HT29 VE K562 KANSER HÜCRELERİNDE PROTEİN VE METABOLİTLERİN ANALİZİ İÇİN ÇEŞİTLİ ANALİTİK YÖNTEMLERİN GELİŞTİRİLMESİ

Transkript

1 i T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HT29 VE K562 KANSER HÜCRELERİNDE PROTEİN VE METABOLİTLERİN ANALİZİ İÇİN ÇEŞİTLİ ANALİTİK YÖNTEMLERİN GELİŞTİRİLMESİ Uzm. Kim. Mustafa ÇELEBİER Analitik Kimya Programı DOKTORA TEZİ ANKARA 2013

2 ii T.C. HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ HT29 VE K562 KANSER HÜCRELERİNDE PROTEİN VE METABOLİTLERİN ANALİZİ İÇİN ÇEŞİTLİ ANALİTİK YÖNTEMLERİN GELİŞTİRİLMESİ Uzm. Kim. Mustafa ÇELEBİER Analitik Kimya Programı DOKTORA TEZİ TEZ DANIŞMANI Prof. Dr. Sacide ALTINÖZ ANKARA 2013

3 iii

4 iv TEŞEKKÜR Tez çalışmamın yürütülmesi ve hazırlanması süresince yardımlarını benden hiçbir zaman esirgemeyen, bana her zaman destek olan, bilgilerinden, önerilerinden ve birikimlerinden sürekli yararlandığım çok değerli danışman hocam Sayın Prof. Dr. Sacide Altınöz e sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Tez çalışmamın yürütülmesi sürecinde İspanya Institute of Food Science Research (CIAL)' de bulunduğum süre içerisinde tez çalışmalarıma destek veren ve bilgilerini benden esirgemeyen Sayın Prof. Dr. Alejandro Cifuentes' e ve Dr. Carolina Simó' ya ve tez çalışmama olan yardımlarından dolayı çalışma arkadaşlarıma teşekkür ederim. Tez izleme komitesinde yer alan ve değerli katkılarda bulunan Sayın Prof. Dr. Dilek Ak ve Sayın Prof. Dr. Sedef Kır' a teşekkürlerimi sunarım. Analitik Kimya Anabilim Dalımızın Sayın Öğretim Üyelerine, teorik ve pratik derslerde öğrettikleri değerli bilgiler, bilgi ve birikimime sağladıkları katkılar, gösterdikleri yakınlık, ilgi ve samimiyet için teşekkür ederim. Anabilim Dalındaki çalışma arkadaşlarıma yakın arkadaşlıkları için, ayrıca her zaman yanımda oldukları için ve yardımlarından dolayı teşekkür ederim. Bu günlere gelmemi sağladıkları için sevgili anneme ve babama minnettarlığımı sunarım. Sevgili kardeşlerime her zaman üzerimde hissettiğim destekleri için teşekkür ederim. Değerli eşim Seren' e tez çalışmam süresince bana her zaman destek olduğu ve moral verdiği için teşekkür ederim.

5 v ÖZET Mustafa, Ç. HT29 ve K562 Kanser Hücrelerinde Protein ve Metabolitlerin Analizi için Çeşitli Analitik Yöntemlerin Geliştirilmesi, Hacettepe Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Analitik Kimya Programı Doktora Tezi, Ankara, Günümüzde tedavisi zor ve ölümcül hastalıklardan biri olan kanser, sosyal ve ekonomik anlamda insanlığı tehdit etmektedir. Kanserin önlenmesi ve tedavisi ile ilgili çözüm arayışları halen devam etmektedir ve bu amaçla moleküler düzeyde çalışmalar yapılmaktadır. Bu tez çalışması başlıca iki aşamadan oluşmaktadır; birinci aşamada HT29 kolon kanseri hücreleri ve K562/R ve K562/wt kan kanseri hücreleri üzerinde biberiye (Rosmarinus officinalis L.)' nin antikanser aktivitesi karşılaştırmalı proteomik çalışmalarla moleküler düzeyde incelenmiştir. Bunun için biberiyeden elde edilen polifenolce zengin ekstrelerin kanserli hücre hatlarına in vitro olarak uygulanması sonucu hücre büyümesinde azalmanın görüldüğü işlenmiş gruplar ile kontrol gruplarına ait proteinler iki boyutlu jel elektroforez ile ayrılarak biberiye ekstreleri ile işlem sonrası düşük veya yüksek miktarda ifade edilen proteinler tespit edilmiştir. Tespit edilen proteinlerden en üst düzeyde farklılaşmış olanlar matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaşmalı - uçuş zamanlı kütle spektrometrisi ile analiz edilmiş ve protein veribankaları aracılığıyla tanımlanmıştır. Tanımlanan proteinler, biberiyenin antikanser aktivitesini proteom düzeyinde açıklamak amacıyla kaynaklardaki çalışmalarla ilişkilendirilmiştir. İkinci aşamada ise R programlama dili altında çalışan ve sıvı kromatografisi - kütle spektrometrisi verilerinin değerlendirilmesinde kullanılan bir metabolit profilleme yazılımı olan XCMS, kapiler elektroforez - kütle spektrometrisi çalışmalarına uyarlanmıştır. Bu amaçla K562/R hücre hattına ait metabolitler, kapiler elektroforez - kütle spektrometrisi yöntemi kullanılarak analiz edilmiş ve analiz sonucu elde edilen elektroferogramlar XCMS için çeşitli parametrelerin değerlendirilmesiyle metabolit profillemede kullanılmıştır. Tespit edilen metabolitlerden bazıları kanser ile ilişkilendirilmeye çalışılmıştır. Anahtar Kelimeler : Kanser, Rosmarinus officinalis L., Kütle spektrometrisi, Proteomik, Metabolomik

6 vi ABSTRACT Mustafa, Ç. Development of Various Analytical Methods for Determination of the Proteins and Metabolites from HT29 and K562 Cancer Cells, Hacettepe University Health Sciences Institute Analytical Chemistry Program Doctor of Philosophy, Ankara, Cancer is one of the most dangerous fatal diseases threating the human being both economically and socially. Therefore, the studies are performed on molecular level to promote effective strategies for preventing and controlling cancer. There are mainly two different objectives in this thesis. The first objective is to investigate the molecular mechanism of the anticancer activity of Rosmarinus officinalis L. on HT29 column cancer cells and K562/R and K562/wt leukemia cells. For this purpose, the enrichment extracts of Rosmarinus officinalis L. including polyphenols were appiled on in vitro cultures. The proteins were separated through two dimensional gel electrophoresis and the over- or under-expressed proteins through extracts treatment on cell lines were compared. The proteins found to be changed quantitatively on treated cells and control group were analyzed by matrix assisted laser desorption/ionization - time of flight - mass spectrometry and identified through protein databases. The identified proteins seem to be associated with the anticancer activity according to the literature. The second objective is to adapt the XCMS, which is a metabolite profiling software working under R language for liquid chromatography - mass spectrometry studies, on capillary electrophoresis - mass spectrometry experiments. For this purpose, the metabolite of K562/R cell line were analyzed by using capillary electrophoresis - mass spectrometry and the electropherograms were used on metabolite profiling through the evalution of XCMS parameters for capillary electrophoresis. Some of the identified metabolites were attempted to be associated with the cancer. Key words : Cancer, Rosmarinus officinalis L., Mass spectrometry, Proteomic, Metabolomic

7 vii İÇİNDEKİLER TEŞEKKÜR ÖZET ABSTRACT İÇİNDEKİLER SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ TABLOLAR DİZİNİ iv v vi vii xi xiii xx 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER Genler ve Proteinler Gen ve Genom Kavramının Tanımı Protein ve Proteom Kavramının Tanımı Proteomik: Genomikle İlişkisi ve Bioinformatik Tek Gen - Tek Enzim Hipotezi ve İnsan Genom Projesi ne Uzanan Süreç Az Sayıda Gen Keşfine Karşın Çok Sayıda Protein Varlığı Tek Gen - Birden Fazla Protein: Proteomik Yaklaşımlara Gereksinim Protein Tanınma Metodları Proteomik Teknolojisi Protein Ayırma Metodları Kütle Spektrometrisi Numune Girişi Vakum Sistemi İyonlaştırma Kaynağı Kütle Analizörü Dedektör Boyutlu Jel Elektroforez (2-D Jel Elektroforez) 26

8 viii Proteinlerin İzolasyonu Proteinlerin Çöktürülmesi Numune Hazırlanması İzoelektrik Odaklama (IEF) - 1.Boyut Sodyumdodesilsülfat Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE)- 2. Boyut Proteinlerin Renklendirilmesi İmaj Görüntüleme Proteinlerin Jelden Kesilmesi ve Peptitlere Parçalanması Peptit Dizileme Çalışmaları (Peptide Mass Fingerprint) ve De Novo Dizileme Proteom Analizinde Yaklaşımlar Metabolomik Metabolomik Analiz Teknikleri Yazılım ve Veribankası Desteği LC-MS Verilerinin Değerlendirilmesinde XCMS Kullanımı LC-MS Verisinin XCMS ile Uyumlu Hale Getirilmesi Piklerin Eşleştirilmesi ve Alıkonma Zamanlarının Düzeltilmesi Piklerin Karşılaştırılması İstatistiksel Değerlendirme Yapılması Önemli Pikleri Görüntüleme Metabolik Ağ Modellemesi Hücre Kültürü Çalışmaları GEREÇ VE YÖNTEM Tez Çalışmasında Uygulanan Genel Metodoloji Rosmarinus officinalis L. Ekstrelerinin Hazırlanması Hücre Kültürü Çalışmaları Numune Hazırlama 70

9 ix Proteomik Çalışmalarda Uygulanan Metodoloji Metabolomik Çalışmalarda Uygulanan Metodoloji Proteomik Çalışmalar Proteinlerin Çöktürülmesi Proteinlerin Çöktürme Sonrası Geri Kazanımının Hesaplanması Proteinlerin Miktar Tayini ve Numune Hazırlama Proteinlerin IPG Şeride Yüklenmesi IEF uygulaması (1. boyut) SDS-PAGE Uygulaması (2.boyut) Jellerin Boyanması İmaj Görüntüleme Çalışmaları İmaj Analizi Çalışmaları Jel İçindeki Proteinlerin Peptidlerine Parçalanması ve MALDI-TOF- MS için Hazırlanması Peptid Dizileme ile Proteinlerin Tanımlanması Metabolomik Çalışmalar Metabolitlerin Örnek Çözeltisinden Alınması Metabolitlerin CE-MS ile Analizi için Optimum Koşullar XCMS ile Metabolit Profilleme Çalışmaları BULGULAR Proteomik Çalışmalar Proteinlerin Çöktürme Sonrası Geri Kazanım Değerleri Analiz Sonucu Tespit Edilen Protein Miktarları D Jel Elektroforez Şartlarının Optimizasyonu Farklı Yükleme Tamponlarının Protein Ayrımı Üzerine Etkisi Farklı SDS-PAGE Jellerin Protein Ayrımı Üzerine Etkisi Farklı Boyama Tekniklerinin İmaj Analizi Çalışmaları Üzerine Etkisi Farklı ph Aralığındaki IPG Şeritlerin Protein Ayrımı Üzerine Etkisi 110

10 x Fotoğraflama Süresinin İmaj Analizi Çalışmaları Üzerine Etkisi İmaj Analizi Çalışmaları Metabolomik Çalışmalar Metabolitlerin CE-MS ile Analizi XCMS Parametrelerinin Optimizasyonu Pik Alanı Değerlerinde Varyasyonun Önlenmesi Çalışmaları TARTIŞMA VE SONUÇ Proteomik Çalışmalar Numune Hazırlama D Jel Elektroforez Şartlarının Optimizasyonu İmaj Analizi Çalışmaları Peptid Dizileme ile Proteinlerin Tanımlanması Proteomik Sonuçlarının Yorumlanması Metabolomik Çalışmalar Numune Hazırlama CE-MS ile Metabolitlerin Analizi XCMS Parametrelerinin Optimizasyonu 174 KAYNAKLAR 183 EKLER 202 Ek 1. XCMS ve AStream ile CE-MS verilerin işlenmesinde kullanılan script 202 Ek 2. MALDI-TOF-MS Spektrumları 204 Ek 3. Validasyon Parametreleri 217 ÖZGEÇMİŞ 219

11 xi SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ 2-D Jel Elektroforez İki boyutlu jel elektroforez BML-NMR CE CE-MS CHCA CI DNA DTE DTT E EDTA EI ESI F FAB FD FI FiD FT-MS GC HCNO HMDB HMP HORA HPLC IAA IEF Birmingham Metabolite Library NMR Database Kapiler elektroforez Kapiler elektroforez-kütle spektrometrisi α -siyano-4-hidroksisinamik asit Kimyasal iyonlaştırma Deoksiribonükleik asit Dithioerythritol Dithiothreitol Elektriksel alan Etilendiamintetraasetikasit Elektron çarpışması Elektrosprey iyonizasyonu Moleküle etki eden kuvvet Hızlı atom bombardımanı Alan desorpsiyonu Alan iyonizasyonu Fragment identificator Fourier transform kütle spektrometrisi Gaz kromatografisi İzosiyanikasid Human Metabolome Database İnsan Metabolom Projesi Human blood range validator Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi İodoasetamid İzoelektrik odaklama

12 xii IPG LC m/z MALDI MMCD mrna MS NMR pi q rrna SDS SDS-PAGE SFE TCA TFA TOF TS UPLC UV Vh XRC İmmobilize ph gradient Sıvı kromatografisi Küle/yük Matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaştırma Madison Metabolomics Consortium Database Mesajcı RNA Kütle spektrometrisi Nükleer manyetik rezonans İzoelektrik nokta Molekülün net yükü Ribozomal RNA Sodyumdodesilsülfat Sodyumdodesilsülfat poliakrilamid jel elektroforez Süper kritik akışkan ekstraksiyonu Triklorasetik asit Triflorasetikasit Uçuş zamanlı analizör Termosprey iyonizasyon Ultra performanslı sıvı kromatografisi Ultraviyole Volt x saat X-ışını kristalografisi µ Elektroforetik hareketlilik ν Göç hızı

13 xiii Şekil 1.1. ŞEKİLLER DİZİNİ Hücre içersinde gerçekleşen olaylar sonucu genomdan proteoma artan karmaşık yapı ve hücre içersinde ilgili moleküllerin tahmini sayıları. 5 Şekil 2.1. DNA nın üç boyutlu sarmal yapısı. 7 Şekil 2.2. İki farklı aminoasitteki karboksil ve amino grubunun reaksiyonu sonucu oluşan peptit bağı ve peptit bağı üzerinde aynı düzlemde bulunan atomlar. 9 Şekil 2.3. Proteinlerin birincil, ikincil, üçüncül ve dördüncül yapıları. 10 Şekil 2.4. Tırtıl ve kelebek, bir böceğin yaşam döngüsü içinde protein profilinin değişimine bağlı geçirmiş olduğu morfolojik değişimi. 11 Şekil 2.5. Proteomik teknolojisi 17 Şekil 2.6. Elektrosprey iyonizasyon (ESI) tekniği ile iyon oluşumu. 23 Şekil 2.7. Matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaştırma (MALDI) tekniği ile iyon oluşumu. 24 Şekil 2.8. Uçuş zamanlı kütle analizörü (TOF). 25 Şekil 2.9. Proteinlerin 2-D Jel elektroforez ile ayrımının şematize edilmiş hali ve bir IPG şerit ile SDS-PAGE jel görüntüsü. 28 Şekil Ditiyotreitol (DTT) ve Ditiyoeritritol (DTE) ün kimyasal yapısı. 32 Şekil CHAPS ın kimyasal yapısı. 33 Şekil Proteinlerin ph değişimine bağlı olarak kimyasal yapılarındaki değişmeler. 34 Şekil Akrilamid jel üzerindeki amfolitlerin kimyasal yapısı. 35 Şekil Ticari IPG Şeritler (7-24 cm boyunda ph 3-10 aralığındadır). 36 Şekil Şekil Rehyratation loading tekniği ile numunenin IPG şeride yüklenmesi Proteinlerin poliakrilamid jel gözeneklerinden kütlelerine göre farklı hızlarda ilerlemesi Şekil SDS-PAGE uygulamasının şematize edilmiş hali 39

14 Şekil Jellerden protein kesimi için kullanılan robotik sistem 43 Şekil Peptitlerin parçalanmasıyla oluşan b ve y türü iyonlar. 44 xiv Şekil Kütle spektrometresinin çarpışma hücresinde fragmentlerine ayrılan GLSDGEWQQLNVWGK peptidine ait ilk dört b ve y iyonlarının oluşumu (121). 45 Şekil Bottom-up (A) ve top-down(b) proteomik yaklaşımlar 47 Şekil Şekil LC-MS kullanımında bir metabolitin kolondan elue olması ve kütle spektrometresinde dedekte edilmesine ait şematik gösterim. A ve B şeklinde iki farklı grup için metabolit profilleme çalışmalarında XCMS kullanımı sürecinde izlenen basamaklar Şekil XCMS uygulamasında kullanılan algoritmanın gösterimi. 63 Şekil Bir CE-MS çalışmasında kreatinin piki için orijinal elektroferogram ve XCMS kullanımı sonucu elde edilen düzeltilmiş elektroferogram. 65 Şekil 3.1. Tez çalışması kapsamında HT29, K562/R, K562/wt hücre hatları için gerçekleştirilen karşılaştırmalı proteomik ve K562/R hücre hattı için gerçekleştirilen metabolit profilleme çalışmaları. 72 Şekil 3.2. Numunenin tablaya uygun bir biçimde yayılarak tatbiki. 84 Şekil 3.3. IPG Şerit üzerinden koruyucu bandın çıkarılması. 84 Şekil 3.4. IPG Şeridin numune üzerine yerleştirilmesi. 85 Şekil 3.5. Elektrot kağıtlarının tellerin üzerine yerleştirilmesi ve ıslatılması. 86 Şekil 3.6. IPG Şeritlerin odaklama tablasına yerleştirilmesi. 86 Şekil 3.7. Bio Rad marka PROTEAN IEF Sistemi. 87 Şekil 3.8. IPG Şeritlerin SDS-PAGE tamponunda yıkanması. 88 Şekil 3.9. IPG Şeridin, SDS-PAGE jele yerleştirilmesi, sıcak agaroz ilavesi ve yerinin sabitlenmesi. 89 Şekil SDS-PAGE elektroforez aşamaları 90 Şekil Orbital karıştırıcı 91 Şekil Bio Rad marka Versa Doc Image system görüntüleme cihazı 92

15 Şekil Şekil Şekil 4.1. Şekil 4.2. Amicon Ultra-0.5 ml ultrafiltre için gösterilen kullanım aşamaları Verilerin yüklenmesinde MassTrix parametrelerine ait ekran çıktısı DC TM Protein assay ve Bio-RadTM protein assay kullanılarak elde edilen kalibrasyon eğrileri. Farklı içerikteki yükleme tamponlarının protein ayrımına etkisi: HT29 (C grubu), 200 µl yükleme tamponunda çözülmüş 300 µg protein; IPG şeritlerin (ph 4-7) dengelenmesi için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanıldı, Criterion XT gel Bis-Tris % 4-12 ile ayrım gerçekleştirildi, Commassie mavisi ile jeller 24 saat süresince boyandı, marker olarak PPP All blue kullanıldı. xv Şekil 4.3. Farklı SDS-PAGE jellerin protein ayrımına etkisi: HT29 (C grubu), 200 µl yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş 300 µg protein; IPG şeritlerin (ph 4-7) dengelenmesi için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanıldı, Commassie mavisi ile jeller 24 saat süresince boyandı, marker olarak PPP All blue kullanıldı. 109 Şekil 4.4. Şekil 4.5. Farklı boyama tekniklerinin imaj analizi çalışmaları üzerine etkisi: HT29 (C grubu), 200 µl yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş 300 µg protein; IPG şeritlerin (ph 4-7) dengelenmesi için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanıldı, Criterion XT gel % 4-12 Bis-Tris ile ayrım gerçekleştirildi, marker olarak PPP All blue kullanıldı. Farklı ph aralığındaki IPG şeritlerin protein ayrımı üzerine etkisi: HT29 (C grubu), 200 µl yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş 300 µg protein; IPG şeritlerin dengelenmesi için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanıldı,

16 xvi Şekil 4.6. Şekil 4.7. Şekil 4.8. Şekil 4.9. Şekil Criterion XT gel % 4-12 Bis-Tris ile ayrım gerçekleştirildi, SYPRO Ruby ile jeller 2 saat süresince boyandı, marker olarak ph 4-7 için PPP All blue, ph 5-8 için PPP unstained kullanıldı. Fotoğraflama süresinin imaj görüntüleme çalışmaları üzerine etkisi: HT29 (C grubu), 200 µl yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş 300 µg protein; IPG şeritlerin (ph 5-8) dengelenmesi için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanıldı, Criterion XT gel % 4-12 Bis-Tris ile ayrım gerçekleştirildi, SYPRO Ruby ile jeller 48 saat süresince boyandı, marker olarak PPP unstained kullanıldı. HT29 C grubu 1. örnek için optimum koşullarda ayrımı sağlanan proteinlere ait imaj görüntüleme çalışmaları sonrası elde edilen jel fotoğrafı (imaj analizi çalışmaları için kullanılan kısım çerçevenin içinde kalan alandır). HT29 kolon kanseri hücre hattı için biberiyeden elde edilen polifenollerle işlem görmüş grup (T grubu) ve işlem görmemiş kontrol grubu (C grubu) örnekleri için elde edilen jel görüntüleri. K562/R kan kanseri hücre hattı için biberiyeden elde edilen polifenollerle işlem görmüş grup (T grubu) ve işlem görmemiş kontrol grubu (C grubu) örnekleri için elde edilen jel görüntüleri. K562/wt kan kanseri hücre hattı için biberiyeden elde edilen polifenollerle işlem görmüş grup (T grubu) ve işlem görmemiş kontrol grubu (C grubu) örnekleri için elde edilen jel görüntüleri Şekil PDQuest yazılımı tarafından verilen sanal jel haritaları. 118 Şekil Şekil PDQuest yazılımı ile K562/R hücre hattı için T ve C gruplarına ait nicel anlamda farklılaşan spotların tespitinde kümelerin oluşturulması. HT29 hücre hattında T ve C gruplarında nicel anlamda farklılaşan spotlar (Yeşil renk, T grupları için yüksek miktarda ifade edilen; kırmızı renk ise C gruplarında yüksek miktarda

17 xvii Şekil Şekil ifade edilen proteinleri işaret etmektedir). K562/R hücre hattında T ve C gruplarında nicel anlamda farklılaşan spotlar (Yeşil renk, T grupları için yüksek miktarda ifade edilen; kırmızı renk ise C gruplarında yüksek miktarda ifade edilen proteinleri işaret etmektedir). K562/wt hücre hattında T ve C gruplarında nicel anlamda farklılaşan spotlar (Yeşil renk, T grupları için yüksek miktarda ifade edilen; kırmızı renk ise C gruplarında yüksek miktarda ifade edilen proteinleri işaret etmektedir) Şekil HT29 hücre hattı için 1106 numaralı spot. 122 Şekil HT29 hücre hattı için 1604 numaralı spot. 122 Şekil HT29 hücre hattı için 1701 numaralı spot. 123 Şekil HT29 hücre hattı için 2811 numaralı spot. 123 Şekil HT29 hücre hattı için 3102 numaralı spot. 124 Şekil HT29 hücre hattı için 4007 numaralı spot. 124 Şekil HT29 hücre hattı için 4102 numaralı spot. 125 Şekil HT29 hücre hattı için 5307 numaralı spot. 125 Şekil HT29 hücre hattı için 7003 numaralı spot. 126 Şekil HT29 hücre hattı için 8001 numaralı spot. 126 Şekil HT29 hücre hattı için 8303 numaralı spot. 127 Şekil HT29 hücre hattı için 8701 numaralı spot. 127 Şekil K562/R hücre hattı için 0812 numaralı spot. 128 Şekil K562/R hücre hattı için 2610 numaralı spot. 129 Şekil K562/R hücre hattı için 2714 numaralı spot. 129 Şekil K562/R hücre hattı için 3108 numaralı spot. 130 Şekil K562/R hücre hattı için 4611 numaralı spot. 130 Şekil K562/R hücre hattı için 4712 numaralı spot. 131 Şekil K562/R hücre hattı için 6411 numaralı spot. 131 Şekil K562/R hücre hattı için 7219 numaralı spot. 132

18 xviii Şekil K562/R hücre hattı için 7302 numaralı spot. 132 Şekil K562/R hücre hattı için 7431 numaralı spot. 133 Şekil K562/wt hücre hattı için 3604 numaralı spot. 133 Şekil K562/wt hücre hattı için 3607 numaralı spot. 134 Şekil K562/wt hücre hattı için 4601 numaralı spot. 134 Şekil K562/wt hücre hattı için 5602 numaralı spot. 135 Şekil K562/wt hücre hattı için 8639 numaralı spot. 135 Şekil 4.43 Şekil Şekil Şekil Şekil 5.1. Şekil 5.2. Şekil 5.3. K562/R hücre hattı için T ve C gruplarına ait toplam iyon elektroferogramları Farklı XCMS algoritmaları ve parametreleri kullanılarak K562/R hücre hattı için %95 güven seviyesinde tespit edilen olası metabolitlere ait pik sayıları. XCMS tarafından K562/R hücre hattı için göç zamanları düzeltilerek tespit edilen bazı metabolitlere ait elektroferogramlar-1. XCMS tarafından K562/R hücre hattı için göç zamanları düzeltilerek tespit edilen bazı metabolitlere ait elektroferogramlar-2. Rosmarinus officinalis L. nin doğal florasında çekilmiş fotoğrafı. HT29 hücre hattı için gruplar arasında %99 güven seviyesinde en az 2 kat farklılaştığı tespit edilen spotların intensite x alan değerlerini gösterir çubuk grafikler (Kırmızı renk C grubunu, yeşil renk ise T grubunu ifade etmektedir, grafiklerin altında belirtilen numaralar spotlara aittir). Kolon kanserinde katepsin ifadesindeki artışa bağlı olarak hayatta kalma ihtimali Şekil 5.4. Arabidopsis thaliana kökleri ve yapraklarında LC/MS kullanılarak MZmine ve XCMS kullanılarak tespit edilen olası metabolit pikleri (163). 175

19 Şekil 5.5. Şekil 5.6. Farklı algoritmalarla tespit edilen N-Asetil-L-sitrülin pikinin integrasyonu. XCMS ile K562/R hüce hattında tespit edilen metabolitlere ait göz zamanı değerleri arasındaki varyasyonları düzeltilmesi (göç zamanı düzeltilen (a, c) ve orjinal elektroferogramlar (b, d)). xix

20 xx TABLOLAR DİZİNİ Tablo 2.1. Çeşitli iyonlaştırma kaynakları ve sınıflandırılması. 22 Tablo 2.2. Protein boyama tekniklerinin karşılaştırılması. 41 Tablo 2.3. Metabolom analizlerinde kullanılan bazı terimler. 51 Tablo 2.4. Metabolomik çalışmalarda kullanılan yazılımlardan bazıları. 55 Tablo 2.5. Metabolomik çalışmalarda kullanılan veribankalarından başlıcaları. 57 Tablo 3.1. Proteomik çalışmalarda kullanılan kimyasallar. 73 Tablo 3.2. Proteomik çalışmalarda kullanılan hazır tampon çözeltiler. 75 Tablo 3.3. Proteomik çalışmalarda kullanılmak üzere hazırlanan çözeltiler. 76 Tablo 3.4. Proteomik çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler. 78 Tablo 3.5. Proteomik çalışmalarda kullanılan cihazlar ve ekipmanlar 79 Tablo 3.6. Proteomik çalışmalarda kullanılan yazılım ve veribankası. 80 Tablo 3.7. İzoelektrik odaklama için uygulanan program. 87 Tablo 3.8. Metabolomik çalışmalarda kullanılan kimyasallar. 96 Tablo 3.9. Metabolomik çalışmalarda kullanılmak üzere hazırlanan çözeltiler. 97 Tablo Metabolomik çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler 97 Tablo Metabolomik çalışmalarda kullanılan cihazlar ve ekipmanlar. 98 Tablo Metabolomik çalışmalarda kullanılan yazılım ve veribankası. 98 Tablo 4.1. HT29, K562/R ve K562/wt hücre hatları için protein miktarları. 106 Tablo 4.2. Tanımlanan kümeler içine giren toplam spot sayısı. 117 Tablo 4.3. HT29 kolon kanseri hücre hattı için tanımlanan proteinler 136 Tablo 4.4. K562/R kan kanseri hücre hattı için tanımlanan proteinler 137 Tablo 4.5. K562/wt kan kanseri hücre hattı için tanımlanan proteinler 138 Tablo 4.6. Farklı algoritmalar ile K562/R hücre hattı için tespit edilen toplam pik sayıları. 141 Tablo 4.7. XCMS için m4 ve w3 parametreleri ile belirlenen piklere farklı 142

21 xxi Tablo 4.8. Tablo 4.9. yaklaşımlar kullanılarak normalizasyon yapılması sonucu elde edilen pik sayıları. K562/R hücre hattı için XCMS ile metabolit profilleme çalışmaları sonucu tespit edilen metabolitler (p<0.05, n=5) K562/R hücre hattı metabolit profilleme çalışmaları sonucu tespit edilen metabolitlerin açık isimleri (p<0.05, n=5)

22 1 1. GİRİŞ Her canlının hücrelerinin içine yerleştirilmiş genetik program olan genom, DNA nın taşıdığı genetik bilgiyi ifade eder ve bir organizmanın kromozomlarında bulunan genetik şifrenin tamamını simgeler. Genom terimi ilk kez 1920 yılında Alman botanikçi Hans Winkler tarafından önerilmiştir (1); ancak İnsan Genom Projesi nin başladığı yıllara dek pek kullanılmamıştır. Genomdaki bilginin ortaya çıkarılması ile ilgili tüm çalışmalar genomik olarak adlandırılmaktadır. Genetikçi Thomas Roderick, bu terimi genomun haritalanması ve karekterizasyonunu tanımlamak için önermiştir (2) te Nature dergisinde yayınlanan Nükleik Asitlerin Moleküler Yapısı: Deoksiriboz Nükleik Asit İçin Bir Yapı isimli makale ile DNA nın çift sarmal yapısı hakkında ilk bilgiye ulaşılmıştır li yıllarda başlayan çalışmaların devamında 1990 lı yıllara gelindiğinde İnsan Genom Projesi başlatılmıştır. Bu projede ilk amaç; insan DNA sındaki genleri tanımlamak, günümüzde tedavisi olmayan genetik hastalıklara yatkınlığı belirlemek, ilgili genlerin yerlerini, yapılarını aydınlatarak tanı ve tedaviyi olanaklı kılmaktır (3). İnsan Genom Projesi 2003 yılında tamamlanmıştır ve bu projenin sonucunda fiziksel özellikleri belirleyen öğelerin yanısıra çeşitli hastalıkların da genler aracılığıyla ortaya çıktığı anlaşılmıştır (4,5). İnsan genom projesi kapsamında gerçekleştirilen genomik çalışmalar ile insan genomundaki bütün yapısal ve işlevsel fonksiyonları kodlayan genler teker teker tanımlanarak bu genlerin birbirleri ve çevre ile etkileşim ve ilişkisi bütünsel olarak ortaya çıkarılmaya çalışılmıştır (6). Proje sonunda elde edilen bilgi, başlangıçta düşünüldüğü şekilde bilgisayar veribankalarına işlenmiş ve kullanıma açılmıştır (7,8). İnsan Genom Projesi nin tamamlanması dünya kamuoyunda hastalıkların teşhisinde yeni ufuklar açılacağı ve hastalıkların tedavisi ile ilgili yeni ilaçların geliştirileceği yönünde yüksek beklentilerin oluşmasına neden olmuştur. Bunun başlıca sebebi proje sonucunda kronik hastalıklarla ilgili genlerin ortaya çıkarıldığı düşüncesidir. Ancak; kronik hastalıkların oluşmasında genlerin etkisi tahmin edilenden azdır ve ayrıca tek başına genomik çalışmalar ile organizmanın, tanımlı geni hangi oranda kullandığı hakkında bilgi elde edilmesi mümkün değildir. Ortada

23 2 olan gerçek, bir genin birden fazla biyolojik işleve sahip farklı proteinleri kodlaması ve bu proteinlerin translasyon sonrası değişimlere uğramasıdır. Çoğu durumda translasyon sonrası değişimler (posttranslasyonel modifikasyonlar) gen işlevinden bağımsız olarak ilerlemektedir (9). Genden proteine geçişin ara basamağı olan translasyon (çevrim), traskripsiyon sonrası oluşan mrna daki koda uygun olarak ribozomlarda gerçekleştirilen polipeptid sentezi sürecidir. Proteinlerin fonksiyonlarında önemli olan etmenler; hücredeki yerleri, fizyolojik uyaran sonucu konumlarında meydana gelen değişiklikler ve translasyon sonrası meydana gelen modifikasyonlardır. Bu bilgilere ise ancak proteomik çalışmalar ile ulaşılabilmektedir (9,10). Dolayısıyla sadece genomik çalışmaların hastalıkların önlenmesinde, teşhisinde ve tedavisinde yeterli olmadığı görülmüştür. Bugün ortada olan gerçek, proteinlerin oluşturduğu karmaşık ağın taşıdığı bilginin genomik bilgiden daha fazla olduğu ve bu bilginin sadece genomik bilgiden yola çıkılarak aydınlatılamayacağıdır (11). Ancak proteinlerin tanımlanmasıyla, hücre içinde ve hücreler arasında gerçekleşen kimyasal tepkimelerin anlaşılabileceği, hücrelerin canlılıklarını nasıl korudukları, hücre yapısının nasıl geliştiği, hücre çeşitliliğinin nasıl sağlandığı gibi soruların detaylı bir şekilde yanıtlanabileceği anlaşılmıştır (12). Proteom; protein ve genom sözcüklerinin birleştirilmesinden türetilmiş bir sözcüktür. Proteom kelimesi ilk kez 1994 yılında Siena daki iki boyutlu elektroforez toplantısında Avustralyalı araştırmacı Marc Wilkins tarafından önerilmiş ve kabul görmüştür. Proteom, genom tarafından kodlanan proteinleri tanımlar. Bir hücrenin, organın veya organizmanın belirli bir zaman ve mekanda sahip olduğu (izoformlar, polimorfizmler ve sentez sonrası değişimler de dahil olmak üzere) tüm proteinlerin bir toplamıdır ve sadece genler tarafından kodlanan polipeptid yapıları değildir. Mekan terimi farklı proteinlerin hücrenin farklı bölümlerinde ve farklı hücre tiplerinde ifadesini, zaman terimi ise farklı gelişim evrelerinde farklı çevresel koşullar, yaşlılık ve çeşitli hastalıklar gibi süreçleri ifade eder (13). Proteom analizine proteomik denilmektedir. Proteomik; belli bir zamanda belli bir yerde bulunan tüm proteinlerin yapılarını, yerleşimlerini, miktarlarını,

24 3 translasyon sonrası değişimlerini, diğer proteinlerle ve makro moleküllerle olan etkileşimlerini inceler (14). Bir organizma, hücre döngüsünün farklı evrelerinde ve farklı çevre koşullarında farklı protein ifadelerine (ekspresyonlarına) sahiptir. Sabit bir yapı olan ve bir organizma için çok iyi tanımlanabilen genomun aksine proteom, hücreden hücreye farklılık gösterir ve iç ve dış uyaranlara yanıt olarak biyokimyasal etkileşimler aracılığı ile sürekli bir değişim halindedir. Buna karşın, genom bir organizmanın kromozomlarında bulunan genetik şifrenin tamamını simgeler ve sabittir. Sonuçta gen dizisi protein aktivite ve fonksiyonu için gerekli olan çevrim sonrası değişimler (proteinlerin hücre içinde doğru yerleşim ve fonksiyonları için sentez sonrası değişikliklere maruz kalması olayı) hakkında bilgi vermemektedir. Oysa fonksiyon gösteren birçok protein modifiye formda olup, 150 den fazla translasyon sonrası modifikasyon bilinmektedir. Tüm bunlara ilave olarak; genom, makromoleküler etkileşmeler, biyofiziksel özellikler, hastalık koşulları, üç boyutlu yapı ve fonksiyon işlevleri gibi olguları protein düzeyinde açıklayamaz (14,15). Proteom analiziyle hastalıkların gelişim süreçlerini de kapsayan birçok biyolojik olayda proteinlerin yapısal ve işlevsel çeşitliliği arasında ilişki kurulabilmektedir. Örneğin; ilaç etkin maddeleri, toksik ajanlar veya enfeksiyonlar gibi pek çok dış faktör uyarısı sonucu sağlıklı ve hastalıklı durumda farklılaşan proteinler belirlenebilmektedir. Ayrıca, spesifik hastalıklar sonucu proteinlerin seviyelerinde ve yapısal özelliklerindeki değişim de aydınlatılabilmektedir. Hücrelerin fonksiyonları, genler ve mrna lardan ziyade direk olarak proteinler ile düzenlenir (15). Bir hücre veya canlıdaki metabolizmanın tümüne metabolom denilmektedir. Metabolomik, metabolomdaki küçük moleküllü metabolitlerin yüksek hassasiyette analitik teknikler kullanılarak saptanması, tanımlanması ve miktarının belirlenmesidir. Metbolitlerin düzeyleri hücresel fonksiyonların işleyiş bilgilerini yansıtır ve bunun sonucu olarak genetik veya çevresel değişikliklere bağlı hücrenin veya dokunun fenotipini tanımlar. Fenotip, genetik ve çevresel etkenlerin oluşturduğu özelliklerin canlının dış görünüşündeki yansımasıdır. Fenotip çoğunlukla genler tarafından

25 4 belirlenir ancak bazı koşullarda çevresel etkenler, fenotipin genotipe yüzde yüz uymasını engelleyebilir. Klinik fenotipi belirleyen bilgi hücrede oluşan metabolitlerde saklıdır (14). Transkriptom ve proteom gibi metabolom da hücresel fonksiyonlara bağımlı olup her bir metabolomun seviyesi hücre, doku ya da organizmanın fizyolojik, gelişimsel ve patolojik durumuna göre değişkenlik gösterir. Ancak en önemli fark, mrna ve proteinlerin aksine genler ile metabolitler arasında doğrudan bir bağlantının kurulmasının zor ya da imkansız olmasıdır (16). Genomik ve proteomik ne olabileceğini metabolomik ise gerçekte ne olduğu bilgisini verir. Tüm metabolitlerin ileri analitik ve kemometrik yöntemler kullanılarak profillenmesi yani tanımlanmasına metabolit profilleme çalışmaları denilmektedir. Metabolit profilleme çalışmaları ile hasta, tedavi görmüş ve sağlıklı gruplar arasında nicel anlamda metabolit miktarlarının karşılaştırılması yapılabilmektedir. Ayrıca hastalıkların teşhisi, ilerleyişini inceleme, tedaviye cevabının belirlenmesi ve yeni tedavi olanaklarının değerlendirilmesi de bu çalışmalar kapsamındadır (17). Günümüzde herhangi bir hastalığın moleküler mekanizmasının aydınlatılmasında yalnızca genom analizinin ya da yalnızca proteom analizinin yeterli olmadığı, bunun yerine metabolomik çalışmaları da içine alan bütünsel bir değerlendirmenin akılcı olduğu ve kesin sonuç verdiği bilinmektedir (18,19). Genomik, transkriptomik, proteomik ve metabolomik bilimlerinin ilgi alanları Şekil 1.1 de verilmiştir. Genler ve çevresel etkenler canlının dış görünüşüne yansıyan özellikleri yani fenotipini belirler.

26 5 Şekil 1.1. Hücre içerisinde gerçekleşen olaylar sonucu genomdan proteoma artan karmaşık yapı ve hücre içersinde ilgili moleküllerin tahmini sayıları (20). Foodomik olarak isimlendirilen yaklaşım; genomik, transkriptomik, proteomik ve metabolomik teknikleri de içine alan, ileri analitik teknikler kullanarak gıdaların insan sağlığı üzerine etkilerini moleküler düzeyde incelemeye çalışan yeni bir çalışma sahasıdır (21-24). Beslenme tarzı ile kansere yakalanma riski arasında bağlantı kurmaya yönelik çalışmalar ilk olarak 80 li yıllarda ciddi anlamda merak uyandırmaya başlamış ve daha sonraki yıllarda hızlı bir şekilde artış göstermiştir (25-29). Özellikle son zamanlarda yapılan çalışmalar Akdeniz tarzı beslenmenin kanser riskini azaltmada olumlu sonuçlar verdiğine işaret etmektedir (30-33). Bu tez çalışmasının amacı doğrultusunda gerçekleştirilen çalışmalar iki aşamadan oluşmaktadır. Birinci aşamada Akdeniz tarzı beslenmede öne çıkan baharatlardan birisi olan biberiye (Rosmarinus officinalis L.) nin HT29 kolon kanseri ve K562/R ve K562/wt kan kanseri hücre hatları üzerine etkisi moleküler düzeyde araştırılmıştır. Bu amaçla foodomik bir yaklaşım sergilenerek HT29 kolon kanseri, K562/R ve K562/wt kan kanseri hücre hatları biberiyeden elde edilen ekstrelerle işlem gördükten sonra proteom düzeyindeki değişimler işlem görmemiş kontrol grupları ile karşılaştırılmıştır. Böylece biberiyenin kolon ve kan kanseri üzerine etkisi proteomik çalışmalarla incelenmiştir. İkinci aşama ise birinci aşamadan bağımsızdır. Bu aşamada K562/R hücre

27 6 hatları üzerinde CE-MS (kapiler elektroforez-kütle spektrometresi) tekniği kullanılarak ve XCMS isimli bilgisayar programı yardımıyla kemometrik bir yaklaşım sergilenerek metabolit profilleme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Böylece XCMS in CE-MS ile gerçekleştirilen metabolit profilleme çalışmalarında kullanımı, kapasitesi ve sağladığı olanaklar değerlendirilmiştir. Ayrıca K562/R hücre hattı için metabolitler profillenerek tespit edilmiştir. Kanserle ilişkili olan metabolitler kaynaklardaki çalışmalar ile karşılaştırılarak ilişkilendirilmiştir ve XCMS in CE-MS ile metabolit profillemede ileride yapılacak çalışmalar için kullanılması önerilmiştir. Böylece; bu tez çalışması ile antikanser aktivitesi bildirilen biberiye bitkisinin kolon ve kan kanseri üzerine iyileştirici etkisi ilk kez proteomik çalışmalarla moleküler düzeyde incelenmiştir. Ayrıca; R progralama dili altında çalışan ve LC-MS için geliştirilen XCMS yazılımının, CE-MS çalışmalarına adaptasyonu, kaynaklarda bulunmayan kapsamlı bir parametre değerlendirmesi ile gerçekleştirilmiştir.

28 7 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Genler ve Proteinler Gen ve Genom Kavramının Tanımı Deoksiribonükleik asit veya kısaca DNA, tüm organizmalar ve bazı virüslerin canlılık işlevleri ve biyolojik gelişmeleri için gerekli olan genetik bilgiyi taşıyan bir nükleik asittir. Kimyasal olarak DNA iki uzun polimerden oluşur. Bu polimerlerin omurgaları, ester bağları ile birbirine bağlanmış şeker ve fosfat gruplarından meydana gelir. Bu iki iplik birbirlerine ters yönde uzanırlar. Her bir şeker grubuna nükleobaz olarak adlandırılan dört tip molekülden yani adenin (A), guanin (G), sitozin (C) ve timinden (T) biri bağlanır ve böylece nükleotitler olarak adlandırılan birimler oluşur (34). DNA omurgası boyunca nükleobazların oluşturduğu dizi genetik bilgiyi kodlar. Bu genetik bilgileri içeren DNA parçaları ise gen olarak adlandırılır. Gen, genom dizisinde yeri tanımlanabilen, düzenleyici ve fonksiyonel bölgeleri olan, kalıtımda rol oynayan işlevsel birimdir (35). DNA nın yapısı Şekil 2.1 de verilmiştir (36).!"#$%&'()$(*+ 01(./.+ 2/3&)/.+ 4/5/.+,-%./.+ 6%#%*78&9:(3+ '(;<+!"#$%&=3+ >?+8&9:(3+ 2?+6%#%*+ Şekil 2.1. DNA nın üç boyutlu sarmal yapısı.

29 8 Genom, bir organizmanın DNA' sında kayıtlı genetik bilgilerin tamamına verilen isimdir ve organizmanın kromozomlarında bulunan genetik şifrelerin tamamını simgeler. Kromozom, DNA nın histon proteinleri etrafına sarılmasıyla yoğunlaşarak oluşturduğu, canlılarda kalıtımı sağlayan genetik birimdir. Kromozomların sayısı canlı türlerinde değişiklik gösterir. Örneğin sirke sineğinde 8, kurbağada 26, farede 42, köpekte 78 kromozom vardır. İnsanın kromozom sayısı ise 46'dır. Genlerin kromozom üzerindeki sırası ve sayısı organizmalara göre belli bir düzen ve sıra içindedir. Bu uyum türler için sabittir ve değişmez. Ancak, cinsler veya familyalar arasında farklılıklar oluşabilir. Örneğin, en büyük insan kromozomu olan 1 numaralı kromozom 3141 gen içerir ve yaklaşık olarak 220 milyon baz çifti uzunluğundadır (37,38). Genler; hücrelerin ve dolayısıyla da canlıların yaşamları için gerekli olan proteinlerin, enzimlerin, diğer makro ve mikromoleküllerin kodlarını taşıyarak, kalıtsal karakterlerinin nesilden nesile aktarılmasını sağlarlar. Ayrıca; canlılardaki bütün, genetik, biyokimyasal ve fizyolojik olayların denetimini ve doğru şekilde ilerlemesini kontrol ederler. Nükleik asit dizilerinden oluşan genler belli peptitlerin bilgilerini kod birimleri halinde taşımaktadırlar. Kod kelimesi, kodon olarak adlandırılan üç nükleotitlik diziler ile amino asitler arasındaki ilişkiyi tanımlamaktadır. Bir nükleik asit dizisindeki üçlü kodon genelde tek bir amino asidi belirler ancak bazı durumlarda farklı konumlarda bulunan aynı kodon üçlüsü bulunduğu yere bağlı olarak iki farklı amino asidi de kodlayabilmektedir. Her protein kodlayıcı gendeki baz dizisi transkripsiyon 1 yoluyla DNA'ya benzer özellikleri olan bir RNA polimerine yazılır, bu moleküle mesajcı RNA veya mrna denir. Mesajci RNA'daki baz dizisi de, sırası gelince, ribozomlar 2 üzerinde translasyon (çevrim) 3 denen süreç ile bir amino asit dizisine, yani bir proteine dönüştürülür (39). 1 Transkripsiyon (yazılma veya yazılım), DNA'yı oluşturan nükleotit dizisinin RNA polimeraz enzimi tarafından bir RNA dizisi olarak kopyalanması sürecidir. Başka bir deyişle, DNA'dan RNA'ya genetik bilginin aktarımıdır. DNA'da bulunan genetik bilginin (bir mrna aracılığıyla) bir protein veya peptit dizisine çevirisinin ilk aşamasıdır. 2 Ribozom, ribozomal RNA (rrna) ve proteinlerden oluşmuş hücrenin protein sentez yerleridir. Burada rrna, ribozomun protein senteziyle ilişkili katalitik fonksiyonundan sorumludur. 3 Translasyon, transkripsiyon sonucu oluşan mrna' lardaki koda uygun olarak ribozomlarda gerçekleştirilen aminoasit zinciri (polipeptit) sentezi sürecidir, daha sonra üretilen amino asit zinciri uygun bir şekilde katlanarak etkin bir protein haline gelir.

30 Protein ve Proteom Kavramının Tanımı Proteinler, 20 farklı aminoasitten oluşmuş lineer polimerlerdir. Tüm aminoasitlerin alfa karbonuna bir karboksil ve amin grubu ve bir yan zincir bağlıdır. Aminoasitler içinde bir tek prolin yan zincirinin amino grubuyla bir halka oluşturması yüzünden farklılık göstermektedir. Bir polipeptit zincirdeki aminoasitler bir dehidrasyon tepkimesi sonucu oluşan bir amino asidin α-karboksil karbonu ile bir başka amino asidin α-amino azotu arasında oluşan C N bağları yani peptit bağı ile birbirlerine bağlanırlar. Peptit bağının uzunluğunun C=N çift bağının uzunluğundan büyük ve C N tek bağının uzunluğundan küçük olması nedeniyle peptit bağının kısmi çift bağ olduğu kabul edilir. Kısmi çift bağ özelliği, peptidin ekseni etrafında dönmesini engeller ve peptit bağı oluşumuna katılan gruplara ait atomların (C, O ve N) bir düzlemde bulunmasına sebebiyet verir; dolayısıyla peptit bağı rijit ve düzlemseldir (Şekil 2.2).!"#$%&'()*& Şekil 2.2. İki farklı aminoasitteki karboksil ve amino grubunun reaksiyonu sonucu oluşan peptit bağı ve peptit bağı üzerinde aynı düzlemde bulunan atomlar. Proteinlerde birincil (primer), ikincil (sekonder), üçüncül (tersiyer) ve dördüncül (kuarterner) yapı olmak üzere dört yapı tanımlanır. Bir proteinin birincil yapısı, karakteristik ve genetik olarak tespit edilmiş olan aminoasit dizilişidir. Belirli türde, belirli sayıda, belirli diziliş sırasında aminoasitlerin birbirlerine peptit bağlarıyla bağlanarak oluşturdukları bir polipeptit zinciri biçimindeki yapısıdır. Bir proteinin ikincil yapısı, yarı sertleşmiş polipeptit zincirlerinin bükülmeler ve katlanmalarla oluşturdukları alfa sarmal ve beta yaprak biçimindeki yapılarıdır. Bir proteinin ikincil yapısının oluşmasını ve sürdürülmesini sağlayan, birincil yapı ile

31 10 meydana gelen polipeptit omurgasının özelliği ve hidrojen bağlarıdır. Üçüncül yapı, tek bir protein molekülünün üç boyutlu yapısıdır. Alfa sarmal ve beta yapraklar bir arada ve düzenli şekilde katlanırlar. Bu katlanma hidrofobik kalıntıların sudan uzaklaştırılması tarafında yönlendirilir ancak yapının kararlı olabilmesi için tuz köprüleri, hidrojen bağları, disülfür bağları ve yan zincirlerin sıkı istiflenmesi gibi etkileşimlere ihtiyaç vardır. Posttranslasyonel modifikasyonlar (çevrim sonrası değişimler) 1 üçüncül yapı aşamasında gerçekleşmektedir. Dördüncül yapı birkaç protein veya polipeptit zincirinin bir araya gelmesinden meydana gelen büyük bir toplaşmadır. Dördüncül yapı, üçüncül yapıyı stabilize eden, non-kovalent bağlar ve disülfid bağları tarafından kararlı hale getirilir (34). Proteinlerin birincil, ikincil, üçüncül ve dördüncül yapıları Şekil 2.3 de şematize edilmiştir (40).!"#"$%"&'()*+',-"$%"&'()*+' 456$%6&'' ()*+' 123)'()*#)-' )&.)'/)#0)&' 78#96$%6&' ()*+' Şekil 2.3. Proteinlerin birincil, ikincil, üçüncül ve dördüncül yapıları. Proteom, genom tarafından kodlanan proteinleri tanımlar ve hücreden hücreye farklılık gösterir. Hastalık durumlarında, stres altında hatta günün saatine bağlı olarak bile proteom genomun aksine değişiklik göstermektedir. 1 Bir proteinin translasyonundan sonra kimyasal değişime uğramasıdır. Çoğu protein için bu değişimler, protein biyosentezinin son adımlarındandır.

