Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR: Polymerase Chain Reaction) Ayten AŞKIN KILINÇ Veteriner Hekim

Transkript

1 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR: Polymerase Chain Reaction) Ayten AŞKIN KILINÇ Veteriner Hekim

2 PCR nedir? DNA Polimeraz enzimi kullanılarak DNA nın spesifik bir parçasının in vitro (bir tüp içerisinde) yöntemle çoğaltılmasıdır.

3 İlk kez 1985 yılında PCR ile ilgili bilgiler Kary Mullis adlı bir biyokimyacı tarafından ortaya konmuştur. Bu buluşundan dolayı K. Mullis, 1993yılı Nobel Kimya Ödülünü kazanmıştır. PCR ABD'de Cetus şirketinde çalışan Henry A. Erlich, Kary Mullis ve Randall K. Saiki tarafından geliştirilmiştir.

4 Kullanım Alanları: Kalıtsal hastalıklarda taşıyıcının ve hastanın tanısı Prenatal tanıda Klinik örneklerde patojen organizmaların saptanması Adli tıpta Onkogenesisin araştırılmasında Klonlamada, gen tanısı araştırmalarında

5 Nokta mutasyonlarının belirlenmesinde DNA dizi analizinde, büyük miktarda DNA örneklerinin oluşturulmasında Bilinmeyen dizi tayininde Evrimin aydınlatılmasında İn vitro fertilization yapılan tek hücrede, implantasyon öncesi genetik testlerin yapılmasında DNA-protein interaksiyonunun araştırılmasında

6 Avantajı: PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile çalışmaya olanak sağlamaktadır. Yöntem hassas ve hızlıdır. Bir çok durumda radyoaktivite kullanımını gereksiz hale getirmiştir.

7 Dezavantajı: Pahalı laboratuar ekipmanlarına ihtiyaç vardır. Uzman personel gerektirir. Kullanılan sarf malzemeler pahalıdır. Kontaminasyona bağlı hatalı sonuçlar alınabilir.

8 Verimli bir PCR için ; -Denatürasyon, -Primerlerin bağlanması, -Primerlerin uzaması, -Döngü sayısı, -Thermal cycler ın iniş-çıkış sürelerinin, optimizasyonu ve standardizasyonu yapılmalıdır.

9 PCR tekniği, temel olarak üç basamaktan oluşmaktadır. Denatürasyon: C de 3-5 dakika DNA zincirini ayırmak için, bazı durumlarda 5-10 dakika ön ısıtma yapmak gerekebilir. Bağlanma (Annealing): C de, 3-5 dakika Uzama (Extension- Elongation): C de, 2 dakika PCR sonucunda elde edilen ürün, çoğaltılması hedeflenen DNA parçası ile iki primerin toplam uzunluğu kadardır.

10

11 Üç basamaktan (denaturation, annealing, primer extension) oluşan işlem, bir PCR devrini temsil eder. Bu işlem, genel olarak 25 ile 40 defa tekrar edilerek başlangıçtaki DNA dizisinden milyonlarca yeni DNA parçacığı çoğaltılır. PCR sonucunda elde edilen DNA parçacıkları agaroz veya poliakrilamit jellerde yürütüldükten sonra, ethidium bromide (EtBr) veya gümüş nitrat (GN) ile boyanarak gözlemlenir.

12 PCR boyunca biriken ürünlerin boyu, iki primerin boyu ve hedef DNA bölgeleri arasındaki mesafelerin toplamı kadardır. Matematiksel olarak amplifikasyon; (2 n -2n)X ile hesaplanır. n=döngü sayısı 2n= birinci ve ikinci döngü sonucunda oluşan boyları bilinmeyen ürünler X= orijinal kalıbın kopya sayısı Her döngü %100 verimle çalışsa 20 döngü sonunda 2 20 kat ürün oluşur.

