T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TRAKYA BÖLGESİ NDE ÜRETİLEN İNEK SÜTLERİNDE AFLATOKSİN M1 VARLIĞI Aslı ÖZSUNAR YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Danışman Prof. Dr. Mehmet DEMİRCİ TEKİRDAĞ, 2005

2 T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ TRAKYA BÖLGESİ NDE ÜRETİLEN İNEK SÜTLERİNDE AFLATOKSİN M1 VARLIĞI Aslı ÖZSUNAR YÜKSEK LİSANS TEZİ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Bu tez 23/08/05 tarihinde Aşağıdaki Jüri Tarafından Kabul Edilmiştir. Prof. Dr.Mehmet DEMİRCİ Doç.Dr. Muhammet ARICI Yrd.Doç.Ahmet KUBAŞ

3 ÖZET YÜKSEK LİSANS TEZİ TRAKYA BÖLGESİ NDE ÜRETİLEN İNEK SÜTLERİNDE AFLATOKSİN M1 VARLIĞI T.C. TRAKYA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ GIDA MÜHENDİSLİĞİ ANABİLİM DALI Aflatoksinler esas olarak küflü gıdalarda görülmesine karşın doğrudan insan tüketimine sunulan gıdalarda da aflatoksin bulunabilmekte çeşitli işleme yöntemleri bunu tamamen ortadan kaldıramamakta ve hayvan yeminde bulunabilecek aflatoksinler çok az da olsa et, süt ve yumurta gibi gıdalara geçebilmektedir. Temel gıda maddesi olan süt, insan beslenmesi açısından büyük öneme sahiptir. İnekler vasıtasıyla aflatoksin B1 (AFB1) ile kontamine olan gıdaların sindiriminin direkt sonucu olarak, süt ürünleri ya da sütte aflatoksin M1 (AFM1) ortaya çıkmaktadır. Bebeklerin AFM1 e maruz kalması, sütün çocuklar için besleyici madde olmasından dolayı çok üzücüdür. Trakya Bölgesi ndeki sütün kontaminasyon derecesini ölçmek için yapılan çalışmada, örnekler Mart ve Haziran aylarında bir süt üretim çiftliğinden alınmıştır. 135 adet çiğ süt örneğinden 116 sında (%86) AFM1 bulunduğu tespit edilmiştir. AFM1 bakımından pozitif çıkan örneklerden sadece 1 tanesi (%0,74) yasal limitin üzerindedir. Pozitif örneklerde saptanan AFM1 miktarları 0,001-0,068 µg/l (ppb) arasında değişirken, genel ortalama 0,008 µg/l (ppb) olarak tespit edilmiştir. Mart ve Haziran aylarına ait ortalama AFM1 miktarları arasındaki fark p<0,01 düzeyinde önemli bulunmuştur. 2005, sayfa sayısı: 39 ANAHTAR KELİMELER: Aflatoksin M1, Süt, Trakya Bölgesi.

4 ABSTRACT MASTER THESIS OCCURENCE OF AFLATOXIN M1 IN RAW MILK FROM TRAKYA REGION DEPARTMANT of FOOD ENGINEERING INSTITUTE of NATURAL and APPLIED SCIENCES TRAKYA UNIVERSITY Aflatoxins appears in human diets as the direct result of the intake of them although are found in the food containing mould especially. Take into account that the some technological procedures do not affect aflatoxin concentration and finally aflatoxins may occure in various agricultural products even if the amount of aflatoxins are very low in the animals feedstuff ingredients. Milk is the basic food stuff that is very important for human diets. Aflatoxin M1 (AFM1) appears in milk ve milk products as the direct of the intake of aflatoxin B1 (AFB1) contaminated feed by dairy cows. The exposure of infants to AFM1 is something to worry about because milk is a main nutrient for children. Our aim is to carry out a study to determine the contamination degree of milk in our region. Samples are collected from the dairy farm in March ve June period. AFM1 occurence was found from 116 (%86) of 135 of the examined milk samples. Levels of AFM1 of just 1 positive milk sample (%0.74) were higher than 0.05 µg/l (ppb) level accepted by Turkish regulations as maximum tolerance limit. Concentrations of AFM1obtained from positive milk samples changed between µg/l (ppb) and the average was µg/l (ppb). The differences were statistically significant between the samples of March June period (p<0.01). 2005, page:39 KEYWORDS: Aflatoxin M1, Milk, Trakya Region.

5 TEŞEKKÜR Bu araştırmada benden hiçbir yardımını esirgemeyen ve yol gösteren Sayın Hocam Prof. Dr. Mehmet DEMİRCİ ye, araştırmayı tavsiye eden ve tezin yürütülmesine katkı sağlayan Sayın Hocam Doç. Dr. Muhammet ARICI ya, analizlerin yapılması aşamasında yardımını ve desteğini gördüğüm Sayın Hocam Yrd. Doç. Dr. Tuncay GÜMÜŞ e, laboratuar imkanlarını esirgemeyen Tarım Bakanlığı Tekirdağ İl Kontrol Laboratuarı çalışanlarına, araştırmamı maddi olarak destekleyen TÜBAP a ve her zaman manevi desteğini yanımda hissettiğim anneme ve sevgili eşime teşekkürü bir borç bilirim. Aslı ÖZSUNAR Tekirdağ, 2005

6 İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ABSTRACT TEŞEKKÜR İÇİNDEKİLER RESİMLER DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ SİMGELER DİZİNİ I II III IV VI VII VIII IX 1.GİRİŞ 1 2.LİTERATÜR ÖZETİ Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksin M 1 Oluşumu ve Kontaminasyon Kaynakları Çeşitli Teknolojik İşlemlerin Aflatoksin M 1 Üzerindeki Etkileri Süt ve Süt Ürünlerinde Bulunmasına İzin Verilen Maksimum AFM 1 Düzeyleri Sütün Kimyasal Bileşimi MATERYAL VE METOT Materyal Metot Aflatoksin M 1 Tayini Numunelerin Hazırlanması Çözeltilerin Hazırlanması Aflatoksin M 1 Testi Sütün Fizikokimyasal Özelliklerin Belirlenmesi Kuru Madde Oranlarının Belirlenmesi Yağ Oranlarının Belirlenmesi 16

7 Özgül Ağırlık Belirlenmesi % Asitlik (Laktik Asit Cinsinden) Değerlerinin Belirlenmesi Kül Oranlarının Belirlenmesi Protein Oranlarının Belirlenmesi Laktoz Oranlarının Belirlenmesi İstatistiksel Analizler BULGULAR VE TARTIŞMA Çiğ Sütlerde Aflatoksin M 1 Varlığı Örneklerin Kimyasal Özellikleri Kuru Madde Miktarı ( %) Yağ Oranı ( % ) Asitlik ( % ) Özgül Ağırlık ( % ) Protein ( % ) Laktoz ( % ) SONUÇ VE ÖNERİLER 31 KAYNAKLAR 32 EKLER 37 ÖZGEÇMİŞ 39

8 RESİMLER DİZİNİ Sayfa Şekil 1: Elisa Okuyucusu ve yıkayıcısı 15

9 ÇİZELGELER DİZİNİ Sayfa Çizelge 2.1. Çeşitli ülkelerde süt ve süt ürünlerinde bulunmasına izin verilen maksimum AFM 1 düzeyleri 11 Çizelge İncelenen çiğ süt örneklerine ait AFM 1 miktarları (µg/l ) 19 Çizelge Tesadüfi alınan çiğ süt örneklerine ait AFM 1 miktarları (µg/l ) 21 Çizelge Analiz periyotlarına göre ortalama AFM 1 konsantrasyonları varyans analiz sonuçları (ng/l ) 24 Çizelge Analiz periyotlarına göre ortalama AFM 1 konsantrasyonları arasındaki farkların tek yönlü varyans analiz sonuçları (ng/l ) 24 Çizelge AFM 1 bakımından aynı popülasyondaki tüm örneklerin korelasyonları 25 Çizelge 4.2. Örneklerin Kimyasal Özellikleri 26

10 ŞEKİLLER DİZİNİ Sayfa Ek 1 Şekil 1. Analize ait standart kurve örneği 36 Ek 1 Şekil 2. Analizlere ait standart kurve örnekleri 37

11 SİMGELER DİZİNİ Simgeler ppb : Milyarda kısım ( µg/l ) ppm : Milyonda kısım ( mg/l ) ppt : Trilyonda kısım ( ng/l ) µg : Mikro gram ng : Nano gram (10-9 g) µl : Mikro litre nm : Nano metre (10-9 m) Kısaltmalar AFB 1 : Aflatoksin B 1 AFB 2 : Aflatoksin B 2 AFM 1 : Aflatoksin M 1 IARC : Uluslararası Kanser Araştırma Kuruluşu