32 Proteomik: Genomikle İlişkisi ve Biyoinformatik Proteomik; belli şartlar altında bir organizmada, belli bir dokuda ve hücre içerisinde genler tarafından kodlanan tüm proteinlerin analiz edilmesi, tanımlanması ve gösterdikleri işlevleriyle ilgilenir. Bu sebeple proteomik, genomik ile doğrudan ilişkilidir; çünkü genomik, bir hücre veya organizmadaki genleri anlamaya çalışırken bu genlerin proteinleri nasıl kodladığı ile de ilgilenmektedir. Biyoinformatik ise bir organizmada elde edilen genomik ve proteomik verilerinin bilgisayar ortamında kayıt altında tutulması, analiz edilmesi ve yönetilmesidir. Genomik statiktir; yani organizmada hücre içersindeki DNA dizilimi daima sabit kalmaktadır. Proteomik ise genomikin tersine dinamiktir; çünkü protein içeriği gelişme süresince bir hücre türünden diğerine değişiklik göstermektedir. Söz edilen statik ve dinamik olma olgusunun çarpıcı bir örneğini tırtıl ve kelebeğe bakarak değerlendirmek gerekirse, her ikisinin de aynı genoma sahip oldukları halde farklı proteomlara sahip oldukları ve bu sebeple birbirlerinden farklı morfolojilerde ve dolayısıyla farklı kabiliyetlerde oldukları gerçeği akla gelmektedir (Şekil 2.4) (41). Tırtıl Kelebek Şekil 2.4. Tırtıl ve kelebek, bir böceğin yaşam döngüsü içinde protein profilinin değişimine bağlı geçirmiş olduğu morfolojik değişimi. Proteinlerin kodlanması sırasında birbirini izleyen süreç ve posttranslasyonel modifikasyonlar protein ile gen sayısı arasındaki bu büyük farkı oluşturarak protein profilinde değişikliklere sebep olmaktadır (42).

33 Tek Gen - Tek Enzim Hipotezi ve İnsan Genom Projesi ne Uzanan Süreç Canlıların özelliklerinin kalıtsal olduğu bilinci tarih öncesi çağlardan beri bitki ve hayvanlar üzerinde yapılan gözlemlerle anlaşılmıştır; ancak 1866 yılında Mendel, sebebini ve fiziksel temelini açıklayamadıysa da çeşitli kalıtsal özelliklerin birbirinden bağımsız birimler olarak aktarıldığını bildirmiştir. Günümüzde bu kalıtım birimlerine gen adı verilmektedir. Genler DNA da belirli bölgelere karşılık gelmektedir. Nükleik asitler, bütün canlı hücrelerde ve virüslerde bulunan nükleotid biriminden oluşmuş polimerlerdir ve DNA daki her iplikçikteki nükleotitler birbirini tamamlar. Bu özellik genetik bilginin kopyalanması ve kalıtımı için işleyen fiziksel mekanizmadır. Nükleotitlerin DNA daki dizilişi, hücre tarafından aminoasit zincirleri üretmek için kullanılır, aminoasit zincirleri ise proteinleri oluşturur. Bir proteindeki aminoasitlerin sırası, gendeki nükleotitlerin sırası ile ilişki içersindedir. Aradaki bu ilişkiye genetik kod adı verilir yılında Beadle ve Tatum un çalışmalarıyla başlayan süreç sonucunda 1948 yılına gelindiğinde tek gen - tek enzim hipotezi ortaya atılmıştır (43). Bu hipoteze göre tek bir protein tek bir gen tarafından kodlanmaktadır. Gerçekten de tek gen tek enzim hipotezine uygun olarak protein eksikliği veya protein deformasyonu ile mutasyon arasında doğrudan ilişki ilk kez Neurospora crassa mutantlarında keşfedilmiş ve daha sonra bütün basit ve gelişmiş canlı türlerinde geçerliliği gözlenmiştir (41) lerin başlarında protein dizileme (protein fingerprint) çalışmaları ile orak hücre hastalığında hemoglobinin beta zincirinin 6. sırasında bir nokta mutasyonu varlığı tespit edilmiştir. Bu değişiklikle glutamat yerine bir başka aminoasit olan valin geçmiştir. Dolayısıyla modifikasyon protein zincirinin tamamında değil sadece tek bir polipeptit zinciri üzerindedir yılında Davis tek gen - tek enzim hipotezi yerine tek gen - tek polipeptit hipotezinin geçerli olabileceğini ancak tek gen - tek enzim teriminin sadece ilgili araştırma programının adı olarak kullanılabileceğini belirtmiştir (44). Özellikle DNA nın yapısının aydınlatılmasından sonra gelişen ve hızla ilerleyen çalışmalar tek gen - tek protein ilişkisinin farklı şekillerde de ele alınmasına

34 13 olanak vermiştir. Örneğin, gen dizilerinin DNA zinciri üzerinde var olduğu bilgisinden yola çıkılarak çeşitli nükleotitler bloke edildiğinde ciddi mutasyonlar gözlenmiştir. Yanofsky ve arkadaşları 1967 de, triptofan sentetaz protein A ile ilgili genin başlangıç nükleotid dizilerinde değişiklik yaptıklarında protein dizisindeki başlangıç amino asitlerinde değişim gözlemişler, benzer şekilde nükleotid dizisinin orta ve son bölümlerinde değişiklik yaptıklarında ise aminoasit dizisinin orta ve son bölümlerinde değişimler gözlemişlerdir (45). DNA dizi analizi, gen yapısı ve genetik kontrol mekanizmaları hakkında bilgi sağlar. İnsan genomu 80 ile 300 milyon baz çifti arasında değişen ve 22 otozom 1 ile 2 cinsiyet kromozomu arasında dağılmış, kabaca 3 milyar baz çiftinden oluşan bir DNA molekülü içerir. Yaklaşık toplam gen sayısı kadardır. İnsan genomunun dizilenmesi amacıyla yapılan çalışmalarda başlangıç 1984 de Los Hamas ve Lawrence Livermore Laboratuvarları nda insan kromozomlarını yansıtan kütüphaneler üretilmeye başlanmasıdır. Tüm insan genom dizisinin belirlenmesi fikri yılları arasında Amerika Birleşik Devletleri Enerji Bakanlığı nda bilimsel toplantılarla tartışılmıştır da insan genomunun dizilenmesi sürecinde bilgilerin farklı yaklaşımlarla çok sayıda araştırma kuruluşu tarafından toplanmaya başlandığı görülmüştür. Nihayetinde 1990 yılında 18 ülkenin destek verdiği bu proje 15 yıllık bir süre için başlatılmıştır (46). İnsan Genom Projesi nin başlatılması ile genom dizileme çalışmalarının hızlandırılması ve elde edilen sonuçların toparlanması ve paylaşılması sağlanmıştır. Bu projedeki amaç; insan genomunun şifrelerinin çözülmesi; yani DNA bazlarının diziliş sırasının belirlenmesi, doğuştan var olan kalıtımsal özellikler ile ilgili genlerin tanımlanması ve günümüzde tedavisi olmayan den fazla genetik hastalığa yatkınlığı belirlemekti. Böylece; ilgili genlerin yerleri ve yapılarını aydınlatarak tanı ve tedavinin olanaklı kılınacağı düşünülmüştü (47). Gelişen teknoloji, projenin beklenenden kısa sürede tamamlanmasına ön ayak oldu ve insan genom projesi 2003 yılında tamamlandı ve böylece insan DNA dizisi internet ortamında herkese açık halde kayıt altına alınmış ve paylaşıma açılmış oldu (48). 1 Otozomlar, eşey olmayan 22 kromozomu kapsayan kromozom grubudur.

35 14 Projenin sonuçları insan genomunun 3,164,700,000 nükleotitten oluştuğunu ve en büyük gen olan distrofin geninin 2.4 milyon baz içerdiğini gösterdi. Proje sonucunda elde edilen veriler onlarca genetik hastalığın teşhis ve tedavisinin önünü açmakla kalmadı; Alzheimerden vereme, kalp hastalıklarından astıma, kanserden depresyona kadar birçok hastalığın genetik risk haritasını ortaya çıkardığı gibi tedavisinde de yeni kapılar araladı (6,49-51). Adli bilimlerde de kendine kullanım alanı bulan proje sonucunda (52) yeni ilaç molekülleri geliştirme sürecinde DNA üzerinde yeni hedef bölgelerin belirlenmesi ile ilgili önemli verilere ulaşıldı (53,54) yılına kadar geliştirilen toplam ilaçların sadece %3 ü biyoteknolojik ilaçlar (rekombinant ilaçlar, monoklonal antikorlar, rekombinant aşılar vb.) yani DNA düzeyinde etki eden ilaçlar iken yılları arasında geliştirilen ilaçların %26 sının biyoteknolojik ilaçlar olduğu görülmektedir (55). Bu hızlı artış İnsan Genom projesinin bir sonucudur ve günümüzde ilaç teknolojisi halen biyoteknolojik ilaçlara doğru hızlı bir biçimde yönelmektedir. Farmakogenomik olarak isimlendirilen ve genlerdeki polimorfizm bilgilerinden yola çıkarak kişiye özel ilaç ve ilaç dozu seçebilme yollarını araştıran bilimin ortaya çıkmasında da İnsan Genom Projesi rol oynamıştır (56) Az Sayıda Gen Keşfine Karşın Çok Sayıda Protein Varlığı İnsan genom projesi beraberinde bazı süpriz sonuçlar da ortaya çıkardı. Örneğin; toplam gen sayısının ila arasında olduğu ve nükleotid dizilerinin bütün insanlarda % 99.9 oranında aynı olduğu görüldü (14). Oysa; projeye başlanıldığı zamanlardaki genel fikir den fazla genin keşfedilmesiydi; çünkü insan tabiatı gereği den fazla morfolojik özelliğe sahiptir ve eğer her bir özellik bir enzim tarafından kontrol ediliyor ise (tek gen - tek enzim hipotezine göre) den fazla gen ilgili mrna vasıtasıyla DNA dan transkripte edilmelidir ve den fazla protein translasyonu gerçekleşmelidir. Gerçekten de mrna dizi analizi yapıldığında yaklaşık kadar mrna varlığında ancak kadar protein kodlayan gen tespit edilmiştir (57,58). İnsanlarda kodlanan kadar protein posttranslasyonel modifikasyonlarla farklı hücrelerde farklı seviyelerde bulunan proteini oluşturmaktadır (41).

36 Tek Gen - Birden Fazla Protein: Proteomik Yaklaşımlara Gereksinim Genomun sadece % 2-5 'i protein kodlamaktadır, geri kalanı RNA genleri 1, düzenleyici diziler 2, intronlar 3 ve protein kodlamayan çöp DNA (junk DNA) 4 dan oluşur. Protein kodlayan genlerin ise % 50 sinin gen başına ortalama 3 protein kodladığı düşünülmektedir (41). Tek gen - tek enzim hipotezine göre genetik bilginin aktarım şekli aşağıdaki gibidir: tek DNA tek RNA(Transkript, mrna) tek Protein Bu şema prokaryotik organizmalar için işleyen bir sıralamadır. Prokaryotlarda 5 çekirdek zarının olmaması, transkripsiyon ve translasyonun aynı anda olmasını sağlar. Ökaryotlarda 6 organellerin gelişmiş olması hedef proteinleri meydana getiren sinyallerin gelişmesine yol açmıştır. Bu sistemler prokaryotlarda bulunmaz. Ayrıca transkripsiyonun prokaryot canlılarda stoplazmada gerçekleşmesi, ökaryot canlılarda çekirdekte gerçekleşmesi de bir başka farklılıktır. Çünkü DNA ökaryotlarda çekirdekte, prokaryotlarda ise stoplazmada dağınık halde bulunur. Bir polipeptidin sentezinden sorumlu olan nükleotidlerden oluşmuş DNA parçası (veya parçaları) o polipeptidin genini oluşturur. Ökaryotlardaki genler, içlerinde 1 RNA genleri proteine çevrilmeyen, RNA kodlayan genlerdir, bunlar kodlamayan RNA veya küçük RNA olarak adlandırılır. 2 Düzenleyici diziler gen ifadesinin kontrolünde önemli bir rol oynayan genelde genlerin yakınında veya içinde yer alan kısa DNA dizileridir. 3 mrna oluşturulurken, genin harf dizilimi baştan sonra tümüyle okunmaz. Bir kısım dizilim okunup kopyası çıkarıldıktan sonra, uzun bir bölüm okunmadan atlanıp başka bir bölüme geçilir ve ordan devam edilir. DNA nın okunmadan atlanan bu bölümüne intron adı verilir. Kodlanan kısımlara ise ekzon adı verilmektedir. 4 Kodlamayan DNA, bir proteindeki amino asit dizisine karşılık gelen bilgiyi içermeyen DNA' dır. İnsan genomundaki nükleotit bazlarının % 80 i transkripte edilmektedir ve bu sebeple protein kodlamayan çöp DNA nın ne gibi bir fonksiyonu olabilir sorusu halen tartışılmakta ve konu ile ilgili araştırmalar devam etmektedir. 5 Tek hücreli ilkel organizmalardır. Bu canlılarda hücre çok basit yapılıdır ve çekirdekleri yoktur. Zarla çevrili hiçbir organel bulunmaz ve tek organelleri ribozomdur. Kalıtsal yapı sitoplazmaya dağılmıştır. 6 Belli bir çekirdek yapısına sahiptirler. Çekirdek içinde DNA, RNA, özel çekirdek sıvısı ve çekirdekçik gibi yapılar bulunur. Ökaryotların tanımlayıcı özelliği genetik malzemelerinin zarla çevrili bir (veya birkaç) çekirdek içinde yer almasıdır.

37 16 kodlamayan intron bölgeleri bulundurabilir. Ayrıca gene bitişik olarak, polipeptit sentezini idare ve kontrol eden promotörleri 1 vardır. Bu bölgeler okunmaz, sadece gen sentezini denetler. Dolayısıyla tek gen - tek enzim hipotezi ökaryotlar için aşağıdaki gibi ifade edilir: tek DNA tek transkript birden fazla mrna birden fazla protein Ökaryot hücrelerde genetik bilginin aktarımındaki bu farklılık insanlarda genden nasıl in üzerinde protein kodlanabildiğine de açıklık getirmektedir. Gelişmiş ökaryotlarda genlerin %50 si birden fazla protein kodlarken gelişmemiş ökaryotlarda (örn: bir mantar olan filamentus fungi için) genlerin %90 ı tek protein kodlamaktadır. İnsanlarda kodlanan kadar protein posttranslasyonel modifikasyonlarla farklı hücrelerde farklı seviyelerde bulunan proteini oluşturmaktadır (41,59). Çoğu durumda, sentez sonrası değişimler gen işlevinden bağımsızdır. Dolayısıyla sadece genomik çalışmalar hastalıkların önlenmesinde, teşhisinde ve tedavisinde yeterli olmamaktadır. Rakamlar göstermektedir ki; proteinlerin oluşturduğu karmaşık ağın taşıdığı bilgi genomik bilgiden daha fazladır ve bu bilgi sadece genomik bilgiden yola çıkılarak aydınlatılamaz. Ancak proteinlerin tanımlanmasıyla hücre içinde ve hücreler arasında gerçekleşen kimyasal tepkimelerin anlaşılabileceği, hücrelerin canlılıklarını nasıl korudukları, birbiriyle nasıl haberleştikleri, hücre yapısının nasıl geliştiği, hücre çeşitliliğinin nasıl sağlandığı gibi soruların da detaylı bir şekilde yanıt bulabileceği görülmüştür Protein Tanınma Metodları Proteinler bilindiği üzere aminoasitlerin birbirine bağlanmasından oluşan polimer yapılardır. Her proteinin kendisine has özelliklerinin ortaya çıkmasını sağlayan, o proteine ait özel aminoasit dizilimidir. Her bir proteinin yapısına giren (yapısında yer alan) 22 çeşit aminoasit vardır. Proteinlerin tanımlanmasına olanak sağlamak için öncelikle hücre içersinde bulundukları ortamdan ayrıştırılmaları, ardından fiziksel özelliklerinden yararlanılarak ayrımlarının gerçekleştirilmesi 1 Genlerin transkripsiyonunu kolaylaştıran, DNA'nın bir bölümüdür. Promotörler, genel olarak etkileşimde bulundukları genin yanında ve aynı iplikte bulunur.

38 17 gerekmektedir. Elektroforetik ve kromatografik teknikler kullanılarak ayrımı gerçekleştirilen proteinlerin, Pehr Edman tarafından geliştirilen Edman degradasyonu 1 (60) gibi spektroskopik olmayan tekniklerle veya kütle spektroskopisi ile aminoasit dizilimi ortaya çıkarılarak, birincil yapıları hakkında bilgi edinilebilmektedir. Proteinlerin üç boyutlu yapıları ile ilgili bilgiye direkt olarak kütle spektroskopisi kullanarak ulaşabilmek mümkün değildir; ancak aminoasit dizilimi çıkarılmış olan protein için çeşitli on-line veribankaları kullanılarak daha önceden belirlenmiş yapıya ulaşılabileceği gibi aminoasit diziliminden yola çıkarak yazılım destekli yapı önerisi sonuçları da elde edilebilmektedir (61). Doğrudan üç boyutlu yapı hakkında bilgi edinebilmenin tek yolu, X-ışını kristalografisi (XRC), X- ışını kırınımı (62) veya nükleer manyetik rezonans (NMR) tekniklerinden yararlanmaktır (63). Dolayısıyla elde edilmek istenen bilginin içeriğine göre proteinlerin tanımlanmasında farklı yaklaşımlara ve farklı tekniklere ihtiyaç duyulmaktadır Proteomik Teknolojisi Proteomik teknolojisi, önce örnekteki proteinlerin ayrımı ve sonra bu proteinlerin tanımlanması prensibine dayanmaktadır ve birbirinden bağımsız olmayan ve sürekli ilişki içerisinde bulunan üç ana başlık altında toplanabilir. Bunlar kıyaslamalı proteomik, yapısal proteomik ve işlevsel proteomiktir (Şekil 2.5). Biyoinformatik! *+,-./-&-/+) /)!"#$%#&'() Biyoinformatik! Biyoinformatik! 23/%4.%/) Şekil 2.5. Proteomik teknolojisi. 1 Edman degredasyonunda peptitlerin sadece N-terminal amino asitleri sırayla koparılır ve analiz edilir. Peptidin geri kalanı ise aynen korunur. Böylece aminoasit dizilimi hakkında bilgi edinilmiş olur.

39 18 Kıyaslamalı (Ekspresyon) Proteomik İki farklı koşul altında toplam protein ifadesinin (ekspresyonunun) nitel ve nicel analizinin yapılmasıdır. Hücrede belirli bir hastalık durumunda değişime uğrayan proteinlerin belirlenmesi ya da bir ilaç, kimyasal veya fiziksel stimüle edici ile karşılaşma durumunda etkilenen proteinlerin incelenmesi kıyaslamalı proteomiğin çalışma alanı içersinde yer almaktadır. Örneğin, kanserli bir hastaya ait hücre örneği ve sağlam bir bireye ait hücre örneği protein ifadelerinin belirlenmesi amacıyla iki boyutlu jel elektroforez (2-D Jel elektroforez) ve ardından sıvı kromatografisi veya kapiler elektroforezle kombine bir kütle spektrometresi kullanılarak analiz edilir. Sadece kanserli hücrelerde ifade edilen proteinler veya kanserli hücrelerde bulunmayan proteinler bu sayede tespit edilebilmektedir. Aynı zamanda eksik veya fazla miktarda ifade edilen proteinler de tespit edilerek elde edilen sonuçlar karşılaştırmalı olarak değerlendirilebilir. Benzer analizler, çeşitli ilaç moleküllerinin hastalıklı hücrelere uygulanmasından sonra bu hücrelerden elde edilen verinin sağlam hücrelerle karşılaştırılması için de yapılabilmektedir. Kıyaslamalı proteomik ile ulaşılan bulgular, hastalıklarda ilaç terapilerinin potansiyellerinin tespitini ve işleyişini anlamada yararlı sonuçlara dönüştürülebilmektedir (64). Yapısal (Structural) Proteomik Adından da anlaşılacağı gibi yapısal proteomik, proteinlerin işlevleriyle ilişkili üç boyutlu yapılarıyla ilgilenmektedir. Ribozomdaki, membrandaki ve diğer hücre içi organellerdeki proteinlerin yapılarının aydınlatılmasıyla spesifik proteinlerin işlevleri ve protein-protein etkileşmeleri hakkında önemli bulgulara ulaşılabilmektedir. Proteinlere ait yapıların belirlenmesiyle genomdan proteoma geçiş sonrası ilgili protein ile ilişkili hedef genler belirlenebilmektedir. İşlevsel protein ile ilgili genlerin belirlenmesi genomik çalışmalara da ışık tutacak niteliktedir. Ayrıca proteinlerin üç boyutlu yapılarının elde edilmesiyle enzim substrat ilişkisi gibi etkileşmelerin fizikokimyasal özellikleri hakkında bilgi sahibi olunabilmektedir. Birçok enzim protein yapısındadır ve özellikle günümüzde bilgisayar destekli ilaç molekülü tasarımında hedef enzim moleküllerinin üç boyutlu yapılarından

40 19 yararlanılarak uygun afiniteye sahip moleküllerin tasarlanması amaçlanmaktadır. Dolayısıyla yeni ilaç moleküllerinin tasarlanması aşamasında da yapısal proteomik sonucu elde edilen bilgiler önem arz etmektedir (65,66). İşlevsel (Functional) Proteomik Birçok protein, fonksiyonlarını diğer proteinler ile etkileşimleriyle ortaya çıkarır. Bu bakımdan, bir proteinin yapısını tespit ettikten sonra metabolik aktivite içerisindeki bireysel rolünü tayin edip, protein ağı içerisindeki rolünü incelemek ve sisteme katkısını anlamak ayrı bir çalışma alanıdır. Protein ağ haritaları, yaşayan sistemlerde hangi proteinlerin birbirleriyle etkileşimde olduklarını belirler. Protein modifikasyonlarının haritalanması ise proteinlerin nasıl ve nerede modifiye olduklarının belirlenmesi işidir. Birçok yaygın posttranslasyonel modifikasyon, proteinlerin hedefleme özelliğini, yapısını ve dolayısıyla işlevlerini yönetir. Bilindiği üzere çoğu çevresel faktör, ilaçlar ve endojen kimyasallar proteinleri modifiye etmektedir. Bu modifikasyonlarla ilgili araştırmalar da işlevsel proteomik çalışma alanı içinde yer almaktadır (67,68) Protein Ayırma Metodları Tipik bir kıyaslamalı proteomik çalışmasında proteinlerin tanımlanabilmesi için analiz edilmeden önce ilgilenilen proteinin diğerlerinden veya proteinlerin tamamının birbirinden ayrılması gerekmektedir. Çok çeşitli protein ayırma metodları bulunmaktadır. Bunlar 2 boyutlu jel elektroforez (2-D Jel elektroforez), iki boyutlu diferansiyel jel elektroforez (2-D DIGE) ve tek ve iki boyutlu sıvı kromatografisidir (1-D LC, 2-D LC). Ancak en sık kullanılan tekniklerin başında 2-D Jel elektroforez gelmektedir (69-72). 2-D Jel elektroforez ile proteinlerin ayrımı aslında temel elektroforez mantığına dayanmaktadır. Birinci basamak, proteinlerin izoelektrik noktalarına göre ayrıldığı izoelektrik odaklama (isoelectric focusing (IEF)), ikinci aşama ise proteinlerin kütlelerine göre ayrıldığı Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE) basamağıdır. Ayrılan ve analiz edilmek istenen proteinler kütle spektrometrisi gibi ileri analitik teknikler kullanılarak analiz edilir ve çeşitli yazılımlar kullanılarak tanımlanır.

41 Kütle Spektrometrisi Bir proteinin kütlesini yüksek hassasiyetle belirlemek o proteinin teşhisinde kullanılabilecek en yararlı verilerden biridir. Zira; proteinleri oluşturan aminoasitler bellidir ve sınırlı sayıdadır. Dolayısıyla; bir proteini oluşturan peptitlerin kütlelerinden yola çıkarak (peptit dizileme çalışmaları) veya aminoasitleri peptitlerden sırasıyla koparıp elde kalan kütle değerlerini ölçerek (De Novo dizileme) proteinlerin tanımlanması mümkündür. Kütle ölçümü ile elde edilebilecek bilgiler sadece proteinlerin tanımlanması ile sınırlı değildir. Protein kütlesindeki değişimler; bağlı metal iyonları veya kofaktör varlığı bilgisine, çevrim sonrası modifikasyonların tespitine ve hatta protein etkileşimleri gibi çok değerli bilgilere ulaşılmasına imkan tanımaktadır (73). İşte bu nedenle kütle spektrometrisi proteomik çalışmalarda kullanılan temel analitik yöntemdir. Bu teknik ile proteinlerin kütlelerinin belirlenmesi çok büyük bir hassasiyetle ve proteinlerin yapısından kaynaklanan pek çok sınırlamadan (çözünürlük, posttranslasyonel modifikasyonlar, serbest N-terminalinin olup olmaması v.b.) etkilenmeksizin yapılabilmektedir. Kütle spektrometreleri, yüklü partiküllerin manyetik ya da elektriksel bir alandan geçerken diğer yüklü partikülllerden m/z oranlarına göre ayrılmaları prensibi ile çalışırlar. Moleküller normalde yüklü partiküller değillerdir; ancak kütle spektrometreleri iyonizasyon işlemi ile molekülleri iyonize hale dönüştürürler. Oluşan her bir iyon özgün bir moleküler kütleye (m) ve yüke (z) sahiptir. Oluşan iyon(lar)a ait m/z değerlerinin şiddete (intensite) karşı gösterildiği bir spektrum ile bileşik tanımlanmaktadır. Her bir iyonun şiddeti dedektöre ulaşan miktarı ile orantılıdır (74). Bütün kütle spektrometreleri genelde şu kısımlardan oluşur: - Numune girişi - Vakum sistemi - İyonlaştırma kaynağı (MALDI, Elektron bombardımanı (EI), Elektrosprey (ESI), İyon Sprey)

42 21 - Kütle analizörü (TOF, Dört Uçlu, İyon Tuzaklı, Manyetik Sektör) - Dedektör (MCP Dedektör, Elektron Çoğaltıcı Dedektör, Hibrit Dedektör) Numune Girişi Numunenin sisteme girişi gaz kromatografisi, sıvı kromatografisi, kapiler elektroforez veya katı prob tarafından sağlanmaktadır Vakum Sistemi Kütle spektrometreleri bir vakum sistemi altında çalışmaktadır. Yüksek verimli vakum pompaları yalnızca analizin zorlaşmasına neden olan iyon-molekül reaksiyonlarını minimuma indirmekle kalmayıp üretilen iyonların dedeksiyonunu, geçişini ve kararlılığını sağlar (75) İyonlaştırma Kaynağı Numune sisteme girdikten sonra gerçekleşen ilk işlem iyonlaştırma işlemidir. İyon kaynağı, incelenecek maddenin türüne ve çalışmada istenilen bilgilere göre seçilmektedir. İyon kaynağı ne türde olursa olsun yüksek iyon verimi ve olabildiğince küçük enerji dağılımı sağlayacak özelliklerde olması istenir. İyonlaştırma çeşitli kaynaklarla sağlanabilir. Bunlar istenilen iyonlaştırma türüne göre elektronlar, fotonlar, elektriksel ark (kıvılcım), ısı ve kimyasal reaksiyonlar olabilmektedir. İyon kaynaklarını başlıca gaz faz iyon kaynakları ve desorpsiyon iyon kaynakları olmak üzere iki grupta incelemek mümkündür. Gaz faz iyon kaynaklarında numune önce buharlaştırılır ve daha sonra iyonize edilir. Desorpsiyon kaynaklarında ise numune likid veya katı halden direkt gaz iyonlara dönüştürülür. Isıya dayanıksız ve uçucu olmayan bileşiklere kolaylıkla uygulanabilir olması desorpsiyon kaynaklarının avantajıdır (75). Tablo 2.1 de çeşitli iyonlaştırma kaynakları ve sınıflandırılması verilmektedir.

43 22 Tablo 2.1. Çeşitli iyonlaştırma kaynakları ve sınıflandırılması. İyon Kaynağının Tipi İyon Kaynağının İsmi İyonlaştırıcı Ajan Gaz Faz Elektron bombardımanı (EI) Yüksek enerjili elektronlar Kimyasal iyonlaştırma (CI) Alan iyonizasyonu (FI) Reaktif gaz iyonları Yüksek potansiyelli elektrot Desorpsiyon Alan desorpsiyonu (FD) Yüksek potansiyelli elektrot Elektrosprey iyonizasyon (ESI) Matriks yardımlı lazer desorpsiyon/ iyonlaştırma (MALDI) Hızlı atom bombardımanı (FAB) Termosprey iyonizasyon (TS) Yüksek elektrik alanı Lazer kaynağı Atomik enerji Yüksek ısı Bu iyonizasyon kaynaklarından ESI iyon kaynaklarının kullanımı oldukça yaygındır ve -omiks (genomik, proteomik, metabolomik vb. çalışmaların tümü) çalışmalarda polipeptitlerin, proteinlerin, oligonükleotidlerin ve metabolitlerin analizinde sıklıkla kullanılmaktadır. MALDI ise diğer iyonlaştırma yöntemlerine göre nispeten yenidir ve özellikle proteinlerin ve peptitlerin analizinde kullanılmaktadır (73,74). Bu nedenle bu iki iyonizasyon kaynağından bahsedilecektir. Elektrosprey İyonizasyon (ESI) ESI tekniği kütle spektrometrelerinde iyon oluşturmak için kullanılan bir tekniktir. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) tekniğinde kolonunun çıkışına veya CE tekniğinde kapilerin çıkışına bir modül aracılığıyla uygulanır. Genellikle büyük polar moleküllerin iyonlaştırılmasında moleküler parçalanmanın önüne geçebilmek için kullanılan yumuşak bir iyonlaşma tekniğidir. Bu teknikte çözeltinin üzerine potansiyel uygulanmış çok küçük (yaklaşık 8 µm) bir metal kapilerden sabit bir hacim oranında geçmesi sağlanır. Bu kapilerin çıkışı çok daha dar olup nanometre ölçeğindedir. Kapiler ile çıkış yönündeki levha arasında yüksek bir potansiyel fark oluşturulur. Analiz edilecek molekülleri içeren çözücünün uçuculuğu fazladır ve bu amaçla tampon çözeltilerde uçucu tamponlar kullanılır (76). Metal kapiler herhangi bir yükle yüklendiğinde çözelti içindeki aynı yüklü

44 23 iyonlar hızla dışarıya doğru itilecektir. Bu kuvvetle itme sonucu çapı 10 µm olan yüklü damlacıklar oluşacaktır. Elektriksel alan, yüklü sıvıyı kapiler ucun sonunda bir koni oluşturması için zorlar. Taylor konisi isimli bu koni yüzeydeki yük oranını azaltır. Koninin ucunda damlacıklar oluşur ve kütle spektrometresinin girişine doğru taşınırlar. Bu damlacıkların kendilerine karşı gelen azot gazı ile karşılaşması sonucu çözücü buharlaşacak ve küçülen taneciklerdeki moleküller birbirlerini daha çok iterek daha küçük tanecikler oluşturacaktır. Nihayetinde çözücü, taneciklerden tamamen uzaklaşacak ve taneciğin üzerinde oluşan yük moleküllere aktarılacak ve iyonlar kütle analizörüne gönderilecektir. ESI tekniğinde elde edilmek istenen iyon türüne göre pozitif veya negatif voltaj uygulanmaktadır. ESI tekniğinin en önemli avantajı HPLC, CE gibi tekniklerle kombine olarak kullanılabilir oluşudur (77). Şekil 2.6 da pozitif iyon modunda elektrosprey oluşumu şematize edilmiştir (78). ;)310(%)*%++!"#$%&'(%)*%+!"2%.3%+45&5)-)+ 6-2&-+."#&%0+ 7&%#'0/)&-0+,-.&/0+#/)1$1+ 7&%#'0/$80%.+3-*&-9:#&-0:+ <"'&%+ 7&%#'0/)&-0+ Şekil 2.6. Elektrosprey iyonizasyon (ESI) tekniği ile iyon oluşumu. Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon/İyonlaştırma (MALDI) Bu teknikte düşük uçuculukla yüksek molekül ağırlıklı analit (>10000 Da) lazerden gelen enerjiyi absorblayan matriks olarak adlandırılan bileşikler kullanılarak parçalanmadan analiz edilir. Analit kendisine kıyasla aşırı miktarda olan ve mor ötesi (UV) soğurucu karakterde bir matriks içine gömülü olacak şekilde hazırlanır. Matriks olarak kullanılan bileşikler benzoik veya sinnamik asit türevleri gibi ya UV de ya da

45 24 kızıl ötesi (IR) de absorpsiyon yapan organik bileşiklerdir. Matriksin yapısına uygun dalga boyunda kesikli lazer ışını gönderilmesi ile matriks molekülleri parçalanmadan süblimleşir ve bunlara göre düşük miktarda olan analit molekülleri kendilerini gaz fazında bulurlar. Bu ortamda meydana gelen çok sayıda çarpışma sonucunda çeşitli miktarlarda artı ve eksi yüklenmiş analit molekülleri oluşur (79). Artı yüklü moleküller bir elektrik alan yardımıyla buharlaşma yüzeyinden uzaklaştırılıp kütle spektrometresine yönlendirilirler. Şekil 2.7 de MALDI tekniği ile yüksek molekül ağırlıklı analitlerin iyonize edilmesi şematize edilmektedir (80). MALDI nin geliştirilmesi protein kütle spektrometresi çalışmalarına proteinleri parçalamadan iyonlaştırma özelliği ile büyük katkılarda bulunmuştur.!"#$%&& '(')'& *)"+,-&./0)1& 89-+$&")"+,#:%9& 2"-%,3&./0)1& *)"+,-&4&2"-%,56& 5"%'('7'& Şekil 2.7. Matriks yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaştırma (MALDI) tekniği ile iyon oluşumu Kütle Analizörü Kütle analizörü, kütle spektrometresinin temel elemanlarından birisidir. İyonlaştırma kaynağından çıkan iyonlaşma ürünleri analizöre yönlendirilir. Analizör, m/z oranlarına göre maddelerin ayırımının saglandıgı bölümdür. Bazı uygulamalarda kütle değerlerinin yüksek hassasiyetle analiz edilme gerekliliği olmadığı halde en ideali analizörün küçük kütle farklılıklarını yüksek hassasiyetle algılayabildiği

46 25 sistemlerdir. En çok kullanılan kütle analizörleri; manyetik sektörlü kütle analizörü, kuadropol kütle analizörü ve uçuş zamanlı kütle analizörüdür. Bunlar içinde uçuş zamanlı kütle analizörü gerek ESI gerek MALDI ile kombine olarak kullanılabilen bir kütle analizörüdür ve -omiks çalışmalarda en sık kullanılan kütle analizörlerinden biridir. Uçuş Zamanlı Kütle Analizörü (TOF) Uçuş zamanlı kütle analizöründe iyonlar elektrik alan tarafından ivmelendirilir ve iyonların dedektöre uçuş süresi ölçülür. Dolayısıyla değişik kütledeki iyonlar farklı hızlarda yol alır ve dedektöre farklı zamanlarda ulaşırlar. Bu tip analizörler düşük hata payıyla analitin kütlesini yüksek doğrulukta ölçmek için kullanılır. Şekil 2.8 de uçuş zamanlı kütle analizörü şematize edilmiştir (81). 6+&*'$5+1.')'*'$+))))))),-.-$/)0%1%2%)!"#$%&'("#$) '*'$+) 98:84)%"#$*'1) ;"#$)5/5/4<=18) 78"84)%"#$*'1) 3'4-.)#5'(+) >4+2)?=*0/(%) Şekil 2.8. Uçuş zamanlı kütle analizörü (TOF) Dedektör Kütle analizörlerinden geçen iyonlar elektron çogaltıcı dedektöre ulasır. Elektron çogaltıcıda çarpısmadan dolayı olusan akım, önce analog voltaja, sonra da dijital sinyale dönüsür. En çok kullanılan dedektörler dizi dinot elektron çogaltıcı ve devamlı dinot elektron çogaltıcılardır. Bunlar sinyali 10 7 kata kadar artırabilirler. Bu da femtoamper gibi çok düsük iyon akımlarının kaydedilmesini saglar (75).

47 Boyutlu Jel Elektroforez (2-D Jel Elektroforez) Elektroforez, moleküllerin elektriksel yüklerinden yararlanarak bir elektrik alan altında büyüklüklerine ve yüklerine göre ayrılması tekniğidir. Karışım içerisindeki bir moleküle etki eden kuvvet (F), molekülün net yükü (q) ve elektriksel alan (E) ile doğru orantılıdır: F = q.e (1) İlgili formüle göre molekülün net yükü arttıkça molekülü hareket ettiren kuvvet de artacaktır. Aynı kütleye sahip iki molekülden yükü fazla olan elektrik alan altında bulunduğu ortam içersinde daha hızlı hareket edecektir. Ancak her iki molekül de aynı yüke sahipse sürtünme kuvveti sebebiyle iki molekülden kütlesi daha büyük olan daha yavaş hareket edecektir. Sürtünme kuvveti, jelin viskozite ve porozite gibi fiziksel özelliklerine bağlı bir sürtünme katsayısı (ƒ ile ifade edilebilmektedir. Moleküllerin kütleleri arttıkça büyüklükleri de artmaktadır ve büyüklüğü artan molekül ilerlemek istedikçe o moleküle etki eden sürtünme kuvveti de artacaktır ve molekülün göç hızına olumsuz yönde etki edecektir. Buradan yola çıkarak bir moleküle ait elektroforetik hareketlilik (µ) ve elektrik alanın büyüklüğüne bağlı göç hızı (ν) aşağıdaki formülle ifade edilebilir: µ = q/ƒ ν = E. µ (2) (3) Formül 2 ve 3 ün özeti bir molekülün elektroforetik hareketliliğinin (µ), o molekülün yük/kütle oranına bağlı olduğudur. Aynı yük/çap oranına sahip iki farklı molekül, molekül yapısından gelen etkiler ihmal edilirse bulundukları ortam içersinde bir elektrik alan varlığında aynı hızda ilerleyeceklerdir. Başarılı bir elektroforez yapılabilmesi için analizi yapılacak örnek onunla reaksiyon vermeyen ve örneğin elektrik alanda ilerlemesini engellemeyen bir zemin kullanmakla mümkün olur. Dolayısıyla, elektroforez ile ayrımı yapılacak moleküllere göre jel seçimi gerçekleşmektedir. Proteinlerin ayrımı için poliakrilamid jel kullanılır; oysa DNA ve RNA ( baz çifti içeren) ayrımı için genellikle

48 27 agaroz jel kullanılmaktadır. Gerek poliakrilamid jel, gerekse agaroz jel gerçekten de jel yapısındadır ve şeffaftır; dokunulduğunda ıslaklık hissi veren yumuşak yüzeyleri vardır ve çalışırken hassaslıklarını dikkate alarak titiz çalışmayı gerektirir (82). Proteinlerin ayrımında 2-D Jel elektroforezin geliştirilmesi bir dönüm noktasıdır; çünkü bu sayede proteinler binlerce protein içeren kompleks karışımlar içinde tek adımda ayrılabilecektir. 2-D Jel elektroforez ilk kez 1975 yılında O Farrel ve Klose isimli iki araştırmacı tarafından birbirinden bağımsız olarak önerilmiştir (83,84). Bu teknikte proteinler öncelikle bir şerit (strip) üzerindeki ph gradienti içersinde elektrik alan varlığında izoelektrik noktalarına göre ayrılırlar. İzoelektrik noktalarına göre proteinleri ayırma işlemi birinci boyuttur. İkinci boyutta ise izoelektrik noktalarına göre şerit üzerinde ayrılmış proteinler poliakrilamid jel üzerinde kütlelerine göre ayrılırlar. Dolayısıyla herbir protein iki boyutlu bir sistemde izoelektrik noktası ve kütlesine göre dağılım göstermiş olur. Böylece aranılan ve analiz edilmek istenen protein jel üzerinde kendine has bir bölgeye konumlanmış halde bulunur (Şekil 2.9). 2-D Jel elektroforez tekniğinde bu özgün konumlanma, proteomik analizlerde ve özellikle kıyaslamalı proteomikte tekniğin yaygın kullanımına yol açmıştır (85). Jellerde analizler ile belirlenen ve karakterize edilen proteinlerin büyük bir çoğunluğu 2-D Jel elektroforez veribankalarında depolanır. Bu veribankalarına internet üzerinden erişim mümkündür. En sık kullanılan veribankalarından birisi Swiss-2DPAGE 1 veribankasıdır. Bu veribankasında iki farklı bilgiye ulaşılabilmektedir. Bunlar imaj verileri ve teşhis edilen proteinlere ait bilgilerdir. İmaj verileri: Biyolojik bir örnek için bir veya birden fazla referans jel haritasını içerir. Örneğin doku, fizyolojik sıvı veya hücre vb. numuneler için elde edilen jel haritası tek bir 2-D jel veya 2-D jellerin birleştirilerek farklı ph, moleküler kütle bölgelerini kapsayan mozaik formu olabilir. Proteinlere ait bilgiler: Verilen jeller üzerinde her bir spota ait molekül kütlesi, izoelektrik noktası, proteinin adı, tanımlanma metodu ve ilgili referanslara ulaşılabilmektedir. Bütün bu bilgilerin yanısıra proteinin aminoasit dizisi, 1 Swiss-2DPAGE:

49 28 posttranslasyonel modifikasyonlar, protein ve nükleotit dizi analizleri, ikincil ve üçüncül yapılar, metabolik yolaklar gibi bilgilere de ulaşılabilmektedir (86).!" #" Şekil 2.9. Proteinlerin 2-D Jel elektroforez ile ayrımının şematize edilmiş hali ve bir IPG şerit ile SDS-PAGE jel görüntüsü. 2-D Jel elektroforez uygulamaları temel anlamda 10 ana basamaktan oluşmaktadır. Bunlar (87,88): 1- Proteinlerin izolasyonu 2- Proteinlerin çöktürülmesi 3- Numune hazırlama 4- Uygun miktarda proteinin hareketsiz ph gradienti (IPG: immobilize ph gradient) şeritlerine tatbik edilmesi ve IEF tekniği ile izoelektrik noktalarına göre ayrılması 5-IPG şerit üzerinde izoelektrik noktalarına göre ayrılan proteinlerin SDS- PAGE tekniği ile kütlelerine göre ayrılması 6- Poliakrilamid jel üzerinde ayrılmış proteinlerin renklendirilmesi 7- İmaj görüntüleme ile jel haritalarının belirlenmesi ve spotların tespiti 8-Analiz edilmek istenen proteinlere ait spotların kesilmesi ve proteinin tripsin vb. bir enzimle peptitlerine parçalanması 9- Peptitlerine parçalanan proteinin kütle spektroskopisi ile analiz edilmesi 10- Analiz edilen proteinin veribankaları yardımı ile teşhis edilmesi.

50 Proteinlerin İzolasyonu Proteinlerin ayrımı sağlanarak analiz edilmeden önce hücre içerisinden alınmaları ve izole edilmeleri gerekmektedir. İzole edilecekleri ortam, proteinlerin aminoasit dizilimlerini koruyabilecekleri bir fiziksel ortam olmalıdır. Bu ortam ancak uygun bileşime sahip bir liziz tamponu kullanılarak sağlanır. Liziz tamponları hücre çeşidi ve ekstre edilmek istenen proteinlerin çeşidine göre tris-hcl, etilendiamintetraasetik asit (EDTA), sodyumdodesil sülfat (SDS), deoksikolat, Trinton X, NP-40 ve bazı durumlarda NaCl içermektedir (89). Proteinleri hücre içerisinde tutan hücre zarının kırılmasından sonra oluşan protein ve nükleik asit çözeltisine hücreden arındırılmış lizat adı verilir. Hücreden arındırılmış lizat hazırlamak için fiziksel liziz teknikleri ve hassas liziz teknikleri olmak üzere temel anlamda iki farklı yol bulunmaktadır (90). Fiziksel Liziz Teknikleri: - Sonikasyon probu kullanımı (hücre süspansiyonları için) - French press ile ezme (hücre zarına sahip mikroorganizmalar için) - Havanda ezme (katı dokular ve mikroorganizmalar için) - Numune öğütme kiti kullanımı (az miktarda, değerli örnekler için) - Aşındırıcı yardımcılar ile beraber vorteksleme (hücre süspansiyonları için) Hassas Liziz Teknikleri: - Osmotik liziz (hücre kültürü ortamı için, hipoosmotik çözeltiler yardımıyla) - Tekrarlı dondurma ve çözme (bakteriler için, sıvı azot kullanılarak) - Deterjan kullanılması (mantarlar için, üre ve deterjanlı liziz tamponu ile) - Enzimatik liziz (bitkiler, bakteriler ve mantarlar için, çeşitli enzimlerle) Protein analizine geçilmeden önce hücreden arındırılmış lizat ve lizat tamponu içerisinde bulunan ve protein analizini kontamine edecek bileşenlerin (DNA/RNA, lipidler, polisakkaritler, katı materyal ve tuzlar)uzaklaştırılması gerekmektedir. DNA/RNA kontaminasyonu, jelin boyanması sırasında (gümüş ile boyama yapılacaksa) proteinlerle birlikte boyanacağı gibi ayrıca jelin asidik bölgesinde yatay çizgilere de sebebiyet verecektir. Ayrıca 2-D jel elektroforezin

51 30 birinci aşaması olan izoelektrik odaklamada bazik kısımda çökmelere sebep olacaktır. Ortamda bulunan tuzlar da jelde oluşan ve istenmeyen yatay çizgilerin en belirgin sebeplerindendir (91). DNA-RNA kontaminasyonunun önlenmesi için DNase-RNase ile muamele, fenol-kloroform ile DNA-RNA ekstraksiyonu, ultrasonikasyon ile mekanik parçalama gibi teknikler kullanılır. Lipidlerin uzaklaştırılması için %2 den büyük derişime sahip deterjan kullanılması uygun olacaktır. Polisakkaritler içinse enzimatik prosedürlerden yararlanılır. Tuzların uzaklaştırılmasında mikrodiyaliz 1 yöntemleri veya elektroforetik tuz uzaklaştırma 2 teknikleri kullanılır (92). Kontaminasyonların engellenmesinde tercih edilen kolay yollardan biri proteinlerin çöktürülmesi ve çökeltinin (pelletin) yıkanarak tekrar çözülmesidir. Bu sayede hem olası bir kontaminasyon engelleneceği gibi hem de ayrım ve analiz için daha derişik bir protein çözeltisi elde etmek mümkün olmaktadır. Dolayısıyla proteinlerin çöktürülmesi işlemi protein saflaştırma ve deriştirme amacıyla sıklıkla kullanılmaktadır; ancak çöktürme işlemi sırasında çeşitli sebeplerle protein kayıpları da olabilmektedir (93) Proteinlerin Çöktürülmesi Proteinlerin çöktürülmesinde en sık kullanılan yöntem Damerval ve arkadaşları (94) tarafından önerilen -20 C de saklanmış aseton içinde %10 triklorasetik asit (TCA) ve % merkaptoetanol çözeltisi kullanılarak çöktürme yapılmasıdır. Ancak ilerleyen zamanlarda 2-merkaptoetanolün yerine ditiyotreitol (DTT) kullanılması önerilmiştir (95). Çünkü bazı asidik proteinler merkaptoetanol kullanımıyla çökememekte ve kaybolmaktadır. Ticari olarak piyasada bulunan ve 2- DE cleanup kit adıyla geçen bazı hazır kitler de proteinlerin çöktürülmesinde kullanılabilmektedir. Bu kitler aslında yukarıda verilen yöntemle örtüşen bir metodoloji kullanmakla birlikte içeriğinde bulunan yardımcı çöktürücü adı verilen 1 Mikrodiyaliz yönteminde özel olarak imal edilmiş ve bir membran filtre içeren tüp içersine konan örnek santrifuj edildiğinde diyaliz membranın türüne göre genellikle Dalton ve aşağı kütleye sahip moleküller süzülürken, protein molekülleri tüpün içersinde kalmaktadır. 2 Bazı durumlarda tuz molekülleri tamamen çözeltiden uzaklaştırıldığında proteinlerin çözünme problemi oluşmaktadır. Bu gibi durumlarda uzaklaştırılmayan tuz molekülleri izoelektrik odaklama basamağında 5 saat süreyle 100 V uygulamasıyla göç ettirildiğinde 2-D jel elektroforez uygulamalarında tuz kontaminasyonu sonucu gözlenen yatay çizgi oluşumunun önüne geçilmektedir.

52 31 bazı kimyasal ajanlar sayesinde proteinlerle etkileşerek daha iyi bir çökme sağlamaktadırlar Numune Hazırlanması Başarılı bir protein analizine giden yolun iyi bir numune hazırlama sürecinden geçtiği açıktır. Ekstraksiyon işleminin düzgün gerçekleşebilmesi için uygun liziz tekniğinin seçilmesi, sıcaklığın ve ph nın iyi ayarlanarak protein bozulmalarının önüne geçilmesi gerekmektedir. Protein çöktürme işlemi gerçekleştikten sonra çöken proteinleri tekrar çözmek için kullanılan lizat tamponuna bazı kimyasallar eklenmelidir. Yükleme tamponu (rehydratation/loading buffer) olarak da adı geçen bu lizat tamponunun proteinlerin yapılarının korunmasında ve 2-D Jel elektroforez uygulamasında çeşitli görevleri bulunmaktadır. Lizat tamponunun; -Proteinlerin okside olmasının önüne geçmesi, -Proteinler üzerinde meydana gelebilecek modifikasyonları önlemesi, -Proteinlerin birbiri ile etkileşmesinin ve birarada gruplanmasının engellemesi, -Hidrofobik proteinleri çözmesi, -Disülfür ve hidrojen bağlarını çözerek tamponlanacak bütün grupları çözelti içinde serbest hale geçirmesi gerekir. Bu amaçla kullanılacak kimyasallar aşağıda sıralanmıştır: İndirgeyici Ajanlar Ditiyotreitol (DTT) veya ditiyoeritritol (DTE) 1 iyi birer indirgendir ve proteinlerin okside olmasını önler. Proteinlerin üçüncül yapısındaki disülfür bağlarını kopararak proteinlerin ayrımında kullanılan iki boyutlu jel elektroforezde SDS nin etkileyemeyeceği bölgelerin önüne geçmiş olur. Proteinin üçüncül yapıda kalması SDS-PAGE ile ayrımında yapıdan kaynaklı sıkıntılara yol açmaktadır. DTT ve DTE ye alternatif olarak tribütilfosfin de önerilmektedir (96). Çünkü; DTT ve DTE ph 8 1 DTT nin IUPAC adlandırması (2S,3S)-1,4-bis(sulfanyl)butane-2,3-diol dür. DTE nin IUPAC adlandırması ise (2S,3R)-1,4-Bis-sulfanylbutane-2,3-diol dür.

53 32 in üstünde iyonize olabilmekte ve 2-D Jel elektroforezde izoelektrik fokuslama veya bir diğer adıyla izoelektrik odaklamada (IEF) anoda doğru göç ederek yatay çizgilere sebebiyet vermektedir. Buna karşı tribütilfosfinin kararsız yapısı ise kullanımında dezavantaj teşkil etmektedir (97). DTT ve DTE nin kimyasal formülleri Şekil 2.10 da verilmiştir.!""#!"$# Şekil Ditiyotreitol (DTT) ve Ditiyoeritritol (DTE) ün kimyasal yapısı. Üre Ürenin birden fazla görevi bulunmaktadır. Yüksek miktardaki üre derişimi ile proteinlerin üçüncül ve ikincil yapıları bozularak herbiri sadece aminoasit dizisinden oluşan birincil yapılarına dönüştürülür. Ayrıca protein-protein etkileşmelerinin de önüne geçilmiş olur. Proteaz İnhibitörleri Proteazlar, proteinlerin parçalanmasından sorumlu enzim gruplarıdır. Hücrede protein sentezi ve yıkımı hücresel bileşenlerin ihtiyaç duyduğu homeostazı 1 sağlar. Proteazlar veya peptidazlar, peptid bağlarının yıkımını katalizler ve mekanizmalarına göre beş ana sınıfa ayrılırlar. Bunlar; serin, treonin, sistein, aspartat ve metallo proteazlardır. Proteaz inhibitörleri, üre ve deterjan ortamında halen aktif halde bulunan proteazları inhibe ederek proteinlerin parçalanmasının önüne geçmekten sorumludur. Bazik Koşulları Sağlamak için Tamponlar Bazı proteazlar bazik koşullarda aktif değildirler. Ayrıca bazik koşullarda nükleik asitler çöktüğü gibi proteinlerin ekstre edilmesinde de bazik koşullar yardımcı olmaktadır. Bu amaçla Tris tamponu kullanılmaktadır. 1 Homeostaz (Homeostasi), hücre dışı gerçekleşen olaylar karşısında hücrenin kendi metabolizmasını koruma eğilimidir. Yaşamın devamı için düzenleyici sistemler yardımıyla organizmanın iç ortamının sabit tutulmasıdır.

