OPERE EDİLEN SPİNAL EPENDİMOMA OLGULARINDA P53, P27 VE Kİ-67 DEĞERLERİ VE PROGNOZ ÜZERİNE ETKİLERİ

Transkript

1 OPERE EDİLEN SPİNAL EPENDİMOMA OLGULARINDA P53, P27 VE Kİ-67 DEĞERLERİ VE PROGNOZ ÜZERİNE ETKİLERİ P53, P27 AND KI-67 EXPRESSION RATES AND EFFECTS ON PROGNOSIS IN CASES OF OPERATED SPINAL EPENDYMOMA Mustafa GÜVEN 1, Metin ŞANLI 2, Nebi YILMAZ 3, Ergün KARAVELİOĞLU 4, Evrim ÖZTÜRK 5, Zeki ŞEKERCİ 2 Osmaniye Devlet Hastanesi, Beyin ve Sinir Cerrahi Kliniği, Osmaniye. S.B. Yıldırım Beyazıt Eğitim Araştırma Hastanesi. 1.Beyin ve Sinir Cerrahi Kliniği, Ankara. Mustafa Kemal Üniversitesi, Beyin ve Sinir Cerrahi AD., Hatay. Afyon Bolvadin Devlet Hastanesi, Beyin ve Sinir Cerrahi Kliniği, Afyon. S.B. Yıldırım Beyazıt Eğitim Araştırma Hastanesi, Patoloji Kliniği, Ankara. Özet Bu çalışmada SSK Ankara Eğitim Hastanesi 1.Nöroşirürji Kliniğinde yıllarında tanı almış 22 adet spinal ependimoma olgusunda p53, p27 ve Ki-67 ekspresyon oranları araştırıldı.p53, p27 ve Ki-67 ekspresyon oranları ile olguların prognozu arasındaki ilişki istatistiksel olarak değerlendirildi. Her antikor için olguların prognozu dikkate alınarak eşik değeri araştırıldı. Ki-67 ekspresyonunun olguların prognozu ile doğru orantılı olarak artış gösterdiği gözlenirken Ki-67 için % 3 eşik değerine ulaşıldı. P27 ile aralarında istatistiksel olarak anlamlı, negatif korelasyon gösteren bir ilişki saptandı. P53 ekspresyonunun olguların prognozu ile doğru orantılı olarak artış gösterdiği gözlenirken, p53 için % 3 eşik değerine ulaşıldı. P27 ile aralarında istatistiksel olarak anlamlı, negatif korelasyon gösteren bir ilişki saptandı. P27 ekspresyonunun olguların prognozu ile istatistiksel olarak anlamlı bir ilişkisi olmadığı saptandı. Ki-67 ile p53 ekspresyonu arasında istastistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanmadı. Sonuç olarak; opere edilen spinal ependimomalarda yaş, cerrahi rezeksiyon miktarı, kitlenin yerleşimi, histopatolojik subtipi Ki-67 ve p53 ekspresyon oranları prognostik kriterler olarak saptanmıştır. Bu olguların postoperatif takibinde nüks açısından Ki-67 ve p53 ekspresyon oranlarının da dikkate alınması gerektiğini düşünmekteyiz. Anahtar sözcükler: Spinal ependimoma, P53, p27 ve Ki-67 ekspresyonu. Abstract In this study, we researched p53, p27 and Ki-67 expression rates in twenty two diagnosed cases of spinal ependymoma at 1ˢᵗ Neurosurgery Clinic of Social Security Institution, Ankara Education Hospital in between Correlation of p53, p27 and Ki-67 expression rates and prognosis of the cases were evaluated statistically. We researched the cut-off point for each anticor with considering the account of prognosis. It was observed that Ki-67 expression increased directly proportional with prognosis. Cut-off point of Ki-67expression obtained 3%. It was determined a relationship which is statistically significant and a negative correlation between Ki-67 and p27. It was observed that P53 expression increased directly proportional with prognosis. Cut-off point of p53 expression obtained 3%. It was determined a relationship which is statistically significant and a negative correlation between p53 and p27. It was determined that P27 expressions insignificant correlation statistically with prognosis of cases. It was detect that there is not significant correlation statistically between Ki-67 and p53.as a result, age, amount of surgical resection, localization of mass, histopathologic