HAMĐLELĐK GĐNGĐVĐTĐSĐNDE SUBGĐNGĐVAL PLAKTA PERĐODONTOPATOJEN OLAN VE OLMAYAN TÜRLERĐN VARLIĞININ KLĐNĐK PARAMETRELERLE ĐLĐŞKĐSĐNĐN ARAŞTIRILMASI

Transkript

1 TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ HAMĐLELĐK GĐNGĐVĐTĐSĐNDE SUBGĐNGĐVAL PLAKTA PERĐODONTOPATOJEN OLAN VE OLMAYAN TÜRLERĐN VARLIĞININ KLĐNĐK PARAMETRELERLE ĐLĐŞKĐSĐNĐN ARAŞTIRILMASI Esra ZOR PERĐODONTOLOJĐ ANABĐLĐM DALI DOKTORA TEZĐ DANIŞMAN Doç. Dr. Gülden EREŞ ANKARA

2 TÜRKĐYE CUMHURĐYETĐ ANKARA ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ HAMĐLELĐK GĐNGĐVĐTĐSĐNDE SUBGĐNGĐVAL PLAKTA PERĐODONTOPATOJEN OLAN VE OLMAYAN TÜRLERĐN VARLIĞININ KLĐNĐK PARAMETRELERLE ĐLĐŞKĐSĐNĐN ARAŞTIRILMASI Esra ZOR PERĐODONTOLOJĐ ANABĐLĐM DALI DOKTORA TEZĐ DANIŞMAN Doç. Dr. Gülden EREŞ ANKARA

3

4 ii ĐÇĐNDEKĐLER Kabul ve Onay Đçindekiler Önsöz Simgeler ve Kısaltmalar Şekiller Çizelgeler i ii v vii x xi 1.GĐRĐŞ Hamilelik Kadın cinsiyet hormonlarının periodontal dokular üzerine etkileri Hamilelikte bağ dokusu Hamilelik ile periodontal sağlık arasındaki ilişki Hamileliğin periodontal sağlık üzerine etkileri Periodontal enfeksiyonların hamilelik üzerine etkileri Hamilelikte subgingival florada mikrobiyal değişiklikler Hamilelikte mikrobiyal değişikliklere gingival cevap Hamilelik gingivitisi Hamilelik gingivitisinde klinik özellikler Hamilelik gingivitisinde histolojik özellikler Hamilelik gingivitisinin etiyolojisi ve patogenezi Bakteriler Aggregatibacter actinomycetemcomitans 23

5 iii Prevotella intermedia Prevotella nigrescens Campylobacter rectus Tannerella forsythia Treponema denticola Porphyromonas gingivalis Actinomyces viscosus Streptococcus sanguinis Periodontal hastalıklarda bakteriler Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Oluşum Mekanizması Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Temel Bileşenleri Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Đşleyişi Amplifikasyon Sonrası Đşlemler Amaç GEREÇ ve YÖNTEM Araştırmaya Dahil Edilen Bireylerin Tanımı Araştırmaya Katılan Kadınlara Ait Kişisel Bilgilerin Elde Edilmesi Klinik Ölçümler Subgingival plak örneklerinin toplanması Laboratuar Aşamaları Kaynatma Yöntemi ile DNA Extraksiyonu PCR da kullanılan primer dizinleri Polimeraz Zincir Reaksiyonu 57

6 iv PCR Reaksiyon Karışımının (Master miks) Hesaplanması ve Kullanılan Thermal Cycler Programları Jel Boyama ve Görüntüleme Đşlemleri Veri Analiz Yöntemleri BULGULAR Demografik Bulgular Klinik Bulgular Bakteriyolojik Değerlendirme Bulguları TARTIŞMA SONUÇ VE ÖNERĐLER 113 ÖZET 114 SUMMARY 116 KAYNAKLAR 118 EK 133 ÖZGEÇMĐŞ 134

7 v ÖNSÖZ Hamilelik sonrasında profesyonel bakım yapılmaması ve hastaların yeterli oral hijyen sağlamamaya devam etmeleri durumunda gingival hastalık periodontal dokulara ilerler ve periodontal dokularda oluşan geri dönüşümsüz değişikliklerin tedavisi daha zaman alıcı ve daha pahalıdır. Bu durum ülke ekonomisine yük getirmektedir. Bir başka ekonomik olumsuz etki de hamilelerde oluşan diğer sağlık problemleri gibi periodontal sağlığın da fetüsün sağlığını olumsuz etkileyip tedavi ihtiyaçlarını arttırmasıdır. Türk toplumunda yapılmış hamilelik esnasında oluşan periodontal hastalıklar ile ilgili mikrobiyolojik çalışma bulunmamaktadır. Yapılan çalışmalar daha çok Amerika ve Kuzey Avrupa toplumlarındaki durumu yansıtan çalışmalardır. Bulunduğumuz coğrafyada ve toplumumuzda hamilelik gingivitisinde subgingival plakta bulunan mikroorganizmalar ile ilgili arşiv oluşturması bakımından önemlidir. Bu çalışma ile toplumumuzda, seçmiş olduğumuz çalışma popülasyonundaki subgingival plakta periodontal bakterilerin saptanması sonucunda konu ile ilgili sonraki çalışmalar için arşiv oluşturulmuş olacak, ayrıca etkene yönelik tedavi geliştirme çalışmaları için de bir basamak oluşabilecektir. Bu çalışmanın gerçekleşmesinde değerli katkılarını ve yardımlarını esirgemeyen Prof. Dr. Hamit BOSTANCI ya, Prof. Dr. Yaşar AYKAÇ a güleryüzü ve samimiyetiyle bizlerle yakından ilgilenen Prof. Dr. Meral GÜNHAN a, Doktora öğrenciliğim süresince değerli bilgi ve deneyimlerinden her zaman yararlandığım, yetişmemde büyük emeği geçen değerli hocam Doç. Dr. Gülden EREŞ e ve Prof.Dr.Yeşim BOZKURT a, çalımanın ortaya çıkmasında hakkı ödenmeyecek katkıları ve emeği olan Sayın Prof. Dr. Mehmet AKAN, Yrd.Doç.Dr.Barış SAREYYÜPOĞLU ve Dr.S. Mıtchell HALLORAN a,

8 vi Đstatistik analizlerimizde bize yol gösteren ve değerli zamanlarını bizimle özveri ile paylaşan Gülhane Askeri Tıp Akademisi Halk Sağlığı Anabilim Dalı Öğretim Üyelerinden Doç.Tbp.Bnb.Cengizhan AÇIKEL e ve Doç.Tbp.Yb.Selim KILIÇ a, Klinik çalışmalarımda benden dostluklarını esirgemeyen Periodontoloji Anabilim Dalı araştırma görevlilerinden Dt. Canan ÖNDER GÜLEÇ, Dt. Şivge AKGÜN, Dt.Selda AYTAÇ ve Dt. Şükran KARAGÖZ e ve tüm klinik çalışanlarına, Beni yetiştiren, bugünlere gelmemde büyük emeği olan, maddi ve manevi her konuda yanımda olan, en zor günlerimizi beraber paylaştığımız aileme, Varlığını her zaman yanımda hissetiğim, yardımını ve sevgisini hiçbir zaman esirgemeyen biricik eşim Fatih ZOR a ve yorgun bir günün sonunda kucağıma aldığımda bütün sıkıntılarımı unuttuğum yaşam enerjim biricik oğlum Senih ime sonsuz teşekkürler

9 vii SĐMGELER VE KISALTMALAR BANA CD DNA dntp datp dctp dgtp dttp PCR PMNL RNA IL Benzoyl-DL-Arginine-Naphthylamide Periodontal cep derinliği Deoksiribonükleik Asit Deoksiribonükleozid Trifosfat Deoksiadenozin Trifosfat Deoksicitidin Trifosfat Deoksiguanozin Trifosfat Deoksitimidine Trifosfat Polimeraz Zincir Reaksiyonu Polimorfonükler Lökosit Ribonükleik Asit Đnterlökin PGE 2 Prostaglandin E 2 PAI-2 Plazminojen Aktivatör Đnhibitör Tip 2 TNF DDA NDA ED ND PMN Ig EBV Tümör Nekrozis Faktör Düşük Doğum Ağırlığı Normal Doğum Ağırlığı Erken Doğum Normal Doğum Polimorfonükleer Đmmünglobulin Epstein-Barr Virüs

10 viii CMV Mg MgCl UV EtBr TE bç Sitomegalovirüs Magnezyum Magnezyum klorür Ultraviole Etidyum bromür Tris HCL EDTA Baz çifti A. actinomycetemcomitans Aggregatibacter actinomycetemcomitans P. intermedia Prevotella intermedia P. nigrescens Prevotella nigrescens C. rectus Campylobacter rectus P. gingivalis Porphyromonas gingivalis T. denticola Treponema denticola T. forsythia Tannerella forsythia A. viscosus Actinomyces viscosus S. sanguinis Streptococcus sanguinis F. nucleatum Fusobacterium nucleatum P. micros Peptostreptococcus micros P. melaninogenica Prevotella melaninogenica Aa Pi Pn Cr Pg Aggregatibacter actinomycetemcomitans Prevotella intermedia Prevotella nigrescens Campylobacter rectus Porphyromonas gingivalis

11 ix Td Tf Av Ss FSH LH WHO GI PlI CD BOP CPITN NK LFA LPS AIDS EPK KAD TBE BsPA MsP MMP Treponema denticola Tannerella forsythia Actinomyces viscosus Streptococcus sanguinis Follikül Stimüle edici Hormon Lüteinize edici Hormon World Health Organization Gingival Đndeks Plak Đndeksi Cep Derinliği Sondalamada Kanama Community Index of Periodontal Treatment Necessity Doğal Öldürücü Lenfosit Fonksiyon ilişkili Antijen Lipopolisakkarit Acquired Immun Deficiency Syndrome Eğitim Planlama ve Koordinasyon Klinik Ataşman Düzeyi Tris- Borik asit- EDTA Boiling Stable Protein Major surface protein Matriks Metallo Proteinaz

12 x ŞEKĐLLER Şekil 1.1. PCR döngülerinin şematik görüntüsü 41 Şekil 1.2. PCR da sıcaklık döngüleri 44 Şekil Araştırma ve muayene formu 42

13 xi ÇĐZELGELER Çizelge 1.1. Periodontal hastalıkların farklı tiplerinde görülen mikroorganizmalar 22 Çizelge 2.1. PCR da kullanılan türe spesifik primerler 56 Çizelge 2.2. Çizelge 2.3. A. actinomycetemcomitans, P. nigrescens, P. intermedia bakterileri için master miks hazırlanması ve PCR koşulları 58 T. forsythia, C. rectus, P. gingivalis, T.denticola bakterileri için master miks hazırlanması ve PCR koşulları 58 Çizelge 2.4. A. viscosus için master miks hazırlanması ve PCR koşulları 59 Çizelge 2.5. S. sanguinis için master miks hazırlanması ve PCR koşulları 59 Çizelge 3.1. Araştırmaya katılan test ve kontrol gruplarının yaş ortalamaları ve sosyokültürel özellikleri 62 Çizelge 3.2. Çizelge 3.3. Çizelge 3.4. Çizelge 3.5. Çizelge 3.6. Çizelge 3.7. Test ve kontrol gruplarında oral hijyen alışkanlıklarının değerlendirilmesi 63 Test ve kontrol gruplarının periodontal durumları ile ilgili şikayetlerinin değerlendirilmesi 64 Araştırmaya katılan test ve kontrol gruplarında klinik periodontal parametrelerin karşılaştırılması 65 Araştırmaya katılan test ve kontrol gruplarında gingivitisli ve sağlıklı bölgelere ait klinik periodontal parametrelerin karşılaştırılması 65 Araştırmaya katılan test ve kontrol gruplarında plak örneği alınan gingivitisli ve sağlıklı bölgelerin periodontal parametrelerinin karşılaştırılması 66 Test grubunda gingivitisli ve sağlıklı bölgelerde bakteri bulunan bölgelerin yüzdeleri ve görülme sıklıkları 68

14 xii Çizelge Kontrol grubunda gingivitisli ve sağlıklı bölgelerde bakteri bulunan bölgelerin yüzdeleri ve görülme sıklıkları 69 Çizelge Test ve kontrol grupları arasında gingivitisli ve sağlıklı bölgeler açısından bakterilerin görülme sıklıklarının karşılaştırılması 70 Çizelge Test grubunda A. actinomycetemcomitans saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 71 Çizelge Kontrol grubunda A. actinomycetemcomitans saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 72 Çizelge Test grubunda P. intermedia saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 72 Çizelge Kontrol grubunda P. intermedia saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 73 Çizelge Test grubunda P. nigrescens saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 73 Çizelge Kontrol grubunda P. nigrescens saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 74 Çizelge Test grubunda C. rectus saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 74 Çizelge Kontrol grubunda C. rectus saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 75

15 xiii Çizelge Test grubunda P. gingivalis saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 76 Çizelge Kontrol grubunda P. gingivalis saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 76 Çizelge Test grubunda T. forsythia saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 77 Çizelge Kontrol grubunda T. forsythia saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 78 Çizelge Test grubunda T. denticola saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 78 Çizelge Kontrol grubunda T. denticola saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 79 Çizelge Test grubunda A. viscosus saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 79 Çizelge Kontrol grubunda A. viscosus saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 80 Çizelge Test grubunda S. sanguinis saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 81 Çizelge Kontrol grubunda S. sanguinis saptanan ve saptanmayan bölgelerin klinik periodontal parametreler açısından değerlendirilmesi 82

16 xiv Çizelge Test ve kontrol gruplarında A. actinomycetemcomitans saptanan bölgelerdeki klinik periodontal parametreler 82 Çizelge Test ve kontrol gruplarında P. intermedia saptanan bölgelerdeki klinik periodontal parametreler 83 Çizelge Test ve kontrol gruplarında P. nigrescens saptanan bölgelerdeki klinik periodontal parametreler 84 Çizelge Test ve kontrol gruplarında C. rectus saptanan bölgelerdeki klinik periodontal parametreler 85 Çizelge Test ve kontrol gruplarında P. gingivalis saptanan bölgelerdeki klinik periodontal parametreler 86 Çizelge Test ve kontrol gruplarında T. forsythia saptanan bölgelerdeki klinik periodontal parametreler 86 Çizelge Test ve kontrol gruplarında T. denticola saptanan bölgelerdeki klinik periodontal parametreler 87 Çizelge Test ve kontrol gruplarında A. viscosus saptanan bölgelerdeki klinik periodontal parametreler 88 Çizelge Test ve kontrol gruplarında S. sanguinis saptanan bölgelerdeki klinik periodontal parametreler 88 Çizelge Test grubunda A. actinomycetemcomitans varlığının düşük doğum ağırlığı ve erken doğum ile ilişkisinin araştırılması 89 Çizelge Test grubunda P. intermedia varlığının düşük doğum ağırlığı ve erken doğum ile ilişkisinin araştırılması 90 Çizelge Test grubunda sağlıklı bölgelerde P. intermedia yokluğunda diğer bakterilerin dağılımı ve BOP 91 Çizelge Test grubunda sağlıklı bölgelerde P. intermedia saptanan ve saptanmayan bölgelerin ED ile olan ilişkisi 92 Çizelge Test grubunda sağlıklı bölgelerde P. intermedia saptanan ve saptanmayan bölgelerin EBV ile olan ilişkisi 92

17 xv Çizelge Test ve kontrol gruplarında hem P. intermedia hem de EBV saptanan bölgelerin dağılımı 93 Çizelge Test grubunda P. nigrescens varlığının düşük doğum ağırlığı ve erken doğum ile ilişkisinin araştırılması 93 Çizelge Test grubunda C. rectus varlığının düşük doğum ağırlığı ve erken doğum ile ilişkisinin araştırılması 94 Çizelge Test grubunda P. gingivalis varlığının düşük doğum ağırlığı ve erken doğum ile ilişkisinin araştırılması 95 Çizelge Test grubunda T. forsythia varlığının düşük doğum ağırlığı ve erken doğum ile ilişkisinin araştırılması 95 Çizelge Test grubunda T. denticola varlığının düşük doğum ağırlığı ve erken doğum ile ilişkisinin araştırılmas 96 Çizelge Test grubunda A. viscosus varlığının düşük doğum ağırlığı ve erken doğum ile ilişkisinin araştırılması 96 Çizelge Test grubunda S. sanguinis varlığının düşük doğum ağırlığı ve erken doğum ile ilişkisinin araştırılması 97 Resim 3.1. A. actinomycetemcomitans, C. rectus, P. intermedia, A. viscosus, T. denticola, T. forsythia, P. gingivalis ve P. nigrescens pozitif ve negatif bireylerin jel görüntüsü 67 Resim 3.2. S. sanguinis pozitif ve negatif bireylerin jel görüntüsü 67

18 1 1. GĐRĐŞ Hamilelik kadınlar için her yönüyle özel bir fizyolojik durumdur. Hamilelikte fetüsün büyüme ve devamlılığının sağlanması için maternal sistemlerde anatomik, fizyolojik ve biyokimyasal değişiklikler görülür. Gerek plasenta gerekse annenin endokrin sistemi çok sayıda hormon salgılayarak bu değişikliklerin olmasını ve annenin doğuma hazırlanmasını sağlar. Bu hormonal değişikliklerin sadece uterus gibi üreme organlarında değil oral kavite de dahil olmak üzere tüm vücutta farklılıklar oluşmasına neden olduğu bilinmektedir Hamilelik Kadınlarda majör fizyolojik ve hormonal değişiklikler hamilelik döneminde olur. Anne vücudundaki tüm fonksiyonlar bu yeni duruma uyum gösterir. Her koşulda olduğu gibi hamilelikte de vücut fonksiyonlarının düzenlenmesinde etkili olan hormonların kontrolü beyinde bulunan hipotalamus endokrin bezinden olur. Hipotalamus; vücudun susuzluk, açlık, uyku düzeni, libido ve endokrin fonksiyonları gibi fonksiyonlarını düzenlemektedir. Hipotalamus Gonadotropin Releasing Hormon salgılayarak beyinde bulunan bir diğer bez olan hipofizin, gonadotropinleri yani Follikül Stimüle edici Hormon (FSH) ve az miktarda da Lüteinize edici Hormonları (LH) salgılamasına neden olur. Hipofizden salgılanan FSH ve LH kan dolaşımına katılır ve overdeki follikülün matürasyonuna neden olurlar. Matürasyon aşamasındaki follikülden östrojen salgılanır. Follikül yaklaşık 7. günden sonra çok daha fazla östrojen salgılamaya başlar, salgılanan östrojen endometriyumda hiperplazi ve kalınlaşmaya neden olur. Kandaki östrojen seviyesi belirli bir noktaya ulaştığında hipotalamo-hipofizer akstan LH salgılanır. LH seviyesindeki yükselme ile follikül çatlar ve ovum dışarı çıkar, bu olaya ovulasyon adı verilir. Ovulasyon;

19 2 menstrüel siklusun yaklaşık 14. gününde oluşur. Ovulasyon sonrasında follikül korpus luteum (sarı cisim) adını alır. Korpus luteum östrojen ve çok fazla miktarda progesteron salgılamaya başlar. Korpus luteumdan salgılanan yüksek miktardaki progesteron hamileliğin devamı için gereklidir. Progesteron endometriyal glandlardan mukus salgısını arttırarak endometriyumun mukus ile kaplanmasına neden olur. Fertilizasyon ve implantasyon oluşmazsa, endometriyumun spiral arterlerinin kan akımı ve yüzey epitelinin beslenmesi bozulur. Kan venöz göllenmeler oluşturur ve beslenmesi bozulan endometriyum menstrüasyon ile dışarı atılır. Menstrüasyon 4-8 gün arasında sürer ve sonrasında yeni bir siklus başlar. Fertilizasyon ve hamilelik oluşursa, ilk 4 ay içinde korpus luteum'a ihtiyaç vardır, bu zaman diliminde korpus luteum progesteron üretemezse uterusun uygun yapısı bozulur ve düşük meydana gelir. Dördüncü aydan sonra fetüs progesteron üretimine başlar. Hamileliğin başlaması ile korpus luteumdan östrojen ve progesteron salımı artan miktarlarda devam eder. Plasenta endokrin bir organ gibi gelişir ve östrojen ve progesteron salımına katkıda bulunur. Hamilelik esnasında plazma progesteron seviyesi 100 ng/ml seviyesine kadar ulaşabilir. Bu değer reprodüktif siklusun luteal fazı esnasındaki progesteron değerinin yaklaşık 10 katıdır. Östrojen seviyeleri de benzer olarak 30 katına kadar ulaşabilir. Bu hormonlardan östrojenin başlıca görevi, vücuttaki sekonder kadın cinsiyet karakteristiğini saptayan hücrelerin büyümesini ve proliferasyonunu sağlamaktır. Hamile olmayan kadınlarda östrojen, overlerden ve az miktarda da böbreküstü korteksinden salgılanır. Plazmada bulunan östrojenin; β-östrodiol, östron ve östrodiol olmak üzere 3 tipi vardır (Williams, 1999). Hamilelikte progesteron; uterusu hamileliğe, meme bezlerini ise laktasyona hazırlamaktadır. Hamilelik dışı dönemde overler, testisler, böbreküstü korteksi dahil tüm steroid yapıda hormon yapan bezlerden ve korpus luteumdan salgılanırken; hamilelik sırasında 7. ile 8. haftaya kadar korpus luteumdan ve sonra da hamileliğin sonuna kadar plasentadan salgılanmaktadır. Plasental progesteron, korpus luteumun hormon üretimine katkıda bulunmaya başlayınca, düzeyler daha hızlı yükselir. (Williams,1999).