54 33 Deterjanlar Hidrofobik proteinlerin çözülmesinde kullanılan deterjanlara örnek Triton X-100 ve Nonidet NP-40 verilebilir. Triton X-100 gibi deterjanların içindeki safsızlıklar kütle spektroskopisi verilerini kontamine edebilmektedir. CHAPS 1 ise zwitter iyonik yapıda bir kimyasaldır ve diğer adı geçen noniyonik yapıdaki deterjanlara göre yüksek saflığı nedeniyle de iyi bir alternatif oluşturmaktadır. CHAPS ın kimyasal yapısı Şekil 2.11 de verilmektedir.!"#$%& Şekil CHAPS ın kimyasal yapısı. Taşıyıcı Amfolitler Proteinlerin çözünmesinde rol aldıkları gibi ayrıca 2-D Jel elektroforezde IEF aşamasında ph gradientleri oluşturarak proteinlerin izoelektrik noktalarına göre ayrımında yardımcı olurlar. Herbir taşıyıcı amfolit 2 kendi izoelektrik noktasına (pi) göç eder ve o noktada yüksüz halde sabitlenir. Boyalar 2-D Jel elektroforezde başlangıç ve bitiş noktasını tespit etmede ve elektroforezin ilerleyişini görmede renk oluşturarak deneyin yapılışına yardımcı olur. Bromfenol mavisi bu amaçla sıklıkla kullanılan boyalardandır İzoelektrik Odaklama (IEF) - 1.Boyut Proteinler aminoasitlerden oluşmaktadır ve dolayısıyla aminoasit zincirlerinin üzerinde bulunan yan gruplar proteinlerin asidik ortamda katyonik yapıda, bazik ortamda ise anyonik yapıda davranmalarına sebep olurlar. Ancak proteinlerin hem 1 CHAPS ın IUPAC adlandırması (3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylammonio]-1 propanesulfonate) dır. 2 Asit ya da baz rolü oynayarak, aynı anda, farklı tipte iki elektrolitik ayrışmaya uğrayan maddelere amfolit denir.

55 34 anot, hem de katot tarafından eşit olarak çekildikleri bir nokta vardır ki bu noktada aminoasit yan zincirlerinin üzerindeki iyonlaşabilen gruplar en üst düzeyde iyonlaştığı halde proteinin toplamına ait net yük sıfırdır (Şekil 2.12). Bu noktadaki ph değeri proteinin izoelektrik noktasıdır (pi). Proteinler izoelektrik noktalarında iken elektrik alan altında hareket etmezler; dolayısıyla bir ph gradienti oluşturulduğunda ve bu ph gradientinin bulunduğu ortama proteinler gelişigüzel yerleştirildiğinde elektrik alan altında herbir proteinin kendine ait izoelektrik noktaya kadar göç ettiği ve bu noktada hareketsiz kaldığı görülecektir. Pozitif Yüklü Negatif Yüklü Pozitif ve negatif yük e!it!"#$#%&'(&,+-./.%01#%&2-%0*& )*+#%&'(& Şekil Proteinlerin ph değişimine bağlı olarak kimyasal yapılarındaki değişmeler. İzoelektrik odaklamada IPG şerit adı verilen şeritler kullanılmaktadır. Hareketsiz ph gradientinin sağlandığı bu şeritlerde akrilamid jel, ph gradienti olacak şekilde polimerize edilmiştir. Üzerlerinde immobilin adı verilen gruplar taşıyan akrilamid türevi maddelerin polimerize edilmesiyle ph gradientinin sağlandığı bir matriks oluşturulur (98). İmmobilinler aslen amfolitlerdir ve zayıf asidik veya zayıf bazik özellik gösteren gruplardır. İmmobilinlere ait kimyasal yapı Şekil 2.13 de verilmektedir.

56 35 Şekil Akrilamid jel üzerindeki amfolitlerin kimyasal yapısı. Bir ph gradienti oluşturmak için en az iki immobilin gerekmektedir. Biri asidik diğeri ise bazik olan bu iki immobilini farklı oranlarda kullanarak polimerizasyon sonrası bir ph gradienti sağlanmış olur. ph nın hangi değerde olacağı aşağıdaki asidik ve bazik immobilinin derişimiyle belirlenir. ph gradienti oluşturmayla ilgili yazılımlar dahi geliştirilmiş olsa da; bu yazılımlar deneysel verilerle her zaman örtüşmemektedir (99). Daha önceki yıllarda ph gradienti oluşturarak bir IPG şerit elde edilmesi işlemi bazik ve asidik immobilin kokteyli içeren iki farklı karışımın akrilamid monomerleriyle birlikte iki plaktan oluşan bir cam içine farklı oranlarda dökümü ile gerçekleştirilse de tekrarlanabilirlik problemlerinin ortadan kaldırılması, sağlamlık, tutarlılık ve en önemlisi zamandan tasarruf sağlamak amacıyla son zamanlardaki çalışmalarda artık hazır IPG şeritler kullanılmaktadır (100). Hazır IPG şeritler farklı boylarda ve farklı ph aralıklarında doğrusal veya doğrusal olmayan gradient içerecek şekilde piyasada birçok firma tarafından sunulmaktadır. Boyları, kullanım amacına ve tatbik edilecek numunenin miktarına göre farklılık göstermekle birlikte 7 ila 24 cm arasında değişebilmektedir. Şekil 2.14 de ticari olarak satın alınabilecek farklı boyutlardaki hazır IPG şeritlerin farklı ph aralıklarında çalışabilen çeşitlerine ait örnekler gösterilmektedir. IPG şeritlerin sol kenarında çalışma ph aralığı üretici firma tarafından işlenmektedir.

57 36 Şekil Ticari IPG şeritler (7-24 cm boyunda ph 3-10 aralığındadır). IPG Şeritlere Numune Tatbiki En yaygın yöntem, numunenin yükleme tamponunda çözüldükten sonra 12 saat veya daha fazla süre IPG şerit ile mineral yağı gibi hava geçirmeyen, iletken ancak şeridin ıslaklığını koruyabileceği bir ortamda muamele edilmesi ve proteinlerin şeride difüzyonudur. Başlangıçta IPG şerit üzerindeki porlar proteinlerin giremeyeceği kadar küçüktür ve şerit nispeten kurudur. Önce bu porlara yükleme tamponuna ait bileşenler; yani su, üre, deterjan ve indirgeyiciler girerken proteinler en son olarak gözeneklerin açılmasıyla birlikte porlara difüze olurlar. Bu yönteme rehydratation loading denilmektedir ve Şekil 2.15 de şematize edilmiştir (93).!"#"$%&'$()#*+$,-./)0)$ "$ $$$5$67$811+$ yüklenmesi Şekil Rehydratation loading tekniği ile numunenin IPG şeride

58 37 İzoelektrik Odaklama Koşulları İzoelektrik odaklama sırasında sıcaklık kontrolü büyük önem taşır. Zira, voltaj uygulaması sırasında IPG şerit üzerinde bölgesel ısınmaların önüne geçmek ve ürenin yüksek sıcaklıklarda kristalize olmasını engellemek için optimum sıcaklık değeri 20 C olarak bildirilmiştir. Bu değerin altında ise proteinler karbamilasyon reaksiyonuna 1 uğrarlar. Ayrıca proteinlerin şerit üzerindeki yerlerinin her uygulamada sabit kalabilmesini sağlamak elektroforezin tabiatı gereği ancak sabit sıcaklık değerlerinde uygulama yaparak mümkün olabilmektedir (101). Uygulanan voltaj programında ise başlangıçta düşük voltaj uygulanarak hem IPG şeridin ısınmasının önüne geçilir hem de tuzlardan kaynaklı girişimler bu sayede tuzların uzaklaştırılmasıyla önlenmiş olur. Daha sonrasında doğrusal bir artışla voltaj değeri artırılır, uzun süre arttığı değerde tutulur ve elektroforez sonlandırılır. Uygun voltaj programının optimizasyonu önem taşımaktadır; aksi takdirde proteinler yeterince odaklanamaz ve under focusing denilen olay gerçekleşir. Bu durumda proteinler yeterince odaklanamadığı için ikinci boyuta geçtiğimizde yatay çizgilerin varlığı ile karşılaşırız. Eğer gereğinden fazla voltaj uygulanırsa da bu sefer over focusing denilen aşırı odaklanma sorunuyla karşılaşırız ve bu durumda da sisteinler okside olabilir ve bazı proteinlerin modifikasyon sonucu pi değerleri değişebilir. Modifiye olmuş proteinlerin tekrar göç etmeye çalışmasıyla ikinci boyutta yatay çizgilere rastlanabilmektedir. En uygun odaklama biçimi, uygulanabilecek en yüksek voltajı en kısa süre uygulamakla sağlanır. Gece boyu sürecek çalışmalarda cihazın programlaması yapılırken uygulanacak voltaj değerini saat cinsinden cihaza tanımlamak yerine ulaşılmak istenen toplam voltajı Volt x saat (Vh) olarak cihaza girmek daha yararlı olacaktır. Böylece şeritlerin yerleştirilmesinden ve numune içeriğinden kaynaklı olarak farklı iletkenliğe sahip şeritlere daha az veya daha fazla voltaj uygulama problemi ortadan kalkacaktır (93). Uygulanmak istenen toplam voltaj değerine gelinceye kadar cihaz IPG şerit üzerine güç uygulayacaktır. Örnek verecek olursak; 5000 Vh voltaj demek bir saatte 5000 V veya 5 saatte 1000 V uygulanmış demektir. 1 İzosiyanikasid (HCNO) in proteinlerin amino terminaliyle reaksiyona girmesine bağlı olarak proteinin yapısının bozulması.

59 Sodyumdodesilsülfat Poliakrilamid Jel Elektroforez (SDS-PAGE)- 2. Boyut Proteinler veya polipeptitlerin molekül ağırlıklarına göre akrilamid jelde göç ettirilmesi ve jelde bunların tespit edilmesi temeline dayalı bir tekniktir. Sodyum dodesil sülfat (SDS) bir anyonik deterjan olup proteinlere sıkıca bağlanarak tersiyer yapısının bozulması ancak sekonder ve primer yapısının korunması biçiminde bir denatürasyon sağlar. Ayrıca yüksek derişimde SDS varlığında proteinler SDS ile etkileşerek birim kütle başına homojen sabit negatif bir yük kazanırlar. Böylece proteinler yük bakımından eşitlendiği için moleküler ağırlıklarına göre ayrımları gerçekleşecektir. Oluşan SDS-protein kompleksi elektroforez sırasında anoda doğru hareket kazanır. Jelin moleküler elek özelliğinden dolayı belirli bir sürede aldıkları mesafe moleküler ağırlığa göre proteinden proteine farklılık gösterecektir (Şekil 2.16). "$#+'-.!! */$01020! )('*+$#,#$'%!!"#$#%!&'(! Şekil Proteinlerin poliakrilamid jel gözeneklerinden kütlelerine göre farklı hızlarda ilerlemesi. Poliakrilamid jeller akrilamid monomerlerinin bir çapraz bağlanma reaktifi kullanılarak (genellikle N,N -metilenbisakrilamid) polimerleştirilmesiyle elde edilir. Amonyumpersülfat bu reaksiyonda katalizör görevi üstlenmektedir. Oluşan jelin por büyüklüğü toplam akrilamid derişimi ve bis-akrilamid miktarı ile belirlenir. Ayrılmak istenen proteinlerin büyüklüğüne bağlı olarak homojen jeller hazırlanabileceği gibi çoğu durumda gradient jeller de kullanılabilmektedir. Gradient jellerde toplam ayrım homojen jellere göre daha başarılı bir şekilde sağlanmaktadır (93). Piyasada uygulama amacına göre ticari olarak satın alınabilecek hazır jeller bulunmaktadır.

60 39 SDS-PAGE Uygulaması İzoelektrik noktalarına göre ayrılan proteinler IPG jel üzerinde konumlanmışken öncelikle proteinlerin SDS ile kompleks oluşturmaları için % 2 lik SDS içeren bir dengeleme tamponuyla (equilibrium buffer) iki kere muamele edilir. Her iki tampon da üre ve gliserol içeren Tris-HCl ph 8.8 tamponudur. Ancak; dengeleme tamponlarından ilki DTT içerir ve proteinlerin disülfit bağlarını koparmakla görevlidir. Böylece SDS, proteinlerle daha rahat etkileşebilecektir. İkincisi ise iodoasetamid (IAA) içerir ve sisteinleri (ve dolayısıyla açıkta kalan -SH gruplarını) alkile etmekle görevlidir. Aksi takdirde akrilamidle reaksiyon gerçekleşebilir. Bunun yanısıra IAA daha keskin spotların oluşmasına yardımcı olur. Her iki tamponda bulunan üre ve gliserol ise elektroozmotik akış ile oluşabilecek istenmeyen etkileri en aza indirmek için kullanılır (93). IPG şeritler 15 er dakika süreyle sırasıyla ilk ve ikinci dengeleme tamponuyla muamele edildikten sonra özel bir hücre içersine konulmuş poliakrilamid jelin bulunduğu kaset içine dikkatlice yerleştirilirler (Şekil 2.17). B:=:$,C,'*9$?,)*)$$ ),.@*14$!"#$%&'()$ D,'-&'$ "*+(,-'(+,.(/$0&+(1$$ (2(1/&$34+41/454$-,6&)$ A1*)$$ ),.@*14$ 7+&-)'*8*'&9$6:',6:1/,$$ *'),;,$2:-,1$<,=,$-,3,'>:-+,':$ Şekil SDS-PAGE uygulamasının şematize edilmiş hali Yerleştirme işleminde IPG şeritin poliakrilamid jelle temasta olmasına özen gösterilir. Bu teması sağlamlaştırmak için katot tamponu içinde çözülmüş ve % 0.01

61 40 bromfenol mavisi içeren sıcak sıvı agaroz IPG şerit ile poliakrilamid jelin üzerine dikkatlice tatbik edilir. Bromfenol mavisinin buradaki görevi elektroforezin ilerleyişini izlemeye yardımcı olmaktır. Katot ve anot tamponları dikkatlice hücre içerisindeki yerlerine, belirtilen yüksekliğe kadar eklenir ve IPG şeridin hemen soluna marker olarak tabir edilen ve ağırlığı bilinen proteinlerden oluşan karışım konur. Marker ın yuvası poliakrilamid jel üzerinde belirlenmiştir ve marker proteinleri özenli bir tatbik yapıldığı ve yuvasından taşmadığı sürece elektroforez sırasında kendi hizalarında ilerleyeceklerdir. Elektroforez tamamlandıktan sonra kaset, hücre içinden çıkarılır. IPG şerit artık atılabilir çünkü zaten üzerindeki proteinler poliakrilamid jele geçmiş ve kütlelerine göre ayrılmıştır. Poliakrilamid jel ise kaset dikkatli bir şekilde açılarak çıkarılır ve jel üzerindeki proteinler boyanarak spotların belirlenmesi işlemine geçilir Proteinlerin Renklendirilmesi Proteinler 2-D Jel elektroforez ile ayrıldıklarında poliakrilamid üzerinde görülemezler; çünkü renksizdirler. Proteinlerin renklendirilerek spotların belirlenmesi için çeşitli kimyasallar kullanılır. Literatürde spotların analizi için pek çok kimyasal önerilmiş ve denenmiş olsada temel anlamda beş ana özelliği sunması gerekmektedir. - Proteinleri yeterince hassas bir şekilde analiz edilebilecek kadar net bir biçimde görüntülemelidir. - Spotların renkleri protein miktarlarına göre doğrusal bir şekilde artış göstermelidir ve böylece nicel analiz yapılabilmelidir. - Proteinlerle etkileşmesi, kütle spektroskopisinde girişim yapacak düzeyde olmamalıdır. - Toksik olmamalı ve çevre dostu olmalıdır. - Sürekli uygulanabilecek kadar basit ve tekrarlanabilir olmalıdır.

62 41 Bütün bu özellikleri aynı anda gösterebilen bir kimyasal boyama tekniği henüz bulunamamıştır. En sık kullanılan boyama teknikleri coomassie 1 mavisi coomassie brillant blue ile boyama (102), gümüşle boyama (103,104) ve floresan boyama teknikleridir (105,106). Coomassie boyamada kullanılan kimyasal proteinlerin nicel tayininde yaygın olarak kullanılan bir maddedir vebradford yönteminin de temelini oluşturur (107). Bu yöntem, organik boyanın, proteinlerin asidik ve bazik grupları ile etkileşerek, renk oluşturması esasına dayanır. Floresans boyama için ise; birden fazla aromatik halka veya siklik yapısında birden fazla π bağı içeren, tescilli ada sahip pekçok floresans ajan bulunmaktadır. İlgili tekniklerin birbirine göre avantaj ve dezavantajlarını tartışan kaynaklar bulunmaktadır ( ). Ancak; özet olarak her bir tekniğin avantaj ve dezavantajları duyarlık, doğrusallık, maliyet, görüntüleme sistemine olan gereksinim ve kütle spektroskopisi ile uyumluluk açısından Tablo 2.2 de verilmiştir (111). Tablo 2.2. Protein boyama tekniklerinin karşılaştırılması. Boyama Tekniği Duyarlık Doğrusallık Maliyet Görüntüleme sistemi Kütle Spektrometrisi ile uyum Commassie G ng Densitometre Commassie R ng ++ + Densitometre Gümüş ile boyama ng Densitometre ++ Floresans boyama ng Floresans görüntüleme ++++ * Artı + işaretlerinin sayısı göreceli artışı ifade eder İmaj Görüntüleme Jeller üzerindeki proteinler boyandıktan sonra imaj görüntüleme çalışmalarına geçilir. Özellikle kıyaslamalı proteomiks çalışmalarında karmaşık jel haritalarının göz yordamıyla karşılaştırılması ve nicel anlamda değişime uğramış spotların doğrudan jel üzerinden tespiti neredeyse imkansızdır. Bu yüzden, jeller imaj 1 Coomassie olarak adı geçen kimyasal Coomassie Brilliant Blue G-250 ve R-250 adı ile anılmakta olan tescilli bir kimyasaldır.

63 42 görüntüleme image capturing cihazları ile fotoğraflanarak jel görüntüleri bilgisayar ortamına aktarılır. Burada dijital hale getirilmiş jel görüntüleri PDQuest, ImageMaster 2D, Dymension, Redfin, Delta2D vb. ticari veya ticari olmayan imaj analiz programları kullanılarak analiz edilir ve jel haritaları çıkarılır. İmaj görüntüleme yazılımları amaca yönelik yazılımlar olduğu için jellerin arka planındaki gürültünün giderilmesi, netliğinin artırılması ve spotların yerlerinin işaretlenmesi gibi birçok özelliği içinde barındırır. Sağladıkları bütün bu avantajlar dikkate alındığında imaj görüntüleme yazılımlarının neden gelişmeye ve rekabete bu kadar açık oldukları ve dolayısıyla bilgisayar teknolojisinin emekleme çağı olan 80 li yıllarda bile niçin yazılım desteği fikrinin ön plana çıktığı daha net anlaşılmaktadır ( ) Proteinlerin Jelden Kesilmesi ve Peptitlere Parçalanması Tespit edilen spotlardan proteinlerin analizi için sırasıyla spotun kesilmesi, kesilen spot içindeki proteinin jelden ayrılması, ayrılan proteinin tripsin 1 vb. bir enzim kullanarak peptitlerine parçalanması ve kütle spektroskopisi ile analizi gerekmektedir. Spotların el yordamıyla kesilmesi zor, dikkat gerektiren zaman alıcı bir iştir. Ayrıca bu işlem sırasında keratin ve diğer başka kontaminasyonların oluşabilme ihtimali yüksektir (93). Bu sebeple spot kesim işlemleri günümüzde kapalı bir ortam içerisinde çalışan robotik sistemler vasıtasıyla yapılmaktadır (116). Bu robotik sistemler yazılım üzerinde görüntülenen imajdaki spotun konumu doğrultusunda tespit edip yüksek hassasiyetle keserek mikroplate içine yerleştirebilmektedir. Ayrıca floresan boyama yapılmışsa ilgili spotlar çıplak gözle görülemeyeceğinden robotik sistem kullanımı neredeyse zorunlu hale gelmektedir. Kesilen spottaki proteinin peptitlerine parçalanmasında en sık kullanılan yöntem tripsin ile jel içindeki proteinin peptitlerine parçalanmasıdır. Bu yöntem Staudenmann ve arkadaşları tarafından tanımlanan bir yöntemdir ve proteinlerin jelde parçalanması yani in-gel digestion denilmektedir (117). Kesilen spot asetonitril ile yıkandıktan sonra vakum altında kurutulur ve böylece enzimin 1 Tripsin, çoğu omurgalının sindirim sisteminde bulunan, proteinleri parçalayıcı özelliğe sahip peptidaz grubunda bir sindirim enzimidir.

64 43 aktivitesini koruyabileceği bir tampon çözelti içindeki tripsin yani digestion buffer jel üzerinde tatbik edildiğinde enzim tampon çözelti ile birlikte jel içine nüfuz ederek proteini peptitlerine parçalar. Peptitlere parçalanma işlemi 3 ila 24 saat arası sürebilmektedir ve bu süreç sonunda peptitlerin jel içinden ekstre edilmesi gerekmektedir. Peptit geri kazanımını en üst seviyede tutmak için SDS, Tween 20, Triton X-100 veya NP 40 gibi deterjanları içeren çözeltiler rapor edilmiştir. Ancak deterjan içeren bu çözeltilerin kütle spektroskopisinde girişime sebebiyet vermemeleri için triflorasetik asit ve asetonitril de kullanılabilmektedir. Bütün bu işlemler sonunda elde edilen peptit karışımı analiz edilmek üzere kütle spektrometresine gönderilir. Spot kesimi için kullanılan robotik sistem Şekil 2.18 de verilmektedir (93).!"#$%& '%#()%&*(&+,+-& '(./#&010& 2+-%#%&& 345#(./& :/-)"$5%;(& 6(5&7%89(./& Şekil Jellerden protein kesimi için kullanılan robotik sistem Peptit Dizileme Çalışmaları (Peptide Mass Fingerprint) ve De Novo Dizileme Proteomik çalışmalarda tripsin ile parçalanan proteinlerden elde edilen peptitlerin kütleleri yüksek kesinlik ve doğrulukla MALDI-TOF-MS veya ESI-TOF- MS ile tespit edilebilmektedir (118). Peptitlere ait kütle değerleri proteinlerle ilgili veritabanlarında bilinen proteinlerin peptit dizilerine ait değerlerle karşılaştırılarak protein analizinin gerçekleştirilmesine peptit dizileme çalışmaları (peptide mass fingerprint) denilmektedir. Diğer bir alternatif ise Tandem-MS kullanılarak De Novo

65 44 dizileme yapılmasıdır. De Novo dizilemede kütle spektrometresinde izole edilen ve kütlesi tespit edilen peptit iyonu (MS 1 ) çarpışma hücresinde parçalanarak fragmentlerine (MS 2 ) ayrılır. Fragment iyonların kütlelerinden yola çıkarak ilgili peptite ait aminoasit dizilimi elde edilebilmektedir. Burada dikkat edilmesi gereken, her bir MS 2 spektrumunun kendisiyle ilgili kütlesi bilinen peptide (MS 1 ) ait olduğudur. Peptitin parçalanmasıyla ortaya çıkan en bilgi verici iyonlar aminoasitler arasındaki peptid bağının kırılmasıyla oluşur (119). Bu tür iyonlara b türü ve y türü iyonlar denilmektedir. Bunun haricinde a, c, x ve z türü iyonlar da oluşmaktadır (Şekil 2.19). Ancak gözlenebilirliği en yüksek olan iyonlar a, b ve y türü iyonlardır. Şekil Peptitlerin parçalanmasıyla oluşan b ve y türü iyonlar. Parçalanma işlemi sırasında varolan yükün amino terminali tarafında kalması ile b türü iyonlar, karboksi terminali tarafında kalması ile de y türü iyonlar oluşur. Peptit zinciri b ve y türü iyonların oluşmasıyla C-N ve N-C yönünde her iki taraftan birden fragmentlerine ayrılmaktadır (Şekil 2.20) ( ).

66 45 b1 b2 b3 b4 y1 y2 y3 H H N H H N H H N H H N GLSDGEWQQLNVWGK H G G G C=O C=O C=O L L C=O GLSDGEWQQLNVWGK C=O S C=O G C=O L C=O S C=O D C=O H H N K H + C=O OH H H N G H + C=O K C=O OH H H N H + W C=O G C=O K C=O OH Şekil Kütle spektrometrisinin çarpışma hücresinde fragmentlerine ayrılan GLSDGEWQQLNVWGK peptidine ait ilk dört b ve y iyonlarının oluşumu. Gerek peptit dizileme çalışmaları gerekse de De Novo dizileme çalışmaları için geliştirilmiş halihazırda onlarca ticari yazılım ve internet ortamında ulaşıma açık veritabanları bulunmaktadır. Örneğin; SwissPort, UniPort, NCBInr, MatrixScience bunlardan bazılarıdır lı yılların başlarından itibaren peptit dizilimiyle ilgili problemlerin aslında bilgisayar destekli olarak çözülebilecek bir veritabanı ve yazılım problemi olduğunun farkına varılmıştır. Her saniye 4 fragment spektrumunun alındığı 1 saatlik bir MS analizinde spektrum elde edildiği gerçeği göz önüne alınırsa sadece insan emeği ile bu işin çözümünün çok zor olacağı ortadadır. Proteom analizlerinde kullanılmak üzere geliştirilmiş onlarca veritabanı ve yazılım halihazırda bu amaçla kullanılmaktadır ( ). Bir diğer gerçek ise analiz sonucu eldeki verinin bu kadar fazla olmasına karşın doğada bulunabilecek aminoasit dizilerinin ancak çok küçük bir kesiminin gerçekte var olduğudur. Herhangi bir proteinin enzimatik sindiriminden elde edilen peptitlerin kütlelerinin saptanması veya o peptitlerin aminoasit diziliminin ortaya çıkarılması ile elde edilecek sonuçlar kimi zaman

67 46 veritabanına kayıtlı sadece bir tek proteini işaret edebilmektedir. Bu durum protein analizinin bazı uygulamalar için rutin hale gelmesine olanak tanımaktadır. Ancak; yazılım destekli veritabanı araçlarının da kendine has sınırlamaları elbetteki vardır. Örneğin; veri tabanı karşılaştırması ile ortaya konabilecek sonuç ancak veritabanı oluşturabilecek şekilde genom dizilemesi yapılmış canlılar için uygun olmaktadır. Bunun yanısıra bir diğer sorun; büyük proteinlerin hem çok fazla sayıda teorik peptit oluşturarak karmaşık spektrumlar üretilmesi, hem de korunmuş dizilerindeki spektrumların başka proteinler tarafından da oluşturulabildiği gerçeğidir. Dahası özellikle 7 aminoasitten daha küçük peptitler ise veri tabanında birden fazla sayıda proteinle uyuşup sorun yaratabilirler. Sonuç olarak bu çalışmalarda nicel değeri bilinmeyen, fakat kısmen yüksek olan bir hata payı vardır. Ancak hata oranının ve düzeyinin belirlemesine yönelik deneysel çalışmalar da bulunmaktadır (127). Burada önemli olan nokta; ne kadar dikkatli ve düzgün bir deney yapılırsa yapılsın asıl uzmanlık gerektiren ve sonuca götüren çalışmanın bilgisayar destekli veri analizinden geçtiğidir Proteom Analizinde Yaklaşımlar Proteom analizlerinde iki farklı yaklaşım bulunmaktadır. Bu yaklaşımlar bottom-up (A) ve top-down (B) olarak adlandırılmaktadır (Şekil 2.21). Buraya kadar anlatılan basamaklar tipik bir kıyaslamalı proteomik uygulaması olan bottom-up (A) yaklaşıma ait çalışma basamaklarıdır. Bu yaklaşımda proteinler yukarıda da anlatıldığı üzere 2-D Jel elektroforez ile ayrıldıktan sonra tripsin vb. bir proteolitik enzim ile peptidlere parçalanmaktadır ve kütle spektroskopisi ile analiz edilmektedir.

68 47 A Hücrelerden Proteinlerin Ayrı!tırılması B Proteinlerin ayrılması Proteinlerin çe!itli enzimlerle peptidlere parçalanması 2D Jel Elektroforez ile proteinlerin ayrılması Ayrılan proteinlerin çe!itli enzimlerle peptidlere parçalanması Peptid karı!ımının kromatografik veya elektroforetik bir yöntemle önayrımı Analiz edilmek istenen protein FT-MS Protein molekülünden parçalanan iyonlar Peptid Karı!ımı MALDI-TOF ESI-TOF Tandem MS/MS * Teorik peptid dizilimiyle kar!ıla!tırma MS I * MS II Proteinin tanımlanması Veritabanı taraması Şekil Bottom-up (A) ve top-down(b) proteomik yaklaşımlar. Ancak; proteinler ayrılmadan doğrudan protein karışımı da peptitlerine parçalanabilir. Oluşan peptitler sıvı kromatografisi (LC) ve kapiler elektroforez (CE) gibi tekniklerle ayrılarak kütle spektrometresi (MS) ile analiz edilir. Bu tekniğe bottom-up (A) yaklaşımın bir alt dalı olarak shot-gun proteomik denilmektedir (128,129). Ters faz HPLC ESI ile uyumlu olan hareketli fazlar sayesinde proteinlerin proteolitik enzimlerle parçalanmasından elde edilen peptitlerin iyi bir şekilde ayrımı ve analizi gerçekleştirilebilir. Bunun yanısıra nano ölçekli sıvı

69 48 kromatografisinin avantajları kullanılarak nano-lc-esi-ms-ms cihazları ile yüksek hassasiyette ve doğrulukta peptit analizleri neredeyse on-line denilebilecek seviyede gerçekleştirilebilmektedir. İkinci yaklaşımda (B) ise; proteinler kromatografik tekniklerle ayrıldıktan sonra analiz edilmek istenen protein yüksek hassasiyetli fourier transform kütle spektrometresi (FT-MS) ile iyonlarına parçalanarak teşhis edilmektedir (130,131). Bottom-up (A) yaklaşımın sınırlandığı durumlarda top-down (B) yaklaşım yoluyla protein analizi gerçekleştirilebilir. Örneğin, posttranslasyonel modifikasyonlar sonucu etkileşim ve görevlerinin yanısıra kimyasal yapıları da değişen proteinlere ait kütle spektrumlarında veritabanı ile karşılaştırmada sorun teşkil edebilecek istenmeyen sinyaller oluşabilir. Elbetteki bazı modifikasyonların özgün kütleleri dolayısıyla tespit edilebilmeleri mümkündür; örneğin fosforilasyon (+80 Da), glikozilasyon (+162 Da), metilasyon (+14 Da) ve disülfit bağı oluşumu (-2 Da) gibi çevrim sonrası modifikasyonların tespiti durumunda kütle değişim farkları dikkate alınır ve çeşitli veritabanlarından yararlanılarak ilgili modifikasyon tespit edilebilir (41). Ancak her modifikasyonda belirgin bir kütle değişimi olmayabilir veya veritabanıyla uyuşmayan yeni aminoasit dizileri oluşabilir. Özellikle yapısal ve işlevsel proteomik çalışmalarında bu gibi durumların çözümü için FT-MS kullanımı gerekebilmektedir Metabolomik 2003 yılında tamamlanan İnsan Genom Projesi sonucunda insan genomunun % 99.9 unun tüm bireylerde aynı, % 0.1 inin farklı olduğunu ortaya çıkarmıştır (46). Görülen bu % 0.1 lik fark klinik fenotipleri, yani farklılıkları açıklamak için yeterli olmamıştır. Fenotip, genetik ve çevresel etkenlerin oluşturduğu özelliklerin canlının dış görünüşündeki yansımasıdır ve çoğunlukla genler tarafından belirlenir. Ancak bazı koşullarda çevresel etkenler fenotipin genotipe yüzde yüz uymasını engelleyebilir ve işte bu noktada fenotip üzerine metabolitlerin etkisi dikkate değerdir (132). Biyokimyasal reaksiyonların ara ürünleri olan metabolitler, canlı hücre içerisinde gerçekleşen çok sayıda farklı yolakların bağlanmasında rol alan veya bu

70 49 metabolik yolakların işleyişi sırasında ortaya çıkan önemli kimyasal yapılardır. İnsandaki metabolitlerin sayısı tam olarak bilinmemekle birlikte ila arasında olduğu tahmin edilmektedir (14). Metabolomik ise belirli bir zaman diliminde dokularda, hücrelerde ve fizyolojik sıvılarda ve diğer hücre bileşenlerinde görevi bulunan veya biyokimyasal reaksiyonlar sonucu ortaya çıkan metabolitlerin yüksek verimli teknolojiler kullanılarak saptanması, miktarının belirlenmesi ve tanımlanmasıdır. Metabolitlerin düzeyleri hücresel fonksiyonların işleyiş bilgilerini yansıtır ve bunun sonucu olarak genetik veya çevresel değişikliklere bağlı hücrenin veya dokunun fenotipini tanımlar. Moleküler seviyede hücresel fonksiyonun analizi için çok sayıda farklı ancak birbiriyle ilişkili -omik teknik kullanılır. Transkriptom ve proteom ile ortak olarak metabolom da hücresel fonksiyonlara bağımlı olup her bir metabolomun seviyesi hücre, doku ya da organizmanın fizyolojik, gelişimsel ve patolojik durumuna göre değişkenlik gösterir. Ancak en önemli fark, mrna ve proteinlerin aksine genler ile metabolitler arasında doğrudan bir bağlantının kurulmasının zor ya da imkansız olmasıdır (133). Metabolitlerin metabolik yolaklara katılarak işlev göstermesiyle ilgili iyi bilinen bir örnek verilecek olursa; folik asidin hamile kadınlarda ceninin sağlıklı gelişimi için kritik önem taşıdığı ve bebeğin santral sinir sistemi üzerinde tahribata neden olan spina bifida hastalığını önlemede önemli rol oynadığı hatırlatılabilir (134). Metabolit miktarları hastalıkların önlenmesinde ve tedavisinde rol oynadığı kadar metabolik yolakların işleyişi sırasında ortaya çıkan metabolitler de hastalıkların teşhisinde iyi birer biyobelirteç (biomarker) görevi görmektedir. Konuyla ilgili güncel bir örnek sağ kalan meme kanseri hastalarının kanlarında metabolit profilleme çalışmalarıdır. Bu çalışmalar sonucunda meme kanserli hastalarda kanserin tekrarlama riski ile ilişkili olduğu anlaşılan bazı metabolitler tespit edilmiştir (135). Tespit edilen bu metabolitler biyobelirteç görevi görür ve ileride aynı hastalığa yakalanmış hastalarda hastalığın tekrar nüks etme eğilimi olup olmadığıyla ilgili bilgi edinilmesi açısından önem arz eder. Genomik, transkriptomik, ve proteomik analiz metodlarının hızlı bir gelişme

71 50 döneminde olması ve halihazırda kullanımda olmasına rağmen metabolomik yaklaşımların analiz metodları halen daha az yaygındır ve mevcut durumda metabolomun analizine imkan sağlayan tek ve temel bir yöntem bulunmamaktadır. Genom, transkriptom ve proteomların aydınlatılması, 4 farklı nükleotit (genom ve transkriptom) veya 22 aminoasitten (proteom) oluşan biyopolimerlerin hedeflendirilmiş kimyasal analizlerine dayanır. Bu bileşenler kimyasal olarak oldukça benzerdir ve rutin analitik yaklaşımlara olanak tanır. Ancak metabolom için, kimyasal yapılar ve özelliklerinde büyük farklar vardır. Metabolom; iyonik inorganik türlerden hidrofilik karbonhidratlara, uçucu alkoller ve ketonlara, amino ve amino olmayan organik asitlere, hidrofobik lipitlere ve karmaşık doğal ürünlere kadar son derece farklı kimyasal bileşiklerden oluşur. Bu karışıklık tam metabolomun eş zamanlı (simultane) belirlenmesini hemen hemen imkansız hale getirmektedir. Metabolom analizlerinin karmaşık olmasının bir diğer sebebi ise metabolitlerin devrinin çok hızlı olmasıdır. Pek çok metabolit organizma içinde düşük derişimlerde bulunur ve metabolit havuzları aracılığıyla çok yüksek akış ve devir halindedirler. Dolayısıyla canlı hücrelerden metabolitlerin ekstraksiyonu için özel yöntemler gerekmektedir. Temel olarak her bir metabolom çalışması için mümkün olan en fazla bilgiye ulaşılmasını sağlamak amacıyla, örnek hazırlama ve ekstraksiyon işleminin değerlendirilmesini ve farklı analitik tekniklerin kombinasyonunun eşleştirilmesi gerekir (136). Tıbbi teşhis ve tedavi amaçlı metabolit analizleri uzun zamandır uygulanmasına rağmen, fonksiyonel metabolomik kapsamında çok sayıda hücre içi metabolitin analiz edilmesi ve profillenmesi amacıyla (metabolite profiling) kullanılacak metodların geliştirilmesi için yapılan çalışmalar yeni yeni artmaktadır (137,138). Metabolomun analizi için farklı terimler kullanılmaktadır. Bu terimler Tablo 2.3 de özetlenmiştir.

72 51 Tablo 2.3. Metabolom analizlerinde kullanılan bazı terimler Metabolom Metabolomik Metabolik parmak izi alma Metabolik ayak izi alma Metabolit profilleme Metabolit hedef analizleri Hücrenin metabolizması ile bağlantılı olarak, hücre tarafından oluşturulan ya da kullanılan tüm metabolitler. Metabolom endometabolom (hücre içi metabolitler) ve ekzometabolomdan (hücredışı sıvıya veya büyüme ortamına salgılanan metabolitler) oluşur. Metabolomun veya bir bölümünün analizi için yaklaşımlardır. Metabolomik; örnekleme, örnek hazırlama, kimyasal analiz ve veri analizini içerir. Endometabolomun analizidir. Hücre tarafından üretilen metabolitlerin toplamı üzerinden nükleer manyetik rezonans (NMR) ve MS analizidir. Parmak izi genel olarak spesifik metabolitler için bilgi sağlamak amaçlı değildir ve gruplar arası metabolom düzeyindeki farklılıkları karşılaştırmak amaçlı kullanılır. Ekzometabolomun analizidir. Spesifik metabolitlerin analizini kapsar veya parmak izi almada olduğu gibi metabolitlerin toplamına ait spektrumlar üzerinden analiz yapılır. Toplam metabolom içinden spesifik ve bilinen metabolitlerin analiz edilmesi ve profillenmesidir. Analizin kantitatif olmasına gerek yoktur; ancak çoğunlukla en az yarı-kantitatiftir. Metabolizmanın spesifik bir bölümüne katılan metabolitlerin kantitatif analizidir. Metabolom teriminin, belirli bir biyolojik sistem ya da metabolizma tarafından kullanabilir veya oluşabilir metabolitlerin toplamını tanımladığına dair genel, ortak bir görüş vardır. Metabolom, endometabolom (hücre içi metabolitler) ve ekzometabolom (hücredışı sıvıya veya büyüme ortamına salgılanan metabolitler) olmak üzere ikiye ayrılır. Hücredışı (ekstrasellüler) ortam ile hücrelerin ayrılmasının kolay olduğu mikrobiyal sistemlerde (örneğin hücre kültürü çalışmaları vb.) ekzo- ile endometabolom arasındaki ayrım oldukça yararlı iken, tam dokudan hücrelerin izole edilmesinin zor olabileceği çok hücreli sistemlerde bu ayrım anlam taşımaz. Ancak ekzometabolom endometaboloma göre çok farklı bir fizyolojik rol oynadığından yine de kavramsal olarak bu ayrımın yapılması önemlidir (139). Metabolomun analizini tanımlamak amacıyla en sık kullanılan iki terim, metabolit profilleme (metabolite profiling) ve metabolik parmak izi almadır (140). Bu iki terim çoğunlukla net bir ayrım olmamasına rağmen isimlendirme amaçlı olarak kullanılır. Bu tanımlara göre, metabolit profilleme, bilinen bir seri metabolitin analizidir (örneğin; aminoasit ve organik asit serisi). Yani metabolit profillemede aranan seri haldeki metabolitler

73 52 tanımlıdır. Metabolik parmak izi alma (metabolite fingerprinting) ise spesifik olmayan ve bilinmeyen (daha önceden tanımlanmamış) metabolitlerin de analizini içerir (141). Metabolit profilleme doğrudan fizyolojik bilgi sağlar ve elde edilen veri metabolik modeller ile ilişkilendirilebilir. Metabolik parmak izi alma ise genelde farklı kümelerin gruplandırılması için bilgi sağlar. Metabolik ayak izi alma (metabolite footprinting) terimi ise ekzometabolomun analizini tanımlamak için geliştirilmiştir (142). Ayak izi alma terimi, mikrobiyal hücrelerin büyüme işlemi ile ilişkili olarak besin alırken ve metabolitleri salgılarken hücredışı ortama bir ayak izi yani bir biyobelirteç bıraktığı esasından yola çıkar (143). Aynı metabolitin pek çok farklı yolağa katılabildiği hücre metabolizmasının karmaşık doğası metabolit verilerinin yorumlanmasını güçleştirmektedir. Dolayısıyla metabolomik; biyoloji, kimya ve matematik içeren multi-disipliner bir bilimdir. Kromatografi, moleküler spektroskopi ve kütle spektrometrisi gibi analitik tekniklerin çok değişkenli veri analiz yöntemleriyle birleştirilmesiyle iç içe işler Metabolomik Analiz Teknikleri Metabolomik uygulamalarda analiz teknikleri; hedef bileşik analizleri ve profilleme için metabolitlerin ayrımını sağlayan metabolit ayırım teknikleri (gaz kromatografisi (GC), sıvı kromatografisi (LC) ve kapiler elektroforez (CE)), metabolitlerin analizini sağlayan tayin teknikleri (kütle spektrometrisi (MS) ve nükleer manyetik rezonans spektroskopisi (NMR)), metabolitlerin teşhisini ve istatistiksel değerlendirmeyi sağlayan yazılım-veribankası desteğinden oluşmaktadır. Gaz kromatografisi (GC) Metabolomik çalışmalarda en sık kullanılan güçlü bir tekniktir. Güçlü bir kromatografik ayrım kapasitesi vardır. Sadece uçucu metabolitlerin ayrımını sağlar ve çoğu biyomolekül için türevlendirme gerekebilmektedir. Kütle spektrometresi ile kombine vaziyette kullanılır. En önemli avantajı GC ile kromtagorafik ayrımlarda tekrarlanabilirliğin yüksek oluşudur ve bu sebeple GC-MS uygulamaları için halihazırda alıkonma zamanı indekslerini de içeren birçok veritabanı bulunmaktadır (144,145).

74 53 Sıvı Kromatografisi (LC) GC ile kıyaslandığında daha düşük bir kromatografik ayrım kapasitesi vardır ancak daha fazla sayıda metabolitin ayrımına izin vermektedir. Özellikle son yıllarda ön plana çıkan UPLC (Ultra performanslı sıvı kromatografisi) cihazları ile kromatografik ayrım geliştirilmiştir ve LC-MS için farklı biyolojik sıvılarda veya hücre kültürü ortamında rutin metabolit profilleme çalışmaları için C18 ve HILIC kolonların kullanıldığı protokoller yayımlanmıştır ( ). Kapiler Elektroforez (CE) Tabiatı gereği CE tekniklerinde LC ile kıyaslandığında daha fazla teorik tabaka sayısı oluşmakta ve dolayısıyla daha iyi bir ayrım gerçekleştirebilmektedir. Özellikle yüklü moleküllerin ayrımında LC ve GC ye göre daha fazla sayıda metabolitin analizine olanak tanımaktadır ( ). Ancak bütün bu avantajlara rağmen kapiler elektroforez ile çalışmalarda en büyük sorun tekrarlanabilirlik, duyarlılık ve sağlamlığın düşük olmasıdır. Metabolit profillemede kendisine kullanım alanı bulmasına rağmen kompleks biyolojik sıvılardan ayrım için iyi bir seçenek oluşturmamaktadır ve gelişmeye açıktır (152). Kütle Spektrometrisi (MS) Kütle spektrometresi GC, LC veya CE ile ayrılan metabolitlerin analizinde kullanılır. Ayrılan ve kütle spektrometresine giden metabolitler kütle spektrumlarını içeren veribankaları sayesinde tanımlanarak metabolik parmak izi alma uygulaması gerçekleştirilmiş olur. MS-MS uygulamaları için de fragment iyonları hakkında bilgi içeren ve halihazırda kullanımı bulunan veribankaları vardır. MS teknolojisi tabiatı gereği hassasiyeti ve özgün sonuçlar alınabilmesi açısından metabolomik çalışmalarda vazgeçilmez bir unsurdur. Kütle spektrometresinin kullanımında bir diğer yaklaşım ise numunede bulunan metabolitlerin tamamını ayrılmadan kütle spektrometresine verilmesidir. Özellikle yüksek ayrım gücüne (>1,000,000) ve kesinliğe (< 1 ppm) sahip FT-MS cihazları bu iş için kullanıldığında tatmin edici sonuçlar alınabilmektedir ( ). FT-MS in metabolomik çalışmalarda rutin kullanımına en büyük engel şu an için yüksek maliyeti ve dolayısıyla seyrek kullanımı sonucu yetişmiş personel eksikliğidir (152).

75 54 Nükleer Manyetik Rezonans (NMR) Spektroskopisi NMR günümüzde metabolitlerin ayrımını gerçekleştirmeye ihtiyaç duymadan metabolomik çalışmaların yapılabildiği ve kendisine yaygın kullanım alanı edinmiş yegane yöntemdir. Çok sayıda metaboliti eş zamanlı olarak analiz edebilme özelliği sayesinde ve NMR ile metabolomik çalışmalar için geliştirilmiş onlarca veribankası sayesinde evrensel bir metabolit tayin tekniği olma yolunda ilerlemektedir. Metabolitlerin ayrımını gerçekleştirmeye gerek duyulmadığı için basit ve yaygın kullanılan protokoller sayesinde numune hazırlama süreci kolaylıkla gerçekleştirilebilmektedir (157). Ancak; bütün bu avantajlarının yanında en büyük sorun şu an için duyarlılığının düşük olması sonucu özellikle kütle spektrometrisi kullanılan tekniklerle karşılaştırıldığında düşük derişimdeki metabolitlerin teşhisinde yaşanan sıkıntılardır (158,159) Yazılım ve Veribankası Desteği Metabolit profilleme çalışmalarının; biyobelirteç tespitinde, enzim substrat ilişkisi değerlendirmede, ilaç aktivite çalışmalarında, metabolik yolak analizlerinde ve daha birçok amaca hizmet eden çalışmalarda kullanımı son dönemlerde oldukça yaygındır (137,138,141,160). Metabolit profilleme çalışmaları için LC-MS, GC-MS, CE-MS ve NMR tekniklerinden elde edilen verinin bilgisayar destekli bir ön işlemden geçirilmesi; çalışma sürecinde harcanacak zaman kaybını, yapılabilecek olası hataları ve varoldukları halde gözden kaçabilecek metabolitlerin tespit edilememe sorunlarını en aza indirmektedir. Bu amaçla çeşitli ticari veya ticari olmayan yazılımlar bulunmaktadır (161). Bu tür yazılımlarla ilgili Metabolomics Society 1 tarafından yayınlanan güncel liste amaçlarına göre Tablo 2.4 de sunulmaktadır. 1 Dr. Kaddurah-Daouk tarafından 2004 yılında kurulan, tüzel kişiliği olan ve şu an dünya çapında 500 den fazla üyesi bulunan bir dernektir. adresinden dernek ile ilgili detaylı bilgiye ulaşılabilir.

76 55 Tablo 2.4. Metabolomik çalışmalarda kullanılan bazı yazılımlar. Yazılım Adı * BioSpider Colmar FiD (Fragment identificator) HORA (Human Blood Range Validator) MeltDB Kullanım Amacı Biyomoleküllerin raporlanmasında kullanılan bir yardımcıdır. Metabolitlerin kimyasal isimlerini, yaygın isimlerini, fiziksel ve kimyasal özelliklerini ve CAS numaralarını ** raporlamada yardımcı olur. Kompleks metabolit karışımlarındaki metabolitlerin NMR ile teşhisine yardımcı olan bir web tabanlı yazılımdır. NMR spektrumlarını içeren bir veribankası aracılığıyla çalışır ve piklere ait kimyasal kayma değerleri ile ilgili listeler içermektedir. MS/MS analizlerinden elde edilen bilginin yorumlanmasında grafik arabirimi kullanarak çalışabilen kolay kullanımlı bir yardımcı yazılımdır. Fragmentlerin yapıları ve parçalanma mekanizmaları ile ilgili bilgi verebilmektedir. İnsan kanından tespit edilen metabolitlerin profillenmesinde bir yardımcı yazılımdır. Plazmadaki ve kandaki normal metabolit düzeyleri sistemdeki bir veribankasında saklıdır ve bu veribankası ile analiz sonucu elde edilen bilgilerin karşılaştırılmasına olanak tanıyarak metabolomik çalışmaların valide edilmesine yardımcı olur. Farklı gruplar için metabolomik verilerin karşılaştırılmasına olanak tanıyan web tabanlı çalışan bir yardımcı programdır. Çalışmacılara kendi veri gruplarını kaydetme ve diğer veri gruplarıyla karşılaştırma olanağı tanır. MetaboloAnalyst Metabolomik verilerin analizi, birbiri ile karşılaştırılması, istatistiksel olarak değerlendirilmesi ve farklılıkların bulunmasına olanak tanıyan web tabanlı bir uygulamadır. Metabolitler için NMR spektrumlarıyla ilişkili pik listesi, MS pikleri listesi ve metabolit derişim bilgileri ile ilgili işlem yapma ve detaylı raporlanma hazırlanmasına olanak tanır. MetaboMiner OpenMS SetupX XCMS Kompleks vücut sıvılarından metabolitlerin analizinde iki boyutlu NMR verilerinin yarı otomatik olarak değerlendirilmesine olanak tanır. 500 e yakın metabolitin NMR verileri ile eldeki verilerin birbiriyle karşılaştırılmasına ve metabolitlerin tanımlanmasıan yardımcı olur. MS verilerinin anlaşılmasına yardımcı olmayı hedefleyen ve kolay kullanım özellikleriyle dikkat çeken bir yazılımdır. BinBase isimli veribankası ile GC-MS verilerinin eşleştirilmesi ve metabolitlerin bu sayede tespiti amacıyla web tabanlı çalışan bir uygulamadır. Metlin veribankasıyla ortak çalışabilen açık kaynak kodlu LC-MS verilerini analiz ederek veritabanıyla eşleştirdiği metabolitleri teşhis etmeye yarayan yardımcı bir yazılımdır. * Yazılım adları alfabe sırasına göre verilmiştir. ** CAS kayıt numaraları kimyasal bileşikler, polimerler, biyolojik dizinler, karışımlar ve alaşımlar için kullanılan tek tanımlayıcı (unique) sayılardır. CAS numarası olarak da bilinirler.

77 56 Metabolit profilleme çalışmalarının veribankası kullanmadan yapılamayacağı gerçeği ortadadır. Yüzlerce metabolitin kütle değerlerinin tek tek taranması, tandemkütle spektrometresi parçalanma ürünlerinin irdelenmesi veya NMR verilerinin tek tek incelenmesi profilleme çalışmalarında zaman kaybına ve iş gücünün verimli kullanılmamasına sebep olmaktadır. Ayrıca tespit ve teşhis edilen her bir metabolitle ilgili klinik bilgiye, yayınlara, kimyasal ve fiziksel özelliklere ve hatta bu metabolitin katıldığı metabolik yolaklarla ilgili bilgilere tek bir kaynaktan yani veribankalarından ulaşılabilme ihtimali veribankalarının kullanımını cazip hale getirmektedir. Metabolit profilleme ve bilginin değerlendirilmesi sürecinde veribankası kullanımı değer arz eder. Metabolomik veribankaları genomik veya proteomik veribankaları kadar detaylı ve tamamlanmış bilgiyi henüz içermemektedir. Genlerle veya proteinlerle karşılaştırıldığında kimyasal olarak farklı yapıları olan ve tek bir şekilde tanımlanamayan binlerce kimyasalın yani aranılan ve anlam ifade eden/edecek her bir metabolitin veribankalarına kayıtlı olmadığı bir gerçektir. Aslında bu durum metabolomik çalışmaların neden bu kadar değerli olduğunun bir göstergesidir. Daha yapılacak ve yapılması gereken çok iş vardır ve her geçen gün özellikle tanımlanan metabolitlerin sayısının, fonksiyonlarının ve yer aldıkları metabolik yolakların belirlenmesiyle metabolomik ile ilgili bilgi ve dolayısıyla metabolomik veribankaları zenginleşecektir (162). Bu veribankalarını karşılaştırmalı metabolomik veribankaları, metabolik yolak veribankaları, kimyasal özellikler ve spesifik kimyasallara ait veribankaları, ilaç ve metabolitleri veribankaları ve spektral veribankaları olarak gruplandırmak yerinde olacaktır. Ancak bu gruplandırma çoğu veribankası için iç içe geçmiş vaziyettedir ve bu veribankaları birden fazla amaca hizmet etmektedir. Tablo 2.5 de metabolomik çalışmalar için kullanılabilecek veribankaları verilmektedir.

