T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SELÇUK ÜNĠVERSĠTESĠ FEN BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ SCOLYMUS HISPANICUS L. (ASTERACEAE) UN IN VITRO ANTĠOKSĠDAN ÖZELLĠKLERĠNĠN FARKLI METOTLAR ĠLE ARAġTIRILMASI Abdullah ÇETĠN YÜKSEK LĠSANS TEZĠ Biyoloji Anabilim Dalı Mayıs-2012 KONYA Her Hakkı Saklıdır

2

3 TEZ BĠLDĠRĠMĠ Bu tezdeki bütün bilgilerin etik davranış ve akademik kurallar çerçevesinde elde edildiğini ve tez yazım kurallarına uygun olarak hazırlanan bu çalışmada bana ait olmayan her türlü ifade ve bilginin kaynağına eksiksiz atıf yapıldığını bildiririm. DECLARATION PAGE I hereby declare that all information in this document has been obtained and presented in accordance with academic rules and ethical conduct. I also declare that, as required by these rules and conduct, I have fully cited and referenced all material and results that are not original to this work. Tarih: Abdullah ÇETİN

4 1 ÖZET YÜKSEK LĠSANS TEZĠ SCOLYMUS HISPANICUS L. (ASTERACEAE) UN IN VITRO ANTĠOKSĠDAN ÖZELLĠKLERĠNĠN FARKLI METOTLAR ĠLE ARAġTIRILMASI Abdullah ÇETĠN Selçuk Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı DanıĢman: Prof. Dr. Abduraahman AKTÜMSEK 2012, 38 Sayfa Jüri Prof. Dr. Abdurrahman AKTÜMSEK Prof.Dr. Muhsin KONUK Doç.Dr. Murad Aydın ġanda Scolymus hispanicus Anadolu geleneksel halk hekimliğinde çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanılmaktadır. Bu çalışmada S. hispanicus un metanolik ekstraktının antioksidan özellikleri; toplam antioksidan, serbest radikal süpürme etkinliği (DPPH testi), β- karoten /linoleik asit metodu, demir ve bakır indirgeme güçlerini içeren farklı kimyasal test sistemleri kullanılarak değerlendirilmiştir. Toplam fenolik ve flavonoid içerikler belirlenmiştir. Toplam fenolik ve flavonoid içerik sırasıyla mggae/g ve mgre/g olarak tespit edilmiştir. DPPH yönteminde 2 mg/ml konsantrasyonda %92.09 etkinlik gözlenmiştir. β-karoten/ linoleik asit test sisteminde, 4 mg/ml konsantrasyon linoleik asit oksidasyonu %81.31 oranında inhibe edilmiştir. Demir ve bakır indirgeme güçleri ise konsantrasyona bağlı bir durum sergilemektedir. Bu sonuçlar S. hispanicus un doğal antioksidanların bir kaynağı olarak gıda ve farmakoloji endüstrilerinde kullanılabileceğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: Antioksidan, Fenolik içerik, Serbest radikal, Scolymus hispanicus, Türkiye.

5 2 ABSTRACT MS THESIS INVESTIGATION OF IN VITRO ANTIOXIDANT PROPERTIES OF SCOLYMUS HISPANICUS L. (ASTERACEAE) WITH DIFFERENT METHODS Abdullah ÇETĠN THE GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCE OF SELÇUK UNIVERSITY THE DEGREE OF MASTER OF SCIENCE IN BIOLOGY Advisor: Prof. Dr. Abdurrahman AKTUMSEK 2012, 38 Pages Jury Advisor Prof. Dr. Abdurrahman AKTUMSEK Prof. Dr. Muhsin KONUK Assoc Prof. Dr. Murad Aydın SANDA Scolymus hispanicus is used in Anatolian folk medicine for the treatment of various ailments. In the present study, The antioxidant properties of methanolic extract obtained from S. hispanicus was evaluated by different chemical assays, including total antioxidant, free radical scavenging activity (DPPH method), β-carotene/linoleic acid test system, ferric and cupric reducing power. Total phenolic and flavonoid content were also determined. Total phenolic and flavonoid content were detected as mggae/g and mgre/g, respectively. The free radical scavenging activity was observed as 92.09% at 2 mg/ ml concentration in DPPH method. In B-carotene/linoleic acid system, the extract exhibited % inhibition against linoleic acid oxidation. Moreover, the ferric and cupric reducing powers were concentration-dependent manner. The results indicated that S. hispanicus can be exploited as a source of natural antioxidants in food and pharmacological industry. Keywords: Antioxidant, Phenolic content, Free radical, Scolymus hispanicus, Turkey.

6 3 ÖNSÖZ Selçuk Üniversitesi, Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü, Fizyoloji-Biyokimya Araştırma Laboratuarı nda yürütülmüş olan bu tez çalışmasında, Türkiye florası için oldukça önemli bir tür olan Scolymus hispanicus un antioksidan kapasitesi belirlenmiştir. Bu tür ile yürütülmekte olan çalışmaların bir bölümünü bana tez olarak veren danışman hocam Prof. Dr. Abdurrahman AKTÜMSEK e teşekkür ederim. Tez çalışmasının her aşamasını gerçekleştiren, bitkileri toplayan, analizleri yapan ve tezi yorumlayan Arş. Gör. Gökhan ZENGİN e özellikle çok teşekkür ederim. Ayrıca laboratuvar çalışmalarına katkıları olan Doç. Dr. Gökalp Özmen GÜLER ve Yrd. Doç. Dr. Yavuz Selim ÇAKMAK ve Şengül UYSAL a teşekkürü borç bilirim. Bu araştırma projesini nolu projeyle maddi olarak destekleyen Selçuk Üniversitesi Bilimsel Araştırma Proje Koordinatörlüğüne (BAP) de teşekkür ederim. Abdullah ÇETİN KONYA-2012

7 4 ĠÇĠNDEKĠLER ÖZET... 1 ABSTRACT... 2 ÖNSÖZ... 3 ĠÇĠNDEKĠLER GĠRĠġ KAYNAK ARAġTIRMASI Serbest Radikaller ve Antioksidanlar Fenolik Bileşikler Asteraceae Familyası ve Scolymus Cinsi MATERYAL VE YÖNTEM Scolymus hispanicus Hakkında Taksonomik Bilgiler Bitkisel Ekstraktın Hazırlanması Toplam fenolik madde tayini (Folin yöntemi) Total Flavonoid Tayini Toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi DPPH süpürme etkinliği β-karoten/linoleik asit test sistemi Bakır indirgeme gücü (CUPRAC testi) Demir indirgeme gücü (Fe(III) Fe(II)) ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA Toplam Fenolik ve Flavonoid Madde İçeriği Toplam Antioksidan Kapasite Serbest Radikal Süpürme Etkinliği (DPPH Testi) Demir İndirgeme Gücü Bakır İndirgeme Gücü (CUPRAC Testi) β-karoten/linoleik Asit Test Sistemi Antioksidan Testlerinden elde edilen EC 50 ve IC 50 değerleri SONUÇLAR VE ÖNERĠLER Sonuçlar Öneriler KAYNAKLAR ÖZGEÇMĠġ... 38

