VDR KOD A Vitamin D reseptör geninde (vdr) polimorfizmlerin belirlenmesi için kit

Transkript

1 KULLANICI KILAVUZU VDR KOD A Vitamin D reseptör geninde (vdr) polimorfizmlerin belirlenmesi için kit

2

3 1. KİT İÇERİĞİ 3 2. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI 4 3. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 4 4. GÜVENLİK KURALLARI Genel güvenlik kuralları Kit hakkında güvenlik kuralları 6 5. KİT İÇERİĞİNDE OLMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Reaktifler Cihazlar Materyaller 7 6. REAKTİFLERİ HAZIRLAMA 8 7. GİRİŞ 9 8. TEST PRENSİBİ ÜRÜN TANIMI ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ Periferik kan PROTOKOL DNA ekstraksiyonu Periferik kandan DNA ekstraksiyonu DNA AMPLİFİKASYONU AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi Örnek yükleme SONUÇLARIN YRUMLANMASI 17 1

4 11.5 POLİMORFİZM TANIMLANMASI VDR B amplifikasyon ürünlerinin enzimatik sindirimi VDR B amplifikasyon ürünlerinin enzimatik sindirimi RESTRİKSİYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi Örnek yükleme RESTRİKSİYON SONUÇLARININ YORUMLANMASI SORUN GİDERME TEST LİMİTLERİ TEST PERFORMANSI Analitik özgünlük BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR SİPARİŞ İÇİN BİLGİLER İlgili ürünler 24 2

5 1. KİT İÇERİĞİ KUTU F* -20 C DE SAKLANIR AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK 25 test 50 test 8 test 10X Buffer 10X Buffer Renksiz (T) 1 X 150 μl 1 X 300 μl 1 X 70 μl dntp dntp Renksiz (T) 1 X 150 μl 1 X 300 μl 1 X 70 μl MgCl 2 MgCl 2 Renksiz (T) 1 X 60 μl 1 X 100 μl 1 X 25 μl VDR A Primer VDR A Primer Sarı 1 X 45 μl 1 X 85 μl 1 X 20 μl VDR B Primer VDR B Primer Sarı 1 X 45 μl 1 X 85 μl 1 X 20 μl VDR F Primer VDR F Primer Yeşil 1 X 45 μl 1 X 85 μl 1 X 20 μl VDR R Primer VDR R Primer Yeşil 1 X 45 μl 1 X 85 μl 1 X 20 μl Hot start thermostabil Taq DNA polymerase AB Super-Taq 5 U/μL Kırmızı 1X 20 μl 1X 40 μl 1X 6 μl B enzim B enzim Sarı 1 X 60 μl 1 X 110 μl 1 X 26 μl F enzim F enzim Yeşil 1 X 60 μl 1 X 110 μl 1 X 26 μl Enzim B için 10X buffer 10X BUFFER B Sarı 1 X 90 μl 1 X 170 μl 1 X 40 μl Enzim F için 10X buffer 10X BUFFER F Yeşil 1 X 90 μl 1 X 170 μl 1 X 40 μl KUTU F TÜP (T) RENGİ YA DA KAPAK +2 / +8 DE SAKLANIR Örnek yükleme için elektroforez buffer 6X Blue Mavi 1 X 450 μl 1 X 900 μl 1X 150 μl Ethidium Bromide solusyonu (2,5 mg/ml) DNA Moleküler Ağırlık Markır Ethidium Bromide toksik R S 36/37 45 HMW Markır Kırmızı 1 X 250 μl 1 X 400 μl 1 X 100 μl Sarı 1 X 300 μl 1 X 550 μl 1 X 100 μl KUTU A +15 / +25 DE SAKLANIR Moleküler biyoloji için agaroz AGAROZ 1 X 25 g 1 X 50 g 1 X 8 g Elektroforez buffer TRIS-Acetate-EDTA ph: 8,00 50 X TAE 1 X 60 ml 1 X 180 ml 1 X 30 ml Mineral Yağı MİNERAL YAĞI 1 X 4 ml 1 X 7 ml 1 X 2 ml 3

6 2. REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU F* KUTU F KUTU A -20 C de saklanır +2 / +8 C DE SAKLANIR +15 / +25 C DE SAKLANIR Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. 3. KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it. Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: Filtreli uç kullanın; Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki pozitif kontrol ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. Sık sık eldiven değiştirin. 4