20 Kadın Cinsiyet Hormonlarının Periodontal Dokular Üzerine Etkileri Hormonlar vücutta üreme, büyüme ve gelişim, iç çevrenin devamlılığının sağlanması (homeostasis), enerji üretimi, enerjinin kullanılması ve depolanması gibi fonksiyonları regüle eden spesifik moleküllerdir (Mariotti, 1994). Hormonal etkiler hemen hemen vücutta her tip dokuda fizyolojik ve patolojik değişikliklerin olmasına neden olur. Hormonlar kimyasal yapılarına göre steroidler, glikoproteinler, polipeptidler ve aminler olarak dört ana gruba ayrılırlar (Mascarehas, 2003). Steroid yapıdaki hormonların, karbonhidrat, protein ve yağ metabolizmasında oluşan metabolik olayların çoğunda güçlü etkileri görülür. Ayrıca bu hormonlar enflamatuar reaksiyonları baskılama yeteneğine sahiptirler (Zachariasen, 1989) ve bundan dolayı yara iyileşmesini inhibe ederler (Robinson, 1992). Steroid yapıda olan cinsiyet hormonlarının üreme fonksiyonlarını düzenlemelerinin yanı sıra sinir sistemi ve kardiyovasküler sistem üzerine etkileri mevcuttur, bu etkilerinin yanı sıra iskelet sistemi ve periodontal dokuları da içeren oral kavitenin bütünlüğünün sağlanmasında da etkilidirler (Lorenzo, 2003). Steroid yapıda olan androjen, östrojen ve progesteron gibi bazı cinsiyet hormonlarının reseptörlerinin periodontal dokularda bulunduğu, buna bağlı olarak sistemik endokrin değişikliklerin, periodontal patogenezde etkili olabildiği gösterilmiştir (Gornstein, 1999). Periodontal değişikliklerin cinsiyet hormon değişiklikleri ile ilişkisi Armitage (1999) tarafından yapılan periodontal hastalık sınıflandırmalarında belirtilmiştir. Bu sınıflandırmada hormonlarla ilgili olarak, puberte gingivitisi, menstrüel siklus gingivitisi ve gebelik gingivitisi kategorileri vardır. Kadın reprodüktif siklusu ve hamilelik esnasında dişetinde ortaya çıkan artmış enflamatuar cevap, cinsiyet steroid hormonların periodonsiyum hücreleri üzerine olan etkileri sonucu olabilir. Cinsiyet steroid hormonlarının doğrudan veya dolaylı olarak, dişetinde keratinosit ve fibroblastları da içeren hedef dokularda hücre proliferasyonu ve farklılaşmasını etkilediği gösterilmiştir (Mariotti, 1994). Hormonların bu hücreler üzerine olan etkileri hakkında iki teori mevcuttur. Birincisi, hormonların bakteri saldırısına karşı epitelyal bariyerin etkinliğini değiştirdiği, diğeri de kollajen idamesi ve tamiri üzerinde olumsuz etki gösterdiğidir (Mealey, 2003).

21 4 Cinsiyet steroid hormonlarının oral mukozada folat metabolizma oranında artışa sebep olduğu gösterilmiştir (Thomson, 1982; Pack, 1980). Folat, B grubu suda eriyen bir vitamindir ve vücutta özellikle DNA yapımında rol oynar. Bunun yanı sıra bazı amino asitlerin metabolizmasında da rol aldığı bilinmektedir. Folat doku idamesinde gerekli olduğu için, artmış metabolizma folat depolarını azaltır ve doku tamirini inhibe eder (Willerhausen, 1986). Cinsiyet steroid hormonları aynı zamanda dişetinde ekstrasellüler matriks üzerinde dinamik tarzda etki gösterirler ve bu etkiler belirgin hormonal dalgalanmalar olduğunda artabilir. Dişeti bağ dokusunda fibroblast proliferasyonu ve kollajen matürasyonu, hem östrojen hem de progesteron tarafından etkilenmektedir. Östrojenler kollajen turn-over hızını değiştirerek dişetindeki fibroblastların proliferasyonunu ve dişeti bağ dokusunun sentez ve matürasyonunu uyarmaktadır (Mariotti, 1991). Bunun aksini savunan Lundgren ve ark. ise dişetinde kollajen üretim paterni ve oranını değiştiren hormonun progesteron olduğunu göstermişlerdir (Lundgren, 1973). Günümüzde çok az bilgi olmasına rağmen, Nanba (1989), yaptığı in vitro çalışmada östrojen ve progesteronun, periodontal ligament kaynaklı fibroblastların metabolizması üzerine olan etkilerini ve kollajen sentezini inhibe ettiğini göstermiştir. Kadın cinsiyet hormonlarından östrojenin periodontal dokular üzerine farklı etkileri vardır: Epitelyal glikojen miktarını arttırırken keratinizasyonu azaltır bunun sonucunda; epitelyal bariyerin etkinliği azalır (Mascarehas, 2003). Östrojen seviyesindeki azalma sonucunda vajinal mukozada epitelyal proliferasyon ve keratinizasyon azalmaktadır. Bazı araştırmacılar, östrojenin benzer etkilerinin oral mukoza ve dişeti epiteli üzerinde de oluştuğunu göstermişlerdir (Richman, 1943; Mealey, 2003). Postmenopozal kadınlarda dişeti epiteli keratinizasyonundaki azalmanın plazma östrojen seviyesinin düşmesi nedeni ile olduğu gösterilmiştir (Mealey, 2003).

22 5 Aynı zamanda östrojen kan damarlarında hücresel proliferasyonu ve (Lindhe, 1967) polimorfonükleer lökosit (PMNL) fagositozunu azaltır (Hofmann, 1986), PMNL kemotaksisini inhibe eder (Ito, 1995). Dişetinde fibroblast proliferasyonunu ve dişeti bağ dokusunun sentez ve matürasyonunu stimüle eder (Beagrie, 1966). Plak miktarında artış olmasa da dişetinde enflamasyonu arttırır (Reinhardt, 1999). Kemik formasyonunu stimüle eder, östrojenin tekrarlanan enjeksiyonları çenelerde endosteal kemik formasyonunun artmasına ve kemiğin ara maddesinde mukopolisakkarit protein kompleksinin azalmasına neden olmaktadır. Dişi hayvanlarda östrojen artmasıyla, permabilitenin artmasına bağlı olarak, gingival eksudasyon miktarı artmaktadır. Ayrıca; östrojen, insan oral mukozasında bağ dokunun mukopolisakkarit içeriğinde artışa neden olmaktadır (Raber-Durlacher ve ark., 1993). Kadın cinsiyet hormonlarından progesteronun dişetine olan etkileri ise şunlardır: Vasküler sistem üzerinde önemli etkileri vardır, kapiller ve endoteliyal hücrelerin bütünlüğünü etkilemesinin yanı sıra, eksudasyonun artmasına da neden olduğu belirtilmiştir (Abraham-Inpijn ve ark., 1996). Progesteron vasküler dilatasyonu arttırır bu yüzden permeabilite artışına sebep olur. (Mascarenhas, 2003). Ayrıca progesteron insanlarda dişetinde enflamasyonun ve hiperplazinin gelişmesinde rol oynar ve sağlıklı insan dişetinde progesteron sadece az miktarda metabolize olur, enflame olmuş dişetinde ise progesteron metabolizması sağlıklı dişetinden 2-3 kez daha fazladır (Ojanotko ve ark., 1991). Progesteronun dişetindeki konsantrasyonu ve onun metabolitleri, hamilelik esnasında çoğalabilir. Metabolitlerin akümülasyonu, daha önceden mevcut olan dişetinin iltihabi cevabını şiddetlendirir bununla beraber prostaglandin üretimini arttırır (ElAttar, 1976).

23 6 Progesteronun bir diğer etkisi dişeti oluğu sıvısında PMNL ve prostaglandin E 2 (PGE 2 ) yi arttırmasıdır (Ferris, 1993). Dişetinde fibroblast proliferasyonunu inhibe eder (Mealey, 2003). Fibroblastlarda kollajen ve non-kollajen maddelerin sentezini inhibe eder (Sooriyamoorthy, 1989). Aynı zamanda dişetinde kollajen üretim hızı ve şeklini değiştirir bunun sonucunda; tamir ve idame potansiyeli azalır. Ayrıca doku tamir ve idamesinde gerekli olan folatın yıkım metabolizmasını hızlandırır (Pack, 1980) Hamilelikte Bağ Dokusu Hamilelikte, yüksek miktarda salınan progesteron ve östrojen gibi hormonların majör hedefi bağ dokusudur. Ayrıca, bağ dokuya ek olarak ekstrasellüler matriks, dişeti dokusu, migrator hücreler ve fibroblastlar da hormonal değişikliklerden etkilenir (Lundgren, 1973). Bu hormonlardan başta progesteronun vasküler permeabilitede artış ve vasküler proliferasyon oluşturduğu çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir (Mariotti, 1994). Cinsiyet steroid hormon reseptörleri immün sistem komponentlerinde bulunmaktadır ve immün sistem hücrelerinin işleyişini düzenleyebilirler (Ahmed, 1988). Örneğin, düşük dozdaki östrojenin PMNL kemotaksisini % 26,8 oranında azalttığı gösterilmiştir (Miyagi, 1992). Ayrıca, oral gingival epiteldeki CD1 hücrelerin (primer Langerhans hücreleri), CD3 hücrelerin (matür T lenfositlerin büyük bölümü) ve oral ve sulkular gingival epiteldeki CD4 hücrelerin (T hepler hücreleri) hamilelik esnasında arttığı gösterilmiştir (Raber-Durlacher, 1993). Cinsiyet steroid hormonların dokuların hücresel farklılaşması, proliferasyonu ve büyümesi üzerine direkt ve indirekt etkileri vardır. Oral kavitede, androjenler, östrojenler ve progesteronun çeşitli hücre tiplerini etkilediği bilinmektedir. Dişetinde ise cinsiyet steroid hormonlarının etkilerini inceleyen araştırmalar genel olarak iki hücre grubu üzerinde (keratinosit ve fibroblast) odaklanmıştır (Mariotti, 1994).

24 7 Fibroblastlar dişetinin ekstrasellüler matriksinde bulunan primer hücre tipleridir ve yapılan araştırmalar fibroblastların her üç tip cinsiyet steroid hormonlarından etkilendiğini göstermektedir. Östrojenin dişeti fibroblast hücre kültürleri üzerine stimülatör etkisi olduğu görülmektedir. Östrodiol gingival dokudan elde edilen fibroblastların proliferasyonunu stimüle edebilmektedir (Mariotti, 1994; Narayanan 1983). Bağ dokuda enflamatuar reaksiyonlarda rol oynayan makrofajlar çok fonksiyonludur. Antimikrobiyal aktivitelerine ek olarak, enflamasyon esnasında dokunun yeniden yapılanmasında önemli rol oynarlar. Plazminojen Aktivatör Đnhibitör tip- 2 (PAI-2) üretirler ve bunlar doku proteolizisinin önemli inhibitörleridir. Klinik olarak gingivitis semptomları gösteren kadınlarda, dişeti oluğu sıvısında, PAI-2 konsantrasyonu düşük olarak bulunmuştur (Laine, 2002) Hamilelik ile Periodontal Sağlık Arasındaki Đlişki Hamilelik ve periodontal enflamasyon arasındaki ilişki uzun zamandan beri bilinmektedir yılında Vermeeren hamilelikte diş ağrıları olduğundan bahsetmiştir de Pitcarin hamilelikte gingival hiperplaziden bahsetmiştir. Pinard 1877 yılında ilk hamilelik gingivitisi olgusunu rapor etmiştir ancak mekanizmalarının anlaşılması için çalışmalar yapılmasına son zamanlarda başlanmıştır. Hamilelik gingivitisi oldukça sıktır ve ortalama hamilelerin % ünde gözlenmektedir (Hanson ve ark., 1986; Löe ve ark., 1984; Samant ve ark., 1976). Hamilelik döneminin periodontal sağlık üzerine olumsuz etkileri bilinmekle birlikte hamilelik sırasında gelişen periodontal hastalığın sistemik sağlık üzerine olumsuz etkileri olduğuna dair bulgular son zamanlarda elde edilmiştir. Yakın tarihte yapılan epidemiyolojik, mikrobiyolojik ve immünolojik çalışmalar; periodontal hastalığın tek başına kardiyovasküler, serebrovasküler, respiratuar

25 8 hastalıklar ve aynı zamanda Erken Doğum (ED) ve Düşük Doğum Ağırlığı (DDA) için bağımsız bir risk faktörü oluşturabileceğini bildirmektedir (McGaw, 2002) yılında ilk olarak Galloway, periodontal hastalığın periodonsiyumun Gram negatif anaerobik enfeksiyonu olduğunu, bu mikrobiyal değişimin hamile kadınlar ve gelişmekte olan fetüs üzerine olumsuz etkilerde bulunabileceğini bildirmiştir (Offenbacher ve ark., 1996). DDA nın oluşmasında periodontal enfeksiyonların anlamlı etkilerinin olduğu dünya genelinde yapılan çalışmalarla gösterilmiştir (Collins, 1994a; Collins, 1994b; Offenbacher ve ark., 1996; Hill ve ark., 1998; Dasanayake, 1998; Mitchel Lewis ve ark., 2001; Jeffcoat ve ark., 2001; Moliterno ve ark., 2005; Noack ve ark., 2005; Dörtbudak, 2005; Buduneli, 2005; Kürklü, 2007). Enfeksiyon, ED ve DDA nın ana nedenlerinden biri olarak görülmektedir. Enfeksiyon durumunda sitokin (IL-1, IL-6 ve TNF-α gibi) üretiminin önderlik ettiği, sonrasında prostaglandinlerin açığa çıkmasıyla devam eden hücresel immünitenin aktivasyonu söz konusudur. Enfeksiyon durumunda bu mediatörlerin anormal üretimi, ED ve DDA yı tetikleyebilir (Mc Gaw, 2001). Progesteron gibi maternal hormonlar rölatif olarak orta derecede immün tolerans oluştururlar ve bu sayede semi-allojenik fetal greftin doku tarafından reddedilmesine engel olurlar. Annenin immün sistemi fetüsü enflamatuar proses olarak kabul etmesi nedeniyle eğer fetomaternal sistemde bu enflamatuar prosesi regüle ve selektif olarak aktive edecek mediatörler mevcutsa, doğum olayını indükleyici mekanizmaların oluşması sağlanıyor olabilir. PGE 2 gibi birçok enflamatuar mediatörün intraamniyotik sevileri hamilelik süresince artış gösterir ve doğum esnasında en yüksek seviyeye ulaşır ve PGE 2 mekanizmaları normal fizyolojik doğum esnasında görev yapar (Offenbacher, 1998). Prostaglandinlerin hamileliğin normal fizyolojisinin regülasyonunda önemli rolleri olduğu yapılan diğer çalışmalarda da ortaya konmuştur. Gibbs ve ark. (1992)

26 Hamileliğin Periodontal Sağlık Üzerine Etkileri Periodontal hastalıklarda majör etkenin bakteri plağı olduğu, bunun yanı sıra lokal ve sistemik faktörlerin de etkili oldukları bilinmektedir. Diabetes mellitus, immün bozukluklar, osteopöröz gibi sistemik hastalıkların yanı sıra, sigara kullanımı, stres, hamilelik gibi kişisel ve endokrin faktörlerin periodontal hastalık riskini arttırabileceği bilinmektedir (Mealey, 2003). Puberte, menstrüel siklus, hamilelik ve diabet gibi endokrin değişiklikler plağa karşı olan gingival enflamatuar yanıtı değiştirerek gingivitis oluşumuna katkıda bulunurlar. Sistemik durumlar konağın hücresel ve immünolojik fonksiyonları üzerine etki ederek değişen yanıta neden olurlar. Bu değişiklikler en fazla hamilelik döneminde görülmektedir. Hamilelikte dişetindeki enflamasyonun prevalansı ve şiddeti düşük seviyede plak olmasına rağmen artmıştır (Kinane, 1999; Mariotti, 1999; Porter, 1998). Hormonal değişimlerin yaşandığı hamilelik dönemi araştırmalarda güncelliğini kaybetmemiş ve cinsiyet hormonlarındaki değişimlerin periodontal durumlarla ilişkisini gösteren çalışmalar yapılmıştır. Bu çalışmalarda hormonal değişimlerin dişetlerinde enfeksiyon oluşturduğu ve bunun doğuma kadar giderek arttığı belirtilmiş olup koruyucu programlar önerilmiştir (McGaw, 2002). Hamilelikte seviyesi artan hormonların gingivitis ve periodontitisin şiddeti ve insidansı üzerine etkili olduğu bilinmektedir. Gingivitis belirtileri hamileliğin 2. ayında başlar ve artarak doğumdan 1 ay önce maksimum seviyeye ulaşır. Doğumdan sonra ise yavaş yavaş gerilemeye başlar. Hamilelikte meydana gelen immün değişiklikler sonucu nötrofil kemotaksisi ve fagositozundaki azalma, lenfosit cevabı ve antikor üretimine bağlıdır. Sonuç olarak, dişetinde artmış ödem, kızarıklık, kanamaya yatkınlık ve bakteriyel plağa karşı cevapta artmış gingival enflamasyon görülebilmektedir. Amar ve Chung (1994) yaptıkları bir çalışmada, hamileliğin ağız boşluğu üzerine dört ayrı patolojik etkisinin olduğunu bildirmişlerdir. Bunlar;

27 10 Hamilelik gingivitisi Hamilelik tümörü (epulis) Periodontitis Diş çürüğü şeklindedir. Hamilelikte diş çürüğü; bulantı ve kusma hamilelerin yaklaşık %70 inde ortaya çıkmaktadır ve dördüncü veya sekizinci haftalar arasında başlar, ondördüncü veya onsekizinci haftalarda son bulur. Kusma, diş minesinin erozyonuna ve vücudun elektrolit dengesini bozarak hayati tehlikeye neden olabilmektedir (Casamassimo, 2001). Hamile bireylerde 3. trimestırda ortaya çıkan rinit, ağız solunumuna neden olarak enflamasyon şiddetini arttırabilir (Rose ve ark., 2004). Hamileliğin diğer oral bulguları arasında özofagal reflü sık rastlanan bir durumdur. Ağız kuruluğu da hamile bireyler arasında sıklıkla rastlanan diğer bir durumdur. Yapılan çalışmalarda hamile bireylerin %44 ünde ağız kuruluğu görülmüştür, ender olarak da hamile bireylerde pityalizm (aşırı tükürük salgısı) ve kötü ağız kokusu ortaya çıkmaktadır (Rose ve ark., 2004) Periodontal Enfeksiyonların Hamilelik Üzerine Etkileri Mc Gaw (2002) periodontal hastalığın tek başına ED ve DDA için bağımsız bir risk faktörü oluşturabileceğini bildirmektedir. Dünya Sağlık Örgütü (WHO), 1984 yılında DDA nın uluslararası tanımlamasını, Doğum ağırlığının 2500 g dan daha az olmasıdır şeklinde yapmıştır gr ın altında doğan bebekler DDA; 37 haftadan önce gerçekleşen doğumlar ise ED vakası olarak kabul edilir (Crowter, 1990; Offenbacher ve ark., 1996; Wessel ve ark., 1996; Tough ve ark., 2001).