78 57 Tablo 2.5. Metabolomik çalışmalarda kullanılan bazı veribankaları. Veribankaları HMDB (Human Metabolome Database) Metlin MMCD (Madison Metabolomics Consortium Database) SetupX Fiehn GC-MS Database BML-NMR (Birmingham Metabolite Library Nuclear Magnetic Resonance database) Golm Metabolome Database İçeriği Kimyasal bilgi, klinik bilgi ve moleküler biyoloji/biyokimyasal bilgi içerir kadar metabolit ve bu metabolitlerle ilişkili 1500 kadar protein (ve DNA) dizilimi içerir. Birçok metabolit için o metabolit ve yer aldığı metabolik yolaklar ile ilgili olarak KEGG, PubChem, MetaCyc, ChEBI, PDB, Swiss-Port ve GenBank gibi veribanlarıyla ilişkilendirme sağlar. Kimyasal yapıları gösterebilmenin yanısıra yaklaşık 790 bileşik için 1H ve 13C NMR verisi içeren, 800 bileşik için MS/MS verisi içeren ve 260 bileşik için GC-MS ve alıkonma zamanı bilgisi içeren bir altyapısı vardır farklı metabolit içinse sanal NMR spektrumu önerebilmektedir. Kimyasal isim, formül ve kütle değeri bilgilerini kullanarak tarama yapmaya olanak tanıyan den fazla metabolit bilgisini içinde barındıran bir veribankasıdır. LC-MS ve MS/MS bilgisi ışığında kütle aralığı girilerek biyolojik kaynağı ve hastalık sınıfına göre metabolitleri bulabilmekte ve listeler halinde ayırabilmektedir. XCMS yazılımıyla birlikte çalışabilme özelliği sunar kadar metaboliti içeren 500 kadar metabolite ait spektral veriyi içinde barındıran kapsamlı bir veribankasıdır. Kimyasal ve fiziksel özelliklerin, formüllerin ve isimlerin yanısıra metabolitler için teorik NMR kimyasal kayma değerleri de sunabilmektedir. Özellikle GC-MS çalışmaları için geliştirilen ve BinBase isimli veribankası ile ortak çalışan ilişkilendirme sağlayan bir veribankasıdır. Adından da anlaşılacağı üzere GC-MS ile metabolit analizinde yaklaşık 713 kadar metabolit için MS spektrumu ve alıkonma zamanı verisini içerir. Yaklaşık 210 yaygın metabolit için NMR spektrumları içerir. En önemli özelliği farklı ph larda (6.0, 7.0, 7.4) kaydedilmiş NMR spektrumlarını ve 2 boyutlu NMR spektrumlarını da içermesidir. Detaylı GC-MS verileri içerir ve bu veriler kütle spektrumları, alıkonma zamanı indeksleri ve metabolitlerle ilgili kütüphanelerden oluşur. NIST/AMDIS yazılımı ile birlikte çalışabilmektedir. Bu yazılım sayesinde eldeki verilere ait alıkonma zamanı ve kütle spektrumu ile veribankası arasında eşleştirme yapabilmektedir. Farklı GC-MS koşulları için kayıtlı kütüphaneleri taranmaya ve indirilmeye açıktır.

79 58 PubChem ChEBI ChemSpider DrugBank Therapeutic Target PharmGKB STITCH SuperTarget Sadece metabolitler için olmamakla birlikte metabolitleri de kapsayan ve küçük kütleli moleküllere ait yapıları, fiziksel ve kimyasal özellikleri kapsayan, ilgili yayınları ve bazen klinik bilgileri de içeren veribankalarıdır. Onaylı ve halihazırda kullanılan veya üzerinde çalışılmış molekülleri de içeren geniş arşivlere sahip veribankalarıdır. İlaçların farmakolojik özellikleri, ilaç etkileşimleri, katıldıkları metabolik yolaklar ve ilaç moleküllerine ait fiziksel ve kimyasal özelliklerin de içinde bulunduğu pek çok veriyi içinde barındırırlar. Protein/peptit cinsi biyoteknolojik ilaç molekülleri hakkında da bilgi edinilebilmektedir. Yüzlerce hatta binlerce metabolit içeren numunelerde metabolit hedef analizleri (targeted metabolomik) yapıldığında iki farklı grup arasında (örneğin hasta grup ve kontrol grubu olarak sağlıklı grup) hedeflenen metabolitlerin miktarlarındaki farklılaşma tespit edilerek sonuç çıkarılmaya çalışılmaktadır. Bu tür çalışmalar gerek rutin olarak gerekse bilimsel amaçlı olarak uygulanabilmektedirler (163,164). Dolayısıyla metabolit hedef analizleri gibi uygulamalarda aranılan metabolit(ler)in uygulanan ayrım tekniği sonucu alıkonma zamanını ve kütlesini bilmek büyük avantajdır. Bu sayede alıkonma zamanı ve kütlesi bilinen metabolit, yüksek ayrım gücüne sahip cihazlarla ayrılıp, TOF gibi yüksek kesinlikte çalışan bir kütle analizörü ile analiz edildiğinde hiç kuşkusuz ki karşılaştırılan gruplar arasındaki metabolit düzeylerini ortaya çıkarmada oldukça başarılı sonuçlara ulaşılacaktır. Benzer şekilde, binlerce metabolit arasından hangisinin arandığının bilinmediği; yani teşhis edilebilecek bütün metabolitlerin taranarak iki grup arasında nicel anlamda farklılaşmış olanların ortaya çıkarıldığı metabolit profilleme çalışmalarında da metabolitlerin alıkonma zamanları ve kütlelerini veritabanlarından bularak eldeki numuneler ile karşılaştırmak zaman ve iş gücü kaybını en aza indirmek açısından önemli kolaylıklar sağlar. Gerek metabolit hedef analizleri gerekse metabolit profilleme çalışmalarında GC-MS gibi ayrım gücü ve tekrarlanabilirliği yüksek yöntemler için halihazırda çeşitli veribankaları 1 aracılığıyla sağlanan alıkonma zamanı ve metabolit kütle indeksleri metabolomik çalışmalar için kolaylık sağlamaktadır. Bu yüzden GC-MS 1 Fiehn GC-MS Database ve Golm Metabolome Database spesifik GC-MS uygulamaları için kullanılabilecek iki farklı veribankasıdır.

80 59 kütle spektrometresiyle metabolomik çalışmalar için evrensel bir yöntemdir. Benzer alıkonma zamanı indekslerin LC-MS teknikleriyle kullanımı şu aşamada piyasada bulunan onlarca ticari kolonun farklı ayrım kapasitelerine sahip olması dolayısıyla kesin bir şekilde uygulamaya konulamasa da alıkonma zamanlarını çok değişkenli lineer regresyon analizi uygulamalarıyla öngörmeye yönelik bir çalışma Hagiwara ve ark. tarafından 2010 yılında yayımlanmıştır (165) LC-MS Verilerinin Değerlendirilmesinde XCMS Kullanımı XCMS yazılımı LC-MS tabanlı metabolomik çalışmalarda tekrarlı analizlerde grup içi ve gruplar arası alıkonma zamanları arasındaki farklılaşmaları doğrusal olmayan (nonlinear) matematiksel modellemelerle eşleştirerek gidermek ve analiz edilen metabolit kütleleri arasındaki farklılıkları istatistiksel olarak değerlendirerek grup içi ve gruplar arası eşleşen metabolitleri tespit etmek için kullanılan bir metabolit profilleme yardımcı yazılımıdır. Bir LC-MS analizinde, kolon içinde ayrım sırasında difüze olmuş analit molekülleri, bir çan eğrisi oluşturacak şekilde yani en fazla molekül sayısı pik genişliğinin ortasında toplanmış vaziyette dağılır. Kolondan çıkan herbir molekül kütle spektrometresine gönderilir ve herbir molekülün kütle/yük (m/z) değerlerinin ölçülmesi sonucu belli bir m/z değeri için intensite - zaman grafiği ekrana pik olarak yansımaktadır. Şekil 2.22 de 540. saniyede elue olan ve m/z değeri olan yüklü bir molekülün herbir m/z değeri için 20 ppm hata payı olan bir cihazdaki pik şekli oluşumu şematize edilmiştir (166). Şekil incelendiğinde en yukarıda analitin kolondan bir çan eğrisi oluşturacak şekilde elue olması, ortadaki grafikte kolondan elue olan herbir analit molekülünün kütle spektrometresine ulaşması sonucu ölçülen m/z değerleri ve en aşağıdaki grafikte ise bu analite ait kütle değeri girildiğinde pik şeklinin intensite-zaman grafiği olarak ekrana yansıması gösterilmektedir.

81 60!"#$%&'(')*% +,-.&./(0%1,2%,),(0/% 34/(.%56.&/-'7./-.50% <)/.)50/.% 8,7,)%95,)0:.;% Şekil LC-MS kullanımında bir metabolitin kolondan elue olması ve kütle spektrometresinde dedekte edilmesine ait şematik gösterim. İki farklı grup için (örnek olarak hasta ve sağlıklı grup) beşer kez LC-MS analizi yapılan bir metabolik parmak izi çalışmasında her bir grup için 5 adet LC-MS kromatogramı elde edilecektir ve iki grup için toplam 10 adet LC-MS kromatogramı olacaktır. Bu gruplar için uygulanan yönteme bağlı olarak analiz süresinin 30 dakika ve taranacak m/z değerlerinin arasında olduğu düşünülsün. Böyle bir çalışmada herbir saniye için dedektör tarafından taranan verinin toplamı oldukça büyüktür. Herbir dakika için belkide onlarca farklı metabolit kolondan elue olacak ve kütle spektrometresinde analiz edilecektir. Bu metabolitlerin derişimleri birbirinden oldukça farklı olacağına göre bunlara ait piklerin intensiteleri de birbirinden oldukça farklıdır. Böyle bir çalışmada herbir kromatogramda ayrım tekniğindeki (LC) hata payından ötürü metabolitler farklı zamanlarda kolondan elue olabilecek ve

82 61 dedeksiyon tekniğindeki (kütle spektrometresi) hata payından ötürü ise her bir kromatogram için m/z değerleri birbirinden az da olsa farklı ölçülecektir. İşin kötü tarafı bu hata payları çoğunlukla rastgele hataların bir sonucudur ve belli bir düzen içermeyebilirler. Bu kadar fazla verinin içinden hata payları da dikkate alındığında yüzlerce metabolitin tespit edilmesi ve tanımlanması imkansız olmamakla birlikte zaman alıcı ve zor bir süreçtir. Özellikle düşük derişimdeki metabolitler insan emeği ile kromatogramların taranması sırasında gözden kaçabilir veya zemindeki gürültü ile karıştırılabilir. XCMS, bütün bu sorunların üstesinden gelmek ve farklı gruplar için metabolit düzeyindeki farklılıkları teşhis etmek amacıyla kullanılan ve R programlama dili 1 altında kod satırları yazılmasıyla çalışan bir uygulamadır (167,168). XCMS ile farklı gruplar arasında farklılaşan metabolitlerin teşhis edilmesi sonucunda program bir tablo ve alıkonma zamanlarının düzeltildiği yeni kromatogramlar verecektir. Nordstrom ve ark. tarafından bu işleyiş Şekil 2.23 de verildiği biçimde şematize edilmiştir (169). 1 R istatistiksel hesaplama ve grafikleri için bilgisayar programı olup aynı zamanda bir programlama dilidir. Yeni Zelanda Auckland Üniversitesinden Ross Ihaka ve Robert Gentleman tarafından ortaya çıkarılan R her geçen gün daha da gelişmekte ve farklı amaçlara hizmet edebilmektedir.

83 62 5%6(%7%)1'*%&+&%8)0+'*%90:;:-%<"=#$%)-)'&/&%!"#$%&'(% )'*+,-.)% /).)-')0*-*-% 12/('3'.(4&% H).)-%I1)+J% 12/('3'.(.&B% C&+'(0%!"#$%&'(% 12/('3'.&B% C&+'(0% 1(F(0'(-1&0.(% D)0+'*')BEF*% 0)C,0')-.)4*% Şekil A ve B şeklinde iki farklı grup için metabolit profilleme çalışmalarında XCMS kullanımı sürecinde izlenen basamaklar. İlgili tablo; - Kromatogramdaki piklerin alıkonma zamanlarının düzeltildiği, farklı gruplardaki ve grup içi gözlenen alıkonma zamanı arasındaki farklılıkları içeren (gözlenen en düşük ve en yüksek alıkonma zamanının belirtildiği) sütunlar, - Kromatogramdaki piklerin kütle değerlerinin eşleştirildiği, farklı gruplardaki ve grup içi gözlenen kütle değerleri arasındaki farklılıkları içeren (gözlenen en düşük ve en yüksek kütle değerinin belirtildiği) sütunlar, - Bir metabolite ait olduğu düşünülen piklerin birbiri ile grup içinde ve gruplararası istatistiksel olarak ne kadar örtüştüğünü gösterir sütunlar, - Farklı gruplardaki metabolitlere ait pikler için pik alanı değerlerini gösterir sütunlar, - Pik alanlarının istatistiksel değerlendirmesi sonucunda iki farklı grup için metabolit düzeyindeki değişimi ifade eden fold change yani pik alanlarındaki orantısal farklılık değerlerini veren sütünlar,

84 63 - Metlin veribankası ile eşleştirme sonucunda m/z değerlerine göre olası metabolitlerin neler olduğu ile ilgili internet bağlantısını içeren bir sütundan oluşacaktır. XCMS, Smith tarafından anlatıldığı üzere Şekil 2.24 de verilen adımları içeren bir algoritmaya göre çalışır (168). Bu algoritmadaki adımlar sıralanacak olursa; LC-MS Verisinin XCMS ile Uyumlu Hale Getirilmesi Nihayetinde XCMS bir bilgisayar programıdır ve LC-MS verilerini işleyebilmesi için kromatogramların XCMS in analiz edebileceği türden bir veri formatına dönüştürülmesi gerekmektedir. XCMS ile veri analizine başlamadan önce LC-MS verileri uygun formata dönüştürülür ve XCMS e tanıtılır. Şekil XCMS uygulamasında kullanılan algoritmanın gösterimi Piklerin Eşleştirilmesi ve Alıkonma Zamanlarının Düzeltilmesi XCMS, grup içi ve gruplar arasında aynı metabolite ait olduğunu düşündüğü pikleri centwave ve matchfilter adı verilen iki farklı algoritma kullanarak tespit edebilmektedir. Her iki algoritma da birbirinden farklı mantıkla çalışır; ancak amaç alıkonma zamanı ve kütle değerleri farklılaşan pikleri tespit etmek ve eşleştirmektir.

85 Piklerin Karşılaştırılması Tespit edilen piklerin gruplar arasında nicel anlamda ne kadar farklılaştığının belirlenmesi amacıyla ortalama pik alanı değerlerine göre orantısal karşılaştırma yapılacaktır İstatistiksel Değerlendirme Yapılması Alıkonma zamanlarının, kütle değerlerinin ve pik alanlarının istatistiksel olarak karşılaştırılmasıyla bütün metabolitlerin tanımlanması ve farklılaşan metabolitlerin en üst düzeyde belirlenmesi amaçlanmaktadır. XCMS, metabolitler için grup içi ve gruplar arası pik alanı değerlerini ve alıkonma zamanlarını karşılaştırarak istatistiksel anlamda uyuşan pikleri ortaya çıkarabilmektedir Önemli Pikleri Görüntüleme XCMS bütün bu işlemler sonunda tespit ettiği ve farklılaşan metabolitlere ait olduğuna karar verdiği piklerin her biri için alıkonma zamanı düzeltilmiş yeni kromatogramlar yayınlayacaktır. Tautenhahn ve ark. tarafından yayınlanan güncel bir çalışmada XCMS in kapasitesi değerlendirilmiş ve iki farklı grup için elde edilen kromatogramlar XCMS kullanılarak alıkonma zamanı düzeltilmesi ardından orjinal toplam iyon kromatogramları (total ion chromatogram) ile karşılaştırılmıştır (170). Nevedomskaya ve ark. ise XCMS in CE uygulamalarında kapasitesini XCMS benzeri bir diğer program olan msalign2 ile karşılaştırmışlardır (171). İdrardan metabolit parmak izi alma çalışmalarında böbrek yetmezliğiyle ilişkili bir metabolit olan kreatinin (m/z ±0.05) CE-MS ile analiz sonucu göç zamanını gösteren elektroferogramı ve XCMS ile müdahale edilmiş elektroferogramını Şekil 2.25 de verilmiştir.

86 65 /01&",2'$2$3#045$0460,-' 789:'&2$';<+$2=2-&>' $2$3#045$0460,-'!"#$"%&#$' ()*'+,-,".' ()*'+,-,".' Şekil Bir CE-MS çalışmasında kreatinin piki için orjinal elektroferogram ve XCMS kullanımı sonucu elde edilen düzeltilmiş elektroferogram. XCMS, her geçen gün yeni özellikler kazanan ve daha iyi ve kullanıcı dostu arayüze kavuşan bir platformdur. Her ne kadar LC-MS için oturmuş bir platform olsa da henüz CE-MS uygulamaları için yaygın kullanılan bir platform olduğu söylenemez. Bunun başlıca nedeni LC-MS ile metabolit profilleme çalışmalarında XCMS kullanımı için birikmiş tecrübenin fazla oluşundandır. XCMS in metabolit piklerini bulabilmesi, alıkonma zamanlarını düzeltebilmesi ve metabolitleri teşhis edebilmesi için yazılıma girilecek parametreler bellidir (168). Örnek verilecek olursa; Bruker MicrOTOF-Q cihazı için kütle spektrometresinin hata payı 3-5 ppm aralığındadır ve UPLC ile ayrımda karşılaşılabilecek maksimum ve minimum pik genişlikleri ise 5 ila 10 saniye arasındadır. Ayrıca bir UPLC uygulamasında tekrarlı analizler için piklerin alıkonma zamanlarındaki değişim bilinebilecek bir ölçüdedir ve sınırlıdır. Sinyal/gürültü oranı ise kolaylıkla belirlenebilmektedir. Buna göre XCMS uygulamasında gerek centwave gerekse matchfilter algoritmaları için belirlenecek alıkonma zamanı düzeltme ve pik tespiti parametreleri kullanılan ayrım ve dedeksiyon sisteminin özellikleri doğrultusunda yazılıma girilebilecektir. Bu sayede mümkün olan en fazla sayıda metabolitin (düşük derişimli metabolitler de dahil) profillenmesi sağlanacaktır (166). XCMS, her geçen gün yeni özellikler kazanan ve daha fazla kullanıcı dostu bir arayüze kavuşan bir platform olması dolayısıyla yakın gelecekte metabolit

87 66 profilleme çalışmalarının vazgeçilemez bir unsuru haline dönüşeceği düşünülmektedir. Özellikle 2012 yılından sonra hizmete giren web tabanlı uygulama sayesinde kullanımı daha da kolay bir hal almıştır ve R programlama dili altında script yazılmasına gerek duyulmayan bir arayüze kavuşmuştur (170). Analizin yapıldığı platforma göre (örneğin HPLC/Orbitrap veya UPLC/Q-TOF gibi) parametrelerin otomatik olarak web üzerinden seçildiği bu arayüz sayesinde sonuçlar internet üzerinden sisteme yüklenip işlenebilmektedir. Ancak halen CE-MS için hazır parametreler bu yeni arayüze eklenmemiştir ve CE-MS için en uygun parametrelerin script yazılarak girilmesi gerekmektedir Metabolik Ağ Modellemesi Metabolik yolak veya metabolik patika (metabolic pathway), hücre içinde meydana gelen bir dizi biyokimyasal tepkimenin izlediği yoldur. Bunlar toplu olarak metabolizmayı oluştururlar. Her bir yolakta belli bir kimyasal bileşik, enzimler tarafından değişime uğrar veya belli reaksiyonlar sonucu ortaya yeni bileşikler çıkar. Bazı metabolik yolaklarda pekçok bileşik ve enzim yer aldığı için karmaşık yapıda olabilirler. Hücrelerde pek çok yolak bulunur, bunlar ortak bileşiklerde kesiştikleri için karmaşık ağlar oluşturabilirler ve bütün bu karmaşık ancak ilişkili yapıya metabolik ağ denir. Metabolik ağ, yaşamın devamı için düzenleyici sistemler yardımıyla organizmanın iç ortamının sabit tutulmasında rol oynar. Metabolik ağ modellemesi ise çeşitli hastalıkların teşhisi, tedaviye cevabının belirlenmesi ve tedavisi için metabolik ağ içindeki metabolitlerin analiz edilerek izlenmesi ve bu metabolitlerin hastalıklarla, tedaviye cevapla ve hastalığın seyriyle ilişkilendirilmesi çalışmalarıdır (172,173). Bu amaçla KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) gibi açık erişimli veribankaları ve Ingenuity Systems firmasının IPA (Comprehensive pathway and network analysis of complex omics data) ismindeki yazılımı gibi ticari yazılımlardan yararlanılabilmektedir (174).

88 Hücre Kültürü Çalışmaları Hücre kültürü, spontan migrasyon, mekanik yolla veya enzimatik parçalanma ile bir dokudan ayrılmış olan hücrelerin üretilmesidir ve yaklaşık yüz yıl önce kullanılmaya başlanan bir tekniktir (175) yılında Ross Harrison plazma pıhtısında ürettiği kurbağa embriyo dokularındaki sinir liflerini incelemiş ve bu kültürde sinir liflerinin gelişimini ve büyümesini gözlemlemiştir yılında Alexis Carrel yaptığı çalışmalarla tavuk embriyo bağ dokusunun üç aydan daha uzun bir süre için büyütülmesini ve tavuk embriyo kalp parçalarının üç aya kadar muhafaza edilmesini gerçekleştirmiş ve hücre kültürünün olanaklarını genişletmiştir. Hücre kültürü teknolojisinin gelişmesinde bir sonraki önemli aşama 1948 yılında Katherine Sanford ve arkadaşlarının tekli hücrelerin kültür ortamında büyütülmesini başarmasıdır yılında Harry Eagle, hücreleri büyütmek için kullanılan kompleks doku ekstrelerinin ve pıhtıların aminoasitler, vitaminler, ko-faktörler, karbonhidratlar ve küçük miktarlarda serum proteinleri ile desteklenen tuzların karışımı ile yer değiştirebileceğini göstermiş ve hücre kültüründe yeni bir alan açmıştır (176). Her hücre tipinin fonksiyonlarını sürdürmesi için optimum besin karışımına ihtiyacı olduğunun gösterilmesi, spesifik hücre tipleri için özel kültür ortamlarının üretilmesine neden olmuştur. Memeli hücrelerinin kültüründe büyük ölçekli kültür tekniklerinin kullanımı ile rekombinant ekspresyon ve hibridoma tekniklerinin birleştirilmesi, rekombinant proteinlerin üretiminde kullanılan endüstriyel hücre kültürü için önemli bir adım olmuştur (177) de Rosenfield ve arkadaşları tarafından yapılan çalışmalarda genetik olarak modifiye edilmiş hücreler çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmaya başlanmıştır ki bu, hücre kültürü teknolojisinin kullanıldığı son ve önemli alanlardan biri olmuştur (178). Hücre kültür ortamları hücrelerin üremesini sağlayan besin karışımlarıdır. Bu karışımlara genellikle serum ya da başka bir kompleks biyolojik sıvı (süt, embiyo ekstresi, plazma) ya da belirlenmiş hormon ve büyüme faktörleri karışımları ilave edilir. Hücre kültürü ortamları bölünen hücreleri beslemek üzere gerekli olan aminoasitler, yağ asitleri, şekerler, iyonlar, eser elementler, vitaminler gibi esansiyel besin maddelerini ve hücre için uygun kimyasal çevreyi oluşturmada gerekli olan ko-

89 68 faktörleri, iyonları ve molekülleri içerir. En sık kullanılan tipleri dana serumu, fetal sığır serumu, at ve insan serumudur. Serumun bileşiminde temel olarak proteinler, polipeptidler, hormonlar, mineraller, metabolitler, besinler ve inhibitörler bulunur. Hücre kültürü ortamlarına, kültürü bakteri ve mantar kontaminasyonlarından korumak için penisilin, streptomisin, gentamisin gibi antibiyotikler ilave edilebilir. Ortamın temel gaz bileşimi O2 ve CO2 olup, değişik hücre tiplerinin O2 ihtiyaçları farklıdır. Hücre kültüründe serum, % 5-25 oranında eklenerek kullanılır (177).

90 69 3. GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Tez Çalışmasında Uygulanan Genel Metodoloji Rosmarinus officinalis L. Ekstrelerinin Hazırlanması Lamiaceae familyasına ait olan biberiye (Rosmarinus officinalis L.), Akdeniz ülkelerinde doğal olarak yetişen ve birçok ülkede kültürü yapılan aromatik bir bitkidir. Mursia-İspanya daki Herboristeria Murciana isimli seradan temin edilen biberiyeler geleneksel yöntemlerle kurutulmuştur. Herrero ve ark. (179) tarafından verilen yönteme göre bitkiler önce serilerek havalandırılmış ve güneş görmeden 20 ila 30 gün arası bir örtü üzerinde kuruyuncaya kadar bekletilmiştir. Süper kritik akışkan ekstraksiyonu (SFE) ile %7 etanol içeren karbondioksit 150 bar basınç ve 40 C sıcaklıkta 300 dakika süreyle geçirilerek majör bileşiklerden sirsimaritin, genkvakin, karnozol, karnozik asit ve metil karnozat içeren polifenolce zengin ekstreler hazırlanmıştır Hücre Kültürü Çalışmaları Kanserli hücre hatları, Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ABD) ten temin edilen Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) in ısıyla inaktive edilmiş % 5 fetal sığır serumu içerdiği ortama 2 mm L-glutamin, 50 U ml -1 penisilin G ve 50 µg/ml streptomisin eklenerek 37 ºC nemli atmosfer altında % 5 CO2 uygulanarak 60 mm çaplı hücre kültürü kaplarında cm 2 başına hücre olacak şekilde çoğaltılmıştır (180). Hücreler iki gruba ayrılmıştır. Birinci grup, 5 µm polifenolce zengin biberiye ekstreleri tatbik edilip 48 saat boyunca bekletilerek işlem görmüştür. Bu grup işlenmiş gruptur [T grubu (Treated group)]. İkinci grup ise herhangi bir şekilde işlem görmemiş, sadece çözücü ilave edilmiş kontrol grubudur [C grubu (Control group)]. Biberiye ekstreleri ile işlem sonrası hücre canlılığı tespiti toplam ve ölü hücrelerin sayımı ile gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla floresans mikroskop ve hassas CCD kamera içeren ADAM Cell Counter (Digital-Bio, Korea) kullanılmıştır. Biberiye ekstreleri ile işlem görmüş hücre gruplarında hücre canlılığının farklı hücre hatları için % 46 ila % 74 aralığına düştüğü gözlenmiştir.

91 Numune Hazırlama Hücre kültürü çalışmaları sonrası T ve C grubu hücre hatları hazır satın alınan fosfat tamponlu salin (138 mm NaCl, 2.7 mm KCl, 10 mm Na2HPO4, ph: 7.4, Sigma-Aldrich) çözeltisi ile yıkanarak homojenizasyon tamponunda (10 mm Tris- HCl, 5 mm EDTA, 120 mm NaCl, ph:7.4, Sigma-Aldrich) çözülmüş ve Polytron homojenizatör cihazı [Capitol Scientific (Austin, TX, ABD)] kullanılarak homojenat hazırlanmıştır. Homojenat santrifuj edilmiş ve santrifuj işlemi ( g x 14 dakika, 4 C de) sonrasında oluşan çökelti (nükleer fraksiyon ve mitokondriyal fraksiyon) atılmıştır. Kalan çözelti ultrasantrifuj cihazında tekrar santrifuj ( g x 1 saat, 4 C de) edilmiştir. Santrifugat (sitozolik fraksiyon) alınarak kullanılacağı zamana kadar -80 C de 500 µl lik fraksiyonlar halinde saklanmıştır Proteomik Çalışmalarda Uygulanan Metodoloji Proteomik çalışmalar için HT29 kolon kanseri, K562/R ve K562/wt kan kanseri hücre hatları kullanılmıştır. Foodomik bir yaklaşım sergilenerek biberiyeden (Rosmarinus officinalis L.) polifenollerce zengin ekstreler hazırlanmıştır. Bu ekstreler, 5 µm toplam polifenol içerecek şekilde zenginleştirilmiş ve kanserli hücre hatlarına uygulanmıştır. Biberiye ekstreleri ile tatbikin gerçekleştirildiği işlenmiş grup (T grubu) ve işlenmemiş grup yani kontrol grubu (C grubu) proteinleri önce izoelektrik noktalarına, sonra ise kütlelerine göre 2-D Jel elektroforez ile ayrılarak imaj analizi çalışmaları yapılmıştır. Yüksek miktarda ifade edilen (up-regulated) ve düşük miktarda ifade edilen (down-regulated) proteinlerin T ve C grupları için karşılaştırılmasıyla proteom düzeyindeki değişimler tanımlanmış ve farklılaştığı tespit edilen proteinler MALDI-TOF-MS ile analiz edilerek yapıları aydınlatılmıştır. HT29 kolon kanseri hücre hattı için proteomik çalışmalar sonucu elde edilen veriler tez çalışmasına paralel olarak ilerleyen genomik, transkriptomik ve metabolomik çalışmalar ile bir bütün olarak değerlendirilerek kolon kanseri üzerinde biberiye etkisi metabolik ağ modellemesi ile moleküler düzeyde açıklanmaya çalışılmıştır (180). K562/wt ve K562/R kan kanseri hücre hatları içinse proteomik çalışmalar ile elde edilen sonuçlar ayrıca ele alınmış ve literatürdeki çalışmalarla karşılaştırılarak

92 71 biberiye ekstrelerinin antikanser aktivitesi proteom düzeyinde açıklanmaya çalışılmıştır (181) Metabolomik Çalışmalarda Uygulanan Metodoloji Metabolomik çalışmalarda K562/R hücre hattı için proteomik çalışmalardan bağımsız olarak metabolit profilleme çalışmaları yapılmıştır. Bu amaçla, Çelebier ve ark. (182) tarafından daha önce HT29 hücre hatlarında yapılan çalışmalar sonrası önerilen protokole uygun olarak numune hazırlama işlemi ultrafiltrasyon tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Ultrafiltrasyon, akışkandaki partiküllerin mikrogözenekli membrandan geçerek uzaklaştırıldığı bir işlemdir. Ultrafiltrasyon teorik olarak mikrofiltrasyon ve nanofiltrasyonla aynı işlemdir ve sadece ayrıştırılan materyalin boyut aralığı farklıdır. Yukarıda anlatıldığı şekilde numune hazırlama işlemi sonucu elde edilen fraksiyonlar 3 kd ağırlığından küçük moleküller için (metabolitleri içine alacak şekilde) ultrafiltrasyon ile süzülerek CE-MS ile analiz edilmiştir. Analiz sonucu elde edilen elektroferogramlar XCMS ile işlenerek K562/R hücre hattı için tam bir metabolit profilleme yapılmaya çalışılmıştır. Bu sayede XCMS in CE-MS analizlerinde kullanımıyla ilgili centwave ve matchfilter algoritmalarına ait pik filtreleme ve alıkonma zamanı düzeltme ile ilgili çeşitli parametreler birbiri ile karşılaştırılarak en uygun parametrelerin bulunması amaçlanmıştır. Sonuç olarak XCMS in CE-MS uygulamalarındaki performansı değerlendirilerek K562/R hücre hattına ait Human Metabolome Database e kayıtlı metabolom profillenmeye çalışılmıştır (183). Tez çalışması kapsamında gerçekleştirilen proteomik ve metabolomik çalışmalar Şekil 3.1 de şematize edilmiştir.

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`&*9a&5/&.;b/K.*(&D4;$*";;$%(/&c;2%$;$/D$1(& I$2.>4;(2;$%(/&G0O0!ROFS7OI!&(;$&./.;(B(& dgi!&*5;;./,;.%.*&d$2.>4;(2;$%(/&& #%4c;;$/D$1(& Şekil 3.1. Tez çalışması kapsamında HT29, K562/R, K562/wt hücre hatları için gerçekleştirilen karşılaştırmalı proteomik ve K562/R hücre hattı için gerçekleştirilen metabolit profilleme çalışmaları.

94 Proteomik Çalışmalar Tez çalışması kapsamında yapılan proteomik çalışmalarda optimizasyon sürecini de kapsayacak şekilde kullanılan kimyasallar (Tablo 3.1), hazır satın alınan tampon çözeltiler (Tablo 3.2), hazırlanan çözeltiler (Tablo 3.3), kullanılan sarf malzemeler (Tablo 3.4), kullanılan cihazlar (Tablo 3.5), imaj analizi çalışmalarında ve proteinlerin tanımlanmasında yararlanılan yazılım ve veribankaları (Tablo 3.6) aşağıda verilmiştir. Çözeltilerin hazırlanmasında kullanılan su daima Milli-Q system (Millipore) cihazından elde edilmiştir. Tablo 3.1. Proteomik çalışmalarda kullanılan kimyasallar. Kimyasal Firma* Kullanım Amacı Aseton Sigma-Aldrich Proteinlerin çöktürülmesi Triklorasetik asit (TCA) Merck Proteinlerin çöktürülmesi DL-Ditiyotreitol (DTT) Fluka Proteinlerin çöktürülmesi ve yükleme tamponunun hazırlanmasında Trizma (minimum %99.9) Sigma-Aldrich Homojenizasyon tamponunun hazırlanmasında Etilendiamintetraasetikasit (EDTA) disodyum tuzu Sigma-Aldrich Homojenizasyon tamponunun hazırlanmasında NaCl Sigma-Aldrich Homojenizasyon tamponunun hazırlanmasında HCl Sigma-Aldrich Tampon çözelti hazırlanmasında ph ayarlamada Üre Sigma-Aldrich Yükleme tamponunun hazırlanmasında CHAPS BioXtra, 98% Sigma-Aldrich Yükleme tamponunun hazırlanmasında

95 74 Kimyasal Firma* Kullanım Amacı Bio-Lyte 3/10 Ampholyte Bio-Rad Yükleme tamponunun hazırlanmasında Protein assay standard II (bovine serum albumin) Bio-Rad Protein miktar tayininde standart olarak DC Protein assas reagent A Bio-Rad Protein miktar tayininde DC Protein assas reagent B Bio-Rad Protein miktar tayininde DC Protein assas reagent S Bio-Rad Protein miktar tayininde Protein assay dye reagent Bio-Rad Protein miktar tayininde Mineral Yağı Bio-Rad IEF (1.boyut) Agaroz (%0.5 eritilmiş agaroz, 1x Tris-Glisin-SDS ve %0.001 bromfenol mavisi içeren) Bio-Rad SDS-PAGE (2.boyut) Tribütilfosfin (TBP) (200 mm) Sigma-Aldrich İndirgeyici ajan Akrilamid (AA) Sigma-Aldrich İndirgeyici ajan İyodoasetamid (IAA) Sigma-Aldrich Alkilleyici ajan %30 luk ultrasaf gliserol Bio-Rad Dengeleme tamponlarının hazırlanmasında Precision Plus Protein All Blue Standards Precision Plus Protein Unstained Standards Bio-Rad Bio-Rad SDS-PAGE (2.boyut) için Marker olarak SDS-PAGE (2.boyut) için Marker olarak Bio- Safe Coomassie G-250 Stain Bio-Rad Jelleri boyamak için SYPRO-Ruby Protein Gel Stain Bio-Rad Jelleri boyamak için Glasial Asetikasit Scharlu Jelleri yıkamak için Metanol Lab-Scan Jelleri yıkamak için Asetonitril (HPLC grade) Sigma-Aldrich Jelden kesilen spotların yıkanması için

96 75 Kimyasal Firma* Kullanım Amacı Amonyumbikarbonat Sigma-Aldrich Jelden kesilen spotların yıkanması için Tripsin (sequencing grade) Promega Analiz edilecek proteinlerin peptitlere parçalanması için Triflorasetikasit (TFA) Sigma-Aldrich MALDI-TOF-MS ile peptit analizi sırasında protein parçalanma reaksiyonunun durdurulması için α-ciyano-4-hidroksisinamik asit Sigma-Aldrich MALDI-TOF-MS ile peptit analizi sırasında kullanılan matriks * Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, ABD), Merck (Whitehouse Station, NJ, ABD), Fluka (Buchs, İsviçre), Bio-Rad (Hercules, CA, ABD), Scharlu (Barcelona, İspanya), Lab-Scan (Gliwece, Polonya), Promega (Madison, WI, ABD) Tablo 3.2. Proteomik çalışmalarda kullanılan hazır tampon çözeltiler. Kimyasal Firma Kullanım Amacı Yükleme tamponu (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio- Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) Dengeleme tamponu (375 mm Tris-HCl, 6 M Üre, %2 SDS, ph: 8.8) Bio-Rad Bio-Rad Çöktürülen proteinleri tekrar çözerek IPG şeritlere yüklemede İzoelektrik odaklama sonrasında IPG şeritleri şartlandırmak için Criterion XT MOPS Buffer (20x) Bio-Rad SDS-PAGE (2.boyut) Criterion XT Precast Gel ile kullanılmak üzere Tris/Glycine/SDS Buffer (10x) 25 mm Tris, 192 mm glisin, %0.1 SDS, ph: 8.3 Bio-Rad SDS-PAGE (2.boyut) Criterion TGX gel ile kullanılmak üzere

97 76 Tablo 3.3. Proteomik çalışmalarda kullanılmak üzere hazırlanan çözeltiler. Tampon Çözelti Homojenizasyon tamponu (10 mm Tris-HCl, 5 mm EDTA, 120 mm NaCl, ph: 7.4) %10 (a/h) TCA, 20 mm DTT içeren aseton çözeltisi Yükleme tamponu (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio- Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) Dengeleme tamponu 1 Hazırlanışı g Trizma bazı tartıldı ve hacim 100 ml olacak şekilde suda çözüldü g EDTA disodyum tuzu tartıldı ve hacim 100 ml olacak şekilde suda çözüldü g NaCl tartıldı ve hacim 50 ml olacak şekilde suda çözüldü. 10 ml Trizma çözeltisi, 10 ml EDTA çözeltisi ve 12 ml NaCl çözeltisi karıştırıldı. Hacim 95 ml ye tamamlandı. 1:5 oranında seyreltilmiş HCl çözeltisinden birkaç damla damlatılarak manyetik karıştırıcı aracılığıyla karıştırılarak bir ph metre yardımıyla ph: 7.4 olacak şekilde ayarlandı g DTT ve 4.0 g TCA tartıldı, yavaş yavaş aseton ilave edilerek karıştırıldı. Her ikisi birden çözüldü ve hacim 40 ml ye tamamlandı g üre ve 0.2 g CHAPS tartıldı. Her ikisi de 5 ml suda düşük sıcaklıkta (~40 C de) manyetik karıştırıcı aracılığıyla k a r ı ş t ı r ı l a r a k ç ö z ü l d ü. S ı c a k l ı ğ ı n yükselmesine izin verilmedi. Daha sonra hacim 10 ml ye tamamlandı. Ependorf tüpler içinde 250 µl olacak şekilde porsiyonlara bölündü ve -20 C de saklandı. Kullanılmadan önce çözüldü, vortekslendi ve üzerine her bir porsiyon için 20 µl Bio-Lyte 3/10 amfolit ve 1 küçük damla kadar bromfenol mavisi mikropipetle eklendi ml %30 luk ultrasaf gliserol, 1 şişe hazır dengeleme tamponu katı karışımını çözmek için kullanıldı. Çözeltinin 4 ml lik iki kısmı ayrıldı ve bu kısımlardan ilkine kullanılmadan önce 5 µl 200 mm TBP çözeltisinden eklenerek karıştırıldı ve taze çözelti hazırlandı.

98 77 Tampon Çözelti Hazırlanışı Dengeleme tamponu g IAA tartıldı ve dengeleme tamponu 1 için hazırlanan 4 ml lik ikinci kısma kullanımdan hemen önce ilave edilerek karıştırıldı ve taze çözelti hazırlandı. %7 (h/h) lik asetik asit çözeltisi 500 ml su üzerine 70 ml glasiyel asetik asit ilave edildi, karıştırıldı ve hacim 1 L ye tamamlandı. %7 (h/h) asetik asit, %10 (h/h) metanol çözeltisi 50 mm Amonyumbikarbonat çözeltisi %25 Asetonitril/50 mm Amonyumbikarbonat (h/h) çözeltisi 10 mm DTT içeren 25 mm amonyumkarbonat çözeltisi 55 mm IAA içeren 50 mm amonyumkarbonat çözeltisi 16 µg ml -1 tripsin içeren %25 Asetonitril/50 mm Amonyumbikarbonat (h/h) çözeltisi 500 ml su üzerine 70 ml glasial asetik asit ve 100 ml metanol ilave edildi, karıştırıldı ve hacim 1 L ye tamamlandı g NH4HCO3 tartıldı ve bir miktar distile suda çözülerek hacim 100 ml ye tamamlandı g NH4HCO3 tartıldı ve bir miktar distile suda çözüldü. Üzerine 25 ml asetonitril ilave edildi ve hacim suyla 100 ml ye tamamlandı mg DTT tartılıp 10 ml 25 mm amonyumkarbonat çözeltisinde çözüldü 104 mg IAA tartılıp 10 ml 25 mm amonyumkarbonat çözeltisinde çözüldü g tripsin tartıldı ve yukarıda anlatıldığı şekilde hazırlanan çözelti içinde kullanılmadan hemen önce çözüldü. %0.5 Triflorasetikasit çözeltisi 250 µl Triflorasetikasit, suda çözülerek hacim 50 ml ye tamamlandı.

99 78 Tablo 3.4. Proteomik çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler. Kimyasal Firma Kullanım Amacı ReadyPrep 2-D Cleanup Kit Bio-Rad Proteinlerin çöktürülmesinde IPG şerit numune yükleme tablası Bio-Rad Proteinlerin IPG şeritlere yüklenmesinde ReadyStrip IPG şerit ph 3-10, 11 cm ReadyStrip IPG şerit ph 4-7, 11 cm ReadyStrip IPG şerit ph 5-8, 11 cm Bio-Rad Bio-Rad Bio-Rad IEF (1.boyut) IEF (1.boyut) IEF (1.boyut) Elektrot kağıdı (Electrode Wicks) Bio-Rad IEF (1.boyut) Criterion XT gel 4-12% Bis-Tris IPG 1 Well Comb, 11 cm, 1.0 mm Criterion TGX gel 4-15% Bis-Tris IPG 1 Well Comb, 11 cm, 1.0 mm Bio-Rad Bio-Rad SDS-PAGE (2.boyut) SDS-PAGE (2.boyut) Jel kazıyıcı (gel releaser) Bio-Rad SDS-PAGE (2.boyut)

100 79 Tablo 3.5. Proteomik çalışmalarda kullanılan cihazlar ve ekipmanlar Cihaz Firma * Kullanım Amacı Ultrasantrifuj cihazı Optima MAX/MAX-E Beckman Coulter Hücre kültürü çalışmalarında sitozolik fraksiyon eldesinde ve proteinlerin çöktürülmesinde Microplate Spectrophotometer XS PowerWave Protein miktar tayininde spektrofotometrik ölçümler için Thermo-mixer mikrotüler ve PCR plateleri için (24 x 1.5 ml hazneli) Eppendorf Proteinlerin çöktürülmesi ardından yükleme tamponuyla çözülmesini kolaylaştırmak için PROTEAN IEF System Bio-Rad IEF (1.boyut) Orbital karıştırıcı Cole Parmer IPG şeritlerin dengeleme tamponları ile karıştırılarak dengelenmesinde Criterion Cell Bio-Rad SDS-PAGE (2.boyut) PowerPac HC Power Supply Bio-Rad SDS-PAGE (2.boyut) Versa-Doc image system Bio-Rad Jellerin görüntülenmesinde PROTEINEER dp istasyonu 386-well OptiTOFTM plate ABI 4800 MALDI-TOF/TOF-MS Brucker Daltonics Applied Biosystem Applied Biosystems Proteinlerin peptitlerine parçalanması ve MALDI için hazırlanmasında MALDI-TOF-MS için peptitlerin cihaza verilmesinde Kütle spektrometresi analizleri için * Beckman (Fullerton, CA, ABD), PowerWave (Winooski, VT, ABD), Eppendorf (Hamburg, Almanya), Cole-Parmer (Vernon Hills, IL, ABD), Brucker Daltonics (Bremen, Almanya), Applied Biosystems (Framingham, MA, USA)

101 80 Tablo 3.6. Proteomik çalışmalarda kullanılan yazılım ve veribankası. Yazılım/Veribankası PDQuest TM 2D Analysis Software (versiyon 8.0) ABi 4000 Series Explorer Spot Set Manager MASCOT software v GPS Explorer TM v4.9 NCBI protein database (NCBI no (11,960,556 sequences; 4,082,908,561 residues)). protein Firma/ Kaynak Bio-Rad Applied Biosystems 1 Matrix Science Applied Biosystems 1 National Center for Biotechnology Information Kullanım Amacı İmaj analizinde Numunelere ait spektrumların kaydedilmesinde Peptit dizileme çalışmalarında Peptit dizileme çalışmalarında veritabanının kullanılmasında Peptit dizileme çalışmalarında veritabanı olarak yararlanılmak amaçlı 1 İnternet üzerinden serbest olarak erişilebilen yazılım veya veribankasıdır. Ticari amacı yoktur Proteinlerin Çöktürülmesi HT29 kolon kanseri, K562/R ve K562/wt kan kanseri hücre hatlarından T ve C grupları için elde edilen sitozolik fraksiyonlar -80 C de her bir tüpte yaklaşık 0.5 er ml olacak şekilde ependorf tüplere ayrılarak saklanmıştır. Bu fraksiyonlar proteomik çalışmalara başlanacağı gün her bir hücre hattı için T ve C gruplarına ait toplam 2 şer ml olacak şekilde (4 adet T grubu için, 4 adet C grubu için toplam 8 ependorf tüp) alınarak oda sıcaklığında eriyene kadar bekletilmiş ve ardından vortekslenmiştir. Eldeki çözeltiler T ve C grupları için 8 ayrı tüpe 250 şer µl olacak şekilde paylaştırılmış ve üzerlerine -20 C de bekletilmiş soğuk % 10 (a/h) TCA, 20 mm DTT içeren aseton çözeltisinden 1.5 ml eklenmiştir. Proteinlerin çöktüğünün

102 81 gözlenmesiyle birlikte vortekslenmiş ve -20 C de bir gece bekletilmek suretiyle muhafaza edilmiştir. Bu sayede proteinlerin geri kazanımının en üst düzeyde olması amaçlanmıştır. Ertesi gün rpm de 10 dakika boyunca 9 C de santrifuj edilmiş ve santrifugat atılmıştır. Pelletler, 2 kere 1 ml ve bir kere de 0.5 ml -20 C de bekletilmiş asetonla yıkanmış ve ependorf tüp içinde oda sıcaklığında kurutulmak üzere bekletilmiştir. Tamamen kuruduğundan emin olunan pelletler satın alınmış olan hazır yükleme tamponunda çözülmüş ve 1 saat boyunca oda sıcaklığında Eppendorf thermo mixer cihazı ile karıştırılarak inkübe edilmiştir Proteinlerin Çöktürme Sonrası Geri Kazanımının Hesaplanması Proteinlerin çöktürme öncesinde homojenizasyon tamponundaki miktarı HT29 hücre hattı kontrol grubu için DC TM Protein assay 1 kullanılarak bulunmuş ve çöktürme sonrasındaki protein miktarı ise Bio-Rad TM protein assay 2 kullanılarak analiz edilmiştir. Bunun için satın alınan yükleme tamponuna eşdeğer olacak şekilde baştan hazırlanan yükleme tamponuna amfolitler ve bromfenol mavisi eklenmeden pellet çözülmüş ve çöktürme öncesi ve sonrasındaki protein miktarlarından yola çıkılarak gerikazanılan protein miktarı 3 hesaplanmıştır. DC TM Protein assay, Lowry ve ark. tarafından geliştirilen (184) ve proteinlerin bazik ortamda bakır ile kompleks oluşturması ve daha sonrasında Folin reaktifinin bu kompleks tarafından indirgenmesi esasına dayanan hızlı bir yöntemdir. Oluşan karekteristik mavi renk 750 nm de spektrofotometrik olarak ölçülebilmektedir ve protein miktarına bağlı olarak Lambert-Beer yasası gereği ölçülen absorbans değeri protein miktarıyla doğru orantılıdır. DC TM Protein assay in avantajı deterjanlarla ve bazik protein tamponlarıyla uyumlu çalışabilmesidir. Dolayısıyla Tris-HCl tamponunda bazik ph da üre ve EDTA ile uyumlu olarak çalışabilmektedir. DC TM Protein assay, reagent A (bazik bakır tartarat çözeltisi), reagent B (seyreltik folin reaktifi) ve reagent S isminde üç farklı reaktif içermektedir Geri kazanılan protein miktarı = ([çöktürme öncesindeki protein miktarı (µg)] / [çöktürme sonrasındaki protein miktarı (µg)]) x 100

103 82 Bio-Rad TM protein assay ise Bradford ve ark. tarafından geliştirilen (107) yöntemi esas alır. Bu yönteme göre Coomassie mavisi G-250 reaktifinin karakteristik renginde proteinlere bağlanması sonucunda 465 nm den 595 nm ye kayma gerçekleşir (185). Bağlanma özellikle bazik ve aromatik aminoasitler üzerinden gerçekleşir. Arginin, bu aminoasitlerden başlıcasıdır (186). Bio-Rad TM protein assay, protein assay dye reagent concentrate isminde boya, fosforik asit ve metanol karışımından oluşan derişik çözelti içerir. DTT ve benzeri indirgeyici ajanlar ile çalışabilmesi DC TM Protein assay e göre en büyük avantajıdır. Protein miktar tayini için bovine serum albumin yani büyükbaş hayvanların serumundan elde edilen albumin çözeltisi standart olarak kullanılmıştır. Bu amaçla 10 mg ml -1 derişimdeki hazır satın alınmış stok çözeltiden 0.05, 0.15, 0.25, 0.35, 0.5, 0.75 ve 1.5 mg ml -1 derişiminde 7 farklı çözelti toplam hacim en az 150 µl olacak şekilde mikropipet kullanılarak uygun seyreltme oranlarında seyreltilmiş ve taze olarak hazırlanmıştır. Seyreltme işlemi için proteinlerin çöktürülmesi öncesinde hazırlanan homojenizasyon tamponu ve yükleme tamponuna amfolitler ve bromfenol mavisi eklenmeden hazırlanmış çözeltiden oluşan iki farklı seri kullanılmıştır. Böylece çöktürme öncesi ve sonrası için iki ayrı kalibrasyon eğrisi DC TM Protein assay ve Bio-Rad TM protein assay kullanılarak elde edilmiştir. DC TM Protein assay kullanımında ilgili prosedür uyarınca 360 µl reagent A ve 7.2 µl reagent S karıştırılmış ve reagent A ı çözeltisi elde edilmiştir. Bu çözelti üzerine 5 µl standard çözelti eklenmiş ve sonrasında reagent B den 200 µl ilave edilerek minimum 15 dakika, maksimum 1 saat beklenmek koşuluyla ölçümler gerçekleştirilmiştir. Bio-Rad TM protein assay kullanımında ise hazır satın alınan derişik boya çözeltisinden (protein assay dye reagent concentrate) prosedür uyarınca 600 µl alınmış ve 2400 µl su kullanılarak toplam hacim 3 ml ye seyreltilmiştir. 200 µl seyreltik boya çözeltisi üzerine 10 µl standard çözelti ilave edilmiş ve vortekslenmiştir. Numune çözeltileri 1:1, 1:2, 1:4, 1:8 oranlarında standartlarla uyumlu olacak şekilde uygulanan yönteme göre seyreltilerek analiz edilmiş ve kalibrasyon eğrisinin

104 83 içine girecek miktarda proteinin spektrofotometrik analizi hedeflenmiştir. Bütün ölçümler mikro plaka okuyucu spektrofotometre kullanılarak uygun dalga boylarında en az 3 tekrarlı gerçekleştirilmiştir Proteinlerin Miktar Tayini ve Numune Hazırlama Aynı hücre hattı için (HT29, K562/R ve K562/wt) T ve C gruplarına ait 3 er örnek aynı anda hazırlanıp, aynı anda IPG şeritlere yüklenip, aynı anda izoelektrik odaklama işlemine geçilmiş ve SDS-PAGE ile aynı anda ayrılmıştır. Böylece grup içi ve gruplar arasında oluşabilecek muhtemel varyasyonların önüne geçilmesi amaçlanmıştır. HT29 kolon kanseri hücre hatları baz alınarak yapılan geri kazanım çalışmalarının ardından (geri kazanım ~ %90) K562/R ve K562/wt kan kanseri hücre hatları için (T ve C gruplarına ait) protein miktarı çöktürme öncesinde DC TM protein assay kullanılarak ve çöktürme sonrasında Bio-Rad TM protein assay ile gerçekleştirilmiştir. Miktarı belirlenen proteinler çöktürme sonrasında yaklaşık 1 µg ml -1 derişimde olacak şekilde, hazırlanan yükleme tamponunda çözülmüş ve %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi eklendikten 300 µl lik kısımlar halinde her bir hücre hattı ve her bir grup için (T ve C grupları) 3 farklı IPG şeride (ph 5-8) yüklenmiştir Proteinlerin IPG Şeride Yüklenmesi µl (280 µg) protein çözeltisi, 12 kanaldan oluşan IPG şerit tablasının kanalına uygun şekilde kanalın başı ve sonuna temas etmeyecek bir biçimde mikropipet aracılığıyla yayılmıştır 1 (Şekil 3.2). 2- IPG şerit (ph 5-8), -20 C den çıkarıldı ve oda sıcaklığında birkaç dakika bekletildikten sonra koruyucu jelatininden çıkarılarak üzerindeki film bant bir pens yardımıyla el değmeden alınmıştır (Şekil 3.3). 1 Tez çalışması kapsamında yapılan proteomik çalışmalar çerçevesinde Bio-Rad ürünleri kullanılmıştır ve IEF ve SDS-PAGE uygulaması için verilen şekiller literature/ a.pdf internet adresinden serbest olarak erişilebilen Bio-Rad ReadyPrepTM 2-D Starter Kit kullanım kılavuzundan alınmıştır.

