INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2

Transkript

1 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 KEY-CODE: FRI INNO-LiPA MYCOBACTERIA v v p 1/12 Türkçe Üretici: Fujirebio Avrupa N.V. Technologiepark Gent Belçika BTW BE RPR Gent Dağıtıcı: Fujirebio Almanya GmbH Hans-Böckler-Allee Hannover Almanya Fujirebio Italya S.r.l. Via Vaccareccia 39/A Pomezia (Roma) Italya Fujirebio Avrupa N.V. Technologiepark Gent Belçika Fujirebio Fransa SARL. Les Conquérants, Bât. Le Kilimandjaro 8/10, avenue des Tropiques Les Ulis Fransa Fujirebio Iberia S.L. Calle Tarragona 161, Planta Barselona İspanya Diğer dillere bakın / Autres langues voir / Andere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: AVRUA GR IS LT RO SK TR LI MT non-avrupa US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Avrupa N.V.

2 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 2/12 İÇERİK TABLOSU Kullanılan semboller... 2 Kullanım amacı... 3 Test Prensibi... 3 Reaktifler... 3 Tanımlama, kullanım için hazırlama ve önerilen saklama koşulları... 3 Gereken ama sağlanmayan materyaller... 4 Güvenlik ve çevre... 5 Numuneler... 6 Açıklamalar ve önlemler... 6 Test prosedürü... 7 Prosedürel notlar Örnekler... 8 Hibridizasyon... 8 Sıkı yıkama... 8 Renk gelişimi... 8 Otomatik test prosedürü... 9 Sonuçlar... 9 Okuma... 9 Kalite kontrol... 9 Sonuçların yorumlanması Prosedür sınırlamaları Test performansı Ticari markalar Yorumlama tablosu Kullanılan Semboller Üretici In vitro Diagnostik Medikal Cihaz Grup kodu Katalog numarası Tarafından kullanılır Kullanım talimatlarına bakın Sıcaklık sınırlaması <n> test için yeterlidir Konjugat 100x Konjugat Seyreltici Denatürasyon Solüsyonu

3 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 3/12 Kullanım amacı Hibridizasyon Solüsyonu Durulama Solüsyonu 5x Sıkı Yıkama Solüsyonu Stripler Substrat BCIP/NBT 100x Substrat Buffer INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 testi in vitro kullanım için DNA prob testidir. 16S-23S ribozomal RNA (rrna) spacer bölgedeki nükleotid farklılıklarına dayanarak Mycobacterium cinsinin ve sıvı ve katı kültürden 16 farklı mycobacterial türün tespiti ve tanımlaması için tasarlanır. Test Prensibi INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 ters hibridizasyon prensibine dayanır. Biyotinli DNA materyali membrane-temelli striplerde paralel çizgiler halinde sabitlenen spesifik oligonükleotid problar ile hibridize edilir. Hibridizasyon sonrası, alkali fosfataz ile etiketli streptavidin eklenir ve önceden oluşan herhangi biyotinli hibride bağlanır. 5-bromo-4- chloro-3-indolyl fosfat ile inkübasyon ve nitroblue tetrazolium (BCIP/NBT) kromojen mor/kahverengi çökelti ile sonuçlanır. INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 testini yapmak için, 16S-23S ribozomal rrna spacer bölgesinin amplifikasyonu yapılmalıdır (INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 Amp kullanım talimatlarına bakın). Amplifikasyon ürünleri 1 tipleme stribi kullanılarak sonradan hibridize edilir, 22 paralel DNA prob çizgisi ve 2 kontrol çizgisi sabitlenir (Şekil 1). INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2: İçerdiği aşamalar Aşama 1 Mycobacterium türlerinin 16S-23S rrna spacer bölgesinin amplifikasyonu (INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 Amp). Aşama 2 Strip üzerinde sabit spesifik problarla amplifiye 16S-23SrRNA spacer bölgesinin hibridizasyonu ve hassas yıkanması. Aşama 3 Renk değişimi. Aşama 4 Sinyal modelinin yorumlaması. Reaktifler Tanımlama, kullanım için hazırlama ve önerilen saklama koşulları C de saklandığında, tüm test reaktifleri, kaplı test stripleri dahil, kitin son kullanma tarihine kadar stabildir. Reaktifleri dondurmayın. Son kullanma tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayın. - Bu kit kontamine DNA nın herhangi bir kaynağından, özellikle amplifiye DNA ürünlerinden ayrı saklanmalıdır. - Tüm reaktifler ve test stripleri içeren plastik tüpler(tüp kapakları kapalı olarak) kullanımdan önce yaklaşık 30 dakika oda sıcaklığına getirilmelidir (20-25 C) ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına koyulmalıdır.