7 Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. Kullanımdan önce reaktifleri oda ısısında eritin. Reaksiyon kurulumu oda ısısında ya da en iyisi buz-banyosunda yapılabilir. 4. GÜVENLİK KURALLARI 4.1 Genel Güvenlik Kuralları Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. Ağızla pipetleme yapmayın. Bilinen hiçbir diagnostik metod enfeksiyon ajanlarının yokolduğunun garantisini vermediğinden, herbir klinik örneğin potansiyel enfeksiyonlu olduğu göz önünde bulundurulup, bu şekilde çalışılması gereklidir. Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121 C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın!!) 5

8 4.2 Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: 3,8-diamino-1-ethyl-6-phenylphenantridiumbromide (Ethidium Bromide) <2% Risk tanımı: T (Toksik) RİSK İBARESİ VE S İBARESİ ETHIDIUM BROMIDE R 23 ve R 68 S 36/37 45 İnhalasyon için toksik. Geri dönülmez etkiler riski. Laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven kullanın. Kaza veya rahatsızlık durumlarında, doktora başvurun ve paket etiketini gösterin. R ve S ibareleri kit ile sağlanan konsantre ürünlere işaret etmektedir. Özellikle Ethidium Bromide için, agaroz jelde dilusyona kadar. Konsantre Ethidium Bromide uygulamasında kimyasal dağıtıcı buharlı kabin kullanın. Seyreltilmiş Ethidium solusyonu ile çalışırken daima laboratuar giysisi ve tek kullanımlık eldiven giyin. Bu ürünler genel çöplere atılamaz. Kurutucu sistem kullanılmamalıdır. Atılım için yasal kuralları uygulayın. Ethidium Bromide kaza ile dökülmesi durumunda Sodyum Hipoklorit ve su ile temizleyin. İstenildiğinde ürünlerin Güvenlik data sheet (MSDS) gönderilebilir. 6

9 5. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 5.1 Reaktifler Steril DNase ve RNase free su; Distile su; DNA ekstraksiyonu için reaktifler 5.2 Cihazlar Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir. ekstrakte DNA eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,5-10 µl; 2-20 µl; µl); Thermalcycler; Mikrosantrifüj (max rpm); Tartı; Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Kimyasal kabin (Ethidium Bromide uygulamasında kullanılması önerilir); Agaroz minijel için yatay elektroforez haznesi; Güç kaynağı ( V); UV Transilluminator; Foto kamera ya da imaj analizör. 5.3 Materyaller Tek kullanımlık eldivenler; Tek kullanımlık filtreli uçlar (aralık: 0,5-10 µl; 2-20 µl; µl); Amplifikasyon reaktifleri hazırlamak için steril mikrotüpler; TAE dilusyonu için dereceli silindirler (1L); Agaroz jel hazırlamak için pyrex şişe ya da Becker; Parafilm. 7

10 6. REAKTİF HAZIRLAMA 1L 1XTAE buffer hazırlama: 20 ml 50X TAE ile 980 ml distile suyu karıştırın. 8

11 7. GİRİŞ Osteoporoz, kemik kütlesi azalması ve kırılma riskini artıran mikro-yapısal değişimler ile karakterize en sık görülen iskelet hastalığıdır. Kalıtsal faktörlerin osteoporoz gelişiminde önemli olduğu bilinmektedir. Bazı araştırmacılar, ikizler ve tüm ailede göstermiştir ki; kemik densite değişkenliğinin %75-85 i genetik kontrol altındadır (Arden ve ark., 1996). Günümüzde bu hastalığın genetik komponentlerinin tanımlaması çalışmaları artmaktadır yaşları arasında elde edilen kemik kütle piki, yaşla ya da menopoz sonrasında kemik kütlesi azalmasının hızı yanında en fazla genetik faktörler ile tanımlanmaktadır. Dahası, yaşam boyunca biriken çevresel faktörler ile çoklu etkileşimler (ilaç kabulu, beslenme, alkol, sigara ve menopoz periyodu öncesi ve sonrası) osteoporoz gelişimi için belirteç olabilir. Bu nedenle, osteoporoz patogenezi, genetik yatkınlık ve çevresel risk faktörlerinin kompleks etkileşimleri sonucudur. Kalıtsal düşük mineral densite kemikler ile ilişkili genetik markırların karakterizasyonu hastalığı geliştirme riski olan hastaların erken tanısını sağlar ve tedavi ve çevresel risklerin azaltılması ile korunma olasılığı verir den beri bazı bilim adamları kemik metabolizmasında yer alan bazı proteinleri kodlayan farklı genlerde polimorfizm tanımlamaya çalışmışlardır: Bu çalışmalar, spesifik alelik değişken ile kemik densite azalması arasında ilişki bulunmasına yardımcı olmuştur. Şimdiye kadar çeşitli polimorfizmler tanımlanmış ve analiz edilmiştir: Vitamin D reseptörü (CDR) (Morrison ve ark., 1994), Kollajen I (COL I A1) (Grant ve ark., 1996) ve Östrojen reseptörü (Er) (Kobayashi ve ark., 1996) kodlayan genlerde. Bu çalışmaların sonuçları gerçeğe göre zıttır, osteoporoz poligenik bir hastlıktır ve hastalık yatkınlığının belirlenmesi farklı polimorfizmlerin analizini gerektirir. Yukarıda bahsedilen her bir gen osteoporozun hafif bir riski ile ilişkilidir ve bu yüzden tekli belirlenmesi hastalığın riski için iyi bir markır değildir. Bunlara karşın, eğer kombinasyonları ile çalışılırsa genetik markırlar etkili risk belirleyicileri olurlar. Vitamin D ile resepteptörleri arasındaki etkileşim hormonunun biyolojik çalışmasında merkezi bir rol oynar. Vitamin D aktif metabolit, 1 α,25-dihydroxyvitamin D 3 (1,25 (OH) 2 D 3 ), reseptörü bağlar ve bu kompleks normal kemik değişimi için esas ilerleme olan kalsiyum ve fosfor hemostazını düzenler. Bu kompleks hormon-reseptör 9

