Genscreen HIV-1/2 Version 2 1 plaka plaka

Transkript

1 Genscreen HIV-1/2 Version 2 1 plaka plaka SERUM VEYA PLAZMADA ANTİ-HIV-1 VE ANTİ-HIV-2 ANTİKORLARININ İMMÜNOENZİMATİK TEKNİKLE ALGILANMASI İÇİN /01 1

2 İÇİNDEKİLER 1 - KLİNİK ÖNEMİ 2 - Genscreen HIV-1/2 Version 2 KİTİNİN PRENSİBİ 3 - Genscreen HIV-1/2 Version 2 KİTİNİN BİLEŞİMİ 4 - SON KULLANMA TARİHİ - SAKLAMA 5 - GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN MALZEMELER 6 - NUMUNELER 7 - ÖNLEMLER 8 - REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI 9 - ÇALIŞMA ŞARTLARI 10 - UYARILAR 11 - HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ 12 - NUMUNE VE KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLE KONTROL EDİLMESİ 13 - PERFORMANSLAR 14 - TEST LİMİTLERİ 15 - KAYNAKÇA 2

3 1 - KLİNİK ÖNEMİ Edinilmiş immünyetmezlik sendromu (AIDS) hücre bağışıklık sisteminde derin bir defisit şeklinde kendini gösteren viral bir enfeksiyon hastalığıdır. AIDS hastalığına yakalanmış veya bu hastalığın ön belirtilerine sahip hastaların lenfositlerinde lentivirüs grubu ile akrabalığı olan iki tip virüs izole edilmiştir. HIV-1 adı verilen birincisi önce Fransa'da, ardından ABD'de izole edilmiştir. HIV-2 adı verilen ikincisi ise Afrika kökenli iki hastada izole edilmiş ve Batı Afrika'da yaşanan yeni bir AIDS salgınından sorumlu olduğu ortaya çıkmıştır. HIV virüsü suşlarının genetik değişkenliği hakkındaki bilgiler her alt-tipi temsil eden suşların GAG, POL ve ENV genleri sekanslanarak elde edilmiştir. HIV-1 virüsleri 2 gruba ayrılır: M grubu (9 alt tip içerir (A ila I) ve O.grubu. HIV-2 virüsü 5 alt tip içerir. Farklı alt-tiplerin coğrafi dağılımı günümüzde oldukça iyi bir şekilde tanımlanmış bulunmaktadır. Bazı HIV-1 varyantları başlıca izolatlardan GAG ve POL genleri konusunda sadece %70 homoloji ve ENV geni konusunda sadece % 50 homoloji arz etmektedir; bu farklılıklar bazı hastalarda enfeksiyonun teşhis edilmesi konusundaki başarısızlıkları açıklayabilir. Farklı HIV-2 virüs suşları simian SIV virüsü ile tüm proteinler konusunda ortak antijenik özellikler arz eder (kılıf proteinleri ve dahili proteinler: heteroloji: %30), ancak HIV-1 virüsünün kılıf proteinleri ile % 40'ın altında bir homoloji arz eder. Genscreen HIV-1/2 Version 2 testi anti HIV-1 ve anti HIV-2 antikorlarının eşzamanlı olarak algılanmasını sağlar. 2 - Genscreen HIV-1/2 Version 2 KİTİNİN PRENSİBİ Genscreen HIV-1/2 Version 2, HIV-1 ve/veya HIV-2 virüsleri ile ilintili farklı antikorların insan serumu veya plazmasında algılanmasına yönelik, iki aşamalı sandviç prensibine dayanan immünoenzimatik bir tekniktir. Genscreen HIV-1/2 Version 2 saflaştırılmış antijenler ile hazırlanan bir solid faz (HIV-1 virüsü gp160 ve p25 rekombinant proteinleri ve HIV-2 virüsü kılıf glikoproteininin immunodominant epitopunu taklit eden peptid) ve peroksidaz ile işaretlenmiş antijenler ile hazırlanan bir konjugat (nükleokapsid rekombinant proteini ve HIV-1 ve HIV-2 virüs kılıf glikoproteinlerinin immunodominant epitoplarını taklit eden peptidler). Testin uygulanması aşağıdaki reaksiyonel aşamaları içerir: 1. İncelenecek serumlar ve kontrol serumları kaplara dağıtılır. HIV-1 ve/veya HIV-2 antikorları varsa, bunlar solid fazın üzerine sabitlenmiş antijenlere bağlanır. Numune ilavesi rengin menekşe renginden maviye dönmesi ile doğrulanır (SDP = Sample Deposition Proof). 2. Saflaştırılmış, peroksidaz ile işaretlenmiş HIV-1 ve HIV-2 antijenleri yıkama işleminden sonra ilave edilir. Bu antijenler de solid fazın üstünde tutulan IgG ve/veya IgM ve/veya IgA'lara bağlanır. 3. Kompleksler üzerine sabitlenmiş enzim, serbest kalan konjugat bölümünün elimine edilmesinden sonra, ortamda substrat mevcut iken inkübe edilerek ortaya çıkarılır. 4. Reaksiyonun durmasından sonra, spektrofotometre ile 450/ nm'de okuma yapılır. Bir numunede gözlemlenen absorbans anti-hiv-1 ve/veya anti-hiv-2 antikorlarının mevcut olup olmadığının belirlenmesini sağlar. 3