4 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 4/12 - Kullanımdan önce striplerin kıvrılma olasılığını minimize etmek için, tüpün yatay olarak saklanması önerilir. Sağlanan reaktifler: Bileşen Miktar Ref. Tanım Stripler 1 x INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 için 20 strip içerir. Konjugat 100x 0.8 ml Kullanımdan önce Konjugat tamponu ile 1/100 seyreltilecektir, konjugat tamponu içerisinde alkali fosfataz ile etiketli streptavidin protein stabilizatörleri ve koruyucular mevcuttur. Her test kuyusu için 2 ml Konjugat çalışma solüsyonu + 2 ml fazladan hazırlayın. Hazırlık sonrası, Konjugat çalışma solüsyonu karanlıkta saklandığında oda sıcaklığında (20-25 C) 24 saat stabildir. Konjugat Tamponu 80 ml NaCl, Triton, protein stabilizatörleri, ve koruyucu olarak 0.01% Denaturasyon Solüsyonu Hibridizasyon Solüsyonu Yıkama Solüsyonu Durulama Solüsyonu 5x MIT/<0.1% CAA içeren fosfat buffer. 1 ml EDTA içeren alkali solüsyon. Dikkat!!! Denatürasyon solüsyonunu içeren şişe kullanımdan hemen sonra kapatılmalıdır; bu solüsyonun havayla uzun süreli temas ettiğinde hızlı bozulmaya yol açar. 80 ml Deterjan ve koruyucular ile SSC tamponu içerir. 200 ml Deterjan ve koruyucular ile SSC tamponu içerir. 80 ml Kullanımdan önce distile veya deiyonize suda 1/5 seyreltilecek (1 kısım solüsyon+ 4 kısım distile su), NaCl, Triton, ve koruyucu olarak 0.05% MIT/0.48% CAA içeren fosfat buffer. Her test kuyusu için 8 ml Durulama çalışma solüsyonu +(tüm çalışma için bir tane 10 ml fazladan hazırlayın). Substrat 100x 0.8 ml Kullanımdan önce substrat buffer 2-8 içinde 1/100 2 hafta seyreltilecek stabildir. dimethylformamid içinde 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl fosfat p- Toluidine salt ve 4-Nitro-blue tetrazolium. Her test oluğu için 2 ml Substrat çalışma solüsyonu + 2 ml fazladan hazırlayın (substrat çalışma solüsyonu konjugat inkübasyonu esnasında hazılanabilir). Substrat çalışma solüsyonu karanlıkta saklanırsa oda sıcaklığında (20-25 C) 24 saat stabildir. Substrat Buffer 180 ml NaCl, MgCl 2 ve koruyucu olarak 0.01% MIT / <0.1% CAA içeren Tris buffer. Inkübasyon tepsileri 3 - Her biri 8 oluk içerir. Okuma kartı 1 - Pozitif probların tanımlanması için. Gerekli olan ama sağlanmayan materyaller - Çalkalama platformu ile su banyosu (80 rpm; eğimli kapakla; 62 C ± 0.5 C ye ayarlanabilen sıcaklık). - Aspirasyon cihazı. - Kalibre termometre. - Distile veya deiyonize su. - Tek kullanımlık eldivenler. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk-takılı). - Strip kullanma için forsepsler. - Dereceli silindirler (10, 25, 50, ve 100 ml). - Orbital, karşılıklı veya sallanan platform çalkalayıcı. Öneriler: Orbital çalkalayıcı için: dairesel hareketin çapı 13 mm ye eşit veya fazla olmalıdır.