8 5 1. GĠRĠġ Bitkilerin tedavi amacıyla kullanımı insanlık tarihinin erken dönemlerine kadar dayanmaktadır. Tarihin erken devrelerinden günümüze kadar tedavi amacıyla kullanılan bitkilerin miktarı artış göstermektedir. Mezopotamya uygarlığında tedavi amacıyla kullanılan bitkilerin sayısı 250 civarı iken, bu sayı Ortaçağda 4000 e, 19. yüzyılın başında ise e ulaşmıştır (Ceylan, 1995). Bitkilerin tedavi edici, şifa kaynağı olarak kullanımlarına ilginin artmasında özellikle sentetik ilaçların oluşturduğu bazı yan etkiler önemli rol oynamaktadır (Branen, 1975; Sebranek ve ark., 2005). Bu durum özellikle ilaç endüstrisi için yeni hammaddelerin tespitine yönelik çalışmaların oldukça hız kazanmasına yol açmıştır. Günümüzde de yine nüfusun çoğunluğu için bitkiler, ilaç hammaddesi olarak kullanılmaktadır. Özellikle gelişmekte olan ülkelerde nüfusun %80 i sağlık gereksinimlerini ilk etapta geleneksel tıbbi bitkilerden sağlamaktadır. Bu ülkelerdeki gerek ekonomik şartların zorluğu, gerekse tıbbi tedavilerin yetersizliğinin insanları bu yöne yönlendirdiği düşünülmektedir (Alkofahi ve ark., 1990). Serbest radikaller olarak nitelendirilen ve bünyesinde eşlenmemiş elektronları içeren başta reaktif oksijen türleri olmak üzere birçok radikal türü organizmadaki çeşitli metabolik olaylar sırasında meydana gelmektedir (Miller ve ark., 1990; Halliwell ve ark., 1995). Bu radikaller oldukça kısa ömürlü olup diğer atom ve moleküller ile oldukça kolay reaksiyona girerek yeni radikallerin oluşumuna yol açarlar. Radikaller başta aşırı doymamış yağ asitleri olmak üzere proteinler, karbohidratlar ve nükleik asitlerle reaksiyona girerek bu moleküllerde hasarların oluşmasına sebep olurlar. Bu durumun doğal sonucu olarak oluşan radikaller ateroskleroz, kanser, diabet, nörodejeneratif hastalıklar gibi birçok hastalığın patogenezinde rol oynamaktadır (Davies et al., 1991; Sies, 1991; Langseth, 1996). Bu nedenle son zamanlarda radikallerin veya onların zararlı etkilerini ortadan kaldıran ve antioksidanlar olarak nitelendirilen bileşiklerin araştırılması son derece ilgi çekici konular arasındadır. Yapılan araştırmalar gıdaların işlenmesi sırasında yoğun olarak kullanılan sentetik antioksidanların örneğin BHA, BHT ve PG nin insan sağlığı üzerine toksik etkilerinden dolayı kullanımlarının sınırlandırılması gerektiğini göstermiştir (Schildermann ve ark., 1995). Bu açıdan sentetik antioksidanların daha ucuz ve güvenli doğal antioksidanlarla yer değiştirmesine yönelik çalışmalar oldukça hız kazanmıştır.

9 6 Bitkiler bünyelerinde bulundurdukları sekonder metabolitler olarak nitelendirilen bileşikler son zamanlarda sergiledikleri biyolojik etkinlikleri ile oldukça dikkat çekicidir. Bu bileşiklerin ana grubunu fenolikler oluşturmaktadır. Fenolik bileşikler aromatik bir halkaya sahip hidroksil grubu içeren ve bu hidroksil grubundan hidrojen kaybetmeye meyilli bileşiklerdir. Yapılan çalışmalar bitkilerin gösterdiği tedavi edici özelliklerin özellikle fenolik bileşiklerden kaynaklandığını göstermiştir (Matkowski, 2006). Fenolik bileşiklerin serbest radikalleri veya bunların zararlı etkilerini ortadan kaldırıp güçlü antioksidan özellik sergilemelerinin yanı sıra antiinflamatuvar, antimikrobial ve antimutagenik etkinlikleri rapor edilmiştir. Bu etkin biyolojik özellikleri fenolik bileşikleri bilimsel çalışmalarda oldukça önemli bir konuma getirmiş ve bu bileşikler üzerine başta saflaştırma olmak üzere birçok biyolojik çalışmalar oldukça hız kazanmış durumdadır. Çoğu araştırmada meyve ve sebze tüketiminin artırılması ile serbest radikallerden kaynaklanan kanser ve kalp hastalıklarının oluşumu arasında ters orantılı bir ilişki olduğu saptanmıştır (Doll, 1990). Türkiye bitki çeşitliliği ve floristik açıdan oldukça dikkat çekicidir. Flora bünyesinde yaklaşık 10 bin bitki türü içermektedir. Bu bitkilerin ise yaklaşık %35 i Türkiye ye özgü endemik türlerdir. Türkiye nin bu bitki çeşitliliğine sahip olmasında; floristik yapısı bakımından farklı üç bitki coğrafya bölgesinin kesiştiği bir konumda olması, Anadolu nun Avrupa ve Asya kıtası arasında köprü konumunda olması ve buna bağlı olarak iki kıta arasında karşılıklı bitki göçleri ile çeşitliliğin artması, birçok cins ve seksiyonun farklılaşma merkezinin Anadolu oluşu, edafik (topraksal) faktörlerin oldukça çeşitlilik göstermesi büyük öneme sahiptir (Erik ve Tarikahya, 2004). Modern dünyada sağlık ve çevre büyük öneme sahipse de ekonomik çıkmazlar insanları başta tedavi olmak üzere çeşitli alanlara yönlendirmiştir. Bu durumda yapılacak çalışmalarla ülkelerin bünyelerinde bulundurdukları doğal zenginlikleri kullanmaları ekonomik ve bilimsel açıdan önem arz etmektedir. Bu nedenle başta etnofarmakolojik çalışmalar olmak üzere doğal bitki kaynakları üzerine yapılan çalışmalar bilimsel çalışmalar içerisinde oldukça popüler konumdadır. Dünya üzerinde yetişen çeşitli bitkilerin, etkin madde bakımından çok azının araştırılmış olduğu göz önüne alınırsa, bitkiler aleminde daha birçok bitkinin keşfedilmeyi beklediğini söylenebilir (İlisulu, 1992; Baytop, 1999).

10 7 Asteraceae familyası ekonomik ve tıbbi öneme sahip bitki türünü içermektedir. Ülkemizde ise Asteraceae familyası 152 cins ve 1239 tür ile temsil edilmektedir (Davis, 1975). Scolymus cinsi ülkemizde 3 tür ile temsil edilmektedir (S. hispanicus, S. maculatus ve S. grandiflorus). S. hispanicus ülkemizde ise Ege bölgesinde Akça kızı, Çetmi dikeni, Kızılgöz dikeni, Sarıdiken gibi isimlerle bilinmektedir (Baytop, 2007). Bu türlerin geleneksel halk hekimliğinde çok farklı kullanımları rapor edilmiştir (Ugulu ve ark., 2009). Örneğin bazı bölgelerde tohumlarının karın ağrısı, ishal ve nefrit tedavisinde kullanıldığı ayrıca bitkinin kök ve yaprak kısımlarının çeşitli yörelerde besin olarak tüketildiği belirtilmiştir (Ertuğ, 2004). Bu tez çalışması kapsamında Scolymus hispanicus un antioksidan özellikleri farklı test sistemleri ile ortaya çıkarılarak ve ele geçen sonuçlarla bu bitkinin başta gıda farmakoloji olmak üzere bir çok endüstri için ham madde kaynağı olup olmayacağının belirlenmesi amaçlanmıştır.

11 8 2. KAYNAK ARAġTIRMASI 2.1. Serbest Radikaller ve Antioksidanlar Serbest radikal terimi bünyesinde eşlenmemiş elektronları taşıyan atom veya moleküllere verilen genel isimdir. Eşlenmemiş elektronları bünyesinde bulundurduğundan ötürü, radikaller aktivitesi oldukça yüksek olan türlerdir ve birçok molekül ile reaksiyona girerek yeni radikal türleri oluşumuna yol açar (Halliwell ve Gutteridge, 1989). Serbest radikaller üç yolla meydana gelirler: 1. Kovalent bağlı bir molekülün, her bir parçasında ortak elektronlardan birisinin kalkarak homolitik bölünmesi, X:Y X. + Y. 2. Normal bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün hidrolitik bölünmesi, X:Y X: - + Y + 3. Normal bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi, A + e - A.- Serbest radikaller içerisinde en önemli grubu reaktif oksijen türleri veya metabolitleri olarak da nitelendirilen serbest oksijen radikalleri oluşturmaktadır. Reaktif oksjen türlerinin ana kaynağı mitokondrial elektron transport zinciridir (Naqui ve ark., 1986). Aerobik canlılar için yaşamın devamı mutlak gerekli olan oksijene elektronların taşınması sırasındaki elektron sızıntısı serbest oksijen türlerinin oluşmasına yol açar. Moleküler oksijenin bir elektron alarak indirgenmesi ile süperoksit, iki elektron alarak indirgenmesi ile hidrojen peroksit, üç elektron alarak indirgenmesi ile hidroksil radikali meydana gelir.