105 84 Şekil 3.2. Numunenin tablaya uygun bir biçimde yayılarak tatbiki. Şekil 3.3. IPG şerit üzerinden koruyucu bandın çıkarılması. 3- IPG şerit, örneğin üzerine jel kısmı örnekle nüfuz edecek şekilde bir pens yardımıyla dikkatlice yerleştirilmiştir (Şekil 3.4).

106 85 Şekil 3.4. IPG Şeridin numune üzerine yerleştirilmesi. 5- Jelin tamamının örnek ile temas etmesi ve jel ile örnek çözeltisi arasında hava kabarcığı kalmaması için pens jel üzerinde örneği dışarı taşırmadan gezdirilmiştir. 6- Tablanın plastik kapağı kapatılarak bekletilmiş ve yaklaşık 2 ila 3 saat arası zaman geçtikten sonra örnek çözeltisinin jele neredeyse tamamen difüze olduğu ve az bir miktar çözeltinin tabla üzerinde kaldığı görülmüştür. Bu durumda IPG şeritlerin örneği emdiği kabul edilmiş ve izoelektrik odaklama için şeritler yerlerinden sırayla alınarak IEF cihazının odaklama tablasına yerleştirilmiştir IEF uygulaması (1. boyut) 1- Odaklama tablası, 12 adet kanaldan oluşan ve her bir kanal için iki uçta da elektrik akımının geçmesine yarayan tellerden oluşan bir tabladır. Elektrot kağıtları ise jellerin pozitif ve negatif ucunun elektrot tablasındaki tellerle temasına yardım ederek iletkenliğin devamını sağlayan kare şeklinde kağıtlardır. Elektrot kağıtları, tellerin üstüne konularak mikropipet yardımıyla 2-3 µl kadar su ile ıslatılıp pens ile yerleri sabitlenmiştir (Şekil 3.5).

107 86 Şekil 3.5. Elektrot kağıtlarının tellerin üzerine yerleştirilmesi ve ıslatılması. 2- IPG şerit tablasında bulunan örnek tabladan çıkarılmış ve artı ve eski kutupları uygun konumda olacak şekilde odaklama tablasına yerleştirilmiştir (Şekil 3.6). Elektrot kağıtları ile tam bir temasın sağlanması için pens yardımıyla hafifçe destek verilmiştir. Şekil 3.6. IPG şeritlerin odaklama tablasına yerleştirilmesi. 3- Şerit yerleştirildikten sonra elektrot kağıtları ile temasın sağlandığından emin olunup ve şeridin üzerine üzerine 2.5 ml mineral yağı ilave edilmiştir.

108 87 4- Odaklama tablası IEF cihazına (Şekil 3.7) yerleştirilmiş ve izoelektrik odaklama için Tablo 3.7 de verilen program bir gece müddetince uygulanmıştır. Odaklamanın başladığı ilk saatlerde IPG şeritlerin üzerindeki boyanın kutuplara doğru çekildiği görülmüş ve işlem IEF cihazı göstergelerindeki voltaj ve akım değerleri takip edilerek kontrol edilmiştir. Şekil 3.7. Bio Rad marka PROTEAN IEF Sistemi. Tablo 3.7. İzoelektrik odaklama için uygulanan program. 11 cm IPG şerit Voltaj Zaman Volt x Saat Mod 1.Basamak 1000 V 4 saat ---- Lineer 2.Basamak 8000 V 2.5 saat ---- Lineer 3.Basamak 8000 V V x saat Hızlı 4.Basamak 1000 V 8 saat ---- Lineer Toplam 12 saat V x saat 5- Gecenin sonunda toplam V x saat değeri kontrol edilmiş ve kayıt altına alındıktan sonra SDS-PAGE uygulamasına geçilmiştir SDS-PAGE Uygulaması (2.boyut) 1- Odaklama tablasından çıkarılan IPG şeridin üzerindeki mineral yağının akması için şerit yaklaşık 30 saniye süreyle dikey bir konumda tutulmuştur. Bir peçete üzerine şeridin jel kısmı yukarıda kalacak ve zarar görmeyecek şekilde konumlandırılarak şerit sürülmüş ve mineral yağının alınabildiği kadarı şeritten

109 88 uzaklaştırılmıştır. 2- Şerit, IPG şerit tablasına yerleştirilmiş ve üzerine 4 ml dengeleme tamponu 1 ilave edilerek orbital karıştırıcıda 10 dakika süreyle nazik bir biçimde dengeleme tamponu varlığında hareket ettirilmiştir. 3- IPG şerit Dengeleme tamponu 1 içinden çıkarılmış, dikey bir pozisyonda bir süre bekletilmiş ve tampon, şeritten uzaklaştırılmaya çalışılmıştır. Şerit, yeni bir IPG şerit tablasına konulmuş ve üzerine 4 ml Dengeleme tamponu 2 ilave edilerek orbital karıştırıcıda 10 dakika süreyle hareket ettirilmiştir. 4- Bu sırada Criterion XT MOPS Buffer (20x) hazır satın alınan ticari tampon su ile 1:20 oranında seyreltilmiş ve SDS-PAGE için anot ve katot tamponu olarak kullanılmak üzere ağzı kapalı bir şişede saklanmıştır. Tampon çözeltiden 25 ml lik bir kısım 25 ml lik bir mezürün içine alınmıştır. IPG şerit dengeleme tamponundan çıkarılmış ve üzerindeki dengeleme tamponu çözeltisini tamamen uzaklaştırmak için mezürün içindeki SDS-PAGE tamponuna daldırmak suretiyle temizlenmiştir (Şekil 3.8). Şekil 3.8. IPG şeritlerin SDS-PAGE tamponunda yıkanması. 5-Hazır jel (Criterion XT gel 4-12% Bis-Tris IPG 1 Well Comb, 11 cm, 1.0 mm) 4 C de muhafaza edilen kutusundan çıkarılmıştır. Jelin üzerindeki yeşil renkli tarak alındığında, IPG şerit için hazırlanmış bir yuva ve marker için hazırlanmış ikinci bir yuva bulunmaktadır. Jel bir şeffaf kaset içinde muhafaza edilmiştir. Kaset,

110 89 beyaz renkli jel tutucu konsolun üzerinde sabitlenmiş ve IPG şerit kendi yuvasına jel kısmı dışa doğru bakacak şekilde yerleştirilmiştir (Şekil 3.9). 6- Hazır satın alınan agaroz (%0.5 eritilmiş agaroz, 1x Tris-Glisin-SDS ve %0.001 bromfenol mavisi içeren) çözeltisi bir manyetik karıştırıcıda 40 C ye kadar ısıtılarak magnet ile karıştırılmış ve akıcı bir hal alıncaya kadar karıştırılmaya devam edilmiştir. SDS-PAGE jelin içindeki IPG şerit yuvasında bulunan şerit üzerine sıcak agaroz çözeltisi plastik damlalıkla ilave edilmiştir (Şekil 3.9). Şekil 3.9. IPG Şeridin, SDS-PAGE jele yerleştirilmesi, sıcak agaroz ilavesi ve yerinin sabitlenmesi. 7- Agarozun ilavesiyle birlikte IPG şeridin yeri bir spatül yardımıyla sabitlenmiş ve SDS-PAGE jelle teması sağlanmıştır. 8- Jel daha sonra elektroforez hücresi (Criterion Cell) içine alınmış ve seyreltik SDS-PAGE tamponu, anot ve katot haznelerine hücre içinde belirtilen

111 90 çizgiye kadar doldurulmuştur. 9- Marker (sırasıyla 250, 150, 100, 75, 50, 37, 25, 20, 15, 10 kd luk işaretleyiciler içeren Precision Plus Protein Unstained standard), kendi yuvasına bir mikropipet aracılığıyla 4 µl hacimde ilave edilmiştir. 10- Bütün bu işlemler sonunda SDS-PAGE ile proteinlerin kütlelerine göre ayrılması işleminin başlatılabileceği noktaya gelinmiştir (Şekil 3.10). - SDS-PAGE jel, kutusundan çıkarıldı -! IPG!erit, SDS-PAGE jelin üzerindeki haznesine yerle!tirildi -!"eridin yeri, spatülün ters ucu ile sabitlendi ve jelle teması sa#landı - Jel hücre içine alındı -! Anot-katot tamponları kendi haznelerine eklendi -!Marker, yuvasına mikropipetle konuldu -!Sıcak agaroz, IPG!erit üzerine ilave edildi - Elektroforez ba!latıldı 12.3*.(,$&(-*./0(!"!#$%&'()*+( Şekil SDS-PAGE elektroforez aşamaları. 11-T grubu ve C grubuna ait toplam 6 jelin elektroforezinin yapıldığı sistemde elektroforez hücreleri (3 adet, her birisinde bir C ve bir T grubuna ait bir numune) çok çıkışlı bir güç ünitesine (PowerPac HC Power Supply) bağlanarak jel başına 100 V voltaj uygulaması yapılmıştır. Kısa sürede akım 500 A olan limit değere kadar yükseldi ve 40. dakikadan sonra voltaj değeri toplamda 150 V olacak şekilde ayarlanarak akım 370 A civarına çekilmiştir. 12- Sıcak agaroz çözeltisi içindeki bromfenol mavisine ait şeridin jel üstünde elektroforez süresince doğrusal bir biçimde nizami ilerleyişi elektroforezin

112 91 gidişatının kontolü açısından önem taşımaktadır. Mavi şeritin gidişi elektroforez süresince kontrol edilerek şerit jelin en altına geldiğinde elektroforezin tamamlandığı anlaşılmış ve güç kaynağı kapatılmıştır. Her üç hücrede toplam 6 jel için elektroforezin tamamlanma süresi yaklaşık 100 dakika kadar sürmektedir. 13- SDS-PAGE işlemi sonrasında jel elektroforez hücresinin içinden çıkarılmış ve jelin muhafaza edildiği kaset, jel kazıyıcının ucu aracılığıyla kırılmıştır Jellerin Boyanması 1- Bir piset yardımıyla distile su ile yıkanan jel, jel kazıyıcı aracılığıyla dikkatlice yuvasından çıkarılmış ve plastik bir kaba aktarılmıştır. 2- % 10 Metanol ve % 7 asetik asit içeren çözelti ile jelin yıkanması sağlanmıştır. Bu amaçla çözelti, jelin yüzeyini kaplayacak şekilde plastik kaba konulmuş ve orbital karıştırıcıda (Şekil 3.11) 1 gün süreyle jellerin fiksleme işlemi gerçekleştirilmiştir. Şekil Orbital karıştırıcı. 3- Ertesi gün, yıkama çözeltisi dökülmüş ve jelin bulunduğu plastik kap içine hazır satın alınan floresans boyama çözeltisi (SYPRO-Ruby Protein Gel Stain) jel yüzeyini kaplayacak kadar ilave edilmiştir. 4- Jellerin içinde bulunduğu kabın yüzeyi aluminyum folyo ile sarılarak ışıkla temasın önüne geçilmiş ve jel bu şekilde 48 saat süresince orbital karıştırıcıda karıştırılarak proteinlerin boyanması gerçekleştirilmiştir saatin sonunda çıkarılan jeller imaj görüntüleme cihazına (Versa-Doc image system) götürülerek fotoğraflanmıştır (Şekil 3.12).

113 92 Şekil Bio Rad marka Versa Doc Image system görüntüleme cihazı İmaj Görüntüleme Çalışmaları 1- İmaj görüntüleme cihazının tablası etanol kullanılarak bir peçete yardımıyla temizlenmiştir. Etanolün kurumasının ardından jel, cihaz tablasının merkezine yerleştirilmiştir. 2- Cihazın objektifi en iyi görüntüyü elde edebilmek için jelin yüzeyi üzerine yakınlaştırma yapılmış ve objektif odaklanmıştır. Flat denilen koruyucu film kullanılarak 20 saniye görüntü yakalama süresinde (capturing time) jel görüntülenmiştir. 3- Jel görüntüsü bilgisayara TIFF ve JPEG resim dosyası olarak kaydedilmiştir. 4- Herbir jel için elde edilen dijital görüntü üzerinde Microsoft Office Resim görüntüleyici kullanılarak kontrast ayarı yapılmış ve jellerin üzerindeki marker standardlarını içeren kısım ve kör kısım kesilip temizlenmiştir. 5- Spotların tamamını içine kapsayacak şekilde ayarlanmış her bir resim dosyası birbiriyle eşit boya getirilmiş ve imaj analizi programında jel haritasının belirlenmesi ve farklılaşan spotların tespiti için imaj analizi programına (PDQuest TM 2D Analysis Software) yüklenmiştir İmaj Analizi Çalışmaları 1- Jel haritasının belirlenmesinde, analiz programının arzu ettiği şekilde jel görüntülerinden birinin üzerinde gözle görünebilecek en küçük spot, görünen en büyük spot ve görülebilecek en saydam spot işaretlenerek programın spot

114 93 olabileceğini düşündüğü bütün noktaları otomatik olarak bulması sağlanmıştır. 2- Otomatik olarak işaretlenen noktalar tek tek jel görüntüleri yakınlaştırılarak taranmış ve kordinatları her bir jel için eşleştirilmiştir. 3- Program tarafından tespit edilemeyen spotlar, jel görüntüleri üzerinde adım adım ilerleyerek bulunmaya çalışılmıştır. 4- Bütün spotlar herbir jel için eşleştirildiğinde ve koordinatları belirlendiğinde spotlar arasından intensiteleri grup içinde birbiriyle istatistiksel olarak %99 güven seviyesinde örtüşenler Statistic 1 adı verilen bir analiz kümesinde toplanmıştır. Gruplar arasında (T ve C grupları) intensiteleri birbirinin en az 2 katı farklılaşmış olanlar ise Quant 1 isminde bir analiz kümesinde tanımlanmıştır. 5- Booln 1 isminde yeni bir küme daha oluşturulmuş ve bu küme Statistic 1 ve Quant 1 in kümelerinin kesişim kümesindeki spotları içerecek şekilde tanımlanmıştır. 6- Böylece grup içi %99 güven seviyesinde intensiteleri birbiriyle uyuşan, ancak gruplar arasında en az 2 kat intensite farkı gözlenen spotların koordinatları tespit edilmiştir. 7- Tespit edilen bu spotlar tek tek taranarak bir hata olup olmadığı kontrol edilmiştir. Böylece spotlardaki farklılaşmalar göz taramasıyla da kontrol edilmiştir ve hataların önüne geçilmiştir. 8- Farklılaştığı tespit edilen spotlar T ve C grupları için farklılaşan intensite sıralamasına göre tablolanmıştır Jel İçindeki Proteinlerin Peptidlerine Parçalanması ve MALDI- TOF-MS için Hazırlanması 1- Tablo üzerinde T ve C grupları için en yüksek seviyede farklılaşan spotların yerleri jel üzerinde MALDI-TOF-MS ile analiz edilmek üzere tespit edilmiştir. 2- Seçilen protein spotlar manuel olarak lansetle 1 kesilerek çıkarılmış ve 1 Küçük, keskin, üçgen biçimli kesici alettir. Steril olanları parmaktan kan almak için kullanılır.

115 94 ependorf tüplere konulmuştur. Daha sonra 96-delikli levhaya (96-well plate) alınmıştır. 3- Bundan sonraki işlemler Proteineer dp TM cihazı tarafından kapalı bir ortamda otomatik olarak gerçekleştirilmiştir. 4- Spotlar önce 50 mm amonyum bikarbonat çözeltisiyle yıkanmıştır. 5- Daha sonra ise 10 mm DTT içeren 25 mm amonyum bikarbonat çözeltisiyle proteinler yükseltgenmiş ve 55 mm IAA içeren 50 mm amonyum bikarbonat çözeltisi ile proteinlerin alkillenmesi sağlanmıştır. 6- Spotlar tekrar 50 mm amonyum bikarbonat çözeltisiyle yıkanmış ve son olarak asetonitril ile kalan organik artıklar temizlenmiştir. 7- Kuru azot altında spotlar kurutulmuştur µg ml -1 tripsin içeren % 25 asetonitril/50 mm amonyum bikarbonat çözeltisi spotların üzerine ilave edilmiş ve 37 C de 6 saat süreyle bekletilmiştir. 9- Parçalanma reaksiyonu %0.5 TFA çözeltisi eklenmesi ile durdurulmuş ve peptidler ekstre edilmiştir. 10- Peptidler, hızlı vakum santrifügasyonu (speed-vacuum centrifugation) ile santrifuj edilmiştir. 0.8 µl olacak şekilde hazırlanan örnek çözeltisi 386-delikli OptiTOFTM levhasına alınmış ve oda sıcaklığında kurutulmuştur mg ml -1 CHCA ( -ciyano-4-hidroksisinamik asit) çözeltisi içerecek şekilde hazırlanan 0.8 µl lik MALDI çözeltisi levha kuyucuklarında bulunan örneklerin üzerine eklenmiş ve oda sıcaklığında kuruyana kadar bekletilmiştir Peptid Dizileme ile Proteinlerin Tanımlanması 1- Numuneler MALDI-TOF/TOF-MS cihazı ile pozitif iyon modunda iyon hızlandırma potansiyeli 25 kv olacak şekilde ayarlanıp, MS/MS için 1 kv voltaj uygulanmak suretiyle analiz edilmiştir. 2- Elde edilen spektrumlar cihaza ait ABi 4000 Series Explorer Spot Set Manager programında saklanmıştır. 3- GPS Explorer v4.9 programı kullanılarak eldeki spektrumlar MASCOT

116 95 software v programına aktarılmış ve NCBI protein veribankasının spektrumlar için taranması sağlanmıştır. 4- %95 güven seviyesinde çalışılarak veribankasından numunedeki peptid dizileri için olası proteinler tanımlanmıştır. 5- Elde edilen veriler ışığında; HT29, K562/R ve K562/wt kanser hücre hatları için biberiye ekstrelerinin tatbiki sonucunda nicel anlamda yüksek miktarda ve düşük miktarda ifade edilen proteinler bu sayede aydınlatılmıştır Metabolomik Çalışmalar Tez çalışması kapsamında yapılan metabolomik çalışmalarda kullanılan kimyasallar (Tablo 3.8), hazırlanan çözeltiler (Tablo 3.9), kullanılan sarf malzemeler (Tablo 3.10), kullanılan cihazlar (Tablo 3.11) ve metabolit profillemede yararlanılan yazılım ve veribankaları (Tablo 3.12) aşağıda verilmiştir. Çözeltilerin hazırlanmasında kullanılan su daima MS grade saflıktadır.

117 96 Tablo 3.8. Metabolomik çalışmalarda kullanılan kimyasallar. Kimyasal Firma * Kullanım Amacı Su (MS grade) Scharlu CE-MS için kullanılan çözeltilerin hazırlanmasında Formik asit (> %98, 250 ml) Fluka CE-MS için çalışma elektrolitinin hazırlanmasında İzopropanol Riedel-de Haën CE den çıkan maddelerin ESI a gönderilmesi sırasında koruyucu sıvı (Sheath liquid) hazırlanmasında ve ESI- TOF kalibrasyonu için sodyum format çözeltisinin hazırlanmasında Arginin Sigma-Aldrich Metabolit standartı Lizin Sigma-Aldrich Metabolit standartı Histidin Sigma-Aldrich Metabolit standartı Valin Sigma-Aldrich Metabolit standartı Serin Sigma-Aldrich Metabolit standartı Lösin Sigma-Aldrich Metabolit standartı Treonin Sigma-Aldrich Metabolit standartı Glutamin Sigma-Aldrich Metabolit standartı Prolin Sigma-Aldrich Metabolit standartı Aspartik asit Sigma-Aldrich Metabolit standartı Tirosin Sigma-Aldrich Metabolit standartı Sodyum format Sigma-Aldrich MALDI-TOF-MS cihazının kalibrasyonunda * Riedel-de Haën (Seelze, Almanya)

118 97 Tablo 3.9. Metabolomik çalışmalarda kullanılmak üzere hazırlanan çözeltiler. Tampon Çözelti Hazırlanışı 1 M Formik asit, ph: ml formik asit, 95 ml su ile karıştırılıdı ve hacim 100 ml ye tamamlandı. İzopropil alkol-su (50:50 h/h) 50 ml su ile 50 ml izopropanol karıştırıldı. 1 M NaOH çözeltisi 4 g NaOH, 95 ml suda çözüldü. Toplam hacim 100 ml ye tamamlandı. Sodyum format (10 mm) İzopropil alkol-su (50:50 h/h) karışımının 50 ml si üzerine 1 ml 1 M formik asit ve 1 ml 1 M NaOH eklendi. Hacim 100 ml ye izopropil alkol-su (50:50 h/h) karışımı ile tamamlandı. Aminoasit çözeltileri (Metabolit standartları olarak kullanılmak üzere) arginin (0.58 mg ml -1 ), lizin (0.49 mg ml -1 ), histidin (0.52 mg ml -1 ), valin (0.39 mg ml -1 ), serin (0.35 mg ml -1 ), lösin (0.44 mg ml -1 ), treonin (0.40 mg ml -1 ), glutamin (0.49 mg ml -1 ), prolin (0.38 mg ml -1 ), aspartik asid (0.44 mg ml -1 ) ve tirosin (0.09 mg ml -1 ) bir spatül ucu ile hassas terazi içindeki cam kaba konuldu ve uygun miktarda su ile seyreltilerek verilen derişimlerde standart çözeltiler hazırlandı. Tablo Metabolomik çalışmalarda kullanılan sarf malzemeler Sarf Malzeme Firma * Kullanım Amacı UltraFiltre: Amicon Ultra-0.5, Ultracel-3 Membrane, 3 kda Eritilmiş silika kapiler (50 µm id) Millipore Composite Metal Services Sitozolik fraksiyondan metabolitleri süzmek için CE-MS çalışmalarında kullanılmak üzere (90 cm olacak şekilde kesildi) * Millipore (Massachusetts, ABD), Composite Metal Services (Worcester, İngiltere)

119 98 Tablo Metabolomik çalışmalarda kullanılan cihazlar ve ekipmanlar. Cihaz Firma Kullanım Amacı Yüksek performanslı kapiler elektroforez (CE) sistemi, Beckman P/ACE 5500, System Gold yazılımı yüklü bilgisayara bağlı Beckman CE-MS çalışmalarında metabolitlerin ayrımını sağlamak için Şırınga pompası Cole Palmer CE den çıkan maddelerin ESI a gönderilmesi sırasında koruyucu sıvıyı (Sheath liquid) şırıngadan ESI-TOF a sürekli ve sabit akış altında göndermek için Ortogonal elektrosprey iyonizasyon arayüzü model Agilent G1607A TOF MS cihazı Bruker microtof marka Bruker Daltonics yazılımı yüklü bilgisayara bağlı Agilent Technologies Bruker Daltonics CE ile MS cihazı arasında bağlantıyı sağlamak için kullanılan arayüz CE-MS çalışmalarında kapilerden çıkan metabolitlerin kütlelerini yüksek hassasiyetle ölçmek için Tablo Metabolomik çalışmalarda kullanılan yazılım ve veribankası. Yazılım/Veribankası Firma/ Kaynak Kullanım Amacı System Gold yazılımı Beckman CE cihazının yönetimini sağlamak için Bruker Data Analysis 3.3 Bruker MS cihazının yönetimini sağlamak ve elektroferogramları görüntülemek ve işleyebilmek için R yazılımı 1 The R Project for Statistical Computing XCMS uygulamasını çalıştırabilmek için

120 99 Yazılım/Veribankası XCMS Metlin Veribankası Human Metabolome Database (HMDB) KEGG Veribankası MassTRIX: Mass TRanslator into Pathways v2 Firma/ Kaynak 1 Scripps Center for Metabolomics 1 Scripps Center for Metabolomics 1,2 İnsan metabolom projesinin (HMP) sonucu oluşturulan veribankası 1 Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes 1 German Research Center for Enviromental Health Kullanım Amacı Metabolit profilleme ve T ve C grupları arasında farklılaşan metaboltilerin tespiti ve verilerin istatistiksel olarak değerlendirilmesi için Metabolit profillemede (XCMS ile bağlantılı olarak çalışabilen bir veribankasıdır) Metabolit profillemede Metabolitlerle ilişkili metabolik yolakların belirlenmesinde Tanımlanan metabolitlerin KEGG veribankası ile otomatik olarak ilişkilendirilmesinde 1 İnternet üzerinden serbest olarak erişilebilen yazılım veya veribankasıdır. Ticari amacı yoktur. 2 İnsan Metabolom Projesi, 2005 yılında Kanada Alberta Üniversitesi nin, Genom Kanada ve Kanada İnovasyon Kurumu nun desteği ile başlayan bir projedir. HMP projesi ile insan vücut sıvılarındaki tüm metabolitleri tanımlamak, ölçmek ve elde edilen bilginin serbestçe elektronik ortamda ulaşılabilir olmasını sağlamak (Human Metabolome Data Base-HMDB) amaçlanmıştır. David Wishart (Departments of Computing Science & Biological Sciences, University of Alberta) yürütücülüğünde devam etmektedir.

121 Metabolitlerin Örnek Çözeltisinden Alınması Metabolitlerin örnek çözeltisinden alınması için metanolle metabolitlerin ekstre edilmesi, ultrafiltrasyon ve katı faz ekstraksiyon teknikleri içinden diğer iki tekniğe göre uygulaması daha kolay ve diğer iki tekniğe paralel olarak yüksek verimlilikte metabolit kazanımına olanak tanıyan ultrafiltrasyon tekniği kullanılmıştır (182). Bu amaçla: 1- K562/R hücre hatlarına ait Bölüm de anlatıldığı şekilde hazırlanan ve -80 C de saklanan örnekler oda sıcaklığında eriyene kadar bekletilmiş ve ardından vortekslenmiştir. 2- Fraksiyonlar, 500 µl hacimde alınarak ultrafiltreye konulmuş ve 20 C de 40 dakika, rpm de santrifuj edilmiştir. Santrifuj işlemi sonrasında ağırlığı 3 kd dan küçük moleküller filtreden süzülerek tüp içinde toplanmıştır. Şekil 3.13 de tez çalışması kapsamında kullanılan Millipore marka Amicon Ultra-0.5, Ultracel-3 Membrane, 3 kda (0.5 ml hacimli, 3 kd luk filtre) için kullanım aşamaları 10 kd lu bir ultrafiltrasyon örneği üzerinden şematize edilmiştir 1. Buna göre 1. aşama sitosolik fraksiyonun yüklenmesi, 2. aşama santrifuj edilerek metabolitlerin (aşağıda kalan fraksiyon) ayrılması, 3. aşama numune içinde kalan yüksek molekül ağırlıklı moleküllerin (proteinler, peptidler vb.) geri kazanımı ve 4. aşama ise yüksek molekül ağırlıklı moleküllerin toplanmasını göstermektedir. Metabolit profilleme çalışmalarda 2. aşamada elde edilen metabolit fraksiyonu kullanılmıştır. 3- Metabolit fraksiyonları 50 µl olacak şekilde ependorf tüplere dağıtılmış ve CE-MS ile analiz edilene kadar -80 C de saklanmıştır. 1 İlgili şekil Millipore firmasının ürün tanıtım amaçlı resmi sitesinden alınarak uyarlanmıştır. Amicon Ultra-0.5 ml Centrifugal Filters for Protein Purification and Concentration:

122 101!"#$%&' ()*+&,-%.' /+'0/')12&' 3/&,4)5)*' 6"7#)' 8' 88' 888' 89' Şekil Amicon Ultra-0.5 ml ultrafiltre için gösterilen kullanım aşamaları Metabolitlerin CE-MS ile Analizi için Optimum Koşullar 1- Çalışma süresince kullanılan 90 cm uzunluğunda kesilmiş eritilmiş silika kapiler (50 µm iç çapa sahip), kasetinin içine yerleştirilmiş ve kullanılmadan önce 20 dakika 0.1 M NaOH, 20 dakika su ve 20 dakika çalışma elektroliti (1 M formik asit ph: 1.8) ile yıkanmıştır. 2- Herbir enjeksiyon sonrasında kapiler 4 dakika su geçirilerek yıkanmış ve ardından 4 dakika boyunca çalışma elektroliti geçirilmiştir. 3- CE ile ESI-TOF-MS cihazı arasındaki bağlantı ortogonal elektrosprey iyonizasyon arayüzü kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 4- İzopropanol:su (50:50 h/h) den oluşan ve sheath liquid denilen koruyucu sıvı şırınga içine doldurulmuş ve şırınga pompası kullanılarak arayüz vasıtasıyla daimi suretle MS cihazına 0.24 ml dak -1 akış hızında enjekte edilmiştir. Sheath-flow dizaynı olarak tabir edilen bu uygulamada amaç ESI kaynağının stabil bir şekilde çalışmasını sağlamak ve kapilerin katot ucunda elektriksel iletim oluşturmaktır (187). 5- Kütle spektrometresi, ESI kaynağı kullanılarak pozitif modda çalıştırılmıştır. 6- Nebulizer olarak 0.4 bar basınçta azot gazı (N2) 4 L dak -1 akış hızında kullanılmış ve ESI odasının sıcaklığı 250 C ye ayarlanmıştır. 7- CE ile ayrım için 0.1 M formik asit ph: 1.8 çözeltisi çalışma elektroliti

123 102 olarak kullanılmış ve örnekler 6 şar tekrarlı olacak şekilde 0.5 psi (34.5 mbar) basınçta ve 80 saniye enjeksiyon süresinde hidrodinamik olarak enjekte edilmiştir. Basınç, azot gazı ile sağlanmıştır. 8- Ayrım için 25 kv voltaj uygulanmış ve kapiler sıcaklığı 25 C de tutulmuştur. Analiz süresi 25 dakikadır. 9- Taranan aralık m/z olarak belirlenmiştir. 10- Her bir analiz tamamlandığında sodyum format çözeltisi kapilerden geçirilmiş ve sodyumformat ürünlerinden oluşan piklere ait ( , , , , , , ve m/z) değerler kullanılarak Bruker Daltonics firması tarafından önerildiği şekilde 1 dış kalibrasyon (external calibration) ve iç kalibrasyon (internal calibration) ile ESI-TOF sistemi kalibre edilmiştir. 11- Analiz sırasında elektroforegramlar incelenmiş ve akım düşmesi, zemin çizgisinin düzelmemesi, cihaza bağlı UV dedektörde gözlem sonucu numunenin ESI- TOF sistemine girememesi gibi bir sorun görüldüyse analiz durdurulmuştur. Bu gibi durumlarda kapilerin ESI-TOF a giren ucunun kesilerek baştan hazırlanması, kapilerin yıkanması ve gerekiyorsa kapilerin değiştirilmesi yoluna gidilmiştir. Herbir analize ait elektroferogramın bir önceki analiz için elde edilen elektroferogramla benzerliği göz taraması ile kontrol edilmiştir XCMS ile Metabolit Profilleme Çalışmaları 1- XCMS, CE-MS cihazından aldığı verileri doğrudan işleyemeyeceği için cihazdan alınan veriler NetCDF dosya formatına dönüştürülerek aynı klasöre kaydedilmiştir. 2- Bilgisayara R programlama dili yüklenmiş ve XCMS e ait kütüphaneler internet üzerinden çağırılarak programa tanıtılmıştır. 3- Dosyaların işlenmesinde Ek 1 de verildiği şekilde bir kod yani script 2 1 Bruker Daltonics firmasının ESI-TOF sistemine ait detaylı kalibrasyon uygulamaları için: ftp://ftp.bruker.es/ms/public/ciudad_real/05_calibration%20for%20esi-tof.pdf (Son ulaşım tarihi: ) 2 Herhangi bir program dilinde yazılmış uygulama parçalarının tümünün kodlarını içeren kod bütününe script adı verilmektedir.

124 103 yazılmıştır. XCMS ile CE-MS verilerinin işlenmesinde wavelet transform algoritmasını kullanan centwave metodu kullanılarak metabolitlere ait olası pikler tespit edilmiştir. 4- Veriler işlendikten sonra XCMS tarafından elde edilen tabloda %95 güven seviyesinde (p<0.05) eşleşen pikler tespit edilmiştir. 5- Göç zamanı 6 ila 23 dakika arasında kalan pikler dışındakiler listeden çıkarılmıştır. 6- Kalan metabolit pikleri için her bir olası metabolitin pik alanı, o analiz için tespit edilen piklerin toplam alanına bölünerek normalizasyon gerçekleştirilmiştir. 6- Normalizasyonu gerçekleştirilen pikler için tekrar %95 güven seviyesinde örtüşenler Microsoft Excel ile istatistiksel hesap yapılarak tespit edilmiştir. Geri kalan pikler listeden çıkarılmıştır. 7- Tespit edilen pikler için Microsoft Excel tablosunda yeni numaralar verilmiş ve bu piklerle ilgili olarak XCMS tarafından verilen elektroferogramlar gözden geçirilerek pik olmadığı düşünülen sinyaller ve gürültü seviyesindeki sinyaller listeden çıkarılmıştır. 8- Kalan pikler göç zamanına göre sıralandığında göç zamanı birbiriyle uyuşan piklerin aslında [M + H] + yani birer metabolit piki değil de bir izotop piki veya bir metabolite ait [M + Na] +, [M + K] +, [M + NH4] + gibi ESI ürünleri (adducts) olup olmadığının anlaşılması için R altında XCMS ile birlikte çalışan AStream (188) uygulamasından yararlanılmış ve Ek1 de verildiği şekilde bir script yazılmıştır. 9- AStream ile oluşturulan tablo ile XCMS ile oluşturulan tablo eşleştirilmiş ve izotoplar ile ESI ürünleri ortaya çıkarılmıştır. Bu pikler orjinal elektroferogramlar üzerinde kontrol edilmiş ve izotop veya ESI ürünü olduğu düşünülenler işaretlenerek listesinden çıkarılmıştır. 10- Kalan piklere ait son liste MassTrix veribankasına yüklenmiştir. MassTrix veribankasına göç zamanına göre sıralı olarak yüklenen m/z değerleri veribankası altında çalışan uygulama tarafından yaklaşık 24 saat kadar bir sürede işlendikten

125 104 sonra verilen liste 0 ila 7.0 ppm hata payı aralığında KEGG veribankası yardımıyla tespit edilen metabolitlere ait listedir. MassTrix veribankasına veri girişi sırasında kullanılan parametreler Şekil 3.14 deki MassTrix web sayfası ekran çıktısında gösterilmektedir. Şekil Verilerin yüklenmesinde MassTrix parametrelerine ait ekran çıktısı 11- MassTrix maksimum 7.0 ppm hata payı ile KEGG veribankasını taramaktadır, ancak cihazın hata payı 10.0 ppm dir. Dolayısıyla 7.0 ila 10.0 ppm hata payı aralığında kalan metabolitler Metlin sistemi altından manuel tarama yapılarak tespit edilmiştir. 12- Böylece K562/R hücre hattı için CE-MS ile analiz yapılıp XCMS kullanılarak metabolit pikleri tespit edilmiştir. KEGG veribankası, MassTrix yardımıyla taranarak 0 ila 7.0 ppm hata payı aralığında metabolit profilleme gerçekleştirilmiş, 7.0 ila 10.0 ppm hata payı aralığındaki metabolitler ise Metlin sistemi altından HMDB de taranarak tanımlanmıştır.

126 BULGULAR 4.1. Proteomik Çalışmalar Proteinlerin 2-D Jel elektroforez ile ayrımı öncesi Bölüm de anlatıldığı şekilde hazırlanan sitozolik fraksiyondan çöktürülerek ayrılması gerekmektedir. T ve C grupları için yüksek miktarda ve düşük miktarda ifade edilmiş proteinlerin tespitinde her iki grup için eşit miktarda total proteinin jel üzerinde ayrılmış olması, imaj analizi çalışmalarında intensite farklarından dolayı ortaya çıkabilecek sistematik hataları en aza indirger. Bu amaçla çöktürülen proteinlerin (Bölüm 3.2.1) çöktürme öncesi ve çöktürme sonrası miktarlarını yani çöktürme işleminin geri kazanımını bilmek önemlidir. Proteinlerin çöktürme sonrası geri kazanım değerlerinin bulunması Bölüm de anlatıldığı şekilde gerçekleştirilmiştir Proteinlerin Çöktürme Sonrası Geri Kazanım Değerleri HT29 kolon kanseri hücre hatlarına ait kontrol grubu için (C grubu) proteinlerin çöktürülmesi sonrası geri kazanım değerleri hesaplanmıştır. Bu amaçla hücre kültürü çalışmaları sonrası elde edilen sitozolik fraksiyonun 300 µl lik üç örneğinden protein miktar tayini DC TM Protein assay kullanılarak yapılmıştır. -20 C de bekletilmiş soğuk %10 (a/h) TCA, 20 mm DTT içeren aseton çözeltisi ile çöktürme sonrası elde edilen pelletler ise 8 M üre, %2 CHAPS ve 50 mm DTT içeren 300 µl yükleme tamponunda çözülmüş ve Bio-Rad TM protein assay ile protein miktar tayini gerçekleştirilmiştir. DC TM Protein assay ve Bio-Rad TM protein assay ile elde edilen kalibrasyon eğrileri Şekil 4.1 de verilmektedir. Proteinleri çöktürmeden önce 300 µl sitozolik fraksiyonlar içerisinde bulunan protein miktarı ± 0.6 µg iken, proteinlerin çöktürülmesi sonrasında pelletin tekrar çözülmesiyle elde edilen 300 µl lik çözelti içindeki miktar ise ± 8.2 µg olarak tespit edilmiştir. Dolayısıyla proteinlerin çöktürülmesi sonucu elde edilen geri kazanım değeri % 89.2 (n=3) olarak ölçülmüştür.

127 106 Absorbans $%1/$$" $%1$$$" $%&/$$" $%&$$$" DC TM protein assay ile elde edilen kalibrasyon e"risi!"#"$%&'(&)"*"$%$$$+",-"#"$%../0+" $%$/$$" $%$$$$" $" $%1" $%'" $%2" $%0" &" &%1" &%'" &%2" Deri!im (mg/ml) Absorbans $%&$$$" $%/$$$" $%,$$$" $%($$$" $%2$$$" $%1$$$" $%0$$$" $%'$$$" $%$$$$" Bio-Rad TM protein assay ile elde edilen kalibrasyon e"risi!"#"$%&'()*"+"$%$,(," -."#"$%))//" $" $%'" $%0" $%1" $%2" $%(" $%," $%/" $%&" Deri!im (mg/ml) Şekil 4.1. DC TM Protein assay ve Bio-Rad TM protein assay kullanılarak elde edilen kalibrasyon eğrileri Analiz Sonucu Tespit Edilen Protein Miktarları HT29 kolon kanseri, K562/R ve K562/wt kan kanseri hücre hatlarına ait biberiye ile işlem görmüş gruplar (T grupları) ve işlem görmemiş kontrol grupları (C grupları) için DC TM Protein assay kullanılarak tespit edilen protein miktarları Tablo 4.1 de verilmiştir (Bölüm 3.2.3). Tablo 4.1. HT29, K562/R ve K562/wt hücre hatları için protein miktarları *. T Grubu C grubu HT29 kolon kanseri ± mg ml ± mg ml -1 K562/R kan kanseri ± mg ml ± mg ml -1 K562/wt kan kanseri ± mg ml ± mg ml -1 * Ortalama ± Standart Hata (n=3)

128 D Jel Elektroforez Şartlarının Optimizasyonu 2-D Jel elektroforez şartlarının optimizasyonu için sırasıyla aşağıdaki parametreler üzerinde değişikliklere gidilerek optimum koşullar bulunmuştur. Proteinlerin çöktürülmesi (%10 (a/h) TCA, 20 mm DTT içeren aseton çözeltisi ve ReadyPrep 2-D Cleanup Kit Yüklenen protein miktarı ( µg) Yükleme tamponu (Hazır satın alınan ve hazırlanan) İndirgeyici alkilleyici ajan kombinasyonu (TBP-AA, TBP-IAA, DTT-IAA, DTT-TBP,IAA) IPG şerit ph aralığı (3-10, 4-7, 5-8) SDS PAGE için kullanılan hazır jeller (Criterion XT jel 4-12% Bis-Tris IPG, Criterion TGX jel 4-15% Bis-Tris IPG) Boyama tekniği ve süresi (SYPRO Ruby ve Coomassie Blue (hazır satın alınan ve hazırlanan)) Görüntüleme koşulları (VersaDoc image system de jellerin en yüksek kontrastta en iyi şekilde görüntülenmesini sağlamak için yapılan çalışmalar) PDQuest TM 2D Analysis Software altında mümkün olan en fazla sayıda spotun içinden en önemli olanlarını tespit edebilmek için yazılım koşulların belirlenmesi Farklı Yükleme Tamponlarının Protein Ayrımı Üzerine Etkisi Hazır satın alınan yükleme tamponu (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) ve hazırlanan farklı içerikteki yükleme tamponu (7 M üre, 2 M tiyoüre, %3 CHAPS, 5 mm TBP, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) proteinlerin IPG şeritlere yüklenmesi için denenmiş ve Şekil 4.2 de elde edilen sonuçlar alınmıştır.

129 108 Yükleme Tamponu (7 M üre, 2 M tiyoüre, %3 CHAPS, 5 mm TBP, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) Yükleme Tamponu (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) Şekil 4.2. Farklı içerikteki yükleme tamponlarının protein ayrımına etkisi: HT29 (C grubu), 200 µl yükleme tamponunda çözülmüş 300 µg protein; IPG şeritlerin (ph 4-7) dengelenmesi için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanıldı, Criterion XT jel Bis-Tris % 4-12 ile ayrım gerçekleştirildi, Commassie mavisi ile jeller 24 saat süresince boyandı, marker olarak PPP All blue kullanıldı Farklı SDS-PAGE Jellerin Protein Ayrımı Üzerine Etkisi Hazır satın alınan Criterion XT jel % 4-12 Bis-Tris (IPG 1 Well Comb, 11 cm, 1.0 mm) SDS-PAGE jel ile Criterion TGX jel % 4-15 Bis-Tris (IPG 1 Well Comb, 11 cm, 1.0 mm) SDS-PAGE jel, IPG şeritlere yüklenmiş ve izoelektrik noktalarına göre ayrılmış proteinlerin kütlelerine göre ayrılması için denenmiş ve Şekil 4.3 de elde edilen sonuçlar alınmıştır.

130 109 SDS-PAGE jel Criterion XT jel % 4-12 Bis-Tris SDS-PAGE jel Criterion TGX jel % 4-15 Bis-Tris Şekil 4.3. Farklı SDS-PAGE jellerin protein ayrımına etkisi: HT29 (C grubu), 200 µl yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş 300 µg protein; IPG şeritlerin (ph 4-7) dengelenmesi için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanıldı, Commassie mavisi ile jeller 24 saat süresince boyandı, marker olarak PPP All blue kullanıldı Farklı Boyama Tekniklerinin İmaj Analizi Çalışmaları Üzerine Etkisi Yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş proteinler IPG şeritlere yüklenmiş ve izoelektrik noktalarına göre ayrılmıştır. Daha sonra Criterion XT jel % 4-12 Bis-Tris (IPG 1 Well Comb, 11 cm, 1.0 mm) SDS-PAGE jel ile kütlelerine göre ayrılan proteinlerin Commassie mavisi ile 24 saat ve SYPRO-Ruby floresans boyama tekniği ile 2 saat boyanması gerçekleştirilmiş ve Şekil 4.4 de elde edilen sonuçlar alınmıştır.

131 110 Boyama tekniği Commassie mavisi Boyama tekniği SYPRO-Ruby Şekil 4.4. Farklı boyama tekniklerinin imaj analizi çalışmaları üzerine etkisi: HT29 (C grubu), 200 µl yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş 300 µg protein; IPG şeritlerin (ph 4-7) dengelenmesi için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanıldı, Criterion XT jel % 4-12 Bis-Tris ile ayrım gerçekleştirildi, marker olarak PPP All blue kullanıldı Farklı ph Aralığındaki IPG Şeritlerin Protein Ayrımı Üzerine Etkisi Yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş proteinler ph 4-7 ve ph 5-8 aralığındaki IPG şeritlere yüklenmiş ve izoelektrik noktalarına göre ayrılmıştır. Daha sonra Criterion XT jel % 4-12 Bis-Tris (IPG 1 Well Comb, 11 cm, 1.0 mm) SDS- PAGE jel ile kütlelerine göre ayrılan proteinlerin SYPRO-Ruby floresans boyama tekniği ile 2 saat süresince boyanması gerçekleştirilmiş ve Şekil 4.5 de elde edilen sonuçlar alınmıştır.

132 111 IPG şerit ReadyStrip IPG şerit ph 4-7, 11 cm IPG şerit ReadyStrip IPG şerit ph 5-8, 11 cm Şekil 4.5. Farklı ph aralığındaki IPG şeritlerin protein ayrımı üzerine etkisi: HT29 (C grubu), 200 µl yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş 300 µg protein; IPG şeritlerin dengelenmesi için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanıldı, Criterion XT jel % 4-12 Bis-Tris ile ayrım gerçekleştirildi, SYPRO Ruby ile jeller 2 saat süresince boyandı, marker olarak ph 4-7 için PPP All blue, ph 5-8 için PPP unstained kullanıldı Fotoğraflama Süresinin İmaj Analizi Çalışmaları Üzerine Etkisi Yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş proteinler ph 5-8 aralığındaki IPG şeritlere yüklenmiş ve izoelektrik noktalarına göre ayrılmıştır. Daha sonra Criterion XT jel % 4-12 Bis-Tris (IPG 1 Well Comb, 11 cm, 1.0 mm) SDS-PAGE jel ile kütlelerine göre ayrılan proteinlerin SYPRO-Ruby floresans boyama tekniği ile 2 saat yerine 48 saat süresince boyanması gerçekleştirilmiştir. Jeller Versa-Doc image system jel görüntüleme cihazı ile 15 sn flat denilen koruyucu film kullanılmadan ve 20 sn süre ile flat kullanılarak fotoğraflanmış Şekil 4.6 da elde edilen sonuçlar alınmıştır.

133 112 Fotoğraflama süresi 15 sn flat kullanmadan Fotoğraflama süresi 20 sn flat kullanarak Şekil 4.6. Fotoğraflama süresinin imaj görüntüleme çalışmaları üzerine etkisi: HT29 (C grubu), 200 µl yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) çözülmüş 300 µg protein; IPG şeritlerin (ph 5-8) dengelenmesi için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanıldı, Criterion XT jel % 4-12 Bis-Tris ile ayrım gerçekleştirildi, SYPRO Ruby ile jeller 48 saat süresince boyandı, marker olarak PPP unstained kullanıldı İmaj Analizi Çalışmaları 2-D Jel elektroforez ile proteinlerin ayırımı (Bölüm 3.2.4, ve 3.2.6) ve imaj görüntüleme çalışmaları (Bölüm 3.2.7, ve 3.2.9) sonucu elde edilen jel görüntüleri dijital ortama aktarılmış ve jel üzerinde protein haritası dışında kalan bölgeler bilgisayar ortamında görüntü üzerinden kesilerek çıkarılmıştır. Şekil 4.7 de HT29 C grubu 1. örnek için jelin fotoğraflanmış tüm görüntüsü ve imaj analizi çalışmaları için kullanılan kısım (şekil üzerinde kırmızı ile işaretlenmiş çerçevenin içi) verilmektedir.

134 113 Şekil 4.7. HT29 C grubu 1. örnek için optimum koşullarda ayrımı sağlanan proteinlere ait imaj görüntüleme çalışmaları sonrası elde edilen jel fotoğrafı (imaj analizi çalışmaları için kullanılan kısım çerçevenin içinde kalan alandır). HT29, K562/R ve K562/wt kanser hücre hatlarına ait T ve C grupları için elde edilen ve imaj analizi çalışmalarında kullanılan jel görüntüleri sırasıyla Şekil 4.8, 4.9 ve 4.10 da verilmektedir.

135 114 T grubu 1. örnek (T1) C grubu 1. örnek (C1) T grubu 2. örnek (T2) C grubu 2. örnek (C2) T grubu 3. örnek (T3) C grubu 3. örnek (C3) Şekil 4.8. HT29 kolon kanseri hücre hattı için biberiyeden elde edilen polifenollerle işlem görmüş grup (T grubu) ve işlem görmemiş kontrol grubu (C grubu) örnekleri için elde edilen jel görüntüleri.

136 115 T grubu 1. örnek (T1) C grubu 1. örnek (C1) T grubu 2. örnek (T2) C grubu 2. örnek (C2) T grubu 3. örnek (T3) C grubu 3. örnek (C3) Şekil 4.9. K562/R kan kanseri hücre hattı için biberiyeden elde edilen polifenollerle işlem görmüş grup (T grubu) ve işlem görmemiş kontrol grubu (C grubu) örnekleri için elde edilen jel görüntüleri.

137 116 T grubu 1. örnek (T1) C grubu 1. örnek (C1) T grubu 2. örnek (T2) C grubu 2. örnek (C2) T grubu 3. örnek (T3) C grubu 3. örnek (C3) Şekil K562/wt kan kanseri hücre hattı için biberiyeden elde edilen polifenollerle işlem görmüş grup (T grubu) ve işlem görmemiş kontrol grubu (C grubu) örnekleri için elde edilen jel görüntüleri.