5 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 5/12 13-mm dairesel hareket için önerilen hız 160 rpm dir. Karşılıklı çalkalayıcı için: to-and-fro hareket için önerilen hız dakika başına is 80 harekettir. Sallanan platform çalkalayıcı için: çalkalama açısı sıvının dökülmesini önlemek için 13 yi aşmamalıdır. önerilen hız 50 rpm dir µl, µl, and µl dağıtmak için ayarlanabilen pipetler. - Dağıtma Multipipet (Eppendorf, isteğebağlı). - Zamanlayıcı, 2 saat (± 1 dakika). - Vorteks karıştırıcı veya eşdeğeri. Güvenlik ve çevre Olası tehlikeli bileşenler hakkında bilgi için lütfen Güvenlik Veri Kağıdına (SDS) ve ürün etiketlenmesine bakın. En son SDS versiyonu website da mevcuttur. Tehlike ifadeleri H312 H314 H317 H319 H332 H360D Önlem ifadeleri P201 P260 P261 P280 Tehlike: DENAT SOL H314 P260 P280 P303+P361+P353 P305+P351+P338 P310 P363 Uyarı: 2-Chloroacetamid içerir: DURULAMA SOL 5x H317 P261 P280 P333+P313 P363 P302+P352 Tehlike: N,N-Dimethylformamid ve 5,5 -diphenyl-3,3 - bis(4- nitrophenyl)-2,2 -(3,3 -dimethoxybiphenyl-4,4 - ylene)ditetrazolium dichlorid içerir: SUBS BCIP/NBT 100x H312 H319 H332 H360D P201 P261 P280 P281 P305+P351+P338 P308+P313 Cilt ile temasında zararlıdır. Ciddi cilt yanıkları ve göz hasarına sebep olur. Alerjik cilt reaksiyonuna sebep olabilir. Ciddi göz tahrişine sebep olur. Solunduğunda zararlıdır. Doğmamış çocuğa zarar verebilir. Kullanmadan önce özel talimatlar edinin. Duman/buhar/sprey solumayın. Duman/buhar/sprey solumaktan kaçının. Koruyucu eldivenler/koruyucu giysi/göz koruyucu/yüz koruyucu kullanın. P281 Gerektiği gibi kişisel koruyucu ekipman kullanın. P302+P352 CİLTTE: Bol sabun ve su ile yıkayın P303+P361+P353 CİLTTE (veya saç): Bütün kontamine giysileri hemen çıkarın/kaldırın. Su/duş ile cildi durulayın. P305+P351+P338 GÖZLERDE: Birkaç dakika su ile dikkatli durulayın. Varsa ve kolaysa kontakt lensleri çıkartın. Durulamaya devam edin.

