KARYA TİPİ KOYUNLARDA MİKROSATELLİT DNA POLİMORFİZMİNE DAYALI EBEVEYN TAYİNİ

Transkript

1 T.C. ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLER ENSTİTÜSÜ ZOOTEKNİ ANABİLİM DALI ZZO-DR KARYA TİPİ KOYUNLARDA MİKROSATELLİT DNA POLİMORFİZMİNE DAYALI EBEVEYN TAYİNİ Onur YILMAZ Tez Danışmanı: Prof. Dr. Orhan KARACA AYDIN

2 v T.C. ADNAN MENDERES ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ MÜDÜRLÜĞÜ NE Bu tezde sunulan tüm bilgi ve sonuçların, bilimsel yöntemlerle yürütülen gerçek deney ve gözlemler çerçevesinde tarafımdan elde edildiğini, çalışmada bana ait olmayan tüm veri, düşünce, sonuç ve bilgilere bilimsel etik kuralları gereği olarak eksiksiz şekilde uygun atıf yaptığımı ve kaynak göstererek belirttiğimi beyan ederim. 16/09/2010 İmza Onur YILMAZ

3 vii ÖZET KARYA TİPİ KOYUNLARDA MİKROSATELLİT DNA POLİMORFİZMİNE DAYALI EBEVEYN TAYİNİ Onur YILMAZ Doktora Tezi, Zootekni Anabilim Dalı Tez Danışmanı: Prof. Dr. Orhan KARACA 2010, 93 sayfa Son yıllarda DNA dizilerinin değişik moleküler genetik teknikleri ve özgün DNA polimorfizmlerinin genetik marker olarak kullanımları hızla gelişmektedir. DNA ya dayalı yöntemler ebeveyn testlerinde oldukça yaygın kullanılmaktadır. Bu nedenle rutin olarak pedigri testlerinde kullanılan kan tiplerinin yerini almıştır. Çalışmanın hedefini, araştırmada ele alınan 10 lokusun heterozigotluk oranı, dışlama gücü, uyuşma olasılığı ve ayrımlama gücü açısından değerlendirilmesi ve ilgili lokusların Karya koyunların ebeveyn tayininde kullanılabilirliklerinin araştırılması oluşturmuştur. Çalışmada 10 mikrosatellit lokusu (MAF65, OarJMP58, OarFCB193, OarFCB304, OarJMP29, BM8125, OarFCB128, OarCP34, OarVH72, DYMS1) kullanılarak Adnan Menderes Üniversitesi Grup Koyun Yetiştirme Programı (ADÜ-GKYP) çekirdek sürüsünde yer alan 16 koç ve bunların 101 yavrusunda babalık testi yapılmıştır. Hayvanlara ait kan örnekleri K3-EDTA lı tüplere alınmış ve DNA izolasyon kiti ile DNA izolasyonu gerçekleştirilmiştir. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) yöntemi ile ilgili DNA bölgeleri yükseltgenmiştir. Fragman analizleri Beckman Coulter CEQ 8000 cihazında yapılmıştır. Elde edilen fragman uzunlukları Beckman Coulter CEQ 8000 yazılımında değerlendirilmiştir. Çalışmada 105 allel gözlemlenmiştir. Lokuslar bazında gözlenen heterozigotluk oranı (Ho) 0,541 ile 0,841 arasında, beklenen heterozigotluk oranı (He) ise 0,699 ile 0,831 arasında olmuştur. Çalışmada, lokusların bireysel olarak dışlama olasılıkları (P E ) ve artan lokus kombinasyonları için dışlama olasılıkları (CP E ) hesap edilmiştir. P E değeri 0,295 ile 0,514; CP E değeri ise 0,363 ile 0,994 arasında değişmiştir. MP değeri 0,054 ile 0,154, P D değeri ise 0,85 ile 0,94 arasında değişmiştir. Sonuç olarak, yapılan babalık testi çalışması ile Karya koyunlarda babalık testlerinde kulanılabilecek uygun genetik markerlar belirlenmiştir. Ayrıca elde edilen sonuçlar ülkemizdeki diğer populasyonlar için bir referans teşkil edecektir. Anahtar Sözcükler: Babalık testi, dışlama olasılığı, Karya, mikrosatellit

4 ix ABSTRACT PARENTAGE ANALYSIS WITH MICROSATELLITES IN KARYA TYPE SHEEP Onur YILMAZ Ph.D. Thesis, Department of Animal Sciences Supervisor: Prof. Dr. Orhan KARACA 2010, 93 pages Nowadays, the use of DNA sequences with genetic techniques and DNA polymorphism as genetic markers is increasing very rapidly. DNA testing is widely used to confirm the parentage of new registrants, and DNA verification of pedigrees is progressively replacing testing based on blood types. The aim of this study was to examine heterozygosity, calculate the power of exclusion, match probability and paternity index of the ten loci, and examine the usefulness of the involved loci in paternity tests. In the present study, 10 microsatellite loci (MAF65, OarJMP58, OarFCB193, OarFCB304, OarJMP29, BM8125, OarFCB128, OarCP34, OarVH72, DYMS1) were evaluated for their possible use to confirm paternity between 16 rams, their 101 offspring in nucleus flock of Adnan Menderes University Group Sheep Breeding Program (ADU-GKYP). DNA samples was isolated by DNA extraction kit from blood samples. Spesific genomic regions were amplified by Polymerase Chain Reaction (PCR). Fragment analysis was achieved using the automatic laser-induced fluorescence DNA sequencer Beckman Coulter CEQ 8000 Genetic Analysis System. These data obtained was analyzed by the Beckman Coulter CEQ 8000 software. A total of 105 alleles were observed in this study. The estimated observed heterozygosities (Ho) were between 0,541 and 0,841 and expected heterozygosities (He) were between 0,699 and 0,831. Probability of exclusion (P E ) for each locus and probability of exclusion for increasing combinations (CP E ) of the 10 loci were calculated. P E for each locus were between 0,295 and 0,514, CP E of the 10 loci were between 0,363 and 0,994. Matching probability (MP) (between 0,054 and 0,154) and power of discrimination (P D ) (between 0,85 and 0,94) were also calculated. As a result, the suitable genetic markers determined for paternity test in Karya sheep. These results could also be used as a reference for the other sheep population in Turkey. Key words: Paternity analysis, probability of exclusion, Karya, microsatellite

5 xi ÖNSÖZ Ülkemizde özellikle koyunlarda yapılan moleküler genetik tanımlamalara yönelik çalışmalar sınırlı sayıdadır. Bu nedenle mevcut yerli koyun ırklarının tanımlanmasında klasik yetiştirme teknikleri dışında ayrıntılı moleküler tekniklerin kullanılmasına da gereksinim vardır. Araştırmada 10 mikrosatellit primeri ile Batı Anadolu da yaygın olarak yetiştiriciliği yapılan Karya koyunlarda babalık testi yapılarak bazı moleküler genetik parametreler ortaya konulmuştur. Çalışma, ülkemizde yapılacak diğer çalışmalara temel oluşturması bakımından önemli olması dışında elde edilen babalık testi referansları proje materyali dışındaki benzer populasyonların tamamında da kullanılabilecektir. Yüksek lisans ve doktora eğitimim boyunca değerli bilgi ve deneyimlerinden yararlandığım her zaman ilgi ve desteğini gördüğüm, yanında çalışmaktan onur duyduğum, çok değerli danışman hocam Sayın Prof. Dr. Orhan KARACA ya, çalışmada kullanılacak metodu öğrenmemde çok büyük emeği olan, çalışmam sırasında her zaman desteğini hissettiğim çok değerli hocam Sayın Doç. Dr. İbrahim CEMAL e ayrıca tez izleme komitelerinde değerli fikirlerini aldığım çok değerli hocam Sayın Prof. Dr. Turgay TAŞIN a teşekkür ederim. Kullanılan metodun öğrenilmesinde yardımlarını esirgemeyen İYTE Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölüm Başkanı Doç. Dr. Sami Doğanlar a, Beckman Coulter sistem biyolojisi uzmanı Dr. Alp KİBAROĞLU na, sunduğu laboratuar altyapısı ve huzurlu çalışma ortamıyla bu çalışmayı gerçekleştirmemi kolaylaştıran Adnan Menderes Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi (ADÜ-BİLTEM) çalışanlarına ve labaratuar çalışmalarım sırasında değerli fikirlerini aldığım ADÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı öğretim üyesi değerli hocam Doç. Dr. Bülent BOZDOĞAN a teşekkür ederim. Çalışmanın gerçekleştirilmesinde laboratuar imkanlarını kullanımamı sağlayan ADÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı Başkanı Prof. Dr. Neriman AYDIN a, Doç. Dr. Mete EYİGÖR e, Yrd. Doç. Dr. Sevin KIRDAR a ve Yrd. Doç. Dr. Murat TELLİ ye teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca Doktora eğitimim süresince verdiği destek ve hoşgörüden dolayı değerli eşim Vahide YILMAZ a teşekkür ederim. Hayvanlardan kan örneklerinin alınmasında yardımlarını esirgemeyen değerli arkadaşım Öğr. Gör. Dr. Engin YARALI ya, Salih Umut Çavaş a ve bölümümüz koyunculuk ünitesinde çalışan tüm personele teşekkür ederim. Bu araştırmanın yürütülmesi için maddi olanak sağlayan Adnan Menderes Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Komisyonu Başkanlığına teşekkür ederim.

6 xiii İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY SAYFASI... i BİLİMSEL ETİK BİLDİRİM SAYFASI... iii ÖNSÖZ... v ÖZET... vii ABSTRACT... ix İÇİNDEKİLER... xi SİMGELER DİZİNİ... xiii ŞEKİLLER DİZİNİ... xv ÇİZELGELER DİZİNİ... xvii EKLER DİZİNİ... xix 1. GİRİŞ KAYNAK ÖZETLERİ Hayvancılıkta Ebeveyn Testlerinin Önemi Hayvancılıkta Ebeveyn Testlerinde Kullanılan Yöntemler Ebeveyn Testlerinde Kullanılan Fenotipe Dayalı Yöntemler Ebeveyn Testlerinde Kullanılan Moleküler Genetik Yöntemler Mikrosatellitlere (STR) Dayalı Ebeveyn Testleri Küçükbaş Hayvanlarda Mikrosatellitler İle Yapılan Ebeveyn Testleri Büyükbaş Hayvanlarda Mikrosatellitler İle Yapılan Ebeveyn Testleri Atlarda Mikrosatellitler İle Yapılan Ebeveyn Testleri Diğer Türlerde ve Yabani Hayvan Populasyonlarında Mikrosatellitler İle Yapılan Ebeveyn Testleri MATERYAL VE YÖNTEM Hayvan Materyali Kan Örneklerinin Toplanması Kandan DNA İzolasyonu Nucleospin Protokolüne Göre DNA İzolasyonu Çalışmada Kullanılan Mikrosatellitler... 27

7 xiv 3.5. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) PCR ile DNA Çoğaltımı Touch Down- PCR Yönteminde Kullanılan Yükseltgenme Koşulları PCR Ürünlerinin Agaroz Jelde Gözlemlenmesi Kapiler Elektroforez ve Fragman Analizi Fragman Uzunluklarının Hesaplanması İstatistik Analizler BULGULAR ve TARTIŞMA SONUÇ KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ... 69

8 xv SİMGELER DİZİNİ AFLP bç (bp) CP E EtBr EPDs FAO HLA Ho He Çoğaltılmış Parça Uzunluk Polimorfizmi (Amplified Fragment Lenght Polymorphism) Baz çifti (Base pair) Kombine Edilmiş Dışlama Olasılığı (Combined Exclusion of Probability) Etidium Bromür Tahmin Edilen Döl Farklılığı (Expected Progeny Differences) Gıda ve Tarım Örgütü (Food and Agriculture Organization) İnsan Lökosit Antijeni (Human Leukocyte Antigen) Gözlenen Heterozigotluk Oranı (Observed Heterozygosity) Beklenen Heterozigotluk Oranı (Expected Heterozygosity) H^ Ortalama Heterozigotluk (Average Heterozygozity) ISAG LOD Uluslararası Hayvan Genetiği Derneği (International Society of Animal Genetics) Logaritmik Olasılık Değeri (The Logarithm of the Likelihood Ratio) µl Mikrolitre mm ML MP Milimol Eşleşmeyen Lokus Sayısı, (Mismatching Probability) Karşılama (Uyuşma) Olasılığı (Matching Probability) n A Allel Sayısı (Number of Allele) n E Etkili Allel Sayısı (Effective Allele Number) PCR Polimeraz Zincir Reaksiyonu (Polymerase Chain Reaction)

9 xvi P D Ayrımlama Gücü (Power of discrimination) PI PIC Babalık İndeksi (Paternity Index) Polimorfik Bilgi İçeriği (Polymorphic Informaiton Content) P E Dışlama Olasılığı (Exclusion of Probability) CL RFLP SLS SNP Karşılaştırılan Lokus Sayısı Kesilen Parça Uzunluk Polimorfizmi (Restiriction Fragment Lenght Polymorphism) Örnek Yükleme Solüsyonu (Sample Loading Solution) Tek Nükleotit Polimorfizmi (Single Nucleotide Polymorphism) SRAF Seçici Kesilmiş Parça Çoğaltma (Selective Restriction Fragment Amplification) STR TD-PCR UV Mikrosatellit (Short Tandem Repeat) Touch Down-PCR Ultraviyole

10 xvii ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Mikrosatellitlerin tipik formu ve mikrosatellitin etrafındaki benzersiz dizi. 11 Şekil 2.2 Otomasyon sistemi ile tespit edilen yavru ve ebeveynlere ait pikler.. 12 Şekil 3.1 Karya Koyunu 26 Şekil 3.2 ADÜ Merkez Araştırma Laboratuarında kullanılan PCR 32 cihazından bir görünüm Şekil 3.3 Çoğaltılan DNA parçalarının büyüklüklerinin belirlenmesinde kullanılan DNA cetveli (ladder) 34 Şekil 3.4 Farklı yükseltgenme koşullarında çoğaltılan 10 mikrosatellitin PCR sonrası agaroz jeldeki bant görüntüsü. 34 Şekil 3.5 ADÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalında bulunan ve çalışmada kullanılan Beckman Coulter CEQ-8000 Cihazından 36 bir görünüm.. Şekil 3.6 DYMS1 Mikrosatellit lokusu bakımından heterozigot genotipe sahip birey. 37 Şekil 3.7 DYMS1 Mikrosatellit lokusu bakımından homozigot genotipe sahip birey Şekil 4.1. Lokuslara ait bireysel dışlama olasılıklarının (P E ) değişimi Şekil 4.2. Artan lokus kombinasyonlarına göre kombine edilmiş dışlama olasılıklarının (CPE) değişimi.. 50

11 xviii

12 xix ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Yıllara göre örnek toplanan hayvan sayıları.. 24 Çizelge 3.2 Çiftleşmelerde kullanılan koçlar ve bunlara ait kuzu sayıları 25 Çizelge 3.3 Çalışmada kullanılan mikrosatelitler. 28 Çizelge 3.4 Çalışmanın başlangıcında oluşturulan multipleks grupları 29 Çizelge 3.5 Çalışmada oluşturulan multipleks grupları 30 Çizelge 3.6 OarCP34, OarFCB193, OarFCB304 (Multipleks-1) isimli mikrosatellit bölgelerinin PCR bileşenleri Çizelge 3.7 OarJMP29, OarFCB128, BM8125 (Multipleks-2) isimli mikrosatellit bölgelerinin PCR bileşenleri Çizelge 3.8 OarJMP58, OarVH72 (Multipleks-3) isimli mikrosatellit bölgelerinin PCR bileşenleri. Çizelge 3.9 MAF65 isimli mikrosatellit bölgesinin PCR bileşenleri.. 31 Çizelge 3.10 DYMS1 isimli mikrosatellit bölgesinin PCR bileşenleri Çizelge 3.11 OarCP34, OarFCB193, OarFCB304 (Multipleks-1) isimli mikrosatellit bölgeleri için PCR programı.. Çizelge 3.12 OarJMP29, OarFCB128, BM8125 (Multipleks-2) isimli mikrosatellit bölgeleri için PCR programı. Çizelge 3.13 OarJMP58, OarVH72 (Multipleks-3) isimli mikrosatellit bölgeleri için PCR programı.. Çizelge 3.14 MAF65 isimli mikrosatellit bölgesi için PCR programı 33 Çizelge 3.15 DYMS1 isimli mikrosatellit bölgesi için PCR programı.. 33 Çizelge 4.1. Çalışmada kullanılan mikrosatellitlere ait gözelenen boyut aralığı (GBA), örnek sayısı (N), allel sayısı (na), gözlenen heterozigtluk (Ho), beklenen heterozigtluk (He), polimorfik bilgi içeriği (PIC) ve 42 ayrımlama gücü (PD) değerleri Çizelge 4.2 Bazı çiftlik hayvanlarında mikrosatellitlerle yapılan çalışmaların He bakımından karşılaştırılması. 44 Çizelge 4.3 Homozigot ve heterozigotların oranı, Babalık İndeksi (PI), Tanımlama Gücü (PD) ve MP (karşılama olasılığı) değerlerine ilişkin 46 bilgiler.. Çizelge 4.4. Mikrosatellit lokusuna ait bireysel dışlama olasılıkları (P E ) 47 Çizelge 4.5. Artan lokus kombinasyonlarına göre kombine edilmiş dışlama olasılıkları (CPE) 49 Çizelge mikrosatellit lokusuna ait χ2 testi değerleri 51 Çizelge 4.7 Pedigri kayıtlarına yanlış işlenen babaların oranı 52 Çizelge 4.8 LOD skoruna göre yapılacak değerlendirmeler 52 Çizelge 4.9 Dışlanan ve atanan babalara ait lokus bilgileri