12 9 Şekil 2.1. Serbest oksijen ve azot radikallerinin oluşumu Serbest oksijen radikaller başta aşırı doymamış yağ asitleri olmak üzere tüm makromoleküllerde hasar meydana getirerek kanser, diabet ve kardiovasküler hastalıkların patogenezinde rol alırlar (Atoui ve ark., 2003; Alasalvar ve ark., 2005). Serbest radikaller hücre membranlarında bulunan aşırı doymamış yağ asitlerini okside ederek hücre membranlarında geçirgenliğin artmasına ve kontrolün kaybolmasına neden olur. Bu durumun doğal sonucu olarak hücre ölümleri meydana gelir (Halliwell ve Aruoma, 1991). Serbest radikalleri ve bunların zararlı etkilerini ortadan kaldırmak için organizmada enzimatik bir savunma sistemi mevcuttur. Bu sistem katalaz, süperoksit dismutaz, glutatyon peroksidaz, glutatyon transferaz gibi bir grup enzimi içermektedir (Halliwell, 1994; Roome ve ark., 2008).

13 10 Şekil 2.2. Serbest radikallerin enzim sistemi ile etkisiz hale getirilmesi Ancak radikal üretimi bu enzimatik sistemin kapasitesini aşarsa bu durumda antioksidanlar olarak nitelendirilen bileşiklerin diyetle alınması büyük önem taşımaktadır. Yapılan çalışmalarla diette antioksidan bileşiklerin alımı ile serbest radikallerin neden olduğu hastalıklara yakalanma riski arasında ters bir orantı olduğu belirlenmiştir (Hertog ve ark., 1995). Antioksidanlar etkinliklerini beş farklı yolla göstermektedir: 1. Oksijenin konsantrasyonunu azaltarak, 2. Zincir reaksiyonunun başlamasını engelleyerek, 3. Peroksitleri parçalayarak onların zincir reaksiyonu oluşturan radikallerle dönüşümünü engelleyerek, 4. Geçiş metallerini bağlayarak radikal oluşumunun başlamasını engelleyerek, 5. Başlamış olan bir radikal zincir reaksiyonunu kırarak, Antioksidanların bu faydalı etkileri gıdaların işlenmesi sırasında sentetik antioksidanların kullanılmasına yol açmıştır. Bu antioksidanlar içerisinde en önemlileri BHA, BHT, PG ve TBHQ dur. Ancak son zamanlarda yapılan birçok çalışmada bu sentetik antioksidanların insan sağlığı için toksik etkilere sahip olduğu (Fusco ve ark., 2007; Nitta ve ark., 2007; Bardia ve ark., 2008) ve bu sentetik antioksidanların mutlaka doğal antioksidanlarla yer değiştirmesi gereği vurgulanmıştır.

14 11 A B C D Şekil 2.3. Sentetik antioksidanlar (A:BHA; B:BHT; C:TBHQ; D:Gallat türevleri) Bitkiler doğal antioksidanların farklı çeşitlerini bünyelerinde bulundurmalarından dolayı antioksidan çalışmalarında köşe taşı konumundadır. Bu antioksidanlardan en önemlileri, β-karoten, fenolik bileşikler, C ve E vitamini dir (Vinson ve Dabbagh, 1998).

15 Fenolik BileĢikler Bitkisel sekonder metabolitleri içinde fenolik bileşikler çok sayıda biyolojik etkinliğe sahip olmalarından dolayı oldukça ilgi çekicidir. Bitkilerin bünyelerinde bilinen yaklaşık 5000 fenolik bileşik vardır. Fenolik bileşikler bir veya daha fazla hidroksil grubu içeren aromatik bir halkadan meydana gelmiştir (Balasundram ve ark., 2006). Fenolik bileşiklerin antioksidan özellikleri genellikle hidroksil radikalinin sayısı ve konumundan ayrıca yapılarındaki çift bağlardan kaynaklanmaktadır (Rice-Evans ve Miller, 1998). Bu bileşikler indirgeme ajanları, hidrojen verici, singlet oksijen süpürücüleri ve metal şelatörleri olarak faaliyet gösterirler (Rice-Evans ve ark., 1995). Fenolik bileşiklerin içinde esas grubu düşük molekül ağırlıklı flavonoidler meydana getirirler. Flavonoidler; flavonlar, flavonollar, flavononlar, izoflavonlar, flavon-3-oller ve antosiyaninler olmak üzere altı gruba ayrılmaktadır (Stewart ve ark., 2000). Şekil 2.4. Flavonoid grupları Yapılan birçok çalışmalarda flavonoidlerin anti-inflamatuvar, antiallerjik, antimikrobial, hepatoprotektit, antiviral, antimutajenik, antikarsinojenik özellikleri başta olmak üzere çok sayıda özellikleri rapor edilmiştir. Yapılan çalışmalarda flavonoidlerin güçlü hidroksil ve peroksil süpürücü özellikleri rapor edilmiştir. Epidemiyolojik çalışmalar fenolik antioksidanların tüketimi ile kardiovasküler hastalıklara ve kansere yakalanma riskinin azalması arasında bir korelasyonu göstermektedir. Özellikle

16 13 flavonoidler LDL oksidasyonun güçlü bir inhibitörüdür. Buna ilaveten antitrombotik, vazoprotektif ve hipolipidemik etkiler sergilemektedir (Fuhrman ve ark., 1995). Polifenollerin farklı tipleri aynı zamanda antikarsinojenik etkilere sahiptir. Polifenoller kötü huylu tümorlerin gelişiminin çeşitli aşamalarına katılarak, oksidatif hasardan DNA yı korur, karsinojenleri inaktif hale getirir ve mutant genlerin ekspresyonunu inhibe eder. Bu durumla bağlantılı olarak diette günlük 1 g flavonoid karışımının bulunması sağlık açısından faydalı kabul edilir (Kandaswami ve Middleton, 1994) Asteraceae Familyası ve Scolymus Cinsi Türkiye florası dünya üzerinde biyoçeşitlilik açısından oldukça önemli bir konumdadır. Üç floristik bölgenin merkezinde yer alması, ılıman iklim kuşağında bulunması, yükselti farklarının çok olması ve özellikle jeolojik devirlerde korunmasından dolayı zengin biyoçeşitliliğe sahiptir. Yapılan çalışmalar Türkiye florasının yaklaşık on bin bitki türünü bünyesinde bulundurduğunu göstermiştir. Bu bitki türlerinin %35 inin sadece Türkiye ye özgü endemikler olması floristik açıdan Türkiye nin önemini daha da artırmaktadır. Ülkemizin zengin florasına rağmen özellikle halk tarafından kullanılan bitkiler üzerine yapılmış çalışmalar oldukça sınırlıdır. Asteraceae, Angiospermlerin en geniş familyalarındandır ve son bilgilere göre üç alt familya, 1535 cins ve civarında türden oluşmaktadır. Familya üyeleri Amerika dan Avustralya ya geniş bir dağılıma sahiptir. Asteraceae familyası Türkiye florasında yaklaşık 1239 tür ile tür sayısı bakımından en zengin familya konumundadır. Bu türlerin %37 si endemik türlerden oluşmaktadır. Familya bünyesinde 152 cins bulunmaktadır (Doğan, 2007). Scolymus cinsi ülkemizde oldukça geniş yayılışa sahip olup S. hispanicus, S. maculatus ve S. grandiflorus olmak üzere 3 tür ile temsil edilmektedir. S. hispanicus ülkemizde ise Ege bölgesinde Akçakızı, Çetmi dikeni, Kızılgöz dikeni, Sarıdiken gibi isimlerle bilinmektedir (Baytop, 2007). Scolymus türlerinden S. hispanicus un Anadolu da geleneksel halk hekimliğinde çeşitli amaçlarla kullanıldığı rapor edilmiştir.

