Bitki Moleküler Biyolojisi. Prof. Dr. Nermin Gözükırmızı

Transkript

1 Bitki Moleküler Biyolojisi Prof. Dr. Nermin Gözükırmızı

2 Bitki Moleküler Biyolojisi moleküler tekniklere dayalı bir bilim dalıdır. Dizileme, PCR, cdna, transkriptomik, proteomik, transformasyon, high-resolution yüksek ölçekli haritalama, mutasyon analizi Gen izolasyonu ve Tanımlanması Benzeri yöntemlerden yararlanır.

3 Bitki Moleküler Biyolojisinde ilgi alanları Biyokimya: protein analizi, yapı işlev ilişkileri Gelişim: bitki gelişimini etkileyen moleküler sinyaller Genetik çeşitlilik: populasyonlar, genom veya genlerdeki genetik çeşitliliğin değerlendirilmesi Bitki-mikroorganizma ilişkileri: bitki savunma mekanizmaları ve bitki-mikroorganizma sinyal yolları Fizyoloji: hormonların işlevleri ve bitkilerdeki diğer büyüme düzenleyicileri

4 Genetik mekanizmalar: rekombinasyon, ploidi, sentromer işlevleri Yetiştirme: uygun rekombinantların bulunması için aday genleri ve genetik markerları kullanma Bitkilerle beslenme ve insan sağlığı: mineral ve mikrobesin içeriğini değiştirme, bitkilerde aşı üretimi Evolüsyon: genetik ilişkileri değerlendirme, gen ve genomların orijini ve evolusyoner tarihçesi Populasyon genetiği: populasyon yapısı, seleksiyon etkileri, bağlantı dengesi

5 Önemli yöntemler Otomatik DNA dizileme Nobel ödülü (Gilbert, Sanger, Berg, 1980) Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) Nobel ödülü (Mullis, 1993) T-DNA veya transpozonlarla gen takibi Nobel prize (McClintock, 1983) Bitki transformasyonu Agrobacterium veya gen tabancası RNAi, virus-aracılığı ile gen sessizleştirilmesi (VGS) Nobel prize (Fire, Mello, 2006) Transkriptomik (cdna mikroarray) Nobel prize (Shimomura, Chalfie, Tsien, 2008) Yeşil fluoresan protein (Aequorea victoria) Proteomik

6 The Nobel Prize in Chemistry 2008 "for the discovery and development of the green fluorescent protein, GFP" Osamu Shimomura Martin Chalfie Roger Y. Tsien 1/3 of the prize 1/3 of the prize 1/3 of the prize USA USA USA Marine Biological Laboratory (MBL) Woods Hole, MA, USA Columbia University New York, NY, USA b b b University of California San Diego, CA, USA

7

8 Bitki nukleus genomunun özellikleri Genom büyüklüğü: C-değerleri, C-değeri paradoksu Kromozom sayısı Gen, gen aileleri sayısı, tüm gen kompleksliklerini anlama Retrotranspozonlar ve diğer tekrarlanan diziler Arada dağılmış pattern lar Sentromer, Telomer, Matriks bağlanma bölgeleri (MARs)

9 Model genom nedir? Biyolojinin hangi konusu ile çalıştığınıza bağlıdır. Kısa generasyon süresi, küçük genom, kendi ve karşı döllemesi kolay, küçük boyutlu bitki, ekonomik olarak önemli diğer bitki türleri ile ilşkisi, kolay transformasyon, genetik ve fiziksel haritalarının varlığı, genom dizisi varlığı. Arabidopsis, pirinç ve son günlerde mısır genom projeleri tamamlanmıştır. Medicago, kavak ve domates de tamamlanmak üzeredir.

10 Fenotip ve Genotip ilişkilerini araştırmak İleri ve Geri genetik çalışmalar İleri: fenotip > harita > gen klonla > işlevi çalış Klasik yöntem Geri: klonlanmış gen > hangi fenotip etkileniyor olası işlev Not: Dizileme otomatize edilmiştir fakat fenotipik değerlendirmede böyle bir olasılık bulunmamaktadır.

11 Genleri tanımlamak ve izole etmek Bir metabolik olayı düzenlemek o olayı etkileyen gen biliniyorsa daha kolay olur. Hangi genler fenotipi kontrol eder, hangi fenotipik değişimler allel değişimleri (mutasyon) ile oluşur. DNA/RNA/protein ve bitki formu, işlevi ve evolüsyonu arasındaki ilişkiyi anlamak

12 Bitki genomunun özellikleri Kloroplast genomu: Halkasal ve çok korunmuş (gen sırası ve dizisi) Büyüklük: kb (ort. = 140 kb, 110 gen) Mitokondri genomu: Halkasal ve az korunmuş, yüksek düzeyde rekombinasyon gösterir Büyüklük: kb (Arabidopsis = 367 kb, 58 gen) Nukleus genomu Linear, çok sayıda kromozom Büyüklüğü değişir (türiçi ve türler arası) Kromozom sayısı değişir (türler arasında) 14

