Dizilim Analizi ile HLA Tiplendirimi (Sequence Based Typing, SBT)

Transkript

1 Dizilim Analizi ile HLA Tiplendirimi (Sequence Based Typing, SBT) Dr Klara Dalva AÜTF Hematoloji BD DTL Laboratuvarı

2 Yüksek Çözünürlükte HLA Tiplendirimi Akraba olmayan vericiden Kök Hücre nakillerinde Hasta Bankalara kayıtlı vericiler (adaylar/seçilmişlerde doğrulama) Akrabadan Kök Hücre Nakillerinde Ebeveynler incelenemediğinde Aile verileri ile ailedeki 4 haplotip belirlenemediğinde Düşük çözünürlük çalışmalarda homozigot şüphesi varken Solid organ Nakillerinde Özellikle antijen uyumsuzluklarının kabul edilebilir/edilemez olduğunun tespitinde (virtual XM)

3 Yüksek Çözünürlükte HLA tiplendirimi Kullanılan Yöntemler-I SSOP (daha kapsamlı kitler ile) SSP (Her alel için ayrı bir çalışma kurarak) Yukarıdaki yöntemlerin yeni bulunan alellere göre güncellenmesi, çok sayıda prob, primer, kullanılması gerekir SBT Yeni Sekenslama Yöntemleri (Next Generation Sequencing )

4 Tüm eksonlar değerlendirilebilir Yüksek Çözünürlükte HLA tiplendirimi Kullanılan Yöntemler-II SSOP SSP SBT (generic) SBT (group specifique) Rezolüsyon Orta/yüksek Orta/yüksek Yüksek Yüksek ve Allel düzeyinde Karmaşık sonuçlar Var * Daha az ** Var *** Nadir*** *: Prob sayısı arttırılarak, tek alel amplifikasyonu ile karmaşık sonuçlar azaltılabilir **: Düşük çözünürlük yanı sıra her alel için ayrı çalışma(ssp) yapılırsa karmaşa az, ancak otomasyona uygun değil, daha fazla DNA gerektiriyor, daha zahmetli *** Ek çalışmalarla eklenen yeni verilerle (GSSP/ HARP, ek ekson, intron sekanslaması) karmaşık sonuçlar çözülebilir

5 Frederick Sanger

6 Sekanslama Donanım, Yazılım,Kimya, Enzimler, Deneyim 1980 lerden 1990lara Y2K Yavaş Otomatik Sekanslama Market ufak Lokıus Spes. primerler Klonlama Radyoizotoplar Manuel Zor PCR ürünü dizi analizi İzotop kullanmayan Enzim/kimya da iyleşme Yazılımla Değerlendirme İnsan Genom Projesi ile önemli ilerlemeler Alel sayısı artıyor HLA için kabul görmesi Maliyette düşme Yeni Nesil Sekanslama Otomatik analiz platformları Heterozigot sekanslanma Grup Spes. sekanslama Yazılımda gelişmeler Günümüz

7 Hangi Bölgeler İnceleniyor? CLASS I CLASS II

8 Antigen Recognition Site, ARS Antigen Recognition Site, ARS Kaynak: A.M Grenoble France, R Blasczyk, Hannover Germany 2007 Teaching Session 2

9 SBT Yöntemi- Basamaklar ANALİZ

10 1 DNA İzolasyonu Rutin çalışmalarda kan ve ağız çalkantı suyu, «buccal smear» ile toplanan hücreler kullanılabilir (Hematolojik malinitelerde LOH, alel mutasyonları olabilir. Aile verileri, gerekirse farklı materyalle yeniden tiplendirme önem taşıyor! ) Farklı yöntemler kullanılabilir Haplotipe Özgün Ekstraksyon yapılması maliyeti arttırsa da karmaşayı çok azaltır DNA miktar/ kalitesi önemli A260/A280:1,8-2,0 <1,5 iken %50 prot kontaminasyonu? Homojen olmalı(fenol ekstraksyonu ile sorun olabilir) Genellikle ng/ml konsantrasyonda kullanılır Elüsyon tamponu: Kit ile uyumlu mu? (PCR inhibisyonu?)