13 xx

14 xxi EKLER DİZİNİ EK-1 Çalışmada kullanılan mikrosatellit lokuslarına ait allel frekanslarının dağılımı EK-2 Çalışmada kullanılan hayvanlarda 10 mikrosatellit lokusunda gözlenen fragman uzunlukları. EK-3 Babalık testi yapılan aday koçlara ait karşılaştırılan lokus sayıları (PL), eşleşmeyen lokus sayıları (ML) ve LOD skorları

15 1 1. GİRİŞ Geçtiğimiz yüzyılda özellikle çiftlik hayvanlarında yapılan ıslah çalışmalarında istatistik metotlar yaygın bir uygulama alanı bulmuştur (Beuzen vd., 2000). Günümüzde ise moleküler biyoloji ve istatistik bilimindeki son gelişmeler, çiftlik hayvanlarında genetik ilerleme için büyük etkili kantitatif karakter lokuslarının (QTL) ve genomik varyasyonun tanımlanmasını ve kullanılmasını olanaklı hale getirmiştir (Montaldo ve Meza-Herrera, 1998). Tek yumurta ikizleri ve klonlar dışında tüm hayvanlar, DNA düzeyinde birbirinden farklılık göstermektedir. Bu nedenle hayvanların DNA dizileri arasında çok ciddi düzeyde bir varyasyondan söz etmek mümkündür. İnsanoğlunun artan isteklerine cevap verebilmek için daha yüksek ve kaliteli üretim yapmak kaçınılmazdır. Bu nedenle özellikle hayvansal üretimde hayvanların bireysel olarak tanımlanması gerekmektedir. Önceleri bireysel tanımlamalarda kullanılan; kan gruplarının tiplendirilmesi ve biyokimyasal polimorfizm tespitine yönelik yöntemlerin yerini DNA temeline dayalı tanımlama yöntemleri almıştır (Cunningham ve Meghen 2001, Kaul vd., 2001, Simm, 1998). Restriksiyon enzimleri ile kesilen DNA ların jel elektroforezinde bireye özgü parçalar (fragman) verdiği tespit edilmiş ve bu yöntem DNA parmak izi olarak tanımlanmıştır. Bu yöntemin bulunması, genetik çalışmalarda bireylerin tanımlanmasında ve adli vakalarda oldukça önemli bir aşama kaydedilmesine neden olmuştur. Ancak, DNA parçalarının oldukça karmaşık yapısı ve bunların kolayca çoğaltılamaması bu yöntemin kullanılmasını sınırlandırmıştır (Jeffreys vd., 1985) yılında Mullis ve arkadaşları tarafından DNA nın çoğaltılmasına yönelik olarak bulunan Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) bu alanda bir çığır açmış ve DNA parmak izi yönteminin kullanılmasının önündeki engellerin büyük kısmını ortadan kaldırmıştır (Cunningham ve Meghen 2001, Mullis vd., 1986). Ancak PCR tek başına bireyler arasında var olan geniş varyasyonun tanımlanmasında yeterli olmamıştır. Bu nedenle 1989 yılında ilk kez mikrosatellit (STR - Short Tandem Repeat) olarak adlandırılan ve DNA da ardışık tekrarlar şeklinde yer alan yüksek düzeyde polimorfik yapılar dikkati çekmiş ve bu yapılar kullanılmaya başlanarak başarılı sonuçlar alınmıştır. Moleküler biyolojide meydana gelen bu

16 2 gelişmeler sayesinde günümüzde; DNA nın baz sıraları belirlenebilmekte, genlerin yerleri tespit edilebilmekte, genler arası ilişkiler incelenebilmekte ve bazı genler canlıdan canlıya aktarılabilmektedir. Moleküler belirteçler hayvancılıkta; populasyonların tanımlanmasında, pedigri analizlerinde, hayvansal ürünlerin orijinlerinin belirlenmesinde, gen fonksiyonlarının belirlenmesinde, evrim hakkındaki bilgilerin artırılması ve genom haritalarının çıkarılmasında, seleksiyonda ve koruma programlarında genetik yapının korunup korunmadığının kontrolünde, kimlik tanımada ve hayvanların kimi ender genleri taşıyıp taşımadıklarının belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır (Cunningham ve Meghen 2001, Simm, 1998). Bireyler arasındaki akrabalık ilişkileri ebeveyn testleri ile belirlenebilmektedir. Ebeveyn testlerinde; biyokimyasal yöntemler, RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), DNA parmak izi, AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism), SNP (Single Nucletide Polymorphism) ve STR (Short Tandem Repeat) gibi moleküler genetik yöntemlerden yararlanılmaktadır. Hayvan ıslahında, özellikle damızlık hayvan seçiminde, düzenli bir soy kütüğünün tutulmasının yanı sıra ebeveynlere ait bilgilerin doğruluğu da önemli bir koşuldur. Çünkü, gelecek generasyonun ebeveynlerini, seçilecek bu hayvanların yavruları oluşturacaktır. Bu, hayvan ıslahında özellikle de seleksiyonda başarının anahtarıdır. Özellikle koyun ve keçi gibi çoğuz doğum yapan ve sürüler halinde bir arada yetiştirilen çiftlik hayvanlarında, ebeveynlere ait bilgilerde çeşitli nedenlerden kaynaklanan birçok hatalar yapılabilmekte ve soy kütüğüne yanlış bilgiler kaydedilebilmektedir. Bunun gibi şüpheli durumlarda ebeveyn kontrol yöntemlerine başvurularak doğru bilgiler ortaya çıkarılabilmektedir (Crawford vd., 1995, Koşum 1995). Koyunculukta seleksiyon programlarında seçilecek aday erkek damızlıklar, ebeveynlerinin performans bilgilerine göre seçilmektedir. Bir başka deyişle bu hayvanların genetik değerleri analarının ve kız kardeşlerinin performans bilgilerine göre hesaplanmaktadır. En iyi erkek hayvanların seçilmesi ve yapay tohumlama uygulamaları ile populasyonda beklenen genetik ilerlemeden daha hızlı bir artış sağlanabilmektedir. Birçok ıslah programında ekonomik olarak

17 3 önemli olan özellikler için tahmin edilen döl farklılığı (EPD) hesaplarında karışık (mixed) modeller kullanılmaktadır. Bu yöntemlere ek olarak genetik tahminlemenin isabetini artırmak için akrabalık matrisi veya pedigri bilgileri eklenmektedir. Ebeveyn tahmininde yapılan hatalar, EPD üzerine olduğu kadar populasyon genetiği parametrelerinin tahmininde de hatalara neden olmaktadır. Yapılan bu ebeveyn hatalarının %20 civarında olması, populasyondaki yıllık genetik ilerlemenin şiddetli bir biçimde düşmesine neden olmaktadır (Arruga vd., 2001, Baron vd., 2002, Weller vd., 2004, Rosa vd., 2003, Koşum 1995, Geldermann vd., 1986). Islah programlarında pedigri kayıtları büyük önem taşımaktadır. Ancak ıslah organizasyonlarına katılan işletmelerde her zaman elde aşım yapmak mümkün olmamaktadır. Bu durum, çeşitli sorunları da beraberinde getirmektedir. Serbest aşım uygulamalarında hatta kızgınlık senkronizasyonunun ve yapay tohumlamanın uygulanması durumunda bile yavrunun ebeveyn tayininde bir takım sıkıntılar ortaya çıkmakta ve yavrunun ebeveyn bilgileri pedigri kayıtlarına yanlış olarak işlenmektedir. Yapılan hatalar ıslah organizasyonlarının hedeflerine ulaşmasını güçleştirmektedir. DNA analizleri ile kimlik belirlenmesi temel olarak tıp alanında kimlik kontrolü yapmak üzere geliştirilmiş ve adli vakalarda (babalık davaları, hırsızlık, cinayet faillerini aydınlatmak vb.) kullanılmış ve zamanla hayvan yetiştiriciliği alanında da kullanılmaya başlanmıştır. DNA, stabil yapısı, kolayca elde edilebilir olması ve hayvanla ilgili en güvenilir bilgiyi sağlaması bakımından kimlik kontrolünde güvenle kullanılabilmektedir. Babalık testi, yavrunun biyolojik babasının kan grubu, hemoglobin ve transferin tiplemesi veya DNA analizleri gibi biyoteknolojik yöntemlerle belirlenmesi veya doğrulanmasıdır. Pedigrili yetiştiricilik yapılan işletmelerde soy kütüğüne çeşitli nedenlerden dolayı yanlış kaydedilmiş bilgilerin tam ve eksiksiz olarak doğrulanmasında babalık testlerinden faydalanılmaktadır. Ayrıca herhangi bir kayıt tutulmayan işletmelerde elde edilen yavruların biyolojik babaları DNA testleri aracılığı ile oldukça yüksek doğrulukla tespit edilebilmektedir. Hayvancılıkta yürütülen ıslah programlarında babalık testlerinin doğru biçimde kullanılması, damızlık değer tahminlerinin doğru ve güvenilir olarak yapılmasını sağlamaktadır (Baron vd., 2002, Ün vd., 2001 (a)).

18 4 Babalık testlerinin kullanımı ile sürüdeki serbest aşım sonrası pedigri kayıtlarındaki hataların önüne geçilebilmektedir. Ayrıca serbest aşım uygulamaları yetiştiriciler için iş gücünü ve üretim maliyetini azalttığı gibi bir koç kullanımına göre düşük gebelik oranı ve koçtan kaynaklanan bazı sorunları da ortadan kaldırmaktadır (Laughlin vd., 2003, Bredbacka ve Koskinen, 1999). Ülkemizde geleneksel yapısını en çok koruyan hayvancılık sektörü koyunculuk sektörüdür. Bunun en temel nedeni rekabet gücü olan damızlık materyali dış kaynaklardan sağlama şansının yok denecek düzeyde düşük olması ve kendi iç dinamiklerimizle de etkili ıslah programlarımızı hayata aktaramamamızdır. Koyunculukta etkili ıslah programlarının devreye sokulamaması ne yazık ki pedigrili hayvan yetiştirilmesini ve nitelikli damızlık materyal üretimini de olumsuz etkilemiştir. Bu bağlamda büyük oranda ekstansif koşullarda gerçekleştirilen ülkemiz koyunculuğu için oluşturulacak ıslah programlarında babalık testlerinin doğru biçimde kullanılması damızlık değeri tahminlerinin isabet derecesini artıracaktır. Buna ek olarak daha önce pedigri bilgileri bilinmeyen bir populasyona ait bilgiler temelden oluşturulabileceği gibi var olan pedigriler kontrol edilerek yanlış kaydedilen bilgiler düzeltilebilecektir. Bu çalışmada, Adnan Menderes Üniversitesi Grup Koyun Yetiştirme Programı (ADÜ-GKYP) kapsamında Karya koyun sürüsünde yer alan üstün verimli bireylerin damızlık olarak seçilebilmesi için gerekli olan pedigri bilgilerinin doğruluğunun test edilmesi ve bu genotipte babalık testlerinde kullanılabilecek uygun mikrosatellit belirteçlerin belirlenmesi amaçlanmıştır. Karya genotipinin 10 mikrosatellit lokusu bakımından araştırlması sonucunda elde edilecek bilgilerle, diğer koyun ırkları arasında karşılaştırma imkanı sağlamak ve mikrosatellit belirteçlerle yapılan çalışmalara katkı sağlamak ve bu çalışma yönteminin laboratuarda rutin uygulanabilirliğini sağlamak bu çalışmanın dğer amaçları arasında sayılabilir.

19 5 2. KAYNAK ÖZETLERİ 2.1 Hayvancılıkta Ebeveyn Testlerinin Önemi Hayvancılıkta ebeveyn testi veya bilinen adıyla babalık testi, serbest çiftleşmenin uygulandığı populasyonlarda, yabani populasyonlarda ve yanlış pedigri kayıtları tutulan işletmelerde evebeynleri bilinemeyen canlıların biyolojik babasını belirlemek amacıyla kullanılan bilimsel bir yöntemdir. Sonuca, yavrudaki genetik yapı ile baba adayının genetik yapısının karşılaştırılması ile ulaşılır. Ebeveyn hataları, negatif direk maternal genetik korelasyonun pozitif bir değer almasına neden olduğu gibi aynı zamanda direk maternal kalıtım derecesinin, genetik ilerlemenin ve tahmin edilen damızlık değerinin isabet derecesinin düşmesine neden olmaktadır. Bunun yanı sıra her yıl %10 düzeyinde yapılacak pedigri hatası genetik ilerlemede % 3-4 düzeyinde düşüşe neden olmaktadır. Yine benzer şekilde %11 düzeyinde yapılacak pedigri hatasının süt verimindeki genetik eğilimin %11-15 dolayında azalmasına neden olacağı bildirilmektedir (Lee ve Pollak 1997, Geldermann vd., 1986, Israel ve Weller 2000, Banos vd., 2001, Vandeputte vd., 2006, Senneke vd., 2004). Yapılabilecek bu hataların düzeltilmesi hayvan ıslahı açısından oldukça önemlidir. Babalık testleri için 1960 lı yıllardan sonra Mendel kalıtımı gösteren kan grubu ve protein sistemleri keşfedilmiş ve ebeveyn tayini çalışmalarında kullanılmıştır. Daha sonraları konuyla ilgili olarak Uluslararası Hayvan Genetiği Derneği (ISAG) tarafından standartlar geliştirilmiştir. DNA teknolojisi ve moleküler biyolojideki hızlı gelişmeye paralel olarak daha ekonomik, kolay ve polimorfik olmalarından dolayı özellikle polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) temelli DNA marker sistemleri tercih edilmeye başlanmıştır. Özellikle son yıllarda seleksiyonda isabet derecesini artırmak amacıyla seçilecek bireylerin pedigri bilgilerinin doğruluğunu sınamak amacıyla babalık testlerinden oldukça yüksek düzeyde yararlanılmaktadır (Özşensoy vd., 2008, Maclean vd., 2010). İşletmelerde gerçekleşen ve bu nedenle de ebeveyn kontrol yöntemlerine başvurulan hatalar şu şekilde özetlenebilir;

20 6 a. Hızlı gelişen erkek hayvanların sürüden uygun zamanda ayrılmamasına bağlı olarak babaların belirlenemediği ve istenmeyen çiftleşmelerin meydana gelmesi durumunda, b. Yapay tohumlama uygulamalarında kullanılan spermaların hatalı etiketlenmesi durumunda, c. Aynı hayvana aynı dönemde birden çok tohumlama yapılmasında d. Çiftleşme döneminde birden çok erkek damızlık hayvanın kullanımında, e. Sürülerin meralarda ortak otlatılması ile dişi hayvanlar farklı sürülerdeki erkek hayvanlarla çiftleşebilmekte ve doğan yavruların babaları tespit edilememektedir. 2.2 Hayvancılıkta Ebeveyn Testlerinde Kullanılan Yöntemler Babalığın belirlenmesinde kullanılan testler, fenotipe dayalı yöntemler ve moleküler genetik yöntemler olarak ikiye ayrılmaktadır. Fenotipe dayalı yöntemler arasında; kan grubu sistemleri, serum proteinleri, enzim allotipleri ve lökosit antijenler sayılabilir. Moleküler genetik yöntemler arasında ise Mikrosatellit (STR, Short Tandem Repeat), RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism), AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism), SNP (Single Nucleotide Polymorhism) tekniği gibi DNA düzeyindeki polimorfizmi ortaya koyan teknikler kullanılmaktadır Ebeveyn Testlerinde Kullanılan Fenotipe Dayalı Yöntemler Çiftlik hayvanlarında ırklar arası ve ırklar içi farklılıkların belirlenmesinde ilk kullanılan moleküler işaretleme tekniği proteinlerin elektroforetik analizi çalışmalarıdır lı yılların ortalarından 2000 li yıllara kadar birçok çalışmada çiftlik hayvanlarının genetik yapılarının incelenmesinde protein polimorfizmi kullanılmış ve halen kullanılabilmektedir (Özkan, 2005). Çiftlik hayvanlarının ebeveyn kontrolleri, son yıllara kadar uluslararası standardizasyonu yapılmış olan kan grupları yöntemi ile genel olarak belirlenmekteydi. Kan grupları ile herhangi bir şüpheli ebeveynlik durumunun doğruluğu ispatlanamaz, ancak yanlış tespit edilmiş ebeveynlik durumları meydana çıkarılabilir.

