Kullanılan Semboller. REF Liste Numarası 2-8 C de saklayın in Vitro Diagnostik kullanım Dikkat! IVD. LOT Lot Numarası VER Versiyon.

Transkript

1 REF TB10-50 FEP IVD in Vitro Diagnostik kullanım için 50 Aladin (Sacace)'de End Point analizi (FEP) ile Flüoresan tespitinin ve Brucella species (B.melitensis, B.abortus, B.suis, B.ovis, B.canis, B.neotomae) in nükleik asit amplifikasyonu için Brucella FEP Kullanılan Semboller REF Liste Numarası 2-8 C de saklayın IVD in Vitro Diagnostik kullanım için Dikkat! LOT Lot Numarası VER Versiyon Son Kullanma Tarihi Reaktif İçerir Kullanım Bilgileri Üretici

2 İSİM Brucella FEP KULLANIM AMACI Brucella FEP amplifiye ürünlerin end-point hibridizasyon-floresan kullanılarak insan (tam kan, eklem sıvısı, lenf bezi punktat) ve hayvan (kan, süt, plasenta, lenf bezleri, dalak, abort fetus karaciğer, higroma, parankimal organlar ) biyolojik maddeler ve bakteri kültüründe Brucella species (B.melitensis, B.abortus, B.suis, B.ovis, B.canis, B.neotomae) in kalitatif tespiti için bir Fluorescence End-Point (FEP) testtir. Her biri tek tek işlenen örneğin amplifikasyon kontrolünü ve olası reaksiyon inhibisyonu tanımlanmasını sağlamak için test bir internal kontrol içerir(ic). TEST PRENSİBİ Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) tarafından tespit edilen Brucella spp. spesifik Brucella spp. primerler kullanılarak spesifik alanda patojenik genomun amplifikasyonuna tespite dayalıdır. Fluorescence End-Point (FEP) PCR da, amplifiye ürün flüoresans boya kullanılarak tespit edilir. Bu boyalar özellikle güçlendirilmiş ürüne bağlı olan oligonükleotitlerin problarına bağlıdır. Çok kanallı rotor tipi florimetre PСR sonrası bir reaksiyon karışımında özel bir reaksiyon karışımı içinde fluorophores dan floresan ekstraksiyon tespit etmek için tasarlanmıştır. Fluorescence End-Point (FEP) analizi PCR çalıştırıldıktan sonra reaksiyon tüplerini yeniden kapatmadan biriktirilen ürünün tespitini sağlar. Brucella FEP PCR kit Internal Kontrol (IC) içeren bir kalitatif testtir. Her biri tek tek işlenen örneğin ekstraksiyonun kontrolünü ve olası reaksiyon inhibisyonu tanımlanmasını sağlamak için izolasyon prosedürlerinde kullanılır. KİT İÇERİĞİ Part N 1 DNA-Sorb-B : klinik örneklerden DNA izolasyonu ; Part N 2 Brucella FEP : amplifikasyon ve Fluorescence End-Point (FEP) kit; Part N 1 DNA-Sorb-B : Lysis Solution, 15 ml; Washing Solution 1, 15 ml; Washing Solution 2, 50 ml; Sorbent, 1,25 ml; DNA-eluent, 5,0 ml. 50 test için gerekli reaktif içerir Part N 2 Brucella FEP : PCR-mix-1-FEP Brucella, 55 kullanıma hazır tek-doz test tüpleri; PCR-mix-2-Flu, 0,77 ml; PCR-mix-Fon, 0,5 ml; Brucella C+, 0,1 ml; Pos IC C+, 0,1 ml ; Negative Control C-, 1,2 ml; IC (Internal Control), 0,5 ml; DNA-buffer, 0,5 ml; 55 reaksiyon için gerekli reaktif içerir. KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER Zone 1: örnek hazırlama: Biyolojik kabin eppendorf tipi tüpler için masa mikrosantrifüj (RCF max. 16,000 x g); Eppendorf 5415D ya da benzeri 60 C ± 2 C kuru ısı bloğu Vorteks mikser Aerosol bariyerli pipetörler 1,5 ml polipropilen steril tüpler (Sarstedt, QSP, Eppendorf) Tek kullanımlık eldiven, pudrasız Atık kabı Zone 2: RT ve amplifikasyon: PCR Fluorescence Detector Aladin (Sacace) Workstation Aerosol bariyerli pipetörler (0,5-10 μl; 5-40 μl)

