TEZ ONAYI Solmaz NAJAFİ tarafından hazırlanan Kebere (Capparis spp.) nin In vitro Çoğaltımı adlı tez çalışması 30/07/ 2008 tarihinde aşağıdaki jüri ta

Transkript

2 TEZ ONAYI Solmaz NAJAFİ tarafından hazırlanan Kebere (Capparis spp.) nin In vitro Çoğaltımı adlı tez çalışması 30/07/ 2008 tarihinde aşağıdaki jüri tarafından oy birliği/oy çokluğu ile Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tarla Bitkileri Anabilim Dalı nda (YÜKSEK LİSANS TEZİ) olarak kabul edilmiştir. Danışman : Prof. Dr. Sebahattin ÖZCAN Eş Danışman: Prof. Dr. Mehdi TAJBAKHSH Jüri Üyeleri : Başkan: Prof.Dr. Orhan ARSLAN Üye : Prof.Dr. Neşet ARSLAN Üye : Prof.Dr. Sebahattın ÖZCAN Yukarıdaki sonucu onaylarım. Prof.Dr.Orhan ATAKOL Enstitü Müdürü

3 ÖZET Yüksek Lisans Tezi KEBERE (Capparis spp.) NİN IN VITRO ÇOĞALTIMI Solmaz NAJAFİ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Tarla Bitkileri Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Sebahattin ÖZCAN Eş Danışman: Prof. Dr. Mehdi TAJBAKHSH Kebere (Capparis spinosa) bitkisi, Türkiye ve İran başta olmak üzere Akdeniz Bölgesinde yer alan ülkelerin doğal florasında bulunmaktadır. Kebere tohumlarında dormansi yüzünden çimlenmenin zor olduğu bilinmektedir. Bu çalışmada kebere tohumlarının çimlenmesinde etkili, aynı zamanda mikro çoğaltımda kullanılabilecek olan bir yöntem geliştirilmeye çalışılmıştır. Tohumlar farklı oranlarda BAP, NAA ve GA 3 içeren MS ortamında başarılı bir şekilde (% 100) çimlendirilmiştir. Daha sonra in vitro da gelişen bitkiciklerden alınan gövde, yaprak ve koltukaltı meristem eksplantları değişik oranlarda BAP ve NAA içeren MS ortamlarda rejenerasyona alınmıştır. En fazla sürgün rejenerasyonu 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilmiştir. Elde edilen sürgünler 50 mg/l IBA ile 5 dk muamele edilip, MS ortamında köklendirilmiştir. Temmuz 2008, 47 sayfa Anahtar Kelimeler: Kebere, çimlenme, in vitro, Capparis spinosa, hızlı çoğaltım, doku kültürü, adventif sürgün rejenerasyonu i

4 ABSTRACT Master Thesis Micropropagation of Capers (Capparis spp.) Solmaz NAJAFİ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Agronomy Supervisor: Prof. Dr. Sebahattin ÖZCAN Co- Supervisor: Prof. Dr. Mehdi TAJBAKHSH Caper (Capparis spinosa L) is an important medicinal plant which is found in various countries of Mediterranean region including Turkey and Iran. The seeds of C. spinosa are very difficult to germinate because of high dormancy. The study aimed to find an effective method to germinate these seeds and subsequently use the developing seedlings in micro propagation experiments. Seeds were germinated successfully on MS medium containing different concentrations of BAP, NAA and GA 3. Later on the plantlets were used to obtain inter node, leaf and nodes and were regenerated on MS medium containing different concentrations of BAP and NAA. The best shoot regeneration was achieved from the explants on MS medium containing 0.4 mg/l BAP and 0.1 mg/l NAA. The shoots were pulse treated with 50 mg/l IBA for 5 minutes and then rooted on MS medium. July 2008, 47 pages Key Words: Caper, germination, in vitro, Capparis spinosa, micro-propagation, tissue culture, adventitious shoot, regeneration. ii

5 TEŞEKKÜR Bu çalışmanın başından sonuna kadar bana her türlü desteğini eksik etmeyen saygıdeğer hocam Prof. Dr. Sabahattin ÖZCAN a teşekkürlerimi bir borç bilirim. Yurt dışında eğitim almama izin veren ve değerli önerilerde bulunan Prof. Dr. Mehdi TAJBAKHSH a, çalışmamı yakından takip edip zamanında bitirmemi sağlayan Doç. Dr. Khalid M. KHAWAR a, çalışma materyalimi temin eden sayın Dr. Durmuşali SÖYLER e, Türkiye de olduğum süre, bana maddi ve manevi desteklerini esirgemeyen çok değerli aileme ve eşime, istatistik analizlerin yapılmasında bana yardım eden Dr. Oruj VALIZADEGAN ve Dr. Babak ABDOLLAHİ ye, yardımlarını benden esirgemeyen sevgili arkadaşlarım Amir REZAEİ OSALOU ve Sevil SAĞLAM a teşekkür ederim. Solmaz NAJAFİ Ankara, Temmuz 2008 iii

6 İÇİNDEKİLER ÖZET... i. ABSTRACT ii TEŞEKKÜR iii SİMGELER DİZİNİ... vi ŞEKİLLER DİZİN. vii ÇİZELGELER DİZİNİ. viii 1.GİRİŞ 1 2. KAYNAK ÖZETLERİ 5 3. MATERYAL VE YÖNTEM Bitki Materyali Yöntem Büyüme ortamları ve kültür koşulları Bitki büyüme düzenleyicilerinin kullanımı Kebere tohumlarına HCl muamelesi Kebere tohumlarına Su, HCl, H 2 SO 4, KNO 3, NaCl, IAA, sıcak ve soğuk muamelesi In vitro da yüzey sterilizasyonu Kebere tohumlarının çimlendirilmesi Eksplant izolasyonu Mikroçoğaltım Rejenere olmuş süegünlerin köklendirilmesi İstatistiki analizler ARAŞTIRMA BULGULARI HCl Uygulamasının Çimlenme Üzerindeki Etkisi H 2 SO 4, HCl ve GA 3 Uygulamasının çimlenme Üzerine Etkisi Farklı Konsantrasyonlarda BAP, NAA, GA 3 in Çimlenme Üzerindeki Etkisi Mikroçoğaltım. 28 iv

7 4.4.1 Gövdeden sürgün rejenerasyonu Yapraktan sürgün rejenerasyonu Koltukaltı meristemlerinden sürgün rejenerasyonu Sürgünlerin Köklendirilmesi TARTIŞMA VE SONUÇ KAYNAKLAR. 42 ÖZGEÇMİŞ. 47 v

8 SİMGELER DİZİNİ BA/BAP 6Benzylaminopurine G, mg, µg Gram, mili gram, mikrogram GA 3 Giberellik Asit IAA Indolasetik asit MS Murashige ve Skoog temel besin ortamı MSO Hormonsuz Murashige ve Skoogtemelbesin ortamı NAA Naftalin Asetik Asit TDZ Thidiazuron IBA Indol 3 butirik Asit Kin/KN Kinetin 2,4-D 2,4 Diklorofenoksiasetik Asit NaOH Sodyum hidroksid HCL Hidroklorikasit K.O. Kareler Ortalaması F F değeri V.K. Varyasyon Kaynakları vi

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 1.1 Şekil 4.1 Şekil 4.2 Şekil 4.3 Urmia Üniversitesi Ziraat Fakültesinde kendiliğinden yetişen bir Capparis spinosa bitkisinin görüntüsü.. 1 C. spinosa bitkisinin %37 lik HCL ile 360 dk muamele edilen tohumlarının çimlenmesi 22 İran da Urmiye Üniversitesinde; Kebere tohumlarına GA3 muamelesi, çimlenen tohumların incelenmesi, sayımı ve çimlenme yüzdelerinin hesaplanması 25 Uygulamalarda kullanılan % lik H 2 SO 4 ; Uygulamalarda kullanılan % 37 lik HCl; 1 saat H 2 SO 4 a tabi tutulan tohumların çimlenmesine ait bir görüntü Şekil 4.4 Gövdeden sürgün rejenerasyonu 29 Şekil 4.5 Yapraktan sürgün rejenerasyonu.. 32 Şekil 4.6 Koltuk altı meristemden sürgün rejenerasyonu. 34 Şekil 4.7 Rejenere olmuş sürgünlerin köklendirilmesi. 37 vii