subtype, expression rates of Ki-67 and p53 were determined as prognostic criteria in operated spinal ependymomas. We think that expression rates of Ki-67 and p53 must be considered in term of recurrence in postoperative follow-up. Key words: spinal ependymoma, p53, p27 and Ki-67 expression. Giriş Ependimomlarda prognostik parametreleri belirlemek ve tedavi protokollerini geliştirebilmek amacı ile yapılmış çok sayıda çalışma vardır. Hasta yaşı, tümör lokalizasyonu, tümör hacmi ve histopatolojik bulgular gibi verileri değerlendiren çalışmalar ile tatminkâr sonuçlar ortaya çıkmaması nedeni ile son zamanlarda ependimomlarda moleküler biyolojiyi temel alan çalışmalar önem kazanmıştır. Farklı yöntemler ile klinik ve histolojik verilerden bağımsız bir şekilde, doğrudan tümör biyolojisi araştırılarak, tümör davranışı hakkında bilgiler elde edilebilmektedir. Özellikle tümörün proliferasyon kapasitesinin, evre ve histolojik derece gibi malignite kriterleri ile prognoz üzerindeki etkisini değerlendiren çalışmalar gündemdedir [1-4]. Bu çalışmalar arasında basit bir metodoloji ile hızlı değerlendirme olanağı sağlaması nedeni ile Mustafa GÜVEN Osmaniye Devlet Hastanesi Beyin Cerrahi Servisi, Osmaniye guven2340@hotmail.com Makalenin gönderilme tarihi: Makalenin kabul edilme tarihi:

2 GÜVEN ve ark. immünohistokimyasal çalışmalar avantajlı durumdadır. Proliferasyon kapasitesinin bir göstergesi olarak meme, akciğer, serviks, mesane ve lenf nodu gibi bir çok organ malignitesinde Ki67/MIB1 ekspresyon oranları araştırılmıştır [1,5,6]. Son zamanlarda Ki67 / MIB1, ependimomlarda da kullanım alanı bulmuştur [3,4,7-9]. Bir tümör baskılayıcı gen olan p53 geninde mutasyon veya kayıp tespit edilmesi erken genetik değişikliği temsil eder. Ependimomlarda kullanımından yeni sözedilen belirleyicilerden biri de p27 dir. Hücre siklusundaki spesifik rolü göz önünde bulundurulduğunda p27 düzeylerinin belirlenmesinin, glial neoplazilerde görülen hücre siklus sapmaları üzerinde yorum yapma olanağı sağlayacağı düşünülmüştür. P53, P27 ve Kİ-67 ekspresyon oranlarının prognoz ile ne düzeyde korelasyon gösterdiğini araştırmak üzere kliniğimizde tanı almış 22 spinal ependimoma olgusunu değerlendirildi (Tablo 4). Gereç ve Yöntem Çalışmaya alınan olgularda preoperatif olarak; Anamnez, fizik muayene, Manyetik Rezonans Görüntüleme (MRG), Postoperatif olarak; Peryodik MRG ile kontrol muayeneleri yapıldı. Postoperatif rezeksiyon materyallerinden immünhistokimyasal yolla boyanarak elde edilen p53, p27 ve Kİ-67 işaretleme indeksleri esas alındı (Tablo 2). Preoperatif ve postoperatif takiplerde fonksiyonel açıdan hastalar Nurick skalası ile değerlendirildi (Tablo 1) [10]. Tablo 1: Myelopatide kullanılan fonksiyonel Nurick gradelemesi. Grade Anlamı 0 Bulgu yok 1 Bulgu var, ancak yürümede zorlanma yok 2 Tam gün çalışmayı engellemeyecek şekilde hafif zorlanarak yürüme 3 Yürürken başkasının yardımına ciddi ihtiyaç duymaz, tüm ev işlerini yapabilir, tam gün çalışmayı engelleyecek şekilde zorlanarak yürüme 4 Yürürken başkasının yardımına ihtiyaç duyar 5 Sandalyeye veya yatağa bağımlı Olgular; tümörün lokalizasyonu gözönüne alınarak servikal, servikotorakal, torakal ve konus olarak gruplandırıldı. Cerrahi prosedür; operasyon gözlemi ve postoperatif dönemde (2, 6 ve 12.ayda) çekilen MRG ile belirlenen rezeksiyon miktarına parsiyel, subtotal ve total olarak gruplandırıldı. Opere edilen 22 olgunun operasyon