28 11 ED aşağıdaki 4 durumdan birinin sonucu olarak ortaya çıkmaktadır (Main,1988): Erken doğum eylemi Prematüre membran yırtığı Anneye ait komplikasyonlar Fetal komplikasyonlar DDA lı bebeklerin neonatal dönemde ölüm oranının, normal doğum ağırlıklı (NDA) bebeklere oranla 40 kat daha fazla olduğu çok uzun zamandan beri bilinmektedir (McCormick, 1985). DDA lı bebeklerin büyük bir kısmı ED veya erken membran rüptürü sonucu ortaya çıkar ve bunlara neden olarak genellikle hamilelikte sigara ve alkol kullanımı, maternal enfeksiyonlar (üriner sistem enfeksiyonları vb. ), diabet ve hipertansiyon gibi hastalıklar gösterilmiştir. Ancak DDA lı bebeklerin annelerinin yaklaşık dörtte birinde bu hastalıklardan herhangi biri bulunamamıştır ve bu nedenle subklinik enfeksiyonlar gibi diğer nedenler araştırılmaktadır (Mealey, 1999). Yapılan bir hayvan çalışmasında canlı veya ısı ile öldürülmüş Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis) subkutan enjeksiyonunun fetal ağırlık ve canlılık üzerine etkisi araştırılmıştır. Bu çalışmada P. gingivalis enjeksiyonu ile TNF-α ve PGE 2 seviyelerinde artış olduğu ve bu lokalize enfeksiyonun DDA ya ve ölüme sebep olduğu gösterilmiştir (Collins, 1994). Collins ve ark. yine P. gingivalis endotoksininin intravenöz enjeksiyonu sonrasında DDA ve fetal ölümlerde artış olduğunu göstermişlerdir (Collins, 1994). Bu çalışmalar Offenbacher ve ark. nın periodontal enfeksiyonlar; Gram negatif anaerobik organizmalara, lipopolisakkaritlere (endotoksin), ve enflamatuar mediatörlere rezervuar olarak görev yaparlar ve fetal-plasental üniteye bir tehdit oluştururlar hipotezini ortaya atmalarına neden olmuştur (Offenbacher, 1996). Bu hipotezi test etmek amacı ile toplam 124 hamile ve postpartum kadın üzerinde vakakontrol çalışması yapmışlardır. Bu çalışmada 93 erken doğum veya erken membran rüptürü nedeni ile DDA lı bebek doğuran kadın ile 31 normal doğum yapan kadını inceleyip her hastaya tam periodontal muayene yapmışlardır. Çalışma sonucunda DDA lı bebek doğuran kadınlarda klinik ataşman kaybının anlamlı olarak yüksek

29 12 olduğunu bulmuşlardır. Yine aynı çalışmada klinik ataşman kaybının hem şiddetinin hem de miktarının kontrol grubundan anlamlı olarak yüksek olduğunu göstermişlerdir. Offenbacher ve ark. (1998), bakteriyeminin plasental dokulara ulaşması halinde doğumun başlaması için enflamatuar bir uyarının ortaya çıkacağını bildirmişlerdir. Ayrıca fazla miktarda plak ve dişeti enflamasyonu olan bireylerde, Gram negatif bakteriyemi oluşma potansiyelinin yüksek olduğunu iddia etmişlerdir. Offenbacher ve ark. (2001), anneye ait enfeksiyonun sadece fetal membran ve tabakalarını hedef alarak büyümeyi bozmak ve prematüriteyi arttırmakla kalmadığını; aynı zamanda yenidoğan sağlığı üzerine de olumsuz etkilerde bulunabileceğini bildirmişlerdir. Periodontal hastalık, gelişmekte olan fetüsü direkt (bakteriyel ürünlerin translokasyonuyla) veya indirekt (anneye ait enflamatuar mediatörlerin aktivasyonuyla) etkileyerek hamilelik sonucunu etkileyebilir (Dasanayake, 1998; Offenbacher ve ark., 2001; Romero ve ark., 2002; Davenport ve ark., 2002). Normal doğum için gerekli olan biyolojik aktif moleküllerden TNF-α ve PGE 2, enfeksiyon durumunda suni olarak yüksek seviyelere ulaşarak ED eylemini tetikleyebilirler (Offenbacher ve ark. 1996; Gibbs, 2001). Yapılan diğer çalışmalarda bilinen değişkenlerin kontrol altında tutulduğu durumlarda, şiddetli periodontal hastalığı olan kadınlarda preterm DDA lı bebek doğurma riskinin yaklaşık olarak 7,5 kat arttığı gösterilmiştir (Mealey, 1999). hastalıkların hamilelik üzerine olumsuz etkilerini göstermektedir. Bütün bu çalışmalar periodontal 1. 5 Hamilelikte Subgingival Florada Mikrobiyal Değişiklikler Cinsiyet steroid hormonlarının hamilelikte subgingival mikrobiota üzerindeki etkileri iyi bilinmektedir. Kornman ve ark. (1982) 2. trimestır esnasında plak seviyelerinin sabit kaldığını ancak gingivitis ve gingival kanama şiddetinin arttığını göstermişlerdir. Aynı zamanda, subgingival alanda bakterilerde anaerob/aerob oranında ve Prevotella melaninogenica (P. melaninogenica) ve Prevotella intermedia (P. intermedia) oranında artış olmaktadır. Đkinci trimestır esnasında

30 13 hastalardan alınan subgingival plak örnekleri diğer periyotlarda alınan örneklerden daha fazla miktarda östrojen ve progesteron içermektedir. Östrojen ve progesteron P. intermedia tarafından K vitamini eşleniği olarak biriktirilir ve bu mikroorganizma için büyüme faktörü olarak etki eder. Jansen ve ark. (1981) yaptıkları çalışmada hamile kadınlarda değişen hormon seviyelerinin gingival durum üzerine etkilerini araştırmışlar ve test grubunda kontrol grubuna göre 55 kat daha fazla Bacteroides türüne rastlamışlardır, buna ek olarak P. intermedia nın daha fazla 2. trimestırda ortaya çıktığı ve gingivitis ile yakından alakalı olduğunu ileri sürmüşlerdir. Hamilelik esnasında deneysel gingivitis modeli kullanılarak ve subgingival plak örneği alınarak yapılan bir çalışmada, P. intermedia seviyelerinin arttığı ve bunun gingival enflamasyon ile paralellik gösterdiği bildirilmiştir. Postpartum dönemde ise P. intermedia seviyelerinde, dişetinde ödem ve sondalama derinliğinde azalma olduğu gözlenmiştir (Raber-Durlacher, 1994). Ancak subgingival plak üzerinde yapılan diğer bir çalışmada bunun aksi bulgulardan söz edilmektedir. Jonsson ve ark. (1988) hamileliğin evreleri arasında veya hamile olan ve olmayan kadınlar arasında P. intermedia açısından farklılık bulunmadığını bildirmişlerdir. Bu farklı sonuçlar hamilelikte 2. trimestır esnasında ortaya çıkan P. intermedia artışının başka nedenlerle olabileceğini akıllara getirmiş ve çeşitli spekülasyonlara yol açmıştır. Mariotti (1994) bu konu ile ilgili yaptığı çalışmada şu sonuçlara varmıştır. Birinci olarak, P. intermedia 2. trimestır esnasında artmakta ve sonra 3. trimestırda yüksek hormon seviyelerine rağmen normal postpartum seviyelerine düşmektedir, buna ek olarak steroid benzeri moleküller ile ilgili kompetitif inhibisyonunun değerlendirildiği bir çalışma yapılmadığından; hamileliğin 2. ve 3. trimestırında dental plakta veya bakteri kültüründe östrojen ve progesteron hormonlarının yüksek olmasının sebebinin cinsiyet hormonlarına spesifik mi olduğu yoksa dental plak örneklerinin lipofilik yapısından mı kaynaklandığı bilinmemektedir. Ayrıca Laine ve ark. (2002) yaptıkları çalışmada Prevotella türlerinin cinsiyet hormonlarını büyüme faktörü olarak kullanabileceğini göstermişlerdir. P. intermedia ve P. melaninogenica esas büyüme faktörü menadion için östrodiol ve

31 14 progesteronu kullanır. Değişen immün cevaplar, derin ceplerde daha iyi besiyeri oluşmasını sağlar. Ayrıca, gingival kanamadan açığa çıkan kan, mikroorganizmalar için ekstra gıda oluşturur. Gingival büyümeler, anaerobik mikroorganizmaların gelişimine daha yatkın bir floranın oluşması için ortam sağlar. Mitchell-Lewis ve ark. (2001), 213 hamile bireyde yaptıkları çalışmada, periodontal enfeksiyonla olumsuz hamilelik sonuçları arasındaki ilişkiyi belirlemeye çalışmışlardır. ED ve DDA lı bebekler ile NDA lı bebeklerin annelerinin klinik periodontal durumları arasında farklılık görülmezken, ED ve DDA lı bebeklerin annelerinde önceleri Bacteriodes forsythus (B. forsythus) olarak anılan sonradan Tannerella forsythia (T. forsythia) olarak tanımlanan T. forsythia ve Campylobacter rectus (C. rectus) seviyelerinin önemli ölçüde yüksek olduğunu, diğer periodontal patojenlerin miktarlarının da arttığını bulmuşlardır. Ayrıca DDA lı bebeğe sahip bireylerde artmış periodontopatojen bulunduğunu ve hamilelik boyunca periodontal tedavi gören bireylerin DDA insidansında azalma olduğunu bildirmişlerdir. Dasanayake ve ark. (2001), 448 hamile bireyde P. gingivalis e spesifik IgG seviyesi ile bebeğin doğum ağırlığı arasındaki ilişkiyi değerlendirmişler ve DDA vakalarında bu seviyenin NDA lara göre 3 kat daha fazla olduğunu bildirmişlerdir. Sonuçta, P. gingivalis e spesifik serum IgG seviyeleri yüksek olan hamile bireylerin, düşük olan hamile bireylere oranla DDA lı bebek dünyaya getirme olasılığının 4 kat daha fazla olduğunu bildirmişlerdir. Buduneli ve ark. (2005), düşük sosyo-ekonomik seviyeye sahip kadınlarda doğum sonrası elde edilen klinik ve mikrobiyolojik veriler ışığında periodontal enfeksiyon ile ED ve DDA yı araştırdıkları çalışmalarında 181 anne adayından subgingival plak örnekleri toplayarak periodontal hastalıkla ilişkili en yaygın 12 farklı bakteri türünün varlığını DNA-hibridizasyon yöntemi ile belirlemişlerdir. Sonuç olarak, Peptostreptococcus micros (P. micros) ve C. rectus un ED ve DDA insidansını artırabileceğini bildirmişlerdir.

32 Hamilelikte Mikrobiyal Değişikliklere Gingival Cevap Hamilelikte dişetindeki hücresel olaylar tam olarak anlaşılamamıştır. Konak cevabı ve bakteri arasındaki denge çoğunlukla korunmaktadır fakat zaman zaman bu dengenin bozulmasıyla bazı değişiklikler görülebilir, dişetindeki enflamasyon şiddetlenebilir, destek kemiğin hastalıktan etkilenişi hamilelikle artabilir (Kornman ve ark., 1980). Önceki bölümlerde de belirtildiği gibi periodontal hastalık bakterilere bağımlı olarak oluşur, enflamasyonun oluşması ile gelişen ödem ve eritemle vasküler değişiklikler sonucunda mast hücrelerinin degranülasyonu pek çok mediatör ile birlikte IL-6 nın da açığa çıkmasına neden olur. IL-6, hamilelikteki dişeti enflamasyonunda önemli rol oynar. Progesteron, IL-6 seviyesinde azalmaya neden olur. Lapp ve ark. (1995), hamilelik sırasında IL-6 üretiminin azalmasının lokalize enflamasyon gelişimine neden olabileceğini bildirmişlerdir. Bu sitokinin ürünleri, steroid hormon düzeyini ayarlamaktadır. Đnsanda gingival fibroblastlardan salınan IL-6 ürünlerinin oluşturdukları etkiyle progesteron ve testosteron seviyelerinde azalma gözlenir. Bu etki, dişetinin enflamatuar değişikliklere karşı direncini düşürebilir (Ojanotko-Harri, 1991). Lapp ve ark. (1995), hamilelik esnasında oluşan yüksek progesteron seviyeleri nedeniyle lokal IL-6 seviyesinde down regülasyon oluştuğunu ve lokalize enflamasyon oluşumunu etkilediğini göstermişlerdir. Artmış östrojen ve progesteron konsantrasyonu, dişetinde PGE 2 ürünlerini stimüle eder. Hamilelikteki artmış hormon seviyesi de dişetindeki enflamasyonu şiddetlendirebilir (El-Attar, 1976). Hamilelik esnasında maternal immün sistemin baskılandığı düşünülmektedir. Bu cevap sayesinde fetüs allogreft olarak yaşabilmektedir. Hamilelik esnasında ortaya çıkan immün süpresif yanıt oluşmasını sağlayanlar arasında monositlerde artış (yüksek miktarda monosit mitojenlere, allojenik hücrelere ve soluble antijenlere karşı proliferatif cevap oluşumunu inhibe eder) ve hamileliğe spesifik β 1 -glikoproteinler (mitojenlere ve antijenlere lenfosit cevabını inhibe eder) sayılabilir (Bischof ve ark., 1983). Maternal immün sistemdeki bu değişikliklerin gingival enflamasyon oluşmasında etkili olduğu düşünülmektedir.

33 16 Bakteriyel plağa karşı konak cevabı vasküler değişikliklerle başlar. PMNL ler enflamasyon bölgesinde hızla kana karışır, periodontal dokulardaki damarlarda dilatasyon ve permeabilite artışı görülür. Enflame bağ dokusuna PMNL, makrofaj ve lenfositler infiltre olur. Hamilelik esnasında fonksiyonu non-spesifik immünite sağlamak olan periferal PMNL miktarında artış olur (Raber-Durlacher, 1993). Yapılan bir diğer çalışmada periferik kan lenfositlerinin çeşitli mitojenler ve P. intermedia nın bazı formlarına karşı in vitro cevabında azalma olduğu bulunmuştur (O Neil, 1979). Prostaglandinler bilindiği gibi enflamasyonun primer mediatörleridir. Ovaryen hormonlar başta PGE 1 ve PGE 2 olmak üzere prostaglandin üretimini arttırırlar. Prostaglandin immünsupresan olarak etki eder ve prostaglandinlerin yükseldiği durumlarda gingival dokuda enflamasyon artar (Ojanotko-Harri ve ark., 1991). Kinnby ve ark. (1996) hamilelik esnasında oluşan yüksek prostaglandin seviyelerinin PAI- 2 yi etkilediğini ve fibrinolitik sistemin dengesini değiştirdiğini bulmuşlardır. PAI-2 doku proteolizinin önemli bir inhibitörüdür, fibronolitik sisteme ait komponentlerinde hamilelik gingivitisinin gelişiminde rol oynayabileceği ileri sürülmüştür Hamilelik Gingivitisi Hamilelik gingivitisi hamilelikte gözlenen gingivitis için tanımlayıcı bir terimdir. Epidemiyolojik çalışmalar hamilelik gingivitisi prevalansının yaklaşık % arasında değiştiğini göstermektedir (Levin,. 1987; DeLiefde, 1984; Hanson, 1986). Hamilelik gingivitisinin paterni hormonal siklusu izler tarzdadır. Đlk olarak gonadotropin seviyesinin yükselmesi ile şiddeti artar, 4. ve 8. aylarda östrojen ve progesteron seviyelerinin yükselmesi ile aynı seviyede sabit kalır ve hamileliğin son ayında hormon sekresyonunun aniden düşmesi ile azalır (Löe H, 1963).

34 Hamilelik Gingivitisinde Klinik Özellikler Hamilelik gingivitisi ilk olarak hamileliğin 2. ayında ortaya çıkan akut formda bir gingivitistir. En şiddetli tablo ayda gözlenir. Hamileliğin son ayında tablo sabit kalır veya biraz düzelir. Doğumdan sonra hamileliğin 2. ayındaki haline döner. Hamilelik öncesinde enflamasyon yoksa hamilelik süresince periodontal sorun görülmeyebilir. Hamilelik gingivitisi eritem, ödem, hiperplazi ve gingival dokuların artmış kanama eğilimi ile karakterizedir. (Levin,. 1987; Hanson, 1986) Olgular asemptomatik hafif hiperplaziden, ağrı ve kanamalı şiddetli olgulara kadar değişik şekillerde ortaya çıkabilir. Ağzın anterior bölgesi sıklıkla etkilenmektedir. (Lang, 1997). Plak seviyelerinde artış, kalkulus ve debris miktarında artış, bakteriyel anaerobik/aerobik oranında artış hamilelik esnasında ortaya çıkmaktadır (Barak, 2003). Ziskin ve ark. (1933), dişetlerinde gelişen patolojinin, değişen hormonal faaliyetler sonucu olduğunu, irritasyon ya da travma gibi faktörlerin ise, olayı daha komplike bir hale getirdiğini belirtmişlerdir. Ringsdorf ve ark. (1961), 330 hamile kadın üzerinde yaptıkları cross-sectional çalışmada hamilelik ile diş mobilitesi ve gingivitis arasında pozitif ilişki olduğunu bulmuşlardır. Löe ve Silness in yaptıkları çalışmalarda (Löe, 1963) gingival enflamasyon ve sondalama derinliği ölçümlerinde en fazla değişikliğin keser bölgelerde olduğu görülürken, çalışmanın ikinci kısmında (Silness, 1964), hamilelikle doğum sonrası dönem arasında plak açısından bir fark olmadığı, gingival durumda bakteri plağının yanı sıra, başka bir faktörün de rol oynayabileceği ortaya konmuştur. Hamilelikte görülen bu klinik tablo hamilelik gingivitisi olarak adlandırılmıştır. Bu dönem sırasında, dişeti hiperemik ve büyümüş olarak görülebilir. Dokunma ve fırçalamayla kanamalı olabilir. Doku metabolizmasının değişmesine bağlı olarak, iltihabi cevabın arttığına da değinilmiştir. Rateitschak ve ark. (1967), periodontal olarak sağlıklı üst keser dişleri olan hamile kadınlarda son ayda mobilite görüldüğünü bildirmişlerdir. Bu bireylerde cep sıvısı akışı artmıştır. Ek olarak, sondalama derinliğinde artış, dişetinde ödem ve/veya

35 18 hiperplastik gingival değişiklikler görülür. Bu bireylerde, daha derin olan gingival cepler gerçek periodontal yıkımı yansıtmaz. Enflamasyonun derecesi cinsiyet hormonlarının seviyesi ile ilişkilidir. Ancak düzenli plak kontrolü yapıldığında periodontal sağlık korunabilir. Hugoson (1971), yaptığı klinik çalışmada, hamileliğin ilerlemesine bağlı olarak, gingival indeks (GI) skorlarında artış bulurken, plak indeks (PlI) skorlarında azalma kaydetmiş ve hamilelikte mevcut dişeti iltihabındaki artışın, bakteri plağı haricinde bir etkene bağlı olduğunu savunmuştur. Araştırmacı, gözlemlerine dayanarak, sağlıklı dişetlerine sahip bireylerin hamilelik döneminde dişetlerinde bir değişim görülmediğini, ancak hamilelik öncesinde dişetlerinde var olan enflamasyonun, diş mobilitesinin ve cep derinliğinin arttığını bildirmiştir. Miyazaki ve ark. (1991), 2424 hamile ve 1565 hamile olmayan kadının periodontal sağlıklarını CPITN indexi kullanarak değerlendirmiş, tüm popülasyonun %95 inde periodontal hastalık rapor etmiş, derinliği 4-5 mm olan ceplerin miktarının hamile kadınlarda kontrol grubuna oranla fazla olduğunu ve artan hamilelik haftası ile korelasyon gösterdiğini, 8. ayda maksimum düzeye ulaştığını bildirmişlerdir. Ancak bu artışın sebebi periodontal yıkımdan çok, gingival büyüme ile ilişkilendirilmiştir Hamilelik Gingivitisinde Histolojik Özellikler Histolojik olarak, gingivitis birçok kapiller damar yapısının katılım gösterdiği vasküler ağ yapısında değişiklik ile karakterizedir. Eksudatif sıvı ve proteinler dokularda ödem oluştururlar ve konnektif dokudaki enflamatuar hücreler dişeti-diş kontakt alanına doğru akın eder. Enflamatuar hücre infiltrasyonu, temel olarak lenfositler, makrofajlar ve nötrofillerden oluşmaktadır. Hücresel infiltrat biriktikçe, dokuların yapısal ve hücresel kompozisyonları değişir (Kinane, 1997).