17 14 Örneğin, bu bitkinin tohumlarından hazırlanan çaylar İzmir ve çevresinde nefrit, hemoroid, karın ağrısı ve ishal tedavisinde kullanılmaktadır (Ugulu ve ark., 2009). Ayrıca bitkinin taze kök ve yaprakları çeşitli yörelerde besin olarak tüketilmektedir (Ertuğ, 2004). Yine benzer şekilde İspanya başta olmak üzere birçok Akdeniz ülkesinde S. hispanicus yaygın olarak beslenmede kullanılmaktadır (Nebel ve ark., 2006).

18 15 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1.Scolymus hispanicus Hakkında Taksonomik Bilgiler Bu tez çalışmasında kullanılan Scolymus hispanicus Selçuk Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Öğretim Üyelerinden Doç. Dr. Murad Aydın ŞANDA tarafından taksonomik olarak teşhis edilmiştir ve türün özellikleri Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1. Scolymus hispanicus un özellikleri Ömür Yapı Çiçeklenme Habitat Yükseklik Endemik Element Türkiye dağılımı Genel Dağılımı İki veya Çok yıllık Ot Haziran-Eylül Boş alan, yol kenarı, nadas tarla m Endemik değil Akdeniz Trakya, Dış Anadolu, O. Anadolu Akdeniz bölgesi, G. Rusya, Kırım

19 16 Şekil 3.1. S. hispanicus un habitatında görünümü 3.2. Bitkisel Ekstraktın Hazırlanması Bitkisel örnekler toplanıp gölgede kurutulduktan sonra değirmende iyice toz haline getirildi. Toz haline gelen örneklerden yaklaşık 15 gr tartılıp sokslest düzeneğinde 6 saat süreyle sırasıyla metanol ekstraksiyonuna tabii tutuldu. Ekstraksiyon sonunda ekstraklar filtre kağıdından (Whatman mavi band) süzüldü. Daha sonra çözücü rotary evaporatörde 40 C de tamamen buharlaştırıldı. Ele geçen ham ekstraklar antioksidan kapasite testleri uygulanıncaya kadar -20 C de saklandı.

20 Toplam fenolik madde tayini (Folin yöntemi) Bitki ekstraktının konsantrasyonu 2 mg/ml olacak şekilde hazırlandı. Bunun için 20 mg bitki tartılıp 10 ml metanolde çözüldü. Bitkisel droglardan 200 µl ayrı deney tüpülerine alındı. Daha sonra her bir tüpe 1.5 ml su ve 0.5 ml %2 lik Na 2 CO 3 çözeltisinden eklendi. 3 dakika beklendikten sonra 0.1 ml Folin-Ciocalteu reaktifi ilave edildi. Karışım oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat bekletildikten sonra 760 nm de absorbansları ölçüldü. Tüm antioksidan kapasite tayin testlerinde spektrofotometrik ölçümler Shimadzu UV-1800 spektrofotometre cihazı kullanılarak gerçekleştirildi. Aynı işlemler standart olarak kullanılan gallik asit için de tekrarlandı. Bitkilerin fenolik madde içeriği gallik asit eş değeri olarak verildi (mg GAE/g) (Slinkard ve Rossi 1965). Şekil 3.2. Gallik asit 3.4. Total Flavonoid Tayini 2 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan bitki ekstraktı (1 ml) aynı miktarda %2 lik AlCl 3 ile karıştırıldı ve daha sonra 10 dakika oda sıcaklığında inkübe edildi. Örneklerin absorbansları 415 nm de okundu. Aynı işlemler standart olarak kullanılan rutin içinde yapıldı ve örneklerin flavonoid içerikleri rutine eşdeğer olarak hesaplandı (mg RE/g) (Arvouet-Grand ve ark., 1994).

21 18 Şekil 3.3. Rutin 3.5. Toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi Metodun esası Mo(VI) nın Mo(V) e indirgenmesi ve asidik ortamda yeşil renkli fosfat/mo(v) kompleksinin oluşumuna dayanır. Metotta öncelikle bitki ekstraktın konsantrasyonları 2 mg/ml olacak şekilde çözeltileri hazırlandı. Standart olarak ise askorbik asit kullanıldı. Metotta kullanılacak reaktif çözeltisi aşağıdaki gibi hazırlandı: 0.6 M H 2 SO 4 çözeltisi: ml H 2 SO 4 alınır ve ml saf su üzerine sızdırılarak ilave edildi 28 mm Na 2 HPO 4.12H 2 O çözeltisi: gr Na 2 HPO 4.12H 2 O tartılıp hacmi saf su ile 25 ml ye tamamlandı. 4 mm Amonyum molibdat çözeltisi: gr amonyum molibdat tartılıp hacmi saf su ile 25 ml ye tamamlandı. Bu şekilde hazırlanan çözeltiler bir mezürde karıştırılarak reaktif çözeltisi hazırlanmış oldu. 2 mg/ml konsantrasyonunda bitkisel çözeltiden 0.3 ml bir tüpe alındı ve bunun üzerine reaktif çözeltisinden 3 ml eklendi. Tüpler kuvvetlice karıştırılıp 95 C de 90 dakika inkübe edildi. İnkübasyon sonunda çözeltilerin absorbansı 695 nm de okundu. Aynı işlemler standart antioksidan olarak kullanılan askorbik asit için de yapıldı. Antioksidan aktivite askorbik asit eşdeğeri (mg AE/g) olarak hesaplandı (Prieto ve ark., 1999).

22 DPPH süpürme etkinliği Bitkisel ekstraktın ve sentetik antioksidanların farklı konsantrasyonlarda çözeltileri hazırlandı. Farklı konsantrasyonlardaki bu bitkisel çözeltilerden 1 ml alınıp bunun üzerine 1 ml konsantrasyondaki DPPH çözeltisinden (final konsantrasyonu 0.2 mm) ilave edildi. Tüpler ağızları kapatılıp kuvvetlice karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika bekletildi. Bu süre sonunda absorbanslar 517 nm de okundu. Bitkisel çözeltilerin ve standart maddelerin (BHA ve BHT) inhibisyonu aşağıdaki denklemden hesaplandı (Sarikurkcu ve ark. 2009). Kontrol çözeltisi olarak ekstrak yerine metanol eklendi. İnhibisyon(%)=((A kontrol -A örnek )/ A kontrol )x β-karoten/linoleik asit test sistemi Bitkisel materyalin 4, 2 ve 1 mg/ml konsantrasyonları hazırlandı. Metotta öncelikle emülsiyon çözeltisi hazırlandı. Bunun için 1 mg β-karoten 2 ml kloroformda çözüldü. Bu karışıma 50 µl linoleik asit ve 200 mg Tween 40 eklendi. Karışım iyice karıştırıldı. Kloroform rotary evaporatörde 40 C de iyice uçuruldu. Kalan kısım üzerine 200 ml saf su eklendi. Böylece emülsiyon çözeltisi hazırlanmış oldu. Farklı konsantrasyonundaki bitkisel droglardan 350 µl alındı ve bunların üzerine 2.5 ml emülsiyon çözeltisinden ilave edildi. Emülsiyon çözeltisi eklenir eklenmez absorbansları 490 nm de okundu. Daha sonra tüpler 2 saat inkübe edildi. (Dapkevicius ve ark., 1998; Sokmen ve ark., 2004). 120 dakika sonunda renk açılım oranı hesaplandı. R=ln(A/B)/t A:Başlangıç absorbansı B:120 dakika sonundaki absorbansı t:120 dakika Bu eşitlikten inhibisyon değeri yani antioksidan aktivite hesaplandı. İnhibisyon değeri= ((R kontrol -R örnek )/ R kontrol )x100