12 immun, sinir, epitelyumyal ve endokrin sistemin düzenlenmesine de katkıda bulunur. Vdr geni kromozom 12 de (q13-14) lokalize ve 9 ekson içerir. Bu gende, özellikle 3 terminal bölgede, çeşitli polimorfizmler tanımlanmıştır; bunlardan bazıları genetik ekspresyon değişkenleri ya da protein yapısı ile ilişkilidir. Transduksiyon için başlangıç kodonunda localize F/f polimorfizm değişken boyutlar (423 ya da 427 aminoasit) ile VDR protein üretimi ile ilişkilidir. Bu bir T/C polimorfizmdir (ATG>ACG): T polimorfizmli kişiler 2 potansiyel başlama kodonuna sahiptir ve protein transduksiyonu ilk birinden başlarken, C polimorfizmli kişiler transduksiyona ikinci ATG bölgesinden başlar. Sonuç, ilkinden 3 aminoasit ile farklılaşan bir protein olabilir. Uzun protein, VDR fonksiyonunda değişiklik yapabilen yapısal bir değişime sahiptir. Genin sekizinci intronunda lokalize B/b polimorfizmi transkripsiyon durumu ile ilişkilidir. Bazı çalışmalar BB ve ff genotipleri ile kemik kütlesinin düşük seviyesi arasında bir ilişki göstermiştir. Dahası, BB genotipi intestinal seviyede calsiyum absorpsiyonunu azaltmaya yatkınlık gösterir (Suarez ve ark., 1997). 10

13 8. TEST PRENSİBİ PCR metodu (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürde DNA amplifikasyonu için tanımlanan ilk metoddur (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda üç nükleik asit segmenti bulunur: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid primerler kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dntpler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Amplifikasyon reaksiyonunun geniş biyolojik örneklerde uygulanabilmesinin yanında, PCRın oldukça küçük DNA segmentlerini de amplifiye edebilmesinden başlangıç DNAsı kısmi olarak yıkılabilir. 11

14 9. ÜRÜN TANIMI Osteoporoz ile ilişkili Vitamin D reseptör genindeki polimorfizmlerin çalışılması için bu kitte kullanılan moleküler yöntem uygun genetik bölgenin amplifikasyonunu takiben restriksiyon analizini (RFLP) içerir. Bu teknik ile aşağıdaki polimorfizmler tanımlanabilir: GEN PROTEİN GENOTİP POLİMORFİZM VDR Vitamin D BB, Bb, bb Tarnskriptin durumunun reseptörü değişkenliği VDR Vitamin D FF, Ff, ff Transduksiyon başama reseptörü bölgesinin değişikliği Kit, amplifikasyon için ve amplifiye ürünlerin enzimatik restriksiyonu için tüm reaktifleri sağlar. Amplifiye ve restriksiyon ürünler agaroz jel elektroforezi ile görüntülenebilir. 12

