PROTEİN CHIP LERİ. Suna TİMUR

Transkript

1 PROTEİN CHIP LERİ Suna TİMUR

2 ANA BAŞLIKLAR Tanımlamalar ve terminoloji Temel prensibler, Fabrikasyon metodları Dedeksiyon metodları Lab-on-a-chip a sistemleri Uygulamalar, son gelişmeler ş

3 TANIMLAMALAR BİYOSENSÖRİ Biyolojik/duyarlı bir elementin fiziksel yada kimyasal transduser ile kombinasyonu yoluyla belirli bir çevrede spesifik bir bileşiğin selektif ve kantitatif analizi [Vo-Dinh and Cullum, 2000].

4 TANIMLAMALAR BİYO-CHIP Biyo-chip teknolojisi mikroelektronik cihazlardan esinlenerek geliştirilmiş olup fabrikasyonda kullanılan malzemeler ve teknikler benzerlik göstermektedir. Kontrollü salınım sistemlerinin bileşeni, Proses, s analiz ve dedeksiyon d cihazları, (m/o, virüs, nükleik asit, proteinler, toksinler vs). [Bashir, 2004].

5 TANIMLAMALAR MİKRO-ARRAY Aynı anda çok sayıda molekülün analizini mümkün kılan sistemler. [Roger Ekins et al Multi-analyte immunoassay [Roger Ekins et. al., Multi analyte immunoassay, 1989, J. Pharm. Biomed. Anal. 7: ].

6 MİKROARRAY İ TEKNOLOJİSİ

7

8 Mikro-Array Nedir? Düzenli olarak yapılandırılmış l çoklu minyatürize i ölçüm sistemleri İlk yayın; y y Roger Ekins et. al., Multi-analyte immunoassay 1989, J. Pharm. Biomed. Anal. 7:

9 Mikro-Array Nedir? Mikro-Array ve Mikroakışkanlar Minyatürize multi parametreleri içeren biyosensörler gibi davranırlar (bu yüzden Mikro- Array teknolojisi i bazen biyoçip i teknolojisi i olarak ifade edilir) Mikroakışkan sistemler Baskı Teknolojisi Non-contact printing baskılama Dijital sentez...

10 Mikro-Array Teknolojisi Çoksayıda biyo-molekülün analizi Floresans özelliğine bağlı olarak etiketlenen örnek dizi üzerinde spesifik komplementer noktaya bağlanır Adlandırma: target / prob Türler: nükleik asit, protein, doku, vs. Hazırlama yaklaşımları Oligonükleotidler, PCR ürünleri Uygulamalar: farmasötikler, hastalık tanısı, çevresel, vs.

11 Mikro-Array Teknolojisi Mikro-Array; Minyatürize ligand Assays, karakteristik özellikleri => Immobilizasyon => Parallelizasyon => Minyatürizasyon Ligand Spesifik reseptörle etkileşen molekül Komplementer olma gereksinimi Prob (immobilize) arasında spesifik bağlanma Bilinen bileşim Hedef (örnekte) Tayin edilecek Sıvı matriks

12 Mikro-Array Teknolojisi => İmmobilizasyon => Paralelizasyon li => Minyatürizasyon Problar substrata Direkt bağlanma ğ şekli Fiziksel Van-der-Waals (hidrojen) İyonik Kimyasal bağ İndirekt bağlanma şekli Bağlayıcı molekül vasıtasıyla

13 Mikro-Array Teknolojisi => İmmobilizasyon => Paralelizasyon => Minyatürizasyon Problar spotlarla ifade edilirler Probların identifikasyonu Düzgün ızgara deseni Kafes pozisyonu 1 spot A B C 2 3

14 Mikro-Array Teknolojisi => İmmobilizasyon => Paralelizasyon => Minyatürizasyon Boyutun küçülmesi Spot boyutu Substrat yüzeyi y μm Mikro-Array Makro-Array