6 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 6/12 P308+P313 P310 P333+P313 P363 Maruz kaldıysa veya ilgiliyse: Tıbbi yardım/tavsiye alın. Hemen bir ZEHİR MERKEZİ veya doktor/hekime başvurun. Cilt tahrişi veya kaşıntı oluşursa: Tıbbi yardım/tavsiye alın. Tekrar kullanmadan önce kontamine giysiyi yıkayın. - Numuneler her zaman potansiyel bulaşıcı gibi kullanılmalıdır. Bu nedenle, tüm kan bileşenleri ve biyolojik materyaller potansiyel bulaşıcı olarak düşünülmelidir ve öyle kullanılmalıdır. Sadece yeterince eğitimli personel test prosedürünü yapmak için izinli olmalıdır. Tüm kan bileşenleri ve biyolojik materyaller belirtilen güvenlik prosedürleri ile uyumlu olarak atılmalıdır. 121 C de en az 15 dk otoklavlayın. Tek kullanımlık materyali yakın. Sodyum hipoklorit ile sıvı atığı karıştırın böylece son konsantrasyon ± 1% sodyum hipoklorittir. Atmadan önce bir gece boyunca bekletin. DİKKAT: sodyum hipoklorit eklemeden önce asit içeren sıvı atığı nötralize edin. - Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: tehlikeli veya bulaşıcı maddeleri işlerken eldivenler ve emniyet gözlükleri - Atık kurumun atık atma kurallarına göre kullanılmalıdır. Ayrıca tüm federal, eyalet ve yerel çevre düzenlemelerini dikkate alın. Numuneler Bu test biyotinli amplifiye DNA materyali kullanır. Biyotinli oligonükleotid primerleri kullanan bir amplifikasyon kiti Mycobacterium türlerinin 16S-23S rrna spacer bölgesinin amplifikasyonu için beraberinde bir kit olarak mevcuttur (INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 Amp). Bu amplifiye materyali Mycobacterium cinsini ve aşağıdaki Mycobacterium türlerini tespit etmek için INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 üstünde kullanılır: M. tuberculosis complex, M. kansasii, M. xenopi, M. gordonae, M. genavense, M. simiae, M. marinum ve M. ulcerans, M. celatum, MAIS, M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. haemophilum, M. chelonae complex, M. fortuitum complex ve M. smegmatis. Açıklamalar ve önlemler - Farklı lot numaralarına sahip reaktifleri karıştırmayın. - Reaktiflerin mikrobiyel kontaminasyonundan kaçının. - Stripleri kullanmak için cımbız kullanın. Elinizdeki yağlar hibridizasyon ve renk gelişimine müdahale edebileceğinden ellerinizle striplere dokunmayın. - Striplerin üzerine yazmak için sadece kurşun kalem kullanın. Test reaktifleri striplerden mürekkebi çıkartabilir. - Test striplerinin kaplı membranı taşıyan tarafı yukarı bakacak şekilde oluklar içine yerleştirildiğinden emin olun (Doğru taraf işaretlidir). - Stripler sadece bir kez kullanılmak üzere tasarlanmıştır! - Konjugat ve Substrat çalışma solüsyonları hazırlamak için kullanılan tüm kaplar iyice temizlenmeli ve distile su ile durulanmalıdır. - Her numune için yeni steril pipet ucu kullanın (pamuk filtreli). - PCR kontaminasyonunu önlemek için, pre- ve post- amplifikasyon aşamalarının fiziksel ayrımını maksimize edin. Örnekleri, ekipmanı veya reaktifleri önceki aşamada kullanılan alana koymayın. Önceki çalışma alanına dönmek gerekirse, ilk olarak uygun anti-kontaminasyon önlemlerini alın.