15 10. ÖRNEK TOPLAMA, MANİPULASYON VE ÖN- MUAMELESİ 10.1 Periferik kan Örnek toplama genel sterilite önlemlerini takip etmelidir ve örnekler transport medyum olmayan steril kutulara transport edilmelidir. Kan EDTAlı olarak alınmalıdır. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ polymerase ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini bozar. Taze kan +2/+8 C de saklanabilir (toplanmadan 4 saat içinde kullanılmalıdır); eğer DNA hemen ekstrakte edilmeyecekse örnek -20 C de dondurulmalıdır. 11. PROTOKOL 11.1 DNA ekstraksiyonu Periferik kandan DNA ekstraksiyonu Saf ve integral DNA ekstrakte eden herhangi bir diğer ekstraksiyon yöntemi de kullanılabilir. Her bir amplifikasyonda kullanılan DNA miktarı yaklaşık 30 ng dır. Eğer gerekirse, su ekleyerek ekstrakte DNA yı seyreltin, fakat her bir tüpe eklenecek olan örnek miktarı 1 μl olmalıdır. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin( laboratorio@abanalitica.it). 13

16 11.2 DNA AMPLİFİKASYONU Her bir örnek için aşağıdaki gibi amplifikasyon miksi hazırlayın: Reaksiyon aşamasında kontaminasyondan korunmak için, DNA solusyonu ve mineral yağı hariç tüm reaktifler ile master miks hazırlayarak 0,2 ya da 0,5 ml tüplere alikuatlamanızı ve sonra herbirine DNA örneği ve mineral yağı eklemenizi öneririz. VDR B VDR F 10X Buffer 2,5 μl 2,5 μl MgCl 2 0,75 μl 0,75 μl dntp 2,5 μl 2,5 μl VDR A Primer 1,5 μl VDR B Primer 1,5 μl VDR F Primer 1,5 μl VDR R Primer 1,5 μl AB Taq 0,2 μl 0,2 μl H 2 O 15,05 μl 15,05 μl Toplam miktar 24 μl 24 μl Her bir amplifikasyon için aşağıdaki miktarda ekstrakte DNA ve mineral yağı ekleyin: VDR B VDR F Mineral Yağı 2 damla 2 damla Ekstrakte DNA 1 μl 1 μl Her bir deneyde kontaminasyonları izlemek için bir negatif kontrol (mikse ekstrakte DNA yerine distile su ekleyin) ve bir pozitif kontrol (önceden test edilen genomik DNA) içermesi önemlidir. Tüpleri kısaca santrifüj edin. 14

17 VDR B ve VDR F amplifikasyonu için tüpleri aşağıdaki programda thermalcyclerda inkübe edin: 1 cycle 94 C, 5 min 94 C, 30 sec 35 cycles 62 C, 30 sec 72 C, 1 min 1 cycle 72 C, 10 min 11.3 AMPLİFİKASYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi %3 agaroz jel hazırlanması: 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Solusyonu berrak oluncaya kadar manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga içine bırakın. Jeli el ile dokunabilecek kadar soğumaya bırakın ve 10 µl Ethidium Bromide ekleyin. NOT: Ethidium Bromide güçlü bir mutajenik ajandır; daima eldiven giyin ve bu reaktifle uygulama yaparken kimyasal güvenlik kabininin içinde çalışın. Jeli tarakları ile birlikte uygun bir dökme tankına koyun ve oda ısısında soğuyana kadar bekleyin ya da jel katı hale gelene kadar buzdolabına koyun. Jel katılaştığında, dikkatlice tarakları çıkarın (jel kuyucuklarına zarar vermemeye dikkat edin), tankı elektroforez haznesine alın ve jelin üzerini tamamen kaplayana kadar uygun miktarda TAE buffer ekleyin (yaklaşık jel yüzeyinin 1-2mm üzerinde). 15

18 Örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 2 μl 6X Mavi 5 μl amplifiye ürünler Ya da 2 μl 6X Mavi 10 μl DNA Moleküler Ağırlık Markır (HMW) Miski jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı V arasına ayarlayın dakika jeli yürütün ve sonra UV transilluminatore koyun; amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans Moleküler Ağırlık Markırı ile karşılaştırarak analiz edin. DNA Moleküler Ağırlık Markır (HMW) 19, 26, 34 x 2, 37, 67, 110, 124, 147, 190, 242, 320, 404, 489, 501, 692, 900, 1114 bp. %3 agaroz jelde bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. 16