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 1.1 Çizelge 3.1 Çizelge 3.2 Çizelge 4.1 Çizelge 4.2 Çizelge 4.3 Türkiye nin 1990 dan başlayan 2004 e kadar beşer yıllık kebere ihracatı... 3 Murashige ve Skoog (1962), ortamında bulunan besin maddeleri ve ortamları Kullanılan büyümeyi düzenleyicilerin çözücüleri, saklama koşulları ve yöntemlerı Tohum çimlenmesi üzerinde farklı sürelerde % 37 lik HCL muamelesinin etkisine ait varyans analizi Tohum çimlenmesi üzerinde farklı sürelerde % 37 lik HCL muamelesinin etkisi. 23 Farklı muamelelere tabi tutulan tohumların çimlenme yüzdelerine ait varyans analizi.. 24 Çizelge 4.4 Farklı muamelelere tabi tutulan tohumların çimlenme yüzdelerinin ortalaması.. 24 Çizelge 4.5 Farklı konsantrasyonlarda BAP, NAA ile 2 ve 6 mg/l GA 3 içeren ortamlarda çimlenme yüzdelerine ait varyans analizi Çizelge 4.6 Çizelge 4.7 Çizelge 4.8 Çizelge 4.9 Çizelge 4.10 BAP, NAA konsantrasyonları ile 2 ve 6 mg/l GA 3 in çimlenme oranına etkisi 27 Farklı BAP-NAA konsantrasyonlarının gövde eksplantından sürgün rejenerasyonuna etkisi. 30 Farklı BAP-NAA konsantrasyonlarının gövde eksplantından sürgün rejenerasyonuna etkisi 31 Farklı BAP-NAA konsantrasyonlarının yaprak explantından sürgün rejenerasyonuna etkisi 32 Farklı BAP-NAA konsantrasyonlarının yaprak eksplantından sürgün rejenerasyonuna etkisine ait varyans analizi 33 viii

11 Çizelge 4.11 Çizelge Farklı BAP-NAA konsantrasyonlarının koltukaltı meristemlerden sürgün rejenerasyonuna etkisine ait varyans analizi.. 35 Farklı BAP-NAA konsantrasyonlarının koltukaltı meristemlerden sürgün rejenerasyonuna etkisi.. 36 ix

12 1 - GİRİŞ Capparis cinsi dünyanın tropik ve suptropik bölgelerinde çok geniş bir alanda bulunmaktadır. Bazı araştırıcılara göre 350 den fazla tür içeren ve bütün kıtalarda doğal olarak yetişebilen bir cinstir. Akdeniz, Balkanlar ve Batı Asya ülkelerinde başlıca altı türe yaygın olarak rastlanmaktadır: Capparis spinosa L., C. ovata Desf., C. leucophylla DC., C. mucronifolia Boiss., C. cartillaginea Decne, C. decidua (Fosk) Edgew. (Zohary 1960, Akgül, A., 1996). Türkiye de Capparis cinsinin C. spinosa ve C. ovata olmak üzere 2 türü tespit edilebilmiştir (Bai1ey 1950, Zohary 1960, Davis 1965, Barbera 1991,Tubives 2008). İran da ise Capparis cinsine ait spinosa türünün farklı variyetelerinin doğal olarak yetiştiği bilinmektedir (Heinz, 1963). Son yıllarda uluslararası pazarlarda yüksek değer bulmakta ve tüketimi gittikçe artmaktadır (Tonçer ve Akın 2000). Kebere bitkisinin boyu m ye kadar ulaşır, Capparis türleri (C.ovata ve C.spinosa) iri beyaz çiçekli, dikenli, genellikle yere yatık çalı görünüşlü çok yıllık bitkilerdir. Oval veya yuvarlak yaprakları koyu yeşildir, 4 çanak, 4 taç, çok sayıda erkek organı ve bir dişi organı vardır. Toprak üstü kısımları büyük bir çoğunlukla yıllık olup, tamamen kurur ve ertesi yıl yeniden sürgün oluşturur (Şekil 1.1). Ancak az da olsa toprak üstü kısmı kısmen kuruyan tipler vardır (Soyler ve Arslan 2000, Soyler ve Khawar 2006). Şekil 1.1 (a ve b) Urmia Üniversitesi Ziraat Fakültesinde doğal olarak yetişen bir Capparis spinosa bitkisinin görüntüsü. 1

13 Kebere, protein, vitamin ve mineral maddelerce oldukça zengin bir bileşime sahiptir (Akgül 1996). Kimyasal analizler sonucunda keberenin henüz açmamış tomurcuklarında rutin glokozid, pentozan, rutik asit, pektik asit, doymuş yağ asitleri, glucocapparin, globulariacitri methyl-isotiacianid ve saponin tespit edilmiştir. Başka bir araştırmaya göre tomurcuklar % rutin ve glucocapparin içermektedir (Soyler ve Arslan 2000). Ayrıca kebere tomurcuklarının organik madde miktarlarının % % 5.534, total azot miktarlarının % % 1.856, fosfor miktarlarının % % 0.91, potasyumun ise % % 0.41 sınır degerleri arasında değiştiği belirtilmiştir (Özcan 1998). Keberenin tohumlarında ise % 35 oranında yağ tespit edilmiştir. Tohumlardaki yağ 18 karbonlu doymamış yağ asitlerinden oluşmuştur (Haqiqat 1973). Protein, vitamin ve mineral maddelerce zengin çiçek tomurcukları toplanıp turşusu yapılarak tüketilmektedir. Ayrıca çiçek tomurcukları kozmetik sanayiinde ve baharat olarak kullanılmaktadır. Bitki dekoratif yapısı nedeniyle peyzaj alanında süs bitkisi olarak yer almaktadır (Kara ve ark., 1996). Çiçek tomurcukları ve kök kabukları bir dizi hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır. Keberenin son yıllarda artan ekonomik öneminden dolayı İtalya ve İspanya'da hem doğal bitkilerden yararlanılmaktadır, hem de tarımı yapılmaktadır. Fransa, Fas, Cezayir, Tunus, Yunanistan, İsrail, Hindistan ve Türkiye gibi ülkelerde doğal bitkilerden yararlanılmaktadır (Soyler ve Khawar 2006). Kebere diğer gıdaların yapısına girerek lezzete katkıda bulunmakta ve garnitür görevi yapmaktadır. Salatalar, çorbalar, balıklar, vejetaryen gıdaları, dondurulmuş ürünler, peynirler ve aroma endüstrisi gibi birçok gıda sanayiinde kullanılmaktadır. Keberenin yeşil aksamı slaj yapımı için uygundur. Mineral madde ve vitamin yönünden çok zengin olması ve fazla protein (% 24) içermesi sebebiyle hayvanların beslenmesinde önemli bir yeri vardır (Akgül 1996). Türkiye de Akdeniz ikliminin hakim olduğu Batı Anadolu, Orta Anadolu ve Güneydoğu Anadolu illeri başta olmak üzere Türkiye de bir çok yerde doğal olarak yetişen keberenin ticareti yaygın olarak yapılmasına karşın, profesyonel anlamda üretimi emekleme safhasındadır. Bu aşama da bile Türkiye ye kazandırdığı dış ticaret gelirinin 2003 yılı itibari ile 24,5 milyon dolar (Ege İhracatçılar Birliği Verileri) 2

14 olduğu düşünüldüğünde bu bitkinin önemi daha da belirginleşmektedir. Kebere ihracatındaki sorunların başında dış pazarın talebini karşılayacak derecede arzı sağlayamamak, ikinci büyük sorun; Keberenin doğadaki yabani bitkilerden rasgele toplanması nedeniyle standart dışı ürün elde edilmesidir. Türkiye de kebere bitkisinin tomurcukları genelde doğadan toplanarak dünyanın değişik ülkelerine, özellikle Avrupa ülkelerine ihracatı yapılmaktadır (Anonim 2000). Türkiye için 1990 yılından itibaren önemli olmaya başlayan kebere bitkisinin ihracat miktarının beş yıllık ortalamalara göre giderek arttığı gözlenmektedir (Çizelge 1.1). Buna bağlı olarak ihracatta döviz miktarı da artmıştır. Çizelge 1.1 Türkiye nin 1990 dan başlayan 2004 e kadar beşer yıllık kebere ihracatı Yıllar Toplam (kg) Toplam Değer ($) Kaynak: Devlet Statistik Enstitüsü 2005 Dünyada kebere ile ilgili yayınlar özellikle yetiştiriciliği konusunda oldukça azdır. Türkiye de son yıllarda keberenin kültüre alınması ile ilgili bazı çalışmalar başlatılmıştır. Bu çalışmalarda Ege Tarımsal Araştırma Enstitüsü (ETAE) önemli adımlar atmıştır. Kebere türleri her türlü elverişsiz çevre koşullarına son derece dayanıklıdır. Yıllık ortalama sıcaklığın 13 o C, yıllık yağışın ise 200 mm nin üzerinde olduğu yerlerde kendiliğinden yetişmektedir (Akgül, 1996). Olumsuz çevre koşullarına son derece dayanıklı olan bitkiye kale duvarlarında bile rastlamak mümkündür. Kebere yaygın olarak tohumla ve çelikle çoğaltılmaktadır. Ancak sert tohum özelliğine bağlı dormansi nedeniyle tohumlarda çimlenme güçlüğü bulunması, üretiminde zorluklara neden olmaktadır (Orphanos, 1988). 3