4 3 - Genscreen HIV-1/2 Version 2 KİTİNİN BİLEŞİMİ Tüm reaktifler sadece in-vitro teşhis amacıyla kullanılmaya yöneliktir Etiketleme R1 Microplate R2 Concentrated washing solution (20X) R3 Negative control R4 Cut-off control R5 Positive control R6 Sample diluent R7a Conjugate R7b Conjugate diluent R8 Substrate buffer R9 Chromogen: TMB solution (11X) R10 Stopping solution Reaktiflerin niteliği Mikroplaka Saflaştırılmış HIV-1 ve HIV-2 antijenleri ile duyarlılaştırılmış 8 kaptan oluşan 12 şerit Konsantre Yıkama Solüsyonu (20X) Tampon Tris NaCl ph 7,4 Koruyucu: ProClin 300 (%0,04) Negatif kontrol Isıtma yoluyla etkisiz hale getirilmiş, HBs ve HIV antijeni ve anti HIV-1, anti HIV-2 ve anti HCV antikorları açısından negatif insan plazması Koruyucu: Sodyum azid < % 0,1 Eşik kontrolü Isıtma yoluyla etkisiz hale getirilmiş, anti HIV antikorları açısından pozitif, HBs antijeni ve anti-hcv antikorları açısından negatif insan plazması Koruyucu: Sodyum azid < % 0,1 Pozitif kontrol Isıtma yoluyla etkisiz hale getirilmiş, anti HIV antikorları açısından pozitif, HBs antijeni ve anti-hcv antikorları açısından negatif insan plazması Koruyucu: Sodyum azid < % 0,1 Numune Sulandırıcısı Dana serumu solüsyonu (%0,1 kloroform, ProClin 300 ve bir numune ilavesi renkli göstergesi ilave edilmiş TRIS tamponu) Konjugat Peroksidaz ile işaretlenmiş, liyofilize, saflaştırılmış HIV-1 ve HIV-2 antijenleri Konjugat sulandırıcısı Renklendirilmiş yağsız süt solüsyonu (% 0,1 kloroform ve ProClin 300 ilave edilmiş TRIS tamponu) Peroksidaz substratı için tampon % 0,015 H ve %4 DMSO içeren sodyum sitrat ve sodyum asetat ph 4,0 solüsyonu Kromojen Tetrametil benzidin (TMB) içeren solüsyon Durdurma solüsyonu 1 N sülfürik asit Sunum plaka 70 ml 1 ml 2,5 ml 1 ml 14 ml q.s. ad 12,5 ml 12,5 ml 60 ml 5 ml 28 ml 5 plaka 235 ml 1 ml 2,5 ml 1 ml 2 şişe 2 x 10 ml 2 şişe q.s. ad 2 x 30 ml 2 şişe 2 x 30 ml 2 şişe 2 x 60 ml 2 şişe 2 x 5 ml 3 şişe 3 x 28 ml 4

5 4 - SON KULLANMA TARİHİ - SAKLAMA Kit +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilmelidir. Genscreen HIV-1/2 Version 2 kitinde bulunan ve +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilen her unsur, özel bir uyarı bulunmadığı takdirde, kitin ilk açılışından sonra kutunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir: R1: Vakumlu poşetin açılmasından sonra, +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilen ve özenle kapatılan orijinal ambalajlarındaki şeritler 1 ay dayanabilir. R2: Sulandırılmış yıkama solüsyonu C sıcaklıkta 2 hafta saklanabilir. Konsantre yıkama solüsyonu (R2) C sıcaklıkta muhafaza edilebilir. R7a + R7b: Yeniden oluşturulduktan sonra, +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilen reaktifler 4 hafta boyunca kullanılabilir. R8 + R9: Yeniden oluşturulduktan sonra, karanlıkta saklanan reaktifler ortam sıcaklığında (18-30 C) 6 saat boyunca kullanılabilir. 5 - GEREKLİ OLAN ANCAK ÜRÜNLE BİRLİKTE VERİLMEYEN MALZEMELER Damıtık su. Sodyum hipoklorit (çamaşır suyu) ve sodyum bikarbonat. 25 µl, 75 µl, 80 µl ve 200 µl'lik hacimler ölçmeye ve boşaltmaya yönelik ayarlanabilir veya sabit, pipetler, otomatik veya yarı otomatik multipipetler. 25 ml, 100 ml, ml dereceli deney tüpleri. Kontamine atık konteyneri 37 C ± 1 C termostatlı benmari veya mikroplaka inkübatörü (*). Manüel, yarı otomatik yıkama tertibatı veya mikrotitrasyon plakası için yıkama cihazı (*). 450 nm ve nm filtrelerle donatılmış, mikroplaka okuma cihazı (*). Emici kâğıt. (*) Teknik servislerimiz tarafından onaylanan cihazlar konusunda tam bilgi edinmek için bize danışınız. 6 - NUMUNE Olağan uygulama yöntemleriyle bir kan numunesi alın. Testler sulandırılmamış serum veya plazma numuneleri üzerinde yapılacaktır (numuneler EDTA, heparin, sitrat, ACD gibi antikoagülanlar ile alınır). Hemolize engel olmak için en kısa sürede serumu veya plazmayı pıhtıdan veya alyuvarlardan çıkarın. Çok belirgin bir hemoliz test performansını etkileyebilir. Agrega içeren numuneler testten önce santrifugasyon ile arıtılmalıdır. Süspansiyon halindeki partiküller veya fibrin agregaları yanlış pozitif sonuçlar elde edilmesine yol açabilir. Numuneleri ısıtmayın. Tarama 7 gün içerisinde yapılır ise, numuneler +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edilecektir; veya numuneler -20 C sıcaklıkta dondurulmuş olarak muhafaza edilebilir. Plazmalar birkaç dakika 40 C sıcaklıkta ısıtılarak hızlı bir şekilde çözdürülecektir (fibrinin çökelmesini sınırlı tutmak için). Dondurma/Çözdürme işlemlerini tekrarlamaktan kaçının. Üç defadan fazla dondurulan ve çözdürülen numuneler kullanılmamalıdır. Eğer numuneler taşınacak ise, bunları etyolojik ajanların taşınması ile ilgili yürürlükteki mevzuata uygun şekilde ambalajlayın. KONTAMİNE, HİPERLİPEMİK VEYA HİPERHEMOLİZE TABİ TUTULMUŞ SERUMLAR VEYA PLAZMALAR KULLANMAYIN. NOT: 90 gr/l'ye kadar albumin ve 200 mg/l'ye kadar bilirubin içeren numunelerde ve ayrıca 36 gr/l'ye kadar trigliserit içeren lipemik numunelerde ve 20 gr/l'ye kadar hemoglobin içeren hemolizli numunelerde hiçbir etkileşim ispatlanamamıştır. 5