12 1. GİRİŞ Mikroorganizmalar içinde yer alan küfler, doğada yaygın olarak bulunurlar. Küflerden bazıları özellikle sıcaklık ve rutubetin uygun olduğu durumlarda tarım ürünleri veya bunların hammaddeleri ile, bunlardan hazırlanan gıda ve yemlerde gelişip çoğalmakta ve bir takım toksik metabolizma ürünleri meydana getirmektedirler. Gıdalarda gelişen küf mantarlarının meydana getirdiği bu toksik maddelere mikotoksin denir (Yaygın ve Demiryol 1980, Van Egmond 1989). Mikotoksin kelimesi Yunanca fungus anlamına gelen Mykis ve Latince zehir anlamına gelen Toxikon kelimelerinin birleşiminden oluşmuştur. Mikotoksinler küflerin ikincil (sekonder) metabolitleridir ve iz miktarda (mg/l ve µg/l seviyelerinde) meydana gelirler. Çok düşük miktarlarda bile insan sağlığını etkiler. Mikotoksinleri belirli küf cinsleri üretir ve her birinin ürettiği mikotoksin farklı yapıdadır. Küf mantarı gıda maddesinde gelişip toksin oluşturduktan sonra tamamen yok olsa da ürettiği toksin gıda maddesinin tüketilmesi sonucu toksik etkisini gösterir (Charles ve Hurburg, 1995). Mikotoksinler ile kontamine olmuş gıda ve yemleri tüketen insan ve hayvanlarda meydana gelen hastalığa da mikotoksikozis adı verilir (Davis ve Diener, 1978). Bilinen ilk mikotoksikozis organlarda çeşitli nekrozlara ve gangrene sebep olan ergotizm dir. Bu hastalık Claviceps purpurea ile kontamine olmuş tahıl tanelerinin tüketilmesi ile ortaya çıkmış ve Orta Çağ Avrupasında Kutsal Ateş olarak tanınmıştır (Duru ve Özgüneş, 1984). Öte yandan, İkinci Dünya Savaşı yıllarında küflü tahıl ürünlerinin tüketilmesi sonucu Rusya nın bazı bölgelerinde nüfusun yaklaşık %10 un dan fazlası bu tip mikotokzokozislerden etkilenmiş ve çok sayıda ölüm meydana gelmiştir. Bütün bunlar o yıllarda önemsiz hastalıklar olarak değerlendirilmiştir (Van Egmond, 1989). Nihayet 1960 lı yıllarda İngiltere de Hindi X Hastalığı nın ortaya çıkmasıyla, bu konudaki kanaatler değişmiştir. Ortaya çıkan bu hastalıktan binlerce hindi palazı ölmüş ve yapılan araştırmalarda hastalığın etkeninin hindilere verilen yemlerde protein kaynağı olarak kullanılan ve Brezilya dan ithal edilen yer fıstığı küspesindeki toksik bir faktörün olduğu anlaşılmıştır. Daha sonraları bu konuda yapılan çalışmalar bu bileşiğin Aspergillus flavus ve Aspergillus parasiticus tarafından meydana getirilen bir metabolit olduğu tespit edilmiş ve bundan sonra, toksine kendisine

13 oluşturan fungusun adından dolayı Aflatoksin adı verilmiştir (Stoloff 1980, Applebaum vd. 1982). İlk olarak, ultraviyole (UV) ışığı altında mavi renkli floresan veren iki bileşen aflatoksin B 1 (AFB 1 ) ve aflatoksin B 2 (AFB 2 ) olarak; sarı yeşil renkte floresan veren diğer iki bileşen ise G 1 ve G 2 olarak adlandırılmıştır. Daha sonra, aflatoksinli yemleri tüketen süt veren hayvanların sütlerinde bu toksinin bir türevinin oluştuğu ortaya çıkmış ve sütte bulunmasından dolayı da buna süt toksini (milk toxin) anlamında aflatoksin M adı verilmiştir. Aflatoksin M in saptanmasının ardından yapılan çalışmalar bu metabolitin aflatoksin B 1 ve B 2 nin 4 hidroksi türevleri olduğunu ortaya konmuş ve böylece aflatoksin M 1 (AFM 1 ) ve M 2 diye iki ayrı bileşik olarak izole edilmiştir (Wood 1991, Van Egmond 1994). AFB 1 in bir türevi olan AFM 1 in oluşumu, karaciğerde gerçekleşmekte ve süt veren memelilerin sütleri ile idrarda bulunmakta ve özellikle karaciğerde tahribatlara sebep olmaktadır tarihinde IARC (Uluslararası Kanser Araştırma Kuruluşu) tarafından AFB 1 birinci derecede, AFM 1 de ikinci derecede kanserojen maddeler grubuna alınmıştır (Anon. 1992, Dragacci vd. 1995). Ayrıca halkın sağlığını yakından ilgilendiren bu konu üzerinde bir çok ülkede uzun yılları kapsayan çeşitli kontrol ve izleme programları yürütülmekte ve elde edilen sonuçlara göre, ülke şartları da dikkate alınarak çeşitli gıda ve hayvan yemlerinde bulunmasına izin verilen aflatoksinler için maksimum tolerans limitleri belirlenmiş ve buna göre mevzuat hazırlanmıştır (Stahr vd. 1990, Stoloff vd. 1991, Chen ve Gao 1993, Tabata vd. 1993). Ülkemizde ise bu konu ile ilgili en son yasal düzenleme 2002 yılında yayınlanmış olup hala yürürlüktedir (Anon. 2002, FAO 2004). Ayrıca, IARC tarafından yayınlanan başka bir raporda, tükettikleri gıdalarda aflatoksin kontaminasyonunun yaygın olduğu Çin ve Filipinler gibi toplumlarda, karaciğer kanseri vak alarına daha sık rastlandığı bildirilmektedir (Anon. 1993, Okumura vd. 1993). Bütün bu bulgular göstermektedir ki gıda ve yemlerin aflatoksinlerle kontamine olması potansiyel bir halk sağlığı problemidir. Ayrıca bebek ve çocukların yetişkinlere göre daha fazla süt tüketmek zorunda oldukları ve bünyelerinin de yetişkinlere göre daha duyarlı olduğu dikkate alınacak olursa, süt ve süt ürünlerinde oluşabilen aflatoksin M 1 in sağlık açısından ne kadar önemli olduğu ortadadır. Ayrıca, ülke ekonomilerinde her yıl ciddi kayıplar da ortaya çıkmaktadır. Örneğin başlıca tahıl üretim bölgelerinden

14 biri olan Kuzey Carolina da 1980 yılında, aflatoksin kontaminasyonundan dolayı meydana gelen zararın 200 milyon dolar civarında olduğu bildirilmektedir (Hagler vd., 1983). Yapılan araştırmalara göre, sütte oluşan AFM 1 in mevsimsel bir değişim gösterdiği tespit edilmiştir. Bunun sebebi, süt veren hayvanların rasyonlarında kesif yemlerin yaz aylarında daha düşük düzeylerde olması veya hiç olmamasıdır (Wood, 1991). Hayvandan hayvana, laktasyon periyoduna ve süt miktarına bağlı olarak değişmekle birlikte AFB 1 in sütte M 1 e dönüşümünün %0,8-2,2 oranında olduğu belirtilmektedir (Smith 1997, Patterson vd. 1980). Kontamine olmuş sütler, çeşitli ürünlere işlendiğinde, AFM 1 in değişik oranlarda, üretilen ürünlere geçtiği bilinmektedir. Çiğ sütte stabil bir halde bulunan AFM 1 peynirde kazeine olan ilgisinden dolayı, süttekine göre 3-4 kat daha yükselmektedir (Yaygın ve Demiryol, 1980). Toksinle kontamine olmuş sütlerin işlenmeleri esnasında ısıl işlem, fermentasyon ve kurutma gibi normal muamelelerin toksini destabilize etmediğinin ortaya çıkmasıyla, AFM 1 in süt ve süt ürünlerinde uzaklaştırılması için özel yöntemler kullanılmaya çalışılmıştır (Yousef ve Marth, 1989). Bu işlemler toksinin fiziksel yollarla uzaklaştırılmasını veya birtakım kimyasal yöntemlerle parçalanmasını kapsamaktadır. Bu konuda daha fazla araştırmaya gerek duyulmaktadır. Aflatoksinler esas olarak küflü gıdalarda görülmesine karşın doğrudan insan tüketimine sunulan gıdalarda da aflatoksin oluşturabileceği çeşitli işleme yöntemlerinin bunu tamamen ortadan kaldıramadığı ve hayvan yeminde bulunabilecek aflatoksinlerin çok az oranda da olsa et, süt ve yumurta gibi gıdalara geçebileceği araştırmacılar tarafından bildirilmektedir (Bullerman 1974, Çoksöyler 1984). Devlet İstatistik Enstitüsü kayıtlarına göre 1999 yılı itibariyle Türkiye de toplam süt üretimi tondur (Anon., 1999). Trakya Bölgesinde üretilen süt miktarı Türkiye nin toplam süt üretiminin önemli bir kısmını teşkil etmektedir. Temel gıda maddesi olan süt, insan beslenmesi açısından büyük öneme sahiptir. Özellikle bebek ve çocukların beslenmesinde gıda maddesi olan sütün aflatoksin içeriğinin tespiti önem arz etmektedir. Türkiye de değişik yörelerde yapılmış benzer çalışmalar bulunmasına rağmen Trakya Bölgesi nde yapılmış çalışma bulunmamaktadır. Bu çalışmada Trakya Bölgesi nde üretilen sütlerin AFM 1 bakımından genel bir durumun belirlenmesi ve

15 bulunan aflatoksin miktarlarının ülkemizde yürürlükte olan mevzuatta belirlenen miktar ile karşılaştırılması amaçlanmıştır. Yapılan bu çalışmada sütün genel bileşimi de incelenerek önemli bir tüketim maddesi ve bir çok ürün için hammadde görevi yapan sütün bileşimi hakkında genel bir fikir elde edilmiştir.