138 117 PDQuest TM 2-D Jel analizi programı (version 8.0) ile kanser hücre hatlarında yapılan imaj analizi çalışmalarında HT29 kolon kanseri hücre hattı için 534, K562/R kan kanseri hücre hattı için 347 ve K562/wt kan kanseri hücre hattı için 350 adet spot tespit edilmiştir. Tespit edilen spotlara ait PDQuest yazılımı tarafından verilen sanal jel haritaları (master gel images) Şekil 4.11 de verilmektedir. Tespit edilen spotlardan gruplar arasında (T ve C grupları) intensiteleri birbirinin en az iki katı farklılaşmış olanlar Quant 1 isminde bir analiz kümesinde toplanmıştır. İntensiteleri grup içinde birbiriyle istatistiksel olarak %99 güven seviyesinde örtüşenler ise Statistic 1 adı verilen bir analiz kümesinde toplanmıştır. Booln 1 ismindeki analiz kümesi ise Statistic 1 ve Quant 1 in kümelerinin kesişim kümesindeki spotları içerecek şekilde tanımlanmıştır (Bölüm 3.2.9). HT29 kolon kanseri K562/R, K562/wt kan kanseri hücre hatları için tanımlanan kümeler içine giren toplam spot sayıları Tablo 4.2 de verilmektedir. Şekil 4.12 de ise PDQuest programı ile kümelerin tanımlanmasında K562/wt hücre hattı için elde edilen ekran çıktısı verilmektedir. Tablo 4.2. Tanımlanan kümeler içine giren toplam spot sayısı. Hücre hatları Toplam spot Statistic 1 Quant 1 Booln 1 HT K562/R K562/wt

139 118 HT29 hücre hattı için tespit edilen 534 spot K562/R hücre hattı için tespit edilen 347 spot K562/wt hücre hattı için tespit edilen 350 spot Şekil PDQuest yazılımı tarafından verilen sanal jel haritaları.

140 119 Statistic 1 Quant 1 Booln 1 Şekil PDQuest yazılımı ile K562/R hücre hattı için T ve C gruplarına ait nicel anlamda farklılaşan spotların tespitinde kümelerin oluşturulması. İntensiteleri grup içi % 99 güven seviyesinde örtüşen ve T ve C gruplarından herhangi birindeki intensitesi diğerinin en az iki katı fazla olan ve PDQuest yazılımı vasıtasıyla tespit edilen spotlar gözden geçirilmiştir. Bu spotlardan HT29 hücre hattı için 17 si, K562/R hücre hattı için 13 ü ve K562/wt hücre hattı için 19 u yapılan göz taraması sonrasında da farklılaştığı görülerek Bölüm ve de anlatıldığı şekilde analiz edilmek üzere listelenmiştir. Sözü edilen spotlar HT29, K562/R ve K562/wt hücre hatları için Şekil 4.13, 4.14 ve 4.15 de verilmektedir.

141 Şekil HT29 hücre hattında T ve C gruplarında nicel anlamda farklılaşan spotlar (Yeşil renk, T grupları için yüksek miktarda ifade edilen; kırmızı renk ise C gruplarında yüksek miktarda ifade edilen proteinleri işaret etmektedir) Şekil K562/R hücre hattında T ve C gruplarında nicel anlamda farklılaşan spotlar (Yeşil renk, T grupları için yüksek miktarda ifade edilen; kırmızı renk ise C gruplarında yüksek miktarda ifade edilen proteinleri işaret etmektedir).

142 Şekil K562/wt hücre hattında T ve C gruplarında nicel anlamda farklılaşan spotlar (Yeşil renk, T grupları için yüksek miktarda ifade edilen; kırmızı renk ise C gruplarında yüksek miktarda ifade edilen proteinleri işaret etmektedir). Her bir hücre hattında intensiteleri T ve C grupları için en yüksek miktarda farklılaşan spotlar MALDI-TOF-MS cihazı ile pozitif iyon modunda analiz edilmiş ve peptit dizileme çalışmaları ile yapıları aydınlatılmıştır (Bölüm ve ). Bu amaçla HT29 hücre hattı için işaretlenen spotlardan intensiteleri en yüksek miktarda farklılaşan 12 adet spot (1106, 1604, 1701, 2811, 3102, 4007, 4102, 5307, 7003, 8001, 8303, 8701) analiz edilmiştir. Bu spotların PDQuest yazılımı üzerinde yakınlaştırılmış görüntüleri sırasıyla Şekil de verilmektedir. MALDI-TOF-MS kütle spektrumları ise Ek 2 de verilmiştir. Bütün yakınlaştırılmış spot şekilleri üzerinde beyaz renk, sanal jel görüntüsünü; yeşil renk, T gruplarını; kırmızı renk ise C gruplarını ifade etmektedir.

143 122 Şekil HT29 hücre hattı için 1106 numaralı spot. Şekil HT29 hücre hattı için 1604 numaralı spot.

144 123 Şekil HT29 hücre hattı için 1701 numaralı spot. Şekil HT29 hücre hattı için 2811 numaralı spot.

145 124 Şekil HT29 hücre hattı için 3102 numaralı spot. Şekil HT29 hücre hattı için 4007 numaralı spot.

146 125 Şekil HT29 hücre hattı için 4102 numaralı spot. Şekil HT29 hücre hattı için 5307 numaralı spot.

147 126 Şekil HT29 hücre hattı için 7003 numaralı spot. Şekil HT29 hücre hattı için 8001 numaralı spot.

148 127 Şekil HT29 hücre hattı için 8303 numaralı spot. Şekil HT29 hücre hattı için 8701 numaralı spot.

149 128 K562/R hücre hattı için işaretlenen spotlardan intensiteleri en yüksek miktarda farklılaşan 10 adet spot (0812, 2610, 2714, 3108, 4611, 4712, 6411, 7219, 7302, 7431) analiz edilmiş ve bunlardan 3 tanesi hariç (4712, 6411, 7302) anlamlı sonuçlar bulunmuştur. K562/wt hücre hattı içinse 6 adet spot (3604, 3607, 4601, 4805, 5602, 8639) analiz edilmiş ve bunlardan bir tanesi hariç (4805) anlamlı sonuçlar elde edilmiştir. Bu spotların PDQuest yazılımı üzerinde yakınlaştırılmış görüntüleri K562/R ve K562/wt hücre hatları için sırasıyla Şekil de ve Şekil de verilmektedir. MALDI-TOF-MS kütle spektrumları ise Ek 2 de verilmiştir. HT29 kolon kanseri ve K562/R, K562/wt kan kanseri hücre hatları için MALDI-TOF-MS analizi ve peptid dizileme çalışmaları sonucu yapıları aydınlatılan protein listeleri ise sırasıyla Tablo 4.3, Tablo 4.4 ve Tablo 4.5 de verilmektedir. Şekil K562/R hücre hattı için 0812 numaralı spot.

150 129 Şekil K562/R hücre hattı için 2610 numaralı spot. Şekil K562/R hücre hattı için 2714 numaralı spot.

151 130 Şekil K562/R hücre hattı için 3108 numaralı spot. Şekil K562/R hücre hattı için 4611 numaralı spot.

152 131 Şekil K562/R hücre hattı için 4712 numaralı spot. Şekil K562/R hücre hattı için 6411 numaralı spot.

153 132 Şekil K562/R hücre hattı için 7219 numaralı spot. Şekil K562/R hücre hattı için 7302 numaralı spot.

154 133 Şekil K562/R hücre hattı için 7431 numaralı spot. Şekil K562/wt hücre hattı için 3604 numaralı spot.

155 134 Şekil K562/wt hücre hattı için 3607 numaralı spot. Şekil K562/wt hücre hattı için 4601 numaralı spot.

156 135 Şekil K562/wt hücre hattı için 5602 numaralı spot. Şekil K562/wt hücre hattı için 8639 numaralı spot.

157 136 Tablo 4.3. HT29 kolon kanseri hücre hattı için tanımlanan proteinler. Kontrol grubunda yüksek miktarda ifade edilmiş proteinler Spot Spot ID IC/IT * Tanım Tübülin alfa-1b TCP-1 içeren şaperonin [Homo sapiens] Statmin [Homo sapiens] Chain A, Hgstp1-1[v104] in Gsh Konjuge (+)-Anti- Bpde ile oluşturduğu kristal yapı Transisyonel endoplazmik retikulum ATPase [Homo sapiens] Chain K, Acetil-Sipa:siklosporin kompleksi PDZ ve LIM domain protein 1 [Homo sapiens] Kontrol grubunda düşük miktarda ifade edilmiş proteinler Spot Spot ID IC/IT * Tanım Katepsin B Peroksiredoksin-4 [Homo sapiens] Heterogen nükleer ribonükleoprotein K [Homo sapiens] Chain B, Katepsin D nin temel ve inhibe edilmiş formlarının kristal yapısı Serin/treonin-protein fosfataz PP1-alfa katalitik altbirimi isoform 1 [Homo sapiens] * Protein spotlarının intensiteleri oranı (IC: kontrol grubu intensitesi, IT: biberiye ekstreleriyle işlem görmüş grup intensitesi)

158 137 Tablo 4.4. K562/R kan kanseri hücre hattı için tanımlanan proteinler. Kontrol grubunda yüksek miktarda ifade edilmiş proteinler Spot Spot ID IC/IT * Tanım Adenin fosforibozil transferaz [Homo sapiens] Chain A, Hgstp1-1[v104] in Konjuge (+)-Anti-Bpde ile oluşturduğu kristal yapı Anneksin A1 [Homo sapiens] Kontrol grubunda düşük miktarda ifade edilmiş proteinler Spot Spot ID IC/IT * Tanım kda ısı şoku proteini, mitokondriyal [Homo sapiens] kda ısı şoku proteini, mitokondriyal [Homo sapiens] kda glukoz-regüle edilmiş öncül protein [Homo sapiens] Retinal dehidrojenaz 2 [Homo sapiens] * Protein spotlarının intensiteleri oranı (IC: kontrol grubu intensitesi, IT: biberiye ekstreleriyle işlem görmüş grup intensitesi)

159 138 Tablo 4.5. K562/wt kan kanseri hücre hattı için tanımlanan proteinler Kontrol grubunda yüksek miktarda ifade edilmiş proteinler Spot Spot ID IC/IT * Tanım Tübülin alfa 1-C Kontrol grubunda düşük miktarda ifade edilmiş proteinler Spot Spot ID IC/IT * Tanım kda ısı şoku proteini, mitokondriyal [Homo sapiens] kda ısı şoku proteini, mitokondriyal [Homo sapiens] kda ısı şoku proteini, mitokondriyal [Homo sapiens] D-3-fosfogliserat dehidrojenaz [Homo sapiens] * Protein spotlarının intensiteleri oranı (IC: kontrol grubu intensitesi, IT: biberiye ekstreleriyle işlem görmüş grup intensitesi) 4.2. Metabolomik Çalışmalar Metabolitlerin CE-MS ile Analizi K562/R kan kanseri hücre hattı için ultrafiltrasyon sonucu elde edilen metabolit çözeltileri Bölüm de anlatıldığı şekilde örnek çözeltilerinden alınmış ve 0.1 M formik asit (ph : 1.8) çözeltisinin çalışma elektroliti olarak kullanıldığı şartlar altında hidrodinamik enjeksiyon (34.5 mbar basınç, 80 saniye enjeksiyon süresi) ile CE cihazına enjekte edilmiştir. 25 kv voltaj uygulanarak ve kapiler sıcaklığı 25 C de sabit tutularak 90 cm lik erimiş silika kapilerde ayrımı gerçekleştirilen metabolitler pozitif modda çalışan ESI kaynağında iyonize hale getirilerek TOF kütle analizöründe m/z değer aralığı taranarak analiz edilmişlerdir (Bölüm 3.3.2). Toplam iyon elektroferogramlarından üçer tanesi T ve C gruplarına ait tekrarlı analizler için Şekil 4.43 de verilmiştir.

160 139!"#$%&%'("()*"+,+-*$./+$.0$(1,($" 2"#$%&%'("()*"+,+-*$./+$.0$(1,($" Şekil K562/R hücre hattında T ve C gruplarına ait toplam iyon elektroferogramları

161 XCMS Parametrelerinin Optimizasyonu XCMS ile CE-MS verilerinin değerlendirilmesinde uygun formatta kaydedilerek R programlama dili altında çalışan XCMS uygulamasına K562/R hücre hattına ait elektroferogramlar yüklenmiştir. Yüklenen elektroferogramlar için centwave ve matchfilter algoritmaları kullanılarak metabolitlerin en yüksek düzeyde tespit edilebilmesi için alıkonma zamanlarının en doğru şekilde düzeltilmesi ve piklerinin en üst düzeyde eşleştirilmesi amaçlanmıştır. Bunun için CE-MS analizi sonucu elde edilen elektroferogramlar üzerinde centwave ve matchfilter algoritmaları için optimum parametreleri bulmak amaçlanmıştır. Gruplar kendi içinde ve birbirleriyle karşılaştırılarak olabilecek en yüksek miktarda metabolitin profillenmesine çalışılmıştır (Bölüm 3.3.3, Ek 1). XCMS uygulamasında piklerin bulunması ve alıkonma zamanlarının düzeltilmesi için 4 adet centwave ve de 4 adet matchfilter parametresi kod üzerinde değiştirilerek veri kümeleri üzerinde denenmiştir. Tablo 4.6 da centwave ve matchfilter için denenen parametreler sonrasında uygulama tarafından verilen tablodaki toplam pik sayıları ve bu piklerden 6 ila 23. dakika arasında tespit edilenlere ait pik sayıları verilmektedir. centwave ve matchfilter algoritmaları için piklerin bulunması ve göç zamanlarının düzeltilmesi ile ilgili parametreler değiştirilerek yazılan farklı scriptler Ek 1 de verilmiştir.

162 141 Tablo 4.6. Farklı algoritmalar ile K562/R hücre hattı için tespit edilen toplam pik sayıları. m1 m2 m3 m4 Sayısı Yüzdesi Sayısı Yüzdesi Sayısı Yüzdesi Sayısı Yüzdesi Toplam pik < tgöç (dak) < w1 w2 w3 w4 Sayısı Yüzdesi Sayısı Yüzdesi Sayısı Yüzdesi Sayısı Yüzdesi Toplam pik < tgöç (dak) < * m1, m2, m3, m4 matchfilter algoritması için denenen farklı parametreleri; w1, w2, w3, w4 ise centwave algoritması için denenen farklı parametreleri ifade eder. Pik sayıları XCMS tarafından verilen tablodaki bulunduğu iddia edilen metabolit piklerinin belirlenen aralık içinde kalan toplam adedini, pik yüzdeleri ise belirlenen aralığın toplam pik sayısı içine giren yüzdelik dilimini ifade eder Pik Alanı Değerlerinde Varyasyonun Önlenmesi Çalışmaları K562/R hücre hattı için XCMS kullanılarak tespit edilen metabolitlere ait listede verilen pik alanı değerlerinde rastgele hatalar sonucu varyasyonlar oluşmaktadır. Enjeksiyonlar arası pik alanı değerlerinde farklılaşmanın önüne geçerek pikleri normalize etmek için iki farklı yaklaşım denenmiştir. Bunlar; 1- Bütün tespit edilen metabolitlerin pik alanlarını, iç standartların pik alanına bölme yaklaşımı 2- Bütün tespit edilen metabolitlerin pik alanlarını, olası metabolitlerin tamamının (6 ila 23. dakika arasındakilerin) pik alanına bölme yaklaşımıdır. Her iki yaklaşımla da normalize edilen pik alanı değerleri ile m4 ve w3 parametreleri ile tespit edilen metabolit pikleri için yeniden bir değerlendirme yapılmış ve Tablo 4.7 de verilen sonuçlar bulunmuştur.

163 142 Tablo 4.7. XCMS için m4 ve w3 parametreleri ile belirlenen piklere farklı yaklaşımlar kullanılarak normalizasyon yapılması sonucu elde edilen pik sayıları. m4 w3 Sayısı Yüzdesi Sayısı Yüzdesi 6 < tgöç (dak) < Normalizasyon Yapmadan Sayısı Yüzdesi Sayısı Yüzdesi p < p < İç standartın pik alanına bölerek normalizasyon Sayısı Yüzdesi Sayısı Yüzdesi p < p < Piklerin toplam alanına bölerek normalizasyon Sayısı Yüzdesi Sayısı Yüzdesi p < p < * Pik sayıları XCMS tarafından verilen tablodaki bulunduğu iddia edilen metabolit piklerinin belirlenen aralık içinde kalan toplam adedini, pik yüzdeleri ise belirlenen aralığın toplam pik sayısı içine giren yüzdelik dilimini ifade eder. Pik alanlarını o enjeksiyon için bulunan piklerin toplam alanına (6 ila 23. dakika arası göç eden piklerin) bölerek normalizasyon yapıldığında m4 ve w3 parametreleri için %95 güven seviyesinde pik alanı değerleri örtüşen 147 ve 518 pik bulunmuştur. Bu piklerden 97 tanesi hem m4 hem de w3 parametreleri ile bulunan piklerdir. Farklı parametreler kullanılarak tespit edilen 518 ve 147 pik sırasıyla gözden geçirilmiş ve bir kısmı pik olmadığı veya gürültü sinyali olduğu düşünülerek elenmiştir. Kalan pikler ise AStream yazılımıyla göç zamanları da dikkate alınarak taranmış ve izotop ile ESI ürünü (adducts) pikleri olduğu düşünülen pikler mümkün olduğunca listeden çıkarılmıştır. Sonuç olarak m4 ve w3 parametreleri için elde kalan ve metabolit profillemede kullanılacak pik sayıları Şekil 4.44 de verilen grafiğe göre değerlendirilmiştir.

164 143 Şekil Farklı XCMS algoritmaları ve parametreleri kullanılarak K562/R hücre hattı için % 95 güven seviyesinde tespit edilen olası metabolitlere ait pik sayıları. Pikler, MassTrix veribankasına yüklenerek ve HMDB de aranarak işlendiğinde (Bölüm 3.3.3) K562/R hücre hattı için tespit edilen en az 36 metabolite ait liste veribankasında kayıtlı metabolitin kodu ile birlikte Tablo 4.8 de verilmektedir. Tablo 4.9 da ise kod numaralarına ait açık isimler verilmektedir.

165 144 Tablo 4.8. K562/R hücre hattı için XCMS ile metabolit profilleme çalışmaları sonucu tespit edilen metabolitler (p<0.05, n=6). Pik 1 tgöç m/z BH 2 İyon 3 Formül 4 Kod M+H [1+] C9H21N3O HMDB02189 HMDB M+H [1+] C11H20O5S C17226 C M+H [1+] C15H22N6O5S C M+H [1+] C3H7NO2 C00041 C00099 C00133 C00213 C01401 C01537 C02116 C M+H [1+] C5H5N5 C M+H [1+] C4H9N3O2 C M+H [1+] C5H11N3O2 C00290 C M+H [1+] C7H9N3O2 C16396 C M+H [1+] C5H6N2O2 HMDB00262 HMDB M+H [1+] C5H5N5O C M+H [1+] C7H15NO3 C00318 C M+H [1+] C16H18O8 C10432 C10441 C M+H [1+] C5H14NO6P C M+H [1+] C11H15NO2 HMDB03626 HMDB a M+H [1+] C6H6N4 C05649

166 145 Pik 1 tgöç m/z BH 2 İyon 3 Formül 4 Kod 5 15b M+H [1+] C5H10O4 C01801 C02783 C04039 C04272 C06257 C M+H [1+] C11H23NO2 LMFA M+H [1+] C11H21NO4 C M+H [1+] C12H23NO4 HMDB13128 HMDB a M+H [1+] C8H18N6O3 C b M+H [1+] C12H22O5 HMDB c M+H [1+] C16H22O2 C10793 LMFA M+H [1+] C9H16N2O4 C M+H [1+] C8H15N3O4 C M+H [1+] C6H5NO2 C M+H [1+] C6H6N2O3 C03277 C03762 C M+H [1+] C5H10N2O3 C00064 C00303 C00819 C M+H [1+] C23H43NO6 HMDB M+H [1+] C9H18N2O5 C M+H [1+] C5H9NO4 C00025 C00217 C00302 C00979 C03618 C03790 C05574 C05938 C05941 C M+H [1+] C9H11NO2 C00079 C02057 C02265

167 146 Pik 1 tgöç m/z BH 2 İyon 3 Formül 4 Kod M+H [1+] C6H10N2O3 C M+H [1+] C10H15N3O4 C M+H [1+] C5H4N4O C M+H [1+] C4H8O5 C01620 LMFA LMFA M+H [1+] C13H22N4O8S2 C M+H [1+] C5H9NO3 C01015 C01073 C01110 C01157 C03440 C03441 C M+H [1+] C10H13N5O5 C M+H [1+] C10H17N3O6S C Pik numaraları göç zamanı (tgöç(dak)) sıralamasına göre verilmiştir. Veribankasına kayıtlı birden fazla yapı ile eşleşme halinde 1a, 1b, 1c vb. şekilde harf kodları eklenmiştir. 2 Yüzde bağıl hata (BH) değerleri analiz sonucu bulunan m/z değerinin veribankasında tanımlı metabolit için tespit edilmesi gereken gerçek m/z değeriyle arasındaki bağıl farkı ifade eder. BH = [(Bulunan-Olması gereken)/olması gereken] x İyon, molekülün ESI kaynağında iyonize olduğu yapıyı tanımlar. 4 Formül, veritabanı ile eşleşme sonucu tespit edilen metabolitin kapalı formülüdür. 5 Kod, tanımlanan metabolitin KEGG, HMDB ve LMSD (Lipid Maps Structure Database) veribankalarına ait kod numaralarıdır.

168 147 Tablo 4.9. K562/R hücre hattı metabolit profilleme çalışmaları sonucu tespit edilen metabolitlerin açık isimleri (p<0.05, n=6). Pik Kod 1 Tanım 2 1 HMDB02189 HMDB C17226 C17227 N8-Asetilspermidin N1-Asetilspermidin 2-(6'-Metiltiyo)hekzilmalik asit 3-(6'-Metiltiyo)hekzilmalik asit 3 C00019 S-Adenozil-L-metiyonin 4 C00041 C00099 C00133 C00213 C01401 C01537 C02116 C11488 L-Alanin beta-alanin D-Alanin Sarkozin Alanin Ürethan 2-Nitropropan HMMF 5 C00147 Adenin 6 C00300 Kreatin 7 C00290 C C16396 C HMDB00262 HMDB02024 Fibrin 4-Guanidinobutanoat 2,4-Diamino-6-nitrotoluen 2,6-Diamino-4-nitrotoluen Timin Imidazolasetik asit 10 C00242 Guanin 11 C00318 C C10432 C10441 C12208 L-Karnitin (S)-Karnitin 1-Kafeoil-4-deoksiquinik asit 4-p-Komaroilkuinik asit p-komaroilkuinik asit 13 C01233 sn-glisero-3-fosfoetanolamin 14 HMDB03626 HMDB03892 (R)-N-Metilsalsolinol (S)-N-Metilsalsolinol 15a C05649 Dihidropteridin

169 148 Pik Kod 1 Tanım 2 15b C01801 C02783 C04039 C04272 C06257 C08347 Deoksiriboz 2-Deoksi-L-arabinoz 2,3-Dihidroksi-3-metillbutanoat (R)-2,3-Dihidroksi-3-metilbutanoat 1-Deoksi-D-kiluloz 2-Deoksi-alfa-D-ribopiranoz 16 LMFA amino-undekanoikasit 17 C02862 O-Butanoilkarnitin 18 HMDB13128 HMDB00688 Valerilkarnitin Isovalerilkarnitin 19a C Deoksistreptidin 19b HMDB Hidroksidodekanedioik asit 19c C10793 LMFA Geranilhi drokinon 4-[5]-laderan-butanoik asit 20 C15700 gama-glutamil-gama-aminobutiraldehit 21 C15532 N-Asetil-L-sitrülin 22 C10164 Pikolinik asit 23 C03277 Imidazol-5-yl-pirüvat 24 C00064 C00303 C00819 C16673 L-Glutamin Glutamin D-Glutamin Isoglutamin 25 HMDB00712 Hekzaadekanedioik asit mono-l-karnitin ester 26 C ,6-Diamino-7-hydroksi-azelaik asit 27 C00025 C00217 C00302 C00979 C03618 C03790 C05574 C05938 C05941 C C00079 C02057 C02265 L-Glutamat D-Glutamat DL-Glutamat O-Asetil-L-serin L-treo-3-Metilaspartat N-(Karbosimetil)-D-alanin Isoglutamat L-4-Hidroksiglutamat semialdehit 2-Okso-4-hidroksi-5-aminovalerat N-Methil-D-aspartik asit L-Fenilalanin Fenilalanin D-Fenilalanin 29 C Metilen-L-glutamin

170 149 Pik Kod 1 Tanım 2 30 C Metil-2'-deoksisitidin 31 C00262 Hipoksantin 32 C01620 LMFA LMFA Treonat D-treonik asit; 2,2,4-trihidroksi-butanoik asit DL-erithronik asit; 2,3,4-trihidroksi-butanoik asit 33 C05526 S-Glutatatyonil-L-sistein 34 C01015 C01073 C01110 C01157 C03440 C03441 C Hidroksi-L-prolin N-Asetil-beta-alanin 5-Amino-2-okzopentanoik acid trans-4-hidroksi-l-prolin cis-4-hidroksi-d-prolin cis-4-4-hidroksi-l-prolin trans-4-hidroksi-d-prolin 35 C00387 Guanosin 36 C00051 Glutatyon 1 Kod, tanımlanan metabolitin KEGG, HMDB ve LMSD (Lipid Maps Structure Database) veribankalarına ait kod numaralarıdır. 2 Veribankaları tarafından m/z değeri eşleştirmesi sonucu tespit edilen pik için önerilen metabolitler. Bazı pikler için m/z değerleri eşleşen ve dolayısıyla kapalı formülleri eşleşen birden fazla metabolit tanımlanmıştır. Şekil 4.45 ve Şekil 4.46 da Tablo 4.8 ve 4.9 da listelenen bazı metabolitlerin pikleri için XCMS tarafından göç zamanları düzeltilerek modifiye edilmiş elektroferogramları verilmektedir. XCMS in CE-MS çalışmalarına adaptasyonunda K562/R nin kullanıldığı ve T ve C gruplarının grup içi ve gruplar arası karşılaştırılmasıyla en yüksek düzeyde metabolit profillenmesinin amaçlandığı bu çalışmada elde edilen kırmızı renkli pikler T grubu, siyah renkli pikler ise C grubu elektroferogramlarından elde edilmiştir.

171 150 0(1.(+,1.$ 0(1.(+,1.$!"#$%&'&()$*+&(,-./$!"#$%&'&()$*+&(,-./$ 0(1.(+,1.$ 0(1.(+,1.$!"#$%&'&()$*+&(,-./$!"#$%&'&()$*+&(,-./$ 0(1.(+,1.$ 0(1.(+,1.$!"#$%&'&()$*+&(,-./$!"#$%&'&()$*+&(,-./$ 0(1.(+,1.$ 0(1.(+,1.$!"#$%&'&()$*+&(,-./$!"#$%&'&()$*+&(,-./$ Şekil XCMS tarafından K562/R hücre hattı için göç zamanları düzeltilerek tespit edilen bazı metabolitlere ait elektroferogramlar-1.

172 151 0(1.(+,1.$ 0(1.(+,1.$!"#$%&'&()$*+&(,-./$!"#$%&'&()$*+&(,-./$ 0(1.(+,1.$ 0(1.(+,1.$!"#$%&'&()$*+&(,-./$!"#$%&'&()$*+&(,-./$ 0(1.(+,1.$ 0(1.(+,1.$!"#$%&'&()$*+&(,-./$!"#$%&'&()$*+&(,-./$ 0(1.(+,1.$ 0(1.(+,1.$!"#$%&'&()$*+&(,-./$!"#$%&'&()$*+&(,-./$ Şekil XCMS tarafından K562/R hücre hattı için göç zamanları düzeltilerek tespit edilen bazı metabolitlere ait elektroferogramlar-2.

173 TARTIŞMA VE SONUÇ Kanser, günümüz insanını gerek sosyal gerekse ekonomik anlamda tehdit eden çağın en ölümcül hastalıklarındandır. Geçen yüzyılda olduğu gibi önümüzdeki yüzyılda da insanlığın çözüm arayacağı en önemli hastalıkların başında gelmektedir. Kanser araştırmaları, kanserin önlenmesi ve tedavisiyle ilişkili olduğu düşünülen çeşitli moleküler hedefleri belirlemeye yönelik çalışmaları içerecek şekilde halen devam etmektedir. Ancak tek bir ilaç kullanımına yönelik monoterapik yaklaşımlarla halen istenilen noktaya gelinememesi araştırmacıları kombine terapi yöntemleri uygulamaya veya farklı metabolik yolakları aynı anda etkileyen yaklaşımlar geliştirmeye yöneltmektedir (189,190). Kanserle mücadelede bir diğer yaklaşım ise gıda takviyeleri ve yaşam tarzındaki ufak değişikliklerle kanserden korunmaya yönelik yaklaşımlardır (191). Beslenme tarzı ile kansere yakalanma riski arasında bağlantı kurmaya yönelik çalışmalar ilk olarak 80 li yıllarda başlamış ve ciddi anlamda önem verilerek daha sonraki yıllarda hızlı bir şekilde artış göstermiştir (25-29). Özellikle son zamanlarda yapılan çalışmalar Akdeniz tarzı beslenmenin kanser riskini azaltmada olumlu sonuçlar verdiğine işaret etmektedir (30-33). Akdeniz tarzı beslenmede öne çıkan baharatlar; kekik türleri (Origanum vulgare ve Thymus vulgaris), biberiye (Rosmarinus officinalis), adaçayı (Salvia officinalis) ve sarımsaktır (Syzygium aromaticum) (192). Lamiaceae familyasına ait olan Rosmarinus officinalis L., Akdeniz ülkelerinde doğal olarak yetişen ve birçok ülkede kültürü yapılan aromatik bir bitkidir. Kışın yaprak dökmeyen, cm boyunda, sık dallı, çalı formundaki bitkinin yaprakları 1-4 cm uzunlukta, 1-2 mm genişlikte, şeritsi ve basittir. Kenarları alta doğru kıvrık olan yaprakların alt yüzü yoğun tüylü, üst yüzü ise seyrek tüylü veya tüysüzdür. Şubat-Mayıs aylarında çiçeklenen bitkinin çiçekleri soluk mavi renklidir (193). Şekil 5.1 de Rosmarinus officinalis L. nin doğal florasında çekilmiş bir fotoğrafı gösterilmektedir.

174 153 Şekil 5.1. Rosmarinus officinalis L. nin doğal florasında çekilmiş fotoğrafı. Rosmarinus officinalis L., ülkemizde Biberiye, Kuşdili, Beyaz püren, Hasalban gibi isimlerle anılan bir bitki olup, Batı ve Güney Anadolu da doğal olarak yetişmekte ve bahçelerde süs bitkisi olarak yetiştirilmektedir (194,195). Yapılan in vitro ve in vivo deneylerde bitkinin antimikrobiyal, antiparazitik, antioksidan, antikatarakt, antispazmodik, antikonvülzan, sitotoksik ve antikanser, antidiyabetik, antihipertansif, diüretik, antienflamatuvar, antihepatotoksik, antiülser ve santral sinir sistemi üzerine stimulan etkileri kanıtlanmıştır (196). Bu tez çalışmasında biberiyenin kullanım amacı antikanser aktivitesidir (197,198). Biberiyenin uçucu yağında bulunan karnozik asitler ve rozmarinik asidin çeşitli kanser hücre hatlarının çoğalmasını engellediği Çeliktaş ve ark. tarafından bildirilmektedir (199). Johnson ve ark. çeşitli bitkiler, zeytinyağı ve bazı baharatların yanısıra biberiyede de bulunan karnozolün, prostat kanseri (200,201) üzerinde iyileştirici etkisi olduğunu ve göğüs, cilt, kan ve kolon kanseri üzerinde birbiriyle ilişkisi olmayan farklı metabolit yolakları etkileyerek iyileştirici etkide bulunduğunu göstermiştir (202). Tai ve ark. yumurtalık kanserini önlemede biberiyenin kullanımı sonucu kanserli hücrelerin çoğalmasının azaldığını tespit etmişlerdir (203). Bunun yanısıra, biberiyede bulunan karnosik asidin, göğüs kanseri ve kolorektal kanser

175 154 üzerinde inhibe edici etkisi olduğunu bildiren çalışmalar da bulunmaktadır (204,205). Foodomik olarak isimlendirilen yeni bir yaklaşım; genetiği değiştirilmiş gıdalar, gıda takviyeleri, gıdalarda kontaminasyon ve toksisite çalışmaları, gıda güvenliği, gıdaların biyoaktivitesi ve insan sağlığı üzerine etkisiyle ilgilenen bir çalışma sahasıdır (21,22,206,207). Genomik, transkriptomik, proteomik ve metabolomik teknikleri de içine alan foodomik yaklaşımlar, ileri analitik enstrumanlar kullanarak gıdaların insan sağlığı üzerine etkilerini moleküler düzeyde incelemeye yardımcı olmaktadır (23,182,207). Çoğu durumda gıda alımıyla birlikte gözlenen kanserden koruyucu veya kanserin çoğalmasını önleyici etki, tek bir metabolik yolak üzerinden değil birden fazla aktif bileşenin sinerjik etkisiyle ve birden fazla metabolik yolak üzerinden meydana gelmektedir. Tez çalışması kapsamında kullanılan biberiye bitkileri Mursia-İspanya daki Herboristeria Murciana isimli seradan temin edilip Bölüm de anlatıldığı şekilde biberiye ekstreleri elde edilmiştir. Bu ekstreler analiz edildiğinde kirsimaritin, genkvakin, arnozol, karnosik asit ve metil karnozat gibi majör fenolik bileşikler içerdiği görülmektedir (179). Tez çalışması kapsamında incelenen HT29 kolon kanseri, K562/R ve K562/ wt kan kanseri hücre hatları Bölüm de anlatıldığı şekilde biberiye ekstreleri ile işlem görmüş ve biberiyeden elde edilen ekstrelerle işlem görmüş grup (T grubu) ve herhangi bir şekilde işlem görmeden bekletilmiş grup (C grubu) için yaşayan ve ölmüş hücrelerin tespiti, ADAM Cell Counter (Digital-Bio, Korea) cihazı ve hassas floresans mikroskobu tekniği kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Bu tez çalışması kapsamında gerçekleştirilen proteomik çalışmalarda HT29 kolon kanseri, K562/R ve K562/wt kan kanseri hücre hatları için 2-D Jel elektroforez tekniği ile proteinler ayrılmış ve MALDI-TOF-MS ile analiz edilerek her bir hücre hattına ait her iki grup için (T ve C grupları) düşük ve yüksek düzeyde ifade edilen proteinler tespit edilmiştir. HT29 hücre hattı için proteomik çalışmalar, tez çalışmasına paralel olarak ilerleyen genomik, transkriptomik ve metabolomik

176 155 çalışmalarda (CE-MS ve LC-MS ile metabolit profilleme) elde edilen sonuçlar kullanılarak bir arada değerlendirilmiştir (180). Böylece, biberiye ekstreleri ile işlem sonucu kanserli hücrelerde çoğalmanın önlenmesinin hangi metabolit yolaklar üzerinden gerçekleştiği anlaşılmaya çalışılmıştır. K562/R ve K562/wt hücre hatları içinse proteomik sonuçlar ayrı olarak değerlendirilmiş ve elde edilen bulgular, kaynaklarda belirtilen bulgularla karşılaştırılarak antikanser aktivitenin etki mekanizması moleküler düzeyde açıklanmaya çalışılmıştır (181). Metabolomik çalışmalarda ise K562/R hücre hattı için XCMS kullanımıyla metabolit profilleme yapılmıştır. Böylece, CE-MS kullanımıyla metabolit profillemede XCMS in performansı incelenmiştir (183). Elde edilen bulgular daha sonraki çalışmalarda CE-MS kullanılarak XCMS ile metabolit profillemeye yardımcı olmayı ve uygun parametrelerin doğru bir biçimde kullanılmasını amaçlamaktadır Proteomik Çalışmalar Proteinlerin 2-D Jel elektroforez ile ayrımı yapılmıştır. Jel üzerinde ayrılan proteinlerin imaj analizi çalışmaları sürecinde görüntülenebilmesi için öncelikle boyanması ve daha sonrasında jellerin fotoğraflanması gerekmektedir. Uygun fotoğraflama koşulları seçilse dahi proteinler iyi bir biçimde boyanamamışsa jel üzerinde gözlenebilen protein adedi, protein spotlarının gözlenebilirliği ölçüsünde olacaktır. Proteinlerin iyi bir biçimde boyanabilmesi ve dolayısıyla boyanma sonucu jel üzerinde gözlenen spotun yoğunluğu, proteinin miktarı ile doğru orantılıdır. Özellikle, iki veya daha fazla grubun karşılaştırıldığı karşılaştırmalı (ekspresyon) proteomik çalışmalarında her bir grup için numunenin yani 2-D Jel elektroforez ile ayrılacak proteinlerin miktarlarının eşit ve optimum bir düzeyde olması gerekmektedir. Böylece, her bir grup için boyanma sonucunda imaj analizi çalışmaları ile intensiteleri ölçülen protein spotları birbirleriyle en doğru biçimde karşılaştırılabilecek ve düşük veya yüksek miktarda ifade edilip edilmediği anlaşılabilecektir. Her ne kadar, yeni nesil imaj analiz programlarının çoğunda jel görüntüleri üzerinde toplam spot intensitesine bağlı olarak görüntünün kontrastını ayarlama şansı bulunsa da iki farklı grup için farklı miktarlarda proteinin ayrımı karşılaştırma

177 156 yapabilme açısından doğru bir yaklaşım değildir. Özellikle izoelektrik odaklama koşullarında numune miktarının odaklama üzerine etkisi kaynaklarda verilmektedir. Yüksek miktarda proteinin izoelektrik odaklamasında ortaya çıkan en büyük problem odaklanmanın tam olarak gerçekleşememesi ve bunun sonucunda oluşan yatay çizgilerdir (91,93) Numune Hazırlama Tez çalışması kapsamında gerçekleştirilen proteomik çalışmalarda proteinlerin istenmeyen bileşenlerden (tuzlar, lipidler, DNA/RNA kalıntıları) çöktürülerek ayrılması ve en yüksek miktarda proteinin geri kazanılması amacıyla çeşitli denemeler gerçekleştirilmiştir. Bu kapsamda iki farklı çöktürme tekniği denenmiştir. İlki ticari olarak hazır elde edilebilen ReadyPrep 2-D Cleanup Kit kullanımı, ikincisi ise hazırlanan ve -20 C de bekletilen % 10 (a/h) TCA ve 20 mm DTT içeren aseton çözeltisidir. Yapılan denemelerde ticari kitin, proteinlerin çöktürülmesinde hazırlanan aseton çözeltisiyle yapılan çöktürmeye göre bir avantaj sağlamadığı görülmüş ve çalışmanın devamında hazırlanan aseton çözeltisi kullanılarak protein çöktürmesinin gerçekleştirilmesine karar verilmiştir. Proteinler Bölüm de anlatıldığı şekilde çöktürülmüştür. Hücre hattı çalışmalarından elde edilen numune miktarının az olduğu düşünülerek istenilen miktardaki proteini çöktürmek ve numuneyi gereğinden fazla kullanmamak adına yapılan çöktürme işlemininde proteinlerin geri kazanımını ölçmek ve bunun sonucunda IPG şeritlere yüklenecek kadar proteini çöktürmek gerekmektedir. Bu amaçla çöktürme sonrası proteinlerin geri kazanım değerlerinin ölçülmesi amaçlanmıştır. HT29 kolon kanseri hücre hatları baz alınarak yapılan çalışmalarda çöktürme öncesi yüksek miktarda tuz içeren homojenizasyon tamponunda (300 µl sitozolik fraksiyon) bulunan proteinler, homojenizasyon tamponunun içeriği ile uyumlu olarak çalışabilen DC TM Protein assay kullanılarak kalibrasyon eğrisi oluşturulmuş ve analiz edilmiştir (Şekil 4.1). Çöktürme sonrasında ise proteinler 300 µl yükleme tamponunda çözülerek Bio-Rad TM protein assay kullanılmış ve kalibrasyon eğrisi

178 157 oluşturularak analiz edilmiştir (Şekil 4.1). Yükleme tamponu içindeki protein miktarı ile homojenizasyon tamponundaki protein miktarı karşılaştırılarak protein geri kazanımı hesaplanmıştır. HT29 hücre hattına ait homojenizasyon tamponu içinde bulunan proteinler 3 farklı ependorfa eşit miktarda (300 µl) alınarak aynı anda aynı şekilde gerçekleştirilen çöktürme işlemi sonrasında protein geri kazanımının % 89.2 (n=3) olduğu görülmüştür (Bölüm ve 4.1.1). Proteinlerin geri kazanımlarını bilmek çalışmalar süresince faydalı olmuştur; çünkü bu sayede çöktürme sonrası elde edilmesi gereken protein miktarına göre -80 C den çıkarılarak analiz edilmek üzere oda sıcaklığında bekletilecek numune miktarına doğru bir şekilde karar verilebilmiş ve kararlılık problemi olan proteinlerin mümkün olan en az sayıda donma-çözünme döngüsüne girmesi sağlanarak numune israfının önüne geçilmiştir. Çalışmalar ilerledikçe görülmüştür ki her bir hücre hattı ve her bir grup için (T ve C grupları) analiz edilen protein miktarları birbiriyle uyumlu değildir (Tablo 4.1) ve çöktürülen protein miktarını önceden tahmin edebilmek, numune hazırlama sırasında büyük kolaylık sağlamaktadır (Bölüm 3.2.3) D Jel Elektroforez Şartlarının Optimizasyonu Çöktürülen proteinlerin tekrar çözünerek IPG şeritlere yüklenmesi ve izoelektrik noktalarına göre odaklanması işlemi için iki farklı tampon çözelti yükleme tamponu olarak denenmiştir. Bunlardan ilki hazır satın alınan yükleme tamponu (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi) ve ikincisi ise kaynaklardakine eş bir biçimde hazırlanan içerikteki yükleme tamponudur (7 M üre, 2 M tiyoüre, %3 CHAPS, 5 mm TBP, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol mavisi). İki tampon arasındaki en belirgin fark kullanılan indirgeyici ajanların farklı oluşudur. Hazır satın alınan tamponda indirgeyici ajan olarak DTT kullanılıyorken hazırlanan yükleme tamponunda TBP kullanılmıştır. Ancak Şekil 4.2 den de anlaşılacağı üzere TBP kullanımı IEF aşamasında ve SDS-PAGE ile ayrımda iyi sonuçlar verememiş ve yatay-dikey çizgilerin oluşmasına sebep olmuştur. Yatay çizgiler en belirgin anlamda izoelektrik odaklamanın istenilen bir biçimde gerçekleşememesinden kaynaklanır.

179 158 Dikey çizgiler ise proteinlerin disülfit bağlarının kopamadığını ve dolayısıyla proteinlerin SDS ile yeterince etkileşemediğini göstermektedir. Daha sonraki çalışmalarda hazır satın alınan yükleme tamponuna eşdeğer bileşimde yükleme tamponları hazırlanarak kullanılmasına karar verilmiştir. 2-D Jel elektroforez çalışmalarında kullanılan SDS-PAGE jeller laboratuvar ortamında hazırlanabildiği gibi hazır olarak da temin edilebilmektedir. Tez çalışması kapsamında laboratuvarda jel hazırlanması fikri tekrarlanabilirlik problemleri oluşturmaması açısından değerlendirilmemiş ve ticari olarak piyasada bulunan hazır jellerin kullanımına yönelinmiştir. Ticari jellerin laboratuvar koşulunda üretilen jellere göre diğer büyük avantajı +4 C de bir yıl süreyle kararlı bir şekilde saklanabilmesi ve gerektiğinde jel hazırlamaya harcanacak vakitten tasarruf etmeye olanak tanımasıdır. Çalışmalarda Criterion XT jel ve Criterion TGX jel hazır temin edilmiş ve uygun koşullarda analiz gerçekleştirildiğinde birinci tercihin daha keskin spotlar elde edebilmek açısından uygun olduğu görülmüştür (Şekil 4.3). Her ne kadar Criterion TGX jel sistemi Criterion XT jele göre daha hızlı bir SDS-PAGE ayrımına olanak tanıyan yeni bir teknoloji olsa da deney şartlarında Criterion XT jelin daha iyi bir ayrıma olanak tanıdığı düşünülmüştür. İlerleyen çalışmalarda Criterion XT jel % 4-12 Bis-Tris kullanılarak çalışmalara devam edilmiştir. İyi bir ayrım yanında ayrılan proteinlerin iyi bir biçimde boyanarak imaj analizi çalışmalarında intensitelerinin en doğru şekilde karşılaştırılması yapılan çalışmanın sağlıklı sonuçlar verebilmesi açısından büyük önem taşır. Bu amaçla Commassie mavisi ile boyama ve SYPRO-Ruby ile floresan boyama teknikleri denenmiştir. Commassie mavisi ile boyamanın en büyük avantajı maliyetinin düşük olması ve boyama sonucu protein spotlarının çıplak gözle görünebilmesidir. Böylece eğer bir sorun varsa jelin fotoğraflanması işlemine geçilmeden deney tekrar edilebilmektedir. Gümüş ile boyama ise tercih edilmemiştir; çünkü hem maliyeti yüksektir hem de doğrusallık ile ilgili problemler oluşturabileceği gibi kütle spektroskopisi cihazı ile uyum konusunda da tercih edilmeyen bir tekniktir (Tablo 2.1). SYPRO-Ruby ise yüksek maliyeti bir kenara bırakılırsa hem duyarlılık, hem

180 159 doğrusallık hem de kütle spektroskopisi ile uyumlu çalışabilme özellikleri sebebiyle Commassie mavisi ile boyamaya iyi bir alternatiftir. Yapılan çalışmalar sonucunda görüldüğü üzere SYPRO-Ruby ile tespit edilebilen spot adedi Commassie mavisine göre tam da beklenildiği şekilde daha fazladır ve ilerleyen çalışmalarda SYPRO- Ruby ile boyama yapılmasına karar verilmiştir (Şekil 4.4). Bir diğer önemli nokta ise SYPRO-Ruby kullanımında 2 saat kadar bir sürenin boyama için yeterli olduğu söylenmesine rağmen (Commassie mavisi için bu süre 24 saattir) gün aşırı beklemenin sonunda tespit edilen spotların görünülürlüğü açısından daha olumlu sonuçlar alınmasıdır. Dolayısıyla jellerin boyanma işlemi için 48 saat süreyle jeller SYPRO-Ruby içeren çözelti içinde bekletilmiştir. SYPRO-Ruby ile boyanan jeller için kullanılan marker, PPP All blue yani mavi renkli marker yerine renksiz bir marker olan PPP unstained dır. Böylece marker da SYRO-Ruby ile boyanmakta ve görüntüleme esnasında ortaya çıkmaktadır. SYPRO-Ruby ile PPP All blue kullanımı Şekil 4.4 de ve PPP unstained kullanımı ise Şekil 4.5 de verilmiştir. Ön çalışmaların sonucunda ayrımı gerçekleştirilebilen ve gözlenebilen proteinlerin özellikle ph 5.0 ila 6.0 aralığında toplanması kullanılan IPG şeritin (ph 4-7) değiştirilmesi fikrine yol açmıştır. Bu amaçla ph aralığında izoelektrik odaklamaya imkan tanıyan IPG şerit kullanıldığında daha fazla sayıda spotun varlığı tespit edilebilmiş ve dolayısıyla çalışmalara ph 5-8 aralığında izoelektrik odaklamaya izin veren ticari şeritlerle devam edilmesi kararlaştırılmıştır (Şekil 4.5). İmaj analizi öncesi gerçekleştirilen fotoğraflama çalışmalarında floresans boyama ile boyanan spotların 20 sn fotoğraflama süresinde flat denilen koruyucu film kullanılarak görüntülendiğinde daha iyi sonuçlar alındığı tespit edilmiştir. Şekil 6 da aynı jelin farklı koşullarda fotoğraflanmış görüntüleri verilmektedir. Dolayısıyla çalışmadaki bütün jeller, 20 sn fotoğraflama süresinde flat kullanılarak görüntülenmiştir. Optimum koşulların bulunmasının ardından; HT29, K562/R ve K562/wt hücre hatları için yapılan proteomik çalışmalarda 280 µl yükleme tamponunda (8 M üre, %2 CHAPS, 50 mm DTT, %0.2 Bio-Lyte 3/10 amfolit, 0.001% bromofenol

181 160 mavisi) çözülmüş 300 µg proteinin (Bölüm 3.2.3) ph 5-8 IPG şeritlerde izoelektrik odaklanması gerçekleştirilmiş ve izoelektrik odaklama sonrası dengeleme için 5 mm TBP ve 135 mm IAA kullanılmıştır (Bölüm ve 3.2.5). Criterion XT jel % 4-12 Bis-Tris ile SDS-PAGE ayrımı gerçekleştirilmiş proteinler (Bölüm 3.2.6) SYPRO Ruby ile 48 saat süresince boyanarak (Bölüm 3.2.7) imaj analizi çalışmaları için hazır hale getirilmiştir. Bütün bu süreç 2-D Jel elektroforez ile protein ayrımının gerçekleştirilmesi için en az 5 iş gününe ihtiyaç duyulduğunu göstermektedir İmaj Analizi Çalışmaları Proteinlerin 2-D Jel elektroforez ile ayrımı sonrası ayrılan proteinler imaj analizi çalışmaları ile tespit edilmekte ve yüksek veya düşük miktarda ifade edilen proteinler farklı gruplar için karşılaştırılmaktadır. İmaj analizi çalışmaları Bölüm ve da anlatıldığı biçimde yapılmaktadır ve yüksek veya düşük miktarda ifade edilen proteinler farklı gruplar için karşılaştırılmaktadır. İmaj analizi çalışmalarında PDQuest TM 2-D Jel analizi programı (version 8.0) kullanılmıştır. Fotoğraflanan jeller dijital ortama aktarılmış ve her bir jel için Şekil 4.7 de gösterilen bölge jellere ait resim dosyası üzerinde kesilerek imaj analizi programına aktarılmıştır. HT29, K562/R ve K562/wt kanser hücre hatlarına ait T ve C gruplarını birbiri içinde karşılaştırmak amacıyla programın istediği şekilde jel üzerinde görüntülenen en büyük spot, en küçük spot ve en silik spot seçilerek program yardımıyla jel üzerinde spot olduğu düşünülen noktaların işaretlenmesi sağlanmıştır (Şekil 4.8, 4.9, 4.10). Bu eşleştirme öncesinde program spotların toplam renkleri yani intensitelerinden yola çıkarak jellere ait resim dosyaları üzerinde kontrast ayarlaması yapmaktadır. Böylece fotoğraflama sırasında ortaya çıkabilecek jeller arası tonlama farklılıkları ortadan kaldırılmaktadır. İşaretlenen spotların yerleri T ve C gruplarına ait herbir örnek için farklı koordinatlarda olduğundan spotların program aracılığıyla tek tek yakınlaştırılarak eşleştirilmesi sağlanmıştır. Eşleştirme sonrasında program tarafından verilen sanal jel haritaları üzerinde Tablo 4.2 ve Şekil 4.11 de verildiği şekilde HT29 hücre hattı için 534, K562/R hücre hattı için 347 ve K562/wt hücre hattı içinse 350 spot tespit edilmiştir. Şekil 4.11 de verilen sanal jel haritalarında T ve C gruplarına ait spotların

182 161 eşleştirilmesi sonucu program tarafından verilen ve jellere ait zemin gürültüsünden ayrılmış olarak her bir spotun bulunduğu koordinat ile spotun boyutunu içeren görüntülerdir. Tespit edilen spotların tamamı program tarafından bulunduğu koordinata göre numaralandırılmıştır. Gözle takip edilerek tek tek farklılaşan onlarca spotun tespiti hatalara sebebiyet vereceği için farklılaşan spotların tespitinde Bölüm da anlatıldığı şekilde PDQuest kullanılarak üç ayrı küme tanımlanmıştır (Şekil 4.12). Booln 1 isimli küme, Statistic 1 ve Quant 1 kümelerinin kesişim kümesidir. Booln 1 kümesinde tanımlanan spotlar MALDI-TOF-MS ile analiz edilebilmek istenen spotlardır (Tablo 4.2). Biberiye ekstresi ile işlem sonucunda yüksek ve düşük miktarda ifade edilen proteinler tespit edilmiş ve biberiye ekstrelerinin kanser hücrelerinin çoğalmasını durdurmadaki etki mekanizmasını moleküler düzeyde açıklamak için ilgili proteinler bulunmuştur. HT29 hücre hattı için T ve C gruplarına ait Booln 1 kümesinde tanımlı 21 spotun intensite x alan değerleri Şekil 5.2 de verilmektedir. Şekil 5.2. HT29 hücre hattı için gruplar arasında %99 güven seviyesinde en az 2 kat farklılaştığı tespit edilen spotların intensite x alan değerlerini gösterir çubuk grafikler (Kırmızı renk C grubunu, yeşil renk ise T grubunu ifade etmektedir, grafiklerin altında belirtilen numaralar spotlara aittir).

