INNO-LiPA HLA-A Multiplex 100

Transkript

1 Anahtar Kod: FRI INNO-LiPA HLA-A Multiplex v0 P 1/7 Türkçe INNO-LiPA HLA-A Multiplex 100 Üretici: Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belçika BTW BE RPR Gent Distribütör: Fujirebio Almanya GmbH Hans-Böckler-Allee Hannover Almanya Fujirebio İtalya S.r.l. Via Vaccareccia 39/A Pomezia (Roma) Italya Fujirebio Fransa SARL Les Conquérants, Bât. Le Kilimandjaro 8/10, avenue des Tropiques Les Ulis Fransa Fujirebio İberya S.L. Calle Tarragona 161, Planta Barselona İspanya Fujirebio Europe N.V. Technologiepark Gent Belçika Diğer dilleri için / Autres langues voir / Veere Sprachen siehe / Altre lingue vedere / Ver otros idiomas / Outras línguas ver: EUROPE GR IS LT RO SK TR LI MT non-europe US CA AR, BR, CO, UY, AU, NZ, RU :00 17:00 GMT+1 M T W T F S S Fujirebio Europe N.V.

2 İÇİNDEKİLER Kullanılan semboller... 2 Kullanım amacı... 3 Test prensibi... 3 Reaktifler... 3 Açıklama, kullanım için hazırlık ve önerilen saklama koşulları... 3 Gerekli ve sağlanmayan materyaller... 3 Güvenlik ve çevre... 3 Numunelerin toplanması, hazırlanması ve saklanması... 4 DNA ekstraksiyonu... 4 PCR karışımının hazırlanması... 4 PCR döngüsü... 4 Açıklamalar ve önlemler... 4 Test prosedürü... 6 Sonuçlar... 6 Görüntüleme... 6 Geçerlilik... 6 Prosedürün kısıtlamaları... 6 Test performansı... 6 Hassasiyet... 7 Kesinlik (iç veri)... 7 Ticari markalar... 7 Kullanılan semboller Üretici In Vitro Tanısal Medikal Yöntem Batch Kodu Katalog Numarası Kullanıcı Kullanım Talimatları Sıcaklık Kısıtlaması Amplifikasyon Kiti Amplifikasyon Tamponu LiPA Taq Primer Çözeltisi

3 Kullanım amacı INNO-LiPA HLA-A Multiplex kit, in vitro kullanım için, insan lökosit antijeni (HLA) A lokusunun birinciden dördüncü ekzonuna kadar nükleik asit amplifikasyonu gerçekleştirmek için tasarlanmıştır. Söz konusu reaksiyon, çok katlı biçimde olmak üzere polimeraz zincir reaksiyonu (PCR) vasıtasıyla gerçekleştirilir. Test prensibi PCR ile amplifiye edilmesi için DNA örneği deoksinükleosit 5'-trifosfatlar (dntp), biyotinile primerler, termostabil DNA polimeraz ile bir tampon içeren bir reaktif karışımı fazlası muamele edilir. Primerler hedef DNA dizisini "kullanım amacı"nda belirtildiği üzere amplifiye eder. Hedef dizileri primerlere maruz bırakmak için ısıtılmak suretiyle DNA sarmalının iki ipi birbirinden ayrılır(denatürasyon ). Belirli bir sıcaklığa kadar soğutularak bu primerlerin dizideki tamamlayıcı bölgelere bağlanması sağlanır. (primer bağlanması) Başka bir özgün sıcaklıkta, termostabil DNA polimeraz, fazla dntpleri kullanarak bağlanmış primerleri hedef şablon boyunca uzatır (uzama). Bu şekilde, bir döngüden sonra hedef dizinin iki tam biyotinile kopyası üretilmiş olur.bir çok döngüden sonra, hedef dizinin büyük miktarda biyotinile kopyası elde edilir. Reaktifler Açıklama, kullanıma hazırlık ve önerilen saklanma koşulları - Reaktifler kontamine edici herhangi bir DNA kaynağından özellikle amplifiye ürünlerden izole şekilde saklanmalıdır. - Amplifikasyon sürecinin reaktifleri amplifiye DNA bulunmayan bir odada ele alınmalıdır. Otoklavlanmış tüpler ve pipet uçları (tercihen pamuk filtreli) kullanılmalıdır /-15 C de ve orijinal viallerinde bulunduğu sürece reaktifler son kullanma tarihlerine kadar kararlıdır. Buna rağmen, reaktiflerin ilk kullanımdan sonra porsiyonlanması /LİPA-Taq hariç) ve ardından -25/-15 C de saklanması önerilir. - Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayın. - Kit reaktiflerinin fiziksel görünümündeki değişiklikler kararsızlık veya bozulma göstergesi olabilir. İçerik Miktar Ref. Açıklama Amp. Tamponu 2 x 0.75 ml Bütün dntp leri ve koruyucu olarak %0.05 NaN3 içerir. Kullanmadan önce tamamen çözün. Primer Çözeltisi 2 x 0.75 ml Biotinlenmiş primerler, MgCI2, Tris Tamponu, ve %0.05 NaN 3 içerir. Kullanmadan önce MgCI 2 ün dağılması için reaktifi tamamen çözün ve C ye getirin. LiPA-Taq 2 x 0.09 ml Taq DNA polimeraz (2 U/µl) ve koruyucu olarak %0.05 lik NaN 3 içerir. Kullanmadan önce -25/-15 C de tutun ve süratle kullanın. Gereken ama sağlanmayan materyaller - DNA ekstraksiyonu için materyaller. - Tek kullanımlık eldiven. - Tek kullanımlık steril pipet uçları (tercihen pamuk filtreli). - Steril mikrotüpler - Mikrotüp rakları. - Mikrotüp santrifüjü. - DNA termal cycler ve ekipmanlar µl, µl, ve µl ayarlanabilen multipipet. - Otoklavlanmış distile su. - Mineral yağ (eğer gerekirse). Güvenlik ve çevre - Tehlikeli olması muhtemel içerikler hakkında bilgi edinmek için lütfen Safety Data Sheet (SDS) e ve ürün etiketlerine başvurunuz. Son SDS versiyonu sitesinden bulunabilir.

