Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 Prof.Dr. Dilek AK /5. DERS BİYOLOJİK SIVILAR

Transkript

1 1 Biyolojik Örneklerde İlaç Analizi ECZ 344 Prof.Dr. Dilek AK /5. DERS BİYOLOJİK SIVILAR

2 İDRAR 2 İdrarın % 95 i sudur. % 5 i, şekerler, amino asitler, kreatinin, üre ve diğer metabolizma ürünleridir. İdrarın fiziksel ve kimyasal bileşimi oldukça değişkendir, diyetin türü ve bileşimi ve endojen metabolitlerin miktarı ile değişir. Ayrıca kilo, duygu durumu metabolizma hızı vb de bağlıdır. Taze idrar berraktır, ancak bekleyen idrarda, idrar yollarından gelen mukus varlığı veya lipitlerin bozulmasına bağlı olarak bulutumsu, bulanık bir görünüm veya topaklı çökelti oluşur.

3 İDRAR 3 Elde edilmesi kolay olduğu için ilaç analizinde en yaygın kullanılan biyolojik örneklerden biridir. Numune alma sırasında, kadınlar için mens dönemi, erkekler için sperm bulaşması konularında dikkatli olmak gerekir. Farmakokinetik çalışmalarda detaylı talimatlara göre 24 saatlik idrar temiz kaplara toplanır. Bakteriyel degredasyon ve dondurarak bekletme gibi durumlarda koruyucu maddelerin eklenmesi gerekebilir. İdrar stabilitesini sağlamak için numune alma ve analiz arasındaki zamanı kısa tutmak en iyi çözümdür.

4 İDRAR 4 İdrar, plazma veya serumdan farklı olarak protein ve lipid içermez. Organik bir çözücüyle doğrudan ekstre edilebilir. Bileşim olarak geniş bir çeşitliliğe sahiptir; gün boyunca açık renkli olmasına rağmen gece sonunda sabah ilk idrar koyu amber renklidir. İdrarda bulunan bileşikler normalde suda çözünür özelliktedir. İlaçların çoğu yağda çözünür ve uygun bir çözücü ile idrardan doğrudan ekstre edilebilir.

5 İdrar 5 En büyük güçlüklerden biri sabit zaman aralıklarında üretilebilen idrarın hacmidir. Analitik testlerin çoğunda sabit bir numune hacmi ile analiz yapmak yaygın bir uygulamadır. Üriner atılma ile belirli aralıklarla ilgili maddenin bir miktarı atılır ve derişim yerine derişimle hacmin çarpımından bulunan miktarı değerlendilir. Burada problem 2 misli olur. İdrar hacmi fazla ise numune seyreltiktir ve yöntem saptama sınırı yakınlarında işleyebilir ve düşük derişimlerde kanıtlanamayan hatalar hacim için ayarlamalarda misli olarak artacaktır. İdrar ile atılım miktarının değerlendirilmesinde büyük bağıl hatalar büyük mutlak hataya dönüşür.

6 İdrar 6 Bu yüzden tek bir hastadan toplanan idrarların bir serisinde, bireysel idrar numuneleri farklı hatalara maruz kalacaktır ve toplam ilaç atılmasında önemli ölçüde belirsizlik olacaktır. Toplam ilaç atılımının sonuçları değerlendirilirken bu faktörü göz önüne almak gerekir.

7 İdrar 7 Örneğin bir yarışın ardından rasgele seçilen ve test numuneleri alınmış olan atletlerin idrarlarındaki özellikle kafeinin anormal miktarlarına karşılık gelen tayinlerinde benzer problemler ortaya çıkar. Sporcuların idrarında kafein için bir derişim sınırı vardır; ancak atlet özellikle ter vb su kaybına maruz kaldığı zaman idrar çok derişik olabilir ve kafeinin normal düzeyi kolayca yasaklı düzeye dönüşür. Spor otoriteleri problemin bilimsel olmayan görünüşü ve yorumlanmasını değerlendirirken dikkatli olmalıdır. Diğer taraftan idrar numunesinin içeriği hatalı negatiflere neden olabilir.