21 7 Bununla beraber, sadece yavru ile ebeveynlerin kan tipleri uygunsa ebeveynliğin büyük bir olasılıkla doğru tespit edilmiş olduğu söylenebilir. Böyle bir olasılığa rağmen, kan grupları ile ebeveyn testi şüphelilerin tespit edilmesi şeklinde değil uygun olmayanların dışlanması esasına dayanmaktadır (Cerit, 2003, Margan, 1996, Larsen, 1971). Evcil hayvanlardaki biyokimyasal polimorfizm; kan plazması/serumu, eritrositler, lökositler ve sütte bulunan proteinlerdeki varyasyondan kaynaklanmaktadır. Söz konusu bu varyasyonlar elektroforetik olarak ya da serolojik olarak saptanabilirler (Elmacı, 2001, Cunningham ve Meghen 2001). Kan sıvısı, içermiş olduğu çok değişik hücre tipleri, serumdaki enzimler ve proteinler ile kan gruplarının biyokimyasal ve genetik polimorfizmlerin araştırılmasında çok değerli vazgeçilmez bir araştırma materyalidir. Bu özelliklerinden dolayı ebeveyn tayinlerinde; kan grupları, kan potasyum tipleri, hemoglobin, transferin, koruloplazmin, karbonanhidraz, indirgenmiş glutation, albumin, prealbumin, diaforez, lisin ve arnithin, alkalik fosfotaz ve X proteini gibi kan parametreleri üzerinde durulmaktadır (Koşum, 1995). Kan grubu ve protein işaretleyicilerinin belli kromozomlar üzerinde yoğunlaşması, polimorfizm değerlerinin nisbeten düşük olması, spesifik olarak kan örneklerine gereksinim duyulması, iş yükünün ağır olması ve analizlerin uzun zaman alması gibi dezavantajları bulunmaktadır. Kan grupları ve alt gruplarıyla başlayan çalışmalar, 70 li yıllarda kandaki enzim ve proteinlerin polimorfik şekillerinin incelenmesiyle gelişmiş olmakla birlikte, bu yöntemlerdeki hata payı %15-20 civarındadır (Özşensoy vd., 2008) Ebeveyn Testlerinde Kullanılan Moleküler Genetik Yöntemler Geçmişte yetiştirme ve ıslah programlarında ekonomik önemi olan karakterler, fenotipik olarak yapılan ölçümler ile seleksiyona tabi tutulmaktaydı. Moleküler genetik alanında 1980 li yıllarda gerçekleştirilen ilerlemeler, polimorfik özelliklerin doğrudan DNA düzeyinde incelenmesine olanak tanımıştır. Bunun sonucunda günümüzde DNA düzeyindeki genetik yapıya yönelik elde edilen bilgiler seleksiyon programlarına entegre edilebilmektedir.

22 8 Populasyonlardaki genetik varyasyonların tanımlanması için DNA düzeyinde analizlerin kullanılması fenotipik yöntemlere göre daha fazla aydınlatıcı bilgi içermektedir. Çünkü DNA dizilimleri (sekansları) insersiyon/delesyon, gen değişimi, düzensiz parça değişimi, gen transferleri vb gibi sebeplerle polimorfizm hakkında daha detaylı bilgi verebilmektedir (Nei ve Kumar, 2000). DNA parmak izi gibi moleküler genetik teknikler hayvanlarda yapılacak genetik analizlerde oldukça önemli araçlardır. Bu teknikler aynı zamanda ebeveyn testlerinde kullanılabilmesi nedeniyle genetik ilerlemeye de oldukça önemli katkı yapmaktadırlar. Günümüzde babalık testlerinde, güvenirliliği nispeten düşük olan kan grupları, protein ve enzim polimorfizmleri, insan lökosit antijeni (HLA) gibi yöntemlerin yerini DNA temelli genetik analiz yöntemleri almıştır (Anunciaçao ve Filho 2000, Ma vd., 2006). DNA işaretleyicileri (markerlar) farklı genotiplere ait DNA nın nükleik asit diziliş farklılıklarını değişik şekillerde ortaya koyabilmektedir. Son yıllarda geliştirilen ve birçok avantaja sahip olan çeşitli işaretleyiciler mevcuttur. Ebeveyn testlerinde en yaygın olarak kullanılan DNA temelli genetik analiz yöntemleri; RFLP, SNP, AFLP ve STR yöntemleri olarak sıralanabilir (Maclean vd., 2010, Usha vd., 1995, Heyen vd., 1997). RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism) Yöntemi RFLP yöntemi, 1968 de Meselson ve Yuan isimli araştırıcılar tarafından E.coli bakterisinden ilk restriksiyon endonükleazı izole etmesini takiben geliştirilmiştir. İlk başarılı genetik haritalama çalışmalarında RFLP işaretleyicileri kullanılmıştır (Babolola, 2003, Montaldo ve Meza-Herrera, 1998). DNA da oluşan mutasyonları veya polimorfizmi ortaya koyan ve restriksiyon enzimi ile kesim sonucu oluşan değişik boydaki DNA parçalarını belirlemeye yönelik bir yöntemdir (Simm, 1998).

23 9 RFLP yöntemi DNA da oluşan mutasyonların veya polimorfizmin belirlenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntem; canlılar arasındaki DNA farklılıklarının belirlenmesinde, populasyonların analizinde, nükleik asit hibridizasyon yönteminde tanımlama ve teşhiste, gen haritalarının çıkarılmasında ve baz dizilerinin belirlenmesinde, rekombinant DNA teknolojisinde ve babalık testinde kullanılmaktadır (Solak vd., 2000, Turner vd., 2004; Schlötterer, 2004; Vignal vd., 2002). RFLP yönteminin mikrosatellitlere göre daha düşük düzeyde bir babalık indeksi (PI) değeri verdiği ve balık testinin temelinin oluşturan dışlama olasılığı değerinin daha düşük olduğu bildirilmiştir (Raimondi vd. 2003). SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Yöntemi Tek nükleotid polimorfizmi (SNP) yaygın olarak bireyler arasında DNA daki tek nükleotid değişiklikleri olarak adlandırılır. Genetik koddaki tek bir nükleotid değişimine bağlı olması nedeniyle DNA daki SNP varyasyonunun formu mikrosatellitlere göre daha basittir. Mikrosatellitler ve SNP ler ebeveyn testleri için etkili yöntemler arasında sayılmaktadır. SNP yönteminin kullanıldığı çalışmalarda tek bir örnekte hem ebeveyn testinin hem de verim 0özelliklerinin test edilebilir olması, bu yöntemin mikrosatellitlere göre daha fazla bilgi sağladığının bir göstergesidir. Bunun yanı sıra VNTR (Variable Number of Tandem Repeat), mikrosatellit ve SNP yöntemlerinin karşılaştırılmalı olarak kullanıldığı insanlarda yapılan bir babalık testi çalışmasında SNP yönteminin diğerlerine göre daha ucuz olduğu bildirilmektedir (Maclean vd., 2010, Borsting vd., 2006). Son yıllarda sığırların tanımlanmasında SNP tabanlı DNA profilleme sistemleri geliştirilmiş ve Kuzey İrlanda sığır populasyonunda tanımlama ve babalık testleri için 2 adet SNP paneli devreye sokulmuştur. Geliştirilen bu panelin kullanımı Avrupa sığır ırkları için önemli bir başlangıç noktası olmuştur. Ancak Avrupa dışındaki ülkelerde yetiştiriciliği yapılan farklı ırklar için bu panelde bazı optimizasyonların yapılması gerekli olduğu bildirilmektedir (Allen vd., 2010).

24 10 SNP lerin mikrosatellitler üzerine belirgin bir takım avantajlarından söz etmek mümkündür. Daha düşük gametik mutasyona sahip olmaları, elde edilen verilerin yorumlanmasının kolay olması, otomasyona uyum sağlaması, isabet derecesinin yüksek olması ve bozulmuş DNA örnekleri için önemli bir sorun olan çoğaltılmış kısa gen ürünlerinin (150 bp den küçük) başarılı olarak taranmasına olanak sağlaması SNP lerin avantajları arasında sayılabilir (Costa vd., 2008). Ancak ebeveyn testlerinde tek baz değişikliği içeren lokuslarda gözlenen toplam allel sayısı az olduğundan bireyleri ayrım güçleri sınırlıdır. Ayrıca birden çok SNP lokusunun kullanımının da genotipleme problemini beraberinde getirmesi bu yöntemin dezavantajı olarak kabul edilmektedir (Allen vd., 2010, Vignal vd., 2002, Maclean vd., 2010). AFLP (Amplified Fragment Lenght Polymorphism)Yöntemi İlk olarak 1995 yılında Vos ve arkadaşları (1995) tarafından geliştirilen bu yöntem SRAF (Selective Restriction Fragment Amplification) olarak da bilinmektedir. Genomik DNA nın restriksiyon enzimi ile kesimi sonucu oluşan DNA parçalarının bir grubunun selektif çoğaltılması esasına dayanan bir genotipleme metodudur (Vos vd., 1995, Solak vd., 2000, Turner vd., 2004). AFLP yöntemini iki varyasyonu bulunmaktadır. Birinci varyasyonda iki farklı restriksiyon enzimi ve amplifikasyon için iki farklı primer kulanılmakta, ikincisinde ise tek primer ve restriksiyon enzimi kullanılmaktadır (Babalola, 2003). Son on yıllık süreçte hayvanların tanımlanması ve babalık testleri için AFLP işaretleyicileri başarıyla uygulanmaktadır (Heaton vd., 2002). Bu yöntem hayvancılıkta ebeveyn testlerinin dışında, DNA parmak izi teknolojisinde, yüksek düzeyde polimorfik olan mikrosatelitlerin bulunmasında ve genotipleme çalışmalarında kullanılmaktadır (Vos vd., 1995, Vignal vd., 2002; Blears vd., 1998). Mikrosatellit (STR) Yöntemi Mikrosatellitler, 1-6 baz çifti (bp) uzunluğunda tekrarlanan DNA bölgeleri olup birçok ökaryotik genomunda nispeten homojen aralıklarla bulunmaktadır. Bu ardışık tekrar sayıları varyasyon göstermekte (genellikle 6-30 bp arasında) ve

25 11 mikrosatelitler DNA nın tüm genoma yayılmış durumda bulunmaktadırlar (Ashley ve Dow, 1994, Forbes vd., 1995, Ellegren vd., 1997, Schlötterer, 1998, Hancock, 2001, Toth vd., 2000, Beuzen vd., 2000; Montaldo ve Meza-Herrera, 1998, Schmidt vd., 1999). Yapılan çalışmalarda mikrosatelitlerin genellikle dinükleotit tekrarları şeklinde olduğu bildirilmiştir. Memeli genomunda dinükleotit tekrarlarının ana formu (n:mikrosatellit ünitesi tekrar sayısı) şeklindedir (Şekil 2.1). Mikrosatelit tekrarları oldukça nadir olsa da mono, tri ve tetramerik tekrarlar şeklinde varyasyon göstermektedir. Mikrosatellitler temel olarak tüm populasyon içerisinde benzer olmasına rağmen bireyden bireye 2-6 nükleotidlik çok küçük farklılıklar göstermektedir ve genom içerisinde rastgele dağılmış olarak bulunurlar (Ün vd., 2001 (b), Jeffreys vd., 1987, Powell, 1997, Georges vd., 1988, Hancock, 2001; Togan vd., 2005, Sancristobal vd., 2003; Bruford vd, 1996, Cunningham ve Meghen 2001). Şekil 2.1 Mikrosatellitlerin tipik formu ve mikrosatellitin etrafındaki benzersiz dizi Bir türün populasyonları gibi evrimsel olarak birbirine yakın olan canlı gruplarının karşılaştırılmasında mikrosatellitler kullanılmaktadır. Ayrıca ırklara ait populasyonlarda yakın zamanda meydana gelmiş bir olayın izlerinin aranacağı durumda en çok kullanılan genetik işaretlerden biri mikrosatellitlerdir

26 12 Mikrosatellit (STR) lokuslarının büyük çoğunluğu standart PCR yöntemi ile çoğaltılabilir. Mikrosatelitlerin kullanımı; tüm genoma yayılmış olmaları, genomda çok sayıda bulunmaları, DNA nın kodlanmayan intron bölgelerini temsil etmeleri, çok sayıda ve kodominant kalıtıma sahip olmaları nedeni ile çiftlik hayvanlarında ırk içi ve ırklar arası genetik çeşitliliği saptama çalışmalarında, mutasyonların detaylı olarak analizinde, hatta bir türe ait evcilleştirmenin nerelerde başlamış olabileceğini belirlemek açısından önemlidir (Togan vd., 2005, Sancristobal vd., 2003, Bruford vd., 1996, Beuzen vd., 2000, Montaldo ve Meza- Herrera, 1998, Schlötterer, 2004). 2.3 Mikrosatellitlere (STR) Dayalı Ebeveyn Testleri Bir lokusta bulunan allel çiftinin her biri, mikrosatellit tekrar sayısının farklılığıyla birbirinden ayrılırlar. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) metoduyla her bir lokustaki alleller çoğaltılabilmektedir. Bu alleller farklı otomasyon sistemleri kullanılarak veya klasik jel elektroforez metodu ile belirlenebilmektedir. Bu yöntemler ile türlerin ve populasyonların allel frekansları ve nükleotid farklılıkları tespit edilebilmektedir. Ancak mikrosatellitlerle yapılacak ebeveyn testlerinde, bireylerin sahip oldukları alleller arasındaki küçük farklılıklar önem taşıdığından allel uzunluklarının belirlenmesinde genetik analizörler gibi otomasyon sistemlerinin kullanılması çalışmanın hassasiyetini artırmaktadır (Şekil 2.2.). Şekil 2.2 Otomasyon sistemi ile tespit edilen yavru ve ebeveynlere ait pikler

27 13 Babalık testlerinde ve pedigri kayıtlarının kontrolünde mikrosatellit işaretleyicilerin etkinliği yüksek düzeyde bilgi içerip içermedikleri ile yakından ilgilidir. Mikrosatellit işaretleyicilerin yüksek bilgi içeriği işaretleyicinin verdiği allel sayısı ve bunun ilgili populasyonlardaki frekanslarına bağlıdır (Taylor, 1997) Küçükbaş Hayvanlarda Mikrosatellitler İle Yapılan Ebeveyn Testleri Ekstansif yetiştiricilik yapılan, yapay tohumlama veya kontrollü çiftleşme uygulanmayan küçükbaş hayvan işletmelerinde doğru ve güvenilir pedigri kayıtlarının tutulması oldukça güçtür. Ebeveyn bilgilerinin doğruluğu yürütülen ıslah programlarının temel taşlarındandır. Yapılan çalışmalar, işletmelerde pedigri hatalarının %20 civarında olduğunu göstermektedir. Bu durum ıslah planlamaları için çok önemli olan genetik parametrelerin yanlış tahminlenmesine neden olmaktadır. Bu nedenle pedigri kayıtlarının kontrolü amacıyla, güvenilirlik düzeyi oldukça yüksek olan DNA temelli marker sistemleri ile küçükbaş hayvanlarda ebeveyn testleri uygulanmaktadır. Ülkemizde yetiştirilen Kıvırcık koyunlarda OarHH41, OarHH64, OarFCB19, OarFCB129, OarFCB128, OarFCB266, OarFCB20, OarFCB48, OarHH51 ve OarVH110 isimli mikrosatellit lokusları ile yapılan çalışmada beklenen heterozigotluk (He) değerleri sırasıyla; 0,857, 0, 837, 0,818, 0,792, 0,751, 0,691, 0,770, 0,808, 0,719 ve 0,649; ayrımlama gücü (P D ) değerleri sırasıyla 0,968, 0,960, 0,951, 0,926, 0,917, 0,861, 0,927, 0,943, 0,878 ve 0,820 olarak bildirilmiştir. Çalışmada elde edilen dışlama olasılığı (P E ) değerleri sırasıyla; 0,71, 0,65, 063, 0,56, 0,53, 0,40, 0,57, 059, 0,44 ve 0,36 ve elde edilen babalık indeksi (PI) değerleri ise 3,488, 3,063, 2,746, 2,408, 2,011, 1,619, 2,333, 2,406, 1,707 ve 1,429 olarak bulunmuştur (Cerit vd., 2003). Aragonesa koyunlarında dört farklı mikrosatellit lokusu (MAF50, MAF18, OarFCB20, McM527) ile yapılan babalık testini konu alan bir çalışmada P E değerinin 0,9288 olduğu bildirilmiştir. Çalışmada babalık testinde protein lokuslarının kullanımı ile bu oranının 0,60 ile 0,70 arasında olduğu, protein lokusları ve mikrosatellitlerin kombinasyonu ile yapılan babalık testlerinde ise bu değerin 0,9720 olduğu bildirilmiştir (Arruga vd., 2001).