23 Bakır indirgeme gücü (CUPRAC testi) 10-2 M Cu(II) klorür çözeltisi.; CuCl 2.2H 2 O den g tartılarak su ile 250 ml ye tamamlanarak hazırlandı. Amonyum asetat tamponu; 1 M (ph=7). NH 4 Ac dan g tartılarak su ile 250 ml ye tamamlanarak hazırlandı. Neokuproin çözeltisi: 7.5x10-3 M, Neokuproin (2,9 dimethyl 1-10 phenantroline) den g tartılarak %96 lık etil alkolle 25 ml ye tamamlanarak hazırlandı. Bitki ekstraklarının 0.2 mg/ml ile 1.6 mg/ml arasındaki farklı konsantrasyonları kullanıldı. Metotta öncelikle her bir deney tüpüne 1 ml CuCl 2.2H 2 O, 1 ml amonyum asetat, 1 ml neokuproin çöeltileri ile 0.6 ml saf su eklenir. Daha sonra her bir tüpe bitkisel çözeltilerden 0.5 ml eklenip iyice karıştırıldı. Tüpler ağızları kapalı bir biçimde oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika beklendi. Aynı işlemler BHA ve BHT çözeltileri içinde yapıldı. Bu süre sonunda absorbansları 450 nm de okundu (Apak ve ark. 2006) Demir indirgeme gücü (Fe(III) Fe(II)) Bu metotta bitkisel ekstrakların 0.2 mg/ml ile 1.6 mg/ml konsantrasyonları kullanıldı. Farklı konsantrasyonlardaki bitkisel çözeltilerden 2.5 ml alındı. Bunun üzerine 0.2 M ph ml fosfat tamponu ve %1 lik 2.5 ml potasyum ferrisiyanür eklendi. Tüpler 50 C de 20 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası tüplerin üzerine 2.5 ml %10 luk TCA ilave edildi. Tüpler iyice karıştırıldıktan sonra üst kısımlarından 2.5 ml başka bir tüpe aktarıldı. Bu tüpün üzerine de 2.5 ml saf su ve 0.5 ml %0.1 lik FeCl 3 çözeltisi eklendi. Aynı işlemler BHA ve BHT içinde tekrarlandı. Çözeltilerin absorbansları 700 nm de okundu (Oyaizu 1986). Absorbans artması indirgeme gücündeki artışı göstermektedir.

24 21 4. ARAġTIRMA SONUÇLARI VE TARTIġMA Bitkisel kimyasalların kompleks yapısı, ekstraksiyon çözücüsü, süresi gibi çok sayıda faktör antioksidan kapasiteyi etkileyeceği için tek bir metot yerine farklı test sistemlerinin kullanılmış olması antioksidan kapasite üzerine daha doğru yorum yapabilmeyi sağlamıştır. Bu amaçla Scolymus hispanicus un antioksidan özellikleri farklı test sistemleri kullanılarak yorumlanmıştır Toplam Fenolik ve Flavonoid Madde Ġçeriği Bitkisel sekonder metabolitleri içerisinde fenolik bileşikler oldukça güçlü antioksidan özelliklere sahiptirler ve yapılan birçok çalışmada fenolik içerik ile antioksidan kapasite arasında güçlü bir korelasyon gözlenmiştir. Fenolik bileşikler içerisinde temel grubu flavonidler oluşturur. Flavonoidlerin antioksidan, antibakterial ve antimutagenik gibi çok sayıda etkileri rapor edilmiş ve halen birçok çalışmanın temel araştırma konusu durumundadır. Çalışılan metanolik ekstraktın toplam fenolik içeriği gallik aside eşdeğer olarak hesaplandı ve bu amaçla gallik asitin bir kalibrasyon eğrisi çizildi (Şekil 4.1). Toplam fenolik içerik mggae/g olarak belirlenmiştir. S. hispanicus gibi Asteraceae üyesi olan bazı türlerde toplam fenolik içerikler şu şekilde tespit edilmiştir: Helichrysum orientale (73.70 mggae/g) (Albayrak ve ark., 2010), Centaurea cheirolopha ( mggae/g) (Aktumsek ve ark., 2011) ve Artemisia campestris (103.4 mggae/g) (Djeridane ve ark., 2006). Flavonoid içerik ise rutine eşdeğer verildi ve bu amaç için rutinin bir kalibrasyon eğrisi çizildi (Şekil 4.2). Flavonoid içerik mgre/g olarak tespit edilmiştir.

25 22 Şekil 4.1. Gallik aside ait kalibrasyon eğrisi Şekil 4.2. Rutine ait kalibrasyon eğrisi 4.2. Toplam Antioksidan Kapasite Fosfomolibdat testi son zamanlarda özelikle kolay olması ve kullanılan reaktiflerinin ucuzluğu nedeniyle oldukça sık uygulanmaktadır. Metodun temel özelliği asidik ortamda antioksidan bileşiklerin Mo (VI) yı Mo(V) e indirgemesi ve sonuçta yeşil renkli fosfat/mo (V) oluşmasına dayanmaktadır. Oluşan bu bileşik 695 nm de absorbsiyon göstermektedir. Metodun sonuçları antioksidan özellikleri bilinen askorbik asit veya α-tokoferol e eşdeğer olarak verilmektedir. Bu amaçla askorbik asitin farklı konsantrasyonlarda çözeltileri hazırlanmış ve bir kalibrasyon eğrisi elde edilmiştir

26 23 (Şekil 4.3). S. hispanicus un metanolik ekstraktının toplam antioksidan kapasitesi 186 mgae/g olarak belirlenmiştir. Kumaran ve Karunakaran (2008) Phylanthus türleri üzerine yaptıkları çalışmada toplam antioksidan kapasite 275 mgae/g ile 376 mgae/g arasında tespit edilmiştir. S. hispanicus un bu Phylanntus türlerinden daha düşük toplam antioksidan kapasiteye sahip olduğu belirlenmiştir. Scolymus gibi Asteraceae familyasına ait bir cins Helichrysum a bazı türlerin antioksidan kapasitelerinin belirlendiği çalışmada toplam antioksidan kapasite mgae/ g arasında dağılım göstermektedir. Bu çalışmanın sonuçları bizim çalışmamızla kıyaslanacak olursa S. hispanicus un belirtilen türlerin büyük çoğunluğundan daha yüksek antioksidan kapasiteye sahip olduğu görülür. Şekil 4.3. Askorbik aside ait kalibrasyon eğrisi Çizelge 4.1. S. hispanicus un toplam fenolik, flavonoid içeriği ile toplam antioksidan kapasitesi Toplam fenolik içerik (mggae/g) * Aritmetik ortalama±s.s Toplam flavonoid içeriği (mgre/g) Toplam antioksidan kapasite (mgae/g) ±3.34 * 24.50± ±7.86