6 7 - ÖNLEMLER Elde edilecek sonuçların kalitesi aşağıdaki laboratuar uygulamalarına tam olarak uyulmasına bağlıdır: Test ismi ve test özel tanıtım numarası her mikroplaka çerçevesinin üzerinde belirtilmiştir. Bu özel tanıtım numarası her şeridin üzerinde de yer alır. Genscreen HIV-1/2 Version 2: Özel Tanıtım Numarası = 05 Bu tanıtım numarası her kullanımdan önce kontrol edilmelidir. Test numarası bulunmayan veya gerçekleştirilen testin numarasından farklı olan hiçbir şerit, kullanılmamalıdır. Son kullanma tarihi geçmiş reaktifler kullanmayın. Aynı deney sırasında farklı partilere ait reaktifleri birbirine karıştırmayın. Not: Aynı deney boyunca hep aynı partiyi kullanmak kaydıyla, kitte teslim edilenlerden farklı yıkama solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2), substrat tamponu (mavi TMB buf. ibaresi ile tanıtılan, R8), kromojen (menekşe rengi TMB 11X ibaresi ile tanıtılan, R9) ve durdurma solüsyonu (kırmızı 1N ibaresi ile tanıtılan, R10) partileri kullanmak mümkündür. Bu reaktifler şirketimizin diğer ürünleri ile birlikte kullanılabilir. Ayrıca, belli bir deneyde bir tek karışımın kullanılması kaydıyla, yıkama solüsyonu (etiketin üzerindeki yeşil 20X ibaresi ile tanıtılan, R2) düzgün bir şekilde yeniden oluşturulan farklı Bio-Rad reaktif kitlerine dahil edilmiş diğer iki yıkama solüsyonundan biri ile (etiketin üzerindeki mavi bir 10X veya turuncu bir 10X ibaresi ile tanıtılan, R2) karıştırılabilir. Ayrıntılı bilgi edinmek için teknik servislerimizle irtibat kurunuz. Developman solüsyonu (substrat tamponu + kromojen) pembe renkte olmalıdır. Yeniden oluşturma işlemini izleyen dakikalarda, başka bir rengin ortaya çıkması reaktifin kullanılamaz durumda olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini gösterir. Bu preparat için tercihen, tek kullanımlık kaplar ve plastik dağıtım malzemeleri veya önceden 1 N hidroklorik asit, ardından damıtık su ile yıkanmış ve kurutulmuş cam kaplar kullanın. Bu solüsyonu güneş ışınlarına maruz bırakmayın. Kullanımdan önce, reaktiflerin laboratuar sıcaklığında dengelenmesi için 10 dakika bekleyin. Reaktifleri özenle yeniden oluşturun. Pipetlerin doğruluğunu ve hassasiyetini ve kullanılan cihazların düzgün çalıştığını kontrol edin. Çalışma şartlarını değiştirmeyin. Yıkama: Testten azami performans elde etmek için, yıkama prosedürlerine titizlikle uyulması gerekir. Hijyen ve Güvenlik Talimatları Pozitif kontroller ve eşik kontrolleri ısıyla etkisiz hale getirilmiştir. Negatif kontrolün hazırlamasında kullanılan insan kaynaklı malzeme teste tabi tutulmuş ve anti-hiv-1, anti-hiv-2 antikorları, HBs antijeni ve anti-hcv antikorları açısından negatif bulunmuştur. Pozitif kontrolün ve eşik serumun hazırlanmasında kullanılan insan kaynaklı malzeme teste tabi tutulmuş ve HBs antijeni ve anti-hcv antikorları açısından negatif bulunmuştur. Hiçbir yöntem HIV, Hepatit B veya Hepatit C virüslerinin veya diğer bulaşıcı ajanların bulunmadığını kesin bir şekilde garanti edemediği için, bu reaktifleri ve hasta numunelerini potansiyel olarak bulaşıcı malzeme addedin ve olağan önlemler ile kullanın. Numuneler ve reaktifler ile doğrudan temas eden malzemeyi ve ayrıca yıkama solüsyonlarını kontamine ürünler addedin. 121 C sıcaklıkta minimum 1 saat otoklavlama HIV virüslerini ve hepatit B virüsünü etkisiz hale getirmek için en iyi yöntemdir. SODYUM HİPOKLORİT İÇEREN SOLÜSYONLARI OTOKLAVIN İÇİNE SOKMAYIN. 6