materyalleri SSK Ankara Eğitim Hastanesi Patoloji Kliniği laboratuarında incelenerek histolojik subtip ile p53, p27 ve Ki-67 immünhistokimyası belirlendi. Çalışma grubunu; 14 ependimom, 7 miksopapiller tip ependimom ve 1 tannisitik ependimom olgusu oluşturdu. İmmünohistokimyasal boyama İmmünperoksidaz- AEC substrat kromojen sistemi ile yapıldı. Her olgudan hazırlanan 3 er kesitten birine Ki67, birine p53, birine de p27 antikorları uygulandı. İmmünohistokimyasal boyamanın ardından kesitler ışık mikroskobunda incelendi. Yüzde cinsinden elde edilen boyanma oranları nın antikorun işaretleme indeksi ni temsil ettiği kabul edildi. Olgu bazında Ki67, P53 ve P27 için ayrı ayrı hesaplanan işaretleme indeksleri ile olguların prognozu arasındaki korelasyon istatistiksel olarak araştırıldı. Tüm değişkenler (hasta yaşı, cinsiyeti, şikayetlerin başlangıcından cerrahiye kadar geçen süre, tümörün yeri, tümörde kistik yapı, hemorraji ve kordda syrinkse neden olup olmadığı, cerrahi eksizyon oranı, tümörün histopatolojik subtipi, antikor işaretleme indeksleri, prognoz, hastaya radyoterapi verilip verilmediği ) için skorlar hesaplandı. Takip sürelerinin başlangıcı olarak operasyon tarihi kabul edildi. Birden fazla operasyon geçirenlerde (2 olgu) de immünohistokimyasal çalışma son operasyonlarında elde edilen materyallerden yapıldı. Verilerin istatistiki analizi SPSS (Ver.11.5) programı ile PC tabanlı bir bilgisayarda yapılmıştır. Olguların prognozu ile patolojisi, radyolojik bulguları ve immünhistokimyasal değişkenlerinin bağıntısı (oran ile sayılar) Mann Whitney U Wilcoxon Rank Sum W testi, birden fazla özellik içeren olguların prognozu ile patolojisi, radyolojik bulguları ve immünhistokimyasal değişkenlerinin bağıntısı (birden çok oran ile sayılar) Kruskal-Wallis testi ile, bağımsız gruplar arasındaki farklılıklar Ki-kare testi ile değerlendirildi. Rekürrenssiz sağ kalım süreleri Kaplan-Meier metodu ile değerlendirilerek farklılıklar Log-Rank test ile analiz edildi. p<0.05 olasılık değeri istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. Pearson korelasyon katsayısı kullanılarak 3 antikorun işaretleme indeksleri arasındaki korelasyon değerleri ve anlamlılık düzeyleri araştırıldı. Bulgular 154

3 Opere edilen spinal ependimoma olgularında P53, P27 Ve Ki-67 ve prognoz Yaş prognostik bir faktördür. 35 yaş üzerinde prognoz daha kötüdür. Histopatolojik subtipler prognostik değerde bulunmuştur. Miksopapiller subtipde prognoz en iyi iken, Klasik(tipik) Ependimomda en kötüdür. Tablo2: p53, p27 ve Ki-67 İşaretleme İndekslerinin Histolojik Subtiplere Göre Dağılımı Histolojik subtip Antikor Olgu sayısı (N) Minimum Maksimum Ortalama Standart hata Ependimom P P Ki Miksopapiller P P Ki Tanisitik P P Ki P53, p27 ve Ki-67 oranları ile yaş, cinsiyet ve nüks oranı arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptanamamıştır. Ki67 işaretleme indekslerinin, kötü prognoz ile istatistiksel olarak anlam gösterir bir şekilde arttığı saptanmıştır. Ki67 için kötü prognoz ve iyi prognoz arasında % 3 düzeyinde bir eşik değerine ulaşıldı (Tablo 3). P53 için kötü prognoz ve iyi prognoz arasında % 3 düzeyinde bir eşik değerine ulaşıldı. P53 işaretleme indekslerinin, kötü prognoz ile istatistiksel olarak anlam gösterir bir şekilde arttığı saptanmıştır (Tablo 3).P27 işaretleme indekslerinin olguların prognozu ile korelasyon göstermediği saptandı (Tablo 3). Tablo3: Olguların Prognoz ve p53, p27 ve