28 14 Quanbari vd. (2007) tarafından İran ın yerli koyunu olan Afshari koyunlarında OarHH55, OarAE101, BM143, BMS2508, LSCV43, CSSM18, OY3, MCMA26, DYMS1, OarFCB304, OarAE64, OarCP26, MCMA2, MAF64, OarJMP58, OarJMP29, MAF65 ve BM8125 isimli 18 mikrosatellit işaretleyicisi kullanılarak genetik varyasyon ve babalık testi yapılmıştır. Çalışmada ortalama gözlenen heterozigotluk (Ho) değeri 0,72, ortalama polimorfik bilgi içeriği (PIC) değeri 0,67 ve kombine edilmiş dışlama olasılığı (CP E ) değeri 1,75E-4 (0,9998) olarak bulunmuştur. Rambouillet koyunlarında 3 mikrosatellit lokusu (HUJ614, OarHH35, OarFCB304) ile yapılan çalışmada, PIC değeri %92 olarak bulunmuştur. Çalışmada her iki ebeveyne ait lokus bilgilerinin bilinmesi ile daha yüksek güvenilirlikte babalık testi yapılabileceği bildirilmektedir (Laughlin vd., 2003). Barbados Blackbelly koyunlarında yapılan bir çalışmada, 11 mikrosatellit lokusu (MAF65, McM527, MAF214, HSC, OarFCB20, ILSTS05, ILSTS0056, SR- CRSP-5, TGLA53, OarJMP29, MAF035) kullanılarak bireylerin dışlanma ve kabul edilme durumları araştırılmıştır. Çalışmada, 11 mikrosatellit lokusundan 93 allel taranmış ve her lokusun ortalama 8,45 allele sahip olduğu bildirilmiştir. Bu 11 mikrosatellit lokusunun heterozigotluk oranının %35 den yüksek olduğu CP E değerinin ise 0.99 olduğu bildirilmiştir (Robert ve Thomas 2003). Çin de yetiştirilen Merinos koyunlarda yapılan çalışmada 9 mikrosatellit lokusu (BM6506, BM1824, BM6438, ILSTS004, OarDB6, BM4621, OarHH55, BM143, OarJMP8) kullanılmıştır. Bu 9 mikrosatellit lokusu içinde en yüksek PIC, heterozigotluk oranı ve P E değerini BM4621 isimli mikrosatellit lokusu vermiştir ve bu lokusun dışındaki 8 mikrosatellit lokusunun Hardy-Weinberg eşitliğine uygunluk gösterdiği tespit edilmiştir. 9 mikrosatellit lokusunda CP E değeri 0,99915 olarak belirlenmiştir. Çin Merinos koyunlarında yapılacak bağlantı (linkage) analizlerinde, babalık testlerinde ve bireysel tanımlamada bu 9 mikrosatellitin kullanılabileceği sonucuna varılmıştır (Zhao vd., 2006). Sütçü keçilerde 9 mikrosatellit lokusu (SR-CRSP-1, SR-CRSP-5, SR-CRSP-8, SR-CRSP-9, INRA011c, ChirUCO2, ChirUCO4, ChirUCO5, ETH10) kullanılarak yapılan babalık testi çalışmasında CP E değeri 0,9991 olarak elde edilmiştir. Çalışmada, 388 doğrulamadan %71,9 unun başarılı bir şekilde gerçekleştiği %16,2 sini ise açık bir şekilde ortaya konulamadığı bildirilmiştir. Uyumsuz olanların büyük çoğunluğunda ( %80) 4 markerdan sonuç elde edilmiştir. Bu nedenle babalık testini konu alan çalışmalarda en az 5 mikrosatellit lokusu ile çalışılması gerektiği vurgulanmştır (Jimenez-Gamero vd., 2006).

29 15 Avustralya da yetiştirilen Angora ve Kaşmir keçi ırklarında 14 mikrosatellit lokusu ile ebeveyn testinin yapıldığı bir çalışmada yüksek düzeyde P E değeri (0,997) elde edilmiştir. Bu iki ırkta 14 mikrosatellit lokusundan elde edilen CP E değerinin sırasıyla 0,9973 ve 0,99997 olduğu bildirilmiştir. Çalışmada ana ve babaya ait genetik verilerin olması durumunda daha güvenilir bir ebeveyn testi yapılabileceği bildirilmektedir (Bolormaa vd., 2008). Sığırlarda kullanılan 12 mikrosatellit lokusu ile Sirohi, Jamnapari ve Barba keçilerinde ebeveyn testini konu alan bir çalışmada 12 li, 8 li, 6 lı, 5 li ve 4 lü olarak 5 farklı multipleks mikrosatellit grubu oluşturulmuştur. Bu üç farklı ırkta elde edilen bir ebeveyn ve yavrunun genotipinin bilindiği durumdaki CP E değerlerinin sırasıyla 0,999, 0,998, 0,990, 0,982 ve 0,945 olduğu bildirilmiştir. Çalışmada 12 li ve 8 li mikrosatellit lokusu ile oluşturulan multipleks gruplarından elde edilen P E değerlerinin diğerlerine göre yüksek olduğu belirtilmiştir. Ayrıca akrabalık ilişkileri yüksek ve nesli tükenmekte olan populasyonlarda meydana gelen düşük çeşitlilik nedeniyle ebeveyn testlerinde fazla sayıda mikrosatellit işaretleyicilerin kullanılmasının faydalı olacağı bildirilmiştir (Ganai ve Yadav, 2005). Mongolya yerli Kaşmir, Ankara keçisi, Saanen keçisi ve Murciana-Grenadina ırkı keçilerde 22 mikrosatellit lokusu ile 3 multipleks grup oluşturulmuş ve oluşturulan bu multipleks gruplar ebeveyn testinde kullanılmıştır. Çalışmada, P E değerleri Kaşmir ırkında 0,999999, Ankara keçisi ve Murciana Grenadina keçilerinde 0,99999, Saanen keçilerinde ise 0,9999 olarak bulunmuştur. İki özdeş genotipin tanımlanmasında önemli olan bireysel tanımlama gücü 22 lokus için 4 ırkta da 1x10 15 olarak tespit edilmiştir (Luikart vd., 1999). Moxoto, Saanen ve Alpin ırkı keçilerde ebeveyn testi için 11 mikrosatellit işaretleyici (BETACAP, INRA005, ILSTS087, INRA006, INRA063, INRABERN172, ILSTS005, ILSTS011, SRCRSP05, OARFCB48, BM3205) kullanılmıştır. Çalışmada, anaya ait genotip bilgilerinin bilinmesi durumunda PIC ve P E değerleri sırasıyla 0,676 ve 0,999 olarak bulunmuştur. Sadece bir ebeveynin bilinmemesi durumunda ise bu değerler 0,542 ve 0,988 olarak elde edilmiştir. Babalık testi çalışmalarında, anaya ait genotip bilgilerinin bilinmesi ile isabet derecesinin artacağı bildirilmektedir (Araujo vd., 2010).

30 Büyükbaş Hayvanlarda Mikrosatellitler İle Yapılan Ebeveyn Testleri Sığırcılıkta geniş ölçüde yapay tohumlama uygulanmaktadır. Bu nedenle ıslah programlarında istenen genetik ilerlemenin gerçekleşmesi için pedigri kayıtlarının kontrolünde babalık testlerinden yararlanılmaktadır (Stevanovic vd., 2010). Weller vd., (2004) tarafından 6040 baş Siyah Alaca ineğinde 104 mikrosatellit işaretleyici kullanılmış ve yanlış pedigri bilgilerine neden olan faktörler tespit edilmiştir. Çalışmada, sperma üretimi ve paketlenmesi sırasında yapılan etiketleme hataları, önceden tohumlanarak gebe kalan hayvanların tekrar tohumlanması ve bu tohumlama boğasının gerçek babaymış gibi kayıt edilmesi ve önceden doğal çiftleşme yoluyla gebe kalanların yapay tohumlamadan gebe kaldığının sanılması gibi durumların yanlış pedigri bilgilerine neden olduğu bildirilmektedir. Pedigri hatalarının %11,7 civarında olduğu ve tohumlama teknisyenlerinin ve sperma üretim enstitülerinin kalite kontrol uygulmalarından geçirilmesi ile yapılan hataların %8 dolayında azalacağı ve genetik ilerlemenin bu yöntemle en azından %1 civarında artacağı sonucuna varılmıştır. Siyah Alaca ineklerinde 7 farklı mikrosatellit lokusu ile yapılan araştırmada allel sayıları fazla olan mikrosatellit lokuslarının ideal babalık yüzdesi olarak kabul edilen %99,73 değerine ulaştığı, allel sayısı az olanların ise bu yüzdenin altında kaldığı bildirilmiştir. Çalışmada, allel sayısı az olan mikrosatellit lokuslarının düşük ebeveyn dışlama ve belirleme olasılığına sahip olduğu bildirilmektedir (Cerit, 2003). Ülkemizde Siyah Alaca ineklerde 12 mikrosatellit lokusu kullanılarak yapılan babalık testini konu alan çalışmada, ISAG tarafından da önerilen BM1824, INRA23, BM2113, SPS115, ETH10, TGLA122, ETH225, TGLA126 ve TGLA227 isimli 9 mikrosatellit lokusunun ülkemizdeki Siyah Alaca ineklerde yapılacak babalık testleri için en uygun markerlar olduğu bildirilmiştir. Aynı çalışmada, teste tabi tutulan 64 yavrudan 21 başının babalık yüzdesi değerinin %99,73 e eşit veya yüksek olduğu bildirilmiştir. Ancak babalık testi için kullanılan aday boğaların ideal babalık yüzdesini yakalayamadığı ve bu durumun tohumlama kayıtlarındaki hatalardan kaynaklanmış olabileceği bildirilmiştir (Özkan vd., 2009).

31 17 28 SNP ve 23 mikrosatellit lokusu ile sığırlarda yapılan bir çalışmada mikrosatellit paneli için allel sayısının 9, ortalama PIC değerinin 0,626, P E ise 0,999 olduğu bildirilmiştir. Çalışmada kullanılan 1 mikrosatellit lokusu dışında diğer lokusların Hardy-Weinberg eşitliğine uygunluk gösterdiği bildirilmiştir. SNP paneli için elde edilen PIC değeri 0,35 ve sadece baba ve yavruların bilindiği durumda P E değerinin 0,956 olduğu bildirilmiştir (Van Eenennaam vd., 2007). Siyah Alacalarda yapılan bir çalışmada, 30 mikrosatellit lokusu denenmiş ve bunlardan dışlama gücü yüksek olan 9 lokus babalık testi için kullanılmıştır. Çalışmada iki ebeveyni bilinen örnekler için P E değerinin %99,88, tek ebeveyni bilinen örnekler için ise bu değerin %90,30 olduğu bildirilmiştir. Aynı çalışmada babalık testi için mikrosatellit lokuslarının seçiminde; PIC değerlerinin, heterozigotluk oranlarının, PCR koşullarının ve P E değerinin önemli olduğu vurgulanmıştır (Tian vd., 2008). Çek Siyah Alaca populasyonunda 10 mikrosatellit şaretleyici kullanılarak yapılan çalışmada ortalama He değerinin 0,746 olduğu ve ile arasında değiştiği; ortalama PIC değerinin 0,713 olduğu ve ile arasında değiştiği bildirilmiştir (Rehout vd., 2006). Charolais, Limousin ve Preta sığır ırkından rastgele seçilen 475 baş hayvanda 10 mikrosatellit işaretleyici kullanılarak babalık testi yapılmıştır. Çalışmada, P E değerinin Charolais, Limousin ve Preta ırkı sığırlarda sırasıyla; 0,9997, 0,9999 ve 0,9995 olduğu; He değerinin ise sırasıyla; ,774, 0,728 olduğu bildirilmiştir (Carolino vd., 2009). Gir sığır ırkından 74 yavru ve 9 baba adayı boğada 6 mikrosatellit işaretleyici ile yapılan çalışmada CP E değerinin 0,842 ve 0,989 arasında değerler aldığı ve bu değerlerin ideal P E değeri olarak kabul edilen 0,99 değerinden düşük olduğu bildirilmiştir. Çalışmada, ayrıca tanımsız birey oranın %36 olduğu bildirilmiştir (Baron vd., 2002).

32 18 Bredbacka ve Koskinen, (1999) tarafından Fin Ayrshire ve Siyah Alaca ırkı sığırlarda 11 mikrosatellit işaretleyici (BM1824, BM2113, SPS115, TGLA122, TGLA126, TGLA227, ETH3, ETH10, ETH225, INRA23, TGLA53) ile yaptıkları çalışmada BM1824, BM2113, SPS115, TGLA122, TGLA126, TGLA227, ETH3, ETH10 ve ETH225 isimli 9 mikrosatellit işaretleyici için kümülatif P E değerlerinin Ayrshire ve Siyah Alaca ırkı sığırlarda sırasıyla; %99,84 ve %99,91 olduğu ve bu 9 işaretleyicinin rutin babalık testlerinde kullanılabileceği bildirilmiştir. 11 mikrosatellit işaretleyici için kümülatif P E değerinin ise Ayrshire ve Siyah Alacalarda sırasıyla; %99,94 ve %99,98 olduğu bildirilmiştir. Simmental sığırlarında 11 STR lokusu (TGLA227, BM2113, TGLA53, ETH10, SPS115, TGLA126, TGLA122, INRA023, ETH3, ETH225, BM1824) ile yapılan bir çalışmada; ortalama PIC değerinin 0,72, kümülatif P E değerinin 0,996, kümülatif ayrım gücünün (PD) ise 0,999 olduğu bildirilmiştir. Çalışmada, kullanılan TGLA53, TGLA227, INRA023, BM2113 ve TGLA122 isimli mikrosatellit işaretleyicilerinin diğerlerine göre daha yüksek sayıda allel verdiği ve yüksek PIC değerine sahip olduğu belirtilmiştir. Çalışmada, INRA023, TGLA53, TGLA227 ve BM2113 isimli 11 mikrosatellit işaretleyici için sık gözlenen allellerin frekansının 0,5 in altında olduğu ve bu nedenle çalışmada üzerinde durulan lokuslar arasında en fazla bilgiyi bu 4 mikrosatellit lokusunun sağladığı belirtilmiştir. Bu 4 lokusta aynı zamanda He ve P D değerinin yüksek olduğu belirtilmektedir (Stevanovic vd., 2010). Heyen vd. (1997) tarafından Siyah Alaca, Kırmızı Angus, Simmental, Güney Dewon, Gelbivieh ve Salers ırkı sığırlarda 6 Multipleks grup oluşturularak 22 mikrosatellit işaretleyicinin babalık testinde kullanımı test edilmiştir. Çalışmada, gerçek ebeveyn bilgilerinin olmadığı sadece aday ebeveyn ve yavru genotiplerinin bilindiği durumda P E değeri 0,01 ve 0,63 arasında değişmiştir. Çalışmada; gerçek ebeveyn, aday ebeveyn ve yavrunun genotiplerinin bilinmesi durumunda ise P E değeri 0,06-0,77 arasında bulunmuştur. Ayrıca çalışmada mikrosatellit işaretleyiciler ile multipleks grupların oluşturulmasının gen haritalama, babalık testleri ve genom taramada oldukça faydalı olacağı ve yapılacak analizleri kolaylaştıracağı ortaya konmuştur.

33 19 Brezilya nın yerli bir ırkı olan Gir ırkı sığırlarda 9 mikrosatellit işaretleyici (ETH10, SPS115, TGLA126, ETH3, POTCHA, BM1824, ETH225, BMS2533, TGLA122) ile yapılan çalışmada BMS2533 ve TGLA122 mikrosatellit işaretleyicilerinden elde edilen gen çeşitliliği, PIC ve P E değerlerinin diğerlerine göre yüksek olduğu ve çalışmada kullanılan diğer işaretleyicilere göre yüksek düzeyde bilgi sağladığı bildirilmiştir. Bu durum bu mikrosatellit işaretleyicilerin Gir sığırlarında yapılacak babalık testlerinde kullanımının daha uygun olduğunu göstermektedir. Çalışmada yapılan babalık testinde, P E değerinin 0,8691 ile 0,9999 arasında değiştiği ve bu değerin ortalamasının 0,9512 olduğu bildirilmiştir (Curi ve Lopes 2002). Yaklarda 12 mikrosatellit işaretleyicinin kullanıldığı çalışmada birden çok mikrosatellit işaretleyicinin kullanılması ile yapılacak babalık testlerinin güvenilirliğinin yüksek olacağı bildirilmiştir. Aynı çalışmada yüksek düzeyde polimorfik olan mikrosatellit işaretleyicilerin kullanımının Yaklarda yürütülen ıslah programlarına büyük yarar sağlayacağı bildirilmiştir (Minqiang vd.,2004). Radko ve Rychlick (2009) tarafından Polonya kırmızısı ve beyazı sığırlarda 12 kan grubu ve 11 mikrosatellit işaretleyici kullanarak yaptıkları babalık testinde kan grupları ve mikrosatellit işaretleyici için He değerinin sırasıyla; 0,416 ve 0,736; PIC değerinin sırasıyla; 0,375 ve 0,701 ve P E değerinin ise sırasıyla 0,995 ve 0,999 olduğu bildirilmiştir. Kan gruplarından elde edilen PIC, He ve P E değerleri mikrosatellit işaretleyicilerden elde edilenlerden düşük çıkmıştır. Schnabel vd. (2000) tarafından 903 bizon ve 5 farklı ırka ait 107 sığırda 12 mikrosatellit işaretleyici kullanılarak babalık testi yapılmıştır. Çalışmada bizonlarda her lokus için ortalama allel sayısı 16, sığırlarda ise 13 bulunmuştur. PIC, He ve P E değerleri bizonlarda sığırlara göre daha düşük bulunmuştur. Çalışmada, bir ebeveyni bilinen bizon ve sığırlarda P E değeri sırasıyla; 0,9955 ve 0,9995 olarak elde edilmiştir. Kullanılan 12 mikrosatellit işaretleyicinin babalık testi ve bireysel tanımlamada yüksek bir güce sahip olduğu, bizonlarda ve bu işaretleyicilerin kullanılmasının bu parametreler bakımından sığır ırklarında yapılacak genetik tanımlamalardaki isabeti artıracağı belirtilmiştir.