8 İdrar 8 İdrar geniş bir ph aralığına sahiptir. İçeriği diyete veya ilaç kullanımına bağlıdır. Örneğin antiasitler absorbe olursa idrarı alkali yapabilir; kuvvetli asit idrar daha az görülür. İdrar için normal ph aralığı dir. Atılan ilacın davranışı bu durumda ph ya bağlıdır. Amfetamin gibi zayıf bazik ilaçlar asit idrarda, zayıf asidik ilaçlar ise alkali idrarda daha fazla atılırlar.

9 İdrar 9 Bekletilen idrar karbondioksitini yavaşca kaybeder ve daha alkali olur bu da inorganik fosfatların çökmesine yol açar. ph değişikliğine ilave olarak bu durum analitin bozunmasına da yol açabilir. Analit bu fosfatlarla da çökebilir ve analiz için kaybedilir. Bu yüzden bekletilmiş idrar taze idrardan farklı bir bileşime sahip olacaktır. Analitik yöntem ve bu matrikste ilacın stabilitesinin sağlanması her iki tipin özellikleri için değerlendirilmelidir.

10 İdrar 10 Kantitatif çalışmalarda kullanıldığı zaman idrar ile ilgili önemli diğer bir konu numune alma yöntemi ve alınan numune miktarıdır. Acaba hasta mesanesini tamamen boşaltmış mıdır, böylece belli bir zaman periyodunda ilaç ya da metabolitinin tamamı idrara geçen miktar olarak hesaplanabilir mi? Hastadan bir numune sağlaması istendiğinde minimum düzeyde idrar verebilir ve bu orta bir numune yerine ilk yakalanmış düzey olabilir ve numune bütünü temsil etmeyebilir.

11 Numune Hazırlama 11 Bir çok ilaç idrar ile konjugatları halinde atılır. Bu nedenle analizden önce dekonjugasyon işlemi için asit hidroliz veya beta glukuronidaz enzimi ile hidroliz edilir. İlacın kanda kaybolması, idrarda ortaya çıkmasına neden olur. Genellikle seyreltme ve tamponlama işlemi uygulanır. İçeriğinde katı varsa santrifüj veya süzme işlemi uygulanır.

12 12 İdrarın Asit Hidrolizi 5 ml idrar üzerine iç standart ve 500 µl derişik hidroklorik asit eklenir ve karıştırılır. Otoklav: 121 o C de20 dk tutulur Su banyosu: (kaynayan su ortamı) 20 dk tutulur. Isıtıcı blok: 90 o C de 30 dk tutulur. Soğutulduktan sonra 10 dk 670 g de santrifüj edilir, pellet atılır. 1 ml 7.4 M NH 4 OH eklenir ve karıştırılır. Numune ph sı 6.0 ± 0.5 değerine fosforik asit ile ayarlanır.

13 13 İdrarın enzimatik hidrolizi 5 ml idrara 2 ml ß-glukuronidaz çözeltisi eklenir. ß-glukuronidaz çözeltisi ph 5.0 olan 1.0 M asetat tamponu içerisinde hazırlanır. 65 o C de 3 saat hidroliz edilir ve soğutulur. 670 g de 10 dk santrifüj edilir ve pellet atılır. Numune ph sı 6.0 ± 0.5 değerine 700 µl 1.0 M NaOH ile ayarlanır.

14 SÜT 14 Süt ilaçların analizi için çok alışılmış bir sıvı değildir, ancak anneden bebeğe bu yolla ilaçların geçip geçmediğini belirlemek için nadiren ilgilenilir. Çoğunlukla idrar veya serum için uygulanan mevcut yöntemler fazla güçlükle karşılaşmadan anne sütüne de uygulanabilir. Temel problem sütte bulunan yağlardır. Ergin insan meme sütünde yaklaşık % 4,5 yağ bulunur. Fillokuinon için önerilen bir yöntemde, HPLC analizinden önce numunedeki yağları hidroliz etmek için lipaz enzimi kullanılmıştır. Alternatif olarak plazma numuneleri için yukarıda önerilen yağdan arındırma basamakları yeterli olabilir, insan sütünde fenoksikam analizi için yağlar 0,5 ml sütün ph 3-4 e tamponlanıp 10 ml n-hekzanla yıkanmasıyla uzaklaştırılmıştır.