15 Kebere çelikle çoğaltılabilmektedir, ancak ekonomik bir metot olmadığından tercih edilmemektedir. Çelikle üretimde düşük köklenme yüzdeleri IBA, IAA ve NAA gibi büyüme düzenleyicilerin kullanılmasıyla artırılabilmektedir. Çelikle üretimde köklendirme ortamını sürekli nemli tutmak köklenmeyi arttırıcı bir etki göstermektedir. Aşı ile çoğaltma veya doğal olarak yetişen genç bitkilerin tarlaya şaşırtılması gibi az da olsa kullanılan çoğaltma yöntemleri mevcuttur. Ayrıca ergin bitkilerden ayırma yoluyla da çoğaltma yapılabilmektedir (Kara ve ark., 1996) Kebere çok yıllık, dikenli ve çalımsı bir bitki olup tropik bölgelerde özellikle kurak alanlarda derin kök sistemi sayesinde rüzgar erozyonu ve toprak katmanlarının sel ve yağmur suları ile taşınmasını önlemede iyi bir örtü bitkisi olarak önem taşımaktadır (Banerjee, A.K., 1989). Ayrıca kurak ve yarı kurak bölgelerde taşlık, meyilli, kireçli, zayıf besin maddeli topraklarda, kayalıklarda, kale duvarlarında, surlarda ve beton kırıklarında bile doğal olarak yetişebilen, yıl ömrü olan ve her türlü elverişsiz çevre şartlarına karşı koyabilen kebere bitkisi, bu özellikleri nedeniyle Türkiye deki erozyonu önleme çalışmalarında önerilen alternatif bitkilerin başında gelmektedir. (Tansı ve Kocabaş, 1997). TEZİN AMACI Kebere (Capparis spp.) önemli bir tıbbi bitkidir. Kebere bitkisinin tomurcukları doğadan toplanarak dünyanın değişik ülkelerine, özellikle Avrupa ülkelerine ihrac edilmektedir. Türkiye için döviz kaynağı olan kebere bitkisinin kültüre alınma çalışmaları 1990 yılından beri devam etmektedir. Bu yüzden bu çalışmanın amacı tıbbi ve ekonomik öneme sahip olan kebere bitkisinin in vitro koşullarda hızlı çoğaltımıdır. 4

16 2. KAYNAK ÖZETLERİ Hussey vd (1984), çimlendirilen bezelye tohumlarından aldıkları eksplantları, 1 mg/l BAP ve 4-8 mg/l IBA içeren MSO besin ortamına alarak kallus ve sürgün oluşumunu teşvik etmişlerdir. 2-4 hafta sonra aynı ortamlara 0.25 mg/l IBA daha ilave edilmiştir. Bu ortamlarda rejenere olan sürgünler, ½ MS mineralleri, %15 şeker ve 2 mg/l IAA içeren ortamda köklendirilmiştir. Rubluo vd (1984), yaptıkları çalışmada, farklı konstrasyonlardaki bazı sitokinin ve oksin kombinasyonlarını kullanarak, olgunlaşmış ve olgunlaşmamış bezelye yaprakçıklardan öncelikle sürgünler daha sonra da tam bitkiler elde etmişlerdir. BAP, NAA, IBA ve IAA içeren MS besin ortamında olgunlaşmamış yaprakçıklar ortalama mm uuzunluğunda sürgünler oluşturmuştur. Oluşan sürgün yüzdesi, ortalama % arasında değişmiştir. BAP ve NAA içeren ortamda, olgunlaşmış yapraklardan gelişen sürgünlerin oranı % 7 ye kadar düşmüştür. GA 3 in sürgün oluşumunda etkili olmadığı, pikloram ve 2,4-D nin ise olumsuz etki gösterdiği tespit edilmiştir. Ayrıca, adventif sürgün rejenerasyonunun büyük ölçüde sıcaklık ve genotipten etkilendiği belirtilmiştir. Natali vd (1987), bezelyede olgunlaşmamış embriyolardan gelişen kalluslardan yeni bitkiler elde etmişlerdir. Bu amaçla, kotiledonlardan embriyoları izole ederek değişik konsantrasyonda BAP ve NAA içeren besin ortamında kültüre almışlardır. Gelişen sürgünler, 2 mg/l IBA içeren besin ortamında köklendirilmiştir. Rejenerasyon kabiliyeti ile genotip arasında önemli bir ilişki olduğu görülmüştür. Yapılan histolojik incelemede, sürgünlerin organogenesis yoluyla geliştiği belirlenmiştir. Kertesz vd (1987), Digitalis lanata da meristem kültürü üzerinde çalışmışlardır. Çalışmada Oxfordy çeşidine ait meristemik dokular, 1 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren besin ortamında kültüre alınmıştır. Meristem başına ortalama 8-10 yan sürgün elde edilirken büyümeyi düzenleyiciler içermeyen MS besin ortamında köklendirme başarılmıştır. Sürgünlerin % 80-90' ının köklendiği görülmüştür. Bitkicikler tarlaya aktarılmadan önce iklim odasında aklimatize edilmiştir. 5

17 Polanco vd (1988), kültür ortamı ve eksplant tipinin, mercimekte kallus ve sürgün oluşumuna etkisini incelemişlerdir. Üç İspanyol mercimek çeşidine ait değişik eksplantlar, (sürgün ucu, birinci boğum ve ilk yaprak çifti) BAP, NAA ve IAA içeren 2 temel besin ortamında (MSO ve B5) kültüre alınmıştır. 2,4-D içeren besin ortamında tüm eksplantlar kallus oluşturmuş, ancak hiç organogenesis meydana gelmemiştir. En çok sürgün, 2.25 mg/1 BAP, mg/1 NAA ve 2.25 mg/1 IBA içeren MS besin ortamından elde edilmiştir. Sürgün oluşumunda en etkili büyümeyi düzenleyicilerun BAP olduğu, ancak bu büyümeyi düzenleyicilerin köklenmeyi azalttığı görülmüştür. Straub vd (1989), su bitkisi Distichlis sipicata nın olgun tohumlarını kullanarak doku kültürü çalışmaları yapmışlardır. Katı, beyaz ve rejenere kabiliyeti olan kalluslar oluşmuş ve üzerinde turuncu-yeşil çizgiler gözlenmiştir. Rejenerasyon ortamına oksin yerine 1 mg/l BAP ilave edince rejenere kabiliyeti yükselmiştir. Yapılan histolojik çalışmalar hücrelerin embriyonik olduğunu göstermiş fakat rejenerasyon sürgün organogenesisi ile elde edilmiştir. Rejenere olan bitkiler doğal koşullarda tohum ve çiçek oluşturmuştur. Tohumların yüzey sterilizasyonunda çamaşır suyu veya ethanol kullanılmıştır. Tohumlar 15 dk çamaşır suyunda bekletildikten sonra 3 defa steril saf su ile durulanmıştır. Diğer bir yöntemde ise, % 95 lik ethanolde 15 dk bekletme ve durulamadan sonra kurutma uygulanmıştır. Jackson vd (1990), bezelye (Pisum sativum L.) nin kotiledon boğumlarından, 1 mg/l BAP içeren MS besin ortamında çok sayıda adventif sürgün elde etmişlerdir. Sitokinin konsantrasyonu arttıkça sürgün ucu sayısının da arttığı görülmüştür. Ancak, 5 mg/l BAP içeren besin ortamında oluşan sürgünler camsılaşma göstermişler ve köklenememişlerdir. Kullanılan bütün çeşitlerin boğumları 5 gün sonra sürgün oluşturmuş ve bu sürgünlerden 21 gün sonra eksplant alınmıştır. Yapılan histolojik çalışmalar, boğum ve sürgünlerin yüzeysel doku tabakalarından geliştiğini göstermiştir. Bu sistemin transgenik bitkiler elde etmek için kullanılabileceği bildirilmiştir. Krogstrup vd (1991), Psiada coronopus bitkisinin 5 µm BAP ile diğer bitki büyüme düzenleyicileri ile birlikte MS ortamında hızlı çoğaltım başarısına bakmışlardır. 6