Ki-67 Ekspresyon Oranlarına Göre Dağılımı Prognoz İyi Kötü p P53 <%3 7 3 % P27 <% % Ki-67 <% % Ki67 ve p27 ekspresyon oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı zıt bir ilişki saptandı. P53 ve p27 ekspresyon oranları arasında istatistiksel olarak anlamlı zıt bir ilişki saptandı. Yaptığımız çalışmada elde ettiğimiz sonuçlar ışığında özellikle Ki-67, p53 ve p27 ekspresyon oranlarını araştıran yeni çalışmalar sayesinde eşik değerleri açısından her tümör için standart değerlere ulaşılabileceği düşüncesindeyiz. Sonuç olarak p53 ve Ki-67 ekspresyon oranları dikkate alınarak belirlenen tedavi protokollerinin daha verimli olacağını düşünmekteyiz. Benzer şekilde, Ki-67 ve p53 antikorları için belirlenen eşik değerleri bize prognoz üzerine daha net bir yorum yapma olanağına ulaşılabileceğini düşündürdü. Tartışma Ependimomlar erişkinlerde spinal kordun ensık görülen İntramedüller tümörüdür. Bu tümörlerin nasıl bir biyolojik davranış içinde olacağı histolojik tanısı belirlense bile kesin belli değildir. Son yıllarda tüm glial kitlelerde olduğu gibi ependimomlarda da tümörlerin biyolojik davranışlarını önceden belirleyecek kriterleri bulmaya yönelik yoğun çalışmalar yapılmaktadır. Tümörün prognozunun önceden belirlenmesi; uygulanacak tedavi yöntemlerinin seçilmesi, hasta ve hasta yakınlarının bilgilendirilmesi açısından önem taşımaktadır. Ki67, p53 ve p27 bir çok organ malignitesinde olduğu gibi spinal ependimomlarda da doğrudan tümör biyolojisi üzerinde yorum yapabilmek 155

4 GÜVEN ve ark. amacı ile kullanımı gündeme gelmiş immünohistokimyasal antikorlardandır. Kötü prognozlu glial tümörlerin, ileri yaşlarda görülme eğiliminde olduğu bilinmektedir. Çalışma grubunu oluşturan olgularda; hasta yaşı ve prognoz arasındaki istatistiksel korelasyon araştırıldı. Hasta yaşı arttıkça, prognozun da istatistiksel düzeyde anlamlı olarak kötüleştiği saptandı. Özellikle 35 yaş üzerindeki olgularda prognozun daha da kötü olduğu saptandı. Chang ve ark., tümörün yerleşimi, cerrahi rezeksiyon oranı ve histopatolojik subtipin de spinal ependimomlarda prognostik olduğunu gösteren çalışmalar yapmışlardır [11]. Literatürle uyumlu olarak serimizde intramedüller yerleşimli tümörlerde total rezeksiyon oranının daha yüksek olduğu görüldü. Konus-filum terminale düzeyindeki ependimomlarda rotlara yapışık olduğundan dolayı total rezeksiyonun güç olduğu bilinmektedir. Çalışmamızda Miksopapiller subtipte prognozun en iyi, klasik (tipik) ependimomlarda prognozun en kötü olduğu saptandı. P53 ekspresyon oranı % 3 ün altında olan olgular ile % 3 ve üzerinde olan olgular arasında prognoz yönünden istatistiksel olarak anlamlı fark saptandı. Buna göre p53 ekspresyon oranı % 3 ün altında olan olgularda prognoz iyi, % 3 ve üstünde olan olgularda ise prognoz kötü olarak saptandı (Tablo 3). Prayson 1997 yılında yaptığı bir çalışmada spinal ependimomlarda p53 ekspresyon oranını % 1 in altında bularak prognostik bir faktör olmadığını, ancak DNA tamiri gibi normal hücre fonksiyonu için bu oranın normal sayılabileceğini bildirmiştir [3,4,9]. Korshunov ve ark, 2002 yılında P53 ekspresyon oranının spinal ependimomlarda istatistiki olarak anlamlı derecede ilişkili olmadığını bildirmiştir [7,8,12]. P27 bir siklin bağımlı kinaz inhibitörüdür. Hücre siklus anormalliklerinin belirlenmesine olanak sağlamasından dolayı p27 ekspresyon oranları, son zamanlarda glial tümörlerde de araştırılmaktadır. P27 ekspresyon