı görülmektedir. Bu durum PTX in tek başına bulunduğu formülasyonlarda görülmemiştir. Salım ortamına eklenen PTX miktarı ve salım ortamının bileşimi aynı olduğu için bu etkinin ELC den kaynaklandığı, ELC nin PTX in salımını arttırdığı düşünülmektedir. 8. Saatten sonra görülen hafif düşüş, PTX in salımının tamamlandığını ve salım deneylerinde ortamdan alınan miktar kadar yeni ortam konulması sebebiyle meydana gelen seyrelmenin etkisini göstermektedir.

158 Modifiye Misellerde Ligandların Aktivitelerinin ELISA ile Kontrolü Hazırlanan misel yapılarının hücresel alımlarının arttırılması için yüzeyleri TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmiştir. Bölüm 3.9 da TATp için 3.10 da ise 2C5 için kullanılan ELISA yöntemi verilmiştir. TATp ile modifiye edilen misellerin ELISA sonuçları Şekil 4.18 de verilmiştir. Sonuçlar incelendiğinde, TATp modifiye misellerin uygulamadan önce 500 kat seyreltilmesi bile yöntemden sonuç alınabilmesini sağlamıştır. Bu durum, olası bir parenteral uygulama sonrasında kan dolaşımında yüksek oranda seyrelecek olan misel yapılarının yüzeylerinde bulunan TATp in aktivite göstermek için yeterli olduğunun bir belirtisidir. Ayrıca misellerin yüzeyine TATp in başarı ile bağlandığının ve dolayısı ile pnp-peg-pe bileşiğinin fonksiyonel bir şekilde ligandları bağlayabildiğinin de bir göstergesidir. 2C5 ile modifiye edilmiş olan misellerde de benzer sonuçlar elde edilmiştir. Bu sonuçlar, özellikle konjugasyon ve diğer hazırlama yöntemleri sonrasında, yüzeyde bulunan ligandların aktivitelerini koruduğunun gösterilmesini sağlamıştır Hücre Kültürü Çalışmaları Kullanılan Hücrelerde P-gp Varlığının Kontrolü Western blot yönteminde daha etkin bir transfer işlemi olabilmesi için proteinler jelden membrana gece boyunca transfer edilmişlerdir. Western blot için verilen farklı protokollerde, daha yüksek voltaj kullanılarak daha kısa sürelerde transfer işlemi gerçekleştirilebileceği belirtilmesine rağmen tam bir transfer işlemi için gece boyunca +4 C de işlem gerçekleştirilmiş ve proteinlerin zarar görmemesi için düşük voltaj değerlerinde çalışılmıştır. Ayrıca deneylerde kullanılan molekül büyüklüğü standartları mavi renkli standartlardır ve ilave bir boyamaya gerek duyulmadan membrana transferlerini takiben rahatlıkla görülebilmektedirler. Bu sayede jelden membrana transferin gerçekleşmiş olduğunun da kontrolü yapılabilmiştir. Şekil 4.20 de elde edilen membran fotoğrafı yer almaktadır ve bir membran proteini olan P-gp nin hücre lizatlarından western blot ile tayininin gerçekleştirilebildiği görülmektedir.

159 144 Yöntemde etkin bir hücre parçalama çözeltisi olan RIPA tamponu kullanılmıştır. Bu işlemler sırasında ortaya çıkan serbest proteazların, incelenmek istenen P-gp yi parçalamamaları için ortama bu enzimleri inhibe edecek bir proteaz inhibitör kokteyli de eklenmiştir. Hücrelere RIPA tamponu eklendikten sonraki bütün basamaklar buz üzerinde gerçekleştirilmiştir. Şekil incelendiğinde, MDCKII-MDR1 hücrelerinin membranlarında bulunan P-gp ye ait bantlar rahatlıkla görülebilmektedir. Diğer kullanılan hücre hatlarında ise P-gp ye ait bantlar görülememiştir. Western blot analizleri ile elde edilen sonuçları doğrulama ve daha hassas bir yöntem ile P-gp varlığını göstermek amacıyla akış sitometrisi yöntemi de kullanılmış ve elde edilen sonuçlar Şekil de verilmiştir. elde edilen sonuçlara göre MDCKII-MDR1 hücrelerinde P-gp ekspresyonu doğrulanmıştır. Bu doğrulamanın yapılması, sitotoksisite deneylerinden önce hangi hücrelerin P-gp ekspresyonu gösterdiğinin bilinmesini sağlamıştır Geliştirilen Formülasyonların Sitotoksisitelerinin Araştırılması PTX ve CYC İçeren Modifiye Edilmemiş Miseller Caco-2 hücrelerinde ön çalışma olarak PTX ve CYC içeren misellerin hücre canlılığı üzerindeki etkilerine bakılmıştır. Şekil 4.26 de verilen sonuçlar değerlendirildiğinde, boş misel yapılarının hücre canlılığı üzerinde bir etki göstermediği, bununla birlikte misel yapısı içerisine hapsedilen PTX in kontrol grubuna göre hücre canlılığında anlamlı bir düşüş gösterdiği bulunmuştur. Misel yapıları içerisine PTX ile birlikte CYC hapsedildiğinde ise en yüksek etkinlik elde edilmiştir. Caco-2 hücreleri, membran yüzeylerinde P- gp eksprese eden hücrelerdir ve bu sebeple de P-gp substratı olan bileşikleri hızla hücre içerisinden uzaklaştırabilirler. CYC gibi bir P-gp inhibitörünün verilmesi geçici de olsa bu pompaları inhibe ettiği için daha yüksek miktarda PTX hücreler içerisinde kalarak toksisitesini gösterebilmiştir. Caco-2 hücrelerinde bulunan yüksek P-gp pompası aktivitesinin PTX ve bir P-gp inhibitörünün birlikte kullanılması ile azaltılabileceği sonucu, ileri çalışmalar için hipotezimizi destekler nitelikte bulunmuştur.

160 145 Şekil 4.27 te ise P-gp eksprese ettiği akış sitometrisi deneyleri ile de doğrulanmış olan MDCKII-MDR1 hücreleri üzerinde elde edilen sonuçlar verilmiştir. Dikkat edilmesi gereken nokta, formülasyonların hücrelere uygulanmadan önce, HPLC ile analiz edilerek içerdikleri PTX miktarına göre normalize edildikleridir. Buna göre, uygulanan formülasyonlardaki ve çözeltilerdeki PTX miktarları aynıdır. Bu sayede formülasyonun etkisinin araştırılması amaçlanmıştır. Sonuçlar incelendiğinde, PTX çözeltisinin uygulandığı grupta elde edilen canlılığın, PTX ve CYC yi birlikte içeren çözeltilerden elde edilen canlılıktan daha yüksek olduğu görülmektedir. Bu sonuç, PTX ile aynı ortamda bulunan CYC nin hücrelerin membranında bulunan P-gp yi inhibe ederek PTX in hücre dışına atımını engellediğini göstermektedir. P-gp nin bir P-gp modülatörü ile inhibe edilmesinin antikanser ilacı hücre dışına atmasının önüne geçtiği hipotezi doğrulanmaktadır. Sadece PTX içeren misellerin sitotoksisitesi ise, Vitamin E içersin ya da içermesin, serbest haldeki PTX den daha yüksek bulunmuştur. Bu durum tek başına miseller enkapsülasyonun bile P-gp aktivitesinden kaçılabilmesine olanak sağladığını göstermektedir. İki etkin maddeyi de birlikte içeren miseller ise en yüksek aktiviteyi gösteren grup olmuştur. P-gp nin misel yapısı içerisinde verilen CYC ile inhibisyonu daha yüksek olduğu için, PTX in hücre dışına atılmasının önüne daha etkili bir şekilde geçilebilmiş ve bu sayede sitotoksisite arttırılabilmiştir. Bu sonuçlar, P-gp aracılı direnç gelişmiş olan hücrelerde misel içine enkapsüle edilmiş PTX in serbest ilaçtan daha yüksek etkinlik gösterdiğini, bununla birlikte misel yapısı içerisine hapsedilen CYC nin kullanıldığı formülasyonlarda, dirençli hücrelerde PTX e karşı hassasiyetin tekrar kazandırılabildiğini desteklemektedir. Vitamin E nin hücre canlılığı üzerine etkisi anlamlı bulunmamıştır. Buna göre, daha yüksek yükleme etkinliği sağladığı için sonraki deneylerde 85:15 mol oranında (PEG-PE.Vitamin E) Vitamin E içeren miseller kullanılmaya devam edilmiştir. Etkin madde içermeyen miseller ise kontrol grubuna göre bir sitotoksisite göstermemişlerdir. Hatta bazı boş formülasyonlarda hücre canlılığında hafif bir artış da görülmüştür. Bu artışın sebebi olarak misellerin hazırlanmasında

161 146 kullanılan ve kendisi de aynı zamanda membran lipidi içeren PEG-PE nin hücre çoğalmasında ve bölünmesinde pozitif yönde bir etkisi olması düşünülmektedir. Şekil 4.28 da ise, hazırlanan formülasyonların uygulandıktan 24 saat MDCKII-Parental ve MDCKII-MDR1 hücreleri üzerindeki etkisi incelenmiştir. MDCKII-Parental hücreleri membranlarında P-gp içermedikleri için PTX in hücre dışına atılımını gerçekleştirememektedirler. Bu sebeple serbest PTX bile son derece yüksek bir sitotoksisite göstermiştir. Miseller PTX ya da PTX ve CYC yi birlikte içeren formülasyonların MDCKII-Parental hücrelerine etkisi son derece yüksek bulunmuştur. Bununla birlikte bu hücrelerin P-gp eksprese eden türlerinde, aynı dozda uygulanan PTX in hücre canlılığına etkisi yaklaşık 3 kat daha az bulunmuştur. Bu karşılaştırma PTX in etkin bir P-gp substratı olduğunu ve etkinliğine karşı gelişen dirençte temel olarak P- gp aktivitesinin rol oynadığını göstermektedir. P-gp içermeyen hücrelerde son derece yüksek PTX aktivitesi ve aşırı P-gp eksprese eden hücrelerde bir inhibitör varlığı ile bu etkinin arttırılabilmesi bu durumu doğrulamaktadır. PTX ve CYC İçeren Ligand ile Modifiye Edilmiş Miseller PTX ve CYC içeren misellerin TATp ya da 2C5 antikoru ile modifiye edilmesinden sonra sitotoksisite çalışmaları ilk olarak MCF-7 meme kanseri hücrelerinde gerçekleştirilmiştir. Şekil 4.29 da 24 saatlik hücre canlılığı sonuçları bulunmaktadır. Sonuçlar incelendiğinde PTX çözeltisi ile PTX-CYC çözeltisinin hücre canlılığına etkisi arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır. Bu durum CYC nin serbest çözelti halinde PTX in hücre dışına atılımı üzerinde anlamlı bir etkisi olmadığını göstermektedir. Modifiye olmayan misellere bakıldığında; sadece PTX içeren misellerin etkinlikleri, PTX serbest çözeltisinden düşük miktarda da olsa yüksek bulunmuştur, fakat bu fark istatistiksel olarak anlamlı değildir. Her iki etkin maddeyi de içeren formülasyonlar ise PTX in serbest çözeltisinden daha etkin bulunmuştur. Vitamin E varlığının sitotoksisite üzerinde anlamlı bir etkisi yoktur. TATp ile modifiye edilen misellerde ise durum daha farklıdır. Sadece PTX içeren ve TATp ile modifiye edilmiş miseller hücre canlılığını serbest

162 147 PTX çözeltisine göre daha fazla düşürmüştür. Bu durum TATp ile modifikasyonun, modifiye edilmemiş misellere oranla formülasyonların hücresel alımlarını arttırdığını göstermektedir. İki etkin maddenin de TATp modifiye misellere eklenmesi, sadece PTX misellerinden de daha yüksek aktivite elde edilmesini sağlamıştır. TATp in uzun PEG zincirlerinin ucuna bağlanması ve bu sayede serbestçe hücre membranıyla etkileşebilmesi sayesinde misellerin hücresel alımını arttırdığı gösterilebilmiştir. TATp in bu özelliği literatürde de açıklanmıştır (116,117). TATp büyük kargo moleküllerine bağlandığında onların hücre içine alımını makropinositoz ile sağlamaktadır (114,115). Bu mekanizma ile hücresel alımın en büyük avantajı endozomal kaçış sağlayabilmesidir. Etkin maddemiz olan PTX etkisini hem mikrotübüller üzerinde hem de mitokondriyel apoptosis yolağı üzerinde göstermektedir. Bu sebeple sitoplazmaya ulaşması ve hücre içinde salımı bütün antikanser etkin maddelerde olduğu gibi oldukça önemlidir. Hem makropinositoz ile hücre alımı artan hem de endozomal kaçış ile hücre içinde lizozomal enzimler tarafından parçalanmadan yüksek miktarlarda salınabilen PTX in etkinliği bu sayede artmıştır. Sawant ve diğ. (228) yaptıkları çalışmada PEG-PE miselleri hazırlamışlar ve bu miselleri TATp ile modifiye etmişlerdir. Kullandıkları PEG- PE polimerindeki PEG zinciri 750 Da, pnp-peg-pe bileşiğindeki PEG zinciri ise 1000 Da uzunluğundadır. PTX yüklü bu misel yapıları ile MCF-7 hücrelerinde yaptıkları sitotoksisite çalışmasında, TATp ile modifiye edilmiş misellerin modifiye edilmemiş misellere göre daha yüksek etkinlik gösterdiklerini belirtmişlerdir. Sethuraman ve diğ. ise (229) PLLA-b-PEG polimerik miselleri hazırlamışlar ve misel yüzeyini TATp ile modifiye etmişlerdir. MCF-7 hücreleri üzerinde yaptıkları çalışmalarda TATp modifiye edilmiş misellerin hücresel alımlarının daha yüksek olduğunu, ayrıca TATp in miselleri hücre çekirdeğine yakın konuma kadar ulaştırabildiğini gözlemişlerdir. TATp ile sağlanan bu özellik, modifiye edilmemiş misellere göre etkinlik artışını açıklayıcı bir bilgidir.