15 Mikro-Array Teknolojisi ÖNEMLİ İŞLEM ADIMLARI Mikro-Array desenlerinin oluşturulması Her mikrospotta biyo-tanıma elementinin in-situ fabrikasyonu/immobilizasyonu Floresans özelliği ile etiketlenen Mikro-Array Veri türün taranması/çıktısı toplanması /proses biyotanınması

16 Genomik/Proteomik ve Mikro-Array Teknolojisi Hızlı-Çoklu analit(multipleks) tayini Birçok biyolojik örneğin yüksek duyarlık ve kesinlikle hızlı ve simultone analizine olanak tanıyan güçlü ve geniş uygulama alanına sahip sistemler.

17 Moleküler genom analizi i Moleküler diagnostik Genomik Proteomik Genom haritalandırılması Gen fonksiyonları Protein profillendirilmesi Protein fonksiyonları

18 GENOMİK 3.1 milyar baz gen Proteinler, yapı/fonksiyon ilişkisi ş PROTEOMİK DNA mikro-array leri özellikle genomik araştırmalarda önemli katkı sağlamaktadırlar. Mikro-Array ler kullanılarak; Gen ekspresyon patternleri çalışılmış, transkripsiyon faktörlerinin bağlanma bölgeleri ve mutasyon dizileriyle delesyonları büyük skalada belirlenmiştir. DNA Mikro-Array leri sadece genler hakkında bilgi verir y g g şifreledikleri proteinlerin fonksiyonları hakkında çok az bilgi sağlarlar.

19 Genomik/Proteomik ve Mikro-Array Teknolojisi Binlerce DNA ve RNA türü bir DNA mikro-array ile simultane problaştırılabilir. (Bu sayede hücresel Phenotyping/ Genotyping ). Phenotyping hücrelerin spesifik belirteçler ile identifiye edilme işlemidir. Antibodiler kullanılırsa işlem immunophenotyping adını alır. Genetik yapılar kullanıldığında buna genotyping denir.

20 Mikro-Array Teknolojisi UYGULAMALAR İlaç Geliştirilmesi Sağlık Temel olarak biyosensör sistemi Çok sayıda DNA, protein, hücre ve doku fragmanı aynı anda analizlenebilir Genetik modifiye gıdaların analizi DNA Mikro Genetik modifiye gıdaların analizi-dna Mikro- Array leri

21 Mikro-Array Teknolojisi UYGULAMALAR Kanser ve diğer hastalıkların moleküler profillerinin çıkarılmasında güçlü bir diyagnostik araç. Kompleks biyokimyasal yolların analizi Nörolojik proseslerin sl araştırılması

22 Mikro-Array Teknolojisi Farklı Mikro-Array Türleri DNA Mikro-Array leri (DNA chip leri, gen chip leri): DNA mikro-array leri tek zincirli DNA dizileri, oligonükleotidler, veya DNA yı yakalayıcı ajan olarak RNA nın, 5-ile 150-μm spot yüzeylerinde immobilizasyonunu içeren sistemlerdir. Protein Mikro-Array leri (protein chip leri): Protein mikroarray/protein chip leri immobilize fusyon proteinlerini yada antikor ları içeren sistemlerdir.

23 Protein Mikro-Array leri (Protein chip leri) Gen ekspresyon array leri, mrna seviyelerindeki değişiklikleri, kodlanan protein seviyelerindeki değişiklikler ile ilişkilendirmek için kullanılırlar. Ancak çoğu zaman bu doğru ğ sonuç vermez. Gen ekspresyon array leri, hücre fonksiyonunu etkileyen proteinlerin translasyon sonrası modifikasyonları (fosforilasyon, glikolizasyon v.b) hakkında bilgi sağlamaz. Protein ekspresyonunu değerlendirmek, ilgilenilen proteinlerle ilgili kalitatif ve kantitatif bilgileri gerektirmektedir. Bu nedenle Proteomik kapsamındaki araştırmalarda ş kullanılmak üzere protein mikro- array leri/chip leri geliştirilmiştir.