36 Hamilelik Gingivitisinin Etiyolojisi ve Patogenezi Hamilelikte görülen hormonal değişiklikler gingival dokuların enflamasyonu ile ilişkilendirilmesine karşın mekanizma tam olarak bilinmemektedir. Steroid hormonların artan seviyesine cevap olarak subgingival florada ve dişeti vaskülaritesinde değişiklikler görülür. Artmış vaskülarite sebebiyle dişeti değişiklikleri meydana gelmektedir. Vaskülaritenin yanı sıra immün sistem veya bağ dokusu metabolizmasındaki değişiklikler gibi diğer faktörler de etkilidir. Hamilelik gingivitisinin etiyolojisi multifaktöriyeldir (Michelberger, 1996) Kısaca etkenler şu şekilde özetlenebilir; Dental plak varlığı Kalkulus ve debrisde artış Anaerob bakterilerin aeroblara oranında artış Dişetinde hiperreaktivite Hücresel ve hümoral immün yanıtta değişiklik Prostaglandin ve sitokin üretiminde artış Gingival doku turnoverında değişiklik Hücresel proliferasyon, farklılaşma ve keratinizasyonda değişiklik Gingival enflamasyonla bakteri türlerinin stimülasyonu Östrojen ve progesteronun P. intermedia tarafından büyüme faktörü olarak kullanılması T hücreleri ile oluşan gecikmiş tip hipersensitivitenin B hücreleri üzerine sitotoksik etkisi (Mealey, 2003) Hamilelik gingivitisinin patogenezinde hamilelik esnasındaki cinsiyet hormon konsantrasyonlarının etkisi olabilir. Dişeti dokusunda spesifik östrojen ve progesteron reseptörlerinin varlığı gösterilmiştir (Vittek, 1982). Bu da dişeti dokusunun cinsiyet hormonları için hedef organ olarak fonksiyon görebileceğini düşündürmüştür. Dahası, hamilelik esnasında dişeti dokusunda progesteronun düşük metabolizması aktif hormonal fonksiyonu düşündürmektedir (Ojanotko-Harri, 1991).

37 20 Hamilelik esnasında, yüksek progesteron ve 17β-östrodiol seviyelerinin artması, prostaglandin ve diğer enflamatuar mediatörlerin salımını arttırarak enflamasyon oluşmasına yol açmaktadırlar (Ojanotko-Harri, 1991; El-Attar, 1976). Progesteron aynı zamanda kollajen üretimini azaltır (Barak, 2003). Ekstrasellüler matriksin temel bileşenlerini oluşturan glikozaminoglikan üretimini kollajen üretimi gibi azalttığı yapılan çalışmalarda gösterilmiştir (Willershausen, 1991). Diğer taraftan östrojenler anabolizan etkiye sahiptirler ve matriks sentezini stimüle ederler (Soory, 2000). Östrojen aynı zamanda hücresel proliferasyon, diferansiasyon ve keratinizasyonu da regüle edebilmektedir. Raber-Durlacher ve ark. (1993), başlangıçta periodontal açıdan sağlıklı hamileleri ayrıntılı bir oral hijyen programına almışlar, hamileliğin 25. haftasında ve doğumdan sonraki 6. ayda olmak üzere iki hafta için oral hijyeni bıraktırmışlardır. Sondalamada kanama hamileliğin 25. haftasında doğum sonrası 6. aya göre daha yüksek bulunmuştur. Plak indeksleri her iki hafta periyodunda da benzerdir. Đnterdental papiller bölgesinde yapılan histolojik incelemede CD4 pozitif T hücreleri miktarının hamilelik periyodunda daha fazla olduğu görülmüştür. CD4 pozitif T hücrelerindeki bu artış hamilelik esnasında görülen gingival enflamasyona cevapta etkili olabilir. Maternal immün sistemdeki değişikliklerin (periferik kanda ve gingival dokuda T3, T4 ve B hücrelerinde azalma, nötrofil kemotaksisinde azalma, hücresel immünite ve fagositozda azalma gibi) hamilelik gingivitisi oluşumunda rol oynayabileceği düşünülmüştür. Periferik kan lenfositlerinin in vitro ortamda çeşitli bakteriyel antijenlere karşı cevabında azalma ve CD4 pozitif hücrelerin sayılarında azalma olduğu yapılan diğer çalışmalarda bildirilmiştir (Brabin, 1985; Lopatin, 1980). Hamilelik esnasında kan dolaşımında bulunan hormonların, gingival enflamasyon ile alakalı olan bazı bakteri türleri için stimülan etkiye sahip oldukları bilinmektedir. Bu

38 21 bakteri türleri arasında Bacteriodes türleri ve P. intermedia sayılabilir (Newman, 1984, Muramatsu, 1994). Artmış östrojen ve progesteron seviyeleri de hamilelerde gingival durumu etkilemektedir. Lindhe ve Branemark (1970), bu hormonların anjioneogenezisi stimüle ettiğini ve bunun sonucunda vasküler permeabiliteyi arttırarak endoteliyal hasara neden olduklarını göstermişlerdir. Ojanotko-Harri ve ark. (1991), gingival fizyolojide önemli rolü olan progesteron metabolizmasını araştırdıkları çalışmalarında hamile olan ve olmayan kadınların gingival dokularını karşılaştırmış, sonuçta hamile kadınlarda, dişetinde bulunan progesteron seviyesinin, hamile olmayanlara göre daha yüksek olduğunu bildirmişlerdir. Bu durumun açıklaması, hamilelikle birlikte dişetindeki progesteron metabolizmasının azalmış olmasıdır. Artan progesteron miktarı gingival enflamasyon gelişiminde rol oynamaktadır. Plak kompozisyonu da hamilelik gingivitisinin oluşumuna katkıda bulunabilmektedir. Kornman ve ark. (1980), hamile olan ve olmayan kadınlarda plak bakteriyolojisini karşılaştırmış, hamilelerde anaerob floranın daha baskın olduğunu, özellikle P. intermedia miktarında artma olduğunu göstermişlerdir. Dişetinde progesteron ve östrojen seviyesindeki artış da bu bakteri artışına neden olabilir. Çünkü bu hormonlar P. intermedia nın esas büyüme faktörü olan menadionun yerini tutar. Görülmektedir ki, hormonal değişiklikler sadece plağa karşı immün cevabı değiştirmekle kalmaz, plağın mikrobiyal kompozisyonunda değişiklikler de yapabilir Bakteriler Periodontal sağlık ve hastalıkta farklı mikroorganizmalar rol almaktadır. Sağlıklı dişeti oluğunda flora sınırlıdır ve hemen hemen eşit oranda Gram pozitif ve fakültatif anaerob mikroorganizmalar ve %5 değerini aşmayacak şekilde spiroket ve hareketli çomaklar baskın olarak bulunmaktadır. Hastalık şiddetinin artması ile zorunlu

39 22 anaerob, Gram negatif bakteriler ve hareketli organizmaların oranında belirgin artış gözlenmektedir (Samaranayake 2002, bölüm 33). Periodontal hastalıkların farklı tiplerinde görülen mikroorganizmalar Tablo 1.1 de izlenmektedir. Çizelge 1.1 Periodontal hastalıkların farklı tiplerinde görülen mikroorganizmalar Koşul Sağlık Kronik marginal gingivitis Kronik periodontitis Agresif periodontitis (Samaranayake 2002, bölüm 33) Predominant mikroorganizmalar Streptococcus sanguinis Streptococcus oralis Actinomyces naeslundii Actinomyces viscosus Veillonella alt türleri Streptococcus sanguinis Streptococcus milleri Actinomyces israelii Actinomyces naeslundii Prevotella intermedia Capnocytophaga alt türleri Fusobacterium nucleatum Veillonella alt türleri Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Fusobacterium nucleatum Bacteroides forsythus Actinobacillus actinomycetemcomitans Selenomonas alt türleri Capnocytophaga alt türleri Spiroketler Actinobacillus actinomycetemcomitans Capnocytophaga alt türleri Porphyromonas gingivalis Prevotella intermedia Yorum Temel olarak Gram pozitif koklar ile az sayıda spiroketler veya hareketli çomaklar Hücrelerin yaklaşık %55 i Gram pozitif az sayıda spiroket ve hareketli çomaklar Hücrelerin yaklaşık %75 i Gram negatif (%90 ı zorunlu anaerob).yaygın hareketli çomak ve spiroket Hücrelerin yaklaşık %65-75 i Gram negatif basil. Az sayıda spiroket veya hareketli çomak bulunmakta. Bu hastalıklar hücresel immün veya genetik defektler ile birlikte görülebilir

40 Aggregatibacter actinomycetemcomitans Daha önceden Actinobacillus actinomycetemcomitans olarak bilinen bakteri günümüzde Aggregatibacter actinomycetemcomitans (A. actinomycetemcomitans) olarak tanımlanmıştır (Lauritsen, 2006) A. actinomycetemcomitans ilk olarak 1912 yılında tanımlanmıştır, çok eskiden beri bilinen bir bakteridir, insanlar haricinde primatların oral kavitesinde varlığı gösterilmiştir, büyük bir ihtimalle primer habitatı dişeti oluğudur (Slots, 1980). A. actinomycetemcomitans Gram negatif, hareketsiz, fakültatif, sporsuz, sakkarolitik (şekeri parçalaması), kapnofilik, µm. çapında, kenarları hafif düzensiz, dış bükey, kanlı agar besiyerinde parlak şekilde görülen, yüzeye sıkı şekilde tutunmuş ve merkezde yıldız şeklinde kolonize olan kokobasil mikroorganizmadır (Cengiz, 2004; Lindhe ve ark., 2003). A. actinomycetemcomitans ın virülans faktörleri endotoksin, lökotoksin, fimbria (pili), kollajenaz, fibroblast inhibe eden faktör ve tripsin-benzeri proteolitik enzimlerdir (Lindhe, 2003). A. actinomycetemcomitans ile ilgili yapılan çalışmalarda endotoksinin PMNL, IL- 1β, TNF-α ve IL-8 salımını stimüle ettiği belirtilmiştir. (Yoshimura ve ark., 1997) Kawai ve ark. (2000) A. actinomycetemcomitans lipopolisakkaritinin (LPS) rat dişetine enjekte edildiğinde periodontal kemik rezorpsiyonunun indüklendiğini göstermişlerdir. Lindhe ve ark. (2003) A. actinomycetemcomitans tarafından üretilen endotoksinin makrofaj toksisitesini, trombosit agregasyonunu ve kompleman aktivasyonunu indüklediğini bildirmişlerdir. A. actinomycetemcomitans endotoksini immün cevabı etkileyen protein yapıda antijene sahiptir ve endotoksin T hücresi, nötrofiller, PMNL ler ve doğal öldürücü hücrelerinin (NK) membran porlarında meydana getirdiği değişiklikler ile bu hücrelerin ozmotik lizislerine sebep olur, endotoksinin düşük dozlarda apoptotik

41 24 mekanizmayla T hücresi ve NK hücrelerinin ölümüne, yüksek dozlarda ise hücre nekrozuna sebep olduğu belirtilmiştir (Mangan ve ark., 1991). A. actinomycetemcomitans ekstrasellüler proteolitik enzimlere sahiptir ve bu enzimlerden tripsin benzeri proteolitik enzim tip I kollajen, fibrinojen ve protein substratların hidrolizine neden olur ve aynı zamanda insan dişeti epitel hücresi proliferasyonunu azaltır (Lunm ve ark., 2000). Kültüre edilen A. actinomycetemcomitans ın proteolitik enzimleri IgG, serum IgA (sekretuar IgA hariç) ve IgM yi parçalarken IgD ve IgE ye etki etmemiştir (Lindhe ve ark., 2003). A. actinomycetemcomitans hücre yüzeyinden salınan antijenik GroEL proteini (heat shock protein) üretir, bu proteinin osteoklastları aktive ederek kemik rezorpsiyonuna neden olduğu gösterilmiştir (Kirby ve ark., 1995). Bunun yanı sıra; düşük seviyedeki GroEL proteini epitel hücre proliferasyonunu indüklerken yüksek seviyelerde sitotoksik etkiye sahiptir (Goulhen ve ark., 1998). A. actinomycetemcomitans yüksek oranda antijenik özelliğe sahip kolonizasyonda önemli rol oynayan fimbrialara sahiptir ve fimbriaya sahip bakterilerin tükürük ile kaplı hidroksiapatitlere karşı afinitesinin fazla olduğu bildirilmiştir (Lindhe ve ark., 2003). A. actinomycetemcomitans ın dış membranından salgılanan bazı proteinler enflamatuar sitokinlerin indükleyicileridirler ayrıca A. actinomycetemcomitans glikoproteini TNF-α, IL-1β ve IL-6 cevabını indükler ve A. actinomycetemcomitans ın ürettiği protein antijenlerinin T hücrelerinin sitokin üretimini azalttır (Tani ve ark., 1997). A. actinomycetemcomitans tarafından oluşturulan doku patolojileri arasında dişetinde enflamasyon, periodontal ligamentte destrüksiyon, alveoler kemikte yıkım sayılabilir. A. actinomycetemcomitans a ait virülans faktörleri 3 ana kategoride özetlenebilir. 1. Đmmünomodülatuar virülans faktörleri: A. actinomycetemcomitans immün savunma mekanizmalarını inaktive eden veya ortadan kaldıran çeşitli ürünler salgılar. Bunlar arasında en fazla ilgi gören lökotoksin ve Lenfosit Fonksiyon ilişkili Antijen (LFA-1) dir. Lökotoksin aktif bir toksindir ve direkt olarak

42 25 hedef hücrelere toksik etki eder, bu hücrelerde mitokondrial hasar oluşturarak hücre apopitozuna neden olur. LFA-1 ise selektif olarak lökositler üzerine etki eder ve lenfosit ve monosit fonksiyonlarının inhibisyonuna ek olarak nötrofil kemotaksisine de engel olan maddelerin salgılanmasına neden olur (Narayanan, 2002). 2. Doku yıkımı yapan virülans faktörleri: Enflamasyon ve doku destrüksiyonu yapan bakterilerde LPS her zaman en önemli virülans faktörü olmuştur. A. actinomycetemcomitans ın, in vivo ve in vitro olarak kemik rezorpsiyonuna yol açan LPS salgıladığı gösterilmiştir (Nishihara, 1995). Bununla birlikte bakteri LPS den daha fazla destrüksiyon oluşturabilecek hücre stres protein ve chaperonin 60 gibi moleküller de sentezlemektedir, yapılan çalışmada bu moleküllerin osteoklastları stimüle ettiği ve osteoblastlarda apopitoza neden olduğu gösterilmiştir (Nishihara, 1995). 3. Adezyon ve invazyon oluşturan virülans faktörleri: Bu faktörler bakteriyel adezyon ve kolonizasyon oluşabilmesi için gereklidir, virülansın anahtar mekanizması adezyondur. Bakteriyel adezyon oluşumunu sağlayan çok sayıda gen ve molekülün varlığı yapılan çalışmada gösterilmiştir (Henderson, 2002). Bakteriyel invazyon patojenite oluşabilmesi için olmazsa olmazdır ve hem bakteri hem de konak hücrelerini ilgilendiren kompleks mekanizmalara bağlı olarak gerçekleşir. A. actinomycetemcomitans ın invazyonu esnasında transferin ve integrin reseptörlerinin görev aldığını gösteren çalışmalar mevcuttur (Meyer, 1997). Sonuç olarak A. actinomycetemcomitans periodontal yıkımda görev alan geniş potansiyelli virülans özelliklere sahip bir bakteridir Prevotella intermedia Önceden Bacteroides intermedius olarak tanımlanan bakteri günümüzdeki sınıflandırmada Prevotella intermedia (P. intermedia) olarak isimlendirilmiştir.

43 26 Gram negatif, sporsuz, hareketsiz, asakkarolitik, anaerob, küçük, ucu yuvarlak, basil formunda mikroorganizmadır (Cengiz, 2004, Lindhe ve ark., 2003). P. intermedia genel olarak hareketsiz kısa veya filamentöz çomak olarak karşımıza çıkmaktadır. Ancak pleomorfik olarak da bulunabilir. Zorunlu anaerob bakteridir ve glukoz, dekstrin, maltoz ve sukrozu fermente eder. P. intermedia zorunlu anaerob, siyah pigmentli Gram negatif çomaktır. Bu bakteri sıklıkla çeşitli periodontal hastalıklarla ilişkilendirilmiştir. Bu periodontal hastalıklar arasında erişkin periodontitis, akut nekrotizan ülseratif gingivitis ve hamilelik gingivitisi vardır. Bu mikroorganizma aynı zamanda nazofaringeal enfeksiyonlar ve intraabdominal enfeksiyonlar gibi ekstraoral enfeksiyonlara da yol açabilir. (Mättö, 1997). P. intermedia için primer yaşam alanı insan dişeti oluğudur. P. intermedia periodontal ceplerde sıklıkla bulunmaktadır. P. intermedia.nın virülans faktörleri endotoksin, fimbria ve enzimlerdir. P. intermedia fimbriası bakterinin epitel hücrelerine invazyonunda önemli role sahiptir. P. intermedia endotoksini fibroblastlardan IL-1β ve IL-6, makrofaj ve monositlerden prostaglandin salımını stimüle ederek kemik yıkımını indükler (Lındhe, 2003). Sokransky (2002) ve ark. P. intermedia nın fosfolipaz A, jelatinaz ve lipaz enzimlerine sahip olduğunu ve bu enzimler ile epitel hücrelerinin bütünlüğünü bozarak dokular arasına invaze olduğunu bildirmişlerdir. P. intermedia, periodontitis etiyolojisinde rol alan sık rastlanılan oral mikroorganizmadır. Periodontitisin yanında peritonsiller apseler, pulmoner enfeksiyonlar ve oral apselerde de prominant olarak bulunmaktadır. Ancak hastalıklı alanlarda bulunabildiği gibi sağlıklı alanlarda da görülebilmektedir. Yapılan çalışmalarda P. intermedia nın iyi fagosite edilemediği ve bakterinin lenfosit proliferasyonunu inhibe ettiği dolayısıyla immün sistemi kısmen baskıladığı gösterilmiştir (Cengiz, 2004).