163 148 Literatürde yer alan bu çalışmalardan farklı olarak, tez çalışmalarında TATp içeren PEG-PE misellerine bir P-gp inhibitörünün de eklenmesi gerçekleştirilebilmiş ve bu sayede TATp ile modifikasyon yapılmış olan misellerin aktivitesi daha da arttırılabilmiştir. 2C5 ile modifiye edilmiş misellerin MCF-7 hücrelerindeki etkinlikleri incelendiğinde ise (Şekil 4.29) hiç bir grup arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulunamamıştır (P>0,05). PTX ya da PTX ile CYC nin birlikte enkapsülasyonu sitotoksisitede bir artışa yol açmamıştır ve MCF-7 hücrelerine karşı en yüksek etkinlik 2C5 antikoru ile modifiye edilmiş misellerde sağlanmıştır. MDCKII-MDR1 hücrelerinde PTX ve CYC içeren misel formülasyonlarının sitotoksisiteleri araştırıldığında elde edilen sonuçlar Şekil 4.30 da verilmiştir. MDCKII-MDR1 hücrelerinin aşırı P-gp eksprese ettikleri daha önceki çalışmalarda doğrulanmış ve tartışılmıştır. PTX ve CYC yi birlikte içeren serbest ilaç çözeltisinin etkinliği, CYC nin P-gp yi inhibe etmesine bağlı olarak, sadece PTX çözeltisinden daha yüksek bulunmuştur. PTX in modifiye olmayan misel yapıları içerisine enkapsülasyonu serbest ilaç çözeltisine göre düşük miktarda da olsa bir etkinlik artışına yol açmıştır. Buna göre miseller enkapsülasyon ile P-gp den az da olsa kaçış sağlanabilmektedir. Her iki maddeyi de içeren modifiye olmayan misellerdeki toksisite artışı ise son derece yüksek bulunmuştur. CYC nin misel yapısı içerisinde bulunması ile onun da hücresel alımı serbest ilaç çözeltisine göre arttırılmış ve PTX in hücre dışına atılmasını engelleme kapasitesi yükselmiştir. Sadece PTX içeren misellerde TATp ile modifikasyon Vitamin E içermeyen misellerde sitotoksisitede artışa yol açarken Vitamin E içeren misellerde anlamlı bir etki göstermemiştir. Her iki maddeyi de içeren TATp modifiye misellere bakıldığında da Vitamin E içermeyen misel yapılarında etkinlikte artış görülebilmiştir. TATp modifikasyonu ile hücresel alımın artışı ve sebepleri ile ilgili bilgiler yukarıda verilmiştir. MDCKII-MDR1 hücrelerinde 2C5 ile modifiye edilmiş misel formülasyonları incelendiğinde ise MCF-7 hücrelerinde elde edilen sonuçlara

164 149 benzer sonuçlar bulunmuştur. 2C5 modifikasyonu yapılmış miseller tüm gruplar içinde en yüksek sitotoksisiteyi göstermiştir. Bununla birlikte grup içinde formülasyonlar arasında bir farklılık yoktur. 2C5 ile modifikasyon yapılmış misellerin hücre canlılığını %75 azaltması dikkat çeken bir orandır. Elde edilen sonuçlara göre tek başına PTX içeren misellerde mab 2C5 ile modifikasyon direnç gelişmiş olan MDCKII-MDR1 hücrelerini PTX e karşı tekrar hassas hale getirebilmektedir. 2C5 ın hücresel alımı ve bağlı olduğu ilaç taşıyıcı sistemlerin hücre içine taşınımını arttırdığı daha önceki çalışmalarda gösterilmiştir (52,72,122,187). Bir çok kanser türünün yüzeyinde bulunan nükleohistonları tanıyabilme özelliği gösteren (121,122) bu monoklonal antikor, terapötik dozlarında antikor bağımlı hücresel sitotoksisite göstermektedir. Örneğin Iabukov ve diğ. (230) 2C5 ın EL4 T hücresi lenfoması taşıyan C57BL/6 farelerinde ilaca direnç gösteren tümörün büyümesini engellediğini göstermişlerdir. Bu bilgiler ışığında misellere konjuge edilen 2C5 miktarının terapötik dozdan düşük olmasına rağmen, 2C5 ın sitotoksik etkisi ile birlikte PTX in antikanser etkisinin sinerjistik olarak birleştiği ve yüksek antikanser etkinlik elde edilebildiği düşünülmektedir (123,124). PTX ve ELC İçeren Modifiye Edilmemiş Miseller PTX ve ELC içeren misel formülasyonları arasından D formülasyonu, yani Vitamin E içermeyen ve yüksek oranda (%10, a/a) PTX içeren formülasyon hücre kültürü çalışmalarında kullanılmıştır. Kanser hücrelerinde sitotoksisite çalışmalarında ELC nin P-gp inhibisyonu gösterebilmesi için gerekli olan konsantrasyonda miseller içerisinde bulunması gereklidir. Bu sebeple, uygulamalardan önce misel formülasyonları, ELC içerikleri 0,5 µm civarında olacak şekilde seyreltilmişlerdir. Bun seyreltme yapılırken yine PTX miktarları da formülasyonlar arasında aynı olmalıdır. Şekil 4.31 ve 4.32 de MCF-7 hücrelerindeki 24 ve 48 saatlik sitotoksisite sonuçları verilmiştir. Her iki grafikte elde edilen cevaplar benzerdir. Hücrelerin formülasyonlar ile 48 saatlik inkübasyonları sonucunda elde edilen canlılık değerleri 24 saatlik inkübasyondan daha düşük bulunmuştur. Grafiklerden de görülebileceği üzere boş misel formülasyonları

165 150 MCF-7 hücrelerinde herhangi bir toksik etki göstermemektedir. Ayrıca yine PTX serbest çözeltisi ile PTX ve ELC nin serbest çözeltileri arasında bir farklılık yoktur. Bununla birlikte PTX in misel yapıları içerisine enkapsülasyonu, MCF-7 hücrelerinde, yüksek miseller alım sayesinde toksisitede anlamlı bir artış sağlamıştır ve 48 saat sonunda hücre canlılığını %42 oranında azaltmıştır. PTX ile ELC nin de misel yapılarına eklenmesi ile bu artış çok daha belirgin olmuş ve hem 24 hem de 48 saat sonunda en yüksek etkinlik her iki etkin maddeyi de içeren misel formülasyonlarında görülmüştür. MDCKII-Parental hücrelerinde elde edilen sonuçlar ise Şekil 4.33 de verilmiştir. şekilden de görülebileceği üzere boş miseller bile kontrol grubuna oranla anlamlı bir toksisite göstermektedirler. P-gp pompası olmayan bir hücre hattı olan MDCKII-Parental hücrelerinde, ELC nin inhibisyon etkisini göstereceği bir mekanizma da bulunmadığı için, serbest PTX, miseller PTX ve miseller PTX-ELC formülasyonları arasında sitotoksisite açısından anlamlı bir fark bulunmamıştır. Bununla birlikte MDCKII-MDR1 hücrelerinde elde edilen sonuçlarda (Şekil 4.34) boş miseller direnç gelişmiş olan bu hücre hattında bir toksik etki göstermemişlerdir. Serbest ilaç çözeltilerinde de MDCKII-Parental hücrelerine göre farklı sonuçlar görülmüştür. Serbest PTX tek başına uygulandığında hücre canlılığını %19 oranında azaltmışken, ELC ile birlikte uygulanan çözelti hücre canlılığını %25 oranında azaltmıştır. Bu sonuç ELC nin MDCKII-MDR1 hücrelerindeki P-gp pompalarını inhibe ederek kanser hücrelerinde sitotoksisiteyi arttırdığını göstermektedir. PTX içeren miseller ise tek başına PTX çözeltilerinden daha yüksek etkinliğe sahiptirler. Miseller enkapsülasyon sayesinde P-gp pompası aktivitesinden kaçış olabilmiştir. Benzer sonuçlar (70) Dabholkar ve arkadaşları tarafından da elde edilmiş ve miseller enkapsülasyon ile kısıtlı da olsa P-gp pompası aktivitesinden kaçılabildiği belirtilmiştir. Her iki etkin maddeyi de birlikte içeren misel formülasyonlarında ise elde edilen etkinlik en yüksek etkinliktir. Polimerik miseller ile dirençli hücrelerde MDR geri çevrilmesi ile ilgili bir çok çalışma bulunmaktadır. Batrakova ve diğ. (231) ve Kabanov ve diğ.

166 151 (232) Pluronic P85 miselleri kullanarak P-gp aktivitesini inhibe etmişlerdir. Pluronic miselleri oluşturma yeteneğine sahip unimerlerin P-gp aktivitesi için gerekli olan ATP sentezini inhibe ederek pompanın fonksiyonunu engellediğini bildirmişlerdir. Zhang ve diğ. ise (233) P123/F127 Pluronic miselleri hazırlamışlar ve PTX ile yüklemişlerdir. Direnç gelişmiş olan hücrelerde P-gp aracılı direncin önüne geçiş mekanizması olarak Pluronic in ATP harcanmasını bloke ettiğini öne sürmüşlerdir. Pluronic misellerinin bu özellikleri farklı direnç gelişmiş hücrelerde de direncin geri çevrilmesi amacıyla kullanılmıştır (234,235). Pluronic miselleri çoklu ilaç direncinin geri çevrilmesi için kullanılan tek misel yapısı değildir. Dabholkar ve diğ. PEG-PE miselleri kullanmışken, Li ve diğ. (194) gibi araştırmacılar da mpeg-plla misellerini kullanarak P-gp aracılı direncin önüne geçmeye çalışmışlardır. PTX ve ELC İçeren Ligand ile Modifiye Edilmiş Miseller PTX ve ELC içeren misellerin TATp ya da 2C5 ile modifiye edilmesi ile hazırlanan formülasyonlar MCF-7 hücrelerine uygulanmış ve sitotoksisite grafikleri Şekil 4.35 ve 4.36 da verilmiştir. 24 saatlik ve 48 saatlik uygulama arasında hücre canlılıkları değerleri dışında bir fark bulunmamaktadır. TATp ile modifiye edilmiş olan misel formülasyonları 48 saat sonunda kanser hücrelerinin canlılığını %50 oranında azaltmıştır. TATp ile modifiye edilmemiş miseller ile aynı süre sonunda canlılıkta %33 lük bir azalma elde edilebilmiştir. Bu durum TATp in hücresel alımı arttırıcı etkisinden kaynaklanmaktadır ve yukarıdaki bölümlerde ayrıntılı olarak tartışılmıştır. PTX ile ELC nin de misel formülasyonlarına katılması ile TATp modifiye misellerde etkinlik daha da yükselmiş ve hücre canlılığı %60 oranında azaltılabilmiştir. 2C5 ile modifiye edilen misellerin ise en yüksek etkinlik gösterdiği görülmektedir. Bunun olası sebebi olarak 2C5 ın kendisinin de PTX e ek olarak tümör büyümesini inhibe etmesi düşünülmektedir. 2C5 ile modifiye edilen misellere PTX ile birlikte CYC eklendiğinde, iki etkin maddenin de formülasyona eklenmesinin toksisitede bir artış sağlamadığı görülmüştür. Oysa PTX ile ELC içeren misellerde, 2C5 ile modifikasyon yapılması TATp e