24 Protein Mikro-Array leri i (Protein chip leri) PROTEOMİK Wikipedia: Özellikle protein yapı ve fonksiyonlarını inceleyen çalışmalardır. Hücrelerin organların, organizmaların protein içeriklerinin gelişmiş (high throughput) tekniklerin i kullanılarak l kanalizlenmesidir. l idi

25 Protein Mikro-Array leri i (Protein chip leri) PROTEOMİK TEKNİKLER 2-D jel elektroforezi Kromatografiyle bağlantılı kütle spektrometresi Protein Mikro-Array leri, protein chip leri

26 Protein Mikro-Array leri (Protein chip leri) i) Ana Teknolojik Sınırlamalar Mikro-Array ler Kütle Sp Proteinler DNA ile kıyasla karmaşık yapıdadır ve Çalışma Protein identifikasyonu koşulları açısından daha hassas sadece bilinen moleküllerdir Spesifik etkileşimler ile proteinlerle sınırlıdır. Miktar tayini tanıyıcı elementlerinden karmaşık prosedürlere ihtiyaç yoksundurlar duyar Birçok protein membran Protein etkileşmelerinin bağlıdır aydınlatılması sofistike Fonksiyonları küçük işlemleri gerektirir farklanmalara bağlıdır (örneğin fosforilasyon)

27 Protein Mikro-Array leri (Protein chip leri) The concept of protein arrays is not new. Miniaturized, i i multiplexed, l solid-phase immunoassays were developed in the 1980 s using protein microdots spotted manually onto nitrocellulose sheets.

28 Protein Mikro-Array leri (Protein chip leri) Protein Array mi?? ve Protein chip mi?? Protein chip leri olarak daha sofistike mikro-total-analiz sistemlerinden (μ- TAS) yada mikro-akışkan sistemlerden de bahsedebilmektedir. bilm di

29 Protein Mikro-Array leri (Protein chip leri)

30 Protein Mikro-Array leri (Protein chip leri) i) Chip leri oluştururken prob yada ligand olarak yüzeye yerleştirilen proteinlerin üç boyutlu yapıları bozulmamalıdır ve aktif yüzeyi dışa gelecek şekilde bağlanmalıdır. Ayrıca artık proteinin tamamının ligand olarak kullanılması yerine bunun aktif bölgelerinin, oligopeptidlerin sentetik olarak yapılması (protein sentezleyici cihazlar kullanılarak), peptit kütüphanelerinin oluşturulması ve protein chip lerinde kullanılması söz konusudur. Peptit kütüphaneleri faj display tekniği ile virüs-bakteri sistemlerini kullanarak da sentezlenebilmektedir. Proteomik çalışmaları için peptitleri de prob olarak değerlendirmek mümkündür. Kullanılan protein array lerini farklı başlıklar altında incelemek olasıdır.

31 Protein Mikro-Array leri (Protein chip leri) 1. Analitik Mikro-Array ler 2. Fonksiyonel Mikro-Array ler 3. Ters faz Mikro-Array ler

32 Analitik Mikro-Array ler Kompleks protein karışımlarının bağlanma spesifikliklerine göre profillerinin i i çıkartılması ve yine protein ekspressiyon ssi düzeylerinin belirlenmesi amacıyla kullanılan sistemler olup, antikor kütüphaneleri, aptamerler yakalayıcı molekül olarak chip yüzeyine yapılandırılmaktadırlar. En çok kullanılan antikor mikro-array leri olup, çevresel strese karşı oluşan cevapların profillendirilmesi ve hastalık durumuyla sağlıklı ğ organizmalar arasında kıyaslama, söz konusu sistemler ile gerçekleştirilebilmektedir. Bu teknik zayıf karakterli hücre sinyal proteinleri gibi Bu teknik, zayıf karakterli hücre sinyal proteinleri gibi protein hedeflerin değerlendirilmesinde kullanılan bir tekniktir. Ancak dezavantajı, spesifik antijen tanımasından emin olunmasını sağlayan antikor fazlalığının olmamasıdır.