44 27 P. intermedia orta derecede proteolitik aktiviteye sahiptir ve Ig A proteaz, kazein, jelatin, DNA, RNA ve lipidleri hidrolize eden enzimleri salgılamaktadır. Kanlı agarda kültüre edildiğinde hemoliz alanı oluşturmaktadır. Bu hemolitik etkisi virülans faktörü olarak karşımıza çıkmaktadır. Yapılan çalışmalarda, hemolizinlerin periferal lökositlerin kemotaktik cevabını inhibe ettikleri ve diğer ökaryotik hücre tipleri için sitotoksik oldukları gösterilmiştir. Bu organizma hemin içeren maddelere bağımlıdır ve bu maddeleri üreme için kullanmaktadır Prevotella nigrescens Sakkarolotik anaerob bir bakteri olan Prevotella türü insan oral kavitesinde bulunmaktadır ve klinik olarak önemli olabilmektedir. Bu grubun en önemli iki türü Prevotella intermedia ve Prevotella nigrescens(p. nigrescens) dir. Bu iki bakteriler başlangıçta tek tür olarak düşülmekteyse de 1990 lı yıllarda yeniden sınıflandırılmışlardır (Shah, 1992; Frandsen ve ark., 1995). Yapılan çalışmalarda P. intermedia türlerinin serolojik ve DNA yapısı olarak heterojen bir grup olduğu anlaşılmış ve 1992 yılında P. intermedia iki genotip olarak sınıflanmıştır: P. intermedia ve P. nigrescens (Shah, 1992). Yapılan çalışmalarda bu iki bakterinin, değişik oral bölgelerden elde edilen örneklerde hem prevalansının hem de miktarının farklı olduğu gösterilmiştir (Gharbia ve ark., 1994; Baumgartner ve ark., 1999). Örneğin; erişkinlerden elde edilen örnekler üzerinde yapılan çalışmada Moore ve ark. (1987) hastalıklı dokularda P. intermedia nın P. nigrescens den 5 kat fazla olduğunu ancak sağlıklı dokularda bu durumun tam ters olduğunu göstermişlerdir. Yine benzer olarak bir başka çalışmada, destrüktif periodontal hastalığı olan kişilerde P. intermedia-benzeri izolatların 2/3 ünü P. intermedia oluştururken sağlıklı bireylerde % 75 ini P. nigrescens in oluşturduğu gösterilmiştir (Dahlen ve ark., 1990). Bu bulgular P. intermedia nın periodontal patojen olabileceğini gösterirken, P. nigrescens in nispeten periodontal sağlığın belirteci olduğu düşüncesine yol açmıştır. Lokalize juvenil periodontitis lezyonlarında P. nigrescens ve P. intermedia nın araştırıldığı bir çalışmada ise hastalardan alınan plak örnekleri blot hibridizasyon

45 28 yöntemi ile değerlendirilmiş, test edilen ceplerde P. intermedia %45 oranında saptanırken, P. nigrescens %73 oranında saptanmıştır (Ereş, 2002). P. nigrescens, diğer siyah pigmentli anaerob bakteriler gibi P. gingivalis, P. intermedia periodontitisin başlangıcından ve ilerlemesinden sorumlu tutulmaktadır (Dahlen, 1993; Haffajee ve ark., 1998; Ximenez-Fyvie ve ark., 2000). Bu bakteriler hemoglobine bağlanırlar ve eksternal demiri üremeleri için demir kaynağı olarak kullanırlar (Okamoto ve ark., 1998). P. nigrescens sağlıklı dokularda tespit edilmesine rağmen, endodontik enfeksiyon, enflamatuar gingival hastalık ve hafif-orta şiddette periodontitis ile ilişkisi olduğu bildirilmiştir ve bu bulgular P. nigrescens in fırsatçı bir patojen olduğunu göstermektedir (Bae ve ark., 1997; Pearce ve ark., 2000) Campylobacter rectus Eski sınıflandırmada Wolinella recta olarak adlandırılan C.rectus Gram negatif, anaerobik, sporsuz, hareketli, kıvrık veya virgül şekilli mikroorganizmadır (Cengiz, 2004, Lindhe ve ark., 2003). C. rectus un virülans faktörleri; endotoksin, crystalline surface layer (SLP), GroEL, lökotoksin ve flagella olarak sayılabilir. Bu virülans faktörleri konak hücrelerde çeşitli enflamatuar mediatörlerin salımına yol açmaktadır (Tanabe, 2003, Rams, 1993). Daha özellikli olarak, C. rectus endotoksini, gingival fibroblastlardan PGE 2, IL-1β, ve IL-6 salımına neden olmaktadır. Ayrıca; SLP de IL-6 ve IL-8 salımına neden olmaktadır (Tanabe, 2003). Yapılan çalışmada C.rectus un lökotoksin ürettiği ve insan dişeti fibroblastlarından IL- 6 ve IL-8 üretimini stimüle ettiği gösterilmiştir (Lindhe ve ark., 2003). C. rectus un endotoksin ile monosit veya makrofajlardan IL-1 ve prostaglandin salımını stimüle ettiğini ve sahip olduğu flagella ile dişeti epiteli ve bağ dokusuna penetre olabildiği bildirilmiştir (Newman, 2006).

46 29 Campylobacter türü insan ve hayvanlarda patojen olan bir mikroorganizmadır. Yapılan çalışmalarda C. rectus ve Campylobacter gracilis in başlangıç ve orta dereceli periodontitiste subgingival bölgede yüksek miktarda bulunduğu gösterilmiştir ve bu bulgu türlerin periodontal hastalıklar ile direkt olarak alakalı olduğunu düşündürmektedir (Rawlinson, 1994; Mauch, 2000). C. rectus erişkinlerde progresif gingivitis oluşturmaktadır. Dahası, C. rectus başlangıç seviyedeki periodontitis ile ilişkili olan üç türden bir tanesidir (Tanner, 1998). Yapılan çalışmada kültür ortamında kadın cinsiyet hormonlarının bulunmasının C. rectus üremesini arttırdığı gösterilmiştir (Mauch, 2000). Yine bir diğer çalışmada hamile kadınlarda oral florada C. rectus seviyelerinin daha yüksek olduğu gösterilmiştir ve bunun sebebinin tükürükte artmış östrodiol konsantrasyonu olabileceği düşünülmektedir (Yokoyama, 2008) Tannerella forsythia Önceden Bacteroides forsythus olarak isimlendirilen bakteri günümüzde T. forsythia olarak tanımlanmıştır. T. forsythia Gram negatif, anaerobik, fusiform şekilli mikroorganizmadır (Cengiz, 2004; Lindhe ve ark, 2003). T. forsythia, hücreleri santral şişlik gösterebilir, hareketsizdirler ve özel bir hücre duvarı yapısına sahiptirler. Yavaş üreyen hücrelerdir ve hücre üremesi için N-acetylmuramic asite ihtiyaç duymaktadırlar (Tanner, 1986). T. forsythia, sadece insan gingival oluğunda rapor edilmiştir ve periodontal hastalıklar için önemli bir patojendir. T. forsythia nın virülans faktörleri kapsül, endotoksin, tripsin-benzeri proteinaz, apoptozisi indükleyen faktör, BspA proteini (Boiling Stable Protein) ve betalaktam enzimi olarak sınıflandırılabilir. T. forsythia kapsülü bakteriyi PMNL fagositozundan korur, kapsül bakterinin epitel hücrelerine invazyonunda önemli rol oynar (Cengiz, 2004). Çeşitli çalışmalarda T. forsythia nın hücre yüzeyinde tripsin-benzeri proteinaz enziminin bulunduğu gösterilmiştir ve tripsin-benzeri proteinazın T. forsythia nın

47 30 eritrositlere, PMNL ve fibroblastlara bağlanmasında etkili olduğu gösterilmiştir (Munemasa ve ark., 2000). T. forsythia nın özellikle membran porlarının formasyonu ile lenfositlerde apoptozisi indükleyen bir protein ürettiği bildirilmiştir (Arakawa ve ark., 2000). Bunun yanı sıra T. forsythia sahip olduğu β-laktamaz enzimi nedeniyle betalaktam antibiyotiklere karşı direnç göstermektedir (Lindhe ve ark., 2003). Mikroorganizma genellikle aktif kronik periodontitis olgularından P. gingivalis ile birlikte izole edilir ve şiddetli periodontitise eşlik eder. Kendisine ait özel üreme ihtiyaçları (hemin, menadion, L-cysteine ve N-acetylneuraminic asit) ve üremesinin güç olması nedeni ile kemik ve doku destrüksiyonu üzerindeki tam etkisi net olarak ortaya konulamamıştır. T. forsythia, periodontal hastalıklı kişilerin subgingival plaklarında sağlıklı olan kişilerden çok daha fazla oranda karşımıza çıkmaktadır, yine sondalama esnasında kanamalı olan bölgelerde T. forsythia nın kanamasız olan bölgelerden daha fazla oranda bulunduğu da gösterilmiştir, bu da bakterinin aktif hastalık ile yakından alakalı olduğunu düşündürmektedir (Suda ve ark., 2004). T. forsythia hem erişkinlerde hem de çocuklarda özellikle periodontitisli olgularda subgingival plak örneklerinde üretilmiştir. Aile bireylerinin subgingival plak örneklerinde T. forsythia bulunan çocukların, kendilerinde de bu bakterinin görülme sıklığı fazladır ve yapılan son çalışmalarda aileden çocuğa geçişin diğer mikroorganizmalara oranla T. forsythia için daha yüksek olduğu bulunmuştur, bu oran yaklaşık % 60 civarındadır (Umeda ve ark., 2004). T. forsythia Benzoyl-DL Arginin-Naphthylamid (BANA) i parçalayan peptidaz aktivitesine sahiptir, bu etki sayesinde periodontal doku yıkımına yol açar (Takaishi ve ark., 2003). Yine, asakkarolitik bir bakteri olmasına rağmen, in vitro olarak çeşitli glukozidazları üretebildikleri gösterilmiştir. Beighton ve ark. (1992) T. forsythia ya bağlı periodontitisi olan hastalarda periodontal dokularda artmış glukozidaz aktivitesi olduğunu belirtmişlerdir. Periodonsiyumda proteoglikanlar bol miktarda bulunur ve glukozidaz aktivitesi için çok iyi bir substrat olarak görev görürler. Hem proteoglikanlar hem de proteoglikanların yıkım ürünleri oral mikrobiyal ajanlar için

48 31 besin kaynağı olarak kullanılır (Bartold ve ark., 1987). Ayrıca T. forsythia lipoprotein üretir, bu lipoproteinler gingival fibroblastları etkileyerek IL- 6 ve TNF-α salımına neden olurlar. IL-6 önemli bir proenflamatuar ajandır ve kemik rezorpsiyonu oluşmasına neden olur (Kotake ve ark., 1996), T. forsythia sialidaz ve tripsin benzeri enzim salgılayarak konak hücreye etki eder (Moncla ve ark., 1990). Yapılan çalışmada T. forsythia nın hücre zarında bulunan S-layer bölgesinin konak hücrenin immün sisteminde baskılanmaya yol açtığı gösterilmiştir (Libermann ve ark., 1990). Bu bakteri, P. gingivalis ve T. denticola ile birlikte periodontopatojenik mikrobiyal ajanların en önemlilerini oluşturmaktadır. T. forsythia nın sitotoksik aktiviteye sahip olduğu da gösterilmiştir, bu da fonksiyonel olarak periodontitisin ilerlemesine yol açar (Arakawa ve ark., 2000) Treponema denticola Oral spiroketler periodontal bölgelerden alınan plaklarda en fazla gözlenen bakteriyel organizmalardan biridir. Buna rağmen hakkında en az çalışma yapılan bakterilerden biri de yine spiroketlerdir. Bu organizmaların metabolik ve fizyolojik karakteristikleri henüz açığa kavuşturulmadığından periodontal hastalıklara olan katkıları tam olarak anlaşılamamıştır. Bu bilgi azlığının nedeni spiroketlerin plaktan izole edilmesindeki ve bu bakterilerin in vitro ortamda üretilmelerindeki güçlükten kaynaklanmaktadır. Günümüzde halen daha kaç farklı çeşit spiroketin kültüre edilebildiği ve ürettikleri hangi faktörlerin periodonsiyum için zararlı olduğu hakkında tam olarak bilgi yoktur (Loesche, 1988). Dört önemli spiroket türü bulunmaktadır. Bunlar T. denticola, Treponema socranskii, Treponema vincenti ve Treponema pectinovorum dur. T. denticola ve T. vincenti asakkarolitik bakterilerdir diğerleri ise glukoz ve diğer şekerleri fermente edebilirler. Gingivitis açısından en önemli spiroket ise T. denticola olarak karşımıza çıkmaktadır.

49 32 T. denticola Gram negatif, hareketli, asakkarolitik, spiral şekilli anaerobik bir spirokettir (Cengiz, 2004; Lindhe ve ark., 2003). T. denticola nın virülans faktörleri flagellum, endotoksin, proteinaz enzimleri, majör kılıf proteini (Msp) olarak sınıflandırılabilir. T. denticola nın sahip olduğu flagellum onun yüksek viskoziteye sahip dişeti oluğu sıvısında hareket etmesine, dişeti epiteli ve bağ dokusuna penetrasyonuna ve konak hücrelere tutunmasına yardım etmektedir (Klitorinos ve ark., 1993). Kültür çalışmaları T. denticola nın hastalıklı bölgelerle yakından ilişkili olduğunu göstermiştir (Moore ve ark., 1985). Simonson ve ark. (1988) monoklonal antikorlar kullanarak yaptıkları çalışmada hastalıklı bölgelerden alınan plak örneklerinde T. denticola bulunma sıklığının arttığını göstermişlerdir. Yapılan çalışmada periodontal hastalıklı bölgelerden alınan plak örneklerinden elde edilen spiroket oranlarının A. actinomycetemcomitans ve P. gingivalis gibi mikroorganizmalardan daha fazla bulunduğu bildirilmiştir ve aynı plak örneğinde T. denticola ile diğer bakteri miktarları karşılaştırılmış ve spiroketlerin fırsatçı mikroorganizma olmalarından çok direkt patojen organizmalar oldukları sonucuna varılmıştır (Loesche, 1988). Aynı zamanda; T. denticola nın dış membran lipidinin makrofajlardan IL-1 ve TNFα salımını indüklediği gösterilmiştir (Schultz ve ark., 1998). 19 günlük ratlarda yapılan bir çalışmada T. denticola nın dış membran lipitlerinin kemik rezorpsiyonunu indüklediği bildirilmiştir (Rosen ve ark., 1999) Yine yapılan çalışmada T. denticola nın ve diğer spiroketlerin kendi özel virülans faktörleri olduğu gösterilmiştir (Lindhe ve ark., 2003). Bu mikroorganizmaların dokulara direkt olarak hasar veren maddeler veya enzimler salgıladıkları bulunmuştur. T. denticola nın fibroblast proliferasyonunu inhibe eden hücre duvarına bağlı faktör salgıladığı gösterilmiştir (Boehringer, 1984). Yine kollajenolitik enzim, fibrinolitik enzim, peptidaz salgıladıkları ve keratinolitik etki gösterdikleri bilinmektedir (Mikx, 1987; Loesche, 1987). T. denticola nın Msp proteini PMNL lerin degranülasyonunu tetiklediği, MMP-8, MMP-9, kollajenaz ve jelatinazın spesifik salımını sağlayarak enflamatuar cevabı arttırdıkları gösterilmiştir (Mathers ve ark., 1996).

50 Porphyromonas gingivalis P. gingivalis, genel olarak hareketsiz çomaklardır ancak pleomorfik olarak da görülebilir. Aerotolerant bakterilerdir ve oksijene maruz kalınca yaşamlarına devam edebilirler. P. gingivalis, karbonhidratları fermente edemez ve üremesi ortamdaki şeker varlığından etkilenmez. Malat dehidrojenaz ve glutamat dehidrojenaz enzimleri vardır. Proteolitik enzimleri değişkendir. P. gingivalis in majör kolonizasyon bölgesi insan oral kavitesinde subgingival sulkustur. Đnsanda ve deney hayvanlarında periodontal yıkım yapmaları nedeni ile agresif periodontal patojen olarak kabul edilirler. Birçok deney hayvanında P. gingivalis in periodontopatojenik potansiyeli gösterilmiştir (Saiki ve ark., 2004). P. gingivalis in virülans faktörleri arasında adheransı sağlayan fimbria, proteazlar, hemaglütininler ve lipopolisakkaritler bulunmaktadır. Fimbria, hem konak hücresi hem de diğer bakteriler ile interaksiyonu sağlamaktadır. Bakteri adherans sonrasında kolonize olmaktadır. P. gingivalis in diğer bakteriler ile koagregasyon yaptığı yapılan çalışmada gösterilmiştir (Hamada ve ark., 1998). Yine P. gingivalis tarafından salgılanan veziküller streptokoklar, Fusobacterium nucleatum ve Actinomyces naeslundii gibi bakterilerin agregasyonunu ve agrege olmayan Streptococcus aureus ve streptokok gibi türler arasında köprü oluşmasını sağlamaktadır. Bakteriler diş yüzeyine tutunduktan sonra dişeti oluğuna doğru ilerlemeye başlamaktadır. Dişeti oluğunun tabanında keratinize olmayan ince bir bağlantı epiteli vardır ve bu epitel tam dişeti ve diş birleşim yerindedir. Keratinize olmaması ve diferansiyasyonunun az olması nedeni ile bu bölge hassas bir bölgedir. Bu nedenle bağlantı epiteli, P. gingivalis invazyonuna duyarlıdır (Saiki ve ark., 2004). P. gingivalis, konağın makromolekülleri (tükürük proteinleri, glikoproteinler ve ekstrasellüler matriks proteinleri gibi) ve hücrelerini etkileyen çeşitli moleküllere ve çok sayıda proteolitik enzim salgılama özelliğine sahiptir (Andrian ve ark., 2004). Bunlardan bir tanesi P. gingivalis in virülansı ile yakından alakalı olan tripsin benzeri proteinaz enzimidir. Bu enzimin yanı sıra bakteri sistein proteinaz enzimini

51 34 de salgılar. Bu proteinazlar türün normal fizyolojisinde vardır ve periodontitiste P. gingivalis e bağlı doku yıkımının oluşmasında kritik öneme sahiptirler (Holt ve ark., 1991). Đnsan oral epitelinin P. gingivalis ile karşılaşması bakteri ataşmanı sonrasında IL- 6 salımı ile sonuçlanır. IL-6 önemli bir enflamatuar sitokindir ve periodontal hastalık gelişmesinde önemli role sahiptir ve IL-6 osteoklastlar tarafından kemik rezorpsiyonu oluşmasını da tetiklemektedir (Chen ve ark., 1997). P. gingivalis aynı zamanda bir ekzopeptidaz olan prolil tripeptidil peptidaz salgılamaktadır, bu enzim hücre yüzeyi serin peptidazıdır ve P. gingivalis enzim aracılığı ile hücre yüzeyindeki polipeptidleri daha küçük peptid parçalarına böler ve bu küçük partikülleri kendi hücrelerine alarak enerji kaynağı olarak kullanır (Amano ve ark., 1994). Aynı zamanda bu enzim kollajen/jelatin yıkım ürünlerinin kullanılmasını sağlar ve hastalıklı dişeti dokusunda seviyesi çok yüksek olarak bulunmuştur. (Banbula ve ark., 2001). Yine yapılan bir çalışmada P. gingivalis in konak hücrenin immün sistemine olumsuz etkilerde bulunarak, koagülasyon faktörlerini etkileyerek ve konak dokusunda yıkım oluşturarak periodontal hastalık oluşturduğu gösterilmiştir (Nakatani ve ark., 1994) Actinomyces viscosus Actinomycesler Gram pozitif fakültatif anaerobik ve mikroaerofilik çomaklardan oluşan heterojen bir gruptur (Sarkonen ve ark., 2001). Actinomyces viscosus (A. viscosus ) Gram pozitif, katalaz pozitif bir bakteridir ve genellikle tonsillalarda yerleşmektedir (Pinto ve ark., 1991; Sarkonen ve ark., 2001). Konak dokularda kommensal veya patojenik bakterilerin kolonizasyonu bakteriyel adeziv ve metabolik aktivitelere bağlıdır, A. viscosus insanlarda ve rat benzeri hayvanlarda oral yüzeylerin mikroflorasının büyük bölümünü oluşturmaktadır, bunun nedeni çeşitli adezyon özelliklerine sahip olmalarıdır (Zambon ve ark., 1995).