34 Atlarda Mikrosatellitler İle Yapılan Ebeveyn Testleri Atlarda DNA parmak izi yöntemi ilk olarak farklı ırklar arasındaki varyasyonun tespiti amacıyla kullanılmıştır. Moleküler genetikteki ilerlemeler sonucunda gündeme gelen mikrosatellit işaretleyicilerin genetik çalışmalarda kullanımının ticari at ıslahı programlarında akrabalığın kontrolü, izlenmesi ve genetik varyasyon düzeylerini tanımlanması anlamında çok büyük bir potansiyel sunduğu bildirilmektedir (Georgescu vd., 2005). Atlarda mikrosatellitlerle yapılan ve babalık testini konu alan bir çalışmada heterozigotluğu düşük olan mikrosatellit işaretleyicilerin düşük dışlama gücüne sahip oldukları, yüksek olanların ise yüksek bir dışlama gücüne sahip oldukları bildirilmiştir. Çalışmada, kullanılan tüm mikrosatellit işaretleyicilerin kullanılması ile yapılan değerlendirmede ise CP E değerinin %99 olduğu tespit edilmiştir (Bowling vd., 1997). Litvanya yerli atlarına ait üç genotipte (Pemaitukai, Pemaitukai ağır tip, Litvanya ağır tip) 15 mikrosatellit işaretleyici kullanılarak ebeveyn testi yapılmıştır. Çalışmada, P E değerleri Pemaitukai, Pemaitukai ağır tip ve Litvanya ağır tip atlarında sırasıyla; 0,9985, 0,9998 ve 0,9999 olarak tespit edilmiştir (Juras ve Cothran 2004). Portekiz yerli ırklarından Lusitano, Sorraia ve Garrano ırkı atlarda kan protein polimorfizmleri (10 lokus), kan grupları (7) ve mikrosatellit işaretleyiciler (6) kullanılarak ebeveyn testi yapılmıştır. Lusitano, Sorraia ve Garrano ırkında protein polimorfizmleri için elde edilen toplam P E değerleri sırasıyla; 0,951, 0,900 ve 0,938; kan grupları için elde edilen P E değerleri; 0,932, 0,773 ve 0,959; mikrosatellit işaretleyiciler için elde edilen P E değerleri ise 0,996, 0,885 ve 0,995 olarak tespit edilmiştir. Çalışmada, yoğun akrabalı yetiştirme koşullarında bile mikrosatellit markerların diğer yöntemlere göre yüksek düzeyde etkinlik sağladığı sonucuna varılmıştır (Luis vd., 2002). İran Caspian ırkı atlarda yapılan ebeveyn testinde 7 mikrosatellit işaretleyici kullanılmıştır. Çalışmada, gözlenen ortalama heterozigotluk değeri 0,946, beklenen ortalama heterozigotluk oranı ise 0,675 olarak bulunmuştur. Ortalama PIC değeri ve toplam P E değeri ise sırasıyla; 0,605 ve 0,973 olarak elde edilmiştir. Uygun mikrosatellit seçiminin babalık testlerinde isabet derecesini artıracağı bildirilmektedir (Seyedabadi vd., 2006).

35 Diğer Türlerde ve Yabani Hayvan Populasyonlarında Mikrosatellitler İle Yapılan Ebeveyn Testleri Babalık testleri çiftlik hayvanları dışında insanlarda ve hayvan populasyonlarında da sıklıkla kullanılagelmektedir. İnsanlarda oldukça kritik olan ve adli tıbbın ilgi alanına giren birey tanımlama ve babalık testleri gibi çeşitli amaçlarla uygulanan DNA analizleri mahkemelere objektif deliller sunabilmek amacıyla kullanılmaktadır. DNA analizleri, adli bilimlerin adli seroloji dalında babalık (paternite) tayini ve kriminal incelemelerde uygulama alanı bulmuştur. İnsanlarda adli amaçlı çalışmalarda, mikrosatellit işaretleyicilerin bireyden bireye tekrarlanan ünite sayılarındaki varyasyonundan yararlanılmaktadır (Dönbak, 2002). Günümüzde adli amaçlı kimliklendirme denilince akla öncelikli olarak mikrosatellit analizi gelmektedir. Uzun süre sadece otozomal mikrosatellitler kimliklendirme ve babalık tayini amacı ile kullanılmış son yıllarda ise gonozomal mikrosatellitler adli amaçlı kimliklendirmede kullanıma girmiştir (Aşıcıoğlu vd., 2002). İnsanlarda 12 mikrosatellit işaretleyici ve 1 cinsiyete özgü amelogenin lokusunun kullanıldığı çalışmada bu 13 lokus multipleks olarak oluşturulmuş ve elde edilen P E değerinin %99,99 olduğu ve bu multipleks mikrosatellit işaretleyici grubunun insanlarda babalık testlerinde güvenle kullanılabileceği bildirilmiştir (Schlenk vd., 2004). Kuzey ve güney bölgelerinde yaşayan İtalyan kökenli ve Kafkas kökenli insanlarda yapılan tanımlama ve babalık testi çalışmasında 9 mikrosatellit işaretleyici kullanılmıştır. Çalışmada P D ve CP E kuzey bölgelerindekiler için sırasıyla ve güney bölgesindekiler için ise ve olarak bulunmuştur (Adreini vd., 2007). Son yıllarda yabani hayvanlarda genetik çeşitliliğin tanımlanması, ortak ataların, ebeveynlerin belirlenmesi ve akrabalık ilişkilerinin ortaya konması amacıyla geniş ölçüde mikrosatellitlerden faydalanılmaktadır. Yaban ördeklerinde (Anas platyrhynchos) yapılan babalık testi çalışmasında 7 mikrosatellit işaretleyici kullanılmıştır. Çalışmada kullanılan 7 işaretleyici için genel P E değerinin 0,999, bir ebeveyne ait genotip bilgileri ışığında bu değerin 0,998 olduğu bildirilmiştir (Denk vd., 2004).

36 22 Üç Makak (Macaca mulatta) maymunu kolonisinde 13 mikrosatellit işaretleyici, 2 isozim ve 5 serum proteini kullanılarak yapılan karşılaştırmalı babalık testi çalışmasında, mikrosatellit işaretleyicilerin biyokimyasal markerlara göre daha yüksek düzeyde bir heterozigotluk, polimorfizm ve dışlama olasılığı sergilediği, bu nedenle babalık testlerinde mikrosatellit markerların tercih edilmesi gerektiği bildirilmiştir. Çalışmada Makak maymunlarındaki genetik çeşitliliğin tanımlanmasında insanlarda kullanılan mikrosatellit işaretleyicilerin başarılı bir şekilde kullanılabileceği de belirtilmiştir (Ely vd., 1999). Baştankara olarak bilinen yabani kuşların iki farklı genotipinde (Parus major ve Parus caeruleus) 8 mikrosatellit işaretleyici kullanılarak yapılan çalışmada toplam P E değeri 0,99 dan büyük elde edilmiştir (Johannessen vd., 2005). Sazangiller familyasından olan Golyan balığında (Pimephales promelas) 7 mikrosatellit işaretleyici kullanılarak babalık testi yapılmıştır. Ortalama P E değerinin 0,102 ve 0,795 arasında değiştiği ve iki lokusun Hardy-Weinberg eşitliğine uygunluk göstermediği bildirilmiştir. Bu 7 lokustan elde edilen CP E değerinin ise 0,999 olarak bulunduğu ve bu mikrosatellitlerin bu taksonda yapılacak babalık testlerinde güvenle kullanılabileceği bildirilmiştir (Bessert ve Orti, 2003). Kızılgerdan kuşlarında (Petroica goodenovii) 7 mikrosatellit işaretleyici kullanılarak yapılan babalık testinde, ortalama heterozigotluk 0,440, ortalama allel sayısı 8 ve toplam P E değeri 0,9760 olarak bildirilmiştir. Çalışmada birbiri ile akraba olmayan bireylerde ebeveyn atamanın kolay olduğu bildirilmektedir (Dowling vd., 2003). Alpakalarda (Vicugna pacos) 10 mikrosatellit işaretleyici ile iki multipleks grup oluşturularak babalık testi çalışılmıştır. Ortalama allel sayısı 14,5 ve heterozigotluk oranı 0,698 ile 0,946 arasında değişmiştir. Çalışmada kullanılan 10 baba adayına ait LOD (logaritmik olasılık değeri) değerinin 2.19 x ile 1.34 x arasında değiştiği Δ (Delta) değerinin ise 2.80 x to 1.34 x olduğu bildirilmiştir. Çalışmada ayrıca tahmin edilen pedigri hatalarının %15,5 düzeyinde olduğu bildirilmiştir (Agapito vd., 2008). Geyiklerde yapılan bir çalışmada, 4, 5 ve 9 mikrosatellit işaretleyiciden oluşturulan multipleks gruplar kurgulanarak babalık testi çalışılmıştır. 4 ve 5 STR

37 23 lokusundan oluşturulan multipleks grubundan elde edilen P E değerinin sırasıyla 0,92 ve 0,95 olduğu, 9 mikrosatellit işaretleyiciden oluşturulan multipleks gruba ait CP E değerinin ise 0,996 olduğu bildirilmiştir. Oluşturulan bu multipleks mikrosatellit işaretleyicilerin geyiklerde ve diğer türlerde yapılacak babalık testlerinde güvenle kullanılabileceği bildirilmiştir (Zsolnai vd., 2009).

38 24 3 MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Hayvan Materyali Çalışmada babalık testi için ve yılarında çiftleşme döneminde Adnan Menderes Üniversitesi Grup Koyun Yetiştirme Programı (ADÜ-GKYP) Karya Üst/Elit sürüsünde bulunan Karya hayvanlar kullanılmıştır. Çalışmada toplam 16 koç ve bunlardan olan 101 kuzudan kan örneği alınmıştır. Bu 16 koçtan birinci ve ikinci yıl 11 koç aşımda kullanılmıştır. Yıllara göre örnek toplanan hayvan sayılarına ait bilgiler Çizelge 3.1 de verilmiştir. Çizelge 3.1 Yıllara göre örnek toplanan hayvan sayıları Çiftleşme Sezonu Karya Koç Karya Kuzu Toplam Çalışmanın ilk ve ikinci yılında ADÜ-GKYP Karya üst sürüsünde bulunan hayvanların kızgınlıkları koç katım mevsiminde (Haziran-Temmuz ayları) 14 gün süreli flugestone acetat (Syncro-Part) içeren vaginal sünger uygulaması ve sünger çıkartılması anında 500 IU PMSG enjeksiyonu uygulamasıyla senkronize edilmiştir. Ardından sürüye önlüklü arama koçu katılarak ve belirli aralıklarla yapılan gözlemlerle kızgın koyunlar belirlenip kaydedilmiştir. Kızgınlık sergileyen koyunlar PMSG enjeksiyonunu izleyen 48. saatte özel bölmelerde gruplandırılarak sabah erken saatte koça verilerek doğal aşım uygulanmıştır. Her bölmeye bir koç konumuştur. Çiftleşmede kullanılan koçlar 2 gün süreyle kendi bölmelerindeki koyunlarla birlikte tutulmuştur. Senkronizasyonu izleyen günlerde sürüde gebelik kontrolu ultrasonla yapılmıştır. Doğum mevsiminde (Kasım-Aralık) doğan kuzular doğar doğmaz numaralanmış ana ve baba numaraları, doğum tarihleri, doğum ağırlıkları ve doğum tipi gibi genel kayıtlar bilgisayara işlenmiştir. Senkronizasyon sonuçları başarılı olan koyunlardan doğan kuzulardan (babaları bilinen kuzulardan) doğum takibeden ilk hafta içerisinde kan örnekleri alınmıştır. Çiftleşmeler kullanılan koçlar ve bunlara ait kuzu sayılarına ilişkin bilgiler Çizelge 3.2 de özetlenmiştir.

39 25 Çizelge 3.2 Çiftleşmelerde kullanılan koçlar ve bunlara ait kuzu sayıları Hayvan No DNA kod KR KR KR KR KR KR KR KR KR KR KR KR KR KR KR KR Toplam Denemede kullanılan Karya, son yıllık dönemde Batı Anadolu daki yağlı kuyruklu yerli ırkların (Ödemiş, Çine Çaparı, Dağlıç vb) yetiştiriciler tarafından Sakız, Kıvırcık veya Sakız x Kıvırcık melezi koçlar kullanılarak yapılan sistemsiz çevirme melezlenmesi sonucu şekillenmiş ince kuyruklu bir koyun genotipidir. Yüksek üreme performansına ve süt verim yeteneğine sahip bir genotip olan Karya yetiştiriciler tarafından tercih edildiğinden Batı Anadolu da son yıllarda oldukça yaygınlaşmıştır. Genotipin tanımlanması ve geliştirilmesi amacıyla hayata geçirilen, bünyesinde birçok AR-GE etkinliği barındıran ADÜ-GKYP kapsamında Karya koyunu Üst Sürüsü oluşturma çabaları ilk olarak Prof.Dr. Orhan Karaca öncülüğündeki ekip tarafından Adnan Menderes Üniversitesi Çine Meslek Yüksek Okulu nda 1994 yılında başlatılmış, çalışmalar daha sonraki yıllarda Ziraat Fakültesinde aynı ekip tarafından genişletilerek sürdürülmüştür. Genotip ilk yıllarda proje ekibi tarafından Çine Tipi olarak anılmış, ancak daha sonra yöresel Çine Çaparı ile isim benzerliği ve genotipin bölgede yaygın olması hususu dikkate alınarak genotipe, geçmişte bölgede hüküm süren Karya uygarlığının isminin verilmesi uygun görülmüştür. Karya Tipi olarak anılmakla birlikte yetiştiriciler arasında Karya koyunu olarak benimsenmiş ve hızla yaygınlaşmıştır (Karaca vd., 1998; Karaca ve Cemal, 2005, Karaca vd., 2009) (Şekil 3.1). Karya koyununun oluşumuna katkıda bulunan ırkların katkı düzeyi tam belli değildir. Yoğunluk Sakız ve Kıvırcık kanına ait olmakla birlikte yöresel

40 26 genotiplerinde katkısı söz konusudur. Yapılan saha araştırmalarında Karya koyununun Aydın dışında başta İzmir ve Denizli olmak üzere diğer komşu illerde de yaygın olarak yetiştirildiği belirlenmiştir. Şekil 3.1 Karya koyunu 3.2. Kan Örneklerinin Toplanması Kanla doğrudan teması önlemek için gerekli önlemler alındıktan sonra kan alınacak hayvan sakinleştirilmiş ve lateralden yavaşça Vena jugularis e baskı yapılarak iğne tutucuya (holder) yerleştirilen vakumlu iğne ile yavaşça damara girilmiştir. Daha sonra kanın vakumlu K3-EDTA içeren tüpe kontrollü bir şekilde dolması sağlanmıştır. Yaklaşık 10 ml kan toplanan tüplerin üzerine hayvan numarası, cinsiyet ve tarih yazılarak kullanılıncaya kadar -20 o C de muhafaza edilmiştir Kandan DNA İzolasyonu Hayvanlardan toplanan kan örneklerinden DNA izolasyonun gerçekleştirilmesinde NucleoSpin Blood DNA izolasyon kiti (Macherey-Nagel, Dateks, İzmir) kullanılmıştır. DNA izolasyonu üretici firma tarafından tavsiye edilen protokol kullanılarak Adnan Menderes Üniversitesi Bilim ve Teknoloji Araştırma ve Uygulama Merkezi (ADÜ-BİLTEM) kapsamındaki laboratuarlarda gerçekleştirilmiştir.