33 Analitik Mikro-Array ler Antikor array lerine bağlanan protein analitlerinin belirlenmesine yönelik dedeksiyon stratejileri Direkt, Sekonder antikorlar ile indirekt, İşaretsiz ş dedeksiyon (label-free)

34 Analitik Mikro-Array ler Direkt işaretleme, farklı renklerde etiketlere sahip olan çeşitli örneklerin karşılaştırılması için kullanılır. Bununla birlikte kütle spektroskopisi, yüzey plazmon rezonans ve atomik kuvvet mikroskopisi (AFM) gibi işaretsiz saptama metotları, ligandın değişimini önler. Vücut sıvılarında ve ekstraktlarda az miktarda bulunan proteinler, sitokinler veya hücrelerdeki düşük ekspresyon ürünleri bu şekilde saptanabilirler.

35 Analitik Mikro-Array ler UYGULAMA

36

37

38 Fonksiyonel Mikro-Array ler Fonksiyonel proteinlerin yada bağlanma bölgelerinin chip yüzeyinde yapılandırılmasıyla l l hazırlanan sistemler olup, protein yada peptit mikro-array olarak da isimlendirilir. Protein array leri leri, proteinleri saptamada çok hızlı bir metot olmaları ve ekspresyon seviyelerini görüntülemede, etkileşimlerini ş ve fonksiyonlarını incelemede kullanılan önemli bir tekniktir. Protein array i geliştirilmesinin arkasındaki amaç, etkin ve ileri düzeyde protein analizi yapmaktır.

39 Fonksiyonel Mikro-Array ler protein-protein, protein-ligand veya protein-ilaç, enzim-substrat etkileşiminin belirlenmesi ve multianalit diyagnostik denemeler yapılabilir. Mikroarray veya chip formatında, bu tip saptamalar ile az miktarda materyal kullanarak çok miktarda veri elde edilerek array lerin sonuçları ile DNA dizi i bilgisi arasında direkt olarak bağlantı kurulabilir. Günümüzde, protein array leri, proteomik yaklaşımların merkezi olmuştur. Mikro-array veya chip formatında, bu tip saptamalar ile az miktarda materyal kullanarak çok miktarda veri elde edilerek array lerin r sonuçları ile DNA dizi bilgisi arasında a direkt olarak bağlantı kurulabilir.

40

41 PROTEIN CHIP Ekspressiyon profillendirilmesi Ab taraması; spesifiklik, çapraz reaktivite Protein-protein etkileşimi Protein-N.A etkileşimi (transkripsiyon faktörleri, transferases, regülator diziler) Protein-ilaç ilaç etkileşimleri Enzimatik aktivite ölçümü; Post-translasyonal t l modifikasyonlar, substrat taraması

42

43 SELDI BioChip Protein Fingerprints Sample Protein Biochip TM Array Serum, urine, culture medium, tissue homogenates, cell lyzates, subcellular components and etc. Binding/reaction sites Chemical Arrays (polymers) Biochemical Arrays (antibodies, enzyme, receptor, DNA) Biological Arrays (membranes) SEL LDI Surface Enhanced Laser Desorption Ionization Protein Maps fingerprint Evaluation of Diagnostic Profiles Data bases / Bioinformatics Data Collection and Identification Identification Quantification Function Structure

44 Ters faz Mikro-Array ler Ters faz arrayler (Hücresel lizatlar yada kompleks protein karışımlar ile hazırlanan array ler) ler)- Hücresel proteinlerin mikro-array leri, kompleks protein karışımları ş mar veya saflaştırılmış aşt ş yada a fazla a miktarda a eksprese olmuş proteinlerin kullanımıyla hazırlanır. Saflaştırılmış veya fazla miktarda eksprese olmuş proteinlerin kütüphanelerinden oluşan mikroarray lerin oluşturulması, protein-protein p etkileşimlerinin ve kinaz aktivitelerinin görüntülenmesine olanak verir.