oranı % 30 un altında olan olgular ile % 30 ve üzerinde olan olgular arasında prognoz yönünden istatistiksel olarak anlamlı fark saptanmadı. Wakimoto ve ark yılında nöral dokunun p27 açısından oldukça zengin bir doku olduğunu bildirmiştir [13]. Tikoo ve ark yılında, glial öncü hücrelerde p27 yukarı düzenlenmesi (upregulation) olduğunu bildirmiştir [14]. Korshunov ve ark. ın yaptığı çalışmada p27 indeksini düşük dereceli ependimomlarda ortalama % 41.3, yüksek dereceli ependimomlarda % 15.7 olarak bildirilmiştir [7,12]. Korshunov ve ark. ın 2003 yılında yaptığı bir çalışmada ise meninjiomlarda p27 ekspresyon oranları ile histolojik derece ve prognoz arasında herhangi bir korelasyon olmadığını bildirmişlerdir [12]. Ependimomlarda Ki-67 ekspresyon oranları ile prognozu arasındaki korelasyonu incelemek ve Ki-67 eşik değerini (cut-off point) belirlemek amacı ile çalışmalar yapılmıştır [1,9,15]. Zuber ve ark. tarafından ependimomlar üzerinde yapılan bir çalışmada: ortalama Ki-67 indeksi ve prognoz arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki bildirilmiştir [16]. Bu çalışma ile; ependimomlarda % 0 5.5, düşük dereceli astrositomlarda %0-4.5, anaplastik astrositomlarda % , glioblastom multiforme olgularında % aralığında değişen Ki67 indeks değerleri elde edilmiştir. Aynı çalışmada prognoz da araştırılarak, Ki67 indeksinin % 3 den düşük olduğu olgularda yaşam periyodunun 40 haftadan fazla olduğu bildirilmiştir. Parkins ve ark. ın yaptığı başka bir çalışmada Ki- 67 indeksi ve prognoz arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki tespit edilmiş olup kötü prognozlu olgularda Ki-67 indeksinin de yükseldiği bildirilmiştir [17]. Yaptığımız çalışmada, literatür sonuçları ile uyumlu olarak olguların prognozu ve Ki-67 indeksi arasında istatistiksel olarak anlamlı bir ilişki saptandı. Elde ettiğimiz sonuçlara göre; Ki- 67 indeksinde artış ile birlikte prognozun da kötüleştiği izlendi (Tablo 3). Buna göre iyi prognozlu tümörlerde Ki67 indeksi % 3 den küçük iken kötü prognozlu tümörlerde % 3 ve daha yüksek olarak saptandı. Bu değer Ki67 indeksinin, ependimomlarda iyi prognozdan kötü prognoza geçiş noktasını belirledi. Montine ve ark. tarafından 1994 yılında yapılan bir çalışmada; Ki67 indeksinin, histolojik derece ve prognozla korelasyonu araştırılmış olup, % 7.5 lik eşik değerinin yüksek histolojik derece ve kötü prognozla istatistiksel olarak anlamlı ilişki gösterdiği bildirilmiştir [18]. Jaros ve ark. tarafından yapılan başka bir çalışmada; % 5 Ki67 indeks değeri kısa yaşam beklentisi için eşik değeri olarak bildirilmiştir [19]. Çalışmamızda prognoz ve Ki-67 indeksi arasında korelasyon araştırıldı, % 3 değeri üzerindeki Ki67 indekslerinin kötü prognoz ile ilişkili olduğu saptandı (Tablo 3). Elde ettiğimiz indeks değerleri literatür verileri ile karşılaştırıldığında, değerlerimizin literatürde belirtilenlere göre daha düşük seviyelerde olduğu 156

5 Opere edilen spinal ependimoma olgularında P53, P27 Ve Ki-67 ve prognoz görüldü. Değerlerin düşük düzeylerde bulunmasının, çalışma grubunu oluşturan olguların patoloji bloklarının eski olup immün boyanma tutmadıklarından kaynaklanmış olabileceği düşüncesindeyiz. Olgularının sayısını arttırarak, daha çok sayıda olgunun değerlendirilmesinin anlamlı olacağı kanısındayız. Kaynaklar 1. Kelley MJ, Johnson BE. Genetic mechanisms of solid tumor oncogenesis. Advances in internal medicine. 