183 Peptid Dizileme ile Proteinlerin Tanımlanması MALDI-TOF-MS ile analiz edilmek istenen spotlar (Tablo 4.2) her bir hücre hattı için gözden geçirilmiş ve sonuç olarak HT29 hücre hattı için 17, K562/R hücre hattı için 13 ve K562/wt hücre hattı için 19 spot listelenmiştir (Şekil 4.13, 4.14, 4.15). İlgili spotların yakınlaştırılmış görüntüleri HT29 için Şekil , K562/ R için Şekil , K562/wt için Şekil de verilmiştir. Elde edilen bu listelerde T ve C grupları için en üst düzeyde farklılaşan spotlar intensite sıralamasına göre seçilmiştir. En üst düzeyde farklılaşan spotlardan, HT29 hücre hattı için 12 adet spot (1106, 1604, 1701, 2811, 3102, 4007, 4102, 5307, 7003, 8001, 8303, 8701), K562/R hücre hattı için 10 adet spot (0812, 2610, 2714, 3108, 4611, 4712, 6411, 7219, 7302, 7431) ve K562/wt hücre hattı için 6 adet spot (3604, 3607, 4601, 4805, 5602, 8639) Bölüm da anlatıldığı şekilde tripsin ile peptidlerine parçalanarak (in gel digestion) jelden ekstre edilmiş ve ekstre edilen proteinler Bölüm de anlatıldığı şekilde MALDI-TOF-MS ile analiz edilmiştir ve veribankaları kullanılarak tanımlanmıştır Peptid dizileme çalışmaları (peptide mass fingerprint) için MASCOT software v ve NCBI protein bankası kullanılmıştır. K562/R hücre hattı için 3 spot hariç (4712, 6411, 7302) ve K562/wt hücre hattı için 1 spot hariç (4805) anlamlı sonuçlar bulunmuştur; çünkü bu spotların olası bir kontaminasyon veya veribankası kaynaklı sapmalar sonucu Homo-sapiens türüne ait olmayan proteinler olduğu görülmüştür ve değerlendirmede kapsam dışı bırakılmıştır. Elde edilen veriler ışığında; HT29, K562/R ve K562/wt kanser hücre hatları için biberiye ekstrelerinin tatbiki sonucunda nicel anlamda yüksek miktarda ve düşük miktarda ifade edilen proteinler böylece tanımlanmıştır (Tablo 4.3; 4.4 ve 4.5) Proteomik Sonuçlarının Yorumlanması Öncel in bildirdiğine göre (208) Hanahan ve ark. (209,210) tümör gelişiminde hücrede gerçekleşen fizyolojik değişiklikleri 6 başlık altında sıralanmıştır:

184 163 1-Büyümede kendi kendine yeterlilik 2-Büyüme inhibisyonuna duyarsızlık 3-Programlı hücre ölümünden (apoptoz) kurtulma 4-Sınırsız replikatif potansiyel (çoğalma potansiyeli) 5-Devam eden anjiogenez (yeni damarların oluşumu ve gelişmesi) 6-Doku invazyonu ve metastaz (çevre dokulara yayılma) Tez çalışmasında, biberiye ekstreleri ile işlem gören kanserli hücre hatlarında biberiyenin antikanser aktivitesinin (kanserli hücre hatlarındaki çoğalmanın (proliferasyon) ne şekilde engellendiğinin) açıklanabilmesi için, yukarıdaki olaylar ile ilişkili mekanizmaların baskılanma şekillerini moleküler düzeyde açıklamak gerekmektedir. Kanserli hücrelerde hücre siklusunda anormallikler (hücrede değişiklikler) saptanmaktadır. Hücre siklusu süreci; çoğalmak (prolifere olmak) üzere uyarılmış bir hücrede gerçekleşen ve bir dizi geçici biyokimyasal aktivitelerin ve morfolojik değişikliklerin görüldüğü bir süreçtir. Bir siklusa giren hücre, morfolojik ve genetik olarak birbirine tıpa tıp benzeyen iki hücre oluşumuyla döngüyü tamamlar. Hücre çoğalması sırasında hücre siklusu içinde yer alan bazı kontrol noktaları tarafından düzenli olarak kontrol edilir. Hücre siklusu; hücre çoğalması, farklılaşması (diferansiyasyon) ve programlanmış hücre ölümü (apoptozis) gibi temel hücresel fonksiyonları düzenlemektedir. Bu düzenleme özelliğinin olması organizmadaki hemen hemen her tür fizyolojik (örneğin doku hemostazisi) ve patolojik durumlarda (örneğin tümör oluşumu) hücre siklusunun ne denli kritik bir öneme sahip olduğunu göstermektedir (211). Böylece kanserli hücrelerde hücre siklusunda meydana gelen olumsuzlukların, biberiye ekstreleri ile işlem sonrasında normale döndüğü saptanmıştır. Isı Şok Proteinleri (Hsp ler) ve Şaperonlar 1962 yılında tükürük salgısının ısıya maruz bırakıldığında yüksek ısıya bağlı bir protein sentezlendiği görülmüştür. Ferruccio Ritossa tarafından yapılan deneyde ısı sonucu sentezlendiği gözlenen bu proteinlere ısı şok proteinleri (heat-shock

185 164 proteins; Hsp) denilmiştir (212,213). Bu proteinin görevi, normal fizyolojik koşullarda sentezlenen proteinlerin üçüncül yapılarını kazanmasını sağlamak, proteinlerin çökmesini engellemek ve yanlış katlanmış ve çökmüş proteinleri birbirinden ayırmak ve doğru katlanmasını sağlamaktır. Ayrıca proteinleri ribozomdan görev alacağı yerlere taşırlar. Isı şoku altında bu proteinlerin sentezi hızlanır. Çoğu durumda ısı stresine bir yanıt olarak sentezlenen bu proteinler, ısı haricinde farmakolojik ajanlara karşı da sentezlenebilmektedir. Bu yüzden sadece ısı şoku proteini demek yanlış olacaktır ve bu proteinleri stres koşullarında hücrenin bir yanıtı olarak düşünmek gerekir. Bu proteinlerin moleküler ağırlıkları 7 ile 110 kda arasındadır ve hem hücre içinde sitoplazma ve organellerde (mitokondri, endoplazmik retikulum), hem de hücre dışında görülebilirler (214). Şaperonlar, proteinlerin katlanarak üç boyutlu hâle gelmesi işleminde yer alan refakatçi proteinlerdir. Hsp ve şaperon isimleri çoğunlukla aynı anlamda kullanılmaktadır ancak şaperon özelliği göstermeyen Hsp ler ve de Hsp olmayan bazı şaperonlar vardır. Dolayısıyla bu noktada Hsp ve şaperon ifadeleri ayrışmaktadır (214,215). Şaperoninler şaperonların bir alt bölümüdür. TCP-1 içeren şaperonin (UniPort ID: Q59ET3), kanserli hücrelerde yüksek miktarda ifade edilen bir proteindir. Kolorektal kanser oluşumunda şaperonin t-kompleks proteinlerinin yüksek düzeyde ifade edildiği bildirilmiştir (216). Ancak; biberiye ekstreleri ile işlem görmüş HT29 kolon kanseri hücre hatlarında, TCP-1 içeren şaperonin kontrol grubu ile karşılaştırıldığında düşük miktarda ifade edilmiştir (Tablo 4.3). Bu durum biberiye ekstrelerinin antikanser aktiviteyle ilişkilendirilebilmesi açısından olumlu bir sonuçtur ve bu sonuç 2012 yılında Lee ve ark. tarafından gerçekleştirilen çalışma sonuçlarıyla uyuşmaktadır. Lee ve arkadaşları, kolon kanserinin ilaç ile tedavisine cevap olarak TCP-1 içeren şaperonin miktarı ile p53 arasında ters bir bağıl ilişki olduğunu bildirmiştir (217). p53, ya da diğer adıyla tümör protein 53 (TP53), hücre döngüsünü düzenleyen ve birçok organizmada kanseri baskılamak için görev alan çok önemli bir proteindir. Hücre siklusunu durdurarak hücreye DNA sındaki hasarları onarması için zaman kazandırır ve genomda mutasyon olmasını önleyerek

186 165 genom kararlılığını korur. Aynı zamanda kontrollü hücre ölümünde (apoptozisde) rol alır. Tez çalışmasındaki sonuçlar göstermektedir ki; biberiye ekstreleri ile HT29 kolon kanseri hücre hattının işlem görmesi sonucu TCP-1 içeren şaperonin miktarı azalmıştır (Tablo 4.3). Bu durum biberiye ekstreleri ile işlem sonucu hücre çoğalmasındaki (proliferasyon) azalmanın tümör gelişiminin devam etmesi için gerekli olan apoptozun inhibe edilmesi ile ilişkilendirilmek için yoruma ve daha detaylı çalışmalara açıktır (218). Kaynaklarda Hsp lerin artışı ile p53 protein ailesinin tümör baskılayıcı özelliğinin tersine çevrildiğini işaret eden çalışmalara sıklıkla rastlanılmaktadır (208,219). Biberiye ile işlem sonrası TCP-1 içeren şaperonin miktarındaki azalmaya paralel olarak miktarı azalması beklenen 60 kda ağırlığındaki mitokondriyal Hsp ler, biberiye ekstreleri ile işlem görmüş K562/R ve K562/wt hücre hatlarında beklenmedik bir şekilde yüksek miktarda ifade edilmiştir (Tablo 4.4 ve 4.5). Her ne kadar Hsp ler hücre çoğalmasında (proliferasyonda) doğrudan görevli olmasalar da ve biberiye ile işlem sonrası hücre çoğalması gerilemiş olsa da Hsp ifadesindeki artışların tümör gelişim aşamaları ve ilaca dirençli fenotip gelişiminde rol oynadığı bildirilmektedir (208). Hsp ler kanser gelişiminde kontrollü hücre ölümü (apoptoz) gibi antikanser mekanizmalarının baskılanmasına neden olmaktadırlar ve metastatik genlerin ekspresyonlarının hızlanmasını sağlamaktadırlar (208). Kaynaklar bu durumu desteklemektedir. Örneğin; Hsp70 ile ilgili çalışmalarda Hsp70 azalmasının çeşitli tümörlerde apoptoz benzeri hücre ölümüne neden olduğu bilgisi verilmektedir. Hsp70 proteinlerinin p53 yolağının baskılanmasında rol aldığı düşünülmektedir ve Hsp70 azalması kusurlu bir yaşlanma sürecinin ortaya çıkmasına neden olmaktadır (220,221). Aynı şekilde Hsp27 için de benzer sonuçlar bildirilmektedir. Örneğin sitoplazmadaki sitokrom C, apoptozun en son basamağında görev alır ancak Hsp27 sitokrom C oluşumunu olumsuz yönde etkiler (222,223). Antikanser ilaçlar içinde Hsp90 ı hedefleyen ilaçlar bulunmaktadır (208).Anjiyogenez yeni damarların oluşması ve gelişmesi anlamına gelir. Tümör hücreleri açısından önemlidir ve eğer engellenirse tümör gelişimi baskılanır (224).

187 166 Tez çalışması kapsamında elde edilen sonuçlara bakıldığında hücre hatlarındaki çoğalmanın biberiye ekstrelerinin tatbiki ile azalmasına rağmen Hsp nin tam tersine biberiye ekstreleri ile tatbik sonucunda yüksek miktarda ifade edilmesi iki şekilde yorumlanabilir. İlk akla gelen düşünce biberiye ekstrelerindeki polifenollerin, hücre hatları üzerinde stres etkisi oluşturması ve buna karşılık olarak Hsp60 cevabının arttığıdır. Bu durum kaynaklarla da desteklenebilmektedir ve strese bağlı olarak Hsp60 miktarının arttığı bildirilmiştir (225,226). Ancak stress koşuluna bağlı olarak Hsp artışı yorumunda açık kalan nokta neden sadece Hsp60 ın yüksek miktarda ifade edildiği olacaktır. Biberiye ekstreleri ile işlem sonrası Hsp60 ifadesindeki artış, stres altında kalmanın bir sonucu olarak gözlenebilme veya tedaviye cevap verme açısından yoruma açıktır; çünkü bu noktada Hsp60, diğer Hsp lerden ayrılmaktadır. Örneğin; Urushibara ve ark. tarafından 2007 yılında yapılan bir çalışmada Hsp60 miktarının mesane kanseri tedavisi sonrasında şaşırtıcı bir şekilde arttığı bildirilmektedir (227). Cappello ve arkadaşları ise 2008 yılında yaptıkları bir çalışmada Hsp60 ın tedaviye yanıtı açısından farklı kanser hücreleri için farklı sonuçlar verebildiğini belirtmişlerdir (228). Dolayısıyla Hsp60 miktarındaki artış kan kanseri hücre hatlarına biberiye ile işlem sonrası antikanser aktiviteye bir cevap olarak da düşünülebilir. Adenin fosforibozil transferaz K562/R hücre hatlarında biberiye ile işlem sonrası düşük miktarda ifade edilen proteinlerden başlıcası olan adenin fosforibozil transferaz enzimi (UniPort ID: G5E9J2), pürin bazlarının sentezinde kurtarma yolunda görev alan, adeninden adenozin monofosfat oluşturan transferaz sınıfından bir enzimdir. Etkisini, adenin ile fosforibozil pirofosfat arasındaki reaksiyonu katalizleyerek gösterir. Pürin kurtarma yolu, normal hücresel nükleik asitlerin döngüsünden veya dietten yıkılmadan gelen pürinlerin tekrar nükleozid trifosfatlara çevrilerek vücutta kullanılmasıdır. Kanser tedavisinde yararlanılan ilaçlardan bazıları pürin ve pirimidin nükleotid sentezini engelleyerek ya da DNA ve RNA sentezinde bunların yerlerini alarak etki gösteren ilaçlardır (229). Pürin sentezi inhibitörleri, nükleotid ve dolayısıyla DNA-RNA

188 167 sentezini bozarak kanser yayılımını önlerler. Dolayısıyla pürin kurtarma yolunda görev alan adenin fosforibozil transferaz ın biberiye ekstreleri ile işlem sonrasında düşük miktarda ifadesi, biberiye ekstrelerinin çoğalmayı önleyici (anti-proliferatif) etkisinin bir sonucu olarak ortaya çıktığı düşünülmektedir (Tablo 4.4). Pürin kurtarma yolunun inhibisyonu ile kanserli hücrelerde çoğalma baskılanmıştır. Retinal dehidrojenaz 2 Retinal dehidrojenaz 2 enzimi (UniPort ID: O94788), oksidoredüktaz ailesine ait bir enzimdir ve K562/R hücre hatlarında biberiye ile işlem sonrasında yüksek miktarda ifade edilmiştir (Tablo 4.4). Oksidoredüktazlar bir elektronun indirgenden yükseltgene aktarılmasını katalizleyen enzimlerdir (230). Bir oksidoredüktaz olan retinal dehidrojenaz 2 enziminin miktarındaki artış biberiye ekstresindeki polifenollerin önleyici antioksidatif (pro-antioksidatif) etkisi ile açıklanabilmektedir. Antioksidatif etki direkt olarak antikanser aktivite ile ilişkili olmasa da oksidatif stres sonucu hücrede meydana gelen hücre hasarını önleme açısından dikkate değer bir sonuçtur. Anneksin A1 K562/R hücre hattında biberiye ekstreleriyle işlem sonrası Anneksin A1 (UniPort ID: P04083) düşük miktarda ifade edilmiştir (Tablo 4.4). Bu durum daha önce meme kanseri ve pankreas kanseri ile ilgili olarak yapılmış çalışmalarda anneksin A1 ve kanser arasındaki ilişki açısından olumlu bir sonuçtur (231); çünkü Anneksin A1 in DNA hasarını önlemede koruyucu etkisi vardır ve Anneksin A1 in azalması DNA nın hasar görmeye eğilimini arttırmaktadır (232). Lipokortin 1 olarak da bilinen Anneksin A1, ANXA1 geni tarafından kodlanır. ANXA1 geni hairy cell lösemi teşhisinde biyobelirteç olarak kullanılabilmektedir (233,234). Anneksin A1 miktarındaki düşüş, biberiye ekstreleri ile işlem sonrası hücre çoğalmasındaki azalmayla ilişkilendirilebilmektedir. Tübülin Üçüncül yapılarıyla ilişkili olarak proteinler kabaca üç ana sınıfa ayrılabilirler: küresel (globüler) proteinler, lifli (fibröz) proteinler ve zar (membran) proteinleri.

189 168 Tübülin, küresel proteinler olarak bilinen mikrotübüllerin bir alt grubudur ve α- ve β-tübülin olmak üzere ikiye ayrılır. Mikrotübüller genellikle demetler halinde bir çoğu bir araya gelerek oldukça kuvvetli yapılar oluştururlar. Bu nedenle mikrotübüllerin esas görevi hücrede bir çeşit iskelet oluşturmaktır. Borucuk biçimindeki yapıları içlerinden madde akışının geçmesine olanak sağlamaktadır. Sitoplazma hareketinin oluşumunda rol aldığı kabul edilir. Ayrıca; hücrenin kendi genomunu eşleyerek iki yavru hücre şeklinde bölünmesi olayında yani mitoz bölünmede de görev almaktadırlar. Bütün bu özellikleri dikkate alındığında kanser kemoterapisinde iyi birer hedef molekül olmaktadırlar ( ). Mikrotübül dinamiğini baskıladığı bilinen ve yaygın olarak kullanılan ilaçların başında taksanlar ve vinka alkaloitleri gelmektedir (238). Taksan sınıfı bileşikler (paklitaksel ve dosetaksel) en önemli kemoterapötik ilaçlardandır ve ilk defa ABD'de yetişen Taxus brevifolia Nutt.' ın kabuğundan 1971 yılında elde edilmiştir. Dosetaksel, Avrupa'da yetişen Taxus baccata' nın yapraklarından ekstre edilen 10-deasetilbakkatin III'den yarısentez sonucu elde edilmiştir. Paklitaksel ve yarısentetik türevi olan dosetaksel antitümör etkilerini, hücrede mikrotübüllerin toplanmasını arttırmak ve depolimerizasyonunu önleyerek mikrotübül toplulukları oluşturmak şeklinde göstermektedir (239). Vinka alkaloidleri ise mikrotübül stabilitesini bozarak metafaz, anafaz geçişini engeller. Vinorelbin klinikte en çok kabul gören ve düşük toksik etkiye sahip vinka alkaloididir (240). Pervane çiçeği (Vinca rosea) nin akut lösemi üzerine etkisi ilk kez 1964 yılında Sampey (241) tarafından bildirilmiştir. Tez çalışması kapsamında yararlanılan biberiyenin antitümör aktivitesiyle ilgili en çarpıcı sonuç tübülin alfa-1c ve tübülin alfa-1b ifadesindeki azalmadır (Tablo 4.3 ve 4.5). K562/ wt hücre hatları için Tübülin alfa-1c (UniPort ID: Q9BQE3) ve HT29 hücre hatları için tübülin alfa-1b (UniPort ID: P68362) miktarında biberiye ile işlem sonrasında sırasıyla 22 katlık ve 5.4 katlık bir azalma görülmüştür. Bu durum, biberiyeden elde edilen polifenoller içersinden bazı moleküllerin etkisiyle veya birkaç molekülün sinerjik etkisiyle tübülin alfa-1c ve tübülin alfa-1b nin hedeflendiğini işaret etmektedir. Dolayısıyla hücre çoğalmasının vinka alkaloidlerinin etkisine benzer bir

190 169 şekilde baskılandığı düşünülmektedir. Statmin HT29 hücre hattında biberiye ile işlem sonrasında statmin (UniPort ID: P16949) miktarındaki azalış doğrudan kanserli hücrelerin çoğalmasındaki azalış ile ilişkilendirilebilmektedir (Tablo 4.3); çünkü statmin, mikrotübül iskeletinin oluşturulmasında görev alan bir protein olup bu işlevini mikrotübüllerin depolimerizasyonununu destekleyerek ve/veya mikrotübül heterodimerlerinin polimerize olmasını engelleyerek sağlar (242). Zheng ve ark. tarafından 2010 yılında yapılan bir çalışmada kanser tedavisinde statminin hedeflenmesi tartışılmıştır (243). Biberiye ile işlem sonrası statmin miktarındaki azalış, biberiye ekstrelerindeki bazı bileşiklerin statmini hedeflediği görüşü üzerinde düşünülmesini sağlar. D-3-fosfogliserat dehidrogenaz D-3-fosfogliserat dehidrogenaz (UniPort ID: O43175) PHGDH geni tarafından kodlanmaktadır ve 3-fosfogliseratın 3-fosfohidroksipirüvat a dönüşümünü katalizleyen bir enzimdir. Bu reaksiyon serin biyosentezi ile doğrudan ilişkilidir; çünkü serin biyosentezi 3-fosfogliserat'ın oksidasyonuyla başlar (244). Tez çalışmasındaki sonuçlara göre D-3-fosfogliserat dehidrogenaz biberiye ekstreleriyle işlem sonrasında K562/wt hücre hatlarında yüksek miktarda ifade edilmiştir (Tablo 4.5). Kaynaklarda bir estrojen reseptörü olan tamoksifenin de tedavi sonrasında göğüs kanserinde D-3-fosfogliserat dehidrogenaz miktarını arttırdığı bildirilmiştir (245). Katepsinler Katepsinler hücre içi sindirimde görev yapan, lizozomlarda bulunan bir grup proteolitik enzimdir. Bir diğer adı proteazlar olan proteolitik enzimler proteinlerin parçalanmasından sorumlu enzimlerdir. Kaynaklarda katepsin B (UniPort ID: P07858) nin tümör oluşumu ve metastazı ile ilişkisini bildiren çalışmalar bulunmaktadır (246). Birçok kanser türünde katepsin B ifadesi mrna ve protein düzeyinde artmıştır (247). Chan ve ark. (248) tarafından 2010 yılında yapılmış bir çalışmada katepsin

191 170 B nin kolon kanserinden kurtulma ile ilişkisi incelenmiş ve katepsin B ifadesindeki artış ile zamana bağlı hayatta kalma ihtimalinin azaldığı görülmüştür (Şekil 5.3). Buradan yola çıkarak Katepsin B nin kolon kanserinin seyrini incelemede kullanılabilecek bir biyobelirteç olduğu bildirilmiştir.!;*6;#<'%+/=<'#+%!'6)7(+$%8%394%%%%%!'6)7(+$%8%3:4%%%%%%!'6)7(+$%8%394%%%%%!'6)7(+$%8%3:4%%%%%%!"#"$%&'$()*+$)%,'-#.%/'0'1'%&'#.2%30.#4%%%%%%%% 5)$)#%/'0'1'%&'#.2%30.#4% Şekil 5.3. Kolon kanserinde katepsin ifadesindeki artışa bağlı olarak hayatta kalma ihtimali. Tez çalışmasında biberiyeden elde edilen ekstrelerle işlem görmüş HT29 hücre hatlarında katepsin B nin, hücre çoğalmasındaki düşüşe rağmen yüksek miktarda ifade edilmesi beklenmedik bir durum gibi görülmektedir (Tablo 4.3). Ancak; bu durum proteolitik bir enzim olan katepsinin kanser hücre hattındaki ölü hücrelerin sindirimi için görev aldığı ve bu yüzden yüksek miktarda ifade edildiği şeklinde yorumlanabilir. Peroksiredoksin-4 Peroksiredoksin-4 (UniPort ID: Q13162) de biberiyeden elde edilen ekstrelerin etkisi ile HT29 hücre hatlarında yüksek miktarda ifade edilmiştir (Tablo 4.3). Peroksiredoksin-4, PRDX4 geni tarafından kodlanır ve bir antioksidan enzimdir. Peroksiredoksinler hücrede hidrojen peroksidin toksik etkisini tiyoredoksin kullanarak yok etmek üzere görev alırlar. Aşağıda peroksiredoksinlerin (Prx) tiyoredoksin (Trx) varlığında hidrojen peroksidi indirgeme reaksiyonu verilmektedir (249).

192 171 Prx(ind.) + H2O2 Prx(yük.) + 2H2O Prx(yük.) + Trx(ind.) Prx(ind.) + Trx(yük.) İlk bakışta antioksidan özelliği bilinen polifenollerin etkisi ile oksidatif stresin azalacağı ve dolayısıyla bir antioksidan enzim olan peroksiredoksin-4 ün düşük miktarda ifade edilmesi gerektiği düşünülebilir. Ayrıca, kolon kanserinde peroksiredoksin in düşük miktarda ifade edilmesinin hücreyi apoptoza götürdüğü de bildirilmektedir (250) ve hücre çoğalmasının azaldığı bir durumda peroksiredoksin-4 ün yüksek miktarda ifade edilmesini açıklamak zordur. Bununla birlikte peroksiredoksin-4 enziminin düşük miktarda ifade edilmesi beklenirken biberiye etkisi ile yüksek miktarda hidrojen peroksidin bulunması dikkate değerdir; çünkü kanser hücreleri antioksidan etkiye karşı kendilerini savunma eğilimindedir ve polifenollerin kuvvetli antioksidan etkisiyle oluşabilecek olan hidrojen perokside karşı peroksiredoksin-4 ün yüksek miktarda ifade edildiği fikri üzerinde düşünülebilir (251,252). Transisyonel endoplazmik retikulum ATPase Transisyonel endoplazmik retikulum ATPase (UniPort ID: P55072), valosin içeren proteinler (VCP) grubundan bir enzimdir ve VCP geni tarafından kodlanır. Yamamoto ve arkadaşları tarafından yapılan bir çalışmada VCP proteinlerinin, mide kanseri sonrasında yapılan operasyonları takiben yüksek miktarda ifade edilmesinin ölüm oranındaki artış ile ilişkili olduğu bildirilmektedir (253). Biberiye ekstreleri ile tatbik sonrası ise transisyonel endoplazmik retikulum ATPase, düşük miktarda ifade edilmiştir (Tablo 4.3). Heterogen nükleer ribonükleoprotein Beklenmedik bir şekilde heterogen nükleer ribonükleoprotein (UniPort ID: KP61978) biberiye ile işlem sonrasında yüksek miktarda ifade edilmiştir. Oysa ki; kaynaklarda heterojen nükleer ribonükleoproteinlerin (hnrnps), kanser durumunda yüksek miktarda ifade edildiği ile ilgili çalışmalar bulunmaktadır ( ). Biberiye ekstreleri ile tatbik sonrası proliferasyondaki azalmaya rağmen heterogen nükleer ribonükleoprotein miktarındaki artış yoruma açıktır.

193 172 Bu tez çalışmasında; foodomik bir yaklaşım sergilenerek gerçekleştirilen, 2-D Jel elektroforez ile protein ayrımına dayalı karşılaştırmalı proteomik çalışmalar sonucunda biberiye ekstrelerinin etkisinin bir sonucu olarak düşük veya yüksek miktarda ifade edilen proteinlerin; tümör gelişimi, hücre çoğalması, kontrollü hücre ölümü ve antioksidan aktivite ile ilişkili olduğu görülmüştür. Bu veriler çoğunlukla kaynaklardaki çalışmalar ile uyum göstermektedir. Türkiye de de Akdeniz tarzı beslenmede sıklıkla kullanılan biberiyenin kolon ve kan kanseri üzerine koruyucu etkisi HT29, K562/wt ve K562/R kanser hücre hatlarında yapılan in-vitro çalışmalarla desteklenmiş ve anti-proliferatif yani kanserli hücrelerin çoğalmasını önleyici etkisi olabileceği belirlenmiştir. Etki mekanizması ile ilgili olarak moleküler düzeyde anlamlı sonuçlara ulaşılmıştır Metabolomik Çalışmalar Metabolomik çalışmalarda K562/R hücre hattı metabolitleri CE-MS kullanılarak analiz edilmiş ve XCMS ile metabolit profilleme çalışmaları yapılmıştır Numune Hazırlama K562/R hücre hattından sitozolik fraksiyonlar Bölüm de anlatıldığı şekilde hazırlanmıştır. Metabolitlerin alınarak analiz edilmesi için metanolle metabolitlerin ekstre edilmesi, ultrafiltrasyon ve katı faz ekstraksiyon teknikleri içinden ultrafiltrasyon tekniği, diğer iki tekniğe göre uygulaması daha kolay olduğu için ve herhangi bir dezavantajı bulunmadığı için metabolitlerin sitozolik fraksiyondan çekilmesi Bölüm de anlatıldığı şekilde uygulanmıştır CE-MS ile Metabolitlerin Analizi Kapiler elektroforezde metabolitlerin ayrılması için 90 cm uzunluğunda kesilmiş (50 µm iç çapa sahip) kapiler ve çalışma elektroliti olarak 1 M formik asit çözeltisi kullanılmıştır (Bölüm 3.3.2). 1 M formik asit çözeltisinin ph sı 1.8 dir ve bu ph da profillenmek istenen bir çok metabolitin pozitif yükleneceği düşünülmüştür. Pozitif yüklü metabolitler, kapiler zon elektroforez (CZE) metodunda elektroozmotik akıştan (EOF) önce göç ederek dedektöre ulaşmaktadırlar. Hidrodinamik enjeksiyonun elektrokinetik enjeksiyona göre daha tekrarlanabilir

194 173 sonuçlar verdiği bilindiğinden enjeksiyonlar 6 şar tekrarlı olacak şekilde 0.5 psi (34.5 bar) basınç uygulanarak 80 saniye süre ile gerçekleştirilmiştir. 25 kv voltaj uygulanmış ve kapiler sıcaklığı 25 C de tutularak 25 dakika süresinde analiz tamamlanmış ve analizin tamamlanmasının hemen ardından sodyum format çözeltisi kapilerden geçirilerek ESI-TOF sistemi kalibre edilmiştir. ESI-TOF sisteminden önce kapiler elektroforez cihazının UV dedektöründen geçen metabolitler takip edildiğinde ilk 6 dakika boyunca UV sinyalinde bir değişiklik olmaması ilk metabolitin 6. dakikada ESI-TOF cihazına ulaşabildiğini işaret etmektedir. Bu sebeple verilerin değerlendirilmesinde 6. dakika ile 23. dakika arasındaki pikler dikkate alınmıştır. Çalışma elektroliti ph sının düşük olması pozitif yüklenen analitler için ESI iyonlaşma veriminin de artmasını sağlamaktadır. Artık bilinen ve kabul edilen bir gerçek; kapiler elektroforez yöntemi teorisinden kaynaklı olarak HPLC ve GC teknikleri ile mukayese edildiğinde enjeksiyonlar arasında tekrarlanabilirlikle ilgili problemler oluşturmaktadır. Tekrarlanabilirlik problemleri yöntemin kesinlik ve doğruluğuna da yansımaktadır. Ancak; bu tekrarlanabilirlik problemlerinin aşılması için kaynaklarda çeşitli uygulamalar önerilmektedir (257,258). Bu uygulamalara paralel olarak tekrarlanabilirlik probleminin önüne geçmek için kapiler, kullanılmadan önce 20 dakika 0.1 M NaOH, 20 dakika su ve 20 dakika çalışma elektroliti ile yıkanmış ve herbir enjeksiyon sonrasında 4 dakika su geçirilerek yıkanmış ve ardından 4 dakika boyunca çalışma elektroliti geçirilmiştir. Çalışmaya başlamadan önce Tablo 3.8 de verilen metabolit standartları kullanılarak tekrarlı enjeksiyonlar gerçekleşmiş ve sistem uygunluğu kütlesi bilinen çeşitli metabolit standartları aracılığıyla enjeksiyon tekrarlanabilirliği, ayırıcılık ve pik simetrisi değerleri kontrol edilerek gerçekleştirilmiştir. Numune enjeksiyonu öncesinde homojenizasyon tamponunda çözülmüş standartlar enjekte edilerek enjeksiyonlar arası tekrarlanabilirlik problemi olup olmadığı gözden geçirilmiş ve cihazın o gün için sorunsuz bir şekilde çalıştığına kanaat getirildiğinde numune enjeksiyonlarına geçilmiştir. Ayrıca tekrarlı enjeksiyonlar arası total iyon elektroferogramları üst üste koyularak karşılaştırılmış

195 174 ve bilinen bazı metabolitler için tekrarlı analizlerde göç zamanları arasındaki bağıl standart sapma değerleri % 10 dan daha yüksek bulunduysa analizler tekrarlanmıştır. Eğer ki yine de tekrarlanabilirlik ve akım düşmesi gibi sorunlar yaşandıysa kapilerin ESI-TOF ile bağlantısını sağlayan ortogonal elektrosprey iyonizasyon arayüzünden kapiler çıkarılarak ucu baştan kesilmiş ve düzgün bir kesim gerçekleşip gerçekleşmediği büyüteç yardımıyla kontrol edilmiş ve tekrar cihaza bağlanmıştır. Buna rağmen sonuç alınamıyorsa kapilerin değiştirilmesi yoluna gidilmiştir. Tekrarlanabilirlik sorunu ile ilgili bütün bu dezavantajlarına rağmen CE yönteminin metabolit profilleme çalışmalarında LC ve GC ye göre en büyük avantajı daha fazla sayıda metabolitin analizine olanak tanımasıdır ( ). CE-MS analizleri Bölüm de anlatıldığı şekilde gerçekleştirilmiştir ve Şekil 4.43 de verilen elektroferogramlar elde edilmiştir XCMS Parametrelerinin Optimizasyonu Metabolit hedef analizleri (Targeted metabolomics) uygulamalarında sonuca ulaşmak için (örneğin bir hastalığın teşhisi veya hastalık durumunda metabolit(ler)in miktarındaki artışın incelenmesi gibi) GC-MS ve LC-MS teknikleri alıkonma zamanlarının tekrarlanabilir olması açısından CE-MS e göre avantajlıdır. Özellikle GC-MS ile metabolit hedef analizi çalışmaları için metabolitlere ait alıkonma zamanları indeksleri içeren veribankaları bulunmaktadır (Tablo 2.5). Ancak; aranılan metabolitlerin bilinmediği ve metabolit profilleme yapılarak farklı gruplar için nicel anlamda değişiklik gösteren metabolitlerin semiquantitative yani yarı kantitatif olarak gruplar arasında karşılaştırılacağı bir çalışmada onlarca hatta yüzlerce metabolitin alıkonma zamanındaki farklılaşmalar verilerin değerlendirilmesinde büyük sorun yaratmaktadır. Alıkonma zamanları arasındaki farklılaşmaya ilave olarak her bir metabolit için enjeksiyonlar arası m/z değerleri ve intensite değerlerinin de farklılaşabileceği düşünüldüğünde işlenmesi gereken veri insan emeği ile büyük zaman harcanması gereken bir hal almaktadır. Bu amaçla bazı firmalar ticari olarak piyasaya sürdükleri cihazlar ile birlikte çalışabilen yazılımlar önermekte olduğu gibi kimi serbest olarak erişilebilen yazılımlar da metabolit profilleme çalışmaları için kullanılabilmektedir. Bu amaçla

196 175 kullanılabilen serbest erişimli yazılımlardan biri olan XCMS ile ilgili detaylı bilgi Bölüm 2.10 da verilmiştir. Tautenhann ve arkadaşları 2008 yılında yaptıkları çalışmada, LC-MS uygulamaları için serbest erişimli diğer bir yazılım olan MZmine ve XCMS i karşılaştırmışlardır (166). Bu çalışmada turpgiller (Brassicaceae) familyasından sık rastlanan ve DNA dizilemesi yapılan üçüncü canlı ve ilk bitki türü olan Arabidopsis thaliana yaprakları ve köklerinde LC-MS ile metabolit profilleme çalışmaları gerçekleştirmişlerdir. Çalışma sonucunda MZmine ve XCMS (matchfilter ve centwave) algoritmaları karşılaştırıldığında köklerden ve yapraklardan elde edilen ekstrelerde metabolit piki olduğu düşünülerek program tarafından tespit edilen pik sayıları Şekil 5.4 de verilmiştir.!"#$%&'%()%$'%)%'*$%()%#+,&%$%&) -./&.#$.&'.()%$'%)%'*$%()%#+,&%$%&) Şekil 5.4. Arabidopsis thaliana kökleri ve yapraklarında LC-MS kullanılarak MZmine ve XCMS kullanılarak tespit edilen olası metabolit pikleri (166). Tautenhann ve arkadaşları yaptıkları bu çalışmada matchfilter ve centwave algoritmaları için kullandıkları parametreleri belirtmektedirler ve sonuç olarak centwave algoritmasının matchfilter algoritması ve MZmine a göre daha hassas ve başarılı olduğunu bildirmişlerdir. Smith, 2006 yılında Analytical Chemistry (168) dergisinde yapmış olduğu XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using Nonlinear peak alignment, matching, and identification isimli çalışmaya paralel olarak 2012

197 176 yılında 1 adresinde LC-MS Preprocessing and Analysis with XCMS isimli bir klavuz yayınlamıştır 2 ve bu klavuzda XCMS uygulaması ile ilgili örnekler vererek alıkonma zamanı düzeltme ve pikleri bulma ile ilgili parametrelerin çeşitli şekillerde varyasyonlarla daha da etkin kullanılabileceğinden söz etmektedir 3. Ancak CE-MS uygulamalarıyla ilgili bilgi burada da verilmemiştir. Tez çalışması öncesinde HT29 hücre hatlarında yapılan metabolit profilleme çalışmalarında XCMS kullanılmamış ve CE-MS verileri manuel olarak değerlendirilmiştir (182). Bu şekilde bir değerlendirmede karşılaşılan zorluklar ve zaman kaybı göz önüne alındığında K562/R hücre hattı için CE-MS ile metabolit profilleme çalışmalarında XCMS in kapasitesinin değerlendirilerek ileriki çalışmalara ışık tutulmasına ve en optimum düzeyde metabolit profillemenin gerçekleştirilmeye çalışılmasına karar verilmiştir. Kaynaklar gözden geçirildiğinde görülen; ilk olarak Ramautar, Hollanda da 2010 yılında tamamlamış olduğu Capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of body fluids isimli tez çalışması kapsamında 4 (259) çeşitli biyolojik sıvılardan CE-MS ile metabolit profillemede XCMS kullanmış ve başarılı sonuçlar almıştır (260,261). Sözü edilen tez çalışmasında XCMS için default parametrelerin kullanıldığı belirtilmiştir (chapter 7, sayfa 128). Bu parametreler Tablo 4.6 da verilen m1 parametresidir. Nevedomskaya ve arkadaşları ise yaptıkları çalışmada CE-MS ile metabolit profillemede XCMS ve benzer program olan msalign2 üzerinde çalışmıştır. Nevedomskaya nın bildirdiğine göre XCMS, çok sayıda parametrenin değiştirilebilmesi parametrelerin ayarlanmasında yaşattığı zorluklar sebebiyle msalign2 e göre zayıf kalmaktadır. msalign2 nin daha az sayıda kontrol edilebilir parametre içerdiği belirtilmiştir. Buna rağmen XCMS in verileri işlemesi sonrası vermiş olduğu tablonun Bu klavuz daha önceki senelerde de var olan benzer klavuzun en güncel halidir. 3 centwave algoritması için script yazımında peakwidth=c(20,50) ibaresinin HPLC, peakwidth=c(5,12) ibaresinin UPLC (Ultra performanslı sıvı kromatografisi) için kullanılması gerektiği gibi örnekler verilmektedir. 4

198 177 kullanışlı olmasından ve alıkonma zamanlarını düzeltmede varyasyonların msalign2 e göre daha başarılı bulunduğundan söz etmektedir (171). Şekil 2.25 de Nevedomskaya ve ark. tarafından yapılan çalışmada kreatinin piki için orjinal ve XCMS tarafından düzeltilmiş elektroforogramlar verilmiştir; ancak bu çalışmada da XCMS için CE-MS elektroferogramlarında metabolit piklerinin tespitine ait parametreler verilmemektedir yılında XCMS, web üzerinden çalışan ve daha kolay kullanılabilen bir hale getirilmiştir (170). Yeni arayüz kullanıcı dostudur ve artık, bilgisayarda script yazılmasını gerektirmeyecek bir yapıdadır. Analizin yapıldığı platforma göre (örneğin HPLC/Orbitrap veya UPLC/Q-TOF gibi) parametrelerin otomatik olarak seçilerek internet üzerinden verilerin değerlendirilmesine olanak tanımaktadır. Ancak; bu yeni arayüzde tanımlı parametreler içerisinde halen CE-MS için hazır parametreler bulunmamaktadır. Bu durum aslında normaldir; çünkü XCMS, temelinde LC-MS için geliştirilmiş bir uygulamadır. Dolayısıyla CE-MS ile metabolit profilleme çalışmalarında XCMS için farklı parametrelerin denenmesi gerekmektedir. Tez çalışması kapsamında K562/R hücre hattında metabolit profilleme çalışmalarında XCMS kullanılarak Tablo 4.6 da verilen ve Ek 1 açık kodları yazan farklı parametreler denenmiştir. Bu parametrelerden m1 parametresi XCMS için matchfilter algoritmasının default yani baştan tanımlı parametresidir. Diğer parametreler (m2, m3, m4, w1, w2, w3 ve w4) ise pikleri filtreleme ve alıkonma zamanlarını düzeltme parametrelerinin farklılaştırılarak en fazla sayıda gerçek metabolit pikinin gürültüden ayrılarak tespitini sağlamak amacıyla denenmiştir. Bu parametreler içinde m4 ve w3 parametreleri, bulunan toplam pik sayılarından 6 ila 23 dakika arasında göç eden piklere ait enjeksiyonlar arası pik alanı değerlerinin %95 güven seviyesinde en yüksek miktarda örtüştüğü iki parametredir. Dolayısıyla bu iki parametrenin Bölüm de verildiği şekilde pik alanı değerleri normalize edilerek pik alanı değerleri arası varyasyonların önlenmesine karar verilmiştir (Tablo 4.7). Bütün tespit edilen metabolitlerin pik alanlarını, iç standartların veya 6 ila 23

199 178 dakika arasındaki metabolit piklerinin alanlarına bölme yaklaşımında ikinci yaklaşımın ilk yaklaşıma göre gerçekçi sonuçlar almada daha etkili olduğu görülmüş ve ikinci yaklaşım tercih edilmiştir. Piklerin, göz taraması ile kontrol edilerek pik olmadığı düşünülen sinyallerin elenmesinden ve AStream yazılımıyla izotopların ve ESI ürünlerinin bulunmasının ardından m4 ve w3 parametreleri için ortaklaşan 81 pik tespit edilmiştir (Şekil 4.44). Centwave algoritması (w3 parametreleri) ile tespit edilen pik sayısının matchfilter algoritması (m4 parametreleri) na göre daha fazla olduğu gerçeği ortadadır. Ayrıca Şekil 5.5 de verildiği gibi bazı metabolit pikleri matchfilter algoritması tarafından hatalı integre edilmiş ve bu sebeple Tablo 4.7 de m4 parametresi için verilen ve % 95 güven seviyesinde pik alanı değerleri örtüşen 147 pik içine girememiştir. Bununla ilgili en çarpıcı örnek arginin ve pirolin metabolizmasında bulunan N-Asetil-L-sitrülin metabolitine aittir. N-Asetil-L-sitrülin metabolitine ait pikin matchfilter ve centwave algoritmalarının her ikisi tarafından da tespit edilebildiği ancak matchfilter algoritması tarafından hatalı integre edilmesiyle % 95 güven seviyesinde pik alanı değeri örtüşen pikler içerisine giremediği gözlenmiştir. Şekilde koyu renk ile gösterilen çizgiler integrasyonun yapıldığı bölgeyi işaret etmektedir.,+#1234#$5& 1$"#6+7$&!"#$"%!#$&!"#$"%!#$& '()&*+,+"-&.%+"!/$0& '()&*+,+"-&.%+"!/$0& integrasyonu. Şekil 5.5. Farklı algoritmalarla tespit edilen N-Asetil-L-sitrülin pikinin

200 179 Pik alanlarının integrasyonu konusunda matchfilter başarısız görünse bile her iki algoritmada da göç zamanı arasındaki varyasyonun düzeltilmesi konusunda başarılı sonuçlar alınmıştır. Tablo 4.8 de kodu ve Tablo 4.9 da açık ismi verilen 19 numaralı pik için ve veribankalarında bulunamadığı için tanımlanamayan bir metabolite ait pik için göç zamanı düzeltilen (a, c) ve orjinal elektroferogramlar (b, d) Şekil 5.6 da verilmektedir. Şekilden de anlaşılacağı üzere özellikle 19 numaralı pik için (a,b) intensite değerinin düşük olmasına rağmen XCMS ilgili piki tespit etmiş ve göç zamanı değerini eşleştirerek analizler arası varyasyonların önüne geçmiştir. &$ &$ 3$ 0(1.(+,1.$!"#$%&'&()$*+&(,-./$!"#$%&'&()$*+&(,-./$ 0(1.(+,1.$ 0(1.(+,1.$ 0(1.(+,1.$ 2$ 4$!"#$%&'&()$*+&(,-./$!"#$%&'&()$*+&(,-./$ Şekil 5.6. XCMS ile K562/R hüce hattında tespit edilen metabolitlere ait göç zamanı değerleri arasındaki varyasyonları düzeltilmesi (göç zamanı düzeltilen (a, c) ve orjinal elektroferogramlar (b, d)). CE gibi göç zamanı değerleri arasında tekrarlanabilirlik problemleri sebebiyle farklılaşmaların yaşandığı bir analitik teknikte özellikle düşük derişimdeki

201 180 metabolitlerin profillenmesinde XCMS in adaptasyonu yararlı sonuçlar oluşturmaktadır. Bu sayede K562/R hücre hattı için çeşitli veribankaları (KEGG, HMDB ve LMSD) taranarak en az 36 adet metabolit tanımlanmış (Tablo 4.8 ve 4.9; Şekil 4.45 ve 4.46) ve 19 adet metabolit piki ise tespit edildiği halde veribankalarında kaydı bulunamadığı için tanımlanamamıştır. DNA metilasyonu DNA bazlarından adenin ve sitozinin metillenmesini içeren bir işlemdir. Yüksek canlıların normal organizmal gelişimlerinde ve hücresel başkalaşımlarında görülen önemli bir aşamadır. DNA metilasyonu gen ifadelenmesini kalıcı bir şekilde değiştirebilir, bir genin ifadelenme düzeyini azaltabilir, konakçı organizmanın genomuna yerleşmiş viral genlerin ifadelenmesini bastırabilir ve kromatin yapısının temelini meydana getirebilir. Tüm bu özelliklerinin yanı sıra DNA metilasyonu birçok kanser türünün gelişiminde çok önemli bir rol oynamaktadır. Bu sebeple kanserleşme sürecinin başlamasının ve ilerlemesinin sadece genetik değişimlere değil aynı zamanda DNA metilasyonu ve histon modifikasyonu gibi epigenetik değişimlere de bağlı olduğu tespit edilmiştir (262). Özellikle genlerin promoter bölgelerinde görülen DNA hipermetilasyonu tümörlerde en iyi tanımlanmış epigenetik değişikliklerdir. Dolayısıyla bu özellik kullanılarak tümöre özel DNA metilasyon biyobelirteçleri tespit edilebilir ve klinikte kullanmak üzere aday DNA biyobelirteçleri bulunabilir. DNA biyobelirteci terimi, karsinojenez sürecinde DNA metilasyonuna uğrayan hedef olarak tanımlanır. Böyle bir belirteç kanserin erken tespitinde, terapötik cevabın izlenmesinde son derece faydalı olacaktır (263). Asetilspermidin putresin aracılığıyla arjinin aminoasitinden oluşmaktadır ve nükleik asitlerin hücresel döngülerinde spermidin ile beraber hayati öneme sahip olan bir bileşiktir. Metabolit profilleme sonucunda tespit edilen asetilspermidin, kolon kanserinin takibinde biyobelirteç görevi görmektedir ve kanserle birlikte miktarında artış bildirilmektedir (264). Ancak; K562/R hücre hattının biberiyeden elde edilen ekstrelerle işlem görmesi sonrasında asetilspermidin miktarının azaldığı görülmüştür (Şekil 4.45). Aynı şekilde, deoksinükleotidler kanserin izlenmesinde iyi birer biyobelirteç görevi görmektedir ve özellikle son yıllarda deoksinükleotidlerin miktarını tayin etmeye yönelik çalışmalar giderek artmaktadır (265,266). K562/R hücre hattında

202 181 tespit edilen metabolitlerden 5-Metil-2 deoksisitidinin, biberiyeden elde edilen ekstrelerle işlem sonrasında miktarındaki azalma biberiyenin antikanser aktivitesine işaret etmektedir (Şekil 4.46). Bu tez çalışmasında gerçekleştirilen metabolomik çalışmalar ile XCMS için çeşitli parametrelerin optimize edilerek CE-MS verilerine adaptasyonu ve farklı veribankalarıyla metabolit profillemenin bir sonucu olarak kaynaklara ve ileriki çalışmalara katkı sağlandığı düşünülmektedir. Tartışılmaz bir gerçek; günümüzde sağlık alanındaki gelişmelerden daha hızlı ilerleyen bir teknoloji varsa o da bilgi teknolojileridir. Tıp alanında hastalıkların teşhis ve tedavisinde yeni ufuklar açmak için gerçekleştirilen multidisipliner bilimsel çalışmaların altına artık bilgi teknolojileri de yeni bir disiplin olarak eklenmiştir. 1960'larda başlayan bilgisayar uygulamalarının sağlık alanında kullanılması girişimi hızla ilerlemiş ve böylelikle ortaya çıkan Biyoinformatik dalı bugün en popüler akademik ve endüstriyel çalışma alanlarından biri haline gelmiştir. Bilgisayarların moleküler biyolojide kullanımı; üç boyutlu moleküler yapıların grafik temsili, moleküler dizilimler ve üç boyutlu moleküler yapı veritabanları oluşturulması ile başlamıştır. Kısa sürede çok yüksek miktarlarda veri üreten, endüstri düzeyinde gen ekspresyonu, protein-protein etkileşmesi, biyolojik olarak aktif molekül ile ilgili araştırmalar ve insan genom projesi gibi çalışmaların oluşturduğu talep sonucunda bu alandaki bilişim uygulamaları neredeyse takip edilemez bir hızda gelişmiştir. Biyoinformatik dalının disiplinlerarası ayrı bir bilim dalı olarak tanınması son 10 yılda gerçekleşmiştir. Günümüz dünyasında bilgi teknolojilerine paralel olarak büyük bir hızla ilerleyen biyoinformatik dalının ağırlığı özellikle kompleks biyolojik sistemlerin çözüm aşamasında yadsınamayacak derecede önemlidir ve üzerinde çalışmayı gerektirir. Bu tez çalışması kapsamında gerçekleştirilen proteomik ve metabolomik çalışmalarda düşük ve yüksek miktarda tespit edilen proteinlerin bulunması ve metabolitlerin profillenmesi için validasyon çalışmaları yapılmıştır (267). Proteomik çalışmalar için üç ve metabolomik çalışmalar için altışar tekrarlı analizler sonucu

203 182 sırasıyla protein spotları ve metabolit pikleri için %99 ve %95 güven seviyelerinde eşleşen spotlar ve pikler dikkate alınarak kesinlik parametresi değerlendirilmiştir. Proteinlerin çöktürme sonrası geri kazanım çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Proteinlerin miktar tayinlerinde kalibrasyon tekniği kullanılmıştır. Kalibrasyon grafiklerinden regresyon denklemleri ve korelasyon katsayıları bulunmuştur. Kesinlik çalışmaları için spotların intensiteleri ve kapiler elektroforezde enjeksiyonlar arası bağıl standard sapma (BSS) değerlerindeki farklılaşmalar tespit edilmiş ve metabolomik çalışmalarda bu farklılıklar XCMS ile düzeltilmeye çalışılmıştır. Kanserli hücre hatlarında proteinler 2-D Jel elektroforez tekniği kullanılarak ayrılmış ve MALDI/TOF kütle spektrometrisi ile proteinlerin nitel analizleri gerçekleştirilmiştir. Metabolitlerin analizi için ise CE-MS tekniği kullanılmış ve metabolit profilleme yazılımı olan XCMS ile veriler değerlendirilmiştir. Kullanılan bu yöntemlerin kesin, doğru ve tekrarlanabilir olduğu görülmüştür.