3 Tüp rakları UYARILAR VE ÖNLEMLER 1. Lizis Solusyonu, guanidine tiyosiyanat içerir. Guanidine tiyosiyanat solunursa, deri ile temas ederse ya da yutulursa zararlıdır. Asitler ile teması toksik gaz oluşumuna neden olur. (Xn; R: 20/21/22-36/37/38; S: 36/37/39). 2. Örnekler ve reaktifler ile çalışırken tek kullanımlık eldivenler, laboratuar giysisi ve göz koruyucu kullanın. Çalışmalardan sonra ellerinizi yıkayın. 3. Ağızla pipetleme yapmayın. 4. Laboratuar çalışma alanında yemek yemeyin, bir şey içmeyin, kozmetik uygulamayın ya da kontak lenslerini ellemeyin. 5. Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. 6. Tüm örnekleri ve kullanılmayan reaktifleri yasal düzenlemelere göre yok edin. 7. Örnekler potansiyel enfeksiyon faktörü olarak kabul edilmeli ve biyolojik kabinlerde Biyo güvenlik Seviye 2 ya da diğer uygun biyo güvenlik pratiklerine göre çalışılmalıdır. 8. Dökülen tüm örnekler ya da reaktifleri 0,5% sodyum hipoklorit ya da uygun diğer dezenfektanlar ile temizleyin. 9. Örnekler ve reaktiflerin deri, gözler ve mukoz membranlar ile temasından kaçının. Eğer bu solüsyonlar ile temas ederse bol su ile yıkayın ve doktorunuza başvurun. 10. Material Safety Data Sheets (MSDS) istenildiğinde verilebilir. 11. Bu kiti ancak amplifikasyon tekniği bilgisi olan kişiler kullanmalıdır. 12. Laboratuardaki iş akışı Ekstraksiyon alanından başlayıp Amplifikasyon ve Belirleme alanlarına doğru tek bir kişinin yönetiminde olmalıdır. Örnekleri, ekipmanları ve reaktifleri bir önceki çalışma alanına geri götürmeyin. SAKLAMA KOŞULLARI Brucella FEP +2-8 C de saklanmalıdır. KARARLILIK Brucella FEP Test kit etiketi üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabil kalır. Ürünün performansı etiket üzerinde yazılı kontrol tarihi ile sağlanacaktır. Işık, ısı ya da neme maruz kalmak bazı kit bileşenlerin raf ömrünü etkileyebilir. Tekrarlanan çözdürme ve bu reaktiflerin dondurulması duyarlılığı azaltabildiği için bu durumdan kaçınılmalıdır. ÖRNEK SAKLAMA, TOPLAMA VE TRANSPORT Brucella FEP aşağıdaki materyallerden ekstre edilmiş DNA lar ile DNA-Sorb-B analiz edilebilir: İnsandan alınan örnekler: tüm periferik kan % 3 EDTA solüsyonlu tüplerde toplanır (1 ml kan başına 50 μl EDTA ). lenf düğümleri ponksiyon örnek 100 μl steril % 0.9 sodyum klorür solüsyonlu ya da taşıma ortamlı tüplerde toplanır. sinovyal sıvı steril tek kullanımlık tüp içinde toplanır. Hayvanlardan alınan örnekler: Kan 6 % EDTA solüsyonlu tüplerde toplanır (1 ml kan başına 50 μl EDTA) ve dekontaminasyon prosedür sonrası DNA izolasyonu için kullanılır. Süt (10-20 ml) steril kap içinde toplanır. 3000g/min de 10 dakika 10 ml santrifüj edin. Süpernatantı dökün ve DNA ekstraksiyonu için yaklaşık 100 µl solüsyon bırakın. Karın ve mide sıvıları, düşürülmüş fetusun karaciğeri ve dalağı. plasenta ve düşen hayvanların fetal membranlar. Yumurtalık sıvısı, hidroma. Kesilmiş hayvanlarda, ölü hayvanın her iki bölümünden alınan tüm lenfatik nod (paraaortik, inguinal, pelvik), parenkimatoz organlarının bir kısmı (dalak, karaciğer), orşit veya epididimite sahip erkek den alınan ek seminal bez analiz için toplanır. Bakteri kültürleri: sıvı kültürleri önceden yapılan işlem olmadan kullanılmaktadır. Şüpheli bakteri kolonileri 0,5 ml steril fizyolojik solüsyon tekrar suspense edilmelidir. 12 saatten daha uzun olmamak kaydıyla örnekleri +2-8 C de ya da daha uzun saklamak için 20/80 C de saklayın. Klinik örneklerin transportu, etiyolojik ajanların transportu için ülkesel, federal, lokal ve yasal düzenlemelere göre yapılmalıdır.