7 Güvenlik verileri fişi talep üzerine verilmektedir. Kontamine solüsyonların ve malzemelerin %5 sodyum hipoklorit son konsantrasyonlu çamaşır suyu ile 30 dakika boyunca işlemden geçirilmesi de HIV virüslerinin ve hepatit B virüsünün etkisiz hale getirilmesini sağlar. Substrat tamponunun, kromojenin ve durdurma solüsyonunun cilt ve mukozalar ile hiçbir şekilde temas etmesine izin vermeyin (toksisite, tahriş ve yanık riski). Ayrıca, kimyasal ürünler doğru laboratuar uygulamalarına göre kullanılmalı ve atılmalıdır. Bu test kitinde bulunan kimyasal komponentlerle ilgili tehlikeler ve bunlardan korunma yöntemleri konusunda öneriler için lütfen etiketler üzerinde bulunan ve ayrıca bu kullanım talimatlarının sonunda yer alan resimli grafiklere başvurun. Güvenlik Veri Sayfası adresinde bulunabilir. 8 - REAKTİFLERİN YENİDEN OLUŞTURULMASI Not: Kullanımdan önce tüm reaktifleri ortam sıcaklığına (18 ila 30 C) getirin. Reaktif 1 (R1): Mikroplaka 12 şerit içeren her taşıyıcı çerçeve kapalı alüminyum poşet içine konulmuştur. Poşeti makas veya bıçak ile birleşme noktasının 0,5 ila 1 cm üzerinde kesin. Poşeti açın ve çerçeveyi poşetten çıkarın. Kullanılmayan şeritleri tekrar poşetin içine yerleştirin. Poşeti özenle kapatın ve yeniden +2-8 C sıcaklıkta muhafaza edin. Reaktif 2 (R2): Konsantre yıkama solüsyonu (20X) Solüsyonu damıtık su ile 20 kez sulandırın. Bu şekilde, kullanıma hazır yıkama solüsyonu elde edilir. 12 şeritten oluşan bir plaka için 800 ml hazırlayın. Reaktif 3 (R3): Negatif kontrol Anti HIV-1 ve anti HIV-2 antikorları, HBs antijeni ve anti-hcv antikorları açısından negatif, % 0,1 sodyum azotür içeren insan serumu. Reaktif 4 (R4): Eşik kontrolü Düşük miktarda anti-hiv antikoru içeren, HBs antijeni ve anti-hcv antikorları açısından negatif, ısı ile etkisiz hale getirilmiş, % 0,1 sodyum azotür içeren insan serumu. Reaktif 5 (R5): Pozitif kontrol Anti-HIV antikorları açısından pozitif, HBs antijeni ve anti-hcv antikorları açısından negatif, ısı ile etkisiz hale getirilmiş, % 0,1 sodyum azotür içeren insan serumu. Reaktif 6 (R6): Numune Sulandırıcısı Dana serumu solüsyonu (%0,1 kloroform, ProClin 300 ve bir numune ilave renkli göstergesi ilave edilmiş TRIS tamponu). Reaktif 7a (R7a): Konjugat Peroksidaz ile işaretlenmiş, saflaştırılmış HIV-1 ve HIV-2 antijenleri. BSA ve ProClin 300 (% 0,1) içerir. Kauçuk kapağa yapışabilecek her türlü maddeyi çıkarmak için şişeyi minderin üstüne hafifçe vurun. Kapağı özenle çıkarın ve bir konjugat sulandırıcı şişesinin içeriğini liyofilize konjugat şişesine boşaltın. Kapağı tekrar kapatın ve erimeyi kolaylaştırmak için şişeyi sallayarak ve zaman zaman ters çevirerek 10 dakika bekletin. Reaktif 7b (R7b): Konjugat sulandırıcısı Renklendirilmiş yağsız süt solüsyonu (% 0,1 kloroform ve ProClin 300 ilave edilmiş TRIS tamponu). 7