11 2 PCR ile Amplifikasyon Çalışma nasıl olsun? Peşin? Taksitli? Generic : Tek bir tüpte tek bir lokusa özgün problar ile Multiplex amplifikasyon yapılır Class I için en az Exon 2 ve 3, 1-6 ya da hepsini içeren kitler Class II için en az Exon 2, exon 3, hepsini içeren kitler Generic(biallelik) sekanslamayı takiben Grup spesifik sekanslama (GSSP, HARPs.. ile mono allelik sekanslama) yapılabilir Grup spesifik Amplifikasyon (Ör: -B için 16 grup, -DRB1 için 16 grup için amp. yapılır) Amplifikasyon ürününde tespit edilen alele göre her alel ayrı sekanslanır Alel spesifik amplifikasyon Mevcut iki basamaklı sonuçlara göre (ör DRB1*04, DRB1*15 için ayrı ayrı) amplifikasyon ve takiben sekanslama yapılır

12 2 PCR ile Amplifikasyon Türü A*02:01/A*03:01 Peşin HLA A lokus PCR A*02:01 ve A*03:01 aynı reaksyonda amplifiye olur Multiple Grup Spesifik PCR A1- A2+ A3+ A24- A68- A80- İki allel birlikte sekanslanır Bazan net, bazan karmaşık sonuçlar A*02:01/A*03:01 A*02:01/A*03:01 veya A*02:24/A*03:17 A2 ve A3 e özgün 2 farklı Kalıp ile (homozigot)dna sekanslaması yapılır HLAA*02:01/A*03:01 değil de A*02:01/A*02:05 olsaydı heterozigot bir sekanslama görülür Taksitli SSP veya GSSP Ile çözülür A*02:01 A*03:01

13 2 Biallelik Amplifikasyonda kullanılan primerler : Örnek: Üretici A, Class I R F1 h,ı,j,k,l,m a,b,c,d,e,f,g.. Amplifikasyon primeri (tek tüpte) Sekanslama primeri (her primer farklı tüpte, 6 tüp) GSSP primeri (karmaşaya göre yazılım öneriyor,geniş bir alanda lokalize olabilir

14 2 Piyasada bulunan kitlere örnekler (core kit)

15 2 PCR ürünlerinin kontrol edilmesi

16 3 PCR Ürünlerinin Temizlenmesi Daha sonraki sekanslama basamağını etkilememesi için kullanılmayan PCR primerleri ve dntp ler uzaklaştırılır Bu amaçla Kolonlar kullanarak filtreleme ExoSAP-IT (20 dk 37 takiben dk 80 ile inaktivasyon) Exonuclease I: Kalan primerleri parçalar Shrimp Alkaline Phosphatase: Kalan dntp leri parçalar ****Bu işlemden önce jel elektroforezi ile amplifikasyon kontrol edilmelidir. Amplikon oluşmuşsa temizleme işlemi ile devam edilir Oluşmamışsa PCR işlemi tekrarlanır

17 3 PCR ürününün temizlenme sorunu Orijinal Temizlenmiş Orijinal Temizlenmiş

18 3 PCR ürününün temizlenme sorunu ExoSAP yetersiz Temiz Sekanslama primerlerinin kalitesi ile temizlenmeyen ürünlerin olumsuz etkisi baskılanabilir

19

20

21 4 Sekanslama Reaksiyonu dntp/ddntp: 100/1, ddntp ler floresan işaretli Kaynak: Dong -Feng Chen, SBT The gold standart for HLA high resolution typing, ABHI-U sunusu

22 4 dntp ve ddntp Farkı Kaynak: Dong -Feng Chen, SBT The gold standart for HLA high resolution typing, ABHI-U sunusu