1994;39: Lloyd RV, Erickson LA, Jin L, Kulig E, Qian X, Cheville JC, et al. p27kip1: a multifunctional cyclin-dependent kinase inhibitor with prognostic significance in human cancers. The American journal of pathology. 1999;154(2): Prayson RA. Myxopapillary ependymomas: a clinicopathologic study of 14 cases including MIB-1 and p53 immunoreactivity. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 1997;10(4): Prayson RA. Clinicopathologic study of 61 patients with ependymoma including MIB-1 immunohistochemistry. Annals of diagnostic pathology. 1999;3(1): Linden MD, el-naggar AK, Nathanson SD, Jacobson G, Zarbo RJ. Lack of correlation between flow cytometric and immunohistologic proliferation measurements of tumors. Modern pathology : an official journal of the United States and Canadian Academy of Pathology, Inc. 1996;9(6): Fearon ER, Vogelstein B. A genetic model for colorectal tumorigenesis. Cell. 1990;61(5): Korshunov A, Golanov A, Timirgaz V. Immunohistochemical markers for intracranial ependymoma recurrence. An analysis of 88 cases. Journal of the neurological sciences. 2000;177(1): Korshunov A, Golanov A, Timirgaz V. Immunohistochemical markers for prognosis of ependymal neoplasms. Journal of neuro-oncology. 2002;58(3): Prayson RA. Cyclin D1 and MIB-1 immunohistochemistry in ependymomas: a study of 41 cases. American journal of clinical pathology. 1998;110(5): Nurick S. The pathogenesis of the spinal cord disorder associated with cervical spondylosis. Brain : a journal of neurology. 1972/01/01 ed1972. p Chang UK, Choe WJ, Chung SK, Chung CK, Kim HJ. Surgical outcome and prognostic factors of spinal intramedullary ependymomas in adults. Journal of neuro-oncology. 2002;57(2): Korshunov A, Shishkina L, Golanov A. Immunohistochemical analysis of p16ink4a, p14arf, p18ink4c, p21cip1, p27kip1 and p73 expression in 271 meningiomas correlation with tumor grade and clinical outcome. International journal of cancer Journal international du cancer. 2003;104(6): Wakimoto H, Aoyagi M, Nakayama T, Nagashima G, Yamamoto S, Tamaki M, et al. Prognostic significance of Ki-67 labeling indices obtained using MIB-1 monoclonal antibody in patients with supratentorial astrocytomas. Cancer. 1996;77(2): Tikoo R, Casaccia-Bonnefil P, Chao MV, Koff A. Changes in cyclin-dependent kinase 2 and p27kip1 accompany glial cell differentiation of central glia-4 cells. The Journal of biological chemistry. 1997;272(1): Deckert M, Reifenberger G, Wechsler W. Determination of the proliferative potential of human brain tumors using the monoclonal antibody Ki-67. Journal of cancer research and clinical oncology. 1989;115(2): Zuber P, Hamou MF, de Tribolet N. Identification of proliferating cells in human gliomas using the monoclonal antibody Ki-67. Neurosurgery. 1988;22(2): Parkins CS, Darling JL, Gill SS, Revesz T, Thomas DG. Cell proliferation in serial biopsies through human malignant brain tumours: measurement using Ki67 antibody labelling. British journal of neurosurgery. 1991;5(3): Montine TJ, Vandersteenhoven JJ, Aguzzi A, Boyko OB, Dodge RK, Kerns BJ, et al. Prognostic significance of Ki-67 proliferation index in supratentorial fibrillary astrocytic neoplasms. Neurosurgery. 1994;34(4):674-8; discussion Jaros E, Perry RH, Adam L, Kelly PJ, Crawford PJ, Kalbag RM, et al. Prognostic implications of p53 protein, epidermal growth factor receptor, and Ki-67 labelling in brain tumours. British journal of cancer. 1992;66(2):