52 35 Diş yüzeyinde ilk kolonize olan bakteriler arasındadır ve insanlarda diş çürükleri ve gingivitis ile alakalı olduğu gösterilmiştir (Haffajee ve ark., 1997; Zambon ve ark., 1995). Yapılan çalışmalarda, gingivitisi olan hastalarda, bu bakteriye spesifik periferal kan T hücrelerinde artış olduğu bulunmuştur, bu da göstermektedir ki A. viscosus immün cevabı indükleyerek periodontitis patogenezinde rol oynayabilir (Mahanonda ve ark., 1989; Mahanonda ve ark., 1991). A. viscosus gingivitisi olan insanların subgingival plaklarında bol miktarda bulunmaktadır (Haffajee ve ark., 1997; Noiri ve ark., 1997). Bu bakterinin gingival B hücrelerinde CD83 ekspresyonunu ve oral epitelyal hücrelerden pro-enflamatuar sitokinlerin salımını arttırdığı gösterilmiştir, bu özellikleri nedeni ile A. viscosus un periodontal hastalıkların immünopatogenezinde rol oynadığı düşünülmüştür (Mahanonda ve ark., 2002). Bu bakteri kommensal oral floranın bir parçasıdır ve bakterinin sürekli olarak yutulması alt gastrointestinal sistemde immün yanıtın stimüle edilmesine neden olabilir, böylece periodontopatojen bakteriye oral toleransın olması enflame dişeti dokusunda immün dengesizlik oluşmasına katkıda bulunabilir ve bakterinin diş ve mukozal yüzeylere yapışması engellenebilir (Gemmell ve ark., 2002). A. viscosus a spesifik periferal T hücre sayısının gingivitisi olan hastalarda arttığı, tedavi sonrasında da azaldığı gösterilmiştir ve elde edilen bulgular ışığında bu bakterinin periodontal hastalıkların immünopatogenezinde rol oynayabileceği düşünülmektedir (Mahanonda ve ark., 1989; Mahanonda ve ark., 1991). A. viscosus genellikle başlangıçtaki plak oluşumundan sorumludur. Yapılan çalışmalarda dişe tutunmuş plağın sadece yüzeyel ve orta bölümlerinde değil aynı zamanda derin bölümlerinden de elde edilmiştir, bu durum, A. viscosus un derin cep bölgelerinde kolonizasyon ile ilişkisi olduğunu göstermektedir (Haffajee ve ark., 1997). Ozaki ve ark. (1994) A. viscosus un dişeti oluğunda yüzeyel ve orta bölümlere oranla derin tabakalarda daha yoğun olarak bulunma eğilimi olduğunu göstermişledir.

53 Streptococcus sanguinis Streptokoklar, orofarenks, gastrointestinal sistem ve genitoüriner sistemde kolonize olabilen bakterilerdir. Bu bakteriler için yağ asitleri toksik olduğundan cilt yüzeyinde nadir olarak bulunurlar. Bu mikroorganizmalar çeşitli enfeksiyonlara neden olurlar. Özellikle diş çürükleri, subakut bakteriyel endokardit ve supuratif intraabdominal enfeksiyonlarla ilişkili oldukları bilinmektedir. Streptokok türleri spesifik hastalıklarla ilişkili olduğundan türlerin tanımlanması önemlidir. Diğer taraftan, septisemi gibi hayatı tehdit eden hastalıklara da yol açabilirler. Streptokoklar enfektif endokarditin en sık sebebi olan bakterilerdir ve Streptococcus sanguinis (S. sanguinis) bu hastalıktan en fazla sorumlu olan streptokoktur. Subakut bakteriyel endokardit Streptococcus gordonii, Streptococcus mitis kaynaklı iken; diş çürükleri Streptococcus mutans ve Streptococcus sobrinus tan; apse formasyonu ise Streptococcus anginosus, Streptococcus constellatus ve Streptococcus intermedius tan kaynaklanır (Murray ve ark., 2005). S. sanguinis Gram pozitif bakteridir ve insan oral kavitesinde kolonizasyonda anahtar rol oynadığı uzun zamandan beri bilinmektedir. S. sanguinis heterojen oral streptokokları ifade etmek için kullanılan bir isimdir. S. sanguinis dokuz aylık bebekken oral kavitede kolonize olmaya başlar ve karyojenik bakterilere karşı koruyucu ve antagonist görev üstlenir (Li, 2003). Diğer birçok oral streptokok gibi, bu bakteri de kanlı agarda alfa hemoliz oluşturmaktadır. Alfa hemoliz, eritrositlerdeki hemoglobulinin okside edildiğini gösteren karakteristik bir özelliktir (Barnard ve ark., 1996). S. sanguinis tükürük kaplı diş üzerine direk olarak bağlanır ve bu bağlanmada çeşitli mekanizmaları kullanmaktadır (Kolenbrander ve ark., 1993). S. sanguinis in bağlandığı çeşitli tükürük komponentleri arasında Ig A ve α-amilaz vardır (Gong ve ark., 2000). S. sanguinis bir kere bağlandıktan sonra, diğer mikroorganizmaların diş yüzeyine bağlanmasını, dental plak, diş çürüğü ve periodontal hastalık oluşmasını kolaylaştırmaktadır (Kolenbrander ve ark., 1993). S. sanguinis aynı zamanda diş

54 37 çürükleri ile alakalı primer tür olan S. mutans ın dişte kolonizasyonuna engel olmaktadır ve bu açıdan bakıldığında varlığı, oral sağlık açısından faydalı olarak değerlendirilebilir (Caufield ve ark., 2000; Mylonakis ve ark., 2001). S. sanguinis geniş bir karbonhidrat türünü enerji kaynağı olarak kullanabilmektedir ve aynı zamanda S. sanguinis in oral kavitede adezyon veya virülansını etkileyen çeşitli proteinleri vardır (Kilian ve ark., 1989) Periodontal Hastalıklarda Bakteriler Đnsan subgingival plak örneklerinde bakteri türü bulunmuştur. Bu bakteri türlerinin adeti destrüktif periodontal hastalık oluşmasında rol oynayabilir (Socransky ve ark., 1994). Bu bakteri türleri, periodontal dokuda kolonize olup hasar oluşturma özelliğine sahiptirler. Subgingival dokuda kolonize olmak için mikroorganizmalar: 1. Periodontal dokuya tutunmak 2. Periodontal dokuda çoğalmak 3. Bu habitatta diğer mikroorganizmalar ile yarışmak 4. Konak savunma mekanizmalarına karşı kendilerini korumak zorundadırlar. Dişeti oluğu, mikroorganizmaların gelişmesi için uygun bir ortamdır. Ancak yine de subgingival alanda kolonize olabilmeleri için konak hücrenin savunma mekanizmalarının üstesinden gelmeleri gerekmektedir. Bu savunma mekanizmaları arasında mekanik etkiler, tükürük ve dişeti oluğu sıvısının akışı gibi nonspesifik mekanizmalar vardır. Tükürük ve dişeti oluğu sıvısında bulunan maddeler, kolonizasyon oluşmasının önlenmesine yardımcı olurlar ve bakteri hücrelerinin dişe ve doku yüzeylerine tutunmalarını engelleyebilirler. Tükürük ve dişeti oluğu sıvısının bazı bileşenleri bakterilere karşı direkt öldürücü bile olabilir. Eğer bir bakteri savunma mekanizmalarını başarılı olarak geçip, subgingival alandaki dokulara yapışırsa başka savunma mekanizmaları devreye girer. Bu savunma mekanizmaları arasında epitelyal yüzeye yapışan bakteriler için epitelyal soyulma, bakteriyel ataşmanı engelleyen antikorlar ve bakterilerin nötrofiller tarafından

55 38 fagosite edilmesi sayılabilir. Eğer bir bakteri türü altta bulunan bağ dokuya ulaşmayı başarırsa, o zaman T hücreleri, B hücreleri, nötrofiller, makrofajlar ve lenfositlerden oluşan konağa ait immün sistem hücreleri ile karşı karşıya gelir. Başarılı olabilmesi için, bakterinin bütün bu savunma mekanizmalarının üstesinden gelmesi gerekmektedir. Periodontal bakteriler arasında A. actinomycetemcomitans, T. forsythia, P. gingivalis esas patojen olarak kabul edilmektedir (Newman, 2006; bölüm 4). Çünkü bu bakteriler periodontal hastalığın durumu, hastalığın ilerleyişi ve başarısız tedavi ile yakından ilişkilidirler. Ne var ki aşağıdaki bakterilerin etiyolojideki rolü için daha az delil vardır. Şöyle ki bu bakterilerin patojenitesinin etkili olması için konsantrasyonlarının belli bir eşik değerin üstünde olması gerekir. Bu bakteriler şunlardır: P. intermedia P. nigrescens C. rectus P. micros F.nucleatum Eubactecterium nodatum ve çeşitli spiroketler. Esas patojenlerin rolünün önemi büyük ölçüde epidemiyolojik verilere, bu mikroorganizmaların hayvanlara inoküle edildiğinde hastalık oluşturabilme yeteneğine ve virülans faktörleri üretebilme kapasitesine dayanmaktadır (Slots, 1991; Socransky, 2002; Wolff, 1994). Fakat periodontal patojenlerin dişeti oluğunda sadece varlığı periodontal enflamasyona neden olmak veya başlatmak için yeterli değildir. Etkili bir doku hasarı oluşabilmesi için bu patojenlerin oranı veya sayısında kritik seviyeye ulaşacak bir artış olması gerekmektedir. Aslında düşük sayıda da olsa sağlıkta bile dişeti oluğunda periodontal patojenler normal ağız florasının bir üyesi olarak bulunabilir (Loomer, 2004).

56 39 Oral hijyenin bıraktırılmasında 8 saat sonra diş yüzeyindeki bakteri konsantrasyonu mm 2 de e ulaşır ve sonraki 24 saat içerisinde katı artar (Socransky, 1977). Deneysel gingivitisteki ilk mikroorganizmalar Gram pozitif çomak, Gram pozitif kok, Gram negatif koklardan oluşur. Gram negatif çomak ve filamentler sonrasında spiroket ve hareketli mikroorganizmalarında olaya katılması ile gingivitise dönüşüm enflamatuar değişikliklerle gözlemlenir (Theilade, 1966). Dental plakla oluşan gingivitiste mikrobiota yaklaşık aynı oranda Gram pozitif (%56) ve Gram negatif (%44) türlerden, aynı zamanda fakültatif (%59) ve anaerobik (%41) mikroorganizmalardan oluşur (Slots, 1979). Gingivitiste baskın olan Gram pozitif türler S. sanguinis, Streptococcus mitis, Streptococcus intermedius, Streptococcus oralis, Actinomyces viscosus, Actinomyces naeslundii ve Peptostreptococcus micros tur. Gram negatif mikroorganizmalar Fusobacterium nucleatum, P.intermedia, Veillonella parvula, Haemophılus, Capnocytophaga ve Camphylobacter türleridir (Moore, 1994). Hamilelik gingivitisine dişeti oluğu sıvısında steroid hormonlarının artışı eşlik eder ve steroidleri büyüme faktörü olarak kullanan P. intermedia seviyeleri dramatik ölçüde artar (Kornman, 1982). Gingivitis araştırmaları hastalığın gelişiminin dental plağın sadece birikimi ile değil mikrobiyal içeriğindeki değişimlerle birlikte oluştuğunu göstermektedir. Gingivitisin kronik periodontitise dönüştüğüne genellikle inanılmaktadır fakat pek çok bireyde periodontal ataşman yıkımı olmaksızın uzun süre gingivitis stabil olarak sürebilir. Yıkıcı periodontal lezyonlar ile alakalı olan mikroorganizmalar, P. gingivalis, P. intermedia, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans ve T. denticola dır (Zambon ve ark., 1996). P. gingivalis, daha çok yetişkinlerde şiddetli periodontitis olgularında, destrüktif formda olan hastalıklarda ve aktif lezyonlarda bulunmaktadır, başarılı olarak tedavi edilen bölgelerde sayıları azalmakta ancak tedavi sonrasında rekürrent hastalıklarda karşımıza çıkmaktadır (Bragd ve ark., 1987). P. gingivalis in sistemik ve lokal antikor cevabını arttırdığı gösterilmiştir (Mahanonda ve ark., 1991). P. intermedia seviyelerinin periodontitisin belli formlarında yükseldiği gösterilmiştir (Dzink ve ark., 1983). Bu türe ait serum antikor sevilerindeki yükselme refraktör periodontitis olgularının büyük bölümünde gösterilmiştir (Haffajee ve ark., 1988). T. forsythia, destrüktif periodontitis olgularında, sağlıklı veya gingivitisli olgulardan daha fazla oranda bulunmuştur, T. forsythia aktif periodontal hastalıklı olgularda

57 40 daha fazla oranda karşımıza çıkmaktadır (Lai ve ark., 1987). Lokalize juvenil periodontitiste, A. actinomycetemcomitans predominant periodontopatojen olarak karşımıza çıkar (Zambon ve ark., 1983). Genco ve ark. (1988), normal floradaki organizmaların gingivitiste anahtar rol oynadığını, eksojen organizmaların ve nadir gözlenen anaerobların ise periodontitiste önemli olduğunu vurgulamışlardır Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR), spesifik bir DNA parçasının kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik olarak sentezlenmesi şeklinde tanımlanan in vitro bir yöntemdir li yılların ortalarında Cetus firması araştırıcıları tarafından geliştirilmesinin ardından temel moleküler biyoloji araştırmalarında (klonlama, dizi analizi ve DNA haritalaması gibi) ve birçok hastalığın (orak hücre anemisi, kistik fibrozis, fragile X sendromu, AIDS, lösemi vb.) DNA temeline dayalı tanısı için de klinik tıpta hızla kullanılmaya başlanmıştır. PCR ile insan genomik DNA sı gibi kompleks DNA kalıplarından spesifik DNA parçalarının sentezinin birkaç saat içinde gerçekleştirilebilir hale gelmesi, bu teknolojinin yaygınlaşmasında başlıca neden olmuştur (Arı, 2004; bölüm 5). Ayrıca günümüzde, polimeraz zincir reaksiyonu, allelik dizi varyasyonlarının gösterilebilmesi ile doku transplantasyonu için doku belirlenmesi, adli tıp örneklerinin genetik tiplendirilmesi (ebeveyn tayini) gibi tıbbın diğer kollarında, tarımda (tohum saflığının belirlenmesi), sistematik ve evolüsyon çalışmaları gibi birçok alanda (doğadaki çeşitli canlı türlerinin tanısı, türler arasındaki polimorfizmin belirlenmesi) kullanılması yaygın hale gelmiştir (Arı, 2004) Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Oluşum Mekanizması Polimeraz zincir reaksiyonu çift iplikli bir DNA molekülünde hedef dizilere iki oligonükleotid primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır. Amplimer olarakta adlandırılan oligonükleotid primerler, kalıp DNA molekülü yüksek sıcaklıklarda

58 41 denatüre edildikten sonra, tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan bölgelerle melezlenirler. Primerlerin spesifik olarak hedef dizilere bağlanması düşük sıcaklık derecelerinde gerçekleşir. DNA polimeraz enzimi, uygun tampon ve dört çeşit deoksiribonükleozit fosfat (dntp) varlığında primerin 3 hidroksil ucundan uzamasını sağlar. Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni DNA molekülü sentezlenmiş olur. Bir PCR döngüsü denatürasyon, primerin bağlanması (annealing) ve uzama (ekstensiyon) olarak adlandırılan üç aşamadan oluşur. Ardı ardına tekrarlanan denatürasyon, primerlerin bağlanması ve primerlerin uzaması evreleriyle DNA parçaları üssel olarak artar. Bu üssel artışın nedeni, bir döngü sonucu sentezlenen ürünün, ardışık döngüde diğer primerler için kalıp görevi yapmasıdır. Böylece her PCR döngüsü DNA molekülü üzerinde istenilen bölgenin iki katına çıkması ile sonuçlanır. PCR boyunca biriken ürünlerin boyu iki primerin boyu ve hedef DNA bölgeleri arasındaki mesafelerin toplamı kadardır (Şekil 1. 1). Şekil 1.1. PCR döngülerinin şematik görüntüsü

59 42 Potansiyel olarak her döngünün % 100 verimle gerçekleştiği varsayılırsa, örneğin 20 döngü sonucu 2²º kat ürün meydana gelir Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Temel Bileşenleri Polimeraz zincir reaksiyonunun temel bileşenleri, kalıp olarak kullanılan DNA molekülü, primerler, dntp karışımı, DNA polimeraz enzimi, tampon ve magnezyum klorürdür. Kalıp DNA: PCR için başlangıç materyali çoğaltılacak baz dizisine sahip genetik materyaldir. PCR için her türlü kaynaktan elde edilen DNA (veya RNA) kullanılabilir. Kan, serum, vücut sıvıları, dokular, organlar çok fazla yararlanılan materyaller arasındadır. PCR ın çok duyarlı olması, çok az miktarlardaki materyalin kullanılabilmesine olanak sağlamaktadır. Primerler (Oligonükleotidler): Gen çoğaltılması dahil PCR ın birçok uygulaması için kalıp DNA ya tamamen tamamlayıcı olan primerlere gereksinim vardır. Genel olarak kullanılan kalıp ile yüksek oranda bağlanma sağlamak üzere primerler nükleotid uzunluğundadır. Oligonükleotid primerler, primer sentezi yapan laboratuarlardan ya da ticari olarak elde edilebilirler. Primer tasarımı yapılırken çoğaltılması istenen DNA dizisinin iki ucundaki dizisi bilinen kısımlar dikkate alınır. Bu bölgelere tamamlayıcı olan primerler tasarlanır. Primer tasarımı yapmak için bilgisayar programları da geliştirilmiştir. Deoksiribonükleotid fosfatlar (dntp'ler): Nükleik asit ya da yeni DNA ların sarmalanabilmesi için datp, dgtp, dttp, dctp olarak bilinen 4 tip dntp ye gereksinim duyulmaktadır. Primerler ve dntp ler, hedef DNA nın amplifikasyonu için gerekli olan ham maddeyi sağlarlar. dntp lerin optimal konsantrasyonu her reaksiyon için ayrı ayrı, deneysel olarak belirlenmelidir. Isıya dayanıklı DNA-Polimeraz enzimi: Đn vitro olarak DNA nın amplifikasyonu işleminde kullanılan ilk ısıya dayanıklı DNA polimeraz 1987 yılında bulunan Taq- DNA Polimeraz enzimidir. Bu enzim Kızıldeniz'in sıcak bölgelerinde yaşayan

60 43 Thermus aquaticus adlı bir mikroorganizmadan elde edilmiştir. Taq-DNA Polimeraz 94 C de inkübe edildikten sonra bile aktivitesini kaybetmez. 95ºC de yarılanma ömrü 40 dakikadır. Taq-DNA Polimeraz enziminin 72º C de maksimum aktivasyon gösterdiği gösterilmiştir. DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DNA ipliği meydana getirmek üzere, orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit deoksiribonükleozit fosfattan uzun polinükleotid zincirin sentezini kataliz ederler. Tampon solüsyonlar (Buffer): Uygun ph ve iyon koşullarını sağlayan tampon solüsyonlar polimeraz enzimlerine özgüdür.. Enzim bu bileşenlerin bir araya geldiği uygun tampon sisteminde ve uygun sıcaklıkta primerin 3 OH grubuna serbest dntp lerin 5 -fosfat gruplarını 3-5 fosfodiester bağı ile kovalent olarak bağlar. MgCl 2 : Önemli bir enzim kofaktörü olup, Taq-DNA Polimeraz enziminin çalışabilmesi için gereklidir. Magnezyum (Mg) iyonları dntp ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar ve çift iplikli DNA nın erimesini hızlandırırlar, ayrıca primer-kalıp etkileşimini sağlayarak hedef dizine primerlerin bağlanmasını da ayarlar Polimeraz Zincir Reaksiyonunun Đşleyişi Termostabil DNA polimerazları ve farklı sıcaklık derecelerini istenilen süreler için otomatik olarak ayarlayabilen PCR aletlerinin ( thermal cycler ) kullanıma sunulması, PCR ın verimi ve kullanımında önemli gelişmelere yol açmıştır. Verimli bir PCR için; (1) denatürasyon, (2) primerlerin bağlanması, (3) primerlerin uzaması, (4) döngü sayısı, (5) PCR makinesinin sıcaklık iniş ve çıkış süreleri önemlidir. Polimeraz zincir reaksiyonu mikrotüplerde gerçekleştirilir. Amaca göre farklı PCR tüpleri ve değişik sıcaklık dereceleri kullanılabilir. PCR da bir döngüyü oluşturan sıcaklık değerleri şekil 1. 2 de verilmiştir.