16 2. LİTERATÜR ÖZETİ 2.1. Süt ve Süt Ürünlerinde Aflatoksin M 1 Oluşumu ve Kontaminasyon Kaynakları Aflatoksinler, depolanmış hemen her çeşit yem maddeleri ile besinlerde ve doğada yaygın bir şekilde bulunan mikotoksijenik Aspergillus flavus ile çeşitli Aspergillus, Penicillum ve Rhizopus suşları tarafından sentezlenen toksik metabolitlerdir. Her zaman toksik etkilere sahip olmamakla beraber uygun koşullarda (%15 in üzerinde nem, o C sıcaklık ve yeterli oksijen) depolanan besin ve yemlerde hızla gelişip toksin sentezi yapabilirler (Kaya vd., 1985). Yem kontaminantları olarak aflatoksinlerin keşfinden kısa bir süre sonra Allcroft ve Carnaghan (1963), yemlerle birlikte aflatoksin tüketen hayvanlardan elde edilen süt ve süt ürünlerinde, aflatoksin kalıntıları oluşabileceğini rapor etmişlerdir. Van der Lind vd. (1964), araştırmalarında iki adet yüksek verimli (28L/gün ) süt ineği ile iki adet düşük verimli (12L/gün) süt ineğinden her birine günde 4mg/kg düzeyinde AFB1 içeren yer fıstığı rasyonundan 2kg, 18 gün süreyle yedirmişler ve daha sonra bu hayvanlardan elde edilen sütleri günlük olarak AFM 1 yönünden kimyasal testlere (ince tabaka kromotografisi yöntemiyle) ve biyolojik deneylere (bir günlük ördek palazları) tabi tutmuşlardır. Bu araştırmada, AFB 1 in tüketiminden sonra ilk 12 ile 24 saat içerisinde sütlerde rahatlıkla toksin belirlenmiş ve içeriğinin belli bir süre sonra en yüksek değerine ulaştığı ve sütteki AFM 1 in ancak yemlerdeki AFB 1 in %1 i kadar olduğu üç gün sonra ise artık sütteki AFM 1 in tayin edilemez düzeye indiği saptanmıştır. Rodricks ve Stoloff (1977) yaptıkları bir araştırmada, yemlerdeki AFB 1 konsantrasyonunun sütteki AFM 1 den kat daha yüksek olduğunu bulmuşlardır. Sütle birlikte salgılanan AFM 1 ile yemdeki AFB 1 konsantrasyonları arasındaki ilişkinin süt hayvanına, sağım zamanına ve hatta sağım aralığına göre değiştiği bir çok araştırmacı tarafından bildirilmiştir (Kiermeier vd. 1975, Mertens 1979, Van Egmond 1989, Wood 1991). Blanc ve Karleskind (1981), Fransa da 1046 süt ve süt ürünleri örneği üzerinde yaptıkları araştırmada, örneklerin %40 nın 0,05 µg/l den daha yüksek AFM 1 içerdiğini belirtmişlerdir. Wood (1989) ABD de toplam 182 süt ve süt ürünleri örneklerinde

17 AFM 1 e rastlamadığını beyan etmiştir. Stahr vd. (1990) Iowa State Üniversitesi tesisleri çevresinde analiz edilen örneklerin %30 nun 20 µg/l düzeyinin üzerinde AFM 1 içerdiğini ortaya koymuşlardır. Yemle birlikte alınan AFB 1 ile sütte salgılanan AFM 1 arasında yüksek düzeyde pozitif ve doğrusal bir ilişkinin olduğu, bir çok araştırıcı tarafında tespit edilmiştir (Masri vd. 1969, Kiermier vd. 1975, Sieber ve Blanc 1978, Van Egmond 1994). Aflatoksin M 1 üzerinde yapılan bir çok araştırmaya göre sütte bulunan AFM 1 konsantrasyonunun yaz aylarında daha düşük düzeylerde olduğu, bunun sebebinin ise süt hayvanlarının yaz aylarında daha az bulaşık konsantre yem tüketmesinden kaynaklandığı belirtilmiştir (Applebaum vd. 1982, Van Egmond 1989, Wood 1991). Heeschen vd. (1983a), Almanya da yaptıkları bir araştırmada, toplam 418 süt örneğini AFM 1 yönünden analize tabi tutmuşlar ve yemlerin ithal olduğu saptanmış ve örneklerdeki AFM 1 miktarının 0,0033-0,333 µg/l arasında değiştiğini, ortalama değerin ise 0,0381 µg/l düzeyinde olduğunu bulmuşlardır. AFM 1 konsantrasyonunun 0,05 µg/l nin altında olması için yemlerdeki AFB 1 in 2-3 mg/l in altında olması gerektiğini bildirmektedirler. Kontamine olmuş sütler, çeşitli ürünlere işlendiğinde, AFM 1 in değişik oranlarda üretilen ürünlere geçtiği bilinmektedir. Çiğ sütte stabil bir halde bulunan AFM 1 ; pastörize süt, peynir, yoğurt, krema ve tereyağı gibi ürünlerde de, değişik oranlarda kalmaktadır (Yaygın ve Demiryol, 1980). Quintavalla ve Casalari (1985), İtalya da yaptıkları bir araştırmada 70 adet süt ve süt ürününden 30 nun 0,18-0,75 µg/l arasında AFM 1 içerdiğini tespit etmişlerdir. Wiseman vd. (1983), AFM 1 ile kontamine olmuş sütlerden yoğurt ve kefir yapmışlar ve ürünlerde AFM 1 miktarı ile ilk ürün olan sütteki AFM 1 miktarının birbirine eşit olduğunu tespit etmişlerdir. Tutelyan vd. nin (1989) Rusya da iki yıl boyunca yürüttükleri bir araştırmada, çeşitli yiyecek ve içeceklerin yanı sıra 250 adet süt ve süt ürünlerini AFM 1 yönünden analiz etmişlerdir. Süt örneklerinin hiçbirinin 0,05 µg/l limitini aşmadığı gözlenmiştir. İncelenen 115 süt örneğinden 8 inde (%6,9) 0,05 in altında, 149 peynir örneğinden ise sadece 15 inde (%10,1) AFM 1 bulunmuştur. Heeschen vd. nin (1990) Almanya da yıllarında yaklaşık iki yıl süreyle yürüttükleri çalışmada, Almanya piyasasında satışa sunulan pastörize sütlerden