18 Oluşan sürgünlerin NAA ve IBA içeren MS besin ortamında edilmiştir. köklendikleri tespit Sakr vd. (1991), Chamomilla recutita bitkisinin yaprak, gövde, meristematik uç, kök, çiçek ve tohum eksplantlarının rejenerasyon kabiliyetlerine bakmışlardır. Kinetin, BAP, Kinetin + BAP veya BAP + NAA içeren MS besin ortamında rejenerasyon kabiliyeti araştırılmıştır. 4 haftalık kültürde en fazla sürgün sırasıyla tohum, meristematik uç ve yaprak sapından elde edilen kallustan elde edilmiştir. Köklenme ise MS ortamında gerçekleştirilmiştir. Chraibi vd. (1991), ayçiçeğinin 3 genotipi R897, Euroflour ve F827 nin olgunlaşmamış kotiledon eksplantlarından sıvı MS ortamında yüksek oranda sürgün rejenerasyonu elde etmişlerdir. Kotiledonlar 2 günlük fidelerden kesilerek 5,4 µm NAA, 4,4 µm BAP içeren sıvı MS ortamına konulmuştur. İki hafta sonra eksplantın üst kısmında bol miktarda sürgün rejenerasyonu görülmüştür.eksplantlar %60-70 oranında rejenerasyon kabiliyeti göstermiştir. Conchou vd. (1992), Arnica montana bitkisinin hızlı çoğaltımını çalışmışlardır. Kullanılan sürgünleri hem seradan hem in vitro dan aldıklarını bildirmişlerdir. Hızlı çoğaltım için 1 mg/l BAP ve 0,1 mg/l NAA içeren MS veya B 5 besin ortamları kullanılmıştır. 6. hafta sonunda MS besin ortamında 7,7 adet sürgün, B 5 ortamında ise 9.0 adet sürgün elde edilmiştir. Sürgünler NAA içermeyen ortamda alt kültüre alınmış ve sonuçların düştüğü gözlenmiştir. Sürgünler 0.1 mg/l NAA içeren MS ortamında köklenmiştir. Seradan alınan bitkilerde en iyi köklenmenin 0.2 ve 0.3 mg/l NAA içeren B 5 ortamında olduğunu rapor etmişlerdir. In vitro daki bitkilerin % 95 i seraya başarı ile aktarılmıştır. Kış koşullarında tarlaya aktarılanlardan % 93 ünün canlılığını koruduğu ve sonraki yaz mevsiminde % 64 ünün çiçeklendiği gözlenmiştir. Lauzer vd (1992), Kuzey Amerika da yetiştirilen Cynara scolymus bitkisinin Green Globe çeşidinde hızlı çoğaltım ve vitrifikasyon üzerine çalışmışlardır. Araştırmada in vitro da tohumdan elde edilen sürgün uçlarından 0,5 mg/l NAA ve farklı konsantrasyonlarda BAP içeren, MS ortamında sürgün rejenerasyonu elde etmişlerdir. Hızlı çoğaltım aşamasında meristematik yaprakların besin ortamına değmesinin 7

19 vitrifikasyona yol açtığı belirtilmiş, besin ortamına değmeleri engellenerek vitrifikasyondan kurtuldukları ve 1 mg/l NAA içeren MS besi ortamında 2 ay sonra % 65 oranında köklendikleri bildirilmiştir. Whipkey vd. (1992), Artemisia annua bitkisinin tarladan alınan P1, P2, P3 hatlarında sürgün rejenerasyon kabiliyetini araştırmışlardır. En iyi kallus oluşumu 1 mg/l 2,4-D içeren MS ortamında en fazla sürgün sayısı ise 10 mg/l BAP içeren MS besin ortamında gözlenmiştir. P2 hatında elde edilen sürgünler 5 ay sonra hızlı çoğaltım ortamına alınmıştır. 0, 2, 4, 6, 8 ve 10 mg/l BAP, 0 ve %10 CW içeren ortamlarda kültüre alınmıştır. En yüksek oranda sürgün 6 mg/l BAP %10 CW içeren ortamdan elde edilmiştir. Sürgünler IBA içeren ortamlarda köklendirilmiş ve seraya aktarılarak büyümeye bırakılmıştır. Sürgünler sürgün rejenerasyonu ve köklenme için katı MS ortamına aktırılmış ve köklenen bitkilerden fertil bitkiler elde edilmiştir. Özcan vd (1992), bezelyede olgunlaşmamış kotiledonlardan sürgün rejenerasyon protokolü geliştirmişlerdir. Çalışma sonunda, 0.5 mg/l BAP ve 4 mg/l NAA içeren MS besin ortamında çoklu sürgünler elde edilmiştir. Sürgün rejenerasyonu embriyoların kotiledondan koparıldığı bölgede gerçekleşmiştir. Besin ortamına AgNO 3 ilave edildiğinde rejenere olan sürgün sayısı değişmediği, fakat iyi gelişmiş yapraklara sahip sürgünler elde edilmesine rağmen, köklenme kapasitesinin düşük olduğu gözlenmıştir. Rejenere olan sürgünler, 1 mg/l IBA içeren ortamda köklendirilip, daha sonra komposta aktarılarak büyütülmüştür. Barna vd (1994), olgunlaşmamış nohut (Cicer arietinum) yapraklarından oluşan kalluslardan organogenesis yoluyla adventif sürgün rejenerasyonu elde etmişlerdir. En iyi kallus oluşumu, 10 µm NAA ve 5 µm BAP içeren besin ortamından alınmıştır. Gövde dokularının en alt kısımlarından alınan eksplantlar için en iyi sürgün rejenerasyonu ortamı ise 10 µm BAP ve 0.1 µm IBA içeren MSO besin ortamı olduğu görülmüştür. En iyi kök oluşumu ise, 1 µm IBA içeren ortamdan elde edilmiştir. White vd (1994), ak üçgül (Trifolium repens) bitkisinde yüksek oranda adventif sürgün oluşumu elde etmek için, 3 günlük fidelerden elde ettikleri kotiledonları değişik oranlarda BAP ve NAA içeren MSO besin ortamında kültüre almışlardır. En yüksek 8

20 oranda sürgün, 1 mg/l BAP ve 0.05 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilmiştir. Stanilova vd. (1994), Leucojum aestivum L. ve Lilium rhodopaeum Delip le yapmış oldukları doku kültürü çalışmalarında; bu bitkilerin in vitro hızlı çoğaltım ve bitkilerin farklı organlarının morfogenetik potansiyellerini araştırmışlardır. Eksplant olarak; soğan, gövde, yaprak ve ovaryum kullanmışlardır. L. aestivum un yaprakları, L. rhodopaeum un ise soğan basal kısmının en yüksek rejenerasyon kabiliyetine sahip olduğunu bildirmişlerdir. Kullanılan ortamlardan ise; MS+1 mg/l BAP+ 1mg/l kinetin ve LS+ 0.5mg/l NAA+ 0.1mg/l kinetin in en iyi ortamlar olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca, düşük dozda (5Gy) gamma ışını uygulamasının soğan oluşumunu olumlu yönde etkilediğini bildirmişleridir. Ault (1995), Eucomis zambesiaca, E. comasa, E. Autumnalis in çift pul yapraklarını in vitro da sürgün oluşumu için 4.4, 11.1 ve 22.2 µm BA ile 5.4 µm NAA içeren MS ortamlarında kültüre almışlardır. Her üç türden de elde edilen sürgünler 0, 2.7, 5.4 ve 10.8 µm NAA içeren ortamda köklendirmeye alınmış olup, sırasıyla % 95, % 98 ve % 100 köklenme başarısı bildirilmiştir. Mesa vd. (1995), Heliantus tuberosus L (Jerusalem artichoke) bitkisinde olgunlaşmamış embriyodan sürgün rejenerasyonu ve köklendirme çalışmaları yapmışlardır. En iyi sürgün rejenerasyonun % 2 sukroz 2,0 mg/l BAP içeren MS ortamında; en iyi köklenmenin ise 0,1 mg/l IAA ve 0,5 mg/l NAA içeren ortamdan elde edildiğini bildirmişlerdir. Sürgünler tarlaya aktarılmadan önce kırmızı toprak kum ve organik madde içeren saksılara konulmuştur. Bitkilerin tarlaya aktarıldıklarında % 100 canlılıklarını korudukları belirtilmiştir. Sarrafi vd. (1996), Helianthus annuus L. bitkisinin SS-56 çeşidine ait 2 günlük fidelerinden alınan kotiledon eksplantları 2 mg/l BAP, veya 2 mg/l 2,4-D, veya 0,7 mg/l Kinetin + 2,5 mg/l 2,4-D, 2 mg/l IAA+ Kinetin veya 2,5 mg/l NAA+ Kinetin içeren MS, LS, B 5 ve Blaydes ortamlarına yerleştirilmiştir. En yüksek kallus oluşumu MS ortamında gözlenirken en düşük kallus oluşumu Blaydes ortamında gözlenmiştir. Özcan vd. (1996a), gen aktarımına uygun adventif sürgün oluşumu sağlamak için, in 9