61 44 Sıcaklık C 100 n sayıda tekrarlı döngüler Birinci aşama Đkinci aşama Üçüncü aşama Zaman (dakika) Şekil 1.2. PCR da sıcaklık döngüleri Başlangıç denatürasyonu için genomik DNA gibi kompleks kalıpların denatüre olmasını sağlamak üzere yüksek sıcaklıklar ( C) kullanılır. Primerlerin uzaması aşamasında genellikle Taq/Amplitaq DNA polimerazların polimerizasyon aktivitesi için en uygun sıcaklık derecesi olan 72 C kullanılır. Uzama aşaması için çoğu zaman iki dakika yeterli olmakla birlikte, eğer uzun amplikonlar çoğaltılıyorsa süre artırılır. PCR ürünü olan tüm moleküllerde reaksiyonun tamamlanmasını garanti altına almak için son döngünün uzama süresi çoğunlukla uzun (10-15 dakika) tutulur. Toplam döngü sayısı genellikle arasındadır. Döngü sayısının artırılması halinde istenmeyen ürünler fazlalaşırken, istenen ürünlerde herhangi bir artış meydana gelmez. Bu yüzden 40 tan fazla sayıda döngüden oluşan PCR işlemi genellikle başarılı sonuçlar vermez.

62 Amplifikasyon Sonrası Đşlemler DNA moleküllerinin analizinde çok çeşitli yöntemler kullanılmakla beraber tüm laboratuarlarda rutin olarak yararlanılan en basit yöntemlerden biri jel elektroforezidir. Yöntemin avantajları basit ve hızlı olması, ayrıca diğer yöntemlerle yeterli düzeyde ayrılamayan DNA fragmanlarının ayrılabilmesini sağlamasıdır. Ultraviole (UV) ışığı altında floresan etki gösteren etidyum bromür (EtBr) boyasının kullanımı ile çok düşük konsantrasyonlarda olsa bile, DNA nın jel üzerindeki yerini belirlemek mümkündür. DNA nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir alanda, jel üzerindeki göçüne dayanır. Bu göç hızı molekülün büyüklüğüne, yapısına, jelde kullanılan maddenin konsantrasyonuna, iyonik kuvvete ve uygulanan akıma bağlı olarak değişmektedir (Arı, 2004; bölüm 5). Agaroz Jel Elektroforezi: DNA ve RNA moleküllerini tanımlamakta kullanılan standart yöntem agarozun kullanıldığı elektroforezdir. Elektroforez işlemi elektrik akımı uygulandığında negatif yüklü moleküllerin nötral ph da katottan anoda doğru hareketi esasına dayanmaktadır. Nükleik asitler sıvı ortamda süspansiyon halinde bulunurlar. Fosfat gruplarından dolayı negatif yük taşırlar ve elektroforez sırasında katottan anoda doğru yol alırlar. Jel, elektroforez tamponuna konulmuş agarozun yüksek sıcaklıkta çözündürülmesi ile hazırlanır. Agaroz çözeltisi ~50 C a kadar soğutulduktan sonra (dikey sistemde) jel kasetleri arasına veya (yatay sistemde) jel tepsilerine dökülür. Ayırımı yapılacak örnek taraklarla oluşturulmuş kuyucuklara konur ve ayırım tamamlanıncaya kadar voltaj uygulanır. Boyama ve Görüntüleme Đşlemleri: Agaroz ya da poliakrilamid jellerde, bir floresan boya olan ve DNA ipliklerinin arasına giren, etidyum bromür boyaması ile ürünler görülür. Boyamadan sonra DNA, jelde bir UV transilüminatörden yararlanılarak görülebilir hale gelir. Jelin kalıcı görünümü fotoğraflama yolu ile elde edilir.

63 46 Etidyum bromür DNA nın baz çiftleri arasına bağlanarak ultraviole ışık altında DNA nın izlenebilir hale getirilmesini sağlamaktadır. Son konsantrasyonu 0,5 mg/ ml olacak miktarda jel içine karıştırılmasıyla elektroforez sırasında boyamanın sağlanması sık olarak kullanılan bir yöntemdir. Elektroforez işlemi sonlandırıldıktan sonra jelin bir morötesi ışık kaynağı üzerine yerleştirilmesiyle jel içerisinde bulunan boyanmış DNA ların görünmesi mümkün hale gelmektedir. Görüntünün fotoğraf makinesine aktarılması için bu amaçla dizayn edilmiş görüntüleme cihazları geliştirilmiştir. PCR tekniği 1985 yılında geliştirilen farklı doku kaynaklarından elde edilen DNA ve RNA ların incelenmesinde yaygın olarak kullanılan bir tekniktir. PCR teknolojisinin gelişmesi ile A. actinomycetemcomitans, T. forsythia ve P. gingivalis gibi bakterilerin saptanmasında çeşitli DNA ekstraksiyon yöntemleri ve primerler kullanılarak farklı mikrobiyolojik testler ortaya konmuştur. Örneğin; Ashimoto (1996) A. actinomycetemcomitans, T. forsythia, C. rectus, Ekinella corrodens, P. gingivalis, P. intermedia, P. nigrescens ve T. denticola prevalansının belirlenmesinde PCR metodunu kullanmıştır. Eick ve Pfister (2002) çalışmalarında multipleks PCR yöntemi ile standart kültür yöntemini karşılaştırarak A. actinomycetemcomitans, T. forsythia, P. gingivalis, P. intermedia ve T. denticola bakterilerini araştırmışlardır. Geleneksel PCR tekniğinin kullanıldığı bu mikrobiyolojik testler çok spesifik ve sensitif olsalar da çeşitli limitasyonları da bulunmaktadır. Bu PCR testleri kalitatif veri sağlamaktadır, bu da araştırılan bakterinin sadece prevalansı hakkında bilgi vermektedir. Bu yüzden tekniğin klinikte teşhise ve prognoza yönelik kullanımında sınırlamalar vardır. Hedef bakterinin kantitatif değerlendirilmesinin önemi PCR yönteminin geliştirilmesine yol açmıştır ve ilk deneylerde end-point PCR yöntemi kullanılmıştır (Doungudomdacha, 2001; Fujise 2002). Fakat bu teknikte ilk üssel faz göz ardı edilerek doymuş fazda PCR ürünü elde edilir bu nedenle PCR ürünü miktarı ve başlangıç DNA miktarı ile arasında zayıf ilişki elde edilir. Bu sorunun üstesinden gelmek için Real-time PCR deneyleri geliştirilmiştir. Bu teknolojinin geliştirilmesiyle ve hücre başına tek gen kopyası kullanılması yolu ile ölçülen

64 47 floresan sinyal ile hücrelerin sayısı arasında iyi bir ilişki elde edilmiştir (Lyons, 2000; Shelbourne 2000). Morillo ve ark.(2003) tek kopya gen sekansını temel alan bir Real-time PCR tekniğini kullanarak subgingival plakta A. actinomycetemcomitans ve P. gingivalis varlığını değerlendirmişlerdir. Bu deneyde tekniğin yüksek derecede spesifik olduğu, tekrarlanabilirlik özelliğinin bulunduğu ve patojenik türlerin tanımlanmasında kullanılabilecek bir yöntem olduğu gösterilmiştir. Real-time PCR yöntemi bakterilerin saptanmasında son derecede hassas ve spesifik olması ve tekrarlanabilirlik avantajları bulunmasına rağmen pahalı bir laboratuar yöntemidir Amaç Halk arasında hamileliğin doğal bir sonucuymuşcasına kabullenilen diş kayıplarının asıl nedenleri çürük veya ileri periodontal hastalıktır. Hamilelikte dişeti hastalıklarının daha sık oluştuğu ve bu durumun hamilelik sırasında hücresel bağışıklık sistemindeki ve hormon seviyelerindeki değişikliklere bağlı olduğu bilinir. Hamilelikte dişetinde meydana gelen bu değişimler profesyonel bakım ve yeterli oral hijyen sağlanması halinde tedavi edilebilecek durumlardır. Ancak, hamilelik sonrasında profesyonel bakım yapılmaması ve hastaların yeterli oral hijyen sağlamamaya devam etmesi durumunda gingival hastalık periodontal dokulara ilerler. Periodontal dokularda meydana gelen değişiklikler geri dönüşümsüzdür. Akut durumlar haricinde periodontal hastalıkların ağrısız olması ve genellikle hasta tarafından fark edilecek belirtilerinin olmaması nedeni ile hastalar tedavi gereksinimi hissetmezler. Hamilelik sırasında meydana gelen periodontal hastalık doğum sonrasında tedavi edilmediği takdirde ilerlemeye devam eder ve diş kaybı kaçınılmaz hale gelebilir. Ayrıca son yıllarda yapılan araştırmalar periodontal hastalığın hamilenin sistemik durumunu etkilediği gibi fetüsün de sağlığını etkileyebildiğini ve düşük, erken doğum ve düşük doğum ağırlıklı bebek riskini artırdığını ortaya koymuştur. Erken doğan ve düşük doğum ağırlıklı bebeklerin okul çağında öğrenme problemleri, dikkat eksiklikleri ve nöromotor gelişim problemlerine sahip olabildiklerine dikkat

65 48 çekilmiştir (Offenbacher, 1998). Erken doğum ve düşük doğum ağırlığı ile periodontal hastalık arasındaki ilişki enfeksiyona bağlı bir ilişkidir. Hamilelik gingivitisi hamilelik döneminde meydana gelen gingivitis tablosu için tanımlayıcı bir terimdir. Klinik olarak hamile olmayanlarda görülen gingivitisle benzer olmakla beraber etiyolojisi kesin olarak bilinmemektedir. Bunun yanında hamilelik esnasında maternal immün değişiklikler ve hormonal dengedeki değişimlerin hamilelik gingivitisi gelişiminde rol oynadığı bilinmektedir. Hamilelikte subgingival florada anaerobik bakterilerin aerobik bakterilere oranı artar. Ayrıca P. intermedia cinsiyet hormonlarını büyüme faktörü olarak kullanır ve hamilelikte subgingival ortamda bulunma oranı artar. P. intermedia nın yanı sıra C. rectus un da ortamda bulunan östrojeni büyüme faktörü olarak kullandığı; kültür ortamına östrojen eklendiğinde bakteri büyümesinin arttığını gösteren ve hamile kadınların tükürük örneklerinde östrojen konsantrasyonunun artması ile C. rectus seviyelerinin de arttığını gösteren çalışmalar ile desteklenmiştir (Yokoyama, 2008). Hamilelikte periodontal hastalıkların etiyolojik faktörlerine değinen çalışmalarda subgingival ortamda bakteri varlığına odaklanan birçok çalışma yapılmıştır. Çoğu çalışmada klinik ataşman kaybının bulunduğu ve cep derinliğinin fazla olduğu durumlar değerlendirilirken, cep derinliğinin az olduğu ve klinik ataşman kaybının olmadığı gingivitis olgusu tek başına değerlendirilmemiştir. Gingivitis olgusunun çalışma dahilinde olduğu durumlarda gingivitise sahip bireylerin yanı sıra başlangıç periodontitis lezyonlarına sahip bireyler de ayırt edilmeksizin çalışmaya dahil edilmiştir. Gingivitisin tek başına değerlendirildiği sığ ceplere sahip hamilelerin test grubu olarak değerlendirildiği çalışmalarda ise hamilelik gingivitisi değil, deneysel gingivitis modeli oluşturularak araştırılmıştır (Raber-Durlacher, 1994). Yaptığımız literatür taraması sonucunda; hamilelik ve olumsuz hamilelik sonuçlarını araştıran birçok çalışmada A. actinomycetemcomitans, P. intermedia, P. nigrescens, C. rectus, T. forsythia, T. denticola, P. gingivalis gibi periodontopatojen bakteriler değerlendirilirken, sıklıkla sağlıkla ilişkilendirilen Streptokok ve Actinomyces grubu bakteriler değerlendirilmemiştir.

66 49 Ülkemizde yapılan çalışmalar arasında da hamilelik gingivitisi mikrobiyolojik verilerle değerlendirilmemiştir. Bu konuda yapılacak çalışmalar kuşkusuz bulunduğumuz coğrafyada ve toplumumuzda bu hastalarda subgingival plakta bulunan mikroorganizmalar ile ilgili arşiv oluşturulması bakımından önemlidir. Ayrıca ilerlemiş yıkıcı periodontal hastalıkların yenidoğanda neden olabileceği sağlık problemlerinin ülke ekonomisine getireceği yükün önüne geçilmesi amacıyla annedeki periodontal hastalıkların daha başlangıç halindeyken koruyucu önlemlerle durdurulması, üzerinde durulması gereken önemli konulardandır. Bu hedef için hamilelik gingivitisinin toplumumuzda kadınları ne ölçüde etkilediğinin araştırılıp bilinmesi gerekmektedir. Bu çalışmada, hamilelik gingivitisi tablosuna sahip kadınlar ile aynı yaş aralığında daha önceden doğum yapmamış ve hamile grupla benzer periodontal duruma sahip hamile olmayan kadınlardan elde edilen subgingival plak örneklerinde polimeraz zincir reaksiyonu metodu kullanarak periodontopatojen olan ve olmayan bakterilerin varlığını iki grup arasında karşılaştırıp sonuçların klinik parametreler ile ilişkisini ortaya koymayı amaçlanmıştır.

67 50 2. GEREÇ VE YÖNTEM Çalışma, Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Etik Kurulu nun tarih ve 114 sayılı kararı dahilinde, Sosyal Sigortalar Kurumu Etlik Kadın Hastalıkları Eğitim Hastanesi ve Doğumevi (2005) yılında değiştirilen adı ile Sağlık Bakanlığı Ankara Etlik Doğumevi ve Kadın Hastalıkları Eğitim ve Araştırma Hastanesi) EPK Kurulu nun tarih ve 77 sayılı kararı dahilinde etik açıdan uygun olduğuna karar verilerek yürütülmüştür Araştırmaya Dahil Edilen Bireylerin Tanımı Araştırmanın hasta grubunu Sağlık Bakanlığı Ankara Etlik Doğumevi ve Kadın Hastalıkları Eğitim ve Araştırma Hastanesi Gebe Polikliniği ne muayene başvurusunda bulunan 70 hamile kadın, kontrol grubunu Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Periodontoloji Anabilim Dalı na dişeti hastalığı şikayetiyle başvuran hamile olmayan 40 kadın oluşturdu. Yaşları aralığında olan ve aşağıdaki dahil edilme kriterlerine uyan kadınlar araştırma gruplarını oluşturdu; Periodontal sağlıklarını etkileyecek herhangi bir sistemik hastalığı olmayan, Son 6 ay içerisinde periodontal tedavi görmemiş ve antibiyotik kullanmamış olan, Sigara kullanmayan, En az 20 doğal dişi olan, Ağzında gingivitis tablosu bulunan,

68 51 Daha önceden kendisine veya eşine kan/ doku nakli yapılmamış olan kadınlar çalışmaya dahil edildi. Araştırmanın test grubunu oluşturan hamilelerde; Daha önceden doğum yapmamış olma, Kontrol grubunu oluşturan kadınlarda; Daha önceden doğum hikayesinin olmaması, Hamile grubuyla aynı yaş aralığında olma, Muayene sırasında menstrüel dönemde olmama, Hormon veya oral kontraseptif kullanmıyor olma kriterleri göz önünde bulunduruldu. Bu kriterlere uyan hastaların, Ankara Üniversitesi Diş Hekimliği Fakültesi Etik Kurulu tarafından onaylanmış Bilgilendirilmiş Hasta Onay Formu nu okuyup imzalamış olmalarına dikkat edildi Araştırmaya Katılan Kadınlara Ait Kişisel Bilgilerin Elde Edilmesi Araştırmaya dahil edilen hamile ve hamile olmayan kadınların kişisel bilgileri anamnez sorularıyla elde edildi (Şekil )

69 52 Adınız: Soyadınız: Doğum tarihiniz: Mesleğiniz: Tel no: Eğitim seviyeniz nedir? a) Okuma-yazma bilmiyor b) Đlkokul c) Ortaokul d) Lise e)üniversite f) Yüksek lisans g) Yüksek okul Sigara kullanıyor musunuz? a) Evet b) Hayır Dişlerinizi günde kaç kez fırçalarsınız? a) Hiç fırçalamam b) Günde 1 kez c) Günde 2 kez d) Günde 3 kez Dişlerinizin arasını temizlemek için herhangi bir araç kullanıyor musunuz? a) Kullanmıyorum b) Diş ipi kullanıyorum c) Kürdan kullanıyorum d) Diş arası fırçası kullanıyorum Dişlerinizin arasını ne zaman temizliyorsunuz? a) Temizlemiyorum b) Bir şey sıkışıp rahatsız ettiğinde c) Günde 1 kez d) Günde 2 kez Düzenli olarak diş hekimine muayene oluyor musunuz? a) Evet b) Hayır En son diş hekimine ne zaman gittiniz? a) 6 ay önce b) 1 yıl önce c) 2 yıl önce d) Hiç gitmedim Dişlerinizi fırçalarken kanama oluyor mu? a) Evet b) Hayır Diş etlerinizde zaman zaman şişme olur mu? a) Evet b) Hayır Dişlerinizde sallanma var mı? a) Evet b) Hayır Şekil Araştırma ve muayene formu

70 53 Ağzınızdan nefes alır mısınız? a) Evet b) Hayır Diş sıkma, gıcırdatma alışkanlığınız var mı? a) Evet b) Hayır Ailenizde diş eti hastalığı olan var mı? a) Evet b) Hayır Daha önceden diş eti hastalığından dolayı tedavi gördünüz mü? a) Hayır b) Diş taşı temizliği c) Küretaj d) Flep operasyonu Son 6 aydır diş eti tedavisi gördünüz mü? a) Evet b) Hayır Herhangi bir hastalığınız var mı? a) Evet b) Hayır Başka bir hastalığınız varsa lütfen ismini yazınız. Gebeliğinizin kaçıncı haftasındasınız? Daha önceden gebelik durumunuz oldu mu? a) Evet b) Hayır Riskli gebelik durumunuz var mı? a) Evet b) Hayır Riskli gebelik durumunuz varsa nedeni nedir? Son 6 aydır herhangi bir antibiyotik kullandınız mı? a) Evet b) Hayır Size veya eşinize kan transfüzyonu yapıldı mı? a) Evet b) Hayır Size veya eşinize doku transfüzyonu yapıldı mı? a) Evet b) Hayır Şekil Araştırma ve muayene formu (Devam) Hamile grubunun hamileliğinin kaçıncı haftasında oldukları hastane dosyalarından elde edildi.