41 Nucleospin Protokolüne Göre DNA İzolasyonu Gerekli ön hazırlıklar yapıldıktan sonra 25 µl Proteinaz K, 200 µl kan ve 200 µl lysis buffer 1,5 ml lik mikrosantrifuj tüplerine eklendikten sonra sn vorteks ile karıştırılmıştır. Karıştırma işlemi biten tüpler 70 0 C de 15 dakika inkübe edilmiştir. İnkübasyonu takiben 210 µl ethanol (absolute) eklenmiş ve tekrar vorteks ile karıştırılmıştır. İzolasyon kiti ile beraber gelen kan kolonu, toplama tüplerine yerleştirilmiş ve 1,5 ml lik mikrosantrifuj tüp içerisindeki içerik bu tüplere aktarılmış ve g de 1 dakika santrifuj edilmiştir. Santrifuj işleminden sonra kan kolonları yeni bir toplama tüpüne yerleştirilmiş ve ilk yıkama için 500 µl yıkama tamponu (BW, wash buffer) eklenerek g de 1 dakika santrifuj edilmiştir. Bunu takiben yeni toplama tüplerine yerleştirilen kan kolonlarına ikinci yıkama için 600 µl BW (B5) eklenmiş ve g de 1 dakika santrifuj edilmiştir. Kan kolonlarının kurutulması amacıyla kolonlar boşaltılmış toplama tüplerine yerleştirilerek g de 1 dakika santrifuj edilmiştir. Son olarak kurutulan kan kolonlarının her birine önceden 70 0 C lik su banyosunda ön ısıtmaya tabi tutulan ayrıştırma tamponundan (Elution buffer) 100 µl eklenerek oda sıcaklığında 1 dakika beklenmiş ve daha sonra g de 1 dakika santrifuj edilmiştir. DNA izolasyonu sonrasında elde edilen DNA örnekleri kan kolonlarından ependorf tüplere alınarak PCR aşamasına kadar +4 0 C de saklanmıştır Çalışmada Kullanılan Mikrosatellitler Çalışmada kullanılan mikrosatellit lokusları aynı zamanda idğer bir çalışmada yerli gen kaynağı Çine Çaparı koyunların genetik çeşitliliğinin araştırılması amacıyla da kulanılacağından FAO tarafından tavsiye edilen mikrosatellit listesinden seçilmiştir. Kapiller elektroforez ve fragman analizinde kullanılması amacıyla her bir lokusun ileri (forward) primeri Beckman Coulter CEQ 8000 Genetik Analiz Sistemine uygun WELL-RED (D4, D3 veya D2) floresans boya ile işaretlenmiştir. Çalışmada FAO tarafından koyun türü için önerilen ilk 10 mikrosatelit kullanılmıştır (Çizelge 3.3).

42 28 Çizelge 3.3 Çalışmada kullanılan mikrosatelitler (FAO, ISAG, Econogene) Lokus İsmi Primer Baz Dizilişi Allel Uzunluğu (bç- Baz çifti) FAO ISAG ECONOGENE Kromozom No Fluoresan İşaret MAF65 OarJMP58 OarFCB193 OarFCB304 OarJMP29 BM8125 OarFCB128 OarCP34 OarVH72 DYMS1 İleri: AAAGGCCAGAGTATGCAATTAGGAG Geri: CCACTCCTCCTGAGAATATAACATG İleri: GAAGTCATTGAGGGGTCGCTAACC Geri: CTTCATGTTCACAGGACTTTCTCTG İleri: TTCATCTCAGACTGGGATTCAGAAAGGC Geri: GCTTGGAAATAACCCTCCTGCATCCC İleri: CCCTAGGAGCTTTCAATAAAGAATCGG Geri: CGCTGCTGTCAACTGGGTCAGGG İleri: GTATACACGTGGACACCGCTTTGTAC Geri: GAAGTGGCAAGATTCAGAGGGGAAG İleri: CTCTATCTGTGGAAAAGGTGGG Geri: GGGGGTTAGACTTCAACATACG İleri: ATTAAAGCATCTTCTCTTTATTTCCTCGC Geri: CAGCTGAGCAACTAAGACATACATGCG İleri: GCTGAACAATGTGATATGTTCAGG Geri: GGGACAATACTGTCTTAGATGCTGC İleri: GGCCTCTCAAGGGGCAAGAGCAGG Geri: CTCTAGAGGATCTGGAATGCAAAGCTC İleri: AACAACATCAAACAGTAAGAG Geri: CATAGTAACAGATCTTCCTACA D D D D D D D D D ? D2

43 Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PCR) PCR aşamasında Touch Down-PCR (TD-PCR) yöntemi kullanılmıştır. Bu PCR yöntemi optimizasyon, kullanılan tamponlar ve döngü şartlarından çok, annealing (yapışma ısısı) üzerine odaklanarak gerçekleştirilmektedir. PCR optimizasyonunda ve buna ek olarak annealing sıcaklıkları tam bilinmeyen markerlarla yapılacak çalışmalarda TD-PCR yaygın olarak kullanılmaktadır. Bu yöntemde tek bir siklus programının seyri süresince annealing dereceleri ard arda değişecek şekilde düzenlenmektedir. TD-PCR programına yüksek bağlanma ısısı (annealing) ile başlanır ve az sayıda da olsa hedef dizinin amplifiye olması beklenir. Bağlanma ısısı döngü sayısı ilerledikçe düşürülür. Amplifiye olmaya başlayan hedef dizinin kalıp populasyondaki oranı arttığı için düşen ısıda artık yalnızca hedef dizi çoğalmaktadır (Hecker ve Roux, 1996) PCR ile DNA Çoğaltımı PCR aşamasında primerlere özgü bölgelerinin çoğaltılmasında 0,2 ml lik ince cidarlı eppendorf tüpleri kullanılmıştır. Tüplerdeki toplam hacim 25 μl olacak şekilde 5X PCR Buffer, MgCl2, dntp karışımı (datp, dttp, dgtp, dctp), FAO ve ISAG tarafından bildirilen 10 flüoresan işaretli mikrosatellit marker (Sigma, Interlab, İzmir), Taq DNA Polimeraz Enzimi, ~100 ng Genomik DNA ve steril ddh2o içeren PCR master miks oluşturulmuştur. Çoklu (multipleks) polimeraz zincir reaksiyonu; birden çok lokusun aynı reaksiyonda çoğaltılması prensibine dayalı bir uygulamadır (Henegraiu vd., 1997). Çalışmanın konusunu oluşturan ebeveyn testinin uygulanması amacıyla başlangıçta Çizelge 3.4 de belirtildiği şekilde 10 mikrosatellit ile 3 multipleks grup oluşturulmuştur. Çizelge 3.4 Çalışmanın başlangıcında oluşturulan multipleks grupları Multipleks-1 Multipleks-2 Multipleks-3 MAF65 OarJMP29 DYMS1 OarFCB193 OarFCB128 OarVH72 OarFCB304 BM8125 OarCP34 OarJMP58 Ancak bu multipleks gruplardan multipleks 1 ve 3 te yer alan bazı mikrosatellit lokuslarından arzulanan sonuçlar alınamayınca kullanılan 10 mikrosatellit lokus ile yeni multipleks gruplar oluşturulmuştur. Bu nedenle 10 mikrosatellit lokusunun 8 i ile 3 farklı multipleks grup oluşturulmuş diğer 2 mikrosatellit lokus ise ayrı

44 30 ayrı amplifikasyonlarda kullanılmıştır (Çizelge 3.5). Hazırlanan örnekler termal çevirici (thermal cycler, Eppendorf) cihazına konulmuş ve DNA lar çoğaltılmıştır. Çizelge 3.5 Çalışmada oluşturulan multipleks grupları Multipleks-1 Multipleks-2 Multipleks-3 OarCP34 OarJMP29 OarJMP58 MAF65 DYMS1 OarFCB193 OarFCB128 OarVH72 OarFCB304 BM8125 Oluşturulan multipleks gruplarının polimeraz zincir reaksiyonu tekniği ile çoğaltılmasında kullanılan bileşenler Çizelge 3.6, Çizelge 3.7, Çizelge 3.8, Çizelge 3.9 ve Çizelge 3.10 da gösterilmiştir. Çizelge 3.6 OarCP34, OarFCB193, OarFCB304 (Multipleks-1) isimli mikrosatellit bölgelerinin PCR bileşenleri 1 örnek için (µl) Son Konsantrasyon ddh 2 O (Otoklavlanmış, ph:7.0)) X PCR Buffer X MgCl 2 (25mM) mm dntp Karışımı* (3 mm) mm Forward Primer (10 µm) / / / / Reverse Primer (10 µm) / / / / Taq DNA Polimeraz Enzimi (5U/µl) U Genomik DNA (50 ng/ µl) 2.00 ~ 100 ng Toplam µl - *:datp,dttp,dctp,dgtp (4 dntp nin her birinden 0.5 μl kullanıldı) 1 :OarCP34; 2 :OarFCB193; 3 :OarFCB304 Çizelge 3.7 OarJMP29, OarFCB128, BM8125 (Multipleks-2) isimli mikrosatellit bölgelerinin PCR bileşenleri 1 örnek için (µl) Son Konsantrasyon ddh 2 O (Otoklavlanmış, ph:7.0)) X PCR Buffer X MgCl 2 (25mM) mm dntp Karışımı* (3 mm) mm Forward Primer (10 µm) / / / / Reverse Primer (10 µm) / / / / Taq DNA Polimeraz Enzimi (5U/µl) U Genomik DNA (50 ng/ µl) 2.00 ~ 100 ng Toplam µl - *datp,dttp,dctp,dgtp (4 dntp nin her birinden 0.5 μl kullanıldı) 1 :OarJMP29; 2 :OarFCB128; 3 :BM8125

45 31 Çizelge 3.8. OarJMP58, OarVH72 (Multipleks-3) isimli mikrosatellit bölgelerinin PCR bileşenleri 1 örnek için (µl) Son Konsantrasyon ddh 2 O (Otoklavlanmış, ph:7.0)) X PCR Buffer X MgCl 2 (25mM) mm dntp Karışımı* (3 mm) mm Forward Primer (10 µm) / / Reverse Primer (10 µm) / / Taq DNA Polimeraz Enzimi (5U/µl) U Genomik DNA (50 ng/ µl) 2.00 ~ 100 ng Toplam µl - *datp,dttp,dctp,dgtp (4 dntp nin her birinden 0.5 μl kullanıldı) 1 :OarJMP58; 2 :OarVH72 Çizelge 3.9 MAF65 isimli mikrosatellit bölgesinin PCR bileşenleri 1 örnek için (µl) Son Konsantrasyon ddh2o (Otoklavlanmış, ph:7.0)) 8,63-5X PCR Buffer X MgCl2 (25mM) mm dntp Karışımı* (3 mm) mm Forward Primer (10 µm) Reverse Primer (10 µm)# Taq DNA Polimeraz Enzimi (5U/µl) U Genomik DNA (50 ng/ µl) 2.00 ~ 50 ng Toplam µl - *datp,dttp,dctp,dgtp (4 dntp nin her birinden 0.5 μl kullanıldı) Çizelge 3.10 DYMS1 isimli mikrosatellit bölgesinin PCR bileşenleri 1 örnek için (µl) Son Konsantrasyon ddh 2 O (Otoklavlanmış, ph:7.0)) 8,63-5X PCR Buffer X MgCl 2 (25mM) mm dntp Karışımı* (3 mm) mm Forward Primer (10 µm) Reverse Primer (10 µm)# Taq DNA Polimeraz Enzimi (5U/µl) U Genomik DNA (50 ng/ µl) 2.00 ~ 50 ng Toplam µl - *datp,dttp,dctp,dgtp (4 dntp nin her birinden 0.5 μl kullanıldı) Mikrosatellit bölgelerinin yükseltgenmesinde Eppendorf Mastercycler Gradient isimli PCR cihazı kullanılmıştır (Şekil 3.2).

46 32 Şekil 3.2 ADÜ Merkez Araştırma Laboratuarında kullanılan PCR cihazından bir görünüm Touch Down-PCR Yönteminde Kullanılan Yükseltgenme Koşulları Termal çeviricide primerlere özgü DNA bölgelerinin çoğaltılmasında kullanılan multipleks gruplarına özgü PCR programları aşağıdaki çizelgelerde özetlenmiştir. Çizelge 3.11 OarCP34, OarFCB193, OarFCB304 (Multipleks-1) isimli mikrosatellit bölgeleri için PCR programı 1. Ayrım (Denatürasyon) 95 0 C 5 dk (1 Döngü) Sıc.( 0 C) Süre Sıc.( 0 C) Süre Sıc.( 0 C) Süre 2.Ayrım (Denatürasyon) 95 0 C 45 sn 95 0 C 45 sn 95 0 C 45 sn Bağlanma (Annealing) 60 0 C 45 sn 59 0 C 45 sn 58 0 C 45 sn Uzama (Extension) 72 0 C 45 sn 72 0 C 45 sn 72 0 C 45 sn Döngü Sayısı Son Uzama (Final Extension) 72 0 C 5 dk (1 Döngü) Çizelge 3.12 OarJMP29, OarFCB128, BM8125 (Multipleks-2) isimli mikrosatellit bölgeleri için PCR programı 1.Ayrım (Denatürasyon) 95 0 C 5 dk (1 Döngü) Sıc.( 0 C) Süre Sıc.( 0 C) Süre Sıc.( 0 C) Süre 2.Ayrım (Denatürasyon) 95 0 C 45 sn 95 0 C 45 sn 95 0 C 45 sn Bağlanma (Annealing) 61 0 C 45 sn 59 0 C 45 sn 57 0 C 45 sn Uzama (Extension) 72 0 C 45 sn 72 0 C 45 sn 72 0 C 45 sn Döngü Sayısı Son Uzama (Final Extension) 72 0 C 5 dk (1 Döngü)

47 33 Çizelge 3.13 OarJMP58, OarVH72 (Multipleks-3) isimli mikrosatellit bölgeleri için PCR programı 1.Ayrım (Denatürasyon) 95 0 C 5 dk (1 Döngü) Sıc.( 0 C) Süre Sıc.( 0 C) Süre Sıc.( 0 C) Süre 2.Ayrım (Denatürasyon) 95 0 C 45 sn 95 0 C 45 sn 95 0 C 45 sn Bağlanma (Annealing) 60 0 C 45 sn 58 0 C 45 sn 56 0 C 45 sn Uzama (Extension) 72 0 C 45 sn 72 0 C 45 sn 72 0 C 45 sn Döngü Sayısı Son Uzama (Final Extension) 72 0 C 5 dk (1 Döngü) Çizelge 3.14 MAF65 isimli mikrosatellit bölgesi için PCR programı 1.Ayrım (Denatürasyon) 95 0 C 5 dk Sıc.( 0 C) Süre Sıc.( 0 C) Süre Sıc.( 0 C) Süre 2.Ayrım (Denatürasyon) 95 0 C 45 sn 95 0 C 45 sn 95 0 C 45 sn Bağlanma (Annealing) 59 0 C 45 sn 58 0 C 45 sn 57 0 C 45 sn Uzama (Extension) 72 0 C 45 sn 72 0 C 45 sn 72 0 C 45 sn Döngü Sayısı Son Uzama (Final Extension) 72 0 C 5 dk (1 Döngü) Çizelge 3.15 DYMS1 isimli mikrosatellit bölgesi için PCR programı 1.Ayrım (Denatürasyon) 95 0 C 5 dk Sıc.( 0 C) Süre Sıc.( 0 C) Süre Sıc.( 0 C) Süre 2.Ayrım (Denatürasyon) 95 0 C 45 sn 95 0 C 45 sn 95 0 C 45 sn Bağlanma (Annealing) 52 0 C 45 sn 51 0 C 45 sn 50 0 C 45 sn Uzama (Extension) 72 0 C 45 sn 72 0 C 45 sn 72 0 C 45 sn Döngü Sayısı Son Uzama (Final Extension) 72 0 C 5 dk (1 Döngü) 3.6. PCR Ürünlerinin Agaroz Jelde Gözlemlenmesi PCR işleminden sonra PCR ürünlerinin varlığının tespiti için %2 lik agaroz jel kullanılmıştır. Bu amaçla 2,4 gr Agaroz hassas terazi ile erlenmayer içerisinde tartılmış ve üzerine ph sı 8.3 e ayarlanan 120 ml 0,5 X TBE çözeltisi (54 gr Tris- Base, 27.5 gr Borik Asit, 20 ml 0.5 M EDTA-pH8.0) eklenerek mikrodalga fırında şeffaflaşıncaya kadar kaynatılmıştır. Kaynamanın ardından karışım C o arası sıcaklığa kadar soğutulmuştur. Soğutulan jel, örneklerin yükleneceği kuyucukların oluşmasını sağlayacak tarakların takılı olduğu yatay elektroforez tankına dökülerek katılaşması beklenmiştir. Katılaşan jelden taraklar özenli bir şekilde çıkarıldıktan sonra üzerine 0.5X TBE çözeltisi dökülerek elektroforez tankı örneklerin yüklenmesi için hazır hale getirilmiştir. 10 μl PCR ürününe 2 μl 6X yükleme boyası (10mM Tris-HCl (ph 7.6), %0.03 Bromfenol Mavisi, %0.03 Ksilen Siyanol FF, %60 Gliserol, 60mM EDTA) eklenerek örnekler boyanmıştır.