45

46

47

48 ÖZET

49 Protein Mikro-Array leri (Protein chip leri) YÜZEY KİMYASI İMMOBİLİZASYON YÖNTEMLERİ

50 Protein Mikro-Array leri (Protein chip leri) Protein chip lerinin hazırlanmasında peptitler p yada antikorlar yüzey üzerinde gelişigüzel yada bir ligand aracılığıyla yönlendirilmiş olarak immobilize edilebilirler. Amin, aldehid yada epoksi türevli yüzeylerin kullanımıyla l daha çok gelişigüzel immobilizasyon hedeflenmiş olup örneğin nitroselüloz yada poli-l-lisin ile modifiye edilen yüzeyler adsorbsiyon yoluyla immobilizasyon için kullanıma uygundur. Bununla birlikte affinite etiketli yüzeylerin kullanımı yönlendirilmiş immobilizasyon için iyi bir alternatif olup nikel kaplı yüzeyler, Histidin etiketli proteinlerin i immobilizasyonunda popüler bir seçim olabilmektedir.

51

52 Protein Mikro-Array leri Protein Mikro Array leri (Protein chip leri)

53 Protein Mikro-Array leri Protein Mikro Array leri (Protein chip leri)

54

55 Hücre Mikro-Array leri

56 Hücre Mikro-Array leri Protein array leri yüzeye direkt immobilize edilmiş proteinleri, i hücre mikro-array leri i ise array yüzeyinde yer alan hücre kümeleri tarafından ekspresse edilen spesifik proteinleri kullanır. İşaretli küçük moleküllerin array yüzeyinde oluşturduğu bağlanma motifleri hedefe olan spesifiklik ve aksiyon mekanizması hakkında bilgi vermektedir. Bir Br takm takım teknik k sınırlamalarla birlikte nispeten yeni bir teknoloji olup, ilaç geliştirilmesi, protein-küçük molekül etkileşimlerinin belirlenmesinde, protein-antibadi etkileşimlerinin kl l karakterizasyonunda k kullanım potansiyeline sahiptir.

57 Hücre Mikro-Array leri

58 BİYO-CHIP TEKNOLOJİSİ

59 BİYO-CHIP PAZARI TEMEL ARAŞTIRMA PROTEOMİK MEDİKAL İLAÇ GELİŞTİRME DİYAGNOSTIK GENOMİK

60 BİYO-CHIP TEKNOLOJİSİİ İ TEMEL ÖZELLİKLER 1. Küçük boyutlu skala 2. Minimize edilmiş termal kütle 3. Laminar akış 4. Yüksek yüzey alanı/hacim W.J. Chang, Demir Akin, Miroslav Sedlek, Michael Ladisch, Rashid Bashir, Biomedical Microdevices, vol. 5, no. 4, pp , 2003.

61

62 NİÇİN MİNTATÜRİZASYON??? (i) Sensör elementinin hedef türlere göre indirgenmiş skalada bulunması DAHA HASSAS DEDEKSİYON! (ii) İndirgenmiş reaktif hacimleri DAHA EKONOMİK (iii) KISA ZAMANDA ÖLÇÜM, (iv) PORTATİF ve MİNYATÜRİZE SİSTEMLERİN FABRİKASYONU (v) POC diyagnostik, (vi) (i) Çoklu analit dedeksiyond kapasitesi i (vii) in vitro ve in vivo kullanılabilirlik potansiyeli

63 Biyochipler UYGULAMALAR Tıp İlaç sanayi Gıda güvenliği Savunma İntegre, Hassas, Hızlı, Maliyet x Performans Ticari ürünler; Nanogen, Affymetrix, Caliper, vb.