27 24 Şekil 4.4. Scolymus hispanicus un toplam fenolik ve flavonoid içerikleri ile toplam antioksidan kapasitesi 4.3. Serbest Radikal Süpürme Etkinliği (DPPH Testi) Serbest bir radikal kullanılarak bitkisel drogların bunu belli oranda etkisiz hale getirmelerine dayanan test sistemleri antioksidan metotların en önemlilerindendir. Bu test sistemlerinin ortak özelliği çeşitli konsantrasyonlarda hazırlanan radikal çözeltilerine bitkisel ekstrakt ilave edilir ve meydana gelen renk değişimi spektrofotometrik olarak belirlenir. Bu amaçla en sık kullanılan radikallerden birisi DPPH dır. Antioksidan bileşiklerle karşılaşınca DPPH ın mor renginin şiddetinde azalma ve buna bağlı olarak absorbansda düşmeler olacaktır. DPPH ile antioksidan bileşik arasında gerçekleşen reaksiyon aşağıdaki gibidir: DPPH + ArOH DPPH + ArO + Hˉ Farklı konsatrasyonlarda hazırlanan metanolik ekstraktın DPPH radikali üzerine etkisi Çizelge 4.2. gösterilmiştir. Konsantrasyona bağlı olarak bitkisel ekstraktın konsantrasyonu arttıkça radikal süpürme aktivitesi de artmıştır. Bitkisel ekstraktın en düşük konsantrasyonu olan 0.25 mg/ml de radikal süpürme oranı %9.16 gibi oldukça düşük seviyededir. Ekstraktın 2 mg/ml lik çözeltisinde ise etkinlik %92.09 a kadar çıkmaktadır (Çizelge 4.2.). Ancak her ne kadar bu konsantrasyonda bitkisel özüt etkin olsa da sentetik antioksidanlar olan BHA ve BHT çok düşük derişimlerde bile oldukça etkilidir. 0.1 mg/ml konsantrasyonda BHA %95.18, BHT ise %88.16 oranında

28 25 inhibisyon yeteneğine sahiptir (Çizelge 4.3.). DPPH test sisteminde çok sayıda bitkinin antioksidan özellikleri araştırılmıştır ve testin sonuçların genellikle radikalin yarısının süpürüldüğü konsantrasyon olan IC 50 değeri hesaplanarak yorumlanmıştır. Bizim çalışmamızda da IC 50 değeri hesaplandı ve 1.09 mg/ml olarak belirlenmiştir. Aktümsek ve ark (2011) tarafından beş Centaurea türü üzerine yapılan çalışmada türlerin IC 50 değeri µg/ml bulunmuş buna göre S. hispanicus bu Centaurea türlerinden daha yüksek etkinlik sergilemiştir. Yine Asteraceae den bir takson olan Achiella millefolium subsp. millefolium un DPPH test sisteminde IC 50 değeri (45.60 µg/ml) ne göre oldukça güçlü radikal süpürücü özelliği rapor edilmiştir (Candan ve ark., 2003) Çizelge 4.2. Scolymus hispanicus un DPPH testinde absorbans ve inhibisyon değerleri Konsantrasyon (mg/ml) Absorbans (517 nm) %Ġnhibisyon ±0.01* 92.09± ± ± ± ± ± ±1.85 * Aritmetik ortalama±s.s Şekil 4.5. S. hispanicus un konsantrasyon-absorbans grafiği

29 26 Şekil 4.6.S. hispanicus un konsantrasyon-inhibisyon grafiği Çizelge 4.3. Sentetik antioksidanların radikal süpürme yeteneklerinin karşılaştırılması (%) Konsantrasyon BHA BHT (mg/ml) ±4.13 * 22.43± ± ± ± ± ± ±1.45 * Aritmetik ortalama±s.s Şekil 4.7. BHA ve BHT nin konsantrasyon-inhibisyon grafiği

30 Demir Ġndirgeme Gücü Bitkilerin indirgeme gücü antioksidan potansiyellerinin değerlendirilmesinde oldukça önemlidir. Özellikle indirgeme gücü testleri antioksidan bileşiklerin elektron verme yeteneklerinin bir göstergesidir. Bu amaçla tez kapsamında S. hispanicus un bakır ve demir indirgeme gücü araştırıldı. Demir indirgeme gücü, bitkisel ekstraktın Fe +3 ün Fe +2 ye indirgenmesine ve bu durumun 700 nm spektrofotometrik olarak incelenmesine dayanır. Bu test sisteminde yüksek absorbans yüksek demir indirgeme potansiyelini göstermektedir. Testin sonuçlarında konsantrasyon arttıkça absorbans da artış göstermektedir. Absorbans değerleri ve konsantrasyon dikkate alındığında sentetik antioksidanlardan BHT oldukça güçlü demir indirgeme potansiyeline sahiptir. BHT ve metanol ekstraktın aynı derişimdeki absorbans değerleri arasında önemli farklılık söz konusudur (Çizelge 4.4 ve 4.5). Demir indirgeme gücü metodu Scolymus gibi bazı Asteraceae cinslerine ait türlerin antioksidan etkinliklerinin değerlendirilmesinde kullanılmıştır. Ayrıca yapılan çok sayıda çalışmada bu metot ile diğer kapasite tayin testleri arasında güçlü korelasyon bulunmaktadır. Testin sonuçları ayrıca EC 50 olarak nitelendirilen (absorbansın 0.5 olduğu konsasntrasyon) değerde konsantrasyonabsorbans grafiğinden elde edilerek de yorumlanabilir. S. hispanicus un EC 50 değeri 0.92 mg/ml olarak belirlenmiştir. Smilax excelsa nın antioksidan özellikleri üzerine yapılan bir çalışmada su, etilasetat, etanol ekstraktlarının EC 50 değerleri sırasıyla 1.18, 1.60 ve 3.63 mg/ml olarak bulunmuştur (Özsoy ve ark., 2008). Buna göre S. hispanicus un metanol ekstraktı bu ekstraktlarda daha güçlü demir indirgeme potansiyeline sahiptir. Çizelge 4.4. Scolymus hispanicus un demir indirgeme gücü Konsantrasyon (mg/ml) Absorbans (700 nm) ±0.11* * Aritmetik ortalama±s.s ± ± ±0.04

31 28 Şekil 4.8.S. hispanicus un demir indirgeme gücü Çizelge 4.5. BHT nin demir indirgeme gücü BHT Konsantrasyon (µg/ml) Absorbans (700 nm) ±0.04 * ± ± ±0.14 * Aritmetik ortalama±s.s Şekil 4.9.BHT nin demir indirgeme gücü

32 Bakır Ġndirgeme Gücü (CUPRAC Testi) CUPRAC test sistemi bitkisel ekstrakların veya antioksidanların Cu(II)- neocuproine kompleksini Cu(I)-neocuproine indirgemesine oluşan renkli kompleksin absorbansının 450 nm de ölçülmesine dayanır. Demir indirgeme gücünde olduğu gibi yüksek absorbans yüksek indirgeme gücünü göstermektedir. Yapılan çalışmalarda demir ve bakır indirgeme güçleri arasında güçlü bir korelasyon rapor edilmiştir. Yine çeşitli çalışmalarda CUPRAC test sistemi ile serbest radikal süpürme, toplam antioksidan kapasite ve β-karoten/linoleik asit gibi çeşitli antioksidan testleri arasında pozitif bir bağlantı rapor edilmiştir (Öztürk ve ark., 2007). BHT ile S. hispanicus un metanolik ekstraktı kıyaslandığında BHT nin oldukça güçlü etkinliğe sahip olduğu görülebilir (Çizelge 4.6 ve 4.7). Demir indirgeme gücünde olduğu gibi CUPRAC testi sonuçları da EC 50 değeri hesaplanarak yorumlanabilir. S. hispanicus un CUPRAC testinde EC 50 değeri 0.69 mg/ml olarak tespit edilmiştir. Çizelge 4.6. Scolymus hispanicus un bakır indirgeme gücü Konsantrasyon (mg/ml) Absorbans (450 nm) ±0.01* ± ± ±0.02 * Aritmetik ortalama±s.s Şekil S. hispanicus un bakır indirgeme gücü