15 BEYİN OMURİLİK SIVISI 15 Beyin omurilik sıvısı, ilaçların ve doğal biyolojik ajanların plazma veya serumda tayin edilenlere göre, etki yerine daha yakın olduğu düşünülen diğer bir biyolojik sıvıdır. Bu sıvıda genellikle ağrı kesici (pain-killing) aktiviteli ilaçların analizine yönelik uygulamalar bulunur. Analiz numunelerinin kolayca elde edilememesine karşın, numune mevcut ise plazma veya serum için geliştirilmiş olan yöntemler kolayca uygulanabilir. Bu tip modifiye olmayan tayinler beta endorfinler ve diğer peptidler ve yanısıra enkefalin, morfin ve nimodipin için bildirilmiştir.

16 SAFRA 16 Safra, ilaçların analizinde çok sık kullanılmayan kompleks ve değişken bir sıvıdır. Analiz numunesi sağlanması kolay değildir. Ayrıca araştırılan proses ile girişim yapabilecek, safra uzaklaştıran herhangi bir sistem analizde zorluklara neden olabilir. Özellikle konjugasyon enzimleri ile ilgili araştırmaların yapıldığı in vivo karaciğer perfüzyon çalışmalarında, safra, analiz numunesi olarak kullanılır. Diğer sıvılar için geliştirilmiş uygun yöntemler safra için kolayca uygulanamaz. Örneğin kan, idrar, vitrös humör ve BOS da morfin için ticari RIA kitleri kullanılarak doğrudan analiz yapılabilir, ancak safra analizlerinde numunenin bazik yapılması ve diklorometan:propanol ile ekstre edilmesi gerekir ve kalıntı serumda çözüldükten sonra analiz yapılır.

17 TÜKRÜK/SALYA 17 Salya, renksiz, saydam veya yarı saydam, düşük viskoziteli bir sıvıdır. İlaç analizi için cazip olmasının nedeni, girişim yapan maddelerden bağıl olarak uzak olması, organik çözücülerle kolayca ekstre edilmesi ve kanda proteine bağlı olmayan ilaç düzeyini yansıtmasıdır. Steroidler gibi iyonize olmayan ilaçlar, plazmadan salyaya kolayca geçebilir ve bu yol ilaç izlemenin noninvaziv bir yöntemini temsil eder.

18 18 Salya, ağız boşluğunda başlıca üç salgı bezi tarafından salgılanır: (1) Parotid gland: Ağız boşluğu tavanında bulunur, kan plazmasından kaynak alan salyanın salgılanmasından sorumludur (Seröz sıvı) (2) Sublingual gland: Ağız boşluğunun yan taraflarında bulunur, hem seröz sıvı hemde musin salgılar. (3) Submandibular gland: Bademciklerin altında bulunur, hem seröz sıvı hem musin salgılar. Musin salyaya yapışkan özellik kazandırır.

19 TÜKRÜK/SALYA 19 Normal kişiler 24 saatte 2 litre salya üretebilir. Yemekler arasında 15 ml/saat altında ya da üzerinde devamlı akış sağlar. Uyarılmamış salyanın ph değeri aralığındadır. Uyarıldığında max ph 8.0 olur. Uygun zaman sürecinde uygun bir numunenin toplanması güç bir işlemdir, ancak parafilm gibi bir inert materyal çiğneyerek veya sitrik asit kullanarak glandların uyarılması ile daha büyük numuneler kolayca elde edilebilir. Schramm ve arkadaşları ağız içine yerleştirilen poliüretan bağlı selüloz yarı geçirgen membranlarda hapsedilmiş sukroz granülleri içeren bir cihazı ultrafiltre salya toplamak için kullanmış ve değerlendirmişlerdir. Bu dâhice cihaz sıvının toplanması ve işlenmesi ile ilgili bazı problemleri ortadan kaldırmıştır. Uyarılmış salyanın kendi ph değeri ile daha uyumlu olduğu da bildirilmiştir (ph 7.0 ile 7.8 arası).