19 11.4 SONUÇLARIN YORUMLANMASI Kontroller aşağıdaki sonuçları göstermelidir: KONTROL SONUÇ YORUM Pozitif kontrol POZİTİF Amplifikasyon doğru çalışır. Negatif kontrol NEGATİF Kontaminasyon yokluğu Örnek amplifikasyonları aşağıdaki sonuçları göstermelidir: AMPLİFİKASYON VDR B amplifikasyon VDR F amplifikasyon SONUÇ 821 bp band 265 bp band Fig. 1. VDR F amplifikasyon ürünlerinin %3 agaroz jel elektroforezi. 1. Moleküler Ağırlık Markır (PM Markır); 2. Negatif kontrol; 3. Örnek (265 bp band). 17

20 11.5 POLİMORFİZM TANIMLAMASI VDR B amplifikasyon ürünlerinin enzimatik sindirimi Her bir örnek için aşağıdaki miks reaksiyonunu hazırlayın: 10X BUFFER B 3 µl B enzim 2 µl Steril H 2 O 15 µl Mineral Yağı 2 damla Kısa bir süre santrifüj edin ve 10 µl VDR B amplifikasyon ürünü ekleyin. 65 C de gece boyu inkübe edin VDR F amplifikasyon ürünlerinin enzimatik sindirimi Her bir örnek için aşağıdaki miks reaksiyonunu hazırlayın: 10X BUFFER F 3 µl F enzim 2 µl Steril H 2 O 15 µl Mineral Yağı 2 damla Kısa bir süre santrifüj edin ve 10 µl VDR F amplifikasyon ürünü ekleyin. 37 C de gece boyu inkübe edin RESTRİKSİYON ÜRÜNLERİNİN GÖRÜNTÜLENMESİ Agaroz jel elektroforezi Restriksiyondan elde edilen bandların çözülmesi için %3 agaroz jel hazırlanması gerekir. Büyük kuyucuklar yaratan (40-50 μl) dişli bir tarak kullanmanızı öneririz. 1,5 g Agaroz tartın ve 50 ml 1X TAE içine dökün. Bilgileri takip edin: paragraf 11,3. 18

21 Örnek yükleme Test tüpünde ya da direk parafilmde aşağıdakileri karıştırın: 6 μl 6X Mavi 30 μl restriksiyon ürünü ve 2 μl 6X Mavi 10 μl DNA Moleküler Ağırlık Markır (HMW) Miski jel kuyucuklarına yükleyin; güç kaynağını açın ve voltajı V arasına ayarlayın dakika jeli yürütün ve sonra UV transilluminatore koyun; amplifikasyon ürünlerinin boyutunu referans Moleküler Ağırlık Markırı ile karşılaştırarak analiz edin. DNA Moleküler Ağırlık Markır (HMW) 19, 26, 34 x 2, 37, 67, 110, 124, 147, 190, 242, 320, 404, 489, 501, 692, 900, 1114 bp. %3 agaroz jelde bp bantlar genellikle tam olarak çözülmez ve tek bir bant olarak görülür; 26 ve 34 bp bantları bazen görünmek için çok küçük olur (düşük moleküler ağırlıklarından dolayı). NOT: UV ışınları deri ve en önemlisi gözler için tehlikelidir: daima eldiven ve koruyucu gözlük kullanın ya da UV transilluminatorün koruyucu ekranını kullanın. 19

22 11.7 RESTRİKSİYON SONUÇLARININ YORUMLANMASI Agaroz jelde restriksiyon ürünlerinin görüntülenmesi farklı alellerin tanımlanmasını ve her bir bireyin genotip sırasını tanımlamayı sağlar. GEN GENOTİP RESTRİKSİYON FRAGMANI VDR BB 821 VDR Bb VDR bb VDR FF 265 VDR Ff VDR ff Osteoporoz ile ilişkili polimorfizmin klinik anlamı henüz tama olarak bilinmemektedir. Bilinen tüm sonuçlar aşağıdaki tabloda gösterilmiştir: GENLE R GENOTİPLER KLİNİK ANLAM VDR BB ve ff (bazı çalışmalarda) kemik kütlesinin düşük seviyesi için yatkınlık VDR BB İntestinal seviyede düşük kalsiyum absorbsiyonuna yatkınlık Fig. 2. VDR F polimorfizmi için elektroforetik pattern. 1. Moleküler Ağırlık markırı; 2. F/f heterozigot; 3. f/f homozigot; 4. F/F homozigot. 20