33 30 Çizelge 4.7. BHT nin bakır indirgeme gücü BHT Konsantrasyon (µg/ml) Absorbans (450 nm) ±0.01 * ± ± ±0.29 Şekil BHT nin bakır indirgeme gücü 4.6. β-karoten/linoleik Asit Test Sistemi Bu yöntem, β- karotenin linoleik asit oksidayonu sonucu oluşan peroksit radikallerinin bu molekülde meydana getirdiği renk açılımını antioksidanların hangi oranda inhibe ettiğinin spektrofotometrik olarak ölçümüne dayanır. Scolymus hispanicus un 4, 2 ve 1 miligramlık derişimlerinin β-karoten-linoleik asit sistemiyle belirlenen toplam antioksidan aktiviteleri Çizelge 4.8 ve Şekil 4.12 de verilmiştir. Bu konsantrasyonlarda çalışılan metanolik ekstrakt sırasıyla %81.31, %70.58 ve %29.17 oranında linoleik asit oksidasyonunu inhibe etmiştir. Sentetik antioksidanlar BHA ve BHT ise 2 mg/ml konsantrasyonunda linoleik asit oksidasyonu inhibe etme yetenekleri oldukça fazladır. Bununla birlikte sentetik antioksidanların sağlık üzerine olumsuz

34 31 etkilerinden dolayı, S. hispanicus un doğal antioksidanların kaynağı olarak gıda endüstrisinde yağ asidi oksidasyonunu engellemek için kullanılabilecek niteliktedir. Bu test sistemi kullanılarak çeşitli bitkilerin linoleik asit oksidasyonu inhibe etme oranları şu şekilde belirlenmiştir. Örneğin, Glycyrrhiza echinata da %79.84 (Cakmak ve ark., 2012), Hieracium cappadocicum da %55.1 (Tepe ve ark., 2006) ve Achiella biebersteinii de %22.7 (Barış ve ark., 2006) olarak belirlenmiştir. Bu test içinde linoleik asit oksidayonunu %50 oranında inhibe edilen konsantrasyon olarak ifade edilen IC 50 değeri hesaplandı ve bu değer 1.98 mg/ml olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.8. Scolymus hispanicus un linoleik asit oksidasyonun inhibe etme yeteneği Konsantrasyon (mg/ml) % Ġnhibisyon ±1.45 * ± ±1.82 * Aritmetik ortalama±s.s Şekil Scolymus hispanicus un linoleik asit oksidasyonun inhibe etme yeteneği 4.7.Antioksidan Testlerinden elde edilen EC 50 ve IC 50 değerleri Antioksidan kapasite tayininde kullanılan metotların sonuçlarını daha anlamlı hale getirmek için EC 50 ve IC 50 değerleri hesaplandı. İndirgeme gücünün tayinine yönelik testlerde absorbansın 0.5 olduğu konsantrasyon olarak ifade edilen EC 50 değerleri hesaplandı. DPPH yöntemi ve β-karoten/linoleik asit test sisteminde ise

35 32 radikalin %50 sinin süpürüldüğü konsantrasyonu gösteren IC 50 değerleri hesaplandı. Belirlenen bu değerler Çizelge 4.9 ve Şekil 4.13 de gösterilmiştir. Çeşitli çalışmalarda antioksidan kapasite testlerinden elde edilen verileri daha sağlıklı değerlendirmek için EC 50 ve IC 50 değerleri hesaplanmıştır. Özellikle testlerde kullanılan konsantrasyon farklılıklarını ve dolayısıyla yorum farklılıklarını ortadan kaldırmak için EC 50 ve IC 50 değerleri oldukça kullanışlıdır. Çizelge 4.9. Scolymus hispanicus un antioksidan testlerden elde edilen değerleri Antioksidan Testler mg/ml CUPRAC (EC 50 ) 0.69±0.01 * DEMİR indirgeme gücü (EC 50 ) 0.92±0.14 DPPH (IC 50 ) 1.09±0.01 β-karoten/linoleik asit test sistemi (IC 50 ) 1.98±0.01 * Aritmetik ortalama±s.s Şekil Scolymus hispanicus un antioksidan testlerden elde edilen değerlerinin karşılaştırılması

36 33 5. SONUÇLAR VE ÖNERĠLER 5.1. Sonuçlar Bu çalışmada Scolymus hispanicus un invitro antioksidan özellikleri: toplam antioksidan, serbest radikal yakalama, β-karoten/linoleik asit, bakır ve demir indirgeme güçlerini içeren beş farklı kimyasal test sistemi kullanılarak araştırılmıştır. Ayrıca toplam fenolik ve flavonoid içerik de belirlenmiştir. Test sistemlerinde S. hispanicus un antioksidan olarak etkinliği kullanılan standart antioksidanlardan daha zayıf olarak tespit edilmiştir. Bu test sistemlerinin sonuçları ile toplam fenolik ve flavonoid içerik değerlendirildiğinde S. hispanicus un orta düzeyde antioksidan etkinliğe sahip olduğu belirtilebilir Öneriler Bu çalışma ile S. hispanicus un antioksidan özellikleri ilk defa ortaya çıkarılmıştır. Bu çalıma ile bu türün daha fazla ilgi çekmesi sağlanacaktır. Günümüzde başta gıda ve farmakoloji alanında doğal antioksidanlar için yeni hammadde kaynaklarının tespiti büyük önem taşıdığı için S. hispanicus un doğal antioksidanların bir kaynağı olarak kullanılabileceği belirtilebilir. Ayrıca bu tez çalışması tür üzerine yapılacak yeni çalışmalara temel oluşturacak ve ışık tutacaktır.

37 34 KAYNAKLAR Aktumsek, A., Zengin, G., Guler, GO., Cakmak, YS., Duran, A., 2011, Screening for in vitro antioxidant properties and fatty acid profiles of five Centaurea L. species from Turkey Flora, Food and Chemical Toxicology, 49, Albayrak, S., Aksoy, A. Sagdıç, O., Hamzaoğlu, E., 2010, Compositions, antioxidant and antimicrobial activities of Helichrysum (Asteraceae) species collected from Turkey, Food Chemistry, 119, Alkofahi, A.S., Abdelaziz, A., Mahmoud, I., Abuirjie, M., Hunaiti, A., El-Oqla, A., 1990, Cytotoxicity, mutagenicity and antimicrobial activity of forty Jordanian medicinal plants. International Journal of Crude Drug Research, 28(2), Apak, R., Guclu, K., Ozyurek, M., Karademir, S.E., Ercag, E., 2006, The cupric ion reducing antioxidant capacity and polyphenolic content of some herbal teas, International Journal of Food Sciences and Nutrition, 57(5/6), Arvouet-Grand, A., Vennat, B., Pourrat, A., Legret, P., 1994, Standardisation d un extrait de propolis et identification des principaux constituants, Journal de Pharmacie de Belgique, 49, Atoui, A.K., Mansouri, A., Boskou, G., Panagiotis, K., 2005, Tea and herbal infusions Their antioxidant activity and phenolic profile, Food Chemistry, 89, Balasundram, N., Sundram, K., Samman S., 2006, Phenolic compounds in plants anda griindustrial by-products: Antioxidant activity, occurence, and potential uses, Food Chemistry, 99, Bardia, A., Tleyjeh, I.M., Cerhan, J.R., Sood, A.K., Limburg, P.J., Erwin, P.J., Montori, V.M, 2008, Efficacy of antioxidant supplementation in reducing primary cancer incidence and mortality: systematic review and meta-analysis Review, Mayo Clinic Proceedings, 83, Baytop, T., 1999, Türkiye de Bitkiler ile Tedavi (Geçmişte ve Bugün), Nobel Tıp Kitabevleri. Istanbul. Baytop, T., 2007, Türkçe Bitki Adları Sözlüğü. Türk Dil Kurumu, 3. baskı, Ankara. Branen, A.L., 1975, Toxicology and biochemistry of butylated hydroxyanisole and butylated hydroxytoluene, Journal of the American Oil Chemists Society, 52, Cakmak YS., Aktumsek A., Duran A., 2012, Studies on antioxidant activity, volatile compound and fatty acid composition of different parts of Glycyrrhiza echinata L., EXCLI Journal, 11,