48 34 Boyanan örneklerden agaroz jele 10 ar μl yüklenmiştir. Jelin ilk kuyucuğuna elektroforez işlemi sonunda oluşacak bantların doğru şekilde yorumlanmasını sağlayacak olan DNA cetveli (Şekil 3.3) 3 μl yüklenmiştir. Şekil 3.3 Çoğaltılan DNA parçalarının büyüklüklerinin belirlenmesinde kullanılan DNA cetveli (ladder) Yükleme işlemi bittikten sonra elektroforez tankı güç kaynağına bağlanmış ve örnekler agaroz jelde 80 voltta 120 dakika yürütülmüştür. Yürütme işlemi bittikten sonra jel, içerisinde 0,5 X TBE ve ilave edilen çözelti miktarına göre hesaplanan etidyum bromid (1 ml çözelti için 0,5 μl etidyum bromid) bulunan bir kapta dakika bekletilmiştir. Ve daha sonra jel UV ışık altında fotoğraflanmıştır (Şekil 3.4). Şekil 3.4 Farklı yükseltgenme koşullarında çoğaltılan 10 mikrosatellitin PCR sonrası agaroz jeldeki bant görüntüsü

49 Kapiler Elektroforez ve Fragman Analizi Son yıllarda geliştirilen kapiller elektroforez (CE), elektroforetik hareket kabiliyeti, faz ayırımı ve moleküler boyuttaki farklılıklara ya da bunların bir kaçına bağlı olarak elektrokinetik ayırım yapan bir tekniktir. Kapiller elektroforez yönteminin LIF (laser-induced fluorescence) ile desteklenmesi sonucunda bu teknik DNA parçalarının ayrımında en hızlı gelişen yöntem olmuştur. Geleneksel jel metodlarında DNA, zincire bağlanan kimyasallar yardımıyla görünür hale getirilirken CE tekniğinde DNA nın algılayıcı sistem tarafından tanınması floresan boyalı primerler sayesinde olmaktadır. Bu amaçla primerler farklı renkte floresan boya ile işaretlenmektedir. Bu da benzer büyüklükte fragmanların aynı zamanda analizini sağlamaktadır. Ticari olarak hazırlanan kitlerle 9,10 ve 16 polimorfik DNA bölgesini bir PCR reaksiyonuyla çoğaltılıp yine bir yürütmeyle analiz etme şansı doğmuştur. Geleneksel jel yönteminde ise bir arada çoğaltılabilen ve analiz edilebilen bölge sayısı sınırlıdır. Böylece CE ile zaman tasarrufu yanında emekten de tasarruf sağlanmaktadır (Aşıcıoğlu vd., 2002). Kapiller elektroforez küçük hacimde örneklerde ya da bozulmuş DNA larla yapılan çalışmaların sonucunda düşük miktarda PCR ürünü bulunduğu durumlarda geleneksel jel elektroforezine göre daha etkin sonuç vermektedir. Kapiller elektroforez kullanılarak farklı laboratuarlarda yapılan çalışmalarda standart sapmasının 0,075-0,1175 baz çifti arasında bulunması, bu teknolojinin standart sapması 0,2 baz çifti olan geleneksel jel elektroforezinden daha etkin ayrım yapabilmektedir (Wenz vd., 1998). Çalışmada fragman analizi için Adnan Menderes Üniversitesi Tıp Fakültesi, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalında bulunan Beckman Coulter CEQ-8000 Genetik Analiz Sistemi kullanılmıştır (Şekil 3.5). Çalışmada flüoresans işaretli primerler kullanılarak yükseltgenen 0,5 μl PCR ürününe 29,5 μl örnek yükleme solüsyonu (SLS, Sample Loading Solution) ve Size Standart 400 karışımı eklenerek örnek plakasının (sample plate) kuyucuklarına yüklenmiştir. Yüklenen örneklerin üzerine birer damla mineral yağ ilave edilmiştir. Daha sonra buffer plakasının kuyucuklarına, kuyucukların %70 ini dolduracak şekilde ayırma (seperation) bufferı eklenmiştir. Örneklerin kapiller elektroforez işlemlerinde Frag 3 yöntemi (90 C de 120 sn denatürasyon,

50 36 2,0 kv da 60 saniye injeksiyon ve 50 C kapiller ısısında 6 kv da seperasyon) kullanılmıştır. Elde edilen fragmanlara ait uzunluklar Beckman Coulter CEQ-8000 Genetik Analiz Sistemi yazılımında bulunan fragman analiz programı kullanılarak yapılmıştır. Şekil 3.5 ADÜ Tıp Fakültesi Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalında bulunan ve çalışmada kullanılan Beckman Coulter CEQ-8000 Cihazından bir görünüm 3.8. Fragman Uzunluklarının Hesaplanması Çalışmada PCR amplifikasyonu sonucunda elde edilen fragman uzunluklarının belirlenmesinde kapiller elektroforez yöntemi (Beckman Coulter CEQ 8000) kullanılmıştır. Kullanılan 4 farklı (mavi, yeşil, siyah) flüoresans boya ile işaretli 10 mikrosatellit lokusunun fragman uzunluklarının belirlenmesinde GenomeLab DNA Size Standard Kit 400 kullanılmıştır. Bu standart işaretleyiciye göre belirlenen uzunluk değerleri bilgisayara kaydedilmiştir. Şekil 3.6 ve Şekil 3.7 de Beckman Coulter CEQ 8000 kapiller elektroforezinde okuması yapılan heterozigot ve homozigot bireylere ait görüntüler verilmiştir.

51 37 Şekil 3.6. DYMS1 Mikrosatellit lokusu bakımından heterozigot genotipe sahip birey Şekil 3.7 DYMS1 Mikrosatellit lokusu bakımından homozigot genotipe sahip birey 3.9. İstatistik Analizler Çalışmada elde edilen fragman uzunlukları bilgisayara işlendikten sonra mikrosatellit lokuslarına ait allel sayıları (n A ), etkili allel sayısı (n E ), gözlenen (Ho) ve beklenen (He) heterozigotluk oranları, polimorfik bilgi içeriği (PIC), ayrımlama gücü (P D ), dışlama olasılığı (P E ), kombine edilmiş dışlama olasılığı (CP E ), karşılama (uyuşma) olasılığı (MP), babalık indeksi (PI) ve Hardy-Weinberg dengesine uyum değerleri hesaplanmıştır. Bu parametrelerin hesaplanmasında

52 38 GenAlEx (Peakall ve Smouse, 2006), Cervus 3.0 (Marshall, 1998/2006, Kalinowski vd., 2007), PowerStatsV12 (Brenner ve Morris, 1990a) ve Popgene32 (Yeh vd., 1997) programları kullanılmıştır. Programlar kaynak kısmında belirtilen internet adreslerinden indirilerek kullanılmıştır. n A ve n E, kullanılan STR lokuslarının bireylerde gözlemlenen allel sayılarını ve etkin allel sayısını ifade etmektedir. Nei (1978), Nei (1987) ve Nei ve Kumar (2000) tarafından belirtilen eşitliklere uygun şekilde kullanılan programlar tarafından hesaplanmıştır. n A ve n E aşağıdaki şekilde hesaplanmaktadır. n A = r n Ai n E 1 = 2 X i Bu formüllerdeki n A = Her bir lokus için ortalama allel sayısını, n Ai = i lokusundaki toplam allel sayısını, X i = i lokusundaki ortalama allel sayısını, r = çalışılan toplam lokus sayısını ifade etmektedir. Ho, He ve H^ değerleri, populasyondaki gözlemlenen ve beklenen heterozigotluk değerlerini ve ortalama heterozigotluk oranını ifade etmektedir. Nei (1978), Nei (1987) ve Nei ve Kumar (2000) tarafından belirtilen eşitliklere uygun şekilde çalışmada kullanılan programlar tarafından hesaplanmıştır. Gözlenen heterozigotluk gözlenen heterozigot sayısının toplam örnek sayısına oranı alınarak hesaplanmıştır. Nij Ho = N Formüldeki Ho= gözlenen heterozigotluğu, N ij =heterozigot bireylerin sayısını, N=analiz edilen toplam birey sayısını ifade etmektedir. Beklenen heterozigotluğun hesaplanmasında ise aşağıdaki formül kullanılmıştır. 2 He=1- P i Formüldeki He=beklenen heterozigotluğu, P i =allel frekansını ifade etmektedir.

53 39 Ortalama heterozigotluğun hesabında aşağıdaki formül kullanılımıştır. H ^ 2n(1 X i ) = 2n 1 Bu formüldeki H^= ortalama heterozigoluk oranını, n= örneklenen ve genotipi belirlenen birey sayısını, x i = i lokusundaki ortalama allel yoğunluğunu ifade etmektedir. PIC, poliformik bilgi içeriği anlamındadır. Bu değer allel frekansı ile hesaplanır ve ortalama tekrar uzunluğu ile yakin ilişki içerisindedir. PIC değerleri, genetik haritalamada yararlı bir bilgi indeksidir. Bilgi verme açısından PIC değerinin, 0.75 e olması istenmektedir. PIC değerleri aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanmıştır (Botstein vd., 1980). PIC = 1 n i= 1 p 2 i 2 n= 1 n p i i= 1 j= i+ 1 2 p 2 j Formülde PIC=polimorfik bilgi içeriğini, p i =i.ci lokustaki allel sayısını, n= allel sayısını ifade etmektedir. P E, dışlama olasılığı (Probability of Exclusion) babalık testi için rastgele seçilmiş bir bireyin DNA profilinden farklı bir bireyin kesimini vermektedir. CP E, kombine edilmiş dışlama olasılığı (Combined Probability of Exclusion) birden çok mikrosatellit lokusunun birey dışlama olasılığını vermektedir. Dışlama olasılığı ve kombine edilmiş dışlama olasılıkları aşağıdaki formüller kullanılarak hesaplanmıştır (Kimberly, 2001, Brenner ve Morris, 1990b, Jamieson ve Taylor, 1997). P E = h 2 2 ( 1 2hH ) CP E = 1 (1 P Ei ) n i= 1 Formülde P E =dışlama olasılığını, h= heterozigotların sayısını, H=homozigotların sayısını, CP E =kombine dışlama olasılığını ifade etmektedir.

54 40 MP, karşılama veya uyuşma olasılığı (Matching Probability) aynı DNA profiline sahip bireylerin sayısının saptanması olarak tanımlanmaktadır. MP aşağıdaki formül kullanılarak hesaplanmıştır (Kimberly, 2001, Brenner ve Morris, 1990b). MP = n n 2 p ij i= 1 j= 1 Formülde MP= karşılama (Uyuşma) olasılığını, i ve j= allel sıklığını, p 2 ij =beklenen genotip sıklığını ifade etmektedir. P D, ayrımlama gücü (Power of Discrimination) olarak tanımlanır. Karşılama ya da uyuşma olasılığının 1 den farkıdır. Ayrımlama gücünün hesaplanmasında aşağıdaki formül kullanılmıştır (Kimberly, 2001, Brenner ve Morris, 1990b). P D = 1 MP veya P D = 1 p ij n n i= 1 j= 1 Formülde P D = ayrılma gücünü, MP= karşılama (uyuşma) olasılığını i ve j= allel sıklığını, p 2 ij =beklenen genotip sıklığını ifade etmektedir. PI, babalık indeksi biyolojik baba olması muhtemel bireyin rastgele seçilmiş bireyden kaç kere daha güçlü baba olduğunu yansıtmaktadır (Kimberly, 2001; Brenner ve Morris, 1990b). 2 PI 1 = 2H Formülde PI= babalık indeksini, H= homozigotluk derecesini ifade etmektedir. Hardy-Weinberg dengesine uyum, bazı basit varsayımlar altında bir populasyondaki genotip ve allel frekanslarının ne olacağını gösterir. Bu varsayımlar gerçek populasyonların karşılaştığı birçok karmaşık durumun bulunmadığı ideal bir populasyonu belirlemektedir. Denge test edilirken öncelikle genotip frekansları hesaplanır daha sonra genotip frekanslarından allel frekansları hesaplanır. Son olarak ise hesaplanan allel frekansları kullanılarak beklenen genotip frekansları tahmin edilir. Hardy- Weinberg kanununa göre bir çift allelden oluşan bir gen için genotip frekanslarının p 2 + 2pq+ q 2 =1 denklemine uyması beklenir. Çalışmada kullanılan mikrosatellit

55 41 lokuslarından elde edilen bilgilerin Hardy-Weinberg dengesine uygun olup olmadığını bir başka ifade ile gözlenen ve beklenen frekanslar arasındaki bağlantıyı bulmak için ki-kare (χ 2 ) testi kullanılmıştır. Ki-kare (χ 2 ) testi için kullanılan formül aşağıdaki gibidir. X 2 ( G B ) = i B i i 2 Formülde χ 2 = Ki-kare testini, G i =i kategorisi için gözlenen değeri, B i =i kategorisi için beklenen değeri ifade etmektedir.

56 42 4. BULGULAR ve TARTIŞMA Çok sayıda lokusla çalışılması nedeniyle, her örnek için önce lokuslar bazında, sonra tüm lokuslar için gözlenenboyut aralığı (GBA) alel sayıları (n A ), etkili allel sayısı (n E ) gözlenen heterozigotluk (Ho) ve beklenen heterozigotluk (He) değerleri, ortalama heterozigotluk değerleri (H^) ve polimorfik bilgi içeriği (PIC) değerleri hesaplanarak allelik varyasyonlar saptanmıştır. 10 mikrosatellit lokusundan bu değerlere ilişkin elde edilen bulgular Çizelge 4.1 de, çalışmada kullanılan 10 mikrosatellit lokusuna ait elde edilen alleller ve frekanslarının dağılımı ise EK-1 de verilmiştir. Çizelge 4.1.Çalışmada kullanılan mikrosatellitlere ait gözelenen boyut aralığı (GBA), örnek sayısı (N), allel sayısı (n A ), gözlenen heterozigotluk (Ho), beklenen heterozigotluk (He), polimorfik bilgi içeriği (PIC) ve Ortalama heterozigotluk (H^) değerleri Lokus GBA N n A n E Ho He H^ PIC OarCP34 112/ ,247 0,841 0,765 0, OarFCB193 96/ ,323 0,774 0,699 0, OarFCB / ,440 0,800 0,816 0, OarJMP29 110/ ,876 0,770 0,795 0, OarFCB / ,902 0,541 0,744 0, BM / ,355 0,726 0,702 0, OarJMP58 143/ ,921 0,748 0,831 0, OarVH72 123/ ,893 0,798 0,830 0, MAF65 121/ ,436 0,823 0,709 0, DYMS1 181/ ,128 0,763 0,805 0, Ort ,5 4,55 0,758 0,773 0,770 SS 2,838 1,032 0,083 0,053 0, mikrosatellit lokusunda toplam 105 allel tespit edilmiş, bu allelerden 6 tanesi OARCP34, 13 tanesi OarFCB193, 13 tanesi OarFCB304, 13 tanesi OarJMP29, 11 tanesi OarFCB128, 8 tanesi BM8125, 14 tanesi OarJMP58, 9 tanesi OarVH72, 7 tanesi MAF65 ve 11 tanesi DYMS1 lokusunda gözlemlenmiştir. Bu değerler incelendiğinde 10 farklı mikrosatellit lokusuna ait allel sayısının 6 ile 14 arasında değiştiği ve en yüksek ve en düşük polimorfizm gösteren lokusların sırasıyla OarJMP58 ve OarCP34 olduğu görülmektedir.

57 43 Kullanılan 10 mikrosatellit lokusundan en yüksek sayıda alleli veren OarJMP58 (14 allel) isimli mikrosatellit lokusunu OarFCB193 (13 allel), OarFCB304 (13 allel) ve OarJMP29 (13 allel) lokusları izlemiştir (Çizelge 4.1). Lokus başına ortalama allel sayısı 10,5 olarak bulunmuştur. Vembur koyunlarında mikrosatellitler ile genetik karakterizasyon yapılmıştır. Çalışmada, 25 mikrosatellit kullanılmış ve 147 allel elde edilmiştir. Kullanılan 25 mikrosatellitten BM8125, OarFCB128, OarJMP29 ve OarVH72 lokuslarına ait allel sayıları sırasıyla; 6, 5, 7 ve 5 olmuştur (Pramod vd., 2009). Kıvırcık, Türkgeldi, Akkaraman, Konya Merinosu ve İvesilerde OarFCB304, OarFCB20 ve MAF65 isimli mikrosatellit lokusları ile yapılan çalışmada, He oranlarının 0,726 ile 0,782 arasında değiştiği bildirilmiştir. OarFCB20, OarFCB304 ve MAF65 lokusuna ait allel sayılarının Kıvırcıkta 11, 8 ve 7, Türkgeldi koyununda 7, 8 ve 5, Akkaraman koyununda 9, 13 ve 6, Konya Merinosunda 7, 9 ve 5 İvesilerde ise 8, 12 ve 6 olarak bulunduğu bildirilmiştir (Soysal vd., 2005). Weir ve Cockerham (1984) tarafından yapılan bir çalışmada en yüksek ve en düşük polimorfizm gösteren lokusların OarJMP29 ve OarVH72 olduğunu bildirilmiştir. Elde edilen bu bulgular Weir ve Cockerham tarafından belirtilen sonuçlarla uyum göstermemesine rağmen Soysal vd (2005) tarafından OarFCB304 ve MAF65 için bildirilen değerlerle uyum içindedir. Sunulan çalışmada tüm lokuslar değerlendirildiğinde Ho ve He değerlerinin sırasıyla; 0,541 ile 0,841 ve 0,699 ile 0,831 arasında değiştiği görülmektedir. En yüksek Ho değerinin OarCP34 e (0,841), en düşük Ho değerinin ise OarFCB128 e (0,541) ait olduğu ve tüm lokuslar için ortalama heterozigotluk değerinin 0,770 olduğu bulunmuştur. Ülkemizde yetiştirilen Akkaraman x Alman Siyah Baş Melezi, Akkaraman, Alman Siyah baş koyunu, Hasak, Hasmer, Karacabey Merinosu ve Konya Merinosunun OarFCB20, OarJMP58 ve OarJMP29 isimli mikrosatellit lokusları bakımından genetik yapılarının incelendiği çalışmada bu ırklarda ortalama He değerinin 0,790-0,867 arasında ortalama Ho değerinin ise 0,762-0,857 arasında değiştiği bildirilmektedir (Bulut 2004).