18 üç aylık periyoda yaklaşık 60 örnek düşecek şekilde aldıkları toplam 473 örnekten sadece 19 nun 0,05 µg/l limitini aştığını bildirmişlerdir. Fransa da 1976 yılında oluşturulan bir İzleme Programı çerçevesinde süt ve süt ürünleri AFM 1 yönünden sürekli kontrole tabi tutulmuş ve daha sonra 1978 yılında 6246 süt örneği analiz edilerek AFM 1 içeriklerine göre üç sınıfa ayrılmıştır. 0,05 µg/l den az AFM 1 içerenler birinci sınıf, 0,05-0,5 µg/l arasında olanlar ikinci sınıf ve 0,5 µg/l den fazla olanlar ise üçüncü sınıfa dahil edilmişlerdir. Bu sınıflandırma esas alınarak sonraki yıllarda bir çok çalışma yapılmıştır (Dragacci ve Fremy, 1993). Hassanin (1994), AFM 1 ile kontamine olan sütlerden yoğurt yapmış ve 4 o C de depolamada AFM 1 de azalmalar görüldüğü ve bu durumun AFM 1 in kazein fraksiyonları ile birleşmeden kaynaklanabileceğini belirtmiştir. Arjantin de 1999 yılında Mart-Eylül ayları arasında bir çiftlikten alınan toplam 77 süt örneğinde Elisa yöntemiyle AFM 1 analizi yapılmış ve sonuçta sadece 18 örnekte AFM 1 tespit edilmiştir (Lopez vd., 2003). Hindistan da da Elisa yöntemi kullanılarak yapılan bir çalışmada analiz edilen markalı 87 süt ve süt mamülleri numunelerinin %87,3 ünde AFM 1 ile kontaminasyon olduğu bulunmuştur (Rastogi vd., 2003). Ülkemizde, sütlerde AFM 1 düzeylerini araştıran fazla çalışma bulunmamaktadır. Demirer (1973) 150 adet, Çoksöyler ve Köşker (1980) 101 adet çiğ süt örneğinin hiçbirinde tespit edilebilir düzeyde AFM 1 e rastlamadıklarını bildirmişlerdir. 1973, 1974 ve 1977 yıllarında yapılan üç ayrı araştırmada 251 süt örneği, 50 beyaz peynir, 26 tulum peyniri, 12 kaşar peyniri, 14 eritme peyniri, 4 adet küflü tulum peyniri, 9 adet çökelek ve 24 adet süt tozundan oluşan 390 örnek analiz edilmiş ve hiçbirinde tayin edilebilir düzeyde AFM 1 bulunamamıştır (Yaygın ve Demiryol, 1980). Bakırcı (2001), Van da üretilen süt ve süt ürünlerinde AFM 1 düzeylerini incelemiş, sütlerin %87,8 nin AFM 1 içerdiğini ve bunların %44,3 nün de 0,05 µg/l nin üzerinde olduğunu tespit etmiştir. Türkiye nin çeşitli illerinden alınan çiğ sütlerin analiz edildiği başka bir çalışmada da 360 örneğin 159 unda (%44,3), en yükseği 1,4 µg/l olmak üzere AFM 1 bulunmuş ve bunların 48 adedinin (%13,3) Türkiye limitini aştığı bildirilmiştir (Özkaya vd., 2002).

19 2.2. Çeşitli Teknolojik İşlemlerin Aflatoksin M 1 Üzerindeki Etkileri Toksinlerle kontamine olmuş sütlerin ısıl işlem ve fermentasyon sırasında toksinin uzaklaştırılması pek mümkün olmamaktadır. Van Egmond (1989) pastörizasyon işleminin bu toksini azaltmadığını bildirmiştir. Stoloff vd. (1975) sütlerin 63 o C de 30 dakika süreyle pastörize edilmesi ile AFM 1 oranında azalma olmadığını belirtmişlerdir. Aflatoksinler yüksek molekül ağırlıklı bileşikler olup UV ışık altında güçlü floresan verirler. Saf halde renksiz kristal formdadırlar. Kaynama noktaları yüksek olduğu için ancak 200 o C nin üzerindeki sıcaklıklarda parçalanabilmektedirler (Whyllie ve Morehouse 1977, Applebaum vd. 1982). Isıl işlem ve kurutmanın AFM 1 in stabilitesi üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla yapılan ilk çalışma Allcroft ve Carnaghan (1963) tarafından gerçekleştirilmiş tir. AFM 1 ile kontamine olmuş sütler iki gruba ayrılarak pastörize süte ve süt tozuna işlenmiş ve bu ürünler ağız yoluyla ördek palazlarına verilmiştir. Araştırıcılar, bu işlemlerin mevcut toksini azaltmada herhangi bir etkiye sahip olmadığını belirtmişlerdir. Ancak bu konudaki sonraki çalışmalar, bu bulguların güvenilirliği üzerindeki kuşkuları artırmıştır (Van Egmond, 1989). Yapılan diğer bir araştırmada, AFB 1 ile kontamine olmuş yemleri tüketen ineklerden elde edilen sütler, pastörizasyona, sterilizasyona ve evaporasyona tabi tutulmuşlar ve yapılan analizler sonucunda, sütlerdeki AFM 1 konsantrasyonu % arasında azaldığını; daha yüksek düzeylerde uygulanan ısıl işlemlerin ise, AFM 1 miktarı üzerinde pek fazla etkili olmadığı saptanmıştır (Purchase vd., 1972). Benzer bir çalışmada ise, AFM 1 içeren sütler 63 o C de 30 dakika süreyle pastörize edilmiş ve AFM 1 miktarında herhangi bir azalma olmadığı rapor edilmiştir (Stoloff vd., 1975). Bu konuda yapılan başka bir araştırmada ise AFM 1 içeren sütler 64 o C de 30 dakika süreyle pastörize edilmiş ve ısıl işlemin AFM 1 üzerindeki etkisinin farklı olduğu ortaya çıkmıştır. Bazı örneklerde AFM 1 içeriğinde bir azalma görülürken bazılarındaki azalma minumum düzeylerde kalmıştır (Wiseman vd., 1983). Buna karşılık, doğal ve yapay olarak kontamine olmuş sütlerde pastörizasyon işleminin AFM 1 in stabilitesi üzerindeki etkisini belirlemek amacıyla yapılan bir araştırmada ise, süt örnekleri 71 o C de 40 saniye tutulmuş ve yapay olarak kontamine edilmiş örneklerdeki kaybın %17,9-39,9 arasında değiştiği, buna karşılık doğal olarak

20 kontamine olan sütlerdeki kaybın ise %6-13 arasında gerçekleştiği belirlenmiştir (Kiermier ve Mashaley, 1977). Görüldüğü gibi, araştırıcılar tarafından rapor edilen, AFM 1 üzerindeki ısıl işlemin etkisi ve azalma oranları birbirinden farklıdır. Elde edilen bu sonuçlar üzerindeki aşağıdaki faktörlerin etkili olduğu tahmin edilmektedir: a) Sütteki AFM 1 stabil değildir ve konsantrasyonu zamanla kendiliğinden azalmaktadır (Rustom, 1997). Örneğin yapılan bir araştırmada doğal yolla AFM 1 ile kontamine olmuş sütler 0 o C de 4 gün süreyle depolandığında %40 civarında bir azalma gözlenirken, 6 gün sonra bu oranın %80 e çıktığı saptanmıştır (Mckinney vd., 1973). Başka bir çalışmada ise, 5 o C de 1-3 gün arasında depolanan sütlerdeki AFM 1 içeriğinin %18-24,2 arasında azaldığı bildirilmiştir (Kiermeier ve Mashaley, 1977). b) İlk kontaminasyon düzeyi ile toksin ekstraksiyonu, saflaştırılması (clean up) ve elde edilmesiyle ilgili yöntemlerdeki farklılıklar da sonucu etkilemektedir. Çünkü kullanılan yöntemler eşit düzeyde doğruluk, kesinlik ve duyarlılığa sahip değildir (Mehan ve Bedi, 1985) c) Kontaminasyon tipi de etkili olmaktadır. Yapay yolla kontamine olmuş toksinin, doğal olarak kontamine olana göre daha kolay inaktif hale getirildiği araştırmalar sonucu belirlenmiştir (Rustom, 1997). Bu konuda yapılan bir çok araştırmada, sütteki AFM 1 in parçalanması veya inaktif hale getirilmesi hususunda çeşitli yöntemler denenmiştir. Genel olarak bu işlemler; sülfit ve /veya bisülfitlerle kimyasal muamele (Doyle ve Marth 1978a, Doyle ve Marth 1978b, Hagler vd. 1982, Hagler vd. 1983), hidrojen peroksit ile inaktif hale getirme (Applebaum ve Marth, 1982) ve ultraviole ile ışınlamak süretiyle parçalama (Yousef ve Marth 1985, Yousef ve Marth 1986) gibi işlemlerden oluşmaktadır. Bu işlemler sonucu AFM1 miktarında %3,6-100 arasında azalma olduğu, ancak uygulanan metodların süt endüstrisinde kullanılması için daha fazla araştırmaya ihtiyaç bulunduğu bildirilmektedir (Yousef ve Marth 1989, Van Egmond 1994). Bakterileri ve asit üreten küfleri de içine alan bir çok mikroorganizma aflatoksinleri metabolize etmekte ve inaktif hale getirebilmektedir. Ancak mikrobiyal ve biyolojik yolla gerçekleştirilen detoksifikasyon henüz yaygın ve pratik hale gelmiş durumda değildir. Literatürde bu konuda farklı bilgiler bulunmaktadır. Bazı araştırmalarda bu amaç için kullanılan Flavobacterium aurantiacum un herhangi bir

21 toksik yan ürün üretmeksizin sıvı besiyerinden ve gıdalardan aflatoksini uzaklaştırabildiği, ancak detoksifikasyon mekanizmasının nasıl gerçekleştiğinin tam olarak bilinmediği ileri sürülürken (El Nezami vd., 1998), bazı araştırıcılar, aflatoksinlerin inaktivasyonunda en aktif mikroorganizma olarak kabul edilen Flavobacterium aurantiacum mevcut ortamda ürettiği asit sonucu AFB 1, kendisinden 1000 kat daha az mutajenik olan AFB 2a ya dönüşerek inaktif hale geldiğini belirtmektedirler (Rustom, 1997). Bazı araştırıcılar ise, aflatoksinin ortamdan uzaklaştırılma mekanizmasının, toksinin bakteri hücre duvarına veya hücre duvarındaki kompenentlere fiziksel olarak bağlanması şeklinde gerçekleştiğini bildirmektedirler (Peltonen vd. 2001, El Nezami vd. 1998).