21 vitro koşullarda gelişen korunga (Onobrychis viciifolia) fidelerinden elde ettikleri kotiledon ve hipokotil örneklerini değişik besin ortamlarında kültüre almışlardır. En yüksek oranda sürgün, 0.5 mg/l BAP ve 0.2 mg/l NAA içeren MSO ortamında kültüre alınan hipokotil örneklerinden elde edilmiştir. Gelişen sürgünler daha sonra, 1 mg/l IBA ya da 1 mg/l NAA içeren MSO ortamlarında köklendirilmiştir. Özcan vd. (1996b), korunga (Onobrychis viciifolia) bitkisinde olgunlaşmamış kotiledon ve embriyo ekseni örneklerini değişik oranlarda BAP ve NAA içeren MSO besin ortamında kültüre almışlardır. Genel olarak, olgunlaşmamış embriyo eksenlerinin sürgün oluşturma kapasitesi olgunlaşmamış kotiledonlardan daha yüksek bulunmuştur. En yüksek oranda sürgün, 0.5 mg/l BAP ve 2 mg/l NAA içeren MSO ortamında kültüre alınan örneklerden elde edilmiştir. Gelişen sürgünler daha sonra, 1 mg/l IBA ve 1 mg/l NAA içeren MSO ortamlarında köklendirilmiştir. Kara vd (1996), Keberede aşı ile çoğaltma ve birkaç yıllık bitkilerden ayırma yoluyla da çoğaltma yapılabildiğini bildirmişlerdir. Siska vd (1996), değişik konsantrasyonlarda NAA, IAA, BAP ve TDZ içeren MS besin ortamında Digitalis purpurea nın yaprak, kotiledon, boğum ve sap ucu eksplantlarını kültüre almış, adventif sürgün rejenerasyonu bakımından morfogenetik potansiyelleri belirlemişlerdir. En yüksek sürgün 3 mg/l 2-IP ve 0.3 mg/l IAA içeren ortamlarda elde edilmiştir. Boğum ve sürgün ucu eksplantlarının her ikisinin de oluşturduğu yaprakların normal D. purpurea fenotipine benzediğini kaydetmişlerdir. Optimum köklenme ortamının 0.5 mg/l IAA içerdiğini bildirmişlerdir. TDZ nin 0.5 mg/l lik dozunun, 0.3 mg/l IAA içeren bir ortamda çoklu sürgün oluşumuna neden olduğu kaydedilmiştir. Luo vd (1998), Astragalus adsurgens türünde hipokotil eksplantlarından yüksek oranda adventif sürgün rejenerasyonunu başarmışlardır. İki haftalık hipokotil eksplantları 9 µm 2,4-D ve 2.2 µm BAP içeren MS besin ortamında kültüre alınmış, daha sonra 0.5 µm NAA ve 8.9 µm BAP içeren rejenerasyon ortamına aktarılmıştır. Bu ortamda % 75 oranında rejenerasyon frekansına ulaşılmıştır. 10

22 Cuenca vd. (1998), doğadan toplanan Centaurea paui nin ilkbaharda çiçeklenen meristematik sürgünleri ile sterilizasyon çalışması yapmışlardır. Gövde 50 mm parçalar halinde kesildikten sonra sabunlu suda bekletilip musluk suyundan geçirilmiştir. 1 dk etanolde bekletildikten sonra 3 damla tween-80 içeren % 7 CaOCl de 20 dk manyetik karıştıcıda yüzey sterilizasyonuna bırakılmış 4 kez 5 er dk steril saf su ile durulanmıştır. 50 mm lik gövde eksplantları 20 mm lik uzunluğunda 1-2 boğumlu parçalar halinde kesilmiş ve yerleştirilmiştir. Doğu İspanya da tehdit altında ve endemik olan Centaurea paui bitkisinin çiçekli gövdelerinde hızlı çoğaltım çalışmışlardır. In vitro ortamda en iyi sürgün oluşumunun 0,5 mg/l BAP içeren ya da 2,0 mg/l Kin içeren MS ortamında olduğunu bildirmişlerdir. Çağlar (1998), Kahramanmaraş'ta yetişen kebere bitkisinin doku kültürleriyle in vitro çoğaltımı amaşçlamıştır. Kebere sürgünleri bir boğumlu parçalara ayrılmış, yüzey dezenfeksiyonu yapıldıktan sonra steril ortamda içerisinde MS temel besin ortamı bulunan test tüplerine dikilmiştir. Besin ortamlarına sürgün oluşumu için BA, kök oluşumu için IAA ve IBA ilave edilmiştir. IAA'nın 0.01, 0.05, 0.1 ve 0.5 mg/l dozları IBA'nın 1,2,3 ve 5 mg/l dozları kullanılmıştır. Bu oksin dozları 1 mg/l BA ile kombine edilmiş, kombine tüplere BA konulmamıştır. Eksplantlardan yeni bitkicikler oluşturulmuştur. BA ilave edilen ortamların tümünde kardeşlenme oranı yüksek ( adet sürgün/eksplant), BA'sız ortamlarda düşük ( adet sürgün/eksplant) bulunmuştur. Elde edilen bitkiciklerin kök oluşturmasında IAA'nın 0.1 mg/l ve IBA'nın 5 mg/l dozlarının etkili olduğu, daha düşük dozların etkili olmadığı saptanmıştır. Dagustu vd. (1999), 0,5, 1,0 ve 1,5 mg/l NAA ve BAP içeren MS ortamında ayçiçeği çeşitleri Sunbred 281 ve Sunbronun kotiledon eksplantları hem aydınlığa hem de karanlığa konularak sürgünler elde edilmiştir. Oluşan sürgünler NAA içeren ½ MS ortamında köklendirilmiştir. 4 hafta sonra bitkicikler steril toprağa aktarılıp adaptasyona tabi tutulmuşlardır. Sunbro çeşidinde sunbreb 281 çeşidinden daha fazla kallus oluşumu gözlenmiştir. Sürgün oluşumu % 0-17 arasında, köklenmenin % 6,8 ve % 29,5 arasında olduğu görülmüştür. Aydınlıktaki bitki rejenerasyonunun karanlıktakinden daha iyi olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen bitkilerin % 50 si dış koşullara adapte olmuştur 11

23 Cuence vd (2000), tehdit altında olan endemik Centaurea spacchii nin çiçekli meristemlerinde hızlı çoğaltım yöntemi geliştirmişlerdir. Çalışmada % 15 kontaminasyon gözlenmiştir. 1 mg/l BAP içeren MS besin ortamında yüksek oranda sürgün oluşumu gözlenmiştir. Fakat oluşan sürgünlerin boyunun uzamadığı bildirilmiştir. Tek çeşit oksin kullanımı ile 6 hafta sonunda köklenme oranı düşük olduğu gözlenmiştir. İki çeşit oksin kullanımında ise en iyi sonuçların 2 mg/l IAA ve 2 mg/l IBA içeren MS besin ortamında % 60 köklenme elde edildiği gözlenmiştir. Sürgünlerin % 50 si 3 hafta içinde köklenmeye başlamıştır. Seraya aktarılan bitkilerin ise % 80 inin canlılığını koruduğu rapor edilmiştir. Tonçer ve Akın (2000), Güney Doğu Anadolu Bölgesin de kebere yetiştiriciliğinin yöre halkına sağlayacağı ekonomik getiri ve yaratacağı istihdam olanaklarının yanı sıra baraj havzalarında ağaçlandırmanın ikamesi olarak kullanılması durumunda sağlayacağı çevresel ve ekonomik faydaları olduğunu, kebere ihracatındaki sorunlarımızın başında dış pazarın talebini karşılayacak derecede arzı sağlayamamamızın geldiğini, ikinci büyük sorunumuzun ise, keberenin doğadaki yabani bitkilerden rastgele toplanması nedeniyle standart dışı, ürün elde edilmesi olduğunu belirtmektedirler. Sage vd. (2000), Narcissus pseudonarcissus Golden Harvest çeşidinin yaprak eksplantlarından sürgün rejenerasyonu ve soğan eksplantlarından somatik embriyo elde etmişlerdir. Denemelerde somatik embriyogenesis için yaprak laminası, yaprak tabanı, ve soğan pul yaprakları gibi eksplantlar kullanılmıştır. Somatik embriyogenesis için 5 µm 2,4-D ve 0.5 µm 2,4-D veya 5 µm BAP içeren ortamların başarılı olduğu ve skap eksplantının diğer eksplantlardan daha erken somatik embriyogenesis oluşturduğu bildirilmiştir. Ayrıca, yaprak eksplantlarında 2,4-D nin etkili olduğunu picloramın ise etkisiz olduğunu tesbit etmişlerdir. Somatik embriyolar 4 C de 4.9 µm IBA içeren ortamda bitkiciklere dönüştürülmüş ve bu bitkiler ex vitro koşullara transfer edilmiştir. Sancak vd. (2000), yüksek oranda adventif sürgün rejenerasyonu elde etmek için Macar fiğinin (Vicia pannonica) olgunlaşmamış kotiledon ve embriyo eksenlerini değişik oranlarda BAP ve NAA içeren MSO besin ortamında kültüre almışlardır. Olgunlaşmamış embriyo eksenlerinin sürgün rejenerasyon kapasitesi olgunlaşmamış 12