23 4 PCR Amplifikasyonu - Sekanslama Reaksyonu Farklar Primer PCR Amplifikasyonu Her reaksyonda bir çift primer (forward ve reverse aynı tüpte ) dntp Kullanılır Kullanılır ddntp Kullanılmaz Kullanılır Thermal Cycling Uygulanır Sekanslama Reaksiyonu Her reaksiyon için tek primer (forward ve reverse ayrı tüpte) Uygulanır Çalışma Alanı Pre-PCR Post_PCR Ürün Çift sarmal Çift sarmal (denaturasyon ile tek sarmal hazırlanıp cihaza yüklenir )

24 4 Sekanslanan Bölgeler

25 4 Sekanslamada kullanılan primerler : Örnek: Üretici A, Class I R1 3 h,ı,j,k,l,m a, b,c,d,e,f,g F1 Amplifikasyon primeri (tek tüpte) Sekanslama primeri (her primer farklı tüpte, 6 tüp) GSSP primeri (karmaşaya göre yazılım öneriyor, geniş bir alanda lokalize olabilir

26 Sekanslanan Bölgeler- Karmaşık Sonuçlar Karmaşık Sorun Örneği

27 5 Sekanslanan Ürünün Temizlenmesi Bağlanmamış floresan işaretli ddntp ler ortamdan uzaklaştırılır Kalırlarsa Elektroforez sırasında DNA fragmanları ile birlikte hareket ederek veri kirliliğine sebep olurlar En sık kullanılan iki yöntem Jel filtrasyonu (Sephadex) Etanol ile çöktürme Bağlanmayan big dye etanolde kalır fragmanlar çöker Küçük fragmanlar için sodyum asetat eklenir

28

29 6 Ürünlerin Elektroforez için Cihaza Yüklenmesi Floresan Dedektörü (CD kamera) DNA Fragmanlarının polimerdeki hareketi Katot

30 6 Kapiller Elektroforez Cihazın performansı önemli Spatial Calibration Her kapiller için Sinyal Pixel pozisyonlarının belirlenmesi Spectral Calibration Floresan sinyallerin ayırımı (üst üste binmemesi) için gerekli

31 Verilerin Analizi: Prensip Elde edilen dizilimler, HLA veri tabanında bulunan sekanslar (Consensus) ile karşılaştırılarak olası aleller tespit edilir Analiz aşamasında tüm dizilimin gözden geçirilmeli (genellikle hata /tutarsızlık şüphesi olan yerlerde kılavuz işaretler var) Concensus ile farklı olan pozisyonların kontrolü, düzeltilmesi Heterozigot pozisyonların kontrolü forward ve reverse dizilimler arasında tutarsızlık kontrolü, bazların gerekiyorsa güvenilir olan veriye göre düzeltilmesi

32 International Union of Biochemistry Nomenclature Committee (IUB) Kodları R= A ve G (purine) Y= C ve T (pyrimidine) K= G ve T (Keto) M= A ve C (amino) S= G ve C (Strong, 3 Hidrojen bağı) W= A ve T (Weak, 2 Hidrojen bağı) N= any base (A veya T veya C veya T)

33 Verilerin Analizi Kullanılan yazılım Programları farklılıklar taşır TÜMÜNDE ORTAK Olası Alel seçenekleri özetleniyor (varsa MM sırasına göre) Yapılan tüm müdahaleler izlenebiliyor Bir sonuç raporu oluşturulur FARK GÖSTERENLER Önerilen ek çalışmalar bildirilebilir ( ek olarak hangi lokus bilgisi gerekli, kullanılması önerilen GSSP) Sık (CWD) ve sık görülmeyen alellere göre veriler sınıflanabilir! Sonuçlar NMDP kodları ile verilebilir! ARS bölgesi ortak olan aleller birlikte sınıflanabilir(g group)!