22 2.3. Süt ve Süt Ürünlerinde Bulunmasına İzin Verilen Maksimum AFM 1 Düzeyleri Birçok ülkede; yemlerde (AFB 1 ), süt ve süt ürünlerinde bulunmasına izin verilen maksimum AFM 1 tolerans değerleri ve bunlarla ilgili yasal hükümler çizelge 2.1 de verilmiştir. Bu tolerans değerleri belirlenirken, aflatoksinlerin çeşitli özellikleri ve ülke koşulları dikkate alınmış ve bu konuda bir çok araştırma yapılmıştır (Stoloff vd. 1991, Hansen 1993, Van Egmond 1994, Dragacci vd. 1995). Çizelge 2.1. Çeşitli ülkelerde süt ve süt ürünlerinde bulunmasına izin verilen maksimum AFM 1 düzeyleri (Van Egmond 1989, Anon. 2002) Ülkeler Ürün Maksimum Limit (µg/kg-l) Belçika Süt, süt tozu, kondanse süt 0,1 Romanya Süt ve mamülleri 0 Avusturya Çocuk ve bebekler için pastörize sütler Diğer sütler ve süt ürünleri Tereyağı Peynir 0,01 0,05 0,02 0,25 Çekoslavakya Süt 0,05 ABD Süt ve ürünleri 0,5 Brezilya Süt ve ürünleri 0,5 İsviçre Süt, süt tozu, kondanse süt Bebekler için süt 0,05 0,01 İsveç Sıvı süt ürünleri 0,05 Hollanda Süt ve diğer sıvı süt ürünleri Peynir Tereyağ 0,05 0,2 0,02 Almanya Süt Bebek sütleri 0,05 0,01 Rusya Süt ve süt ürünleri Çocuk gıdaları 0,05 0 Türkiye Süt ve süt ürünleri 0,05

23 2.4. Sütün Kimyasal Bileşimi Sütün bileşimi laktasyon, hayvan ırkı, hayvanın sağlık durumu, sağım zamanı ve şekli, yem ve hayvanın psikolojik durumuna göre değişiklik göstermektedir (Metin, 2001). Sezgin ve Bektaş (1988), Trabzon da satılan sokak sütleri üzerinde yaptıkları bir çalışmada 87 süt örneğini incelemişlerdir. İncelenen örneklere ait ortalama değerler; % 3,34 yağ, %11,11 kuru madde, %7,77 yağsız kuru madde ve 1,027 özgül ağırlık olarak belirtmişlerdir. Sezgin ve Koçak (1982), Ankara ilinde satılan sütlerin özellikleri üzerine yapılan çalışmada ortalama yağı %3,00, ortalama kuru maddeyi %10,92, ortalama yağsız kuru maddeyi %7,35, ortalama proteini %3,27, ortalama külü %0,66 ve ortalama özgül ağırlığı 1,028 olarak tespit etmişlerdir.

24 3.MATERYAL VE METOT 3.1.Materyal Trakya Bölgesi nde süt üretimi yapan bir çiftlikten 45 adet inekten Mart ve Haziran aylarında ayrı ayrı olmak üzere çiğ süt örnekleri alınmış ve laboratuara soğuk zincir şartlarında getirilerek AFM 1, fizikokimyasal analizleri yapılmıştır. Haziran ayında tesadüfi örnekleme yöntemine göre toplam 45 adet çiğ süt örneği daha alınmış ve soğuk zincir şartlarında laboratuara getirilerek AFM 1, fizikokimyasal analizleri yapılmıştır Metot Aflatoksin M 1 Tayini Numunelerin Hazırlanması Süt örnekleri 10 dak / 3500 rpm / 10 o C de santrifüj edilmiştir. Santrifüjlemeden sonra, en üst kaymak tabakası Pasteur pipet vasıtasıyla çekilerek uzaklaştırılmıştır. Yağsız süt testte direkt olarak kullanılmıştır (Anon., 1999) Çözeltilerin Hazırlanması Aflatoksin M 1 enzim konjugat: Enzim konjugatı limitli stabiliteye sahip olduğundan, yalnızca bir miktarı gerekli olduğundan 1:11 oranında buffer 2 içinde seyreltilmiştir. Yıkama tamponu: 1 litre distile suda, içinde buffer tuzu bulunan kit çözündürülmüştür (Anon., 1999).

25 Aflatoksin M 1 Testi Standartlar önce 0 ppt (negatif kontrol), 5 ppt, 10 ppt, 20 ppt, 40 ppt, 80 ppt olarak içerisine AFM 1 antibody bulunan mikrotiter plate deki kuyucuklara aktarılmıştır ve daha sonra ekstraktlardan 100 µl sonraki viallere konulmuştur. Oda sıcaklığında karanlık ortamda 60 dakika inkübe edilmiştir. Kuyucuklardaki su dışarı boşaltılmıştır. Üzerine 250µl distile su ile doldurulup, tekrar boşaltılarak yıkayıcıda (ELx 50 Serisi Yıkama Ünitesi) yıkanmıştır. Üzerine 100 µl enzim konjugat ilave edilerek oda sıcaklığında 60 dakika inkübe edilmiştir. Yıkama işlemi 3 defa tekrarlanmış ve üzerine her bir kuyucuğa olmak üzere 50 ml substrat ve 50 ml kromojen ilave edilmiştir. İyice karıştırılacak ve 30 dakika oda sıcaklığında ve karanlıkta inkübe edilmiştir. Her bir kuyucuğa 100 µl stop solüsyonu konup, iyice karıştırılıp ve 450 nm de havaya karşı ayarlanıp ELx800 Serisi Microplate Reader da 60 dakika içinde absorbans değerleri okunmuştur. Sonuçlar bilgisayar ortamında özel program ile otomatik olarak hesaplanmıştır (Anon., 1999).

26 Şekil 1: Elisa Okuyucusu ve Yıkayıcısının Genel Görünümü Şekil 1.1. Yıkama ünitesi Şekil 1.2.Okuma ünitesi

27 Sütün Fizikokimyasal Özelliklerinin Belirlenmesi Kuru Madde Oranlarının Belirlenmesi Isıya dayanıklı kaplar 105 o C lik etüvde 1-2 saat bırakıldıktan sonra yarım saat desikatörde soğutulmuştur. Darası tespit edilmiştir. İyice karıştırılmış süt örneklerinden kaplara 2,3-3 g tartılmıştır. 105 o C ye ayarlı etüvde 3-4 saat kadar bekletilmiştir. Desikatörde bekletildikten sonra son tartımlar alınıp örneklerdeki % kuru madde miktarı hesaplanmıştır (Kurt, 1984). Kuru madde = Süt kuru maddesinin ağırlığı (g) / Süt numunesinin ağırlığı (g) Yağ Oranlarının Belirlenmesi Yağ tayini Gerber metoduna göre yapılmıştır. Süt örnekleri oda sıcaklığına getirilmiştir. Süt bütirometrelerine 1,820 özgül ağırlığında 10 ml sülfirik asit, 11 ml süt ve 1 ml amil alkol konulmuştur. Daha sonra tıpası kapatılan bütirometreler ters düz yapılarak sütün yavaş bir şekilde asitle karışması ve proteinlerin parçalanması sağlanmıştır. Bu işlem sonunda bütirometreler Gerber santrifüjünde 5 dak. santrifüje edilip, sütteki % yağ bütirometrenin dereceli kısmından miktarı okunmuştur (Demirci ve Gündüz, 2004) Özgül Ağırlık Belirlenmesi Örneklerin özgül ağırlıkları laktodansimetre kullanılarak belirlenmiştir. Sütün sıcaklığı o C arasında iken okuma yapılmıştır. Aradaki fark 0,2 düzeltme faktörü ile çarpılmıştır. Örnek sıcaklığı 15 o C den fazla olduğunda okunan laktodansimetre derecesine eklenmiştir (Kurt, 1984).