24 kotiledon eksplantlarından yüksek bulunmuştur. Olgunlaşmamış kotiledon eksplantlarında en yüksek sürgün rejenerasyonu 20 µm BAP ve 2.5 µm NAA içeren ortamdan elde edilirken, olgunlaşmamış embriyo eksenlerinde ise 5 µm BAP ve 5 µm NAA içeren ortamdan elde edilmiştir. Elde edilen sürgünler 1/2 MS ve 5 µm IBA içeren ortamda köklendirilip başarılı bir şekilde seraya aktarılmıştır. Bhatti (2001), mercimekte hızlı çoğaltım için uç ve koltukaltı meristemlerini in vitro koşullarda izole ederek değişik oranlarda BAP (1.00, 2.00 ve 4.00 mg/l)-naa (0.2 ve 0.02 mg/l) ve TDZ (0.05 ve 0.1 mg/l)- NAA (0.2 ve 0.02 mg/l) içeren MSO ortamlarında kültüre almıştır. Eksplant başına sürgün sayısı bakımından uç meristem eksplantında en yüksek değer 5.33 adet ile 2 mg/l BAP ve 0.02 mg/l NAA, koltukaltı eksplantında ise en yüksek değer ise 4.62, adet ile 4 mg/l BAP ve 0.02 mg/l NAA içeren ortamdan elde edilmiştir. Yüksel vd. (2002), Capparis ovata nın çelik yoluyla kültürünün yapılıp yapılmamasını incelemek üzere otsu kebere çeliklerini doğal alanlardan Nisan ayı içerisinde toplamışlardır. Çeliklerde köklenmeyi teşvik etmek amacıyla büyüme düzenleyicilerden IAA, IBA ve NAA, 60 dk süreyle 500, 1000 ve 1500 ppm dozlarında uygulanmıştır. Capparis ovata çeliklerinde en yüksek köklenme oranı sırasıyla IAA 1000 ppm % 33.1, IBA 1500ppm % 32.0 ve NAA 1000 ppm % 26.5 dozlarından elde edilmistir. Khawar vd. (2002), MS besin ortamında gelişen Ali Dayı mercimek çeşidine ait 10 günlük sürgünleri keserek, köklendirme için 0.25, 0.5, 1.0, ve 2.0 mg/l IBA içeren MSO besin ortamına aktarmışlardır. Dört hafta sonra en yüksek köklenme oranı (% 25), sürgün başına ortalama kök sayısı (7.87 adet) ve ortalama kök uuzunluğu (7.18 cm) 0.25 mg/l IBA içeren MSO besin ortamından elde edilmiştir. Uranbey vd. (2003), nohut geveninde (Astragalus cicer L.) hipokotil, gövde, kotiledon ve petiol eksplantlarını çeşitli konsantrasyonlarda BAP ve NAA içeren MS besin ortamında kültüre almışlardır. En yüksek adventif sürgün rejenerasyonu hipokotil 13

25 eksplantlarından 10 µm BAP ve 0.1 µm NAA içeren MS besin ortamından elde edilmiştir. Padilla vd. (2003), Annona cherimola Mill. tohumlarının labaratuar şartlarında çimlenme durumlarını araştırmışlardır. Çalışmada sağlam tohumlar sterilize edilmiştir ve karanlıkta 30 ºC de 24 saat suda tutulduktan sonra 8.67 M GA 3 ilave edilmiştir. Bu yöntem ile tohumların çimlenmelerinin ortalama % 80 oranında arttığı kaydedilmiştir. Bu durumun diğer kültür bitkilerinde uygulanarak benzer sonuç alınabileceği bildirilmiştir. Hou vd. (2004), Astragalus melilotoides türünde somatik embriyogenesis ve organogenesis yoluyla hipokotil ve gövde eksplantlarından yüksek frekansta bitki rejenerasyonu başarmışlardır µm NAA ve 4.44 µm BA içeren MS besin ortamında hipokotil eksplantlarından % 98.3 oranında somatik embriyo oluşumu elde edilmiştir. Pascual vd. (2004), Bu araştırmada Capparis tohumlarında sert kabukluluk sonucunda meydana gelen fizyolojik dormansinin kaldırılmasında 7 farklı yöntem denenmiştir. En yüksek çimlenme yüzdesi, son çimlenmenin % 50 sine kadar süren zaman ve relative cumulative rate hesaplanarak incelenmiştir. Analizlerde mantık fonksiyonu (logical function) kullanılmıştır. En iyi sonuç, asit uygulanmasından sonra tohumların GA 3 e tabi tutulması yöntemi ile elde edilmiştir. Soyler vd. (2006), kebere tohumlarını 5.78 mm GA 3, 5.78Mm GA 3 +kabuk çizme, 19.78mM KNO3, 19.78mM KNO3+ kabuk çizme ve soğuk + kabuk çizme,15-20 ve derece arasında değişen sıcaklıklar hem 12 saat (fotoperiyot), 24 saat kesintisiz devamlı ışık (4.2m mol m-2s-1) hem de kesintisiz devamlı karanlığa tabi tutmuşlardır. Genel olarak 5.78 mm GA 3 + kabuk çizme, tüm ışık şartlarında ve derece arasında değişen sıcaklık tohumların çimlenmesi üzerinde olumlu etki bırakmıştır. Sonuç olarak en yüksek tohum çimlenmesi çizilmiş 5.78 Mm GA 3, e tabi tutulan tohumlar bir alternatif değişik sıcaklıkta, 12 saat ışık ve 12 saat karanlık bir fotoperyoda tabi tutulmuştur. Sonuçlar tohumlardaki çimlenmenin ışık, sıcaklık ve 14

26 fizyolojik dormansi arasında olan bir interaksiyona bağlı olduğunu açıklamaktadır. Fiziksel dormansi ve tohum kabuğu arasında bir ilişkinin var olduğu saptanmıştır. Soyler vd. (2007), bu çalışmada NAA ve GA 3 ün kebere tohumlarındaki dormansi üzerindeki etkisini araştırmışlardır. Tohumlar önceden gece boyuca 40 C su içerisine konmuştur. Daha sonra 20 dk H 2 SO 4 ile muamele edilip 20 gün iklim dolaplarında bekletilmiştir ve 2000 mg/l dozlarında NAA ve GA ve 24 saat muamele edilen tohumlardaki çimlenme incelenmiştir. En yüksek çimlenme (% 61) 24 saat GA 3 muamelesinde gözlenmiştir. Tetrazoliyum testi sonucunda 50 adet tohumdan 49 tanesinin canlı olduğu tespit edilmiştir. NAA muamelesinde ise en yüksek çimlenme (% 22) 30 dk 2000 mg/l NAA olunca gözlemlenmiştir. Kalın kabuklu tohumlardaki dormansinin kabuktan kaynaklanmış olduğu bilinmektedir. H 2 SO 4 kalın kabuğun aradan kaldırmasında, NAA ve GA 3 in ise oksijenin embriyoya ulaşmasını sağlayarak çimlenmede olumlu etki bırakmıştır. Sonuç olarak GA 3 uygulanması NAA dan daha iyi sonuçlar vermiştir. Rodriguez vd. (2007), en yüksek çimlenme oranı büyüme düzenleyicileri ihtiva eden MS ortamı (% 71) ve bisturi kullanılarak kabukları çizilmiş tohumların dormasisini kaldırdıktan sonra steril suda (% 64) elde etmişlerdir. Eksplant olarak boğum arası kültürü, MS ve BAP (1.5 mg/l),iba (0.05 mg/l), ±GA 3 (0.1 mg/l) içeren MS ortamı içerisinde 4 hafta süresince (intervals) çok sayıda sürgün oluşturmuştur. Her 6 haftada 2-3 boğumlu olan sürgün parçacıkları aynı ortamda alt kültüre alınarak sürgünler çoğaltılmıştır. 6 kere alt kültürden sonra her bir yeni eksplantdan ortalama 20 tane yeni kök elde edilmiştir. Sürgünlerde en yüksek köklenme (% 87) karanlıkta 4 saat IAA (100 mg/l) ye tabi tutulan sürgünlerin yarım MS ortamında 30 gün süresince bekletilerek elde edilmiştir. Chalak vd. (2007), 6 hafta içerisinde kebere tohumlarını in vitro koşullarında başarıyla çimlendirmişlerdir. Tohumdan elde edilen sürgünler parçalanarak 4 mg/l kinetin içeren ortamda çoğaltılmıştır. Tohum originli klonların arasında çoğalma kabiliyeti bakımından önemli bir fark gözlemlenmiştir. Daha fazla çoğaltım amacıyla kinetinin farklı konsatrasyonları kullanılmıştır. En iyi sonuç 4 mg/l kinetin içeren ortamdan elde 15