7 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 7/12 Test prosedürü Testi yapmadan önce lütfen açıklamalar ve önlemler kısmını okuyun. Not: - Farklı inkübasyon aşamaları boyunca, test stripleri daima aynı oluk içinde kalmalıdır. - İnkübasyon öncesi, kalibre termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin ve su banyosunda tepsiyi yerleştirmeden önce gerekirse sıcaklığı ayarlayın. Kapağı daima kapatın. Prosedürel notlar: - Tam olarak 62 C ± 0.5 C de hibridizasyon ve yıkama inkübasyonu yanlış-pozitif (sıcaklık çok düşük) veya yanlış-negatif/çok zayıf bant oluşumu (sıcaklık çok yüksek) kaçınmak için en önemli aşamalardır. Kapaklı çalkalama su banyosu (80 rpm) sıcaklık değişimlerinin iyi kontrolüne olanak sağlar. Kalibre termometre ile hassas sıcaklık kontrolü gereklidir. - Stripler üzerinde solüsyonların çalkalanması maksimum duyarlılık ve homojen boyamanın elde edilmesinde kritiktir. Çalkalama boyunca, strip yüzeyi tamamen sıvıya batmış olmalıdır. Sıcak hava çalkalayıcısı kullanmayın. - Çalkalamalı su banyosu (hibridizasyon prosedürü) ve orbital, karşılıklı çalkalayıcı veya sallama platformu (renk gelişim prosedürü) tarafından meydana gelen hareketin genliği maksimum duyarlılık ve homojen boyamanın elde edilmesinde kritiktir. Genlik mümkün olduğunca yüksek olmalıdır. Ancak olukların kenarlarından sıvı dökülmesinden kaçınılmalıdır! - Hibridizasyon ve sıkı yıkama için, oluklar su banyosunun çalkalama platformu üstüne yerleştirilmelidir. Su seviyesini oluk yüksekliğinin 1/3 ve 1/2 si arasında ayarlayın. Olukların su üstünde yüzmediğinden emin olun. Su oluklarla direkt temas halinde olmalıdır. - Striplerin inkübasyonu esnasında çalkalama, sıvı ve test stripleri oluk içinde ileri geri hareket edecek şekilde, olukların kenarı üzerinden sıvı dökülmesi olmadan yapılmalıdır. - İnkübasyon boyunca daima su banyosunun kapağını kapalı tutun. - Tepsiyi kapatmayın. - Sıvı tercihen vakum aspiratöre bağlı bir pipetle oluktan aspire edilir. Tepsi, tüm sıvının oluğun bir ucuna akmasına izin verecek açıda tutulur. Her oluğa 2 ml uygun solüsyon ekleyin ve protokolü izleyin. Bu aşamayı test prosedüründe belirtildiği kadar tekrarlayın (dağıtma sırasında Multipipet kullanılması(eppendorf) bu amaç için yararlıdır). Not: Yıkama aşamaları arasında striplerin kurumasına izin vermeyin. Aspire ederken striplerin yüzeyine zarar gelmediğinden emin olun. Tercihen sıvıyı markır çizgisi üstündeki stribin üstünde aspire edin. Tüm stribin solüsyon içine tamamen batırılarak iyice yıkandığından emin olun. Gerektiğinde çalkayıcının hızını değiştirin.

8 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 8/12 Örnekler 1. Mycobacterial 16S-23S rrna spacer amplifiye ürün (10 µl kullanın). 2. Blank amplifiye kontrol örneği (Negatif Kontrol) (10 µl kullanın). Hibridizasyon 1. Çalkalama su banyosunu 62 C ± 0.5 C ye ısıtın. Kalibre termometre kullanarak sıcaklığı kontrol edin ve gerekirse sıcaklığı ayarlayın. Hibridizasyon Solüsyonu ve Sıkı Yıkama Solüsyonunu en az 37 C ye ön ısıtma yapın ve 62 C yi aşmayın. Kullanmadan önce çalkalayın. Tüm kristaller çözülmelidir. 2. Forsepsler kullanarak, tüpten gerekli sayıda INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 stribini çıkartın (örnek başına 1 strip) ve stripte mavi markır çizgisi üstünde kurşun kalemle kimlik numarası yazın. Negatif Kontrol örneği için daima bir strip dahil edin (DNA eklenmeden). 3. Gerekli sayıda test oluğu alın (strip başına bir oluk) ve tepsi içine yerleştirin. 4. Her oluğun üst köşesine10 µl Denatürasyon Solüsyonu pipetleyin. Not: Kullanımdan hemen sonra şişeyi kapatın µl amplifiye biyotinli ürün veya 10 µl Negatif Kontrol örneğini Denatürasyon Solüsyonuna ekleyin ve aşağı yukarı pipetleyerek dikkatle karıştırın. Daima pamuk-takılı steril pipet uçları kullanın. Denatürasyonun oda sıcaklığında 5 dakika devam etmesine izin verin (20-25 C). 