28 % Asitlik (Laktik asit cinsinden) Değerlerinin Belirlenmesi Erlenlere 10 ar ml süt konmuştur. Üzerlerine %1 lik fenolftalein indikatöründen 1 ml konmuştur. 0,1 N NaOH çözeltisi ile değişmez hafif pembe renk meydana gelinceye kadar titre edilmiştir. Harcanan miktar aşağıdaki formül ile hesaplanmıştır (Demirci ve Gündüz, 2004). % Asitlik = Harcanan miktar (ml) X NaOH in normalitesi X 0,009 X 100 Örnek Miktarı (ml) Kül Oranlarının Belirlenmesi Belirli miktar süt kuvars kapsüllerde suyu uçurulduktan sonra kül fırınında 550 o C de yakılıp desikatörde soğutulmuştur ve geri kalan kül miktarından % kül oranı hesaplanmıştır (Kurt, 1984) Protein Oranlarının Belirlenmesi Süt öneklerinin % protein oranları formal titrasyon yöntemiyle elde edilen formal sayısının 0,347 faktörü ile çarpılması sonucu belirlenmiştir (Demirci ve Gündüz, 2004) Laktoz Oranlarının Belirlenmesi 2004). Formülasyon yöntemi kullanılarak sonuç bulunmuştur (Demirci ve Gündüz, % Laktoz = % YKM ( % protein + % kül )

29 İstatistiksel Analizler Analiz sonuçları istatistiksel olarak değerlendirilmiş, örnekler arasındaki farkı belirlemek amacıyla varyans analizi yapılmıştır. Faktörler arasındaki etkileşimi belirlemek için ayrıca korelasyon analizleri de yapılmıştır (Soysal, 1992).

30 4. BULGULAR VE TARTIŞMA 4.1. Çiğ Sütte Aflatoksin M 1 Varlığı Mart ve Haziran aylarında bir süt üretim çiftliğinden alınan çiğ süt örneklerine ait AFM 1 düzeyleri Çizelge de, Haziran ayında bir köyden tesadüfi örnekleme yöntemi ile seçilen çiğ süt örneklerine ait AFM 1 düzeyleri Çizelge 4.2 de verilmiştir. Çizelge İncelenen çiğ süt örneklerine ait AFM1 miktarları (µg/l) Örnek Alma Zamanı Aylar arasında Örnek no Mart Haziran % azalma 1 0,016 0, ,020 0,002 89,3 3 0,025 - a ,015 0,004 76,1 5 0,014 - a ,025 0,004 85,1 7 0,013 - a ,038 0,003 91,5 9 0,036 0,005 85,1 10 0,047 0,005 89,9 11 0,068 0,003 96,2 12 0,016 0,002 87,8 13 0,016 0, ,030 0,002 94,3 15 0,029 0,002 92,2 16 0,019 0,002 88,7 17 0,008 0,004 49,1 18 0,032 0,006 82,8 19 0,020 0,003 84,7 20 0,016 0,002 85,2

31 21 0,019 0,001 93,6 22 0,019 0, ,032 0,001 95,7 24 0,013 0,003 75,1 25 0,030 0,005 84,6 26 0,042 0,004 90,7 27 0,035 0,005 86,5 28 0,031 0,003 91,5 29 0,020 0,003 85,1 30 0,025 0,003 87,2 31 0,031 0,001 96,1 32 0,046 0,004 92,5 33 0,027 0,002 92,2 34 0,041 0,003 92,8 35 0,022 0,002 91,4 36 0,023 0,003 87,2 37 0,010 0,002 79,8 38 0,017 0,002 86,4 39 0,014 0,003 80,1 40 0,025 0,003 88,1 41 0,029 - a ,030 0, ,028 0,004 86,7 44 0,018 0,006 69,6 45 0,029 0,003 88,9 En düşük 0,008 0,001 69,6 En yüksek 0,068 0, Ortalama 0,026 0,003 87,8 Genel 0,014 ortalama - a :Tespit edilemedi.

32 Çizelge Tesadüfi alınan çiğ süt örneklerine ait AFM 1 miktarları (µg/l) Örnek Alma Zamanı Örnek no Haziran 1 0, , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , , a 24 0, a 26 - a 27 - a 28 - a

33 29 - a 30 - a 31 - a 32 - a 33 - a 34 - a 35 0, a 37 - a 38 0, a 40 0, a 42 0, , , ,004 En düşük 0,001 En yüksek 0,006 Ortalama 0,002 Çizelge den de görüldüğü gibi bir çiftlikten Mart ve Haziran aylarında 45 adet süt ineğinden alınan ve analiz edilen çiğ süt örneklerinin AFM 1 düzeyleri; genel değerler dikkate alındığında 0,001-0,068 µg/l arasında değişmiş ve genel ortalama 0,014 µg/l olarak tespit edilmiştir. Elde edilen ortalama değer Quintavalla ve Casalari (1985) tarafından bulunan değerden düşük, Gilbert ve diğerlerinin (1984) tespit ettikleri değerden ise yüksek çıkmıştır. Çizelge de çiğ süt örneklerinin AFM 1 düzeyleri 0,001-0,006 µg/l arasında değişmiş ve genel ortalama 0,002 µg/l olarak tespit edilmiştir. Elde edilen ortalama değer Heeschen vd. (1983a) tarafından bulunan değerden düşüktür.

34 Diğer taraftan, sonuçlar analiz periyotlarına göre değerlendirildiğinde; Mart ayında en düşük AFM 1 miktarı 0,008 µg/l, en yüksek 0,068 µg/l ve ortalama 0,026 µg/l olarak bulunmuştur. Haziran ayında en yüksek 0,006 µg/l, en düşük 0,001 ve ortalama 0,002 µg/l dir. Bu değerler Bakırcı (1995) tarafından çiğ süt örneklerinde saptanan değerlerden düşüktür. Analiz periyotlarına göre AFM 1 konsantrasyonlarındaki değişim incelendiğinde, Mart ayındaki yüksek oranlar Haziran ayında hızlı bir şekilde düşmüştür.azalma % olarak değerlendirildiğinde; en düşük %69,6, en yüksek %100 ve ortalama %87,8 bulunmuştur.bu durum yapılan diğer araştırmalarda da ortaya konulmuştur (Van Egmond 1989, Heeschen vd.1990, Wood 1991, Macho vd.1992, Bakırcı 1995). Mart ayında alınan örneklerde AFM 1 miktarının yüksek çıkması, bu dönemde süt hayvanlarının tükettiği depolanmış yemlerde oluşan AFB 1 in artışından kaynaklanabilir. Çünkü sütlerde oluşan AFM 1 miktarları ile yemlerdeki AFB 1 arasında doğrusal bir ilişki bulunmaktadır (Van Egmond, 1994). A. flavus ve A.parasiticus gibi küf mantarları %13-18 arasında rutubet içeren besinler ile çevre nispi neminin %50-60 ın üzerinde olduğu durumlarda gelişip çoğalmaktadırlar. Toksin oluşturmaları için en uygun sıcaklık 24 o C, en uygun nispi nem %85-90 arasındadır (Yaygın ve Demiryol 1980, Jay 1982). Haziran ayındaki düşüş de, hayvanların merada otlatılmasıyla açıklanabilir. Çünkü mera yemleri AFB 1 içermediğinden veya çok az içerdiğinden, hayvanın aldığı AFB 1 miktarı düşmekte, böylece sütle salgılanan AFM 1 oranı da azalmaktadır (Sieber ve Blanc, 1978). Alınan yemdeki AFB 1 miktarı aynı olmasına rağmen, her hayvana ait süt örneğindeki AFM 1 miktarları farklı olabilmektedir. Dolayısıyla sütte AFM 1 değerleri üzerine bir diğer faktör de etkili olabilmektedir. Bu da hayvanların bireysel metabolizmalarının farklı oluşundan kaynaklanmaktadır. Örnekler arasındaki farklılıkların önemli olup olmadıklarını belirlemek için yapılan varyans analizi sonuçları Çizelge de verilmiştir.

35 Çizelge Analiz periyotlarına göre ortalama AFM 1 konsantrasyonları varyans analiz sonuçları Kareler Serbestlik Kareler F Toplamı Derecesi Ortalaması Gruplar arasında 13544, , ,490* Gruplar içinde 8136, ,458 Toplam 21, , * P<0,01 düzeyinde önemli Varyans analizi çizelgesinde örnekler arasındaki farklılıklar p<0,01 düzeyinde önemli bulunmuştur. Önemli bulunan örneklere tek yönlü varyans analizi uygulanmış ve sonuçlar çizelge de verilmiştir. Hesaplamalarda AFM 1 miktarı ppt ( ng/l) olarak kullanılmıştır. Çizelge Analiz periyotlarına göre ortalama AFM 1 konsantrasyonları arasındaki farkların tek yönlü varyans analiz sonuçları %95 olasılıkla ort. değerlerin bulunduğu aralık Analiz periyodu N Ortalama Standart Standart Düşük sınır En üst sınır Sapma Hata Mart 45 27, ,5228 2, , ,3287 Haziran 45 2,7311 1,4321 0,2135 2,3009 3,1614 Toplam 90 14, ,6077 1, , ,2675 Analiz periyotlarına ait ortalama değerler arasındaki farklılık, daha önce de değinildiği gibi zamana bağlı olarak depo ve iklim koşullarındaki değişikliklerin kontamine olmuş yemlerdeki AFB 1 oluşum düzeylerini etkilemesiyle açıklanabilir.