27 edilmiştir. Ayrıca 1 mg/l kinetin içeren ortamda iyi derecede köklenme gözlemlenmiştir. 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1. Bitki Materyali Bitki materyalı olarak Türkiyedeki çalışmada kullanılan Capparis spinosa türünün tohumları Hatay ilinin Kırıkhan ilçesinden temin edilmistir. Çalışma döneminde Capparis ovata türünün türünün tohumlari ise yeterli miktarda temin edilmedikten dolayı çalışması düşünülmüş olmasına rağmen çalışılamamıştır. İrandaki çalışmada kullanılan Capparis spinosa türünün tohumları Golestan ilinin Gorgan ilçesinden temin edilmiştir Yöntem Büyüme ortamları ve kültür koşulları Denemelerde MS mineral tuz ve vitaminleri (Murashige ve Skoog 1962; Çizelge 3.1) ile % 3 sukroz içeren ve % 0.8 lik (type A, Sigma) veya % lik agar (Duchefa) ile katılaştırılan temel besin ortamı (MSO) kullanılmıştır (Çizelge 3.1). Ortam hazırlığında çift distile saf su kullanılmış olup, gereken durumlarda besin ortamına farklı konstrasyonlarda bitki büyüme düzenleyicileri (sitokinin ve oksin) ilave edilmiştir. Besin ortamının ph sı 1N NaOH ve 1N HCl kullanılarak 5.7 e ayarlandıktan sonra 1.4 kg basınç altında ve 120 o C de 20 dk tutularak sterilizasyon sağlanmıştır. Tüm kültürler beyaz floresan ışığı (15000 Lüks) altında 16 saat ışık ve 8 16

28 saat karanlık fotoperiyodunda 24±1 o C sıcaklıkta tutulmuşlardır. Capparis spinosa tohumları petri kaplarında BAP (0.25, 0.50, 1 mg/l), NAA (0.25, 0.50, 1 ve 2 mg/l) ve GA 3 (2 ve 6 mg/l) içeren MS besin ortamına yerleştirilerek çimlendirmeleri 7 hafta süresince iklim dolaplarında bekletilmiştir. Çizelge 3.1 Murashige ve Skoog (1962), ortamında bulunan besin maddeleri ve oranları Ortamda bulunan maddeler Konsantrasyonu (mg/l) NH 4 NO Makro Elementler KNO CaCI 2. 2H 2 O MgSO 4. 7H 2 O KH 2 PO KI 0.83 H 3 BO MnSO 4. 4H 2 O ZnSO 4. 7H 2 O 8.60 Mikro Elementler Na 2 MoO 4. 2H 2 O 0.25 CuSO 4. 5H 2 O CoCl 2. 6H 2 O FeSO 4. 7H 2 O

29 Na 2 EDTA.2H 2 O Myo-Inositol Nicotinic Acid 0.50 Vitaminler Pyrotinic Acid 0.50 Thiamine-HCI 0.10 Glycine Bitki büyüme düzenleyicilerinin kullanımı Çalışmada kullanılan kimyasal maddeler Duchefa (Almanya) ve Sigma Aldrich Chemical Co (St Lo. Mo, ABD) dan temin edilmiştir. Büyümeyi düzenleyiciler uygun çözücülerde çözüldükten sonra standart şekilde istenilen miktar ve oranda stok solusyonları hazırlanmıştır (Çizelge 3.2). Hazırlanan stok solusyonların +4 o C de saklanmıştır. Büyümeyi düzenleyiciler ortamlara otoklavda steril edilmeden önce ilave edilmiştir. Çizelge 3.2 Kullanılan büyümeyi düzenleyicilerin çözücüleri, saklama koşulları ve sterilizasyon yöntemleri Büyüme düzenleyiciler Çözücü Saklama koşulları ( o C) Sterilizasyon şekli Oksinler NAA 1N NaOH +4 Otoklavlanarak IBA 1N NaOH +4 Sitokininler 18

30 BAP 1N NaOH +4 Otoklavlanarak Gibberellik asit Su +4 Filtre sterilizasyonuyla Kebere tohumlarına HCl muamelesi Capparis spinosa tohumunun kabuğunun çok kalın olması çimlendirmeyi geciktirmektedir. Çimlendirmeyi başlatmak ve hızlandırmak amacıyla kebere tohumları HCl ile 11 değişik zaman muamelesine (0, 10, 20, 40, 80, 120, 180, 240, 300, 360 ve 480 dk) tabi tütülmüştür. Her muamele, içerisinde 5 adet eksplantın bulunduğu 4 tekerrürlü petri kaplarından oluşmuştur Kebere tohumlarına su, HCl, H 2 SO, KNO3, NaCl, IAA, sıcak ve soğuk muamelesi Çimlenmeyi olumsuz etkileyen tohum kabuğu sertliğine karşı yapılan diğer bir çalışmada kebere tohumları 48 saat su; 4 saat 40 oc su; gece boyu suda bekletilip, 1 saat % H 2 SO 4 ; 12 saat su, 24 saat kurutma tekrar 12 saat su; 4 saat su, 24 saat +4 oc ile 1 saat 25 mg/l GA 3 ; 1 saat %2 KNO 3 ; 100 oc su; çizme; ıslatıp 7 gün -10 oc ile 1 saat 25 mg/l GA 3 ; 1 saat 40 mg/l IAA; 6 saat %37 HCl ile 25 mg/l GA 3 ; 7 gün 40 oc; 24 saat 40 oc su; 12 saat %1 NaCl gibi değişik muamelere tabi tutulduktan sonra 15 güne kadar çimlenen tohumların sayımı yapılarak çimlenme yüzdeleri hesaplanmıştır In vitro da yüzey sterilizasyonu 19

31 In vitro çalışmalardaki ilk aşama yüzey sterilizasyonudur. Bu çalışmada bitki materyalı olarak tohum kullanıldığından yüzey sterilizasyonunda yüksek doz ve süre tercih edilmiştir. Tohumlar üzerindeki kalıntıların uzaklaştırılması amacıyla ilk önce deterjanla yıkanan tohumlar dk akar çeşme suyunun altında tutulup daha sonra 30 dk süresince % 100 lük çamaşır suyu (NaOCI- Ace) ile muamele edilip steril saf su ile durulanmıştır Kebere tohumlarının çimlendirilmesi Capparis spinosa tohumları steril edildikten sonra petri kaplarında BAP (0.25, 0.50, 1 mg/l), NAA (0.25, 0.50, 1 ve 2 mg/l) ve GA 3 (2 mg/l ve 6 mg/l) içeren MS besin ortamına yerleştirilerek çimlendirilmeleri için 7 hafta süresince iklim dolaplarında 24±1 o C de 16 saat ışık, 8 saat karanlık fotoperiyotla bekletilmiştir Eksplant izolasyonu Tohumların çimlendirilmesinden elde edilen ve In vitro gelişen steril sürgünlerden gövde, yaprak ve koltukaltı meristem eksplantları izole edilmiştir. Her eksplant farklı çoğaltım ortamlarında kültüre alınmıştır Mikroçoğaltım İzole edilen eksplantlar (gövde, yaprak ve koltukaltı meristem), adventif sürgün rejenerasyonu için farklı konsantrasyonlarda BAP (0.1 ve 0.4 mg/l) ve NAA (0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg/l) içeren MS besin ortamına aktarılmıştır ve 8 hafta süresince iklim dolaplarında bekletilmiştir Rejenere olmuş sürgünlerin köklendirilmesi Rejenerasyon sonucunda elde edilen sürgünler 25 mg/l IBA ile 5 dk muamele edilerek büyüme düzenleyici içermeyen ½ MS besi ortamında magenta kaplarında köklendirilmeye alınmıştır İstatistiki analizler 20