8 Reaktif 8 (R8): Peroksidaz substratı için tampon % 0,015 oksijenli su ve % 4 dimetilsülfoksit (DMSO) içeren sitrik asit ve sodyum asetat ph 4,0 solüsyonu. Reaktif 9 (R9): Kromojen Tetrametilbenzidin (TMB) içeren solüsyon. Solüsyonu substrat tamponunda 11 kez sulandırın (Örnek: 1 ml reaktif R9 +10 ml reaktif R8). 6 saat dayanır. Reaktif 10 (R10): Durdurma solüsyonu Kullanıma hazır 1 N sülfürik asit solüsyonu. 9 - ÇALIŞMA ŞARTLARI Önerilen protokole kesinlikle uyun. Testin kalitesini doğrulamak için, test her uygulandığında negatif ve pozitif kontrol serumlarını ve eşik serumunu kullanın. Doğru laboratuar uygulamalarını kullanın: 1. Numune dağıtım ve tanıtım planını özenle hazırlayın. 2. Sulandırılmış yıkama solüsyonunu hazırlayın. 3. Taşıyıcı çerçeveyi ve şeritleri (R1) koruyucu ambalajdan çıkarın. 4. Plakayı ön yıkamaya tabi tutmadan doğrudan, art arda şunları ilave edin: Her kaba 25 µl sulandırıcı A1'e 75 µl negatif kontrol serumu (R3) B1, C1, D1'e 75 µl eşik kontrol serumu (R4) E1'e 75 µl pozitif kontrol serumu (R5) F1'e birinci numuneden 75 µl, G1'e ikinci numuneden 75 µl, vs. Kullanılan sisteme bağlı olarak, kontrollerin konumu veya dağıtım sırası değiştirilebilir. 75 µl'lik bir pipetle en az 3 defa çekerek veya pipetle çekme işleminden sonra mikroplakayı çalkalayarak karışımı homojenleştirin. Dörtte üç oranında önceden sulandırılan bir numuneden 100 µl koymak da mümkündür (Örnek. 150 µl serum + 50 µl sulandırıcı). Not: İşlemlerin bu aşamasında numune dağılımı görsel olarak kontrol edilebilir; gerçekten de numuneler ilave edildikten sonra, başlangıçta menekşe rengi olan sulandırıcının rengi maviye döner. (otomatik kontrol için bkz. bölüm 12: NUMUNE VE KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 5. Sızdırmazlık sağlamak için, mümkünse üstünü yapışkan bir film ile örterek, tüm yüzeyin üzerine iyice basın. 6. Mikroplakayı 30 ± 5 dakika boyunca 37 C ± 1 C sıcaklıkta, termostatlı benmari veya kuru mikroplaka inkübatöründe inkübe edin. 7. Yapışkan filmi çıkarın. Tüm kapların içeriğini kontamine atıklar için öngörülmüş (sodyum hipoklorit içeren) bir konteynere çekin ve kaplardan her birinin içine derhal minimum 370 µl yıkama solüsyonu ilave edin. Minimum 30 dakikalık bir batırma süresi (bekleme süresi) uygulayın. Yeniden çekin. Yıkama işlemini en az 2 kez tekrarlayın (veya toplam, minimum 3 yıkama). Artık hacim 10 µl'den az olmalıdır (gerekirse plakayı emici bir kâğıt üzerinde ters çevirerek kurutun). Otomatik bir yıkayıcınız var ise, aynı işlem döngüsünü uygulayın (bakınız, bölüm 10: Uyarılar). 8. Tüm kaplara konjugat solüsyonundan hızlı bir şekilde 100 µl dağıtın. Konjugat kullanılmadan önce çalkalanmalıdır. Not: Yeşile boyanmış olan konjugatın dağıtılması işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir, (otomatik kontrol için, bkz. bölüm 12: NUMUNE VE 8

9 KONJUGAT İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLE KONTROL EDİLMESİ). 9. Mümkünse, mikroplakanın üzerini yeni bir film ile örtün. Ortam sıcaklığında (18-30 C) 30 ± 5 dakika inkübe edin. 10. Yapışkan filmi çıkarın; tüm kapların içeriğini çekerek boşaltın ve daha önce olduğu gibi en az 5 kez yıkayın. Artık hacim 10 µl'den az olmalıdır (gerekirse şeritleri emici bir kâğıt üzerinde ters çevirerek kurutun). 11. Önceden hazırlanmış 80 µl'lik enzimatik faaliyet developman solüsyonunu (R8+R9) tüm kaplara hızla dağıtın. Reaksiyonun ortam sıcaklığında (18 ila 30 C) 30 ± 5 dakika boyunca karanlıkta gerçekleşmesini sağlayın. Bu inkübasyon sırasında, yapışkan film kullanmayın. Not: Pembe renkte olan developman solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir: Boş bir kap ile pembemsi renkteki developman solüsyonunu içeren bir kap arasında önemli bir renk farkı vardır. (otomatik kontrol için paragraf 12'ye başvurun: NUMUNE VE REAKTİF İLAVELERİNİN SPEKTROFOTOMETRİ İLE KONTROL EDİLMESİ). 12. Developman solüsyonu ile aynı sıra ve dağıtım temposunu kullanarak 100 µl durdurma solüsyonu (R10) ilave edin. Reaksiyonel karışımı homojenleştirin. Not: Renksiz olan durdurma solüsyonunun dağıtılması, işlemlerin bu aşamasında görsel olarak kontrol edilebilir. Substratın pembemsi (negatif numuneler için) veya mavi (pozitif numuneler için) olan rengi, durdurma solüsyonu ilave edildikten sonra renksiz hale gelen (negatif numuneler için) veya rengi sarıya dönen (pozitif numuneler için) kaplardan kaybolur. 13. Plakaların alt kısmını özenle silin. Durdurma solüsyonunun dağıtılmasından en az 4 dakika sonra ve reaksiyonun sona ermesini müteakip 30 dakika içinde, bir plaka okuyucusu yardımıyla 450/ nm'de optik yoğunluğu okuyun. 14. Sonuçları kayda geçirmeden önce, okuma işlemi ile plaka ve numunelerin dağıtım ve tanıtım planının birbirleriyle uyumlu olduğunu kontrol edin UYARILAR DİKKAT: KONTAMİNASYON OLMASI DURUMUNDA İŞLEMLER SIRASINDA KONTAMİNASYONLARA ENGEL OLUN (sıçrama, vs.) Asit olmayan sıçramış maddeler % 5'lik (minimum) bir sodyum hipoklorit solüsyonu (çamaşır suyu) ile tamamen temizlenmelidir. Sıçrayan asitler kuru olarak temizlenmelidir. Bunun ardından, madde sıçramış bölge (minimum) %5'lik bir sodyum hipoklorit solüsyonu ile temizlenmelidir. Temizleme işleminde kullanılan malzemeler kontamine atıklar konteynerine atılmalı, ardından uygun kurallara göre elimine edilmelidir (bakınız önlemler bölüm 7) KONJUGATI VE DEVELOPMAN SOLÜSYONUNU DAĞITMAK İÇİN ASLA AYNI KABI KULLANMAYIN. TAVSİYE EDİLEN YIKAMA DÖNGÜSÜ SAYISINI KULLANIN.* DAĞITIMDAN ÖNCE ENZİMATİK DEVELOPMAN SOLÜSYONUNU (SUBSTRAT TAMPONU KROMOJEN) KONTROL EDİN. Bu solüsyon renksiz olmalıdır. Yeniden oluşumu takip eden dakikalar içerisinde mavi bir rengin ortaya çıkması reaktifin kullanılamaz durumda olduğunu ve değiştirilmesi gerektiğini gösterir. Gerçekten de, substrat tamponu, kromojen, developman solüsyonu ve durdurma solüsyonuna metal iyonları bulaşabilir. Bu yüzden, tercihen plastik kaplar ve dağıtım malzemeleri veya önceden 1 N hidroklorik asit, ardından özenle damıtık su ile yıkanmış ve kurutulmuş cam kaplar kullanın. (*) Teknik servislerimiz tarafından onaylanan cihazlar konusunda tam bilgi edinmek için bize danışın. 9