36 Benzer sonuçlar Heeschen vd. (1990) ve Bakırcı (1995) tarafından da rapor edilmektedir. Mart ve Haziran aylarında alınan örneklerin tüm popülasyon içinde AFM 1 düzeyleri bakımından aralarında pozitif bir ilişki olduğunu göstermek için diaganol matriks yöntemi uygulanmıştır. Çizelge AFM 1 bakımından aynı popülasyondaki tüm örneklerin korelasyonları Analiz periyotları Mart Haziran Mart ayında alınan örnekler Haziran alınan örnekler ayında Pearson korelasyon 2 periyottaki önemi Örnek sayısı Pearson korelasyon 2 periyottaki önemi Örnek sayısı 1, ,353* 0,017 *:Korelasyon 0,05 seviyesinde önemlidir (2 periyotta). 45 0,353* 0, , Tablodan da anlaşılacağı üzere tüm popülasyondaki örnekler arasında % 95 ihtimalle anlamlı bir ilişki vardır(p<0,05). AFM 1 seviyesinin Mart ayında yüksek çıkmasının bir sebebi de üreticinin sonbaharda düşük maliyetle aldığı yemleri kendi mahsülü olan yemlerle karıştırıp silaj yöntemi ile depolaması ve mikotoksijenik küflerin üremesi için uygun ortamın yemlerde AFB 1 oluşumuna neden olması ile açıklanabilir. Benzer durumlar daha önce bu konuda yapılan çalışmalarda rapor edilmektedir (Van Egmond, 1989).

37 4.2. Örneklerin Kimyasal Özellikleri edilmiştir. Mart ve Haziran ayında aynı süt hayvanlarından alınan 45 er adet örnek analiz Çizelge 4.2. Örneklerin Kimyasal Özellikleri ÖRNEK ALMA ZAMANI MART HAZİRAN Örnek no % TKM % YKM % Yağ % Asitlik % Özgül Ağırlık % TKM % YKM % Yağ % Asitlik % Özgül Ağırlık Ort % Kül 0rt. % Protein 0rt. % Laktoz 1 12,795 8,895 3,9 0,16 1,029 11,856 8,456 3,4 0,16 1,030 0,758 3,795 3, ,726 8,226 4,5 0,19 1,029 12,145 8,145 4,0 0,18 1,030 0,729 3,795 2, ,312 9,712 6,6 0,19 1,032 14,523 9,023 5,5 0,16 1,030 0,821 3,450 4, ,793 8,893 3,9 0,16 1,031 11,937 8,037 3,9 0,16 1,029 0,769 3,519 3, ,627 9,327 7,3 0,18 1,030 14,374 8,574 5,8 0,16 1,006 0,899 3,278 4, ,052 9,852 3,2 0,17 1,030 12,855 9,455 3,4 0,16 1,031 0,689 3,450 5, ,320 9,820 4,5 0,19 1,031 13,825 9,525 4,3 0,16 1,029 0,851 2,933 5, ,955 9,455 3,5 0,16 1,030 11,843 8,443 3,4 0,16 1,003 0,809 4,485 3, ,435 9,535 3,9 0,16 1,033 12,298 9,198 3,1 0,18 1,030 0,728 4,140 2, ,207 9,007 5,2 0,19 1,031 13,357 8,457 4,9 0,17 1,030 0,837 3,450 3, ,108 9,608 3,5 0,19 1,029 12,898 9,398 3,5 0,16 1,029 0,790 3,071 3, ,387 9,987 3,4 0,16 1,030 11,846 8,646 3,2 0,16 1,032 0,695 3,623 4, ,514 10,014 5,5 0,16 1,030 13,387 8,487 4,9 0,16 1,030 0,899 3,450 4, ,114 8,214 1,9 0,16 1,030 11,990 8,190 3,8 0,16 1,029 0,770 2,760 4, ,073 9,273 4,8 0,17 1,030 13,301 8,801 4,5 0,16 1,032 0,710 3,450 4, ,474 9,974 5,5 0,17 1,033 13,468 8,468 5,0 0,16 1,030 0,812 3,795 2, ,647 8,547 4,1 0,17 1,030 12,114 8,114 4,0 0,16 1,029 0,800 3,381 3, ,312 9,512 3,8 0,16 1,030 12,798 9,198 3,6 0,16 1,031 0,742 3,795 2, ,504 8,004 5,5 0,16 1,031 13,108 8,208 4,9 0,16 1,029 0,894 3,450 2, ,306 9,106 5,2 0,19 1,030 12,812 8,212 4,6 0,16 1,030 0,822 3,623 2, ,617 9,217 7,4 0,19 1,030 14,839 8,139 6,7 0,17 1,007 0,887 3,588 3, ,844 9,844 4,0 0,18 1,032 12,348 8,748 3,6 0,18 1,004 0,801 4,589 3, ,139 10,039 4,1 0,19 1,030 12,634 8,534 4,1 0,16 1,004 0,740 4,219 2, ,936 9,036 4,9 0,20 1,032 12,519 8,319 4,2 0,16 1,005 0,796 4,140 2,263

38 25 14,026 9,726 4,3 0,17 1,030 12,750 8,650 4,1 0,16 1,030 0,803 3,554 4, ,242 9,742 0,5 0,16 1,030 11,842 8,042 3,8 0,16 1,031 0,752 4,485 2, ,053 9,153 3,9 0,16 1,032 12,096 8,396 3,7 0,16 1,030 0,814 3,450 4, ,186 9,386 4,8 0,18 1,031 12,734 8,234 4,5 0,16 1,005 0,757 3,795 3, ,257 10,257 3,0 0,18 1,032 11,785 8,785 3,0 0,18 1,029 0,872 3,450 4, ,425 9,525 3,9 0,17 1,030 12,463 8,763 3,7 0,16 1,029 0,758 3,381 4, ,211 9,911 4,3 0,16 1,030 12,997 8,797 4,2 0,16 1,030 0,801 2,760 4, ,201 8,701 3,5 0,16 1,029 11,731 8,331 3,4 0,17 1,032 0,778 3,450 3, ,640 9,540 4,1 0,16 1,030 12,165 8,265 3,9 0,18 1,029 0,749 3,657 3, ,000 10,000 4,0 0,16 1,030 12,345 8,745 3,6 0,16 1,030 0,803 3,347 4, ,399 9,399 7,0 0,17 1,030 14,876 8,376 6,5 0,16 1,030 0,787 3,450 3, ,000 8,700 3,3 0,17 1,030 11,765 8,565 3,2 0,16 1,003 0,806 3,381 3, ,108 9,508 3,6 0,16 1,030 12,115 8,515 3,6 0,16 1,029 0,699 4,140 3, ,147 9,147 3,0 0,16 1,030 11,368 8,268 3,1 0,16 1,032 0,827 3,450 3, ,205 8,905 3,3 0,16 1,030 11,987 8,687 3,3 0,16 1,003 0,732 3,381 4, ,704 9,004 3,7 0,17 1,031 11,973 8,473 3,5 0,16 1,032 0,705 3,588 3, ,745 8,145 3,6 0,18 1,031 11,65 8,250 3,4 0,16 1,003 0,649 3,450 3, ,722 8,822 3,9 0,17 1,030 12,265 8,665 3,6 0,16 1,029 0,815 3,864 3, ,000 8,800 3,2 0,17 1,030 11,85 8,650 3,2 0,16 1,028 0,731 3,347 3, ,297 9,197 3,1 0,16 1,030 11,543 8,443 3,1 0,16 1,030 0,752 3,657 4, ,822 8,722 3,1 0,18 1,031 11,25 8,150 3,1 0,16 1,032 0,681 3,381 3,669 Ort. 13,435 9,275 4,16 0,17 1,030 12,547 8,55 3,99 0,17 1,030 0,780 3,592 3,689 En yüksek 16,63 10,257 7,40 0,20 1,030 14,876 9,525 6,7 0,18 1,030 0,899 4,589 5,742 En düşük 10,114 8,145 0,5 0,16 1,029 11,25 8,037 3,0 0,16 1,028 0,649 2,760 2,238

39 Kuru Madde Oranı ( % ) Mart ayında alınan örneklerin yağsız kuru madde değeri en düşük %8,145; en yüksek %10,257 ve ortalama %9,275 olarak tespit edilmiştir. Haziran ayında alınan süt örneklerde ise en düşük %8,037, en yüksek %9,525 ve ortalama %8,55 bulunmuştur. TS 1018 çiğ süt standardında yağsız kuru madde değerinin inek sütlerinde en az %8 olması gerekmektedir (Anon., 1981). Mart ve Haziran aylarında alınan örneklerin tamamı standartta belirtilen değere uygun bulunmuştur Yağ Oranı ( % ) Çizelgeden de görüleceği gibi Mart ayında alınan süt örneklerinin % yağ oranı en düşük %0,5, en yüksek %7,40 ve ortalama %4,16; Haziran ayında alınan süt örneklerinde ise en düşük %3,0, en yüksek %6,7 ve ortalama %3,99 olarak tespit edilmiştir. TS 1018 çiğ süt standardında yağ oranının en düşük %3 olması gerektiği belirtilmektedir (Anon., 1981). Mart ayında alınan örneklerin %4,44 ü standartta belirtilen değerden düşük bulunmuştur. Düşük yağ oranlarının muhtemel sebebi, hayvanların mastisit hastalığına yakalanmış olabileceğidir. Mart ayında alınan süt örneklerinin %95,56 sı, Haziran ayında alınan örneklerin ise %100 ü standarda uygun bulunmuştur Asitlik ( % ) Mart ayında alınan süt örneklerinin % asitlik değeri en düşük % 0,16, en yüksek % 0,20 ve ortalama % 0,17; Haziran ayında alınan örneklerde ise en düşük % 0,16, en yüksek % 0,18 ve ortalama % 0,17 bulunmuştur. İncelenen örneklerin tamamı TS 1018 çiğ süt standardına uygun bulunmuştur (Anon., 1981).