6. Önceden ısıtılmış Hibridizasyon Solüsyonunu çalkalayın ve her oluğa denatüre amplifiye ürün için hafifçe 2 ml ekleyin. Pipetleme boyunca komşu olukların kontamine olmamasına dikkat edin. 7. Hemen yukarı bakan mebranın işaretli kenarla oluk içine stribi yerleştirin (mavi Markır Çizgisi). Bu stripler solüsyon içine tamamen batmış olmalıdır. Not: Tek kullanımlk eldivenler giyin ve forsepsler kullanın C ± 0.5 C çalkalama su banyosuna tepsiyi yerleştirin (yaklaşık 80 rpm; Prosedürel notlara bakın), kapağı kapatın ve 30 ± 3 dakika inkübe edin. Sıkı yıkama 1. Hibridizasyon sonrası, su banyosundan tepsiyi kaldırın. 2. Tepsiyi düşük açıda tutun ve tercihen vakum aspiratöre bağlı pipetle oluktan sıvıyı aspire edin. Her oluğa 2 ml önceden ısıtılan Sıkı Yıkama Solüsyonu ekleyin ve oda sıcaklığında 60 ± 30 saniye tepsiyi sallayarak durulayın. Her oluktan solüsyonu aspire edin. 3. Yıkama aşamasını birkez tekrarlayın, ayrıca Prosedürel notlara bakın. 4. Son olarak, solüsyonu aspire edin ve 10 ± 2 dakika için 62 C ± 0.5 C de çalkalama su banyosunda 2 ml önceden ısıtılmış Sıkı Yıkama Solüsyonu içinde her stribi inkübe edin. Su banyosunun kapağını kapatın. İnkübasyon öncesi, kalibre termometre kullanarak su banyosunun sıcaklığını kontrol edin, gerekirse sıcaklığı ayarlayın. Kapağı daima kapatın. Not: Sıkı yıkama inkübasyonu esnasında Durulama çalışma solüsyonu ve Konjugat çalışma solüsyonunu hazırlayın. Renk gelişimi Sonraki bütün inkübasyonlar çalkalayıcı üstünde C de yapılır. İnkübasyonlar esnasında, sıvı ve test stripleri homojen boyama için oluk içinde ileri geri hareket etmelidir.

9 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 9/ ml Durulama çalışma solüsyonu kullanılarak saniye her stribi iki kez yıkayın (Prosedürel notlara bakın). Aspire edin. 2. Her oluğa 2 ml Konjugat çalışma solüsyonu ekleyin ve çalkalanırken 30 ± 3 dakika inkübe edin. Aspire edin. Not: Konjugat inkübasyonu bitmeden önce yaklaşık 10 dakika Substrat çalışma solüsyonunu hazırlayın ml Durulama çalışma solüsyonu kullanılarak saniye her stribi iki kez yıkayın ve 2 ml Substrat Buffer kullanarak birden fazla yıkayın. Aspire edin. 4. Her oluğa 2 ml Substrat çalışma solüsyonu ekleyin ve çalkalanırken 30 ± 3 dakika inkübe edin. Aspire edin. 5. En az 3 dakika, çalkalanırken 2 ml distile suda stripleri iki kez yıkayarak renk gelişimini durdurun. 6. Forsepsler kullanarak, oluklardan stripleri kaldırın ve emici kağıt üstüne yerleştirin. Sonuçları okumadan önce striplerin tamamen kurumasına izin verin. Gelişmiş ve kuru stripleri karanlıkta saklayın. Otomatik test prosedürü LiPA test prosedürü otomasyon için son derece uygundur. Bu nedenle, Auto-LiPA hibridizasyon, sıkı yıkama ve renk gelişim aşamalarını tam olarak işlemek için tasarlanır. Auto-LiPA otomatik ısıtma ve soğutma ile ve otomatik aspirasyon ve pipetleme ile bir walk-away sistem olarak donanımlıdır. Lütfen Auto-LiPA üstünde INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 testini çalışmak için MYCOBV5 programını seçin. Daha fazla bilgi ve spesifik protokoller için, lütfen Fujirebio Avrupa N.V. veya yerel distribütörünüzle temasa geçin. Sonuçlar Okuma Şekil 1 INNO- LiPA MYCOBACTERIA v2 stribi üstünde faklı oligonükleotid problarının pozisyonunu gösterir. Bir çizgi, test prosedürünün sonunda net bir mor/kahverengi bant göründüğünde pozitif düşünülür Şekil 1: INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 stribinde farklı probların konumu. Mavi markır çizgisi oryantasyon için striplerin üstünde çizilir. Kalite kontrol - En üstteki mavi çizgi markır çizgisidir. Bu çizgi plastik okuma kartının konumlandırmasını kontrol eder. - İlk pozitif çizgi Konjugat Kontrol çizgisidir. Bu çizgi tespit prosedürü esnasında reaktif Konjugat ve Substrat çalışma solüsyonunun eklenmesini kontrol eder.