10 11 - HESAPLAMALAR VE SONUÇLARIN DEĞERLENDİRİLMESİ Anti HIV-1 ve/veya HIV-2 antikorlarının var olup olmadığı, her numunede kaydedilen aborbansın hesaplanan eşik değerin absorbansıyla karşılaştırılması suretiyle belirlenir. 1) Eşik kontrol serumu için absorbans ortalamasını hesaplayın (DOR4) DO (B1) + DO (C1) + DO (D1) DOR4 = ) Eşik değerin hesaplanması Eşik değer aşağıdaki oranla belirlenir: DOR4 VS = ) Testin Geçerli İlan Edilmesi Negatif kontrol serumu eşik değerin %70'ine tekabül eden değerin altında olmalıdır: DOR3 < 0,7 VS Eşik kontrol serumlarının ortalaması 0,80'in üzerinde olmaldır: DOR4 > 0,80 İsteğe bağlı olarak: DOR5/DOR4 oranı 1,3'e eşit veya bu değerin üzerinde olmalıdır (Bu opsiyonel standart sadece kullanılan okuyucunun doğrusallığı 3,000'ın üzerinde ise uygulanabilir). 4) Sonuçların Yorumlanması Absorbansları eşik değerin altında kalan numuneler Genscreen HIV-1/2 Version 2 testine göre negatif olarak değerlendirilir. Bununla birlikte, eşik değerin hemen altındaki sonuçlar (ED - %10 < OY < ED) ihtiyatla yorumlanmalıdır ve kullanılan sistemler ve laboratuar prosedürleri buna imkân tanıdığında ilgili numunelerin çift kopyalar halinde yeniden teste tabi tutulması tavsiye edilir. Absorbansları eşik değere eşit veya bu değerin üzerinde olan numuneler Genscreen HIV-1/2 Version 2 testine göre başlangıçta pozitif olarak değerlendirilir. Bu numuneler son değerlendirmeden önce iki kopya olarak yeniden kontrol edilmelidir. Test tekrarlandıktan sonra, bir numune için, iki çiftin absorbansı eşik değerin altında ise, ilk başta elde edilen sonuç farklı koşullarda tekrarlanamaz ve numune Genscreen HIV-1/2 Version 2 testine göre negatif ilan edilir. Farklı koşullarda tekrarlanabilir olmayan reaksiyonların kaynağı sıkça aşağıdaki nedenlere bağlıdır: mikroplakaların yeterli derecede yıkanmaması, negatif numunelere yüksek antikor titreli bir serumun bulaşması developman solüsyonunun oksitleyici kimyasal maddeler (çamaşır suyu, metal iyonları, vs.) vasıtasıyla bireysel olarak kontamine olması. durdurma solüsyonunun bireysel olarak kontamine olması. Test tekrarlandıktan sonra, iki çiftten birinde ölçülen absorbans eşik değere eşit veya bu değerin üzerinde ise, ilk başta elde edilen sonuç farklı koşullarda tekrarlanabilir ve numune Genscreen HIV 1/2 Version 2 testine göre pozitif ilan edilir ve bölüm 13'te belirtilen şekilde işleme tabi tutulur. 10