4 - Numuneler her zaman potansiyel bulaşıcı olarak ele alınmalıdır. - Kişisel koruyucu ekipman kullanımı gereklidir: tehlikeli veya bulaşıcı ajanlar işlenirken eldiven ve koruyucu gözlük. - Atık kurumun atık kurallarına göre ele alınmalıdır. Tüm federal, eyalet ve yerel çevre düzenlemeleri de dikkate alınmalıdır. Numunelerin toplanması, hazırlanması ve saklanması - Reaktifler ürünle birlikte verilmez. DNA ekstraksiyonu Genel olarak kullanılan salting-out DNA ekstraksiyon yöntemi veya spin kolonları temelli yöntemler asit sitrat dekstroz (ACD) veya etilendiamintetraasetik asit (EDTA) ile antikoagüle edilmiş tam kan örneği veya dalak dokusundan genomik DNA hazırlamak için kullanılabilir. DNA örneklerini -25/-15 C de saklayın. Ekstrakte edilmiş DNA nın konsantrasyonu 0.02 µg/µl ile 1.5 µg/µl arasından olmalıdır. Saflığı (A260nm/A280nm) 1.5 olmalıdır. PCR karışımının hazırlanması Her bir bileşen ilave edilmeli ve doğru miktarda temin edilmelidir. Çok fazla veya çok az örnek veya reaktif kullanımı özgün olmayan amplifikasyona hatta hiç amplifikasyon olmamasına neden olabilir. PCR döngüsü INNO-LiPA HLA-A Multiplex için doğru sıcaklık profili seçilmiş olmalıdır. Açıklama ve önlemler - PCR kontaminasyonunu önlemek için, öncesi ve sonrası-amplifikasyon adımlarının fiziksel ayrımını maksimize edin: ayrı odalar, ayrı pipetler ve diğer lab malzemeleri, ayrı önlük ve eldivenler (ve stokları)iyi laboratuvar uygulamaları için alınabilecek minumum önlemlerdir. Reaktifler, özellikle amplifiye DNA ürünleri gibi DNA kirletici kaynağından izole edilmelidir. Ayrıca reaktiflerin mikrobik kontaminasyonundan da kaçınılmalıdır. - Amplifikasyon sonrası odasından, amplifikasyon öncesi odasına herhangi bir dönüşten kaçının. - Amplifikasyon işlemi için tüm pipet uçları ve tüpler otoklavlanmalıdır. Pamuk filtreli pipet uçları tavsiye edilir. Her porsiyonlanmış numune için yeni bir steril pipet ucu kullanın. - Bileşenlerin aynı lot numarasında değilse, kitler arasındaki reaktifleri karıştırmayın. - Amplifikasyon Tamponunu ve Primer Çözeltisini çözdükten sonra vorteksleyin ve bütün reaktiflere spin attırın, özellikle LİPA-Taq a. Test prosedürü - HLA-A geninin 1, 2, 3 ve 4. ekzonlarının amplifikasyonu için olan bu protokol GeneAmp PCR tüpleri (0.5 ml) ve PE-480 termal cyclerlar, veya MicroAmp PCR tüpleri (0.2 ml) ve GeneAmp PCR Sistemi 9700 termal cyclerlar, ve LiPA-Taq kullanarak optimum amplikasyonu sağlamak için tasarlanmıştır. Bu protokol, termal cycler'ların çoğu ticari türleri için kullanılabilir, fakat cycler üreticisi tarafından gösterilen bazı değişiklikler gerekli olabilir. - Kullanımdan önce, protokolunuzun laboratuarınızda kullanılan termal cycler ile uyumlu olup olmadığını belirleyin. Termal cycler'ın kullanılmadan önce kalibre edildiğinden emin olun. - Spesifik olmayan amplifikasyon ve primer-dimer oluşumunu önlemek için gerekli önlemleri alın,