167 152 ve modifiye olmayan misellere göre daha yüksek etkinlik sağlarken, iki etkin maddenin de yapıya girmesi, etkinlikte daha da artış sağlamıştır. Bu durumun, ELC nin yarışmalı olarak değil konformasyonel ve seçici olarak P- gp ye bağlanarak onu daha etkin ve tam bir şekilde, geri dönüşsüz olarak inhibe etmesinden kaynaklandığı düşünülmektedir. MCF-7 hücrelerinde yapılan akış sitometrisi ve western blot analizleri sonunda bu hücrelerde P-gp aktivitesi görülmemiştir. Bununla birlikte elde edilen sonuçlar bir P-gp inhibitörü olan ELC nin formülasyona eklenmesi ile PTX in etkinliğinde artışın görüldüğü yönündedir. Her ne kadar direnç gelişmiş hücrelerde MDR ABCB1 (P-gp) temel olarak membranda lokalize olmuş olsa da, P-gp nin ekspresyon bölgeleri olarak diğer başka hücresel kompartmanlar da bulunmaktadır. Bunlar arasında çekirdek ve çekirdek zarı, sitoplazma için ve genellikle golgi cisimciği bağlantılı veziküller sayılabilir. Bu bölgelerdeki P-gp lokalizasyonu ilaç direnci gelişmesinde ve sürdürülmesinde önem taşımaktadır (6). ELC nin membrandan ziyade hücre içi kompartmanlarda bulunan P-gp yi inhibe ederek PTX in etkinliğini arttırmış olabileceği hipotezi geliştirilmiştir. Şekil 4.37 de verilen MDCKII-Parental hücrelerindeki sitotoksisite grafiğinde, serbest PTX çözeltisi, PTX miselleri ve PTX-ELC miselleri arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark görülmemiştir. Bununla birlikte TATp ya da 2C5 modifikasyonu ile birlikte iki etkin maddeyi de içeren misellerde, istatistiksel olarak anlamlı olmamakla (P>0,05) birlikte, hücre canlılığında hafif bir azalma göze çarpmaktadır. Şekil 4.38 de ise direnç gelişmiş MDCKII-MDR1 hücrelerinde modifiye edilmiş misellerin uygulanması ile elde edilen hücre canlılığı sonuçları verilmiştir. Şekilden görülebileceği üzere, modifiye olmayan misellerde sadece PTX içeren formülasyonun etkinliği serbest ilaca göre daha yüksek bulunmamıştır. Ancak ELC nin de misel yapısına girmesi ile hücresel canlılık değerlerinde düşüş elde edilebilmiştir. Bununla birlikte ligand eklenmesi, modifiye olmayan misellere göre hücresel alımı önemli ölçüde arttırdığı için canlılık değerlerinde düşüş sağlanabilmiştir. Sadece PTX içeren misellerin TATp ile modifikasyonu hücre canlılığını %19 azaltırken 2C5 ile modifikasyon

168 153 ile bu azalma %24 oranında bulunmuştur. PTX ve ELC yi birlikte içeren misel formülasyonlarının uygulanması ile elde edilen hücresel canlılık değerleri arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır, hücresel canlılık değerleri iki grup için de %26 oranında azalmıştır. P-gp inhibitörü bileşiklerin antikanser etkin maddeler ile bir arada uygulanması son yıllarda gittikçe yaygınlık gösteren bir uygulama olarak karşımıza çıkmaktadır. Bazı çalışmalarda antikanser etkin maddeler ilaç taşıyıcı sistem içerisine hapsedilmiş ve P-gp inhibitörleri serbest çözelti halinde uygulanmıştır (236). Fakat P-gp inhibitörü serbest çözelti halinde uygulandığında tüm dokulara ve organlara dağılmakta ve bu dokulardaki bütün P-gp pompalarını non-spesifik olarak inhibe etmektedir. Bu durum fizyolojik rolü olan P-gp pompalarının da inhibe olmasına yol açabilmektedir. Bu durumun önüne geçilmesi için P-gp inhibitörünün de aynı bir antikanser etkin madde gibi hedeflendirilmesini gerektirmektedir. Wong ve diğ. (145) ELC yi doksorubisin ile birlikte polimer lipit hibrit nanokürelerine yüklemişler ve bu sistem ile geliştirilen nanokürelerin ilaç direncini geri çevirebildiğini görmüşlerdir. Benzer sonuçlar PTX ve tariquidar enkapsüle edilmiş PLGA nanokürelerinde (237) ve vinkristin verapamil yüklenmiş PLGA nanokürelerinde de elde edilebilmiştir (238). Aynı şekilde Patel ve diğ. (239) tarafından PTX ve tariquidar yüklü kanda kalış süresi uzatılmış lipozom formülasyonları geliştirilmiştir. Bu sistemler PTX e karşı dirençli SKOV3-TR hücrelerinde direnci başarı ile geri çevirebilmişlerdir. Tez çalışmaları kapsamında geliştirilen misel formülasyonlarının hedeflenen uygulama şekli intravenöz uygulamadır. Bu uygulama yolunda her zaman göz önünde tutulması gereken en önemli konulardan birisi formülasyonların sterilizasyonudur. Çalışılan misel formülasyonlarının partikül büyüklüğü değerleri nm aralığında olduğu için laminar akış kabini içinde steril 0,22 µm lik filtrelerden süzülerek sterilizasyonları mümkündür. Formülasyonların karakterizasyon çalışmaları kapsamında gerçekleştirilen enkapsülasyon etkinliği deneylerinde formülasyonlar hapsedilememiş etkin maddenin uzaklaştırılabilmesi için 0,22 µm lik filtrelerden süzülmüşlerdir. Bu süzme işleminin misel yapısı üzerinde

169 154 olumsuz bir etkisi olmadığı da, yine enkapsülasyon etkinliğinin hesaplanması ve partikül büyüklüğü ölçümü için yapılan deneyler sırasında gösterilmiştir. PEG-PE temelli misel sistemleri ile yapılan çalışmalarda, küçük partikül boyutlarının filtrasyon ile sterilizasyona izin verdiği literatürde de belirtilmiştir

170 SONUÇ VE ÖNERİLER Tez çalışmalarında sentezlenen pnp-peg-pe bileşiğinin sentez ve saflaştırma yöntemi Anabilim Dalımızda ilk defa gerçekleştirilen bir işlem olmuştur. Bu şekilde diğer araştırmacılara bir örnek teşkil edebilecektir. PTX içeren ve aktif hedeflendirme ligandı ile modifiye edilmiş (TATp ya da 2C5) PEG-PE temelli misel formülasyonları geliştirilmiş, gerekli karakterizasyon çalışmaları yapılmıştır. Konjugasyon ve diğer hazırlama yöntemleri sonrasında, yüzeyde bulunan ligandların (TATp ve 2C5) aktivitelerini koruyarak formülasyonun başarılı bir şekilde hazırlandığını göstermiştir. CMC belirlenmesi için pyrene yöntemi ve boyut ayırma kromatografisi kullanılmıştır. Elde edilen sonuçlara göre, CMC değerleri son derece düşük, dolayısı ile seyreltmeye karşı son derece dayanıklı misel formülasyonları hazırlanabilmiştir. Yüzeylerinde PEG zincirleri içeren bu sayede kanda kalış süreleri uzatılmış misel yapılarının içerisine iki farklı P-gp inhibitörü enkapsüle edilebilmiştir. Misel formülasyonlarının ligand ile konjugasyonu partikül büyüklüklerinde anlamlı bir farka yol açmadığı bulunmuştur. Artan başlangıç PTX yükleme konsantrasyonunun, PTX ve ELC nin birlikte enkapsüle edildiği Vitamin E içermeyen misellerde artan ELC enkapsülasyonuna yol açtığını gösterilmiştir. Vitamin E ile ELC arasında molekül yapısı ve şekline bağlı olarak bir yarışma olabileceği sonucuna varılmıştır. PTX içeren misel formülasyonlarından in vitro salım deneylerinde salım ortamı olarak sink koşulları sağlayabilmek için 1 M lık SS çözeltisinin kullanılabileceği gösterilmiştir. Western Blot ve akış sitometrisi tekniği ile MDCKII-MDR1 hücrelerinde P-gp ekspresyonu doğrulanmıştır. Hücrelerde yüksek P-gp pompası aktivitesinin PTX ve bir P-gp inhibitörünün birlikte kullanılması ile azaltılabileceği gösterilmiştir.

171 156 P-gp aracılı direnç gelişmiş olan hücrelerde misel içine enkapsüle edilmiş PTX in serbest ilaçtan daha yüksek etkinlik gösterdiği görülmüştür. Misel formülasyonlarının aktif hedeflendirme ligandı ile modifiye edilmesi ile birlikte kanser hücrelerine karşı gösterdikleri sitotoksisite artmıştır. TATp ile modifikasyonun misel formülasyonlarının hücresel alımını arttırdığı gösterilmiştir. Olası endozomal kaçış ve artan alımın bu sonucu doğurduğu düşünülmektedir. 2C5 ın hücresel alımı ve bağlı olduğu ilaç taşıyıcı sistemlerin hücre içine taşınımını arttırdığı gösterilmiştir. Modifikasyonda kullanılan iki ligand karşılaştırıldığında 2C5 ın daha etkili olduğu ve misel formülasyonlarının antikanser etkinliklerini arttırdığı bulunmuştur. Antikanser etkin madde olan PTX ile birlikte bir P-gp inhibitörü içeren mişsellerin kullanılması ile MDCKII-MDR1 hücrelerinde direnç geri döndürülebilmiştir. Bununla birlikte sadece PTX içeren ama 2C5 ile modifiye edilmiş miseller de aynı etkiyi göstermişlerdir. İleriye yönelik çalışmalar için öncelikle ELC nin kullanılmaya devam edilmesi düşünülmektedir. CYC ile kıyaslandığında çok daha düşük konsantrasyonlarda P-gp inhibisyonu yapabilmesi, inhibisyonun geri dönüşümsüz olması ve inhibisyon yaptığı konsantrasyonlarda bir fizyolojik etki göstermemesi ELC nin yeri tutulamayacak üstünlükleridir. Aktif hedeflendirme ligandları arasından 2C5 ile çalışmalara devam edilmesi, daha yüksek antikanser etki görülebilmesi açısından önerilmektedir. Bununla birlikte, TATp ile artan hücresel alımın endozomal kaçışa yol açabileceği de unutulmamalı ve özellikle misel yapısı içerisine protein yapıda etkin maddelerin yüklenmesi halinde, hem molekülün parçalanmadan korunabileceği hem de hücresel alımın artabileceği göz önünde bulundurulmalıdır. İleriye yönelik olarak hazırlanan bu taşıyıcı sistemler in vivo olarak uygulanıp, TATp ve 2C5 ile modifiye edilmiş misellerin etkinlik karşılaştırması

172 157 ve biyodağılıma çalışmaları yapılabilir. Geliştirilen bu sistemlerin özellikle suda çözünürlüğü düşük olan, yüksek toksisiteye sahip ve P-gp substratı olan farklı antikanser etkin maddeler için ilaç taşıyıcı sistem olarak kullanılabileceği düşünülmektedir. Ayrıca bu sistemlerin etkinlikleri MDCKII- MDR1 hücreleri dışında P-gp aracılı çoklu ilaç direnci gösteren diğer hücrelerde de araştırılabilir.