11 12 - NUMUNE VE KONJUGAT DAĞITIMININ SPEKTROFOTOMETRİK YÖNTEMLE KONTROL EDİLMESİ Numune dağıtımının kontrol edilmesi Numune sulandırıcısının (R6), ardından numunelerin art arda dağıtılmasından sonra, 620 nm'de yapılan spektrofotometrik bir okuma ile teste tabi tutulacak numunelerin kaplarda bulunup bulunmadığı kontrol edilebilir: Bir numune içeren kabın optik yoğunluğu 0,150 değerinin üzerinde olmalıdır (daha düşük bir optik yoğunluk numunenin iyi dağıtılmadığını gösterir). Kaplarda konjugat olup olmadığının kontrol edilmesi Konjugat dağıtım aşamasından sonra (R7a + R7b), kaplarda konjugat bulunduğu 620 nm'de yapılan spektrofotometrik bir okuma ile kontrol edilebilir: Konjugat içeren bir kabın optik yoğunluğu 0,100 değerinin üzerinde olmalıdır (daha düşük bir optik yoğunluk konjugatın bu kapta iyi dağıtılmadığını gösterir). Developman solüsyonu ilavelerinin kontrol edilmesi 490 nm'de yapılan otomatik bir okuma ile pembemsi developman solüsyonunun mevcut olup olmadığı kontrol edilebilir: Developman solüsyonu içeren bir kabın optik yoğunluğu 0,100 değerinin üzerinde olmalıdır (daha düşük bir optik yoğunluk developman solüsyonunun iyi dağıtılmadığını gösterir) Boş bir kap ile pembemsi renkteki developman solüsyonunu içeren bir kap arasında önemli bir renk farkı vardır PERFORMANSLAR Genscreen HIV-1/2 Version 2 testi duyarlılık incelemeleri AIDS'e yakalanmış veya AIDS öncesi (PARAAIDS) safhada bulunan hastalara ait pozitif numuneler ve kısa bir süre önce HIV virüsü bulaşmış hastalardan alındığı belgelenen numunelerden oluşan duyarlılık panelleri üzerinde gerçekleştirilmiştir: AIDS'e yakalanmış veya AIDS öncesi (PARAAIDS) safhada bulunan M grubu HIV-1 pozitif hastalara ait olan ve Western-Blot ile doğrulanmış 413 numune ve O grubu HIV-1 hastalara ait olan ve Western-Blot ile HIV-1 olduğu doğrulanmış 31 numune üzerinde yapılan incelemede duyarlılık %100 olarak değerlendirilmiştir. Aynı şekilde, O grubu HIV-1 olan ve Western Blot ile belirsiz sonuç veren 4 numune üzerinde teste tabi tutulan O grubu duyarlılığı 3 numunenin pozitif bulunması ile tatminkâr addedilmiştir. Western-Blot vasıtasıyla pozitif olduğu doğrulanan hastalardan alınmış, sulandırılmış veya sulandırılmamış 119 serum üzerinde değerlendirilen HIV-2 duyarlılığı %100 olarak bulunmuştur. M grubu HIV-1 duyarlılığı 29 ticari serokonversiyon paneli (BBI, NABI, Bioclinicals partners) ve INTS'in duyarlılık paneli üzerinde değerlendirmeye tabi tutulmuştur. Sonuçlar tekniğin günümüzdeki durumuna uygundur. INTS panelinde, 45 serokonversiyon numunesi ve 13 serokonversiyon öncesi numunesi pozitiftir. 25 ek taze pozitif numune (kan alınmasından sonraki 1 gün içinde) test edildi ve tamamı pozitif bulundu. En az 42 serokonversiyon numunesi GenscreenTM HIV-1/2 Sürüm 2 ile test edildi. Teste tabi tutulan numunede, test özgüllüğü kan donörleri için % 99,98 olarak bulunmuştur. AIDS virüsü ile ilişkisi olmayan patolojiler veya durumlar arz eden 212 hasta (hamile kadınlar, romatoid faktör, antinükleer Ig veya diğer viral enfeksiyonlar) üzerinde yapılan inceleme sırasında 3 pozitif reaksiyon gözlemlenmiştir. 11

12 Genscreen HIV-1/2 Version 2 testinin hassasiyeti 4 numune incelenerek belirlenmiştir: 1 negatif serum (num.1), anti HIV-1 antikorları açısından hafif pozitif 2 serum (num. 2 ve 3) ve anti HIV-1 antikorları açısından aşırı pozitif 1 serum (num.4). Tekniğin aynı koşullarda tekrarlanabilirliği (test içi) teste tabi tutulan bu 4 numunenin incelenmesi suretiyle değerlendirmeye tabi tutulmuş, bu 4 numune aynı işlem sırasında 30 kez teste tabi tutulmuştur; farklı koşullarda tekrarlanabilirlik (testler arası) ise aynı 4 numunenin incelenmesi suretiyle değerlendirmeye tabi tutulmuş, bu 4 numune 5 farklı gün boyunca, günde birbirinden bağımsız 2 test yapılarak üç kopya halinde teste tabi tutulmuştur. Sonuçlar aşağıdaki 2 tabloda toplu olarak verilmiştir: Tablo 1: Tekrarlanabilirlik (Test İçi) n = 30 Num. 1 Num. 2 Num. 3 Num. 4 Oranların 0,12 3,34 9,05 19,6 ortalaması* Standart sapma 0,04 0,45 0,30 0,73 Varyasyon Katsayısı oranları* (%) %31,5 %13,6 %3,3 %3,7 * Oranlar = OD/C.O. Tablo 2: Tekrarlanabilirlik (Testler Arası) n = 30 Num. 1 Num. 2 Num. 3 Num. 4 Oranların 0,12 3,43 9,27 19,35 ortalaması* Standart sapma 0,02 0,41 0,89 1,93 Varyasyon Katsayısı oranları* (%) %19,3 %12,1 %9,65 %10,0 * Oranlar = OD/C.O TEST LİMİTLERİ Çok düşük antikor oranları yeni bir enfeksiyon sırasında algılanmayabilir; dolayısıyla elde edilen negatif bir sonuç kontrol edilen numunede Genscreen HIV-1/2 Version 2 testiyle algılanabilir antikorlar bulunmadığını gösterir. Böyle bir negatif sonuç HIV-1/HIV-2 enfeksiyonu ihtimalini ortadan kaldırmaz. HIV-1 (M grubu, O grubu) ve HIV-2 virüslerinin değişkenliği yanlış pozitif reaksiyon olasılığının ortadan kaldırılmasına olanak tanımamaktadır. Bilinen hiçbir yöntem HIV virüsünün bulunmadığına dair bir garanti sunmamaktadır. Yüksek duyarlılığa sahip her türlü ELISA tekniği yanlış pozitif sonuçlara yol açabilir. Reaksiyonun özgüllüğünü kontrol etmek amacıyla, farklı koşullarda tekrarlanabilir bulunan (Genscreen HIV-1/2 Version 2 testi yorumlama kriterlerine göre) her numune bir doğrulama testine tabi tutulmalıdır (Western-Blot). Numunelerin ısıtılması sonuçların kalitesini etkileyebilir. Numune ve/veya konjugat ve/veya developman solüsyonu ilavelerini kolorimetri ile doğrulama yöntemi dağıtılan hacimlerin doğruluğunun kontrol edilmesini sağlamaz, sadece numune ve/veya konjugat ve/veya developman solüsyonunun ortamda mevcut olduğunu gösterir. Bu yöntemle elde edilen hatalı yanıt oranı kullanılan sistemin hassasiyetine bağlıdır (%10'un üzerindeki kümülatif pipetleme ve okuma varyasyon katsayısı değerleri bu kontrolün kalitesini büyük ölçüde azaltabilir). 12