13

14

15

16

17

18 PCR ın Temel Öğeleri: Kalıp olarak kullanılan DNA molekülü PCR de; genomik DNA lar, plazmid ve faj DNA ları çeşitli genler ve hatta herhangi bir DNA parçası kalıp olarak kullanılabilir. PCR da kalıp olarak DNA nın yanı sıra RNA da kullanılabilir.

19 DNA polimeraz enzimi DNA polimeraz enzimleri, kalıp ipliğe tamamlayıcı bir DNA ipliği meydana getirmek üzere, orijinal kalıp iplikteki baz bilgisini kullanarak dört çeşit deoksiribonükleozid trifosfattan uzun polinükleotid zincirin sentezini kataliz eder. Bu enzimler, sentezi başlatmak için kalıp moleküldeki tamamlayıcı diziye bağlanan kısa DNA parçalarına (primerlere) gerek duyarlar. Sentezin yönü, 5 uçtan 3 uca doğru olup, primerin serbest 3 hidroksil ucuna ortamdaki dntp lerin nükleofilik etki yapmalarıyla, fosfodiester bağlarının katalizi ve yeni DNA ipliğinin polimerizasyonu sağlanır.

20 Primerler Gen çoğaltılması dahil PCR nin birçok uygulaması için kalıp DNA ya tamamen tamamlayıcı olan primerlere ihtiyaç vardır. Genel olarak kullanılan kalıp ile yüksek oranda bağlanma sağlamak üzere primerler nükleotid uzunluğundadır.

21 dntp karışımı Deoksirübonükleozid trifosfatlar (datp, dgtp, dttp, dctp) yüksek saflıkta ya tek tek ya da dörtlü karışım halinde ticari olarak sağlanır. Optimal dntp konsantrasyonu; 1. MgCl 2 konsantrasyonuna 2. Reaksiyon koşullarına 3. Primer konsantrasyonuna 4. Çoğaltılmış ürünün boyuna 5. PCR döngü sayısına bağlıdır. Yapılacak PCR için en uygun dntp konsantrasyonu deneysel olarak belirlenmelidir.

22 Tampon ve MgCl 2 PCR de en çok kullanılan tampon Taq/Amplitaq enzimlerine özgü olan tampondur. Diğer enzimler içinde benzeri tamponlar bulunur. MgCl 2 nin reaksiyon karışımındaki final konsantrasyonu değişebilmekle birlikte genellikle 0,5-5,0 mm lıkdeğerlerarasında çalışılır.

23 Mg +2 iyonları; 1. dntp ler ile çözünebilir kompleksler oluştururlar. 2. Polimeraz aktivitesini stimüle(uyarmak) ederler 3. Çift iplikli DNA nın Tm değerini arttırırlar 4. Primer/kalıp etkileşimini sağlarlar. Bu yüzden MgCl 2 ün PCR nin özgüllüğü ve ürün verimi üzerinde çok önemli bir etkisi vardır. Genellikle optimum MgCl 2 konsantrasyonu olarak 1,0-1,5 mm lık değerler tercih edilir. Düşük Mg +2 konsantrasyonu; ürün oluşumunda azalmaya, yüksek Mg +2 konsantrasyonu ise spesifik olmayan ürün birikimine yol açar. MgCl 2 içeren tamponlar kullanılıyorsa, ayrıca MgCl 2 kullanımına gerek yoktur.

24 PCR OPTİMİZASYONU PCR uygulaması için uygun bir şekilde ayarlanmazsa bazı problemlerle karşılaşılabilmektedir. Bu problemler; 1. PCR dan beklenen ürün ya az alınır yada hiç alınmaz. 2. Primerlerin yanlış bağlanmasından dolayı spesifik olmayan bantlar oluşabilir. 3. Primerler yanlış şekilde uzayabilir. 4. Primer-dimer oluşumu ortaya çıkabilir ve bu oluşumlar çoğaltma işlemini yavaşlatır. 5. Yeni sentezlenen DNA dizilerinde mutasyon veya istenilenden farklı diziler ortaya çıkabilir.