38 35 Candan, F., Unlu, M., Tepe, B., Daferera, D., Polissiou, M., Sökmen, A., Akpulat, H.A., 2003, Antioxidant and antimicrobial activity of the essential oil and methanol extracts of Achillea millefolium subsp. millefolium Afan. (Asteraceae), Journal of Ethnopharmacology, 87, Dapkevicius, A., Venskutonis, R., Van Beek, T.A., Linssen, P.H., 1998, Antioxidant activity of extracts obtained by different isolation procedures from some aromatic herbs grown in Lithuania, Journal of the Science of Food and Agriculture, 77, Davies, K.J.A., 1991, Oxidative Damage&Repair: Chemical Biological and Medical Aspects, Pergamon, Oxford. Davis, P.H., 1975, Flora of Turkey and East Eagean Islands. Vol 5, Edinburgh University Press, Edinburgh. Dijeridane, A., Yousfi, M., Nadjemi, B., Boutassouna D., Stocker P, Vidal N., 2006, Antioxidant activity of some algerian medicinal plants extracts containing phenolic compounds, Food Chemistry, 97, Dogan, B., 2007, Türkiye Jurinea Cass. (Asteraceae) Cinsinin Revizyonu, Selçuk Üniversitesi, Fen Bil. Enst. 242 s. KONYA. Doll, R. 1990, An overview of the epidemiological evidence linking diet and cancer, Proceedings of the Nutrition Society, 49, Erik, S., Tarıkahya, B., 2004, Türkiye florası üzerine. Kebikeç 17, Ertug, F., 2004, Wild Edible Plants of the Bodrum Area (Mugla, Turkey), Turkish Journal of Botany, 28, Fuhrman, B., Lavy, A., Aviram, M., 1995, Consumption of red wine with meals reduces the susceptibility of human plasma and LDL to lipid peroxidation, American Journal of Clinical Nutrition, 61, Fusco, D., Colloca, G., Lo Monaco, M.R., Cesari, M., 2007, Effects of antioxidant supplementation on the aging process. Review, Journal of Clinical Interventions in Aging, 2, Halliwell B., Murcia M.A., Chirico S. and Aruoma O.I., 1995, Free radicals and antioxidants in food and invivo: what they do and how they work, Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 35, Halliwell, B., 1994, Free radicals, antioxidants and human diseases: curiosity, cause or consequences, Lancets, 334, Hallıwell, B., Aruoma O.I., 1991, DNA damage by oxygen-derived species its mechanisms and measurement in mammalian systems, FEBS Letters, 281, Halliwell, B., Gutteridge J.M.C., 1989, Free Radicals in Biology and Medicine, 2nd edition, Clanderon Press, Oxford.

39 36 Hertog, M.G.L., Kromhout, D., Aravanis, C., Blackburn, H., Buzina, R., Fidanza, F., Giampaoli, S., Jansen, A., Menotti, A., Nedeljkovic, S., Pekkarinen, M., Simic, B.S., Toshima, H., Feskens, E.J.M., Hollman, P.C.H., Katan, M.B., 1995, Flavonoid intake and long-term risk of coronary heart disease and cancer in the seven countries study, Archives of Internal Medicine, 155 (11), İlisulu, K., 1992, İlaç ve Baharat Bitkileri, Ankara Üniv. Ziraat Fakültesi Yayınları, Yayın No:1256, Ankara, 1-6. Kandaswami, C., Middleton E. Jr., 1994, Free radical scavenging and antioxidant activity of plant flavonoids, Advances in Experimental Medicine and Biology, 366, Kumaran, A., Karunakaran, R.J., 2007, In vitro antioxidant activities of methanol extracts of five Phyllanthus species from India, LWT-Food Science and Technology 40: Langseth, L., 1996, Oxidants, antioxidants and disease prevention, International Life Science Institute, Belgium. Matkowski, A., 2006, Plant phenolic metabolites as antioxidants and antimutagens. In Y. Blume, P. Smertenko, & D. J. Durzan (Eds.). NATO Life Science Monographs, Amsterdam, IOS Press, 376: Miller, D.M., Buettner, G.R., Aust, S.D., 1990, Transition metals as catalysts of autoxidation reactions, Free Radical Biology&Medicine, 8, Naquı, A., Chance, B., Cadenas, E., 1986, Reactive oxygen intermediates in biochemistry, Annual Review of Biochemistry, 55, Nebel, S., Pieroni, A., Heinrich, M., 2006, Ta chòrta: wild edible greens used in the Graecanic area in Calabria, Southern Italy. Appetite, 47, Nitta, H., Kinoyama, M., Watanabe, A., Shirao, K., Kihara, H., Arai M., 2007, Effects of nutritional supplementation with antioxidant vitamins and minerals and fish oil on antioxidant status and psychosocial stress in smokers: an open trial. Clinical and Experimental Medicine, 7, Oyaizu, M., 1986, Studies on products of browning reactions: antioxidative activities of browning reaction prepared from glucosamine, Japanese Journal of Nutrition, 44, Özsoy, N., Can, A., Yanardağ, R., Akev, N., 2008, Antioxidant activity of Smilax excelsa L. leaf extracts, Food Chemistry, 110, Ozturk, M., Aydogmus-Ozturk F., Duru M E., Topcu G., 2007, Antioxidant activity of stem and root extracts of Rhubarb (Rheum ribes): An edible medicinal plant, Food Chemistry, 103, Prieto, P., Pineda, M., Aguilar, M., 1999, Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a phosphor molybdenum complex: Specific

40 37 application to the determination of vitamin E, Analytical Biochemistry, 269, Rice-Evans, C.A., Miller, N.J., 1998, Structure-antioxidant activity relationships of flavonoids and isoflavonoids,flavonoids in Health and Disease, 7, Rice-Evans, C.A., Miller, N.J., Bolwell, P.G., Bramley, P.M., Pridham, J.B., 1995, The relative antioxidant activities of plant-derived polyphenols flavonoids, Free Radical Research, 22, Roome, T., Dar, A., Ali, S., Nqqvi, S., Choudhary, M.I., 2008, A study on antioxidant, free radical scavenging, anti-inflammatory and hepatoproctective actions of Aegiceras corniculatum (stem) extracts, Journal of Ethnopharmacology, 118, Sarikurkcu, C., Arisoy, K., Tepe, B., Cakir, A., Abali, G., Mete, E., 2009, Studies on the antioxidant activity of essential oil and different solvent extracts of Vitex agnus castus L. fruits from Turkey, Food and Chemical Toxicology, 47, Schildermann, P.A.E.L., Ten-Hoor, F., Kleinjas, J.C.S., 1995, Induction of oxidative DNA damage and early lesions in rat gastro-intestinal epithelium in relation to prostaglandin Hsynthase-mediated metabolism of butylated hydroxyanisole, Food Chemical Toxicology, 33, Sebranek, J.G., Sewalt, V.J.H., Robbins, K.L., Houser, T.A., 2005, Comparison of a natural rosemary extract and BHA/BHT for relative antioxidant effectiveness in Pork sausage, Meat Science, 69, Sies, H., 1991, Oxidative stress: Oxidants and Antioxidants, Academic Press, London. Singleton, V.L., Rossi, J.A., 1965, Colorimetry of total phenolics with phosphomolybdicphosphotungstic acid reagents, American Journal of Enology and Viticulture, 16, Stewart, A.J., Bozonnet, S., Mullen, W., Jenkins, G.I., Lean, M.E.J., Crozier, A., 2000, Occurrence of flavonols in tomatoes and tomato-based products, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 48, Ugulu, I., Baslar, S., Yorek, N., Dogan, Y., 2009, The investigation and quantitive ethnobotanical evaluation of medicinal plants used around Izmir province, Turkey, Journal of Medicinal Plants, 3(5), Vinson, J.A., Dabbagh, Y.A., 1998, Tea phenols: antioxidant effectiveness of teas, tea components, tea fractions and their binding with lipoproteins, Nutrition Research, 18,