5 sonuçları etkileyebilecek durumlar: Pipetleme adımlarını buz içerisinde ve gecikmeden gerçekleştirin. Örnekleri yüklemeden önce ısıtıcı bloklara ön ısıtma (96 C ± 0.75 C) yapın ve termal döngüyü süratle başlatın. 1. Her genomik DNA yı 0.02 ve 1.5 µg/µl konsantrasyonları aralığında TE tampon ile seyreltin. 2. Hazırlanacak vial sayıdına N dersek, N = DNA örneği sayısı + 1 (Negatif kontrol; DNA sız) + 1. Master mix i (N x 23.5 µl) pamuk filtreli pipet uçları kullanarak otoklavlanmış 1.5 ml lik tüplerde otoklavlanmış distile su kullanarak hazırlayın: (N x µl) Otoklavlanmış distile su + (N x 10 µl) Amplifikasyon Tamponu + (N x 10 µl) HLA-A multiplex Primer Çözeltisi + (N x 1.25 µl) LiPA-Taq (N x 2.5 U) Bu amplifikasyon karışımının toplam hacmi şimdi N x 45 µl dir. Master karışımı hafifçe vorteksleyin N-1 tane otoklavlanmış amplifikasyon tüpüne tüp başına 45 µl olmak üzere dağıtın. 3. Eğer gerekliyse her tüpe 2 damla ( 40 µl) mineral yağ ekleyin ( örneğin PE-480 kullanırken). Genomik DNA hazırlığından 5 µl ( µg) pipetleyin (gerekliyse mineral yağ ile beraber). Negatif Kontrol tüpüne 5 µl distile su (DNA sız) ekleyin. Vortekslemeyin veya karıştırmayın! Amplifikasyon karışımı tüpün tabanında mı kontrol edin! 4. Örnekleri önceden ısıtılmış ve kalibrasyonu yapılmış termal bloklara yerleştirin ( termal cyclerın üreticisi tarafından sağlanan talimatları izleyin.) INNO-LiPA HLA-A Multiplex amplifikasyonu için tasarlanmış programı başlatın. HLA-A Multiplex Amplifikasyon profili Basamaklar Sıcaklık Süre ± 0.75 C 1 Denatürasyon 96 C 5 dak 2 Denatürasyon 96 C 30 sn 3 Primer bağlanması 64 C 50 sn 2 den 4 e basamakları 5 kez tekrarlayın. 4 Primer uzaması 72 C 50 sn 5 Denatürasyon 96 C 30 sn 5 den 7 ye basamakları 5 kez tekrarlayın 6 Primer bağlanması 62 C 50 sn 7 Primer uzaması 72 C 50 sn 8 Denatürasyon 96 C 30 sn 8 den 10 a basamakları 10 kez tekrarlayın 9 Primer bağlanması 60 C 50 sn 10 Primer uzaması 72 C 50 sn 11 Denatürasyon 96 C 30 sn 11 den 13 e basamakları 15 kez tekrarlayın. 12 Primer bağlanması 55 C 50 sn 13 Primer uzaması 72 C 50 sn 14 Uzama 72 C 10 dak