23 12. SORUN GİDERME 1 Amplifikasyon ürünü olmaması Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır Protokolü dikkatlice okuyun ve tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun. Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. Kit uygun şekilde çalışmaz Amplifikasyon reaktiflerini -20 C de saklayın; Reaktiflerin tekrar tekrar dondurulup/çözdürülmesinden kaçının. 2 Amplifiye ürünlerin agaroz jelde görüntülenmesinden sonra aspesifik ürün ya da ekstra band görülmesi Thermalcycler sıcaklık değişimlerini çok yavaş yapın. Thermalcycler değişikliklerini uygulayın. Amplifikasyon reaksiyonunun hazırlanması oda ısısında çok uzun zaman alır. Oda ısısında çalışma zamanınızı hızlandırın; Buz üzerinde çalışın. Ekstrakte olanlar purifiye edilmiştir İyi bir örnek purifikasyonu sağlayan ekstraksiyon sistemi kullanın. 21

24 Başlangıç örnekleri yıkılmış DNA içerir Ekstraksiyon aşamasını başka bir başlangıç klinik örneği kullanarak tekrarlayın; Örneğin uygun yolla toplanıp saklandığından emin olun. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin( faks N TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler bu analiz için uygun değildir (heparin antikoagülant olarak kullanılan kan örnekleri uygun değildir); 14. TEST PERFORMANSI 14.1 Analitik özgünlük En önemli bilgi bankasında uygulanan primer dizisi spesifik olmayan dizilerin yokluğunu değerlendirir. 22

25 15. BİBLİYOGRAFİK REFERANSLAR Arden NK, Griffiths GO, Hart DJ, Doyle DV, Spector TD, Br J Rheumatol.;35(12): , Cooper GS, Umbach DM, J of Bone and Mineral Research, 12 : , Grant SF, Reid DM, Blake G, Herd R, Fogelman I, Ralston SH. Nat Genet 14: , Kobayashi S, Inoue S, Takayuki H, Ouchi Y, Shiraki M, Orimo H, Journal of Bone and Mineral Research, 11: , Morrison N, Kelly PJ, Sambrook PN, Eisman JA, Agents Actions. Aug, 42(1-2): i-ii Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim, Science 230, , Suarez F, Zeghoud F, Rossignol C, Walrant O, Garabedian M, J of Clinical endocrinology and Metabolism 82: ,

26 16. SİPARİŞ İÇİN BİLGİLER VDR: Vitamin D reseptör geninde (vdr) polimorfizmlerin belirlenmesi için kit (Kod 04-49A) Kit DNA amplifikasyonu, RFLP analizi ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme için rekatifler içerir. Hedef bölge: Vdr geni. Kod Ürün Paket 04-49A-25 VDR 25 test 04-49A-50 VDR 50 test 16.1 İlgili ürünler VDR - amplifikasyon reaktifleri Vitamin D reseptör geninde (vdr) polimorfizmlerin belirlenmesi için kit (Kod 04-49R) Kit DNA amplifikasyonu ve RFLP analizi için reaktifler içerir. Hedef bölge: Vdr geni. Kod Ürün Paket 04-49R-25 VDR - amplifikasyon reaktifleri 25 test 04-49R-50 VDR - amplifikasyon reaktifleri 50 test 24

27 OP-POL: PCR amplifikasyonu ve restriksiyon enzim sindirimi ile osteoporoz ile ilişkili bazı polimorfizmerin (Vitamin D reseptör geni, Kollajen I a1 geni, Östrojen reseptör geni) belirlemesi için kit (Kod A) Kit DNA amplifikasyonu, RFLP analizi ve agaroz jel elektroforezi ile görüntüleme için rekatifler içerir. Hedef bölge: vdr, col I a1, er, genleri. Kod Ürün Paket 04-50A-25 OP-POL 25 test 04-50A-50 OP-POL 50 test OP-POL amplifikasyon reaktifleri PCR amplifikasyonu ve restriksiyon enzim sindirimi ile osteoporoz ile ilişkili bazı polimorfizmerin (Vitamin D reseptör geni, Kollajen I a1 geni, Östrojen reseptör geni) belirlemesi için kit (Kod R) Kit DNA amplifikasyonu ve RFLP analizi için reaktifler içerir. Hedef bölge: vdr, col I a1, er, genleri. Kod Ürün Paket 04-50R-25 OP-POL amplifikasyon reaktifleri 25 test 04-50R-50 OP-POL amplifikasyon reaktifleri 50 test 25

28 26

29

30 AB ANALITICA srl - Via Svizzera PADOVA, (ITALY) Tel Fax info@abanalitica.it