173 158 KAYNAKLAR 1.United States Pharmacopeia 31-NF 26. (2007). United States Pharmacopeia (c. 3, s. 2899). Rockville, MD, USA: The United States Pharmacopeial Convention 2.Lee, J., Choi, J.Y.,Park, C.H. (2008) Characteristics of polymers enabling nano-comminution of water-insoluble drugs. International journal of pharmaceutics, 355 (1 2), Liggins, R.T., Hunter, W.L.,Burt, H.M. (1997) Solid-state characterization of paclitaxel. J Pharm Sci, 86 (12), Adams, J.D., Flora, K.P., Goldspiel, B.R., Wilson, J.W., Arbuck, S.G.,Finley, R. (1993) Taxol: a history of pharmaceutical development and current pharmaceutical concerns. J Natl Cancer Inst Monogr (15), Shikanov, A., Shikanov, S., Vaisman, B., Golenser, J.,Domb, A.J. (2008) Paclitaxel tumor biodistribution and efficacy after intratumoral injection of a biodegradable extended release implant. International journal of pharmaceutics, 358 (1-2), Greenberger, L.M.,Sampath, D. (2006). Resistance to Taxanes. B. A. Teicher (Ed.). Cancer Drug Resistance (s ). Totowa, New Jersey: Humana Press 7.Wang, T.H., Wang, H.S.,Soong, Y.K. (2000) Paclitaxel-induced cell death: where the cell cycle and apoptosis come together. Cancer, 88 (11), Bacus, S.S., Gudkov, A.V., Lowe, M., Lyass, L., Yung, Y., Komarov, A.P. ve diğerleri. (2001) Taxol-induced apoptosis depends on MAP kinase pathways (ERK and p38) and is independent of p53. Oncogene, 20 (2), Zhou, H.B.,Zhu, J.R. (2003) Paclitaxel induces apoptosis in human gastric carcinoma cells. World J Gastroenterol, 9 (3), Park, S.J., Wu, C.H., Gordon, J.D., Zhong, X., Emami, A.,Safa, A.R. (2004) Taxol induces caspase-10-dependent apoptosis. The Journal of biological chemistry, 279 (49), Sugimura, M., Sagae, S., Ishioka, S., Nishioka, Y., Tsukada, K.,Kudo, R. (2004) Mechanisms of paclitaxel-induced apoptosis in an ovarian cancer cell line and its paclitaxel-resistant clone. Oncology, 66 (1), Xu, R., Sato, N., Yanai, K., Akiyoshi, T., Nagai, S., Wada, J. ve diğerleri. (2009) Enhancement of paclitaxel-induced apoptosis by inhibition of mitogen-activated protein kinase pathway in colon cancer cells. Anticancer research, 29 (1), Dorr, R.T. (1994) Pharmacology and toxicology of Cremophor EL diluent. Ann Pharmacother, 28 (5 Suppl), S Gelderblom, H., Verweij, J., Nooter, K.,Sparreboom, A. (2001) Cremophor EL: the drawbacks and advantages of vehicle selection for drug formulation. European Journal of Cancer, 37 (13), The NIH Common Fund-Nanomedicine Overview , 2012, Ağ

174 159 Sitesi: 16.Kaş, H.S. (2002). İlaç Taşıyıcı Partiküler Sistemler. Z. Gürsoy (Ed.). Kontrollü Salım Sistemleri (s ). İstanbul: Elma Bilgisayar Basım ve Ambalaj San. Tic. Ltd. Şti. 17.Nanotechnology at NIH , 2012, Ağ Sitesi: 18.Himmelweit, F. (1956). The Collected Papers of Paul Ehrlich (c. 1). New York: Pergamon Press. 19.Torchilin, V.P. (2007) Micellar nanocarriers: pharmaceutical perspectives. Pharm Res, 24 (1), Lipinski, C.A., Lombardo, F., Dominy, B.W.,Feeney, P.J. (2001) Experimental and computational approaches to estimate solubility and permeability in drug discovery and development settings. Adv Drug Deliv Rev, 46 (1-3), Teicher, B.A. (1997). Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, and Approval. Totowa, New Jersey: Humana Press. 22.Ansel, H.C., Popovich, N.G.,Allen, L.V. (1995). Pharmaceutical dosage forms and drug delivery systems (6th bs.). Baltimore: Williams & Wilkins. 23.Lasic, D.D.,Papahadjopoulos, D. (1998). Medical applications of liposomes. Amsterdam ; New York: Elsevier. 24.Thompson, D.,Chaubal, M.V. (2002) Cyclodextrins (CDS) Excipients by Definition, Drug Delivery Systems by Function (Part I: Injectable Applications). Drug Development and Delivery, 2 (7). 25.Surfactants in Solution (c. 1). (1996). New York: Marcel Dekker Inc. 26.Batrakova, E.V., Bronich, T.K., Vetro, J.A.,Kabanov, A.V. (2006). Polymer Micelles as Drug Carriers. V. P. Torchilin (Ed.). Nanoparticulates as Drug Carriers (s ). London: Imperial College Press 27.Jones, M.,Leroux, J. (1999) Polymeric micelles - a new generation of colloidal drug carriers. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.v, 48 (2), Lasic, D.D. (1992) Mixed micelles in drug delivery. Nature, 355 (6357), Torchilin, V.P. (2001) Structure and design of polymeric surfactant-based drug delivery systems. Journal of Controlled Release, 73 (2-3), Allen, C., Maysinger, D.,Eisenberg, A. (1999) Nano-engineering block copolymer aggregates for drug delivery. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 16 (1 4), Gaucher, G., Dufresne, M.H., Sant, V.P., Kang, N., Maysinger, D.,Leroux, J.C. (2005) Block copolymer micelles: preparation, characterization and application in drug delivery. Journal of Controlled Release, 109 (1-3), Batrakova, E.V.,Kabanov, A.V. (2008) Pluronic block copolymers: Evolution of drug delivery concept from inert nanocarriers to biological response modifiers. Journal of Controlled Release, 130 (2),

175 Alakhov, V., Klinski, E., Lemieux, P., Pietrzynski, G.,Kabanov, A. (2001) Block copolymeric biotransport carriers as versatile vehicles for drug delivery. Expert Opinion on Biological Therapy, 1 (4), Exner, A.A., Krupka, T.M., Scherrer, K.,Teets, J.M. (2005) Enhancement of carboplatin toxicity by Pluronic block copolymers. Journal of Controlled Release, 106 (1-2), Vinogradov, S.V., Batrakova, E.V., Li, S.,Kabanov, A.V. (2004) Mixed polymer micelles of amphiphilic and cationic copolymers for delivery of antisense oligonucleotides. Journal of drug targeting, 12 (8), Aliabadi, H.M., Mahmud, A., Sharifabadi, A.D.,Lavasanifar, A. (2005) Micelles of methoxy poly(ethylene oxide)-b-poly(epsilon-caprolactone) as vehicles for the solubilization and controlled delivery of cyclosporine A. Journal of Controlled Release, 104 (2), Aliabadi, H.M., Brocks, D.R.,Lavasanifar, A. (2005) Polymeric micelles for the solubilization and delivery of cyclosporine A: pharmacokinetics and biodistribution. Biomaterials, 26 (35), Xu, P.S., Van Kirk, E.A., Li, S.Y., Murdoch, W.J., Ren, J., Hussain, M.D. ve diğerleri. (2006) Highly stable core-surface-crosslinked nanoparticles as cisplatin carriers for cancer chemotherapy. Colloids and Surfaces B-Biointerfaces, 48 (1), Shuai, X.T., Merdan, T., Schaper, A.K., Xi, F.,Kissel, T. (2004) Corecross-linked polymeric micelles as paclitaxel carriers. Bioconjug Chem, 15 (3), Slepnev, V.I., Kuznetsova, L.E., Gubin, A.N., Batrakova, E.V., Alakhov, V.Y.,Kabanov, A.V. (1992) Micelles of Poly(Oxyethylene)- Poly(Oxypropylene) Block Copolymer (Pluronic) as a Tool for Low- Molecular Compound Delivery into a Cell - Phosphorylation of Intracellular Proteins with Micelle Incorporated [Gamma-32p]Atp1. Biochemistry International, 26 (4), Yokoyama, M., Miyauchi, M., Yamada, N., Okano, T., Sakurai, Y., Kataoka, K. ve diğerleri. (1990) Characterization and anticancer activity of the micelle-forming polymeric anticancer drug adriamycinconjugated poly(ethylene glycol)-poly(aspartic acid) block copolymer. Cancer Res, 50 (6), Yokoyama, M., Okano, T., Sakurai, Y., Ekimoto, H., Shibazaki, C.,Kataoka, K. (1991) Toxicity and antitumor activity against solid tumors of micelle-forming polymeric anticancer drug and its extremely long circulation in blood. Cancer Res, 51 (12), Nakanishi, T., Fukushima, S., Okamoto, K., Suzuki, M., Matsumura, Y., Yokoyama, M. ve diğerleri. (2001) Development of the polymer micelle carrier system for doxorubicin. Journal of Controlled Release, 74 (1-3), Uchino, H., Matsumura, Y., Negishi, T., Koizumi, F., Hayashi, T., Honda, T. ve diğerleri. (2005) Cisplatin-incorporating polymeric micelles (NC- 6004) can reduce nephrotoxicity and neurotoxicity of cisplatin in rats. Br J Cancer, 93 (6), Kim, T.Y., Kim, D.W., Chung, J.Y., Shin, S.G., Kim, S.C., Heo, D.S. ve diğerleri. (2004) Phase I and pharmacokinetic study of Genexol-PM, a

176 161 cremophor-free, polymeric micelle-formulated paclitaxel, in patients with advanced malignancies. Clin Cancer Res, 10 (11), La, S.B., Okano, T.,Kataoka, K. (1996) Preparation and characterization of the micelle-forming polymeric drug indomethacin-incorporated poly(ethylene oxide)-poly(beta-benzyl L-aspartate) block copolymer micelles. Journal of Pharmaceutical Sciences, 85 (1), Katayose, S.,Kataoka, K. (1998) Remarkable increase in nuclease resistance of plasmid DNA through supramolecular assembly with poly(ethylene glycol) poly(l-lysine) block copolymer. Journal of Pharmaceutical Sciences, 87 (2), Sarisozen, C., Vural, I., Levchenko, T., Hincal, A.A.,Torchilin, V.P. (2012) PEG-PE-based micelles co-loaded with paclitaxel and cyclosporine A or loaded with paclitaxel and targeted by anticancer antibody overcome drug resistance in cancer cells. Drug Deliv, 19 (4), Gao, Z.G., Lukyanov, A.N., Singhal, A.,Torchilin, V.P. (2002) Diacyllipidpolymer micelles as nanocarriers for poorly soluble anticancer drugs. Nano Lett, 2 (9), Wang, J., Mongayt, D.A., Lukyanov, A.N., Levchenko, T.S.,Torchilin, V.P. (2004) Preparation and in vitro synergistic anticancer effect of vitamin K3 and 1,8-diazabicyclo[5,4,0]undec-7-ene in poly(ethylene glycol)- diacyllipid micelles. International journal of pharmaceutics, 272 (1-2), Wang, J., Mongayt, D.,Torchilin, V.P. (2005) Polymeric micelles for delivery of poorly soluble drugs: preparation and anticancer activity in vitro of paclitaxel incorporated into mixed micelles based on poly(ethylene glycol)-lipid conjugate and positively charged lipids. Journal of drug targeting, 13 (1), Gao, Z., Lukyanov, A.N., Chakilam, A.R.,Torchilin, V.P. (2003) PEG- PE/phosphatidylcholine mixed immunomicelles specifically deliver encapsulated taxol to tumor cells of different origin and promote their efficient killing. Journal of drug targeting, 11 (2), Lee, E.S., Na, K.,Bae, Y.H. (2003) Polymeric micelle for tumor ph and folate-mediated targeting. Journal of Controlled Release, 91 (1-2), Rapoport, N. (2007) Physical stimuli-responsive polymeric micelles for anti-cancer drug delivery. Progress in Polymer Science, 32 (8-9), Lukyanov, A.N., Gao, Z., Mazzola, L.,Torchilin, V.P. (2002) Polyethylene glycol-diacyllipid micelles demonstrate increased acculumation in subcutaneous tumors in mice. Pharm Res, 19 (10), Kwon, G.S.,Okano, T. (1999) Soluble self-assembled block copolymers for drug delivery. Pharm Res, 16 (5), Ma, J., Guo, C., Tang, Y., Xiang, J., Chen, S., Wang, J. ve diğerleri. (2007) Micellization in aqueous solution of an ethylene oxidepropylene oxide triblock copolymer, investigated with 1H NMR spectroscopy, pulsed-field gradient NMR, and NMR relaxation. J Colloid Interface Sci, 312 (2), Kwon, G.S. (2003) Polymeric micelles for delivery of poorly water-soluble

177 162 compounds. Crit Rev Ther Drug Carrier Syst, 20 (5), Richter, A., Olbrich, C., Krause, M.,Kissel, T. (2010) Solubilization of sagopilone, a poorly water-soluble anticancer drug, using polymeric micelles for parenteral delivery. International journal of pharmaceutics, 389 (1-2), Veronese, F.M. (2001) Peptide and protein PEGylation: a review of problems and solutions. Biomaterials, 22 (5), Roberts, M.J., Bentley, M.D.,Harris, J.M. (2002) Chemistry for peptide and protein PEGylation. Adv Drug Deliv Rev, 54 (4), Veronese, F.M.,Harris, J.M. (2002) Introduction and overview of peptide and protein pegylation. Adv Drug Deliv Rev, 54 (4), Torchilin, V.P., Levchenko, T.S., Whiteman, K.R., Yaroslavov, A.A., Tsatsakis, A.M., Rizos, A.K. ve diğerleri. (2001) Amphiphilic poly-nvinylpyrrolidones: synthesis, properties and liposome surface modification. Biomaterials, 22 (22), Luppi, B., Bigucci, F., Cerchiara, T., Andrisano, V., Pucci, V., Mandrioli, R. ve diğerleri. (2005) Micelles based on polyvinyl alcohol substituted with oleic acid for targeting of lipophilic drugs. Drug Deliv, 12 (1), Nam, Y.S., Kang, H.S., Park, J.Y., Park, T.G., Han, S.H.,Chang, I.S. (2003) New micelle-like polymer aggregates made from PEI-PLGA diblock copolymers: micellar characteristics and cellular uptake. Biomaterials, 24 (12), Torchilin, V.P., Omelyanenko, V.G., Papisov, M.I., Bogdanov, A.A., Jr., Trubetskoy, V.S., Herron, J.N. ve diğerleri. (1994) Poly(ethylene glycol) on the liposome surface: on the mechanism of polymer-coated liposome longevity. Biochim Biophys Acta, 1195 (1), Sezgin, Z., Yuksel, N.,Baykara, T. (2006) Preparation and characterization of polymeric micelles for solubilization of poorly soluble anticancer drugs. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.v, 64 (3), :0 PEG2000 PE , 2012, Ağ Sitesi: 88&Itemid=448&catnumber= Lukyanov, A.N.,Torchilin, V.P. (2004) Micelles from lipid derivatives of water-soluble polymers as delivery systems for poorly soluble drugs. Adv Drug Deliv Rev, 56 (9), Dabholkar, R.D., Sawant, R.M., Mongayt, D.A., Devarajan, P.V.,Torchilin, V.P. (2006) Polyethylene glycol-phosphatidylethanolamine conjugate (PEG-PE)-based mixed micelles: some properties, loading with paclitaxel, and modulation of P-glycoprotein-mediated efflux. International journal of pharmaceutics, 315 (1-2), Krishnadas, A., Rubinstein, I.,Onyuksel, H. (2003) Sterically stabilized phospholipid mixed micelles: in vitro evaluation as a novel carrier for water-insoluble drugs. Pharm Res, 20 (2), Sawant, R.R., Sawant, R.M.,Torchilin, V.P. (2008) Mixed PEG-PE/vitamin E tumor-targeted immunomicelles as carriers for poorly soluble anti-