25 PCR Çalışma Şartlarını Etkileyen Faktörler Enzim Konsantrasyonu: Diğer PCR şartları optimum seviyede olduğu zaman 100 µl reaksiyon için önerilen Taq DNA polimeraz enzim konsantrasyonu ünitedir. Enzim konsantrasyonu düşük olursa elde edilecek ürün (DNA) az olur. Enzim konsantrasyonu yüksek olursa spesifik olmayan bantlar ortaya çıkabilir.

26 Magnezyum Konsantrasyonu: Çünkü Mg konsantrasyonu primerlerin açılan DNA zincirlerine yapışmasını, kalıp DNA nın açılma sıcaklığını, PCR sonucunda elde edilen DNA kalitesini, primer-dimer bağ oluşumlarını, enzim aktivitesi ve güvenilirliğini etkilemektedir. Ayrıca, Taq DNA polimeraz enziminin iyi bir şekilde çalışabilmesi için; kalıp DNA, primerler ve nükleotid bazları üzerinde serbest Mg iyonlarının bulunması gerekir. Bu yüzden mm arasında Mg iyonlarının dntp konsantrasyonu içerisinde bulunması gerekmektedir.

27 Deoksinükleotid Trifosfatlar (Deoxynucleotide Triphosphates=dNTPs): Her bir deoksinükleotid (A, G, C, T) konsantrasyonu µm arasında olduğunda genellikle PCR uygulamalarından iyi sonuç alınabilmektedir. Bu dört bazın konsantrasyon içerisindeki oranı eşit olmalıdır. Başlangıç stok solüsyonu 10 mm kadar seyreltildikten sonra, küçük hacimlere ayrılarak 20 o C de saklanmalıdır. dntp konsantrasyonunun yüksek olması yeni sentezlenen DNA dizilerinde istenilenden farklı dizilerin (misincorporation) hatalı olarak ortaya çıkmasına sebep olabilir. Bu yüzden mümkün olduğu kadar düşük konsantrasyonda dntp leri kullanmak PCR spesifikliğini ve güvenilirliğini artırmaktadır.

28 Diğer Reaksiyon Unsurları: PCR uygulamalarında genel olarak mm arasında Tris-HCl tampon çözeltisi (ph ) kullanılır. Bu tampon çözeltinin 20 o C de ph sı 6.8 ile 7.8 arasında değişir. PCR karışımı içerisine 50 mm KCl ilave edilirse primer bağlanmasını kolaylaştırır. Fakat 50 mm ın üzerindeki KCl veya 50 mm NaCl Taq DNA polimeraz aktivitesini engeller. Ayrıca, PCR solüsyonuna Jelatin (gelatin), bovine serum albumin veya Tween 20 deterjanı eklenirse enzimin daha iyi çalışmasına yardımcı olurlar. Fakat bu maddeler eklenmeden de PCR protokolleri çok iyi bir şekilde çalışabilmektedir.

29 PCR ÇEŞİTLERİ Yuvalanmış (nested) PCR: Özgün olmayan ürünlerin oluşumunu engelleyen, yüksek özgünlükte bir PCR yöntemi. Bu yönteme göre ardarda 2 PCR yapılır. İlk PCR özgün olmayan ürünlerin oluşumuyla sonuçlanır. 2. PCR ise ilk PCR sonucu çoğaltılmış DNA nın iç kısımlarına ait dizileri içeren NESTED primerleri ile yapılır. İlk PCR ürünleri 2. PCR için kalıp olarak kullanılır ve istenilen hedef bölge çoğaltılarak özgün ürünler elde edilir.

30

31 Anchored (Demirlenmiş) PCR: Çoğaltılacak olan DNA nın sadece bir bölgesinin bilindiği durumda uygulanır. Bilinen bölgeden yaralanılarak ilgilenilen DNA parçasının çoğaltılmasıdır. Çoğaltılacak DNA bilinen bir diziye bağlanır ve bu bilinen dizi 2. primer bölgesi olarak kullanılır.