64 BioChip/BioMEMS Materyalleri Silikon ve mikroelektronik materyaller Cam, Quartz Polymerler Poly (dimethylsiloxane) (PDMS) Poly (methyl methacrylate) (PMMA) Teflon, vb. Biyolojik moleküller Hücre, Protein, DNA BioMEMS in sınırları!

65 LAB-ON-A-CHIP A SİSTEMLERİ

66 LAB-ON-A-CHIP A NEDİR? Mikro Total Analiz Sistemi (μ-tas) Mikroakışkan k k Sistemler İlk örnek; 1979 Stanford Üniversitesinde (S.C. Terry), minyatürize GC nin silikon yüzeyde mikrofabrikasyon teknikleriyle oluşturulması. l

67 LAB-ON-A-CHIP A Lab-on-a-Chip μ-tas olarak Manz ve arkadaşları tarafından 1990 larda Imperial College/Londra da geliştirilmeye başlandı. Review references: Micro Total Analysis Systems 1: Introduction, Theory and Technology Reyes et al, Analytical Chemistry 2002, Vol 74 p2623 Micro Total Analysis Systems 2: Analytical Standard Operations and Applications Auroux et al, Analytical Chemistry 2002, Vol 74 p2623

68 LAB-ON-A-CHIP A İNTEGRE BİYO-CHIP İntegre Özellikle, sağlık sektörü, tıp alanındaki, farmosetik endüstrisi, biyoteknoloji, genomik, proteomik vb gibi alanlardaki hızlı gelişmelere paralel olarak kimyasal/biyokimyasal analizlere olan ihtiyacı arttırmış olup, geleneksel, klasik yöntemlerin gereksinimi olan büyük laboratuarlar, sofistike cihazlar, eğitimli personelin kullanımı, yerini integre biyochip lerin pratik uygulamalarına bırakmıştır.

69 LAB-ON-A-CHIP AVANTAJLAR Düşük internal chip hacimlerinden dolayı daha düşük akışkan hacimlerinin kullanımı (çevresel kirliliklerin analizinde özellikle önemli-daha az atık kullanımı- Pahalı reaktiflerin daha az hacimli kullanımı, daha az örnek hacmi (diyagnostik analizler için önemli), Kontrollü akış hızı daha kısa difüzyon mesafesi, kısa karıştırma zamanınından dolayı daha etkin analiz.

70 LAB-ON-A-CHIP AVANTAJLAR Hızlı ısıtma (kısa mesafeli alanlar, küçük ısıtma kapasitesi), Daha hızlı cevap-daha iyi proses kontrolü (ekzotermik kimyasal reaksiyonlar için termal kontrol), Fonksiyon ve küçük hacimlerin integrasyonuyla y KOMPAKT bir sistemin eldesi, PARALELİZASYON-yüksek analiz sayısı Düşük fabrikasyon maliyeti, Kimyasal, radyoaktif yada biyolojik analizler için daha emniyetli platformların eldesi.

71 LAB-ON-A-CHIP DEZAVANTAJLAR?? YENİ TEKNOLOJİ-henüz tamamen tanımlanmamış fiziksel ve kimyasal etkileşimler; kapiler kuvvetler ve kanal yüzeylerindeki kimyasal etkileşimler daha dominant hale gelerek LOC sistemi daha komplike hale getirebilir ve dedeksiyon prensiplerini her zaman pozitif olarak etkilemeyebilir ve düşük sinyal/gürültü oranlarına neden olabilir.

72 LAB-ON-A-CHIP UYGULAMALAR Real-time PCR ; bakteri, virus ve kanser dedeksiyonu. Immuno-assay ; Antijen-antibadi reaksiyonlarını temel alan bakteri, virus ve kanser dedeksiyonu ve elektroforetik dedeksiyon Kan örneğinin hazırlanması; DNA ekstraksiyonu için hücrelerin hazırlanması Tek hücre analizi için Sellüler lab-on-a- chip.

73

74 Mikroorganisma & Hücre analizine yönelik integre sistemler Lab on a Chip -BioMEMS ve Biyonanoteknoloji

75