10 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 10/12 Bu daima pozitif olmalıdır ve aynı test çalışmasında her strip üzerinde yaklaşık aynı yoğunluğa sahip olmalıdır. - İkinci çizgi test örneğinde Mycobacterium varlığını tespit eden Mycobacterium cinsi prob çizgisidir (okuma kartı ve veri raporlama kağıdında MYC cinsi) ve diğer pozitif çizgilerin yoğunluğunun bu çizginin yoğunluğuyla kıyaslanması gerektiğinden hibridizasyon için uygun miktarda amplifiye materyalin eklenip eklenmediğini gösterir. - Negatif Kontrol Konjugat Kontrol çizgisi hariç blank olmalıdır. Bu kontaminasyon oluşmadığını gösterir. Sonuçların yorumlanması Açıkça görünür çizginin varlığı pozitif reaksiyon düşünülür. INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 stribinde pozitif olan tüm çizgi numaralarını belirleyin ve INNO- LiPA MYCOBACTERIA v2 yorumlama tablosunu kullanarak Mycobacterium türlerini tanımlayın. Çizgi Prob prob ile taxa reaksiyon 2 MYC cinsi Test örneğinde Mycobacterium varlığı 3 *MTB M tuberculosis kompleksi: M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. africanum 4 *MKA-1 M. kansasii (grup I) 5 *MKA-2 M. kansasii (grup II) 6 *MKA-3 M. kansasii (grup III, V) M. kansasii (grup IV), M. gastri 7 MXE M. xenopi 8 *MGO M. gordonae 9 MGV M. genavense 10 MSI M. simiae 11 *MMU M. marinum + M. ulcerans 12 MCE M. celatum 13 *MAIS M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, MAC, M. malmoense 14 MAV M. avium, M. paratuberculosis, M. silvaticum 15 *MIN-1 M. intracellulare (sequevars Min-A, -B, -C ve -D) 16 *MIN-2 M. intracellulare (sequevar Mac-A) 17 MSC M. scrofulaceum 18 MML M. malmoense 19 MHP M. haemophilum 20 *MCH-1 M. chelonae kompleksi (grup I, II, III, IV, M. abscessus) 21 *MCH-2 M. chelonae kompleksi (grup III, M. abscessus) 22 *MCH-3 M. chelonae (grup I) 23 *MFO M. fortuitum - M. peregrinum kompleksi 24 MSM M. smegmatis * Açıklamalar: - Çizgi 3: Prob çizgisi 3 (MTB) M. tuberculosis, M. bovis, M. microti, M. Africanum ile pozitif reaksiyon gösterir. - Çizgi 4-6: M. kansasii into 5 gruba ayırımı 16S-23S rrna spacer nucleoticle dizilerinden türeyen veriye dayanır. - Çizgi 8: Prob çizgisi 8 (MGO) M. Gordonae ile pozitif tepkir. Zayıf yanlış pozitif reaksiyonun M. simiae izolatları ile görülebileceğini dikkate alın. - Çizgi 11: Prob çizgisi 11 (MMU) M. ulcerans ve M. Marinum türleri ile tepkir. Her iki Mycobacterium türüde aynı spacer dizilerini paylaşır. - Çizgi 13: Prob çizgisi 13 (MAIS) tüm M. avium, M. intracellulare, M. scrofulaceum, ve MAC izolatları için pozitif reaksiyon gösterir. Ayrıca M. malmoense bu probla tepkir.