204 183 KAYNAKLAR 1. Winkler, H.P.o.B.i.H.U. (1920). Verbreitung und Ursache der Parthenogenesis im Pflanzen- und Tierreiche: Jena Kuska, B. (1998) Beer, Bethesda, and biology: how "genomics" came into being. Journal of the National Cancer Institute, 90 (2), Crawford, M.H. (1990) The Human Genome Project. Hum Biol, 62 (4), iii-iv. 4. Bentley, D.R. (2000) The Human Genome Project--an overview. Med Res Rev, 20 (3), World Wide Web ( ): Human_Genome/home.shtml 6. Kennedy, M.A. (2001) What does the human genome project mean for medicine? N Z Med J, 114 (1130), Lele, R.D. (2003) The human genome project: its implications in clinical medicine. J Assoc Physicians India, 51, Aldhous, P. (1990) Human genome project. Database goes on-line. Nature, 347 (6288), Tyers, M., Mann, M. (2003) From genomics to proteomics. Nature, 422 (6928), Lottspeich, F. (2009) Introduction to proteomics. Methods Mol Biol, 564, Pandey, A., Mann, M. (2000) Proteomics to study genes and genomes. Nature, 405 (6788), Genomics and World Health. (2002) World Health Orhanization Report of the Advisory Committee on Health Research, Geneva. 13. Özcengiz, G. (2007) Proteomik: Post-genomik dönemin en güçlü teknolojisi. ODTÜ Haber Bülteni, 15, Başaran, E., Aras, S., Cansaran-Duman, D. (2010) Genomik, Proteomik, Metabolomik kavramlarına genel bakış ve uygulama alanları. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi, 67 (2), Denizli, A. (2007) Protein Analizi. Tubitak, Bilim ve Teknik Dergisi, Temmuz, Casado-Vela, J., Cebrian, A., Gomez del Pulgar, M.T., Lacal, J.C. (2011) Approaches for the study of cancer: towards the integration of genomics, proteomics and metabolomics. Clinical & translational oncology : official publication of the Federation of Spanish Oncology Societies and of the National Cancer Institute of Mexico, 13 (9), Madsen, R., Lundstedt, T., Trygg, J. (2010) Chemometrics in metabolomics- A review in human disease diagnosis. Analytica chimica acta, 659 (1-2),

205 Kurban, S., Mehmetoglu, I. (2010) Proteomik. Yeni Tıp Dergisi (27), Türk Eczacılar Birliği Eczacılık Akademisi "Biyokimyada Yeni Uygulamalar: Proteom Analizleri ve Uygulama Alanları" Ders Notları, Haziran Gerszten, R.E., Wang, T.J. (2008) The search for new cardiovascular biomarkers. Nature, 451 (7181), Cifuentes, A. (2009) Food analysis and foodomics. Journal of chromatography. A, 1216 (43), Cifuentes, A. (2010) Food science, foodomics and capillary electromigration methods. Electrophoresis, 31 (13), Herrero, M., Garcia-Canas, V., Simo, C., Cifuentes, A. (2010) Recent advances in the application of capillary electromigration methods for food analysis and Foodomics. Electrophoresis, 31 (1), Herrero, M., Simo, C., Garcia-Canas, V., Ibanez, E., Cifuentes, A. (2012) Foodomics: MS-based strategies in modern food science and nutrition. Mass spectrometry reviews, 31 (1), Parkin, D.M., Coleman, M.P. (1990) Changes in diet and changes in cancer risk: observational studies. IARC scientific publications (103), Cerrato, P.L. (1991) Low-fat diet, lower risk of colorectal cancer. RN, 54 (9), Dwyer, J.T. (1993) Diet and nutritional strategies for cancer risk reduction. Focus on the 21st century. Cancer, 72 (3 Suppl), Hill, M.J. (1999) Diet, physical activity and cancer risk. Public health nutrition, 2 (3A), Key, T.J., Allen, N.E., Spencer, E.A., Travis, R.C. (2002) The effect of diet on risk of cancer. Lancet, 360 (9336), La Vecchia, C., Bosetti, C. (2006) Diet and cancer risk in Mediterranean countries: open issues. Public health nutrition, 9 (8A), Pelucchi, C., Bosetti, C., Rossi, M., Negri, E., La Vecchia, C. (2009) Selected aspects of Mediterranean diet and cancer risk. Nutrition and cancer, 61 (6), Verberne, L., Bach-Faig, A., Buckland, G., Serra-Majem, L. (2010) Association between the Mediterranean diet and cancer risk: a review of observational studies. Nutrition and cancer, 62 (7), Pauwels, E.K. (2011) The protective effect of the Mediterranean diet: focus on cancer and cardiovascular risk. Medical principles and practice : international journal of the Kuwait University, Health Science Centre, 20 (2), Murray, R.K.,Harper, H.A. (1993). Harper's Biochemistry (23rd ed bs.). London: Prentice-Hall International. 35. Pearson, H. (2006) Genetics: what is a gene? Nature, 441 (7092),

206 National Institute of General Medical Services. The New Genetics publications.nigms.nih.gov/thenewgenetics/thenewgenetics.pdf (c ) 37. Alberts, B., Wilson, J.H., Hunt, T. (2008). Molecular biology of the cell (5th ed., Reference ed. bs.). New York, N.Y. ; Abingdon: Garland Science. 38. Gregory, S.G., Barlow, K.F., McLay, K.E., Kaul, R., Swarbreck, D., Dunham, A. ve diğerleri. (2006) The DNA sequence and biological annotation of human chromosome 1. Nature, 441 (7091), Nelson, D.L., Cox, M.M., Lehninger, A.L. (2008). Lehninger principles of biochemistry (5th ed. bs.). New York ; Basingstoke: W.H. Freeman. 40. World Wide Web ( ): bio4fv/page/3d_prot.htm 41. Mishra, N.C. (2010) Introduction to Proteomics: Principles and Applications,. John Wiley & Sons, Inc., USA. 42. Huang, S. (2002) Rational drug discovery: what can we learn from regulatory networks? Drug Discov Today, 7 (20 Suppl), S Horowitz, N.H. (1948) The one gene-one enzyme hypothesis. Genetics, 33 (6), Davis, R.H. (2007) Beadle's progeny: innocence rewarded, innocence lost. J Biosci, 32 (2), Yanofsky, C., Drapeau, G.R., Guest, J.R., Carlton, B.C. (1967) The complete amino acid sequence of the tryptophan sythetase a protein (alpha subunit) and its colinear relationship with the genomic map af the A gene. Proc Natl Acad Sci U S A, 57 (2), Venter, J.C. (2003) A part of the human genome sequence. Science, 299 (5610), Roberts, L., Davenport, R.J., Pennisi, E., Marshall, E. (2001) A history of the Human Genome Project. Science, 291 (5507), World Wide Web ( ): human/ 49. Toriello, H.V. (2002) Effect of the human genome project on the practice of adolescent medicine. Adolesc Med, 13 (2), , v. 50. Polychronakos, C. (2003) Impact of the human genome project on pediatric endocrinology. Horm Res, 59 (2), Cullen, P., Funke, H. (2001) Implications of the human genome project for the identification of genetic risk of coronary heart disease and its prevention in children. Nutr Metab Cardiovasc Dis, 11 Suppl 5, Primorac, D. (2009) Human Genome Project-based applications in forensic science, anthropology, and individualized medicine. Croat Med J, 50 (3), Reiss, T. (2001) Drug discovery of the future: the implications of the human genome project. Trends Biotechnol, 19 (12),

207 Preskorn, S.H. (2001) The human genome project and drug discovery in psychiatry: identifying novel targets. J Psychiatr Pract, 7 (2), Öztürk, M. (2002) İnsan Genom Projesi ve Eczacılık Alanına Etkileri. TEB Meslek İçi Sürekli Eğitim Dergisi, Mayıs (3-4), Carrico, J.M. (2000) Human Genome Project and pharmacogenomics-- implications for pharmacy. Journal of the American Pharmaceutical Association, 40 (1), Zichi, D., Eaton, B., Singer, B.,Gold, L. (2008) Proteomics and diagnostics: Let's Get Specific, again. Curr Opin Chem Biol, 12 (1), World Wide Web ( ): Human_Genome/project/info.shtml 59. Wilkins, M.R. (2007). Proteome research : concepts, technology and application (2nd bs.). Berlin ; New York: Springer. 60. Edman, P. (1949) A Method for the Determination of the Amino Acid Sequence in Peptides. Archives of Biochemistry, 22 (3), Guillonneau, F., Guieysse, A.L., Le Caer, J.P., Rossier, J., Praseuth, D. (2001) Selection and identification of proteins bound to DNA triple-helical structures by combination of 2D-electrophoresis and MALDI-TOF mass spectrometry. Nucleic Acids Research, 29 (11), Macarthur, M.W., Thornton, J.M. (1993) Conformation Analysis of Protein Structures Derived from Nmr Data. Proteins-Structure Function and Genetics, 17 (3), Ratnaparkhi, G.S., Ramachandran, S., Udgaonkar, J.B.,Varadarajan, R. (1998) Discrepancies between the NMR and X-ray structures of uncomplexed barstar: Analysis suggests that packing densities of protein structures determined by NMR are unreliable. Biochemistry, 37 (19), World Wide Web ( ): Expression_Proteomics_Overview.pdf. 65. Jung, J.W., Lee, W. (2004) Structure-based functional discovery of proteins: structural proteomics. J Biochem Mol Biol, 37 (1), Renfrey, S., Featherstone, J. (2002) Structural proteomics. Nat Rev Drug Discov, 1 (3), Monti, M., Orru, S., Pagnozzi, D.,Pucci, P. (2005) Functional proteomics. Clin Chim Acta, 357 (2), Bilikova, K., Mirgorodskaya, E., Bukovska, G., Gobom, J., Lehrach, H.,Simuth, J. (2009) Towards functional proteomics of minority component of honeybee royal jelly: the effect of post-translational modifications on the antimicrobial activity of apalbumin2. Proteomics, 9 (8), Ong, S.E., Pandey, A. (2001) An evaluation of the use of two-dimensional gel electrophoresis in proteomics. Biomolecular engineering, 18 (5),

208 Rabilloud, T. (2002) Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: old, old fashioned, but it still climbs up the mountains. Proteomics, 2 (1), Rabilloud, T., Chevallet, M., Luche, S., Lelong, C. (2010) Two-dimensional gel electrophoresis in proteomics: Past, present and future. Journal of proteomics, 73 (11), Wittmann-Liebold, B., Graack, H.R.,Pohl, T. (2006) Two-dimensional gel electrophoresis as tool for proteomics studies in combination with protein identification by mass spectrometry. Proteomics, 6 (17), Lifshitz, C. (2003) Basic aspects and principles of mass spectrometry applied to biomolecules. Mass spectrometry reviews, 22 (3), Biberoğlu, G. (2003) Kütle Spektrometresi ve Tıp Alanında Kullanımı. Türkiye Klinikleri Tıp Bilimleri Dergisi, 23, Skoog, D.A., Holler, F.J., Crouch, S.R., Skoog, D.A.P.o.i.a. (2007). Principles of instrumental analysis (6th ed. / Douglas A. Skoog, F. James Holler, Stanley R. Crouch. bs.). Pacific Grove, Calif.: Brooks/Cole ; London : Thomson Learning [distributor]. 76. Gross, J.H. (2004). Mass spectrometry : a textbook. Berlin ; London: Springer. 77. Korkmaz, A. (2006). Çoklu ilaç karışımlarında etken maddelerin kantitatif tayinleri için metod geliştirme. Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek Lisans Tezi, Sakarya Üniversitesi, Adapazarı. 78. World Wide Web ( ) (mass spectrometrycommon ionization) 79. Hoffmann, E.d., Stroobant, V. (2007). Mass spectrometry : principles and applications (3rd bs.). Chichester, West Sussex, England ; Hoboken, NJ: J. Wiley. 80. World Wide Web ( ) tutorials/tools/ionization_maldi.html 81. World Wide Web ( ): Gault, V., McClenaghan, N. (2009). Understanding Bioanalytical Chemistry: Principles and Applications: John Wiley High Education 83. O'Farrell, P.H. (1975) High resolution two-dimensional electrophoresis of proteins. The Journal of biological chemistry, 250 (10), Klose, J. (1975) Protein mapping by combined isoelectric focusing and electrophoresis of mouse tissues. A novel approach to testing for induced point mutations in mammals. Humangenetik, 26 (3), Klein, E., Klein, J.B., Thongboonkerd, V. (2004) Two-dimensional gel electrophoresis: a fundamental tool for expression proteomics studies. Contributions to nephrology, 141, Telefoncu, A., Salnikow, J., Zihnioğlu, F.,Kılınç, A. (2002). Proteom Analizi Metodlar ve Uygulamalar. İzmir, Türkiye: Ege Üniversitesi Matbaası.

209 Gorg, A., Postel, W., Gunther, S. (1988) The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized ph gradients. Electrophoresis, 9 (9), Gorg, A., Obermaier, C., Boguth, G., Harder, A., Scheibe, B., Wildgruber, R. ve diğerleri. (2000) The current state of two-dimensional electrophoresis with immobilized ph gradients. Electrophoresis, 21 (6), World Wide Web ( ): option=content&task=view&id= World Wide Web ( ): Cell_Disruption_by_Homogenization_3006_01_06_2008_US.pdf 91. World Wide Web ( ): content/free/protocols_1/pro03.html 92. Gorg, A., Boguth, G., Obermaier, C., Posch, A.,Weiss, W. (1995) Twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis with immobilized ph gradients in the first dimension (IPG-Dalt): the state of the art and the controversy of vertical versus horizontal systems. Electrophoresis, 16 (7), Westermeier, R.,Naven, T. (2002). Proteomics in practice : a laboratory manual of proteome analysis. Weinheim: Wiley-VCH. 94. Damerval, C., Devienne, D., Zivy, M.,Thiellement, H. (1986) Technical Improvements in Two-Dimensional Electrophoresis Increase the Level of Genetic-Variation Detected in Wheat-Seedling Proteins. Electrophoresis, 7 (1), Gorg, A. (1997) Two-dimensional electrophoresis with immobilized ph gradients. Current state. Faseb Journal, 11 (9), A1131-A Herbert, B.R., Molloy, M.P., Gooley, A.A., Walsh, B.J., Bryson, W.G.,Williams, K.L. (1998) Improved protein solubility in two-dimensional electrophoresis using tributyl phosphine as reducing agent. Electrophoresis, 19 (5), Herbert, B., Galvani, M., Hamdan, M., Olivieri, E., MacCarthy, J., Pedersen, S. ve diğerleri. (2001) Reduction and alkylation of proteins in preparation of two-dimensional map analysis: why, when, and how? Electrophoresis, 22 (10), Righetti, P.G. (1990) Recent developments in electrophoretic methods. Journal of chromatography, 516 (1), Altland, K. (1990) IPGMAKER: a program for IBM-compatible personal computers to create and test recipes for immobilized ph gradients. Electrophoresis, 11 (2), Taylor, R.C.,Coorssen, J.R. (2006) Proteome resolution by two-dimensional gel electrophoresis varies with the commercial source of IPG strips. Journal of proteome research, 5 (11),

210 Gorg, A., Postel, W., Friedrich, C., Kuick, R., Strahler, J.R.,Hanash, S.M. (1991) Temperature-dependent spot positional variability in two-dimensional polypeptide patterns. Electrophoresis, 12 (9), Neuhoff, V., Arold, N., Taube, D.,Ehrhardt, W. (1988) Improved staining of proteins in polyacrylamide gels including isoelectric focusing gels with clear background at nanogram sensitivity using Coomassie Brilliant Blue G-250 and R-250. Electrophoresis, 9 (6), Rabilloud, T., Brodard, V., Peltre, G., Righetti, P.G.,Ettori, C. (1992) Modified silver staining for immobilized ph gradients. Electrophoresis, 13 (4), Rabilloud, T. (1992) A comparison between low background silver diammine and silver nitrate protein stains. Electrophoresis, 13 (7), Malone, J.P., Radabaugh, M.R., Leimgruber, R.M.,Gerstenecker, G.S. (2001) Practical aspects of fluorescent staining for proteomic applications. Electrophoresis, 22 (5), Cong, W.T., Hwang, S.Y., Jin, L.T., Choi, J.K. (2008) Sensitive fluorescent staining for proteomic analysis of proteins in 1-D and 2-D SDS-PAGE and its comparison with SYPRO Ruby by PMF. Electrophoresis, 29 (21), Bradford, M.M. (1976) A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical biochemistry, 72, Lopez, M.F., Berggren, K., Chernokalskaya, E., Lazarev, A., Robinson, M., Patton, W.F. (2000) A comparison of silver stain and SYPRO Ruby Protein Gel Stain with respect to protein detection in two-dimensional gels and identification by peptide mass profiling. Electrophoresis, 21 (17), Lanne, B.,Panfilov, O. (2005) Protein staining influences the quality of mass spectra obtained by peptide mass fingerprinting after separation on 2-d gels. A comparison of staining with coomassie brilliant blue and sypro ruby. Journal of proteome research, 4 (1), Ren, G., Okerberg, C.K., Mathews, S.T. (2012) Ultrasensitive protein detection and imaging: comparison of Lumitein, ProteoSilver, SYPRO((R)) Ruby, and Coomassie ((R)) Brilliant Blue gel stains. Methods in molecular biology, 869, Guan, L.W. World Wide Web ( ) images/8/8e/expression_proteomics_overview.pdf 112. Lemkin, P., Merril, C., Lipkin, L., Van Keuren, M., Oertel, W., Shapiro, B. ve diğerleri. (1979) Software aids for the analysis of 2D gel electrophoresis images. Computers and biomedical research, an international journal, 12 (6),

211 Vickerman, M.B., Keith, P.A., McKay, T.L., Gedeon, D.J., Watanabe, M., Montano, M. ve diğerleri. (2009) VESGEN 2D: automated, user-interactive software for quantification and mapping of angiogenic and lymphangiogenic trees and networks. Anatomical record, 292 (3), Li, F., Seillier-Moiseiwitsch, F. (2011) RegStatGel: proteomic software for identifying differentially expressed proteins based on 2D gel images. Bioinformation, 6 (10), Li, J., Liu, S., Osterman, T., Zhang, Y., Coppage, H., Pedrick, N. ve diğerleri. (2004) A software utility for creating interactive maps for 2D gel-based proteomics. Analytical biochemistry, 332 (1), World Wide Web ( ) Scientist Magazine: Staudenmann, W., Hatt, P.D., Hoving, S., Lehmann, A., Kertesz, M.,James, P. (1998) Sample handling for proteome analysis. Electrophoresis, 19 (6), Matthiesen, R. (2007). Mass spectrometry data analysis in proteomics. Totowa, N.J.: Humana ; Arkholme : Quantum [distributor] Vekey, K.R., Telekes, A.S.,Vertes, A. (2008). Medical applications of mass spectrometry. Amsterdam ; London: Elsevier Roepstorff, P., Fohlman, J. (1984) Proposal for a common nomenclature for sequence ions in mass spectra of peptides. Biomed Mass Spectrom, 11 (11), Biemann, K. (1988) Contributions of mass spectrometry to peptide and protein structure. Biomed Environ Mass Spectrom, 16 (1-12), World Wide Web ( ): b_and_y.htm 123. Keller, A., Shteynberg, D. (2011) Software pipeline and data analysis for MS/ MS proteomics: the trans-proteomic pipeline. Methods Mol Biol, 694, Kessner, D., Chambers, M., Burke, R., Agus, D.,Mallick, P. (2008) ProteoWizard: open source software for rapid proteomics tools development. Bioinformatics, 24 (21), Kang, Y., Techanukul, T., Mantalaris, A.,Nagy, J.M. (2009) Comparison of three commercially available DIGE analysis software packages: minimal user intervention in gel-based proteomics. J Proteome Res, 8 (2), Vizcaino, J.A., Cote, R., Reisinger, F., Barsnes, H., Foster, J.M., Rameseder, J. ve diğerleri. (2010) The Proteomics Identifications database: 2010 update. Nucleic Acids Res, 38 (Database issue), D Keller, A., Purvine, S., Nesvizhskii, A.I., Stolyar, S., Goodlett, D.R.,Kolker, E. (2002) Experimental protein mixture for validating tandem mass spectral analysis. Omics : a journal of integrative biology, 6 (2),

212 McDonald, W.H., Yates, J.R., 3rd. (2003) Shotgun proteomics: integrating technologies to answer biological questions. Curr Opin Mol Ther, 5 (3), Matallana-Surget, S., Leroy, B., Wattiez, R. (2010) Shotgun proteomics: concept, key points and data mining. Expert Rev Proteomics, 7 (1), Cottingham, K. (2007) A new top-down proteomics workflow. J Proteome Res, 6 (1), Armirotti, A.,Damonte, G. (2010) Achievements and perspectives of topdown proteomics. Proteomics, 10 (20), Bren, L. (2005) Metabolomics: working toward personalized medicine. FDA consumer, 39 (6), Villas-Bôas, S.G. (2007). Metabolome analysis : an introduction. Hoboken, N.J.: Wiley ; Chichester : John Wiley [distributor] Klein, N.W. (1996) Folic acid and prevention of spina bifida. JAMA : the journal of the American Medical Association, 275 (21), Asiago, V.M., Alvarado, L.Z., Shanaiah, N., Gowda, G.A., Owusu-Sarfo, K., Ballas, R.A. ve diğerleri. (2010) Early detection of recurrent breast cancer using metabolite profiling. Cancer research, 70 (21), Villas-Bôas, S.G., Roessner, U., Hansen, M.A.E., Smedsgaard, J.,Nielsen, J. (2007). Metabolome Analysis: An Introduction. USA: John Wiley & Sons, Inc Griffiths, W.J., Karu, K., Hornshaw, M., Woffendin, G.,Wang, Y. (2007) Metabolomics and metabolite profiling: past heroes and future developments. European journal of mass spectrometry, 13 (1), Theodoridis, G.A., Gika, H.G., Want, E.J.,Wilson, I.D. (2012) Liquid chromatography-mass spectrometry based global metabolite profiling: a review. Analytica chimica acta, 711, Nielsen, J.,Oliver, S. (2005) The next wave in metabolome analysis. Trends in biotechnology, 23 (11), Scholz, M., Gatzek, S., Sterling, A., Fiehn, O.,Selbig, J. (2004) Metabolite fingerprinting: detecting biological features by independent component analysis. Bioinformatics, 20 (15), Fernie, A.R., Trethewey, R.N., Krotzky, A.J.,Willmitzer, L. (2004) Innovation - Metabolite profiling: from diagnostics to systems biology. Nature Reviews Molecular Cell Biology, 5 (9), Kell, D.B., Brown, M., Davey, H.M., Dunn, W.B., Spasic, I.,Oliver, S.G. (2005) Metabolic footprinting and systems biology: The medium is the message. Nature Reviews Microbiology, 3 (7),

213 Allen, J., Davey, H.M., Broadhurst, D., Heald, J.K., Rowland, J.J., Oliver, S.G. ve diğerleri. (2003) High-throughput classification of yeast mutants for functional genomics using metabolic footprinting. Nature Biotechnology, 21 (6), Schauer, N., Steinhauser, D., Strelkov, S., Schomburg, D., Allison, G., Moritz, T. ve diğerleri. (2005) GC-MS libraries for the rapid identification of metabolites in complex biological samples. FEBS letters, 579 (6), Garcia, A.,Barbas, C. (2011) Gas chromatography-mass spectrometry (GC- MS)-based metabolomics. Methods in molecular biology, 708, Bajad, S., Shulaev, V. (2011) LC-MS-based metabolomics. Methods in molecular biology, 708, Gika, H.,Theodoridis, G. (2011) Sample preparation prior to the LC-MSbased metabolomics/metabonomics of blood-derived samples. Bioanalysis, 3 (14), Zhou, B., Xiao, J.F., Tuli, L., Ressom, H.W. (2012) LC-MS-based metabolomics. Molecular biosystems, 8 (2), Soga, T., Ohashi, Y., Ueno, Y., Naraoka, H., Tomita, M., Nishioka, T. (2003) Quantitative metabolome analysis using capillary electrophoresis mass spectrometry. Journal of proteome research, 2 (5), Monton, M.R.,Soga, T. (2007) Metabolome analysis by capillary electrophoresis-mass spectrometry. Journal of chromatography. A, 1168 (1-2), ; discussion Ramautar, R., Mayboroda, O.A., Somsen, G.W., de Jong, G.J. (2011) CE-MS for metabolomics: Developments and applications in the period Electrophoresis, 32 (1), Lei, Z., Huhman, D.V., Sumner, L.W. (2011) Mass spectrometry strategies in metabolomics. The Journal of biological chemistry, 286 (29), Han, J., Danell, R.M., Patel, J.R., Gumerov, D.R., Scarlett, C.O., Speir, J.P. ve diğerleri. (2008) Towards high-throughput metabolomics using ultrahighfield Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Metabolomics : Official journal of the Metabolomic Society, 4 (2), Takahashi, H., Kai, K., Shinbo, Y., Tanaka, K., Ohta, D., Oshima, T. ve diğerleri. (2008) Metabolomics approach for determining growth-specific metabolites based on Fourier transform ion cyclotron resonance mass spectrometry. Analytical and bioanalytical chemistry, 391 (8), Wang, J.N., Zhou, Y., Zhu, T.Y., Wang, X., Guo, Y.L. (2008) Prediction of acute cellular renal allograft rejection by urinary metabolomics using MALDI-FTMS. Journal of proteome research, 7 (8), Lucio, M., Fekete, A., Weigert, C., Wagele, B., Zhao, X., Chen, J. ve diğerleri. (2010) Insulin sensitivity is reflected by characteristic metabolic fingerprints--a Fourier transform mass spectrometric non-targeted metabolomics approach. PLoS One, 5 (10), e13317.

214 Beltran, A., Suarez, M., Rodriguez, M.A., Vinaixa, M., Samino, S., Arola, L. ve diğerleri. (2012) Assessment of compatibility between extraction methods for NMR- and LC/MS-based metabolomics. Analytical chemistry, 84 (14), Griffin, J.L. (2003) Metabonomics: NMR spectroscopy and pattern recognition analysis of body fluids and tissues for characterisation of xenobiotic toxicity and disease diagnosis. Current opinion in chemical biology, 7 (5), Beckonert, O., Keun, H.C., Ebbels, T.M., Bundy, J., Holmes, E., Lindon, J.C. ve diğerleri. (2007) Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma, serum and tissue extracts. Nature protocols, 2 (11), Affolter, M., Bergonzelli, G.E., Blaser, K., Blum-Sperisen, S., Corthesy, B., Fay, L.B. ve diğerleri. (2006) -Omics for prevention: gene, protein and metabolite profiling to better understand individual disposition to disease. Nestle Nutrition workshop series. Paediatric programme, 57, ; discussion Çelebier, M., Altınöz, S. (2013) Metabolomik Çalışmalarda Yazılım ve Veribankası Desteği: LC-MS Verilerinin Değerlendirilmesinde XCMS Kullanımı. Türk Hijyen ve Deneysel Biyoloji Dergisi, (gönderildi) Tsoka, S.,Ouzounis, C.A. (2003) Metabolic database systems for the analysis of genome-wide function. Biotechnology and bioengineering, 84 (7), Dudley, E., Yousef, M., Wang, Y., Griffiths, W.J. (2010) Targeted metabolomics and mass spectrometry. Advances in protein chemistry and structural biology, 80, Koal, T.,Deigner, H.P. (2010) Challenges in mass spectrometry based targeted metabolomics. Current molecular medicine, 10 (2), Hagiwara, T., Saito, S., Ujiie, Y., Imai, K., Kakuta, M., Kadota, K. ve diğerleri. (2010) HPLC Retention time prediction for metabolome analysis. Bioinformation, 5 (6), Tautenhahn, R., Bottcher, C.,Neumann, S. (2008) Highly sensitive feature detection for high resolution LC/MS. BMC Bioinformatics, 9, World Wide Web ( ) Smith, C.A., Want, E.J., O'Maille, G., Abagyan, R., Siuzdak, G. (2006) XCMS: Processing mass spectrometry data for metabolite profiling using Nonlinear peak alignment, matching, and identification. Analytical Chemistry, 78 (3), Nordstrom, A., O'Maille, G., Qin, C., Siuzdak, G. (2006) Nonlinear data alignment for UPLC-MS and HPLC-MS based metabolomics: Quantitative analysis of endogenous and exogenous metabolites in human serum. Analytical Chemistry, 78 (10),

215 Tautenhahn, R., Patti, G.J., Rinehart, D., Siuzdak, G. (2012) XCMS Online: a web-based platform to process untargeted metabolomic data. Analytical chemistry, 84 (11), Nevedomskaya, E., Derks, R., Deelder, A.M., Mayboroda, O.A., Palmblad, M. (2009) Alignment of capillary electrophoresis-mass spectrometry datasets using accurate mass information. Analytical and bioanalytical chemistry, 395 (8), Schilling, C.H., Schuster, S., Palsson, B.O., Heinrich, R. (1999) Metabolic pathway analysis: basic concepts and scientific applications in the postgenomic era. Biotechnology progress, 15 (3), Klamt, S., Stelling, J. (2003) Two approaches for metabolic pathway analysis? Trends in biotechnology, 21 (2), Tanabe, M., Kanehisa, M. (2012) Using the KEGG database resource. Current protocols in bioinformatics / editoral board, Andreas D. Baxevanis [et al.], Chapter 1, Unit Freshney, R.I. (1994). Culture of animal cells : a manual of basic technique (3rd ed. bs.). New York ; Chichester: Wiley-Liss Eagle, H. (1955) Nutrition needs of mammalian cells in tissue culture. Science, 122 (3168), Mather, J.P.,Roberts, P.E. (1998). Introduction to cell and tissue culture : theory and technique. New York ; London: Plenum Press Rosenfeld, M.A., Yoshimura, K., Trapnell, B.C., Yoneyama, K., Rosenthal, E.R., Dalemans, W. ve diğerleri. (1992) In vivo transfer of the human cystic fibrosis transmembrane conductance regulator gene to the airway epithelium. Cell, 68 (1), Herrero, M., Plaza, M., Cifuentes, A., Ibanez, E. (2010) Green processes for the extraction of bioactives from Rosemary: Chemical and functional characterization via ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry and in-vitro assays. Journal of chromatography. A, 1217 (16), Ibanez, C., Valdes, A., Garcia-Canas, V., Simo, C., Çelebier, M., Rocamora- Reverte, L. ve diğerleri. (2012) Global Foodomics strategy to investigate the health benefits of dietary constituents. Journal of chromatography. A, 1248, Çelebier, M., Simó, C., Altınöz, S., Cifuentes, A. (2013) Comparative Proteomics to Investigate the Chemopreventive Effect of Dietary Polyphenols Against K562 Leukemia Cells Proliferation. Turkish Journal of Biochemistry (gönderildi) Çelebier, M., Ibanez, C., Simo, C., Cifuentes, A. (2012) A Foodomics approach: CE-MS for comparative metabolomics of colon cancer cells treated with dietary polyphenols. Methods in molecular biology, 869,

216 Altınöz, S., Çelebier, M. (2011) Some Applications of XCMS on Metabolite Profiling. First International Conference on New Trends in Chemometrics and Applications (Antalya, Eylül 8-11), Poster-21, Lowry, O.H., Rosebrough, N.J., Farr, A.L., Randall, R.J. (1951) Protein measurement with the Folin phenol reagent. The Journal of biological chemistry, 193 (1), Reisner, A.H., Nemes, P.,Bucholtz, C. (1975) The use of Coomassie Brilliant Blue G250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels. Analytical biochemistry, 64 (2), Compton, S.J., Jones, C.G. (1985) Mechanism of dye response and interference in the Bradford protein assay. Analytical biochemistry, 151 (2), Smith, R.D., Barinaga, C.J., Udseth, H.R. (1988) Improved Electrospray Ionization Interface for Capillary Zone Electrophoresis - Mass-Spectrometry. Analytical Chemistry, 60 (18), Alonso, A., Julia, A., Beltran, A., Vinaixa, M., Diaz, M., Ibanez, L. ve diğerleri. (2011) AStream: an R package for annotating LC/MS metabolomic data. Bioinformatics, 27 (9), Hodge, J.W., Ardiani, A., Farsaci, B., Kwilas, A.R., Gameiro, S.R. (2012) The tipping point for combination therapy: cancer vaccines with radiation, chemotherapy, or targeted small molecule inhibitors. Seminars in oncology, 39 (3), Wenger, J.B., Chun, S.Y., Dang, D.T., Luesch, H., Dang, L.H. (2011) Combination therapy targeting cancer metabolism. Medical hypotheses, 76 (2), Aggarwal, B.B., Shishodia, S. (2006) Molecular targets of dietary agents for prevention and therapy of cancer. Biochemical pharmacology, 71 (10), Viuda-Martos, M., Navajas, Y.R., Zapata, E.S., Fernandez-Lopez, J., Perez- Alvarez, J.A. (2010) Antioxidant activity of essential oils of five spice plants widely used in a Mediterranean diet. Flavour and Fragrance Journal, 25 (1), Güner, A., Özhatay, N., Ekim, T., Başer, K.H.C. (2000). Flora of Turkey and the East Aegean Islands. Vol. 11, Suppl.2. Edinburgh: Edinburgh University Press Baytop, T. (1994). Türkçe Bitki Adları Sözlüğü. Ankara: Türk dil kurumu Baytop, T. (1999). Türkiye de Bitkilerle Tedavi: Geçmişte ve Bugün. İstanbul: Nobel Tıp Kitabevleri Demirezer, L.Ö. (2007). Tedavide Kullanılan Bitkiler FFD Monografları. Ankara: MN Medikal / Nobel Basım Yayın.

217 Peng, C.H., Su, J.D., Chyau, C.C., Sung, T.Y., Ho, S.S., Peng, C.C. ve diğerleri. (2007) Supercritical fluid extracts of rosemary leaves exhibit potent anti-inflammation and anti-tumor effects. Bioscience, biotechnology, and biochemistry, 71 (9), Ngo, S.N., Williams, D.B.,Head, R.J. (2011) Rosemary and cancer prevention: preclinical perspectives. Critical reviews in food science and nutrition, 51 (10), Yesil-Celiktas, O., Sevimli, C., Bedir, E., Vardar-Sukan, F. (2010) Inhibitory effects of rosemary extracts, carnosic acid and rosmarinic acid on the growth of various human cancer cell lines. Plant foods for human nutrition, 65 (2), Johnson, J.J., Syed, D.N., Heren, C.R., Suh, Y., Adhami, V.M., Mukhtar, H. (2008) Carnosol, a dietary diterpene, displays growth inhibitory effects in human prostate cancer PC3 cells leading to G2-phase cell cycle arrest and targets the 5'-AMP-activated protein kinase (AMPK) pathway. Pharmaceutical research, 25 (9), Johnson, J.J., Syed, D.N., Suh, Y., Heren, C.R., Saleem, M., Siddiqui, I.A. ve diğerleri. (2010) Disruption of androgen and estrogen receptor activity in prostate cancer by a novel dietary diterpene carnosol: implications for chemoprevention. Cancer prevention research, 3 (9), Johnson, J.J. (2011) Carnosol: a promising anti-cancer and anti-inflammatory agent. Cancer letters, 305 (1), Tai, J., Cheung, S., Wu, M., Hasman, D. (2012) Antiproliferation effect of Rosemary (Rosmarinus officinalis) on human ovarian cancer cells in vitro. Phytomedicine : international journal of phytotherapy and phytopharmacology, 19 (5), Einbond, L.S., Wu, H.A., Kashiwazaki, R., He, K., Roller, M., Su, T. ve diğerleri. (2012) Carnosic acid inhibits the growth of ER-negative human breast cancer cells and synergizes with curcumin. Fitoterapia, 83 (7), Barni, M.V., Carlini, M.J., Cafferata, E.G., Puricelli, L., Moreno, S. (2012) Carnosic acid inhibits the proliferation and migration capacity of human colorectal cancer cells. Oncology reports, 27 (4), Castro-Puyana, M., Garcia-Canas, V., Simo, C., Cifuentes, A. (2012) Recent advances in the application of capillary electromigration methods for food analysis and Foodomics. Electrophoresis, 33 (1), Garcia-Canas, V., Simo, C., Herrero, M., Ibanez, E., Cifuentes, A. (2012) Present and future challenges in food analysis: foodomics. Analytical chemistry, 84 (23), Öncel, M. (2012) Heat Shock Proteins and Cancer. European Journal of Basic Medical Sciences 2(1),

218 Hanahan, D., Weinberg, R.A. (2000) The hallmarks of cancer. Cell, 100 (1), Hanahan, D., Weinberg, R.A. (2011) Hallmarks of cancer: the next generation. Cell, 144 (5), Ulukaya, E. (2006). Akciğer Kanserleri: Tanı ve Tedavide Temel İlkeler ve Uygulamalar (c. Bölüm 3). Bursa: Avrupa Tıp Kitapçılık Ritossa, F. (1996) Discovery of the heat shock response. Cell stress & chaperones, 1 (2), De Maio, A., Santoro, M.G., Tanguay, R.M., Hightower, L.E. (2012) Ferruccio Ritossa's scientific legacy 50 years after his discovery of the heat shock response: a new view of biology, a new society, and a new journal. Cell stress & chaperones, 17 (2), Calderwood, S.K., Khaleque, M.A., Sawyer, D.B., Ciocca, D.R. (2006) Heat shock proteins in cancer: chaperones of tumorigenesis. Trends in biochemical sciences, 31 (3), Nahleh, Z., Tfayli, A., Najm, A., El Sayed, A., Nahle, Z. (2012) Heat shock proteins in cancer: targeting the 'chaperones'. Future medicinal chemistry, 4 (7), Lee, S.C., Chan, J. (2012) Proteomic identification of chaperonin-containing tail-less complex polypeptide-1 gamma subunit as a p53-responsive protein in colon cancer cells. Cancer genomics & proteomics, 9 (2), Beere, H.M. (2004) "The stress of dying": the role of heat shock proteins in the regulation of apoptosis. Journal of cell science, 117 (Pt 13), Khaleque, M.A., Bharti, A., Sawyer, D., Gong, J., Benjamin, I.J., Stevenson, M.A. ve diğerleri. (2005) Induction of heat shock proteins by heregulin beta1 leads to protection from apoptosis and anchorage-independent growth. Oncogene, 24 (43), Kaur, J., Ralhan, R. (2000) Induction of apoptosis by abrogation of HSP70 expression in human oral cancer cells. International journal of cancer. Journal international du cancer, 85 (1), Yaglom, J.A., Gabai, V.L., Sherman, M.Y. (2007) High levels of heat shock protein Hsp72 in cancer cells suppress default senescence pathways. Cancer research, 67 (5), Paul, C., Manero, F., Gonin, S., Kretz-Remy, C., Virot, S., Arrigo, A.P. (2002) Hsp27 as a negative regulator of cytochrome C release. Molecular and cellular biology, 22 (3), Pandey, P., Farber, R., Nakazawa, A., Kumar, S., Bharti, A., Nalin, C. ve diğerleri. (2000) Hsp27 functions as a negative regulator of cytochrome c- dependent activation of procaspase-3. Oncogene, 19 (16), Eustace, B.K., Jay, D.G. (2004) Extracellular roles for the molecular chaperone, hsp90. Cell cycle, 3 (9),

219 Rossi, M.R., Somji, S., Garrett, S.H., Sens, M.A., Nath, J.,Sens, D.A. (2002) Expression of hsp 27, hsp 60, hsc 70, and hsp 70 stress response genes in cultured human urothelial cells (UROtsa) exposed to lethal and sublethal concentrations of sodium arsenite. Environmental health perspectives, 110 (12), Kammenga, J.E., Arts, M.S.J., Oude-Breuil, W.J.M. (1998) HSP60 as a potential biomarker of toxic stress in the nematode plectus acuminatus. Archives of environmental contamination and toxicology, 34 (3), Urushibara, M., Kageyama, Y., Akashi, T., Otsuka, Y., Takizawa, T., Koike, M. ve diğerleri. (2007) HSP60 may predict good pathological response to neoadjuvant chemoradiotherapy in bladder cancer. Japanese journal of clinical oncology, 37 (1), Cappello, F., Conway de Macario, E., Marasa, L., Zummo, G., Macario, A.J. (2008) Hsp60 expression, new locations, functions and perspectives for cancer diagnosis and therapy. Cancer biology & therapy, 7 (6), Hitchings, G.H. (1983). Progress in Cancer Research and Theraphy (c. 28). New York: Raven Press Liden, M., Eriksson, U. (2006) Understanding retinol metabolism: structure and function of retinol dehydrogenases. The Journal of biological chemistry, 281 (19), Deng, S., Wang, J., Hou, L., Li, J., Chen, G., Jing, B. ve diğerleri. (2013) Annexin A1, A2, A4 and A5 play important roles in breast cancer, pancreatic cancer and laryngeal carcinoma, alone and/or synergistically. Oncology letters, 5 (1), Nair, S., Hande, M.P., Lim, L.H. (2010) Annexin-1 protects MCF7 breast cancer cells against heat-induced growth arrest and DNA damage. Cancer letters, 294 (1), Falini, B., Tiacci, E., Liso, A., Basso, K., Sabattini, E., Pacini, R. ve diğerleri. (2004) Simple diagnostic assay for hairy cell leukaemia by immunocytochemical detection of annexin A1 (ANXA1). Lancet, 363 (9424), Weston-Bell, N.J., Hendriks, D., Sugiyarto, G., Bos, N.A., Kluin-Nelemans, H.C., Forconi, F. ve diğerleri. (2013) Hairy cell leukemia cell lines expressing annexin A1 and displaying B-cell receptor signals characteristic of primary tumor cells lack the signature BRAF mutation to reveal unrepresentative origins. Leukemia : official journal of the Leukemia Society of America, Leukemia Research Fund, U.K, 27 (1), Zhou, J., Giannakakou, P. (2005) Targeting microtubules for cancer chemotherapy. Current medicinal chemistry. Anti-cancer agents, 5 (1), Cortes, J., Baselga, J. (2007) Targeting the microtubules in breast cancer beyond taxanes: the epothilones. The oncologist, 12 (3),

220 Pasquier, E., Kavallaris, M. (2008) Microtubules: a dynamic target in cancer therapy. IUBMB Life, 60 (3), McGrogan, B.T., Gilmartin, B., Carney, D.N., McCann, A. (2008) Taxanes, microtubules and chemoresistant breast cancer. Biochimica et biophysica acta, 1785 (2), Erdemoğlu, N., Şener, B. (2000) Taksan Sınıfı Bileşiklerin Antitümör Etkileri. Ankara Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Dergisi, 29 (1), Capasso, A. (2012) Vinorelbine in cancer therapy. Current drug targets, 13 (8), Sampey, J.R. (1964) Use of Alkaloids of Vinca Rosea in Acute Leukemia. Journal of the South Carolina Medical Association, 60, Rubin, C.I., Atweh, G.F. (2004) The role of stathmin in the regulation of the cell cycle. Journal of cellular biochemistry, 93 (2), Zheng, P., Liu, Y.X., Chen, L., Liu, X.H., Xiao, Z.Q., Zhao, L. ve diğerleri. (2010) Stathmin, a new target of PRL-3 identified by proteomic methods, plays a key role in progression and metastasis of colorectal cancer. Journal of proteome research, 9 (10), Grant, G.A., Xu, X.L., Hu, Z. (1999) The relationship between effector binding and inhibition of activity in D-3-phosphoglycerate dehydrogenase. Protein science : a publication of the Protein Society, 8 (11), Al-Dhaheri, M.H., Shah, Y.M., Basrur, V., Pind, S., Rowan, B.G. (2006) Identification of novel proteins induced by estradiol, 4-hydroxytamoxifen and acolbifene in T47D breast cancer cells. Steroids, 71 (11-12), Keppler, D., Sloane, B.F. (1996) Cathepsin B: multiple enzyme forms from a single gene and their relation to cancer. Enzyme & protein, 49 (1-3), Podgorski, I., Sloane, B.F. (2003) Cathepsin B and its role(s) in cancer progression. Biochemical Society symposium (70), Chan, A.T., Baba, Y., Shima, K., Nosho, K., Chung, D.C., Hung, K.E. ve diğerleri. (2010) Cathepsin B expression and survival in colon cancer: implications for molecular detection of neoplasia. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology, 19 (11), Rhee, S.G., Kang, S.W., Chang, T.S., Jeong, W., Kim, K. (2001) Peroxiredoxin, a novel family of peroxidases. IUBMB Life, 52 (1-2), Leydold, S.M., Seewald, M., Stratowa, C., Kaserer, K., Sommergruber, W., Kraut, N. ve diğerleri. (2011) Peroxireduxin-4 is Over-Expressed in Colon Cancer and its Down-Regulation Leads to Apoptosis. Cancer growth and metastasis, 4, 7-23.

221 Nathan, C.F., Arrick, B.A., Murray, H.W., DeSantis, N.M.,Cohn, Z.A. (1981) Tumor cell anti-oxidant defenses. Inhibition of the glutathione redox cycle enhances macrophage-mediated cytolysis. The Journal of experimental medicine, 153 (4), Szatrowski, T.P., Nathan, C.F. (1991) Production of large amounts of hydrogen peroxide by human tumor cells. Cancer research, 51 (3), Yamamoto, S., Tomita, Y., Hoshida, Y., Takiguchi, S., Fujiwara, Y., Yasuda, T. ve diğerleri. (2003) Expression level of valosin-containing protein is strongly associated with progression and prognosis of gastric carcinoma. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 21 (13), Carpenter, B., Mckay, M., Dundas, S.R., Lawrie, L.C., Telfer, C., Murray, G.I. (2006) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K is over expressed, aberrantly localised and is associated with poor prognosis in colorectal cancer. British journal of cancer, 95 (7), Barboro, P., Repaci, E., Rubagotti, A., Salvi, S., Boccardo, S., Spina, B. ve diğerleri. (2009) Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K: altered pattern of expression associated with diagnosis and prognosis of prostate cancer. British journal of cancer, 100 (10), Zhou, R.Y., Shanas, R., Nelson, M.A., Bhattacharyya, A., Shi, J.Q. (2010) Increased expression of the heterogeneous nuclear ribonucleoprotein K in pancreatic cancer and its association with the mutant p53. International Journal of Cancer, 126 (2), Faller, T., Engelhardt, H. (1999) How to achieve higher repeatability and reproducibility in capillary electrophoresis. Journal of chromatography. A, 853 (1-2), Mayer, B.X. (2001) How to increase precision in capillary electrophoresis. Journal of chromatography. A, 907 (1-2), Ramautar, R. (2010). Capillary electrophoresis-mass spectrometry for metabolic profiling of body fluids. Amsterdam Center for Drug Research and Netherlands Metabolomics Centre, Netherland Ramautar, R., van der Plas, A.A., Nevedomskaya, E., Derks, R.J., Somsen, G.W., de Jong, G.J. ve diğerleri. (2009) Explorative analysis of urine by capillary electrophoresis-mass spectrometry in chronic patients with complex regional pain syndrome. Journal of proteome research, 8 (12), Ramautar, R., Somsen, G.W.,de Jong, G.J. (2009) CE-MS in metabolomics. Electrophoresis, 30 (1), Das, P.M.,Singal, R. (2004) DNA methylation and cancer. Journal of clinical oncology : official journal of the American Society of Clinical Oncology, 22 (22),

222 Fukushige, S.,Horii, A. (2013) DNA methylation in cancer: a gene silencing mechanism and the clinical potential of its biomarkers. The Tohoku journal of experimental medicine, 229 (3), O'Brien, B.L., Hankewych, M., McCormick, D., Jacoby, R., Brasitus, T.A.,Halline, A.G. (1995) Urinary N1-acetylspermidine and N8- acetylspermidine excretion in normal humans and in patients with colorectal cancer. Digestive diseases and sciences, 40 (6), Fraga, M.F., Uriol, E., Borja Diego, L., Berdasco, M., Esteller, M., Canal, M.J. ve diğerleri. (2002) High-performance capillary electrophoretic method for the quantification of 5-methyl 2'-deoxycytidine in genomic DNA: application to plant, animal and human cancer tissues. Electrophoresis, 23 (11), Sandhu, J., Kaur, B., Armstrong, C., Talbot, C.J., Steward, W.P., Farmer, P.B. ve diğerleri. (2009) Determination of 5-methyl-2'-deoxycytidine in genomic DNA using high performance liquid chromatography-ultraviolet detection. Journal of chromatography. B, Analytical technologies in the biomedical and life sciences, 877 (20-21), ICH. (2005) Validation of analytical procedures: Text and Methodology Q2(R1). Harmonized Tripartite Guideline.

223 202 EKLER EK 1. XCMS ve AStream ile CE-MS verilerin işlenmesinde kullanılan script XCMS için yazılan script library(xcms) XCMS uygulama kütüphanesini R altında açmak için Filtering the peaks MatchFilter veya Wavelegth transform kullanarak pikleri filtrelemek için xset Seçilen numuneleri programa aktarmak için xset <- group(xset, sleep=.001) Pikleri gruplamak için Retention time correction Alıkonma/göç zamanlarını düzeltmek için xset2 <- group(xset2, bw=5, mzwid=0.025, minfrac=0.5) Alıkonma/göç zamanı düzeltmesinden sonra pikleri tekrar gruplamak için xset3 <- fillpeaks(xset2) İşlenmemiş pikleri bulmak için reporttab <- diffreport(xset3, "C", "T", "centwave", 10000, metlin = 0.005, h = 480, w = 640) Metabolit olduğu düşünülen piklere ait çıktılar almak için ve metabolit tabloları oluşturmak için m1, m2, m3, m4 ve w1, w2, w3, w4 parametreleri için Filtering peaks ve Retention time correction bölümünde yazılan kodlar aşağıda verilmiştir:

224 203 AStream ile ESI ürünlerinin bulunmasında kullanılan script source(" bioclite("biobase") bioclite("plotrix") bioclite("multtest") library(astream) input <- xcms.import(xset3) feat1 <- data.norm(input) names(feat1) dim(feat1$data) feat1$class[,1] feat1$feature.set[1:10,] feat1 <- isotope.search(feat1, mz.tol = 3e-3) feat1$isotopes[1:10,] res <- adduct.search(feat1) printresults("results.txt", feat1, res) AStream, XCMS için yazılan script içinde xset3 te tanımlanan pikler üzerinde çalışır. Dolayısıyla yeni olası metabolit pikleri bulamaz; ancak sadece XCMS ile tespit edilmiş piklerin göç zamanları ve m/z değerlerini karşılaştırarak bu pikler içinde izotop piki veya ESI ürünü piki olabilecekleri ortaya çıkarır ve yeni bir liste oluşturur.

225 204 EK 2. MALDI-TOF-MS SPEKTRUMLARI HT29 hücre hattı için kontrol grubunda yüksek miktarda ifade edilmiş proteinler-1 (Tübülin alfa-1b ve TCP-1 içeren şaperonin [Homo sapiens])

226 205 HT29 hücre hattı için kontrol grubunda yüksek miktarda ifade edilmiş proteinler-2 (Statmin [Homo sapiens]ve Chain A, Hgstp1-1[v104] in Gsh Konjuge (+)-Anti-Bpde ile oluşturduğu kristal yapı [Homo sapiens])

227 206 HT29 hücre hattı için kontrol grubunda yüksek miktarda ifade edilmiş proteinler-3 (Transisyonel endoplazmik retikulum ATPase [Homo sapiens] ve Chain K, Acetil-Sipa:siklosporin kompleksi)

228 207 HT29 hücre hattı için kontrol grubunda yüksek miktarda ifade edilmiş proteinler-4 (PDZ ve LIM domain protein 1 [Homo sapiens])

229 208 HT29 hücre hattı için kontrol grubunda düşük miktarda ifade edilmiş proteinler-1 (Katepsin B ve peroksiredoksin-4 [Homo sapiens])

230 209 HT29 hücre hattı için kontrol grubunda düşük miktarda ifade edilmiş proteinler-2 (heterogen nükleer ribonükleoprotein K [Homo sapiens] ve Chain B, Katepsin D nin temel ve inhibe edilmiş formlarının kristal yapısı)