20 Salya, Kan, Plazma ve Serum bileşimlerinin karşılaştırılması 20 Salya Kan Plazma Serum Su 99.5% % 90-95% Özgül ağırlık ph Toplam protein 262 mg/100ml mg/100 ml Toplam lipit 2.8 mg/100 ml mg/100 ml - Fibrinojen mg/100 ml - Kolestrol <1 mg/100ml mg/100ml Klorür mg/100 ml 300 mg/100ml 350 mg/100ml 350 mg/100ml Hemoglobin 0 15 g/100 ml - - -

21 Salya 21 Salyadaki ilaçların tayini için analitik yöntem geliştiren araştırmacılar plazma veya serum gibi diğer sıvılar için mevcut yöntemlerin salyadaki analizlere uygulanmasında önemli güçlüklerle karşılaşmamışlardır. Bu durum terapötik ilaç izleme ve adli uygulamalarda önemli kolaylık sağlar. Karşılaşılan küçük problemler ise salyada bulunan mukoit proteinlere ilaçların (örn. fenitoin) adsorpsiyonu ve ilaçların uyarıcı materyal tarafından seyrek de olsa adsorbe edilmesidir. Salyada ilaçların analizi ile ilgili temel problem teknolojik bir problem değildir. Ancak böyle analizlerin sonuçlarının uygunluğu belirlenmelidir.

22 Salya 22 Kandan salyaya ilacın transferinin pasif difüzyon ile olduğu kabul edilirse, salya ve kan derişimleri arasındaki ilişki teorik olarak ifade edilebilir. Araştırmacılar beklenen düzeylerin analitik kapasiteleri içerisinde olup olmadığına karar verebilirler ve salya içerisindeki analitik değerler elde edilirse kandaki derişimleri belirlemek için uygun ekstrapolasyonlar yapabilirler. Henderson- Hasselbach eşitliğini uygulayarak zayıf bir asidin salya ve plazmadaki ilaç derişimleri oranı şöyle ifade edilebilir:

23 Salya 23 Plazma ve salyadaki zayıf asit ilaçlar için derişim oranı Oran= salya ph pka plazmada bağlı olmayan fraksiyon plazma ph pka x salyada bağlı olmayan fraksiyon Plazma ve salyadaki zayıf bazik ilaçlar için derişim oranı 1+ 10(pKa salya ph) plazmada bağlı olmayan fraksiyon Oran = (pka plazma ph) x salyada bağlı olmayan fraksiyon Salyadaki ilaç derişimi salyanın ph sına ve uyarılma derecesine bağlıdır.

24 Salya 24 Plazma phsı 7.4 olduğunda ve asit ve baz ilaçların salya/plazma oranları hesaplandığında salyada protein bağlanmasının minimum olduğu gösterilmiştir. Salyanın ph sı dağılım üzerine dramatik etkiye sahip olabilir. Düşük ph larda ve plazma proteinlerine %99 bağlanan asidik ilaçlar için salyadaki derişim plazmadakinin katı olabilir. Bu yüzden anlamlı bir yorum için salya toplandığında ph sını ölçmek önemlidir.

25 BLİSTER SIVISI 25 Blister sıvısı (yeni bir ayakkabının ayakta içi sulu kese oluşturması, yanık sırasında oluşan kese, sürtünme nedeniyle el ve ayakta tahriş, kimyasal maruziyeti gibi) hafif iltihaplı reaksiyonlarda salınan ve interstisyal sıvıya benzer olan bir sıvıdır ve protein ve lipid içerir. İbuprofenin farmokokinetiğinin çalışılmasında kullanılmıştır.

26 SİNOVİAL SIVI 26 Eklem kıkırdakları arasında bulunan sıvıdır. Antiinflamatuar ilaçların sinovial sıvıda analizi için HPLC ile yapılan analizler plazma için kullanılanlar ile aynıdır. Eklem romatizmalı hastaların sinovial sıvı ve plazmasında flurbiprofenin enantiyomerlerinin analizi için benzer yöntemler kullanılır; sinovial sıvının sınırlaması sadece numunenin küçük miktarıdır. Diklofenak tayininde plazma için kullanılan ekstraksiyon yöntemi sinovial sıvı için de aynı şekilde kullanılmıştır.

27 AKÖZ HUMOR 27 Kornea ile lens arasını dolduran sıvıdır. İmipenemin bu sıvıdaki HPLC yöntemi ile analizi, plazmadaki tayini için kullanılan yöntem ile aynıdır.

28 İlginiz için teşekkür ederim. 28