11 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 11/12 Bu probla zayıf pozitif reaksiyon M. haemophilum izolatları için görülebilir, çizgi 19 üstünde pozitif MHP prob ile tanımlanır. - Çizgi 15 ve 16: Prob çizgisi 15 (MIN-1) M. intracellulare sequevars Min-A, -B, -C ve D için pozitif reaksiyon gösterir. Prob MIN-2 (çizgi 16) M. intracellulare sequevar Mac- A ile tepkir. - Çizgi 20-22: 16S-23S rrna nükleotid dizilerine göre, M. chelonae kompleks izolatları (= M. chelonae ve M. abscessus) dört genotipik kümeye bölünebilir, küme I, II, III, ve IV; M. abscessus küme III içinde dahil edilir. Prob MCH-1 tüm dört kümeyi tespit eden genel M. chelonae-kompleks probdur (M. Abcessus dahil). Prob MCH-2 özellikle M. Abscessus kapsayan küme III ile tepkir. Prob MCH-3 özellikle ağırlıklı olarak insan örneklerinden izole edilen küme I izolatları ile tepkir. Zayıf yanlış pozitif reaksiyonun M. xenopi izolatları ile çizgi 20 ile (MCH-I) görülebileceğini dikkate alın. - Çizgi 23: Prob çizgisi 23 (MFO) M. fortuitum - M. peregrinum kompleksine ait izolatlar için pozitif reaksiyon gösterir. M. smegmatis ayrıca bu probla pozitif tepkir ama çizgi 24 üstünde pozitif MSM probuyla bu kompleksten net şekilde ayrılır. Prosedür sınırlamaları - Bu ürünün kullanımı amplifikasyon ve hibridizasyon tekniklerinde eğitimli personelle sınırlandırılmalıdır. - Belirtilen prosedürlerin dikkatli performansının yanısıra iyi laboratuvar uygulaması spesifik amplifikasyona imkan sağlar. - Polimeraz inhibisyonu testin tamamen hatalı olmasına sebep olabilir! - Tek kullanımlık eldivenlerdeki pudra ve sodyum hipoklorit amplifikasyon üstünde inhibe edici etkiye sahiptir. Test performansı INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 bir Belçika merkezinde (Antwerp) ve INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 üstünde eklenen ya da gelişmiş problar için ağırlıklı olarak bu türleri temsil eden, seçilen bir örnek popülasyonunda dahili olarak değerlendirildi. Toplam 73 mycobacterium türü, 21 non-mycobacterium türü ve 25 media merkezde test edildi. Tüm 73 Mycobacterium zincirleri Mycobacterium cins (MYC) probuyla tepkidi. Bu izolatların 66sı başlangıç testinden sonra referans metoduyla uyumlu sonuçlar verdi, uyumsuzluk testinden sonra 73 izolatın 71i uyumluydu. Kalan 2 uyumsuz örnek M. intracellulare 2 izolattı, MAIS kompleksinin üyeleri olarak doğru şekilde sınıflandırıldı. In-house test edilen 11 mycobacterial türün hepsi Mycobacterium cins (MYC) probuyla tepkidi ve bu zincirlerin 10u referans metoduyla uyumlu yorumlanabilir LiPA sonucu verdi. Genel olarak diagnostik duyarlılık %98.8di. Başlangıç testinden sonra kesinlik %91.6 ve uyumsuzluk testinden sonra %97.6ydı. Amplifikasyon 21 non- mycobacterial türün 20si için elde edildi ve amplifiye materyalin hiçbiri Mycobacterium cins (MYC) probuyla tepkimedi (%100 özgüllük). 25 ortam örneği konjugat kontrol çizgisi hariç strip üzerinde negatifdi.

12 80346 INNO-LiPA MYCOBACTERIA v2 / v0 / KEY CODE: FRI15757 p 12/12 Ticari markalar - INNO-LiPA ABD de olduğu gibi dünya çapında markadır - LiPA Benelüks te tescilli markadır ve dünyanın geri kalanında markadır (ABD dahil) - Auto-LiPA ABD de olduğu gibi dünya çapında markadır Yorumlama tablosu