34 Karşılaşılan Problemlerin Kaynakları Bir alelin tercihli amplifikasyonu Kullanılan Sekanslama primerlerinin bağlanmasını etkileyen yeni bir polimorfizm farklı bir kit ile farklı verim alınabilir HLA genlerindeki somatik mutasyonlar LOH ( tüm bir haplotip ya da tek bir lokusta olabilir, farklı yöntemlerle farklı sonuçlar alınabilir SBT daha duyarlı) HLA Allel polimorfizmi ( ör: indel mutasyonları, ortaya çıkan Null bir alel) Karmaşık Sonuçlar (ambiguity)

35 Tercihli amplifikasyon örneği: C*7 ve 17 olan bir bireyde C*17 de amp. avantajı var

36 Karmaşık Sonuçların Sebepleri Dizilim analizi yapılan bölgede gen sekanslarının ortak olması (Ör: C*04:01-C*04:01N DRB1*14:01-14:54 Bu durum ifade edilen iki alel ya da ifade edilen bir alel ile null bir alel olarak karşımıza çıkabilir Bu sorun genellikle diğer eksonları/intronları sekanslayarak çözülür Serolojik tipleme, SSP ile ek testler yardımcı olur Belli motiflerin yer değiştirmiş olabilmesi olasılığı (cis-trans) nedeniyle görülen karmaşalar Mono allelik sekanslama (haplotip spesifik ekstraksyon) Allelerden birine özel primerlerin kullanılması (monoallelik sekanslama) grup spesifik amplifikasyona ek olarak HARP; GSSP kullanımı En başından seçilmiş bir alelle özgün sekanslama reaksiyonu

37 Ortak Gen Sekansları Agnés Moine, Grenoble - France 2007 Teaching Session 2

38 ARS de Ortak Gen Sekansı -Örnekler Alel 1 Null Alel Polimorfizm yerleşimi A*0101 A* N Intron 2 A*0301 A* N İntron 4 A*2901 A* N İntron 4 A*6801 A*6811N Exon 1 B*1501 B* N Intron 1 B*1801 B*1817N Exon B*4402 B*4419N Exon 1 C*0301 C*0303N Exon 1 C*040 1 C*0409N Exon 7 Alel 1 İfade edilen Alel 2 A*7401 A*7402 Exon 1 B*0705 B*0706 Exon 5 B*2705 B*2713 Exon 1 B*8101 B*8102 Exon 1 C*0501 C*0503 Exon 4 Polimorfizm yerleşimi C*0701 C*0706, 0718 Exon5,6 C*0704 C*0711 Exon7 DRB1*1201 DRB1*1206, 1210 Exon 1 ve3 DRB1*1401 DRB1*1454 Exon 3 Agnés Moine, Grenoble - France 2007 Teaching Session 2

39 Motif Pozisyonlarının Önemi

40 Motiflerin yer değiştirme olasılığı Generic Karmaşa Allelik Karmaşa A B C DRB1 A B C DRB1 01/ / / / / /53 05/ /13 25/ /39 07/ /14 25/ /4501/ / / / /78 51/ / /5610 %79,7 %80,46 %54,6 %96,7 %9,7 %5,77 %4,34 %2,7 AM, Grenoble France 2007 EFI Teaching Session 2

41 Özet SBT, halen Yüksek çözünürlükte HLA tiplendirimi için kabul edilen Referans Yöntemdir Seçilecek olan yöntem ve kullanılacak donanım, amaca/kaynaklara göre farklılıklar gösterebilir Seri çalışmalar için Otomasyon mümkündür SBT ile çözülmesi zaman alan soruların çok yakın gelecekte NGS ile çözümlenmesi mümkün olabilecektir Diğer HLA tiplendirme yöntemlerinde olduğu gibi Çalışma- Analiz ve Sonuçların Onaylanmasında başarılı olmak, deneyim- konu ve incelenen toplumlar hakkında bilgi sahibi olmayı gerektirir

42