40 Özgül Ağırlık Çizelge 4.2 den de görüleceği üzere Mart ve Haziran aylarında alınan örneklerde en düşük özgül ağırlık; Mart ayında 1,029, Haziran ayında 1,028 bulunmuştur. Genel ortalama Mart ve Haziran aylarında 1,030 olarak tespit edilmiştir. TS 1018 çiğ süt standardında yoğunluğun (15,6 o C da) en az 1,028 en fazla 1,039 değerleri sınırlaması getirilmiştir (Anon., 1981). Analiz edilen örneklerin tamamı TS 1018 e uygun bulunmuştur Protein ( % ) Çizelge den de görülebileceği gibi Mart ve Haziran aylarında alınan örneklerdeki protein oranı değerleri ortalamayı temsil edip, % protein oranı en düşük %2,760, en yüksek %4,589 ve genel ortalama %3,592 olarak tespit edilmiştir. İncelenen örneklerin tamamı Türk Gıda Kodeksi nde belirtilen %2,8 değerine uygun bulunmuştur (Anon., 1997 c ) Laktoz ( % ) Mart ve Haziran aylarında alınan örneklerin ortalama % laktoz oranı değerleri hesaplanmış ve en düşük %2,238, en yüksek %5,742 bulunmuştur. Genel ortalama %3,689 olup, literatürde belirtilen %4,9 değerinden düşük bulunmuştur. Çizelgeden de görüldüğü gibi, kış döneminde alınan örneklerin ortalama kuru madde, yağ değerleri, yaz döneminde alınan örneklerin ortalama kuru madde, yağ değerlerinden yüksek bulunmuştur. Ortalama asitlik ve özgül ağırlık değerlerinde tespit edilebilir bir fark belirlenmemiştir. Sütün bileşimi bir çok faktör tarafından etkilenmektedir. Laktasyonun etkisi, hayvan ırkının etkisi, hayvanın sağlık durumunun etkisi, sağım zamanı ve şeklinin

41 etkisi, yemin etkisi ve hayvanın psikolojik durumunun etkisi (Metin, 2001) sütün bileşimini etkileyen faktörler arasındadır. Çalışmada incelenen süt örneklerinin bileşimiyle literatür değerleri arasındaki farkların sayılan faktörlerden kaynaklandığı söylenebilir. Bu çalışmada elde edilen değerler Sezgin ve Koçak (1982) ın bu konuda yaptıkları çalışmada elde edilen değerlerden yüksek bulunmuştur.

42 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Araştırmadan elde edilen bulgulara göre; analiz edilen toplam 135 adet çiğ süt örneğinden 116 sında (%86) AFM 1 tespit edilirken 19 örnekte (%14) AFM 1 bulunmamıştır. Bu örneklerden sadece 1 i (%0,74) Avrupa Birliği ve ülkemizde de kabul edilen limit değer olan 0,05 µg/l (ppb) düzeyinin üzerinde yüksek bulunmuştur. Halk sağlığının korunması açısından önemli olan bu konuda ilk alınacak tedbir yemlerde oluşan aflatoksinlerin kontrol altına alınmasıdır. Sütlerde oluşan AFM 1 miktarının minumuma indirilmesinin en kolay yolu yemlerde AFB 1 oluşumunu engellemektir. Bunun içinde bir çok ülkede olduğu gibi yemlerin iyi kontrol edilmesi gerekmektedir. Bugün tedavisi mümkün olmayan hastalıklara neden olduğundan bazı ülkeler süt ve süt ürünlerindeki aflatoksin miktarını sıfır olarak kabul etseler de genel olarak kabul gören tolerans değeri 0,05 µg/l (ppb) dir. Türkiye açısından konunun bir başka açıdan önemi ise yapılan denetimlerin yetersizliğidir. Ayrıca bu konuda Türkiye de yapılan araştırmalar yetersiz olup,daha fazla çalışma yapılması faydalı olacaktır. AFM 1 miktarının minumum düzeylerde tutulabilmesi için üreticiye gerekli eğitimler verilmeli, kontroller yapılmalıdır. Türkiye de aflatoksinlerle ilgili en son yasal düzenleme 2002 yılında yayınlanmış olup halen yürürlüktedir.

43 KAYNAKLAR Allcroft, R., Carnaghan, R.B.A. 1963, Groundnut toxicity: an examination for toxin in human food products from animals feed toxic groundnut meal Vet. Res. 75, Anonymous, 1981, Türk Standartları Enstitüsü, Çiğ Süt Standardı TS 1018 Ankara Anonymous, 1992, Aflatoxin food protection report Publ. Mountly by Charles Felix Assoc. 8(10), 1. Anonymous, 1993, Technical profile: the quantative advantage for mycotoxin testing World Grain the Inter. Mag. Grain, Flour and Feed. Anonymous, 1997c, Türk Gıda Kodeksi Yönetmeliği T.C. Resmi Gazete, Sayı: Anonymous, 1999, Ridascreen, aflatoksin M 1 Enzyme immunoassay for the quantative analysis of aflatoxin M 1. r Biopharm GmbH Germany. Anonymous, 2002, Türk Gıda Kodeksi Gıda Maddelerinde Belirli Bulaşanların Maksimum Seviyelerinin Belirlenmesi Hakkında Tebliğ Resmi Gazete No: (Tebliğ No: 2002 / 63). Applebaum, R. S., Bracket, R. E., Wiseman, D. V., Marth, E. H. 1982, Aflatoksin : Toxicity to dairy cattle and occurence in milk and milk product-a review J. Food Protect, 45, Bakırcı, İ., 1995, Sütlerde Aflatoksin M 1 oluşumu ve ürünlere geçişi üzerinde bir Araştırma Yüzüncü Yıl Üniv. Fen Bilimleri Enstitüsü, Van. Bakırcı, İ., 2001, A Study on The Occurence of Aflatoxin M 1 in Milk and Milk Products Produced in Van Province of Turkey. Food Control, 12, Blanc, M., Karleskind, A., 1981, Contamination of milk and dairy products by aflatoksin M 1 in France Lait, 61, Bullerman, L. B., Olivigni, F, J., 1974, Mycotoxin producing-potential of molds isolated from Cheddar Cheese J. Food Sci. 39, Charles, R., Hurburg, J. R., 1995, Mycotoxins in the Grain Market World Grain, October, Chen, J., Gao, J. 1993, The Chinese total diet study in 1990 Part I. Chemical contaminants, J. AOAC Inter. 76(6), Çoksöyler, N. Köşker, Ö., 1980, Süt ve yemde aflatoksin oluşumu üzerinde araştırmalar A.Ü.Z.F. Diploma sonrası Y.O. İhtisas Tez Özetleri, 1, Çoksöyler, N., 1984, İçel yöresinde yetiştirilen yerfıstıklarında aflatoksin oluşumu nedenleri üzerine araştırmalar (Doktora tezi) Ankara Üniv. Fen Bilimleri Enst. Davis, N. D., Diener, V. L. 1978, Mycotoxins food and beverage mycology L.R. Beuchat (ed) AVI Publishing Company Inc Demirci, M., Gündüz, H. 2004, Süt Teknoloğunun El Kitabı Hasad Yayıncılık, Demirer, M. A. 1973, Süt ve Mamüllerinde AFLM 1 ve B 1 Aranması Üzerinde Araştırmalar A.Ü. Vet. Fak. Derg. XX, (2-3) Doyle, M. P., Marth, E. H. 1978a, Bisulfit degrades aflatoxin: effect of temperatures and concentration of bisulfit J. Food Prot. 41(10), Doyle, M. P., Marth, E. H. 1978b, Bısulfit degrades aflatoxin:effect of citric acid and methanol and possible mechanism of degradation J. Food Prot. 41 (11),