4 ÖRNEK VE REAKTİF HAZIRLAMA 1. Lizis Solusyonu ve Yıkama Solusyonu (diğerleri +2-8 C de saklanmasına rağmen) buz kristalleri çözülene kadar C ye kadar ısıtılır. 2. Bir tüpte gerekli miktarda 1,5 ml polipropilen tüpler hazırlayın. 3. Her bir tüpe 10 µl Internal Control ve 300 μl Lizis Solusyonu ekleyin. 4. Uygun tüplere 100 μl Örneklerden ekleyin. 5. Aşağıdaki gibi Kontrolleri ekleyin: Cneg işaretli tüpe 100 μl C (Negatif Kontrol ) ekleyin. 6. Tüpleri vorteksleyin,65 C de 10 dakika inkübe edin ve 3-5 saniye santrifüj edin. 7. Sorbenti şiddetlice vorteksleyin ve her bir tüpe 25 μl ekleyin saniye vorteksleyin ve tüm tüpleri oda ısısında 10 dakika inkübe edin. 9. Tüm tüpleri 10000g de 1 dakika santrifüj edin ve aerosol bariyerli mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 10. Her bir tüpe 300 μl Yıkama Solusyonu 1 ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 5000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 11. Her bir tüpe 500 μl Yıkama Solusyonu 2 ekleyin. Şiddetlice vorteksleyin ve 10000g de 1 dakika santrifüjleyin ve tıpalı bir aerosol bariyerli uçlu mikropipet kullanarak pellete zarar vermeden her bir tüpten dikkatlice supernatantı atın. Yeni bir tüpe geçerken pipet ucunu değiştirin. 12. Adım 11 tekrar edin C de 5 dakika açık kapakla bütün tüpleri inkübe edin. 14. Pelleti 50 μl DNA-eluent içinde yeniden suspense edin. 65 C de 10 dakika inkübe edin ve periyodik olarak vorteksleyin. 15. Tüpleri maksimum hızda ( g) 2 dakika santrifüj edin. Supernatant amplifikasyon için hazır DNA içerir. PROTOKOL: 1. Örnekler ve kontroller için gerekli miktarlarda PCR-mix-1-FEP Brucella tüpleri hazırlayın. 2. Her bir tüpe 7 μl PCR-mix-2 Flu ekleyin. 3. PCR-mix-1-FEP ile 2 tüp hazırlayın ve Fon olarak işaretleyin. Her bir tüpe 17 µl PCR-mix-Fon ekleyin. Fon örnekleri termocyclere bir kez konunduğunda, termocyceler olmadan başka çalışma için kullanılır. Fon örneklerinin çoklu kullanımı aynı lotlu PCR kitinin uygulanmasına izin verir; aynı ekstrasksiyon kit ve aynı tüp tipi. 1 ay kadar 2 den 20 ºC ye Fon tüpleri saklayın. Işıktan uzak tutun. 4. Uygun tüplere 10 μl ekstrat DNA ekleyin. 5. Her bir panel için 3 kontrol hazırlayın: Amplifikasyon Negatif Kontrol etiketli tüpe 10 µl DNA-buffer ekleyin; C+Bru etiketli tüpe 10 µl Brucella C+ ekleyin; IC C+ etiketli tüpe 10 µl Pos IC C+ ekleyin; PCR Protocol Termalcyclerda aşağıdaki programı başlatın (tablo 1 bakın). Sıcaklık 95 º C e ulaştığında, amplifikatörün hücrelerine tüpleri yerleştirin ve devam etmek için düğmeye basın. Termocylere yerleştirmeden önce kısa süre vorteksleyerek tüplerin duvarlarından sediment damlaları uzaklaştırılmalıdır. Brucella DNA ın amplifikasyonunda termocylere programlayın. Adım Sıcaklık Zaman Döngü 0 95 С Duraklama 1 95 С 2 dk 1 95 С 25 sn 2 65 С 40 sn С 25 sn 95 С 25 sn 3 56 С 40 sn С 25 sn 4 10 С Saklama Aladin programlama (Bu kiti kullanmadan önce lütfen Aladin Operating Manueli okuyun). Brucella DNA in tespiti 1. Güç düğmesini açın ve ALA-1 programı başlatın. 2. Ana menü programında Set up ve Test seçin.