178 163 cancer drugs: improved drug solubilization and enhanced in vitro cytotoxicity. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.v, 70 (1), Maeda, H. (2001) The enhanced permeability and retention (EPR) effect in tumor vasculature: the key role of tumor-selective macromolecular drug targeting. Adv Enzyme Regul, 41, Iyer, A.K., Khaled, G., Fang, J.,Maeda, H. (2006) Exploiting the enhanced permeability and retention effect for tumor targeting. Drug Discov Today, 11 (17-18), Maeda, H., Takeshita, J.,Kanamaru, R. (1979) A lipophilic derivative of neocarzinostatin. A polymer conjugation of an antitumor protein antibiotic. Int J Pept Protein Res, 14 (2), Maeda, H., Matsumoto, T., Konno, T., Iwai, K.,Ueda, M. (1984) Tailor- Making of Protein Drugs by Polymer Conjugation for Tumor Targeting - a Brief Review on Smancs. Journal of Protein Chemistry, 3 (2), Matsumura, Y.,Maeda, H. (1986) A new concept for macromolecular therapeutics in cancer chemotherapy: mechanism of tumoritropic accumulation of proteins and the antitumor agent smancs. Cancer Res, 46 (12 Pt 1), Maeda, H., Wu, J., Sawa, T., Matsumura, Y.,Hori, K. (2000) Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. Journal of Controlled Release, 65 (1-2), Maeda, H. (2012) Vascular permeability in cancer and infection as related to macromolecular drug delivery, with emphasis on the EPR effect for tumor-selective drug targeting. Proc Jpn Acad Ser B Phys Biol Sci, 88 (3), Torchilin, V. (2011) Tumor delivery of macromolecular drugs based on the EPR effect. Adv Drug Deliv Rev, 63 (3), Trubetskoy, V.S.,Torchilin, V.P. (1995) Use of polyoxyethylene-lipid conjugates as long-circulating carriers for delivery of therapeutic and diagnostic agents. Adv Drug Deliv Rev, 16 (2 3), Klibanov, A.L., Maruyama, K., Torchilin, V.P.,Huang, L. (1990) Amphipathic polyethyleneglycols effectively prolong the circulation time of liposomes. FEBS Lett, 268 (1), Torchilin, V.P.,Trubetskoy, V.S. (1995) Which Polymers Can Make Nanoparticulate Drug Carriers Long-Circulating. Adv Drug Deliv Rev, 16 (2-3), Torchilin, V.P. (1998) Polymer-coated long-circulating microparticulate pharmaceuticals. J Microencapsul, 15 (1), Hatakeyama, H., Akita, H., Ito, E., Hayashi, Y., Oishi, M., Nagasaki, Y. ve diğerleri. (2011) Systemic delivery of sirna to tumors using a lipid nanoparticle containing a tumor-specific cleavable PEG-lipid. Biomaterials, 32 (18), Kaminskas, L.M., Kelly, B.D., McLeod, V.M., Boyd, B.J., Krippner, G.Y., Williams, E.D. ve diğerleri. (2009) Pharmacokinetics and Tumor

179 164 Disposition of PEGylated, Methotrexate Conjugated Poly-L-lysine Dendrimers. Molecular pharmaceutics, 6 (4), Eto, Y., Yoshioka, Y., Asavatanabodee, R., Mizuguchi, H., Mukal, Y.,Nakagawa, S. (2008) Development of PEGylated Adenovirus Vector for Cancer Gene Therapy. Yakugaku Zasshi-Journal of the Pharmaceutical Society of Japan, 128 (12), Napper, D.H. (1983). Polymeric stabilization of colloidal dispersions. London ; New York: Academic Press. 89.Milla, P., Dosio, F.,Cattel, L. (2012) PEGylation of Proteins and Liposomes: a Powerful and Flexible Strategy to Improve the Drug Delivery. Curr Drug Metab, 13 (1), Maeda, H., Sawa, T.,Konno, T. (2001) Mechanism of tumor-targeted delivery of macromolecular drugs, including the EPR effect in solid tumor and clinical overview of the prototype polymeric drug SMANCS. Journal of Controlled Release, 74 (1-3), Yoshizawa, Y., Kono, Y., Ogawara, K., Kimura, T.,Higaki, K. (2011) PEG liposomalization of paclitaxel improved its in vivo disposition and antitumor efficacy. International journal of pharmaceutics, 412 (1-2), Liu, D.F., Wu, W., Ling, J.J., Wen, S., Gu, N.,Zhang, X.Z. (2011) Effective PEGylation of Iron Oxide Nanoparticles for High Performance In Vivo Cancer Imaging. Advanced Functional Materials, 21 (8), Huynh, N.T., Roger, E., Lautram, N., Benoit, J.P.,Passirani, C. (2010) The rise and rise of stealth nanocarriers for cancer therapy: passive versus active targeting. Nanomedicine, 5 (9), Yuan, F., Dellian, M., Fukumura, D., Leunig, M., Berk, D.A., Torchilin, V.P. ve diğerleri. (1995) Vascular permeability in a human tumor xenograft: molecular size dependence and cutoff size. Cancer Res, 55 (17), Hobbs, S.K., Monsky, W.L., Yuan, F., Roberts, W.G., Griffith, L., Torchilin, V.P. ve diğerleri. (1998) Regulation of transport pathways in tumor vessels: role of tumor type and microenvironment. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 95 (8), Vinogradov, S., Batrakova, E., Li, S.,Kabanov, A. (1999) Polyion complex micelles with protein-modified corona for receptor-mediated delivery of oligonucleotides into cells. Bioconjug Chem, 10 (5), Nagasaki, Y., Yasugi, K., Yamamoto, Y., Harada, A.,Kataoka, K. (2001) Sugar-installed block copolymer micelles: their preparation and specific interaction with lectin molecules. Biomacromolecules, 2 (4), Jule, E., Nagasaki, Y.,Kataoka, K. (2003) Lactose-installed poly(ethylene glycol)-poly(d,l-lactide) block copolymer micelles exhibit fast-rate binding and high affinity toward a protein bed simulating a cell surface. A surface plasmon resonance study. Bioconjug Chem, 14 (1), Dash, P.R., Read, M.L., Fisher, K.D., Howard, K.A., Wolfert, M., Oupicky, D. ve diğerleri. (2000) Decreased binding to proteins and cells of

180 165 polymeric gene delivery vectors surface modified with a multivalent hydrophilic polymer and retargeting through attachment of transferrin. The Journal of biological chemistry, 275 (6), Yue, J., Liu, S., Wang, R., Hu, X., Xie, Z., Huang, Y. ve diğerleri. (2012) Transferrin-Conjugated Micelles: Enhanced Accumulation and Antitumor Effect for Transferrin-Receptor-Overexpressing Cancer Models. Molecular pharmaceutics. 101.Blume, G., Cevc, G., Crommelin, M.D., Bakker-Woudenberg, I.A., Kluft, C.,Storm, G. (1993) Specific targeting with poly(ethylene glycol)- modified liposomes: coupling of homing devices to the ends of the polymeric chains combines effective target binding with long circulation times. Biochim Biophys Acta, 1149 (1), Hansen, C.B., Kao, G.Y., Moase, E.H., Zalipsky, S.,Allen, T.M. (1995) Attachment of antibodies to sterically stabilized liposomes: evaluation, comparison and optimization of coupling procedures. Biochim Biophys Acta, 1239 (2), Torchilin, V.P., Levchenko, T.S., Lukyanov, A.N., Khaw, B.A., Klibanov, A.L., Rammohan, R. ve diğerleri. (2001) p-nitrophenylcarbonyl-peg- PE-liposomes: fast and simple attachment of specific ligands, including monoclonal antibodies, to distal ends of PEG chains via p- nitrophenylcarbonyl groups. Biochim Biophys Acta, 1511 (2), Torchilin, V.P. (2004) Targeted polymeric micelles for delivery of poorly soluble drugs. Cell Mol Life Sci, 61 (19-20), Lee, H., Soo, P.L., Liu, J., Butler, M.,Allen, C. (2007). Polymeric Micelles for Formulation of Anti-Cancer Drugs. M. Amiji (Ed.). Nanotechnology for Cancer Therapy (s ). Boca Raton, FL: Taylor & Francis Group 106.Yoo, H.S.,Park, T.G. (2001) Biodegradable polymeric micelles composed of doxorubicin conjugated PLGA-PEG block copolymer. Journal of Controlled Release, 70 (1-2), Kakizawa, Y.,Kataoka, K. (2002) Block copolymer micelles for delivery of gene and related compounds. Adv Drug Deliv Rev, 54 (2), Torchilin, V. (2009) Multifunctional and stimuli-sensitive pharmaceutical nanocarriers. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.v, 71 (3), Varkouhi, A.K., Scholte, M., Storm, G.,Haisma, H.J. (2011) Endosomal escape pathways for delivery of biologicals. Journal of Controlled Release, 151 (3), Ota, T., Maeda, M.,Tatsuka, M. (2002) Cationic liposomes with plasmid DNA influence cancer metastatic capability. Anticancer research, 22 (6C), Schwarze, S.R.,Dowdy, S.F. (2000) In vivo protein transduction: intracellular delivery of biologically active proteins, compounds and DNA. Trends in Pharmacological Sciences, 21 (2), Frankel, A.D.,Pabo, C.O. (1988) Cellular uptake of the tat protein from human immunodeficiency virus. Cell, 55 (6), Schwarze, S.R., Hruska, K.A.,Dowdy, S.F. (2000) Protein transduction:

181 166 unrestricted delivery into all cells? Trends in Cell Biology, 10 (7), Kaplan, I.M., Wadia, J.S.,Dowdy, S.F. (2005) Cationic TAT peptide transduction domain enters cells by macropinocytosis. Journal of Controlled Release, 102 (1), Wadia, J.S., Stan, R.V.,Dowdy, S.F. (2004) Transducible TAT-HA fusogenic peptide enhances escape of TAT-fusion proteins after lipid raft macropinocytosis. Nat Med, 10 (3), Torchilin, V.P. (2008) Tat peptide-mediated intracellular delivery of pharmaceutical nanocarriers. Adv Drug Deliv Rev, 60 (4-5), Torchilin, V.P. (2008) Cell penetrating peptide-modified pharmaceutical nanocarriers for intracellular drug and gene delivery. Biopolymers, 90 (5), Abbas, A.K., Licthman, A.H.,Pober, J.S. (1994). Cellular and Molecular Immunology. (2 bs., s ). USA: W.B. Saunders 119.Alberts, B., Bray, D., Johnson, A., Julian, L., Raff, M., Roberts, K. ve diğerleri. (1998). Protein Structure and Function. Essential Cell Biology: an introduction to the molecular biology of hte cell (1 bs., s ). New York: Garland Publishing Inc. 120.Kohler, G.,Milstein, C. (1975) Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature, 256 (5517), Torchilin, V.P., Iakoubov, L.Z.,Estrov, Z. (2001) Antinuclear autoantibodies as potential antineoplastic agents. Trends in Immunology, 22 (8), Iakoubov, L.Z.,Torchilin, V.P. (1998) Nucleosome-releasing treatment makes surviving tumor cells better targets for nucleosome-specific anticancer antibodies. Cancer Detection and Prevention, 22 (5), Chakilam, A.R., Pabba, S., Mongayt, D., Iakoubov, L.Z.,Torchilin, V.P. (2004) A single monoclonal antinuclear autoantibody with nucleosome-restricted specificity inhibits growth of diverse human tumors in nude mice. Cancer Therapy, 2, Iakoubov, L., Rokhlin, O.,Torchilin, V. (1995) Anti-nuclear autoantibodies of the aged reactive against the surface of tumor but not normal cells. Immunol Lett, 47 (1-2), Society, A.C. (2012). Cancer Facts & Figures 2012 (Rapor No). Atlanta: American Cancer Society. 126.Martin, A.M.,Weber, B.L. (2000) Genetic and hormonal risk factors in breast cancer. Journal of the National Cancer Institute, 92 (14), Shabbits, J.A., Krishna, R.,Mayer, L.D. (2001) Molecular and pharmacological strategies to overcome multidrug resistance. Expert Rev Anticancer Ther, 1 (4), Gottesman, M.M. (2002) Mechanisms of cancer drug resistance. Annu Rev Med, 53, Gottesman, M.M., Ambudkar, S.V., Ni, B., Aran, J.M., Sugimoto, Y., Cardarelli, C.O. ve diğerleri. (1994) Exploiting multidrug resistance to