71 Klinik Ölçümler Çalışmaya katılmayı kabul eden ve dahil edilme kriterlerine uyan hamile ve hamile olmayan kadınların periodontal durumlarının belirlenmesinde kullanılan ölçümler aşağıda açıklanmıştır. Her iki grupta 3. molar dişler değerlendirmeye alınmadı. Plak Đndeksi (PlI; Sillness, 1964): Çalışmaya katılan tüm bireylerin ağız hijyen düzeylerinin belirlenmesi amacıyla, ağızdaki tüm dişlerin dört yüzeyinden (mezial, bukkal, distal ve palatinal/ lingual) plak indeksi skorları 0, 1, 2, 3 olarak kaydedildi. Gingival Đndeks (GI; Löe, 1963): Dişlerin marjinal gingival bölgesindeki enflamasyon düzeylerinin belirlenmesi için tüm dişlerin dört yüzeyinden gingival indeks skorları 0, 1, 2, 3 olacak şekilde kaydedildi. Sondalamada Kanama Đndeksi (BOP): Bireylerin tüm dişlerinin dört yüzeyinde, periodontal cepteki enflamasyon durumu ile ilgili bilgi vermesi amacıyla, periodontal cebin sondalanmasını takiben saniye içinde oluşan kanamaya göre var veya yok olarak kaydedildi. Sondalamada cep derinliği (CD): Subgingival plak örnekleri alındıktan sonra ağızdaki tüm dişlerin dört yüzeyinden kaydedildi. Klinik Ataşman Düzeyi (KAD): Tüm dişlerin dört yüzeyinde cep tabanı ile minesement sınırı arasındaki mesafe periodontal sonda ile milimetrik olarak ölçülüp kaydedildi. Ataşman kaybı olan bireyler çalışma dışı bırakıldı Subgingival Plak Örneklerinin Toplanması Plak ve gingival indeks değerleri kaydedildikten sonra subgingival plağın analizinin yapılabilmesi için subgingival plak örnekleri her bireyin hem sağlıklı hem de gingivitisli bölgelerinden dublike olarak toplandı. Toplanan iki set örnekten bir seti Hamilelik gingivitisinde subgingival plakta sitomegalovirüs ve Epstein-Barr virüs varlığının klinik parametreler ile ilişkisinin araştırılması başlıklı tez çalışmasında (Erdem, 2007) virüs saptanması için kullanılmıştır diğer seti ise bu çalışmada bakteri saptanması için kullanılmıştır. Subgingival plak örnekleri subgingival florayı değiştirmemek için cep derinliği ölçümü yapılmadan ve sondalamada kanama varlığı değerlendirilmeden önce elde edildi. Subgingival örneklerin alınması için bölge

72 55 pamuk rulolarla tükürükten izole edildi. Kontaminasyonu önlemek için supragingival plak steril pamuk pelet yardımıyla uzaklaştırıldı. Hamile ve hamile olmayan kadınların gingivitisli ve sağlıklı dişeti özelliklerine sahip üçer bölgesine ayrı ayrı steril paper pointler yerleştirilerek 30 saniye bekletildi. Gingivitisli ve sağlıklı bölgelere yerleştirilen 3 er paper point bir araya getirilerek 100 µl tris Etilendiamin tetraasetikasit (TE) buffer içeren eppendorf tüplere aktarıldı. Tüpler buz içerisine yerleştirildi. Elde edilen subgingival plak örnekleri buz içerisinde en geç 1 saat içerisinde laboratuara nakledildi. Örnekler vortekslendikten sonra DNA ekstraksiyonu yapılana kadar 20 ºC de bekletildi Laboratuar Aşamaları Subgingival plak örneklerinin PCR yöntemi ile analizi Ashimoto ve ark. (1996) metoduna uygun olarak yapılmıştır Kaynatma Yöntemi ile DNA Ekstraksiyonu Eppendorf tüpler içerisinde bulunan 100 µl plak örnekleri buz üzerinde çözündürüldükten sonra 30 sn vortekslenip, rpm de 15 saniye olacak şekilde kısa santrifüj yapıldı, paper pointler çıkarıldıktan sonra tekrar 2500 xg de 4 dakika santrifüj yapıldı, pelete dokunmadan supernatant uzaklaştırıldı, 100 µl distile su ilave edilip tekrar vortekslendikten sonra daha önceden ısıtılmış kuru ısı bloğuna yerleştirildi ve 100 ºC de 10 dakika kuru blokta kaynatıldı, kuru ısı bloğundan alınan örnekler buz üzerinde soğumaya bırakıldı. Tüpler rpm de 10 dakika santrifüj edildi ve supernatant her PCR analizi için 5 µl kullanılmak üzere saklandı PCR da kullanılan primer dizinleri Çalışmada varlıkları araştırılan bakteri türüne spesifik primerler Çizelge de gösterilmiştir.

73 56 Çizelge PCR da kullanılan türe spesifik primerler Primer Adı Dizini (5 3 ) Ürün Büyüklüğü (bç) Kaynak A. actinomycetemcomitans AAA CCC ATC TCT GAG TTC TTC TTC ATG CCA ACT TGA CGT TAA AT 557 Ashimoto ve ark T. forsythia GCG TAT GTA ACC TGC CCG CA Ashimoto ve ark. 641 TGC TTC AGT GTC AGT TAT ACC T 1996 C. rectus TTT CGG AGC GTA AAC TCC TTT TC Ashimoto ve ark. 598 TTT CTG CAA GCA GAC ACT CTT 1996 P. gingivalis AGG CAG CTT GCC ATA CTG CG Ashimoto ve ark. 404 ACT GTT AGC AAC TAC CGA TGT 1996 P. intermedia TTT GTT GGG GAG TAA AGC GGG TCA ACA Ashimoto ve ark. 575 TCT CTG TAT CCT GCG T 1996 P. nigrescens ATG AAA CAA AGG TTT TCC GGT AAG Ashimoto ve ark. 804 CCC ACG TGT CTG TGG GCT GCG A 1996 T. denticola TAA TAC CGA ATG TGC TCA TTT ACA T Ashimoto ve ark. 316 TCA AAG AAG CAT TCC CTC TTC TTC TTA 1996 S. sanguinis GAT TGA CCA AGA ACG CCG GGC T Li ve ark CGC ATG ATA TCA GAG ATG CAA CCC 2003 A. viscosus GTG AAG GAG CCA GCT TGC TGG TTC TG Xia ve ark. 155 CGG AAC AAA CCT TTC CCA GGC 2003 A. actinomycetemcomitans pozitif değerlendirilen örnekler 480-1,034 baz çifti aralığında bulunurken, T. forsythia , C. rectus 415-1,012, P. gingivalis 729-1,132, P. intermedia 458-1,032, P. nigrescens 219-1,022, T. denticola , A. viscosus baz çifti aralığında pozitif kabul edilmiştir.

74 Polimeraz Zincir Reaksiyonu Bu çalışmada bireylerden toplanan plak örneklerinde DNA saflaştırma işlemi yapıldıktan sonra bakteri varlığını tespit etmek amacıyla PCR metodu kullanıldı. PCR yönteminde her bakteri için farklı çift primer seti kullanıldı PCR Reaksiyon Karışımının (Master miks) Hesaplanması ve Kullanılan Thermal Cycler Programları Kontaminasyondan kaynaklanabilecek hatalı pozitiflerin önüne geçmek için negatif kontrol yerine distile su kullanıldı. Deneyin çalışıp çalışmadığını kontrol için pozitif kontroller kullanıldı. Pozitif kontroller için önceden uygun besiyerlerinde üretilip DNA ekstraksiyonları yapılmış bakteri türleri kullanıldı. Bu bakteri türleri aşağıdaki gibidir. A. actinomycetemcomitans NCTC 9710 C. rectus ATCC P. gingivalis FDC 381 P. intermedia ATCC P. nigrescens ATCC T. denticola ATCC A. viscosus ATCC S. sanguinis ATCC T. forsythia FDC 338 Her PCR testi hasta örneklerinin yanı sıra pozitif ve negatif kontroller kullanılarak tekrarlandı. PCR reaksiyon karışımı aşağıdaki miktarlar kaç örnek için çalışılacaksa o sayı ile çarpılarak hesaplandı ve 1,5 ml lik eppendorf tüpü içerisinde hazırlandı. Elde edilen master miks pipet yardımıyla karıştırıldıktan sonra 45 µl master mikse 5 µl DNA ilave edilerek 200 µl lik PCR tüplerinde reaksiyon başlatılmak üzere thermal cycler a yerleştirildi.

75 58 Çizelge A. actinomycetemcomitans, P. nigrescens, P. intermedia bakterileri için master miks hazırlanması ve PCR koşulları 5X PCR Buffer 30,0 µl PCR Amplifikasyon Koşulları MgCl 2 dntp Primer Final (mm) konsantrasyon 1 µl Vol (µl) 6 µl Final (mm) konsantrasyon 0,2 µl Vol (µl) 3,0 Ön Denaturasyon 95 ºC 2 dk 1 siklus Final miktar (pmol) 20 µl Amplifikasyon Forward 0,6 µl Reverse 0,6 µl 94 ºC 30 sn Distile su 94 µl 55 ºC 1 dk Taq Polimeraz 0,8 µl 72 ºC 2 dk Final Ekstansiyon 36 siklus Template DNA 5 µl 72 ºC 10 dk 1siklus Çizelge T. forsythia, C. rectus, P. gingivalis, T.denticola bakterileri için master miks hazırlanması ve PCR koşulları 5X PCR Buffer 30,0 µl PCR Amplifikasyon Koşulları MgCl 2 dntp Primer Final (mm) konsantrasyon 1,5 µl Vol (µl) 9 µl Final (mm) konsantrasyon 0,2 µl Vol (µl) 3,0 Ön Denaturasyon 95 ºC 2 dk 1 siklus Final miktar (pmol) 20 µl Amplifikasyon Forward 0,6 µl Reverse 0,6 µl 94 ºC 30 sn Distile su 91 µl 55 ºC 1 dk Taq Polimeraz 0,8 µl 72 ºC 2 dk Final Ekstansiyon 36 siklus Template DNA 5 µl 72 ºC 10 dk 1siklus

76 59 Çizelge A. viscosus için master miks hazırlanması ve PCR koşulları 5X PCR Buffer 20,0 µl PCR Amplifikasyon Koşulları MgCl 2 Final konsantrasyon (mm) 1,5 µl Vol (µl) 6 µl Ön Denaturasyon dntp Final konsantrasyon (mm) 0,2 µl Vol (µl) 2,0 95 ºC 2 dk 1 siklus Final miktar (pmol) 20 µl Amplifikasyon Primer Forward 0,4 µl Reverse 0,4 µl 94 ºC 30 sn Distile su 61 µl 55 ºC 1 dk 36 siklus Taq Polimeraz 0,5 µl 72 ºC 2 dk Final Ekstansiyon Template DNA 5 µl 72 ºC 10 dk 1siklus Çizelge S. sanguinis için master miks hazırlanması ve PCR koşulları 5X PCR Buffer 20,0 µl PCR Amplifikasyon Koşulları MgCl 2 Final konsantrasyon (mm) 1,5 µl Vol (µl) 6 µl Ön Denaturasyon dntp Final konsantrasyon (mm) 0,2 µl Vol (µl) 2,0 95 ºC 2 dk 1 siklus Final miktar (pmol) 20 µl Amplifikasyon Primer Forward 0,4 µl Reverse 0,4 µl 95 ºC 30 sn Distile su 61 µl 60 ºC 30 sn 30 siklus Taq Polimeraz 0,5 µl 72 ºC 1 dk Final Ekstansiyon Template DNA 5 µl 72 ºC 10 dk 1siklus

77 Jel Boyama ve Görüntüleme Đşlemleri Bu çalışmada tampon solüsyon olarak TBE kullanıldı (Fermentas Life Sciences 10 X TBE). Agaroz jel hazırlanacağı zaman 10X stok TBE den distile su ile 0,5X e seyreltildi. PCR ürünleri 0,5X TBE içinde hazırlanmış %1 lik bir agaroz jelde 5 µl EtBr (5 µg/ml; Sigma, Almanya) içerecek şekilde elektroforez işlemi gerçekleştirildi. Elektroforez tankının tablasına, daha sonra PCR ürünlerinin yüklenebilmesi için kuyucuklar oluşturacak şekilde taraklar, kontrol edilecek örnek sayısına göre yerleştirildi. Hazırlanan jel, elektroforez tankının tablasına dökülüp, donması beklendi. Agaroz jel tamamen donduktan sonra taraklar örnek gözleri yırtılmaksızın çıkartıldı. Tabla ve üzerindeki jel, içerisinde 0,5X TBE tampon solüsyonu bulunan tankın içine yerleştirildi. Jelin her iki sırasındaki ilk kuyucuğa 100 baz çifti ağırlığındaki DNA merdiveni (Fermentas, Litvanya) veya 1000 baz çifti ağırlığındaki DNA merdiveni yüklendi. Diğer kuyucuklara da PCR ürünü yüklendi. Örnekler agaroz jele yüklenirken, 10 µl örnek 2 µl 6X yükleme boyası ile karıştırıldı ve 12 µl toplam hacimde gözlere yerleştirildi. Yükleme işlemi tamamlandıktan sonra elektroforez güç kaynağı açılarak jele 4 Volt/cm olacak şekilde elektrik akımı uygulandı ve örnekler koşturuldu. Jel ultraviole transiluminatör cihazında gözlenerek PCR ürünlerinin DNA merdiveni paralelinde görüntüleri elde edildi ve PCR ürünlerinin yaklaşık büyüklükleri tespit edildi Veri Analiz Yöntemleri Çalışma sırasında tüm klinik periodontal ölçümler ve değerlendirmeler yapıldıktan sonra ve laboratuar işlemleri tamamlandıktan sonra elde edilen tüm veriler SPSS for

78 61 Windows istatistiksel analiz programı kullanılarak bilgisayar ortamına taşındı. Çalışmanın istatistiksel değerlendirmeleri Gülhane Askeri Tıp Akademisi Halk Sağlığı Anabilim Dalı nda yapıldı. Test ve kontrol gruplarının yaş ortalamaları, gruplar arasında elde edilen klinik periodontal parametreler Mann-Whitney U testi kullanılarak değerlendirildi. Grupların meslekleri, eğitim düzeyleri ve anket soruları yoluyla kaydedilen bilgilerin kıyaslanması için ki-kare testi veya Fisher s exact test kullanıldı. Gruplar arasında bakteri saptanan bölgelerin yüzdeleri ki-kare testi kullanılarak değerlendirildi. Hastaların sağlıklı ve gingivitisli bölgelerindeki bakteri saptanma durumlarının karşılaştırılmasında McNemar testi kullanıldı. Test grubunda bakteri varlığının düşük doğum ağırlığı ve erken doğum ile ilişkisinin araştırılmasında Fisher s exact test kullanıldı. Risk analizi tek değişkenli lojistik regresyon analizi ile hesaplandı.

79 62 3. BULGULAR Demografik Bulgular Bu çalışmadaki demografik bulgular projenin ilk bölümü olan Hamilelik Gingivitisinde Subgingival Plakta Sitomegalovirüs ve Epstein-Barr Virüs Varlığının Klinik Parametreler ile Đlişkisinin Araştırılması başlıklı tez çalışmasında (Erdem, 2007) gösterildiği gibidir ve aynıdır (Tablo 3.1, 3.2, 3.3). Çizelge Araştırmaya katılan test ve kontrol gruplarının yaş ortalamaları ve sosyokültürel özellikleri Test grubu (n=70) Kontrol grubu (n=40) Yaş aralığı 23,929±4,048 24,250±3,334 0,671 ns Meslek Eğitim düzeyi Ev hanımı Memur 6 1 Đşçi 2 0 Öğrenci 1 21 Serbest 5 5 Đlkokul 23 1 Ortaokul 6 4 Lise Üniversite 3 11 Yüksek lisans 1 1 Yüksek okul 5 3 *** p<0,001 ns: istatistiksel olarak anlamlı fark yok Test p<0,001 0,001***

80 63 Çizelge Test ve kontrol gruplarında oral hijyen alışkanlıklarının değerlendirilmesi Test grubu (n=70) Kontrol grubu (n=40) Test Diş fırçalama alışkanlıkları Arayüz temizleme aracı kullanımı Arayüz temizleme aracı kullanım sıklığı Fırçalama yok 9 1 Günde 1 defa Günde 2 defa Günde 3 defa 2 2 Yok Diş ipi 2 8 Kürdan 15 5 Arayüz fırçası 0 0 Yok Gıda sıkışınca Günde 1 defa 4 2 Günde 2 defa 0 0 0,047* 0,008** 0,994ns Düzenli diş hekimi Evet 1 3 muayenesi Hayır ,136ns En son muayene olma zamanı Hiç ay önce sene önce sene önce ,038* * p<0,05 ** p<0,01 ns: istatistiksel olarak anlamlı fark yok

81 64 Çizelge Test ve kontrol gruplarının periodontal durumları ile ilgili şikayetlerinin değerlendirilmesi Test grubu (n=70) Kontrol grubu (n=40) Test Dişeti kanaması Dişetinde şişlik Mobilite Ağız solunumu Bruksizm Aile hikayesi Periodontal tedavi şekli Evet Hayır 3 3 Evet Hayır Evet 11 5 Hayır Evet Hayır Evet Hayır Evet Hayır Yok Detartraj Küretaj 1 0 Flep 0 1 0,666ns 0,638ns 0,646ns 0,609ns 0,064ns 0,030* 0,003** * p<0,05 ** p<0,01 ns: istatistiksel olarak anlamlı fark yok Klinik Bulgular Bu çalışmadaki klinik bulgular projenin ilk bölümü olan Hamilelik Gingivitisinde Subgingival Plakta Sitomegalovirüs ve Epstein-Barr Virüs Varlığının Klinik Parametreler ile Đlişkisinin Araştırılması başlıklı tez çalışmasında (Erdem, 2007) gösterildiği gibidir ve aynıdır (Tablo 3.4, 3.5, 3.6).

82 65 Çizelge Araştırmaya katılan test ve kontrol gruplarında klinik periodontal parametrelerin karşılaştırılması Test grubu (n=70) Kontrol grubu (n=40) Test PlI 1,009±0,270 0,991±0,303 0,747ns GI 0,910±0,290 0,975±0,271 0,242ns CD 2,720±0,404 2,773±0,349 0,474ns BOP 56,214±32,190 56,200±24,408 0,998ns ns: istatistiksel olarak anlamlı fark yok Çizelge Araştırmaya katılan test ve kontrol gruplarında gingivitisli ve sağlıklı bölgelere ait klinik periodontal parametrelerin karşılaştırılması Test grubu (n=70) Kontrol grubu (n=40) Test PlI 1,442±0,442 1,489±0,494 0,608 ns Gingivitisli bölge GI 1,733±0,460 1,728±0,518 0,962 ns CD 4,246±1,057 3,653±0,953 0,004 ** BOP 80,329±26,189 83,925±24,775 0,481 ns PlI 0,478±0,518 0,540±0,567 0,561 ns Sağlıklı bölge GI 0,452±0,518 0,438±0,479 0,887 ns CD 2,356±0,716 2,075±0,387 0,024 * BOP 50,714±43,575 36,500±37,341 0,086 ns * p<0,05 ** p<0,01 ns: istatistiksel olarak anlamlı fark yok

83 66 Çizelge Araştırmaya katılan test ve kontrol gruplarında plak örneği alınan gingivitisli ve sağlıklı bölgelerin periodontal parametrelerinin karşılaştırılması Gingivitisli bölge Sağlıklı bölge Test PlI 1,442±0,442 0,478±0,518 p<0,001 Test grubu (n=70) GI 1,733±0,460 0,452±0,518 p<0,001 CD 4,246±1,057 2,356±0,716 p<0,001 BOP 80,329±26,189 50,714±43,575 p<0,001 PlI 1,489±0,494 0,540±0,567 p<0,001 Kontrol grubu GI 1,728±0,518 0,438±0,479 p<0,001 (n=40) CD 3,653±0,953 2,075±0,387 p<0,001 BOP 83,925±24,775 36,500±37,341 p<0,001 *** p<0, Bakteriyolojik Değerlendirme Bulguları Bu çalışmaya dahil edilen bireylerin subgingival plak örneklerinden elde edilen DNA lar PCR yöntemi ile hedef bakteriler için test edildikten ve elektroforez işleminden sonra elde edilen jel görüntülerinde ürün büyüklüklerine göre pozitif ve ya negatif olarak değerlendirildi (Resim 3.1 ve 3.2).

84 67 Resim 3.1. A. actinomycetemcomitans, C. rectus, P. intermedia, A. viscosus, T. denticola, T. forsythia, P. gingivalis ve P. nigrescens pozitif ve negatif bireylerin jel görüntüsü Resim 3.2. S. sanguinis pozitif ve negatif bireylerin jel görüntüsü