13 Nukleus kromozom sayıları Bitki bilinmiyor 2n=2 (200,000 hala sayılmadı) Mirmisia pilosa 2n=2 (ilkel Australya karıncası) Bazı bitkiler 2n=4 (Asteraceae ve Poaceae) Arabidopsis 2n=10 Sorghum 2n=10 Arpa 2n=14 (n=7) Mısır 2n=20 Pirinç 2n=24 Domates 2n=24 Buğday 2n=42 (n=7) Poa literosa 2n=266 Voaniolana gerardii 2n=600 15

14 Bitkilerde C-değeri C-değeri: Haploid hücrelerde (gametlerde) pikogram olarak DNA miktarı, 1 pg = 965 mega [million] baz çifti(mb) ~3,000 türde (~1% angiosperm)biliniyor 38 Mb (bir crucifer, Cardamine amara) ile > 123,000 Mb (bir zambak, Fritillaria assyriaca) arasında Bitki ailelerinin % C-değeri bilinmiyor C-değeri bitki gelişiminin hücresel bazı değerleri ile ilişkilidir: Min. mitotik hücre siklusu, mayoz süresi CO 2 yanıtsızlığı, kışın ısınma, biomass üretimi Küçük genomlular <6 haftada gelişim dönemlerini tamamlarlar (Bennett, 1972) 16

15 C-değeri ve bitki biyolojisi (Bennett, 1998)

16 C-değeri paradoksu Genom büyüklüğü gen sayısı ve kompleksliği ile ilişkili değildir. C-value Tür Fiziksel büyüklük Genetik büyüklük Fiziksel/Genetik Gen Sayısı Arabidopsis 125 Mb 1200 cm 104 kb/cm 25,498 Rice 430 Mb 1800 cm 238 kb/cm ~50,000 Sorghum 760 Mb 1500 cm 500 kb/cm ~50,000 Tomato 950 Mb 1400 cm 680 kb/cm?? Maize 2,500 Mb 1500 cm 1,660 kb/cm ~50-100,000 Barley 5,300 Mb 1760 cm 3,000 kb/cm ~50,000 Genom fiziksel büyüklüğü farklılıklar gösterir. Genetik büyüklükler oldukça yakındır Büyük genomlar büyük fiziksel:genetik uzaklık oranları gösterirler Gen sayısı değişiklikler gösterir Gen sayısı ve gen ailesi sayısı arasındaki ilişki bilinmiyor

17 Genom obezitesi Büyük genomlar ile küçük genomlar arasındaki fark nedir? Büyük genomlarda çok miktarda tekrarlanan diziler bulunur. Tekrarlanan dizilerin çoğunda retrotraspozonlar bulunur. Retrotransposonlar bir RNA ara molekülü taşırlar Büyük genomlarda genler nasıl organize olurlar? Çok değişken araya girişler bulunur Mısırda genler kromozomların ucuna doğru adacıklar oluştururlar Mısırda gen adaları retrotranspozon denizi ile çevrilidir Büyük ve küçük genomlar arasında çalışma yönünden ne fark vardır? Dizileme zor ve pahalı Gen izolasyonu zor

18 Rekombinasyon Genom boyunca varyasyonlar gösterir. Domates: I2 loci = 43 kb/cm karşın Tm2 locus = 3.3 Mb/cM Ortalama fizisel:genetik oran istatistik olarak gerekli olmayabilir Gence zengin alanlarda yüksek Metillenmiş ve tekrarlanan bölgelerde az Gen gence zengin yoksa fakir alanlarda mı yerleşmiş sorusu önemli Marker bulma zengin alanlarda kolaylaşır Rekombinasyon frekansını değiştirebilme çalışmaları büyük önem taşıyor Rekombinasyonu nasıl izleriz? Polimorfizm Her türlü varyasyon RFLP, AFLP, SSR, dizi, morfolojik, biyokimyasal

19 Gen tahminleri Computasyonal gen tahmin programları Dizilenmiş genomlarla annotasyon Gen model konfirmasyonu Alternative kırpılma 21

20 Sentromer ve telomer TELOMER Çok korunmuş, tandem tekrarlar (T/A)n G 1-8 Boyu değişken 2-40 kb SENTROMER Diziler korunmamış (S. cerivisiae ves. pombe). Bitkilerde henüz klonlanmadı Dizilemesi zor (Arabidopsis,pirinç, insan vb) Sentromerle ilgili işlev bilinmiyor, fakat kinetokor oluşumu ve iğ bağlanma yeri, hücre bölünmesinde kardeş kromatidlerin ayrılmasını sağlar 22

21 Arabidopsis ve pirinçte Sentromer 180 bp core tekrarı Arabidopsis (pal), 155 bp core tekrarı pirinç (CentO), 156 bp core tekrarı mısır (CentC) core tekrarı retrotranspozon tekrarları ile çevrili (Athila LTR Arabidopsis; CRR, bir Ty3/Gypsy retrotranspozon pirinç) Perisentrik bölgeler çeşitli tipte transpozonlarla çevrili ve sıklıkla metillenmiş Rekombinasyon oranı diğer bölgelere göre kez az kb/cm a kb/cm in Arabidopsis Rekombinasyon nasıl bastırılır? Sentromerik bölgede eşleşme geç olur Tekrarlar rekombinasyonu azaltır.