182 167 treat cancer. Cold Spring Harb Symp Quant Biol, 59, Szakacs, G., Paterson, J.K., Ludwig, J.A., Booth-Genthe, C.,Gottesman, M.M. (2006) Targeting multidrug resistance in cancer. Nat Rev Drug Discov, 5 (3), Juliano, R.L.,Ling, V. (1976) A surface glycoprotein modulating drug permeability in Chinese hamster ovary cell mutants. Biochim Biophys Acta, 455 (1), Chen, C.J., Chin, J.E., Ueda, K., Clark, D.P., Pastan, I., Gottesman, M.M. ve diğerleri. (1986) Internal duplication and homology with bacterial transport proteins in the mdr1 (P-glycoprotein) gene from multidrug-resistant human cells. Cell, 47 (3), Ueda, K., Cardarelli, C., Gottesman, M.M.,Pastan, I. (1987) EXPRESSION OF A FULL-LENGTH CDNA FOR THE HUMAN MDR1 GENE CONFERS RESISTANCE TO COLCHICINE, DOXORUBICIN, AND VINBLASTINE. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 84 (9), Borst, P.,Elferink, R.O. (2002) Mammalian ABC transporters in health and disease. Annu Rev Biochem, 71, Sauna, Z.E.,Ambudkar, S.V. (2001) Characterization of the catalytic cycle of ATP hydrolysis by human P-glycoprotein. The two ATP hydrolysis events in a single catalytic cycle are kinetically similar but affect different functional outcomes. The Journal of biological chemistry, 276 (15), Ramachandra, M., Ambudkar, S.V., Chen, D., Hrycyna, C.A., Dey, S., Gottesman, M.M. ve diğerleri. (1998) Human P-glycoprotein exhibits reduced affinity for substrates during a catalytic transition state. Biochemistry, 37 (14), Clarke, R., Leonessa, F.,Trock, B. (2005) Multidrug Resistance/P- Glycoprotein and Breast Cancer: Review and Meta-Analysis. Seminars in Oncology, 32 (S7), Lage, H. (2006) MDR1/P-glycoprotein (ABCB1) as target for RNA interference-mediated reversal of multidrug resistance. Curr Drug Targets, 7 (7), Krishna, R.,Mayer, L.D. (2000) Multidrug resistance (MDR) in cancer - Mechanisms, reversal using modulators of MDR and the role of MDR modulators in influencing the pharmacokinetics of anticancer drugs. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 11 (4), Schinkel, A.H., Mayer, U., Wagenaar, E., Mol, C.A., van Deemter, L., Smit, J.J. ve diğerleri. (1997) Normal viability and altered pharmacokinetics in mice lacking mdr1-type (drug-transporting) P- glycoproteins. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 94 (8), Borst, P., Evers, R., Kool, M.,Wijnholds, J. (2000) A family of drug transporters: the multidrug resistance-associated proteins. Journal of the National Cancer Institute, 92 (16), Trock, B.J., Leonessa, F.,Clarke, R. (1997) Multidrug resistance in breast cancer: a meta-analysis of MDR1/gp170 expression and its possible functional significance. Journal of the National Cancer

183 168 Institute, 89 (13), Coley, H.M. (2008) Mechanisms and strategies to overcome chemotherapy resistance in metastatic breast cancer. Cancer Treat Rev, 34 (4), Orr, G.A., Verdier-Pinard, P., McDaid, H.,Horwitz, S.B. (2003) Mechanisms of Taxol resistance related to microtubules. Oncogene, 22 (47), Wong, H.L., Bendayan, R., Rauth, A.M.,Wu, X.Y. (2006) Simultaneous delivery of doxorubicin and GG918 (Elacridar) by new Polymer-Lipid Hybrid Nanoparticles (PLN) for enhanced treatment of multidrugresistant breast cancer. Journal of Controlled Release, 116 (3), Yabuki, N., Sakata, K., Yamasaki, T., Terashima, H., Mio, T., Miyazaki, Y. ve diğerleri. (2007) Gene amplification and expression in lung cancer cells with acquired paclitaxel resistance. Cancer Genet Cytogenet, 173 (1), Tsuruo, T., Iida, H., Tsukagoshi, S.,Sakurai, Y. (1981) Overcoming of vincristine resistance in P388 leukemia in vivo and in vitro through enhanced cytotoxicity of vincristine and vinblastine by verapamil. Cancer Res, 41 (5), Lum, B.L., Kaubisch, S., Yahanda, A.M., Adler, K.M., Jew, L., Ehsan, M.N. ve diğerleri. (1992) Alteration of etoposide pharmacokinetics and pharmacodynamics by cyclosporine in a phase I trial to modulate multidrug resistance. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 10 (10), Krishna, R.,Mayer, L.D. (1997) Liposomal doxorubicin circumvents PSC 833-free drug interactions, resulting in effective therapy of multidrugresistant solid tumors. Cancer Res, 57 (23), Tai, H.L. (2000) Technology evaluation: Valspodar, Novartis AG. Curr Opin Mol Ther, 2 (4), Aszalos, A. (2007) Drug-drug interactions affected by the transporter protein, P-glycoprotein (ABCB1, MDR1) II. Clinical aspects. Drug Discov Today, 12 (19-20), Fellner, S., Bauer, B., Miller, D.S., Schaffrik, M., Fankhanel, M., Spruss, T. ve diğerleri. (2002) Transport of paclitaxel (Taxol) across the bloodbrain barrier in vitro and in vivo. The Journal of clinical investigation, 110 (9), Wandel, C., Kim, R.B., Kajiji, S., Guengerich, P., Wilkinson, G.R.,Wood, A.J. (1999) P-glycoprotein and cytochrome P-450 3A inhibition: dissociation of inhibitory potencies. Cancer Res, 59 (16), Hyafil, F., Vergely, C., Du Vignaud, P.,Grand-Perret, T. (1993) In vitro and in vivo reversal of multidrug resistance by GF120918, an acridonecarboxamide derivative. Cancer Res, 53 (19), Sparreboom, A., Planting, A.S., Jewell, R.C., van der Burg, M.E., van der Gaast, A., de Bruijn, P. ve diğerleri. (1999) Clinical pharmacokinetics of doxorubicin in combination with GF120918, a potent inhibitor of MDR1 P-glycoprotein. Anticancer Drugs, 10 (8),

184 Witherspoon, S.M., Emerson, D.L., Kerr, B.M., Lloyd, T.L., Dalton, W.S.,Wissel, P.S. (1996) Flow cytometric assay of modulation of P- glycoprotein function in whole blood by the multidrug resistance inhibitor GG918. Clinical Cancer Research, 2 (1), Sane, R., Agarwal, S.,Elmquist, W.F. (2012) Brain distribution and bioavailability of elacridar after different routes of administration in the mouse. Drug Metabolism and Disposition, 40 (8), Planting, A.S., Sonneveld, P., van der Gaast, A., Sparreboom, A., van der Burg, M.E., Luyten, G.P. ve diğerleri. (2005) A phase I and pharmacologic study of the MDR converter GF in combination with doxorubicin in patients with advanced solid tumors. Cancer chemotherapy and pharmacology, 55 (1), Freshney, R.I. (2002). Introduction to basic principles. J. M. Davis (Ed.). Basic Cell Culture: A Practical Approach (s. 1-18). New York: Oxford University Press Inc. 160.Doyle, A.,Griffiths, J.B. (2000). Cell and tissue culture for medical research. Chichester: John Wiley & Sons, Ltd. 161.Audus, K.L., Bartel, R.L., Hidalgo, I.J.,Borchardt, R.T. (1990) The Use of Cultured Epithelial and Endothelial-Cells for Drug Transport and Metabolism Studies. Pharmaceutical Research, 7 (5), Mather, J.P.,Roberts, P.E. (1998). Introduction to cell and tissue culture. New York: Plenum Press. 163.Khaw, B.A., dasilva, J., Vural, I., Narula, J.,Torchilin, V.P. (2001) Intracytoplasmic gene delivery for in vitro transfection with cytoskeleton-specific immunoliposomes. Journal of Controlled Release, 75 (1-2), Khaw, B.A., Narula, J., Vural, I.,Torchilin, V.P. (1998) Cytoskeletonspecific immunoliposomes: sealing of hypoxic cells and intracellular delivery of DNA. International journal of pharmaceutics, 162 (1-2), Shah, P., Jogani, V., Bagchi, T.,Misra, A. (2006) Role of Caco-2 cell monolayers in prediction of intestinal drug absorption. Biotechnol Prog, 22 (1), Wilson, A.P. (2000). Cytotoxicity and viability assays. J. R. W. Masters (Ed.). Animal Cell Culture (s ). New York: Oxford University Press 167.Walter, E.,Kissel, T. (1995) Heterogeneity in the Human Intestinal-Cell Line Caco-2 Leads to Differences in Transepithelial Transport. European Journal of Pharmaceutical Sciences, 3 (4), Zhou, J., Zeng, F.Q., Li, C., Tong, Q.S., Gao, X., Xie, S.S. ve diğerleri. (2005) Preparation of arsenic trioxide-loaded albuminutes immunonanospheres and its specific killing effect on bladder cancer cell in vitro. Chin Med J (Engl), 118 (1), Robe, P.A., Nguyen-Khac, M., Jolois, O., Rogister, B., Merville, M.P.,Bours, V. (2005) Dexamethasone inhibits the HSV-tk/ganciclovir bystander effect in malignant glioma cells. Bmc Cancer, Kean, T., Roth, S.,Thanou, M. (2005) Trimethylated chitosans as nonviral gene delivery vectors: Cytotoxicity and transfection efficiency.

185 170 Journal of Controlled Release, 103 (3), Bozdag, S., Capan, Y., Vural, I., Dalkara, T., Dogan, A.L., Guc, D. ve diğerleri. (2004) In vitro cytotoxicity of mitoxantrone-incorporated albumin microspheres on acute promyelocytic leukaemia cells. J Microencapsul, 21 (7), Vural, I., Sarisozen, C.,Olmez, S.S. (2011) Chitosan coated furosemide liposomes for improved bioavailability. J Biomed Nanotechnol, 7 (3), Mosmann, T. (1983) Rapid colorimetric assay for cellular growth and survival: application to proliferation and cytotoxicity assays. J Immunol Methods, 65 (1-2), Stoscheck, C.M. (1990) Quantitation of protein. Methods Enzymol, 182, Smith, P.K., Krohn, R.I., Hermanson, G.T., Mallia, A.K., Gartner, F.H., Provenzano, M.D. ve diğerleri. (1985) Measurement of Protein Using Bicinchoninic Acid. Anal Biochem, 150 (1), Wiechelman, K.J., Braun, R.D.,Fitzpatrick, J.D. (1988) Investigation of the Bicinchoninic Acid Protein Assay - Identification of the Groups Responsible for Color Formation. Anal Biochem, 175 (1), BCA Protein Assay , 2012, Ağ Sitesi: Engvall, E. (1980) Enzyme immunoassay ELISA and EMIT. Methods Enzymol, 70 (A), McLaren, M.L., Lillywhite, J.E.,Au, A.C. (1981) Indirect enzyme linked immunosorbent assay (ELISA): practical aspects of standardization and quality control. Med Lab Sci, 38 (3), Itoh, K.,Suzuki, T. (2002) Antibody-guided selection using capturesandwich ELISA. Methods Mol Biol, 178, Towbin, H., Staehelin, T.,Gordon, J. (1979) Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 76 (9), Sharrow, S.O. (1991). Supplement 50 - Overview of Flow Cytometry. J. E. Coligan (Ed.). Current protocols in immunology (s. v. (loose leaf)). New York: John Wiley and Sons 183.Chan, C.C. (2004). Analytical method validation and instrument performance verification. Hoboken, N.J.: John Wiley & Sons. 184.Shah, V.P., Midha, K.K., Dighe, S., McGilveray, I.J., Skelly, J.P., Yacobi, A. ve diğerleri. (1991) Analytical methods validation: bioavailability, bioequivalence and pharmacokinetic studies. Conference report. Eur J Drug Metab Pharmacokinet, 16 (4), Validation of Compendial Procedures. (2007). USP31 (2008)-NF26 (c. 1, s ). Rockville, MD: The United States Pharmacopeial Convention 186.Validation of Analytical Procedures: Text and Methodology Q2(R1) (Rapor No). (2005). INTERNATIONAL CONFERENCE ON HARMONISATION OF TECHNICAL REQUIREMENTS FOR REGISTRATION OF PHARMACEUTICALS FOR HUMAN USE.