13 Konjugat inkübasyon aşamasından sonra yapılan yıkamanın yetersiz olması durumunda, developman solüsyonu dağıtımının otomatik olarak kontrol edilmesi (kaplardaki optik yoğunlukların 490 nm'de okunması vasıtasıyla) hatalı sonuçlar elde edilmesine yol açabilir ve developman solüsyonu bulunmaması durumunda 0,100'ün üzerinde optik yoğunluklar elde edilir. Bununla birlikte, teste tabi tutulan 939 numune üzerinde yapılan değerlendirmeler sırasında bu olguya rastlanmamıştır KAYNAKÇA 1. BARRE-SINOUSSI F., CHERMANN J.C., REY F. et al Isolation of a T. lymphotropic retrovirus from a patient at risk for acquired immunodeficiency syndrome (AIDS), Science, 1983, 220, ALIZON M., SONIGO P., BARRE-SINOUSSI F. et al. Molecular cloning of lymphadenopathy associated virus Nature, 1984, 312, CLAVEL F., GUETARD D., BRUN-VEZINET F. et al. Isolation of a new human retrovirus from West African patients with AIDS. Science. 1986, 233, CLAVEL F., GUYADER M., GUETARD D. et al. Molecular cloning and polymorphism of the human immune deficiency virus type 2. Nature, 1986, 324, BRUN-VEZINET F., ROUZIOUX C., BARRE-SIOUSSI F. et al. Detection of IgG antibodies to lymphadenopathy associated virus (LAV) by ELISA, in patients with acquired immunodeficiency syndrome or lymphadenopathy syndrome. Lancet. 1984, June, MATHIESEN T., CHIODI F., BROLIDEN P.A., et al. Analysis of a subclass restricted HIV-1 gp 41 epitope by omission peptides. Immunology, 1989, 67, NORRBY E., BIBERFELD G., JOHNSON PR et al. The chemistry of site directed serology for HIV Infections. AIDS Res Human Retroviruses. 1989, 5, 487/ McKEATING J.A., WILLEY R.L. Structure and fonction of the HIV envelope. AIDS, 1989, 3, S35-S41 9. PASQUALI J.L., KIENY M.P., KOLBE H. et al. Immunogenicity and epitope mapping of a recombinant soluble gp 160 of the human immunodeficiency virus type 1 envelop glycoprotein. AIDS Res. Human Retroviruses, 1990, 6, NEURATH A.R., STRICK N., TAYLOR P. et al Search for eptiope specific antibody responses to human immunodeficiency virus (HIV-1) envelope glycoproteins signifying resistance to disease development. AIDS Res. Human Retroviruses, 1990, 6, NAIR B.C., FORD G., KALYANARAMAN V.S. et al. Enzyme immunoassay using native envelope glycoprotein (gp 160) for detection of human immunodeficiency virus type 1 antibodies. J. Clin. Microbio. 1994, 32, ZAAIJER H.L., EXEL-OEHLERS P.V., KRAAIJEVELDT T., et al. Early detection of antibodies to HIV-1 by third generation assays. The Lancet, 1992, 340, CONSTANTINE N.T., VAN DER GROEN G., BELSEY E.M. et al Sensitivity of HIV antibody assays determined by seroconversion panels AIDS, 1994, 8, ENGELBRECHT S., DE JAGER G.J., VAN RENSBURG E.J. Evaluation of commercially available assays for antibodies to HIV-1 in serum obtained from south african patients infected with HIV-1 subtypes B, C, and D. J. Med. Viroloogy 1994, 44, COUROUCE A.M. et al. Trousses de dépistage des anticorps anti VIH1 et VIH2. Spectra Biologie, 1994, 6, DONDERO T.J., HU D.J., GEORGE J.R. HIV-1 variants : yet another challenge to public health. The Lancet 1994, 343, SIMON F., LY T.D., BAILLOU-BEAUFILS A., et al Sensitivity of screening kits for anti HIV-1 subtypes O antibodies. AIDS, 1994, 8,

14 18. JANSSENS W., HEYNDRICKX L. FRANSEN et al. Genetic and phylogenetic analysis of ENV subtypes G and H in Central Africa AIDS Res. Hum. Retrovirus 1994, 10, GAOF., YUE L. ROBERTSON D.L. et al. Genetic diversity of human immunodeficiency virus type 2 : evidence for distinct sequence subtypes with differences in virus biology. J. Virol. 1994, 68,

15 15

16 16

17 17

18 18

19 19