32 Geri (revers) Transkripsiyon PCR: RNA PCR olarak da adlandırılan RT-PCR, iki aşamalı olup. RNA dan tamamlayıcı DNA sentezi (geri transkripsiyon) ve tamamlayıcı DNA nın da standart PCR yoluyla çoğaltılması aşamalarını kapsar.

33 Asimetrik PCR: Asimetrik PCR yöntemi, fazla miktarda çoğaltılan tek iplikli ürünün dizilenmesi için kullanılır. Bu PCR çeşidinde, kullanılan iki primerden biri miktarca diğerinden çok daha fazladır. Bu nedenle asimetrik PCR sonucu ipliklerden biri diğerinden çok daha fazla miktarda artar. Asimetrik PCR herhangi bir kalıp ipliğe uygulanabilir ancak tek iplikli ürünün fazla miktarda üretilememesi gibi bir sorunla karşılaşılabilir. Bu nedenle çoğunlukla klasik PCR ile önce çift iplikli hedef DNA çoğaltılır, ardından asimetrik PCR uygulamasıyla kalıp yeniden çoğaltılarak tek iplikli ürün yeterli miktarda üretilir.

34 Ters (ınvers) PCR (IPCR): Bilinen bir DNA dizisinden yararlanılarak bu DNA nın her iki ucundaki bilinmeyen bölgelerin çoğaltılması için kullanılır. Bilinen diziyi içeren DNA önce restriksiyon enzim kesimi ile doğrusal ve sonra bilinen DNA yı içerecek şekilde halkasal hale getirilir. Ardından bilinen DNA dizilerine ikinci bir restriksiyon kesimi uygulanmasıyla tekrar doğrusal olarak elde edilen DNA molekülü bilinen dizilere uygun olarak tasarlanan primerler yardımıyla çoğaltılır. Böylece dizisi bilinmeyen DNA parçası çoğaltılmış olur.

35 In Situ PCR: Lam üzerindeki hücre, doku ya da doku parçaları içindeki kalıp DNA nın PCR ile çoğaltılması işlemidir. Bu yöntem viral DNA nın ve tek kopyalı genlerin saptanmasında veya RT-PCR ile birlikte viral RNA ve transkriptlerin belirlenmesinde kullanılır. İn situ PCR, hücre içine PCR bileşenlerinin girişine izin vermek üzere hücre membranları yarı geçirgen hale getirildikten sonra fikse edilmiş hücre veya dokularda kullanılır.

36 Çoklu (Multipleks) PCR: Bir PCR ile birden fazla hedef dizinin birlikte çoğaltılmasıdır. Çoklu PCR, birden fazla bölgeye bağlanan multipleks primerler ile gerçekleştirilir. Bu PCR gen delesyonlarının haritalanması, küçük delesyonların, çerçeve kayması ve nokta mutasyonların analizinde kullanılan bir yöntem olduğundan kistik fibrozis gibi genetik hastalıkların tanısında kullanılabilir.

37 Real Time PCR: Son yıllarda PCR reaksiyonlarında sıcaklık döngüleri sağlamak için kullanılan cihazların (thermocycler) hassas ölçüm aletleriyle birleştirilmesi, gerçek zamanlı (real-time) PCR olarak adlandırılan yeni bir yöntemin gelişmesine neden olmuştur. Real-time PCR da ürünlerin analizi reaksiyon sırasında yapılmaktadır. Bu nedenle, agaroz jel elektroforezi, DNA bantlarının mor ötesi ışık altında görüntülenmesi gibi işlemlerin uygulanmasına gerek kalmamaktadır. Real-time PCR ürünlerinin niteliksel ve sayısal analizlerinde, diziye özgün olmayan floresan boyalardan ya da diziye özgün problardan yararlanılmaktadır.

38

39

40 KAYNAKLAR f KAHYA S., BUYUKCANGAZ E., CARLI K.T. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) Optimizasyonu. Uludag Univ. J. Fac. Vet. Med. 32 (2013), 1: ÇARHAN A., ERCAN E., YALÇINKAYA T. Dijital PZR ve kullanım alanları. Turk Hij Den Biyol Derg, 2016; 73(2):