5 3. New düğmesini seçin (sağ üst köşede). 4. Açılan menüden Brucella ismine girin ve OK düğmesini aktive edin. 5. Channels menüsünde FAM ve HEX seçin, IC menüsünde Internal Control (FAM) için kanal seçin. 6. n ve n + alanlarında spesifik DNA tespiti için her bir kanal için sinyal/fon oranı için threshold değerini ekleyin: HEX ve FAM: n- =2.5, n+ =3.0 ve IC/background alanlarında internal kontrol için : Int.Control/Neg = Negative Control Thresholds (Fon parameters) alanında Fon test tüpleri için kabul edilen flüoresans değerini ayarlayın: FAM: = 100; HEX: = 50; 8. Channel attachment penceresi altındaki Add a channel alanına Brucella yazın ve Add a channel basın. Add a channel alanında Brucella seçin ve uygun kanal düğmesini aktifleştirin: Brucella = HEX 9. Bu alanda 555% değerine ayarlayarak Confidential interval seçeneğini bloklayın. 10. Save düğmesini aktive edin. Flüoresans tespiti: 1. Gücü açın ve ALA_1 programı başlatın. 2. ALA_1 programı açın. 3. Yeni bir proje oluşturun. Bunu yapmak için, yeni bir proje oluşturmak için Protocol Create New ya da Open menüsüne gidin. 4. Açılan proje penceresinde yeni proje ayarlamayı seçin. Projenin adını girin, rotor türünü seçin (48 x 0.2), listede uygun testi (Borrelia) seçin ve sonrasında Sample kutusunda örnek için bir isim girin. 5. Ctrl+F komutu ile Fon Kontrolü ekleyin. Fon kontroller olarak Fon örnek test tüpleri kullanın. 6. Exit düğmesini aktifleştirerek protokol penceresini kapatın. Protokolü kaydedin. 7. Sample kutusunun konum sütununda kendi numarasına göre Aladin karüseli içine kesinlikle kontrol ve örnek tüplerini aktarın. Tespit işlemini başlatın. Ana menüde Protocol ve sonra Detection seçin veya araç çubuğunda Run butonuna tıklayın. Tablo 2. Kontrol sonuçları Kontrol Kontrol adımları Fam kanal Joe kanal Yorum NCS DNA izolasyonu Poz Neg Geçerli sonuç DNA-buffer Amplifikasyon Neg Neg Geçerli sonuç Brucella C+ Amplifikasyon Neg Poz Geçerli sonuç Pos IC C+ Amplifikasyon Poz Neg Geçerli sonuç Brucella spp. için pozitif örnek Brucella-positive (HEX kanal) olarak gösterilir. PERFORMANS ÖZELLİKLERİ Analitik özgüllük Primerler ve probların analitik özgüllüğünü negatif örnek ile doğrulanmıştır. Bu örnekler spesifik Brucella primerler ve problar ile sinyal vermezler. Kit Brucella FEP in özgüllüğünü 100% dür. Kit Brucella FEP ın potansiyel çapraz-reaktivitesi kontrol grubuna karşı aşağıdaki tabloda test edilmiştir. Diğer patojenler ile herhangi bir çaprazreaktivite gözlenmedi. Analitik duyarlılığı Kit Brucella FEP, 1000 kopya/ ml den az olmayan % 100 duyarlılıkla testlerin Brucella DNA tespitini sağlar. Tespit, negatif numuneler tarafından kontrol standardını ve dilüsyonlarını gerçekleştirir. Hedef bölge: WboА gene SORUN GİDERME 1. Ekstraksiyonun Negatif Kontrolu için IC sinyal vermez ya da zayıf verir. PCR inhibe olur. Size önerilen DNA ekstraksiyon yöntemini kullandığınızdan ve üreticinin talimatlarını izlediğinizden emin olun. Ekstre edilmiş DNA pipetlenmeden önce maksimum hızda ( g) 2 dakika boyunca bütün tüpleri tekrar santrifüj edin ve dikkatlice süpernatantı alın. Reaksiyonda inhibe olan sorbent pellete dokunmayın. Reaktif saklama koşulları talimatlara uygun değildir. Saklama koşullarını kontrol edin. PCR koşulları talimatlara uygun değildir. PCR şartlarını ve protokolde rapor edilmiş flüoresans kanalını IC tespit için seçin.

6 Reaktifleri pipetleme işlemi sırasında örneğe IC eklenmedi. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında dikkat edin. 2. Pozitif kontrol hiç sinyal vermez ya da zayıf sinyal verir. PCR koşulları talimatlara uygun değildi. Amplifikasyon protokolü kontrol edin ve manuelde yazılan floresans kanalı seçin. 3. Negatif Kontrol ekstraksiyonu ile pozitif spesifik sinyal verir. DNA ekstraksiyon prosedürü sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Ekstraksiyon prosedürü sırasında sadece filtre uçları kullanın. Tüpler arası geçişte uçları değiştirin. Reaktiflerin yeni bir seti ile DNA ekstraksiyonunu tekrar edin. 4. PCR (DNA-buffer) Negatif Kontrolü ile herhangi bir sinyal verir. PCR hazırlık işlemi sırasında kontaminasyon olabilir. Tüm örneklerin sonuçları geçersizdir. Sodyum hipoklorit ve etanol veya özel DNA dekontaminasyon reaktifleri ile cihazın tüm yüzeyleri dekontamine edin. Sonunda Pozitif kontrolü pipetleyin. Reaktiflerin yeni bir seti ile PCR hazırlanmasını tekrar edin. Sacace Biotechnologies Srl 44 Scalabrini str., Como, Italy