186 Torchilin, V.P., Lukyanov, A.N., Gao, Z.,Papahadjopoulos-Sternberg, B. (2003) Immunomicelles: targeted pharmaceutical carriers for poorly soluble drugs. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 100 (10), Musacchio, T., Laquintana, V., Latrofa, A., Trapani, G.,Torchilin, V.P. (2009) PEG-PE micelles loaded with paclitaxel and surface-modified by a PBR-ligand: synergistic anticancer effect. Molecular pharmaceutics, 6 (2), La, S.B., Okano, T.,Kataoka, K. (1996) Preparation and characterization of the micelle-forming polymeric drug indomethacin-incorporated poly(ethylene oxide)-poly(beta-benzyl L-aspartate) block copolymer micelles. J Pharm Sci, 85 (1), Goddard, E.D., Turro, N.J., Kuo, P.L.,Ananthapadmanabhan, K.P. (1985) Fluorescence probes for critical micelle concentration determination. Langmuir, 1 (3), Zhao, C.L., Winnik, M.A., Riess, G.,Croucher, M.D. (1990) Fluorescence Probe Techniques Used to Study Micelle Formation in Water-Soluble Block Copolymers. Langmuir, 6 (2), Lee, J., Lee, S.C., Acharya, G., Chang, C.J.,Park, K. (2003) Hydrotropic solubilization of paclitaxel: analysis of chemical structures for hydrotropic property. Pharm Res, 20 (7), Cho, Y.W., Lee, J., Lee, S.C., Huh, K.M.,Park, K. (2004) Hydrotropic agents for study of in vitro paclitaxel release from polymeric micelles. Journal of Controlled Release, 97 (2), Li, X., Li, P., Zhang, Y., Zhou, Y., Chen, X., Huang, Y. ve diğerleri. (2010) Novel mixed polymeric micelles for enhancing delivery of anticancer drug and overcoming multidrug resistance in tumor cell lines simultaneously. Pharm Res, 27 (8), Kern, F.G., McLeskey, S.W., Zhang, L., Kurebayashi, J., Liu, Y., Ding, I.Y. ve diğerleri. (1994) Transfected MCF-7 cells as a model for breast-cancer progression. Breast Cancer Res Treat, 31 (2-3), Wang, T.T.,Phang, J.M. (1995) Effects of estrogen on apoptotic pathways in human breast cancer cell line MCF-7. Cancer Res, 55 (12), Yang, X.H., Sladek, T.L., Liu, X., Butler, B.R., Froelich, C.J.,Thor, A.D. (2001) Reconstitution of caspase 3 sensitizes MCF-7 breast cancer cells to doxorubicin- and etoposide-induced apoptosis. Cancer Res, 61 (1), Evers, R., Cnubben, N.H., Wijnholds, J., van Deemter, L., van Bladeren, P.J.,Borst, P. (1997) Transport of glutathione prostaglandin A conjugates by the multidrug resistance protein 1. FEBS Lett, 419 (1), Tang, F., Horie, K.,Borchardt, R.T. (2002) Are MDCK cells transfected with the human MDR1 gene a good model of the human intestinal mucosa? Pharm Res, 19 (6), Irvine, J.D., Takahashi, L., Lockhart, K., Cheong, J., Tolan, J.W., Selick, H.E. ve diğerleri. (1999) MDCK (Madin-Darby canine kidney) cells: A

187 172 tool for membrane permeability screening. Journal of Pharmaceutical Sciences, 88 (1), Khoschsorur, G., Erwa, W., Fruehwirth, F., Stettin, M., Meinitzer, A., Hoebarth, G. ve diğerleri. (2005) High-performance liquid chromatographic method for the simultaneous determination of cyclosporine A and its four major metabolites in whole blood. Talanta, 65 (3), Jaiswal, J., Gupta, S.K.,Kreuter, J. (2004) Preparation of biodegradable cyclosporine nanoparticles by high-pressure emulsification-solvent evaporation process. Journal of Controlled Release, 96 (1), Kumar, M., Singhal, S.K.,Singh, A. (2001) Development and validation of a stability indicating HPLC assay method for cyclosporine in cyclosporine oral solution USP. J Pharm Biomed Anal, 25 (1), Vollenbroeker, B., Koch, J.H., Fobker, M., Suwelack, B., Hohage, H.,Muller, U. (2005) Determination of cyclosporine and its metabolites in blood via HPLC-MS and correlation to clinically important parameters. Transplant Proc, 37 (4), Wang, X.Q., Dai, J.D., Chen, Z., Zhang, T., Xia, G.M., Nagai, T. ve diğerleri. (2004) Bioavailability and pharmacokinetics of cyclosporine A-loaded ph-sensitive nanoparticles for oral administration. Journal of Controlled Release, 97 (3), Cutler, L., Howes, C., Deeks, N.J., Buck, T.L.,Jeffrey, P. (2006) Development of a P-glycoprotein knockout model in rodents to define species differences in its functional effect at the blood-brain barrier. J Pharm Sci, 95 (9), Kemper, E.M., van Zandbergen, A.E., Cleypool, C., Mos, H.A., Boogerd, W., Beijnen, J.H. ve diğerleri. (2003) Increased penetration of paclitaxel into the brain by inhibition of P-Glycoprotein. Clin Cancer Res, 9 (7), Zhang, X., Burt, H.M., Mangold, G., Dexter, D., Von Hoff, D., Mayer, L. ve diğerleri. (1997) Anti-tumor efficacy and biodistribution of intravenous polymeric micellar paclitaxel. Anticancer Drugs, 8 (7), Lavasanifar, A., Samuel, J.,Kwon, G.S. (2002) The effect of fatty acid substitution on the in vitro release of amphotericin B from micelles composed of poly(ethylene oxide)-block-poly(n-hexyl stearate-laspartamide). Journal of Controlled Release, 79 (1-3), Bendas, G., Krause, A., Bakowsky, U., Vogel, J.,Rothe, U. (1999) Targetability of novel immunoliposomes prepared by a new antibody conjugation technique. International journal of pharmaceutics, 181 (1), Smith, R.,Tanford, C. (1972) The critical micelle concentration of L- - dipalmitoylphosphatidylcholine in water and water-methanol solutions. J Mol Biol, 67 (1), Weissig, V., Whiteman, K.R.,Torchilin, V.P. (1998) Accumulation of protein-loaded long-circulating micelles and liposomes in subcutaneous Lewis lung carcinoma in mice. Pharm Res, 15 (10),

188 Papahadjopoulos, D., Allen, T.M., Gabizon, A., Mayhew, E., Matthay, K., Huang, S.K. ve diğerleri. (1991) Sterically stabilized liposomes: improvements in pharmacokinetics and antitumor therapeutic efficacy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 88 (24), Parr, M.J., Masin, D., Cullis, P.R.,Bally, M.B. (1997) Accumulation of liposomal lipid and encapsulated doxorubicin in murine Lewis lung carcinoma: the lack of beneficial effects by coating liposomes with poly(ethylene glycol). J Pharmacol Exp Ther, 280 (3), Mu, L., Elbayoumi, T.A.,Torchilin, V.P. (2005) Mixed micelles made of poly(ethylene glycol)-phosphatidylethanolamine conjugate and d- alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate as pharmaceutical nanocarriers for camptothecin. International journal of pharmaceutics, 306 (1-2), Jule, E., Yamamoto, Y., Thouvenin, M., Nagasaki, Y.,Kataoka, K. (2004) Thermal characterization of poly(ethylene glycol)-poly(d,l-lactide) block copolymer micelles based on pyrene excimer formation. Journal of Controlled Release, 97 (3), Bae, Y., Diezi, T.A., Zhao, A.,Kwon, G.S. (2007) Mixed polymeric micelles for combination cancer chemotherapy through the concurrent delivery of multiple chemotherapeutic agents. Journal of Controlled Release, 122 (3), Kaiser, S.,Toborek, M. (2001) Liposome-mediated high-efficiency transfection of human endothelial cells. J Vasc Res, 38 (2), Hafez, I.M., Maurer, N.,Cullis, P.R. (2001) On the mechanism whereby cationic lipids promote intracellular delivery of polynucleic acids. Gene Ther, 8 (15), Han, Y., He, Z., Schulz, A., Bronich, T.K., Jordan, R., Luxenhofer, R. ve diğerleri. (2012) Synergistic Combinations of Multiple Chemotherapeutic Agents in High Capacity Poly(2-oxazoline) Micelles. Molecular pharmaceutics. 221.Nsereko, S.,Amiji, M. (2002) Localized delivery of paclitaxel in solid tumors from biodegradable chitin microparticle formulations. Biomaterials, 23 (13), Yang, T., Cui, F.D., Choi, M.K., Cho, J.W., Chung, S.J., Shim, C.K. ve diğerleri. (2007) Enhanced solubility and stability of PEGylated liposomal paclitaxel: in vitro and in vivo evaluation. International journal of pharmaceutics, 338 (1-2), Liggins, R.T.,Burt, H.M. (2001) Paclitaxel loaded poly(l-lactic acid) microspheres: properties of microspheres made with low molecular weight polymers. International journal of pharmaceutics, 222 (1), D'Souza, S.S.,DeLuca, P.P. (2006) Methods to assess in vitro drug release from injectable polymeric particulate systems. Pharm Res, 23 (3), Jeong, Y.I., Cheon, J.B., Kim, S.H., Nah, J.W., Lee, Y.M., Sung, Y.K. ve diğerleri. (1998) Clonazepam release from core-shell type nanoparticles in vitro. Journal of Controlled Release, 51 (2-3), 169-

189 Ryu, J., Jeong, Y.I., Kim, I.S., Lee, J.H., Nah, J.W.,Kim, S.H. (2000) Clonazepam release from core-shell type nanoparticles of poly(epsilon-caprolactone)/poly(ethylene glycol)/poly(epsiloncaprolactone) triblock copolymers. International journal of pharmaceutics, 200 (2), Soppimath, K.S., Aminabhavi, T.M., Kulkarni, A.R.,Rudzinski, W.E. (2001) Biodegradable polymeric nanoparticles as drug delivery devices. Journal of Controlled Release, 70 (1-2), Sawant, R.R.,Torchilin, V.P. (2009) Enhanced cytotoxicity of TATpbearing paclitaxel-loaded micelles in vitro and in vivo. International journal of pharmaceutics, 374 (1-2), Sethuraman, V.A.,Bae, Y.H. (2007) TAT peptide-based micelle system for potential active targeting of anti-cancer agents to acidic solid tumors. Journal of Controlled Release, 118 (2), Iakoubov, L.Z.,Torchilin, V.P. (1997) A novel class of antitumor antibodies: nucleosome-restricted antinuclear autoantibodies (ANA) from healthy aged nonautoimmune mice. Oncol Res, 9 (8), Batrakova, E.V., Miller, D.W., Li, S., Alakhov, V.Y., Kabanov, A.V.,Elmquist, W.F. (2001) Pluronic P85 enhances the delivery of digoxin to the brain: in vitro and in vivo studies. J Pharmacol Exp Ther, 296 (2), Kabanov, A.V., Batrakova, E.V.,Alakhov, V.Y. (2002) Pluronic block copolymers for overcoming drug resistance in cancer. Adv Drug Deliv Rev, 54 (5), Zhang, W., Shi, Y., Chen, Y., Yu, S., Hao, J., Luo, J. ve diğerleri. (2010) Enhanced antitumor efficacy by paclitaxel-loaded pluronic P123/F127 mixed micelles against non-small cell lung cancer based on passive tumor targeting and modulation of drug resistance. European journal of pharmaceutics and biopharmaceutics : official journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik e.v, 75 (3), Mu, C.F., Balakrishnan, P., Cui, F.D., Yin, Y.M., Lee, Y.B., Choi, H.G. ve diğerleri. (2010) The effects of mixed MPEG-PLA/Pluronic copolymer micelles on the bioavailability and multidrug resistance of docetaxel. Biomaterials, 31 (8), Wang, Y., Yu, L., Han, L., Sha, X.,Fang, X. (2007) Difunctional Pluronic copolymer micelles for paclitaxel delivery: synergistic effect of folatemediated targeting and Pluronic-mediated overcoming multidrug resistance in tumor cell lines. International journal of pharmaceutics, 337 (1-2), Krishna, R., St-Louis, M.,Mayer, L.D. (2000) Increased intracellular drug accumulation and complete chemosensitization achieved in multidrugresistant solid tumors by co-administering valspodar (PSC 833) with sterically stabilized liposomal doxorubicin. International journal of cancer. Journal international du cancer, 85 (1), Patil, Y., Sadhukha, T., Ma, L.,Panyam, J. (2009) Nanoparticle-mediated simultaneous and targeted delivery of paclitaxel and tariquidar

190 175 overcomes tumor drug resistance. Journal of Controlled Release, 136 (1), Song, X.R., Cai, Z., Zheng, Y., He, G., Cui, F.Y., Gong, D.Q. ve diğerleri. (2009) Reversion of multidrug resistance by co-encapsulation of vincristine and verapamil in PLGA nanoparticles. Eur J Pharm Sci, 37 (3-4), Patel, N.R., Rathi, A., Mongayt, D.,Torchilin, V.P. (2011) Reversal of multidrug resistance by co-delivery of tariquidar (XR9576) and paclitaxel using long-circulating liposomes. International journal of pharmaceutics.