6 NOT Aynı amplifikasyon profili INNO-LiPA HLA sınıf I ürünlerde de kullanılabilir. 5. Amplifikasyon prosesinin ardından örnekleri derhal INNO-LiPA HLA-A Update striplerinde kullanın veya 25/-15 C de saklayın. Amplifiye edilmiş DNA ürünlerini kullanılmamış amplifikasyon reaktifleri ile aynı yerde saklamayın. Sonuçlar Görüntüleme - Amplifiye edilmiş ürün varlığı,% 2 lik agaroz jel üzerinde kontrol edilebilir. Yarık başına 10 ul amplifiye ürün yükleyin. INNO-LiPA HLA-A Multiplex amplifikasyonu 578 bp (ekzon 1-2), 436 bp (ekzon 3), ve 377 bp (ekzon 4) olmak üzere üç amplikon üretir. ekzon 3 ve ekzon 4 ürünleri için olan amplikonlar agaroz jelde benzer oranda yürür. Bu amplikonlar beraber tek kalın bir bant (bir kenarı 377 bp de ve diğer kenarı 436 bp de olmak üzere) halinde görünür. - Üretici gözlemleri göstermiştir ki; 10 µl amplifiye ürünün %2 lik agaroz jel üzerinde kontolü sırasında eğer iki bant, örneğin bir normal bant ve bir kalın bant gözleniyorsa, LİPA testi ile yorumlanabilir bir sonuç elde edilebilir. Geçerlilik Her amplifikasyon çalışmasına en azından bir pozitif ve bir negatif kontrol eklenmelidir. Herhangi bir yeni laboratuar prosedüründe test prosedürünün doğru bir şekilde uygulanabileceğine dair yüksek derecede güven gelişene kadar pozitif ve negatif kontrolün varlığı dikkate alınmalıdır. Ek bir pozitif kontrolün varlığına ihtiyaç duyuluyorsa, bilinen bir pozitif örnek kullanın. - Jelde negatif bir kontrol için pozitif bir bant elde edilirse çalışma dışlanmalı bütün test prosedürü tekrar edilmelidir. Prosedürün kısıtlamaları - Bu ürünün kullanımı amplifikasyon teknikleri konusunda eğitim almış personel ile sınırlı olmalıdır. - Polimeraz inhibisyonu (örneğin heparin hemoglobin tarafından ) testin tam bir başarısızlıkla sonuçlanmasına sebep olabilir! - Tek kullanımlık eldivendeki toz ve sodyum hipokloritin amplifikasyonu engelleyici bir etkisi vardır. - DNA örneklerinin tekrarlayan dondurma/çözme işlemleri daha az etkili bir amplifikasyona sebep olabilir. - Primer bağlanması bölgesindeki dizilim bütün alleller için bilinmemektedir. Primer bölgesinde yanlış eşleşme riski çok düşük bir ihtimaldir. Primer başarısızlığı hiç gözlenmemiştir ve tüm grupları kapsayan alleller yüksek miktarda test edilmiştir. Buna rağmen, homozigot sonuçlarda allelik dropout durumu göz önüne alınmalıdır. - İyi laboratuar uygulamaları ve önceden belirtilen prosedürlerin dikkatli uygulanması spesifik amplifikasyona olanak sağlar. - Sadece in vitro kullanım için. Test performansı INNO-LiPA HLA-A Multiplex testinin performansı 4 Avrupa doku tipleme bankasının rutin tipleme örnekleri ile değerlendirilmiştir. Toplamda 346 örnek analiz edilmiştir. DNA, taze veya EDTA lı veya sitrat lı kandan ekstrakte edilmiştir. DNA ekstraksiyon yöntemleri salting out, QIAamp 96 DNA blood kit (Qiagen), Genomic DNA Purification kit (Promega) ve Puregene (Gentra Systems) dir. Taze veya dondurulmuş DNA GeneAmp PCR Sistem PE-9600 veya PE-9700 termal cycler kullanılarak amplifiye edilmiştir. Amplikonlar striplere eklenmeden önce 2-8 C veya -25/-15 C de saklanmıştır.

7 Hassasiyet 3 DNA örneğinin 0.01 µg/µl ile 2 µg/µl arasında değişen dilüe serisinin iç değerlendirmesi göstermiştir ki, bütün örnekler agaroz jelde görünürdür ve doğru tiplenmiştir. Harici performans, konsantrasyonları 20 ve 1500 ng/µl arasında, saflığı (A260nm/A280nm) 1.5 olan 346 DNA örneği kullanılarak değerlendirilmiştir. DNA, amplifikasyon öncesi 20 ng/µl ve 250 ng/µl konsantrasyonları arasında dilüe edilmiştir. Bir merkezde bir örneğin tekrar testine ihtiyaç duymasına rağmen, amplifikasyonda başarısızlığa rastlanmamıştır. Kesinlik (iç veri) 2 örnek 3 kere, 2 farklı çalışmada, 2 farklı kullanıcı tarafından amplifiye edilmiştir. Bütün örnekler agaroz jelde görünürdür. Prob aktivitesi bütün kombinasyonlarda karşılaştırılabilirdir. Bütün durumlarda örneklerin yorumlanması aynıdır. Ticari markalar - INNO-LiPA ABD gibi dünya çapında bir markadır. - LiPA Benelüks'ün tescilli markasıdır ve dünyanın geri kalanında markadır (ABD dahil). - GeneAmp, Applied Biosystems, LLC. ın tescilli markasıdır. - MicroAmp, Applied Biosystems, LLC. ın tescilli markasıdır.