58 44 İvesi koyunlarında OarFCB128, OarFCB20 ve OarFCB304 mikrosatellit lokusları ile yapılan bir çalışmada elde edilen He değerleri sırasıyla; 0,826, 0,896 ve 0,855 olarak bulunmuştur (Eliçin, 2007). Pag Island koyunlarında mikrosatellitler ve mtdna verilerine dayalı olarak yapılan genetik tanımlama çalışmasında elde edilen He oranları MCM42 için 0,773, MCM527 için 0,852, MAF65 için 0,828, MAF214 için 0,826, TGLA53 için 0,825, OarCP49 için 0,859 ve OarAE119 için ise 0,833 olarak bulunmuştur. Ayrıca çalışmada ortalama He değerinin 0,833 olduğu bildirilmiştir (Ivankovic vd., 2005). Koyunlarda ve diğer bazı çiftlik hayvanlarında yapılan bazı çalışmalarda elde edilen beklenen heterozigotluk (He) oranlarına ilişkin bilgiler Çizelge 4.2 de özetlenmiştir. Çizelge 4.2 Bazı çiftlik hayvanlarında mikrosatellitlerle yapılan çalışmaların He bakımından karşılaştırılması Tür ismi Lokus Sayısı Irk Sayısı He Kaynak Keçi ,560-0,670 arası Luikart vd. (1999) Keçi 9 1 0,298-0,880 arası Jimenez-Gamero vd. (2006) Keçi ,617-0,825 arası Araujo vd. (2010) Koyun ,633-0,796 arası Handley vd. (2007) Koyun ,679-0,763 arası Tascon vd. (2000) Koyun ,530-0,772 arası Tapio vd. (2005) Koyun ,574-0,760 arası Grigaliunaite vd. (2003) Koyun ,577-0,853 arası Pramod vd. (2009) Sığır 7 1 0,314-0,833 arası Cerit (2003) Sığır ,625-0,857 arası Rehout vd. (2006) Koyun ,699-0,831 arası Bu çalışmada bulunan değer Çalışmada kullanılan OarFCB128, OarFCB304 ve MAF65 isimli üç mikrosatellit lokusu değerlendirildiğinde bunlara ait He değerlerinin aynı lokuslarla çalışılan literatürlerde bildirilen değerlerden düşük olduğu görülmektedir.

59 45 Bazı çiftlik hayvanı türlerinde mikrosatellitler ile yapılan çalışmaların sonuçları (Çizelge 4.2) değerlendirildiğinde Karya koyunlarda genetik çeşitiliğin, mikrosatellitlerle yapılan bazı çalışmalarda bildirilen değerlerden yüksek olduğu görülmektedir. Bu durumun, çalışılan lokusların yüksek düzeydeki heterozigotluğundan veya Karya koyununun oluşumuna birden çok ırkın katkı yapmasından ya da Türkiye nin coğrafi açıdan koyun evcilleştirme kaynaklarına yakın oluşundan kaynaklanmış olabileceği düşünülmektedir. OarCP34, OarJMP29, OarFCB128, OarVH72 ve DYMS1 isimli mikrosatellitl lokusları için gözlenen boyut aralıklarının FAO ve ISAG tarafından belirtilen boyut aralıklarında olduğu ancak OarFCB193, OarFCB304, BM8125, OarJMP58 ve MAF65 isimli mikrosatellit lokuslarında gözlenen boyut aralıklarının ise belirtilen değerlerden farklı olduğu görülmektedir. Bu durum, çalışmalarda kullanılan ırkların farklılığından kaynaklanmış olabilir. Polimorfik bilgi içeriği bakımından OarJMP58 (0,815) ve OarVH72 (0,811) isimli mikrosatellit lokusları diğerlerine göre yüksek değerler almışlardır. Elde edilen PIC değerlerinin 0,653 ile 0,815 arasında değiştiği görülmektedir. Daha önce bahsedildiği gibi PIC değerinin 0,75 ve üzeri bir değer alması istenmektedir. Bu bağlamda çalışılan lokuslar incelendiğinde en düşük PIC değerini OarFCB193 (0,653) lokusunun gösterdiği bunu MAF65 (0,659) ve BM8125 (0,669) lokuslarının takip ettiği görülmektedir. Çalışmada, PIC değeri düşük olan lokusların daha düşük P D değeri aldığından bahsedilebilir. Bu nedenle babalık testi çalışmalarında yüksek PIC değerine sahip lokusların kullanılması gerektiği sonucuna ulaşılmıştır. Bunun yanı sıra bu çalışmalarda dikkat edilmesi gereken diğer parametreler ise babalık indeksi tanımlama gücü değerleridir. Kullanılan mikrosatellit lokuslarından elde edilen homozigotların oranı (Hom %), heterozigotların oranı (Het %), babalık indeksi (PI), tanımlama gücü (P D ) ve karşılama (uyuşma) olasılığı (MP) değerleri hesap edilmiştir. Elde edilen bu parametrelere ilişkin bilgiler Çizelge 4.3 de verilmiştir.

60 46 Çizelge 4.3 Homozigot ve heterozigotların oranı, Babalık İndeksi (PI), Tanımlama Gücü (P D ) ve MP (karşılama olasılığı) değerlerine ilişkin bilgiler Lokuslar Hom.(%) Het.(%) PI P D MP OarCP34 15,93 84,07 3,14 0,89 0,109 OarFCB193 22,61 77,39 2,21 0,85 0,149 OarFCB304 20,00 80,00 2,50 0,93 0,069 OarJMP29 23,01 76,99 2,17 0,93 0,072 OarFCB128 45,95 54,05 1,09 0,89 0,110 BM ,43 72,57 1,82 0,88 0,120 OarJMP58 25,22 74,78 1,98 0,94 0,062 OarVH72 20,18 79,82 2,48 0,95 0,054 MAF65 17,69 82,30 2,83 0,85 0,155 DYMS1 23,68 76,32 2,11 0,94 0,064 Çizelge incelendiğinde OarCP34 ve MAF65 isimli STR lokuslarının babalık indeksi değerlerinin diğerlerine oranla nispeten daha yüksek olduğu görülmektedir. PI değeri ne kadar yüksekse ilgili allelin babadan yavruya geçme olasılığı da o oranda yüksek olmaktadır. Çalışmada, biyolojik baba olması muhtemel bireyin, rastgele seçilmiş bir bireyden OarCP34 için 3,14 kat, MAF65 için 2,83 kat ve OarFCB304 için 2,5 kat daha güçlü baba olduğunu göstermektedir. Çizelge 4.3 değerlendirildiğinde babalık indeksi bakımından OarCP34, OarFCB304, OarVH72 ve MAF65 lokuslarının diğerlerine göre nispeten yüksek değerler aldığı görülmektedir. Aynı DNA profilini bulunduran birey sayısının saptanmasını sağlayan karşılama olasılığı değerleri (MP) Çizelge 4.3 de görüldüğü gibi 0,054-0,154 arasında bulunmuştur. Karşılama (uyuşma) olasılığı (MP) bireylerin birbirine olan yakınlığının bir göstergesidir. Bireylerin akrabalık derecesi ne kadar yüksek olursa aynı alleli taşıma olasılığı da o oranda yükselmektedir. Bu değerin düşük bulunması allelerin ilgili populasyonda bir araya gelmesinin düşük sıklıkta olacağını ifade etmektedir (Kimberly, 2001). Çalışmada, OarFCB128 için elde edilen PI değeri (1,09) Cerit vd., (2003) tarafından Kıvırcık koyunlarda yapılan çalışmada OarFCB128 lokusu için elde edilen değerden (2,333) düşük, çalışmada aynı lokus için elde edilen MP değerinin (0,110) Kıvırcık koyunlarda yapılan çalışmada elde edilen değerden (0,073) yüksek olduğu görülmektedir. Bu durumun gerçekleşmesinde, iki çalışmada farklı ırkların kullanılmasının etkili olduğu düşünülmektedir.

61 47 Kullanılan mikrosatellit lokusları bakımından homozigot bireylerin oranının %15,93 ile %45,95 arasında olduğu heterozigotlarının oranının ise %54,05 ile %84,07 arasında dağıldığı görülmektedir. Bu değerler bize çalışılan mikrosatellitler bakımından deneme materyali olan hayvanların heterozigotluk oranının yüksek olduğunu göstermektedir. Allel sayılarına ilişkin bulgular ışığında yüksek sayıda allel veren lokusların ayrımlama gücünün de (P D ) diğerlerine göre nispeten yüksek olduğu söylenebilir. Bütün lokuslar göz önüne alındığında P D değerinin >0,80 olduğu görülmektedir. Bu durum, çalışmalarda yüksek sayıda allel veren mikrosatellitlerle çalışılması durumunda daha isabetli sonuçlar alınacağını göstermektedir. Babalık testi çalışmalarında gerçek babaların yüksek isabetle belirlenmesi ve rastgele seçilmiş bireylerin dışlanması oldukça önemli bir kriterdir. Babalık testinin temelini oluşturan ve ilk defa Fisher (1951) tarafından tanımlanan dışlama olasılığı (P E ) değerleri hesaplanmıştır. Çalışmada kullanılan 10 mikrosatellit lokusu için artan lokus kombinasyonlarına göre (CP E ) ve lokusların bireysel dışlama olasılıklarına (P E ) göre iki farklı dışalam olasılığı değeri hesaplanmıştır. Dışlama olasılığı (P E ) test edilen babanın, yavrunun gerçek biyolojik babası olup olmadığını göstermektedir. Kullanılan lokuslardan elde edilen bireysel P E değerleri Çizelge 4.4 te bu değerlerin değişimini gösteren grafik ise Şekil 4.1 de verilmiştir. Çizelge mikrosatellit lokusuna ait bireysel dışlama olasılıkları (P E ) Lokus P E (n:117) OarCP34 0,364 OarFCB193 0,295 OarFCB304 0,471 OarJMP29 0,433 OarFCB128 0,365 BM8125 0,307 OarJMP58 0,514 OarVH72 0,498 MAF65 0,293 DYMS1 0,453 Genel 0,994

62 48 Şekil 4.1. Lokuslara ait bireysel dışlama olasılıklarının (P E ) değişimi Kullanılan lokusların bireysel dışlama olasılıkları değerlendirildiğinde en yüksek değeri OarJMP58 isimli lokusun gösterdiği (P E =0,514) bunu OarVH72 isimli lokusun takip ettiği (P E =0,498) görülmektedir. 10 mikrosatellit lokusunun aldığı dışlama olasılığı değerleri 0,295 ile 0,514 arasında değişmiştir (Çizelge 4.4). Arruga vd. (2001) tarafından Rasa Aragonesa koyunlarında yapılan babalık testi çalışmasında MAF50, MAF18, OarFCB20 ve MCM527 isimli mikrosatellit lokuslarının bireysel dışlama olasılıklarının (P E ) sırasıyla 0,35, 0,32, 0,68 ve 0,50 olduğu bildirilmiştir. Başka bir çalışmada ise DYMS1, OarFCB304, OarJMP58, OarJMP29, MAF65 ve BM8125 lokusları için P E değerleri 0,82, 0,60, 0,88, 0,69, 0,63 ve 0,82 olarak bildirilmiştir (Quanbari vd., 2007). Kullanılan lokusların bireysel dışlama olasılıkları değerlendirldiğinde en düşük dışlama olasılığı değerinin 0,293 ile MAF65 lokusuna, en yüksek dışlama olasılığı değerinin ise 0,514 ile OarJMP58 lokusuna ait olduğu görülmektedir. Elde edilen bu değerler konuyla ilgili yapılan bazı çalışmalarda bildirilen değerlerle uyum göstermektedir (Robert ve Thomas 2003). Çalışılan MAF65 lokusu bakımından elde edilen P E değeri (0,293) Ivankovic vd. (2005) tarafından yapılan çalışmada elde edilen P E değerinden (0,476) düşük bulunmuştur.

63 49 Marshall vd., (1998) tarafından yapılan bir çalışmada, OarFCB193 ve OarFCB304 isimli mikrosatellit lokuslarında elde edilen P E değerleri sırasıyla 0,423 ve 0,415 olmuştur. Çalışmada elde edilen P E değerleri incelendiğinde OarFCB193 lokusunun belirtilen çalışmadan daha düşük bir değer aldığı görülmektedir. Ancak OarFCB304 lokusundan elde edilen dışlama olasılığı değeri ise belirtilen çalışmadan yüksek olmuştur. Çalışmada bireysel dışlama olasılığının yanı sıra artan lokus kombinasyonlarına göre kombine dışlama olasılığı (CP E ) değerleri de hesaplanmıştır. CP E değerleri kullanılan lokusların farklı kombinasyonları ile elde edilmiştir. Artan sayıda lokus kombinasyonlarına göre elde edilen dışalama olasılığı değerleri (CP E ) Çizelge 4.5 te, bu değerlerin değişimi ise Şekil 4.2 de verilmiştir. Elde edilen bulgulardan anlaşıldığı gibi lokus sayısı artıkça dışlama olasılığı daha yüksek bir seğer almaktadır. Dışlama olasılığı değernin artması gerçek biyolojik babanın daha yüksek bir isabetle tespit edildiğini göstermektedir. Çizelge 4.5. Artan lokus kombinasyonlarına göre kombine edilmiş dışlama olasılıkları (CP E ) n CP E 117 0,3638 0,5517 0,7627 0,8655 0,9146 0,9408 0,9713 0,9856 0,9898 0, OarCP34 2 OarCP34/OarFCB193 3 OarCP34/OarFCB193/OarFCB304 4 OarCP34/OarFCB193/OarFCB304/OarJMP29 5 OarCP34/OarFCB193/OarFCB304/OarJMP29/OarFCB128 6 OarCP34/OarFCB193/OarFCB304/OarJMP29/OarFCB128/BM OarCP34/OarFCB193/OarFCB304/OarJMP29/OarFCB128/BM8125/OarJMP58 8 OarCP34/OarFCB193/OarFCB304/OarJMP29/OarFCB128/BM8125/OarJMP58/OarVH72 9 OarCP34/OarFCB193/OarFCB304/OarJMP29/OarFCB128/BM8125/OarJMP58/OarVH72/MAF65 10 OarCP34/OarFCB193/OarFCB304/OarJMP29/OarFCB128/BM8125/OarJMP58/OarVH72/MAF65/DYMS1 Kombine edilmiş dışlama olasılıkları değerlendirildiğinde CP E değerlerinin 0,3638 ile 0,9944 değerleri arasında değiştiği görülmektedir. 10 mikrosatellit işaretleyicinin kombinasyonu sonucunda elde edilen CP E değerinin 0,9944 olduğu görülmektedir.

64 50 Şekil 4.2. Artan lokus kombinasyonlarına göre kombine edilmiş dışlama olasılıklarının (CP E ) değişimi Sunulan çalışmada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ve 10 mikrosatellit lokusunun kombinasyonu ile elde edilen değerler sırasıyla 0,5517, 0,7627, 0,8655, 0,9146, 0,9408, 0,9713, 0,9856, 0,9898 ve 0,9944 olarak bulunmuştur (Çizelge 4.5). Bu değerler incelendiğinde 0,90 değerine 5 lokus kombinasyonu ile ulaşılırken babalık testleri için güven sınırı olarak kabul edilen 0,99 değerine 10 mikrosatellit lokusunun kombinasyonu ile ulaşılmıştır. Bu durum çalışmada kullanılan 10 mikrosatellit lokusunun Karya koyunlarda babalık testlerinde yüksek düzeyde güvenilirlikle kullanılabileceğini göstermektedir. Çalışmada 10 mikrosatellit lokusunun kombine edilmesi ile elde edilen CP E değeri küçükbaşlarda yapılan çalışmalar ile karşılaştırıldığında elde edilen değerlerin kimi literatürde belirtilenlerden düşük çıktığı görülmektedir (Quanbari vd., 2007; Zhao vd., 2006; Bolormaa vd., 2008; Jimenez-Gamero vd., 2006; Luikart vd., 1999; Ganai ve Yadav, 2005; Araujo vd., 2010). Bu durum yapılan çalışmalardaki çalışılan lokus sayıları ile doğrudan ilgilidir. Belirtilen literatürler incelendiğinde bu çalışmalarda 10 mikrosatellit lokusundan daha fazla lokusla çalışıldığı görülmektedir. Bu nedenle babalık testi çalışmalarında fazla sayıda lokus kullanılması daha isabetli dışlama olasılığı değerlerinin elde edilmesini sağlamaktadır.