191

192 EK 1

193 Özgeçmiş Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Eczacılık Fakültesi, Hacettepe Üniversitesi Sıhhiye, Ankara Can SARISOZEN Tel: can@hacettepe.edu.tr - cansarisozen@gmail.com Doğum Tarihi: (Ankara) EĞİTİM Doktora Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Eczacılık Fakültesi, Hacettepe Üniversitesi Akademik Ortalama: 3.96/4.00 Tez Başlığı: Kanser Tedavisinde Kullanılacak Aktif Hedeflendirilmiş Farmasötik Nanotaşıyıcılar Tez Danışmanı: Doç. Dr. İmran Vural Yüksek Lisans Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Eczacılık Fakültesi, Hacettepe Üniversitesi Mezuniyet Tarihi: Eylül, 2006 Akademik Ortalama: 3.94/4.0 Tez Başlığı: Anjioplastide Kullanılmak Üzere Biyoparçalanır Stent Formülasyonlarının Geliştirilmesi ve İn Vitro Değerlendirilmelerine İlişkin Çalışmalar Tez Danışmanı: Prof. Dr. Sema Çalış Yardımcı Tez Danışmanı: Doç. Dr. Betül Arıca Yegin Lisans Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Mezuniyet Tarihi: Haziran, 2003 Akademik Ortalama: 3.10/4.00 ÖDÜLLER Üroonkoloji Kongresi, Yılın Araştırması Ödülü. Erem Bilensoy, Can Sarısözen, Güneş Esendağlı, A.Lale Doğan, Yeşim Aktaş, Murat Şen, Aydın N. Mungan, Intravesical cationic nanoparticles of chitosan and polycaprolactone for the delivery of Mitomycin C to bladder tumors (2009) TÜBİTAK Yurt Dışı Araştırma Bursu (2008) Hacettepe Üniversitesi, TEKNOKENT, İnterfarma-Yaşam Bilimi ve Teknolojileri Araştırma Ödülü, Birincilik. Sarısözen, C., Arıca, B., Çalış, S., Hıncal, A.A., Development and In- Vitro Studies for the Evaluation of Biodegradable Stent Formulations Intended for Use in Angioplasty (2007)

194 Can Sarisozen Özgeçmiş AKADEMİK ve ARAŞTIRMA DENEYİMİ Araştırma Görevlisi Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Misafir Araştırmacı Farmasötik Bilimler Bölümü Farmasötik Biyoteknoloji ve Nanotıp Merkezi Northeastern Üniversitesi, Boston, MA, USA 2008 (Mart-Eylül) Anabilim Dalı Stratejik Planlama Temsilcisi Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı Anabilim Dalı Lisansüstü Eğitim Temsilcisi Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi Farmasötik Teknoloji Anabilim Dalı EĞİTİM DENEYİMİ Araştırma Görevlisi Farmasötik Teknoloji Laboratuarı I (Çözelti Teknolojisi) Farmasötik Teknoloji Laboratuarı II (Yarı Katı Dozaj Formları) Farmasötik Teknoloji Laboratuarı III (Parenteral ve Steril Dozaj Formları) Farmasötik Teknoloji Laboratuarı IV (Tabletler ve Katı Dozaj Şekilleri) ARAŞTIRMA ALANLARI Aktif hedflendirilmiş farmasötik nanotaşıyıcılar Nano boyutlu ilaç taşıma sistemleri Polimerik ilaç taşıma sistemleri Medikal cihaz ve malzemeler Farmasötik araştırma ve endüstrisinde patent YAYINLAR Can Sarisozen, Imran Vural, Tatyana Levchenko, A. Atilla Hincal, and Vladimir P. Torchilin (2012) Long-circulating PEG-PE micelles co-loaded with paclitaxel and elacridar (GG918) overcome multidrug resistance Drug Delivery (Kabul edildi, basımda) Can Sarisozen, Imran Vural, Tatyana Levchenko, A. Atilla Hincal, and Vladimir P. Torchilin (2012) PEG-PE-based micelles co-loaded with paclitaxel and cyclosporine A or loaded with paclitaxel and targeted by anticancer antibody overcome drug resistance in cancer cells Drug Delivery 19(4):

195 Can Sarisozen Özgeçmiş Imran Vural, Can Sarisozen, S. Sevtap Olmez (2011) Chitosan coated furosemide liposomes for improved bioavailability Journal of Biomedical Nanotechnology 7(3): N Dilara Zeybek, Nese Ersoz Gulcelik, Figen Kaymaz, Can Sarisozen, Imran Vural, Ebru Bodur, Hande Canpinar, Aydan Usman, and Esin Asan (2011) Rosuvastatin induces apoptosis in cultured human papillary thyroid cancer cells Journal of Endocrinology 210: Can Sarisozen, Betul Arica, Mehmet N. Orman, A. Atilla Hincal, Sema Calis (2010) Optimization of prednisolone acetate-loaded chitosan microspheres using a 23 factorial design for preventing restenosis Drug Delivery 17(3): Erem Bilensoy, Can Sarisozen, Gunes Esendagli, A. Lale Dogan, Yesim Aktas, Murat Sen, N. Aydin Mungan (2009) Intravesical cationic nanoparticles of chitosan and polycaprolactone for the delivery of Mitomycin C to bladder tumors International Journal of Pharmaceutics 371: Can Sarisozen, Betul Arica, Sema Calis, A.Atilla Hincal (2009) Development of biodegradable drug releasing polymeric cardiovascular stents and in vitro evaluation Journal of Microencapsulation 26(6): SUNUMLAR Sözlü Sunumlar Patent Search Over Internet and Applications (examples and applications), 13 th International Pharmaceutical Technology Symposium, September 10-13, 2006, Antalya, Turkey. Fostering Inventive Activity and Suggestions on How to Conduct Research for Stronger Patents, 12 th International Pharmaceutical Technology Symposium, September 12-15, 2004, Istanbul, Turkey Sarisozen C., Arica B., Calis S., Hincal A.A. Prednisolone Acetate-Eluting Novel Biodegradable Vascular Stents For Implantation GPEN 2006, October 25-27, 2006, Lawrence, Kansas. Poster Sunumları Can Sarisozen, Imran Vural, A. Atilla Hincal, Tatyana Levchenko, Vladimir P. Torchilin Reversal of MDR by Using PEG-PE Based Immuno-Micelles Co-Loaded with Paclitaxel and Different P-gp Inhibitors Colloids and Nanomedicine July 2012, Amsterdam, The Netherlands. Sarisozen C., Vural I., Hincal A.A., Torchilin V. Reversal of Multidrug Resistance by Long-Circulating Micelles: Simultaneous Encapsulation and Action 18 th International Symposium on Microencapsulation, September 12-14, 2011, Antalya, Turkey. Olmez S.S., Sarisozen C., Vural I., Hincal A.A. Antibody-Directed Liposomes for Targeted Delivery 15th IPTS, September 13-15, 2010, Antalya, Turkey. 3

196 Can Sarisozen Özgeçmiş Sarisozen C., Olmez S.S., Vural I.I, Hincal A.A. Immuno-Nanoparticles: Surface Modification for Active Targeted Cancer Therapy 15th IPTS, September 13-15, 2010, Antalya, Turkey. Sarisozen C., Vural I., Hincal A.A., Torchilin V. Investigation of solubility and release characteristics of Paclitaxel mixed micelles FIP Pharmaceutical Sciences World Congress 2010 in association with the AAPS Annual Meeting & Exposition and PSWC 2010 Congress for Students and Postdoctoral Fellows meeting, November 14-18, 2010, New Orleans, USA. Sarisozen C., Vural I., Hincal A.A., Torchilin V. Formulation of Micellar Nanocarriers and Their Effect on Multi Drug Resistant Cancer Cell Lines FIP Pharmaceutical Sciences World Congress 2010 in association with the AAPS Annual Meeting & Exposition and PSWC 2010 Congress for Students and Postdoctoral Fellows meeting, November 14-18, 2010, New Orleans, USA. Gulcelik N.E., Zeybek D., Kaymaz F., Sarisozen C., Asan E., Vural I., Usman A. Atorvastatin inhibited proliferation in papillary thyroid cancer cell line Endocrine Abstracts (2010), 22, P810, European Congress of Endocrinology 2010, April 2010, Prague, Czech Republic. Sarisozen C. Chitosan Coated Liposomes Loaded with Furosemide: Characterization and Cellular Interaction European Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 38, Issue 1, Page 83-84, Suppl. 3 rd BBBB International Conference on Pharmaceutical Sciences, October 26-28, 2009, Antalya, Turkey. Sarisozen C., Vural I., Torchilin V.P., Hincal A.A. PEG-PE Based Mixed Micelles Loaded with Paclitaxel for Antitumor Activity: Enhanced Drug Solubilization European Journal of Pharmaceutical Sciences, Volume 38, Issue 1, Page 83-84, Suppl. 3 rd BBBB International Conference on Pharmaceutical Sciences, October 26-28, 2009, Antalya, Turkey. Sarisozen C., Olmez S.S., Vural I. Preparation of Chitosan Coated Liposomes for Delivery of Furosemide Phospholipids in Pharmaceutical Research, May 2009, Heidelberg, Germany. Mungan N., Sarisozen C., Dogan L., Esendagli, G., Bilensoy, E. Broadhesive Coated Nanoparticles Loaded with Mitomycin C for the Effective Chemotherapy of Superficial Bladder Cancer Urology, Volume 72, Issue 5, Supplement 1, November 2008, Page S67 (SIU World Uro-Oncology Update) Sawant R., Sarisozen C., Torchilin V. Multifunctional Nanocarriers with Target Recognition and Controlled Intracellular Penetration 6th International Nanomedicine and Drug Delivery Symposium (NanoDDS 08), October 18-19th, 2008, Toronto, Canada. Sarisozen C., Calis S., Arica B., Hincal A.A. Prednisolone acetate incorporated chitosan microspheres for preventing restenosis 6 th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, April 7-10, 2008, Barcelona, Spain. Sarisozen C., Aktas Y., Mungan A., Bilensoy E. Bioadhesive Coated Poly-Epsilon- Caprolactone Nanoparticles Loaded with Mitomycin C for the Treatment of Superficial 4

197 Can Sarisozen Özgeçmiş Bladder Tumors The 2nd BBBB Conference on Pharmaceutical Sciences, September 13-15, 2007, Tallinn-Tartu, Estonia. Sarisozen, C., Arica, B., Calis, S., Hincal, A.A. Physicochemical Characterization of Biodegradable Cardiovascular Stents International Symposium on Drug Research and Development, May 17-20, 2007, Antalya, Turkey Sarisozen C., Arica B., Calis S., Hincal A. A. In Vitro Evaluation of Polymer Coated Prednisolone Acetate Eluting Cardiovascular Stents Pharmaceutical Sciences World Congress, April 2007, Amsterdam, The Netherlands Sarisozen C., Arica B., Calis S., Hincal A.A. Development of Biodegradable Polymeric Cardiovascular Stents and In Vitro Evaluation AAPS Annual Meeting and Exposition, October 29 - November 2, 2006, San Antonio, Texas. Sarisozen C., Calis S., Arica B., Hincal A.A. Development of Prednisolone Acetate Incorporated Microspheres by Spray-Drying Technique 5 th World Meeting on Pharmaceutics, Biopharmaceutics and Pharmaceutical Technology, March 27-30, 2006, Geneva, Switzerland. ÜYE OLUNAN DERNEKLER AAPS American Association of Pharmaceutical Scientists TUFTAD Türk Farmasötik Teknoloji Araştırmacıları Derneği 5

198 EK 2

199

200

201

202

203

204

205

206

207