32 Denemeler tesadüf parselleri deneme desenine göre kurulmuş, her muamele 100x10 mm lik petri kapları içerisinde her petride 5 adet tohum olacak şekilde 4 tekerrürden oluşmuştur. Elde edilen veriler SPSS for Windows programı yardımıyla varyans analizine tabi tutulmuştur. Yüzde değerler, istatistik analizinden önce arcsindeğerlerine çevrilmiştir (Snedecor and Cochran 1977). 21

33 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1 HCl Uygulamasının Çimlenme Üzerine Etkisi Önceden 11 değişik muamele (0, 10, 20, 40, 80, 120, 180, 240, 300, 360 ve 480 dk arasında değişen zaman sürelerinde) HCl e tabi tutulan kebere tohumları GA 3 (2.0mg/l) içeren MS ortamlı, 4 tekerrürlu ve her tekerrür petri kaplarında çimlendirilmeye alınmıştır (Şekil 4.1). Her bir petride çimlenme yüzdesi hesaplanmıştır ve uygulanan farklı shgbürelerin sonucunda kaydedilen çimlenme yüzdeleri arasındaki farklılıkların önem düzeylerini belirlemek amacıyla yapılan varyans analizi ve Duncan Testi sonuçları sırasıyla Çizelge 4.1 ve 4.2 de verilmiştir. Çizelge 4.1 de görüldüğü gibi HCl muamelesinde uygulanan süreler arasında 0.01 düzeyinde farklılık çıkmıştır. Çizelge 4.2 de görüldüğü gibi en fazla çimlenme yüzdesi (% 73.33), 360 dk süreyle % 37 lik HCl uygulamasından elde edilmiştir. Ancak 480 dk HCl muamelesi gören tohumların tamamen zarar gördükleri ve bu tohumlarda çimlenme olmadığı gözlenmiştir. HCl muamelesi yapılmayan tohumlarla 10 dk HCl e tabi tutulan tohumların arasında çimlenme yüzdesi (% 23.33) bakımından her hangi bir fark gözlemlenmemiştir. Daha sonra en yüksek çimlenme (% ve % 41.66) sırayla 180 dk ve 300 dk süre ile HCl e tabi tutulan tohumlardan elde edilmiştir. 20, 40 ve 120 dk sürelerinde HCl e tabi tutulan tohumların çimlenme yüzdeleri sırayla (% 30.00, % ve % 30.00) olarak kaydedilmiştir. Bu yüzden daha sonraki çalışmalarda önemli farkla kendini gösteren 360 dk HCl uygulanması tercih edilmiştir. 22

34 Şekil 4.1 C. spinosa bitkisinin % 37 lik HCL ile 360 dk muamele edilen tohumlarının çimlenmesi (a,b,c ve d) Çizelge 4.1 Tohum çimlenmesi üzerinde farklı sürelerde %37 lik HCl muamelesinin etkisine ait varyans analizi Çimlenme Yüzdesi (% 100) V.K. S.D. K.O. F Ortamlar ** Hata Genel Toplam 32 **0.01 düzeyinde önemlidir 23

35 Çizelge 4.2 Tohum çimlenmesi üzerinde farklı sürelerde %37 lik HCl muamelesinin etkisi Muamele Süresi (dk) Çimlenme oranı (%) e e de de e de b cd c a f Aynı sütunda farklı harflerle gösterilen ortalamalar arasındaki fark 0.01 düzeyinde önemlidir H 2 SO 4, HCl ve GA 3 Uygulamasının Çimlenme Üzerine Etkisi Urmia Üniversitesinde yapmış olduğum diğer bir çalışmada (Şekil 4.2 ve 4.3) Kebere (C. spinosa) tohumları üzerinde farklı sürelerde farklı kimyasallar ve sıcaklıklar uygulanmıştr gün sonra çimlenen tohumların sayımı yapılarak çimlenme yüzdeleri hesaplanarak varyans analizine tabi tutulmuştur (Çizelge 4.3). Farklı muamelelere tabi tutulan tohumlara ait çimlenme yüzdeleri üzerinde yapılan Duncan testine göre uygulanan muameleler arasında önemli fark çıkmamıştır (Çizelge 4.4). 24

36 Çizelge 4.3 Farklı muamelelere tabi tutulan tohumların çimlenme yüzdelerine ait varyans analizi Çimlenme oranı V.K. S.D. K.O. F Ortamlar ös Hata Genel Toplam 11 Ös: önemsiz Çizelge 4.4 Farklı muamelelere tabi tutulan tohumların çimlenme yüzdelerinin ortalaması Muamele Çimlenme yüzdesi ortalama ( % ) 1 gece suda bekletmek saat H 2 SO 4 24 saat +4 C 19 1 saat 25 mg/l GA 3 7 gün -10 C saat 25 mg/l GA 3 6 saat HCl saat 25 mg/l GA 3 25

37 Şekil4.2 İran da Urmiye Üniversitesinde; (a ve b) Kebere tohumlarına GA 3 muamelesi, (c) çimlenen tohumların incelenmesi, (d) Dr. TAJBAKHSH in yardımıyla çimlenen tohumların sayımı ve çimlenme yüzdelerinin hesaplanması. Şekil4.3 (a) Uygulamalarda kullanılan % 95-% 98 lik H 2 SO 4 ; (b) Uygulamalarda kullanılan % 37 lik HCl; (c) 1 saat H 2 SO 4 a tabi tutulan tohumların çimlenmesine ait bir görüntü. 26

38 4.3 Farklı Konsantrasyonlarda BAP, NAA ve GA 3 in Çimlenme Üzerine Etkisi Önce 360 dk, % 37 lik HCl e tabi tutulan daha sonra yüzey sterilizasyonu yapılan tohumlar, 34 muamele farklı konsantrasyonlarda BAP (0.25, 0.50 ve 1.00 mg/l), NAA (0.25, 0.50, 1.00 ve 2.00 mg/l ) ve GA 3 (2.00 ve 6.00 mg/l) içeren ortamlar ve her muamele içerisinde 4 tekerrür petri kaplarından ve her petri de 5 tohum la oluşmuştur. Yedi hafta sonra 34 farklı ortamdan elde edilen çimlenme yüzdeleri hesaplanarak varyans analizi yapılmış ve sonuçlar Çizelge 4.5 ve 4.6 da verişmiştir. Çizelge 4.5 te görüldüğü gibi muameleler arasındaki fark 0.01 düzeyinde önemli çıkmıştır (Çizelge 4.5). Farklı BAP, NAA ve GA 3 uygulanmaları sonucunda da Capparis spinosa da çimlenme oranı % 100 e çıkarılmıştır (Çizelge 4.6). Çizelge 4.5 Farklı konsantrasyonlarda BAP, NAA ile 2 ve 6 mg/l GA 3 içeren ortamlarda çimlenme yüzdelerine ait varyans analizi. Çimlenme oranı V.K. S.D. K.O. F Ortamlar Hata Genel Toplam 101 **0.01 düzeyinde önemlidir 27

39 Çizelge 4.6 Farklı BAP, NAA ve GA 3 konsantrasyonlarının çimlenme üzerine etkisi BAP (mg/l) NAA (mg/l) GA 3 (mg/l) Çimlenme oranı (%) d a ab a ab a a ab a c a abc a abc ab abc a a a ab ab ab a a ab bcd a ab a abc a a a a Aynı sütunda farkli harflerle gösterilen ortalamalar arasındaki fark 0.01 düzeyinde önemlidir. 28

40 4.4 Mikroçoğaltım Kebere tohumlarının çimlendirilmesinden elde edilen eksplantlar (gövde, yaprak ve koltukaltı meristem) ile yapılan in vitro hızlı çoğaltım çalışmalarında 8 haftalık in vitro gelişen bitkiciklerden gövde, yaprak ve koltukaltı meristem izole edilerek değişik oranlarda BAP (0.1, ve 0.4 mg/l) ve NAA (0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg/l) içeren MS besin ortamlarında kültüre alınmıştır. Farklı BAP-NAA konsantrasyonlarının sürgün oranı, eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu üzerine etkisi araştırılmıştır Gövdeden sürgün rejenerasyonu In vitro gelişen bitkiciklerden gövde kısmı izole edilerek değişik oranlarda BAP (0.1, ve 0.4 mg/l) ve NAA (0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg/l) içeren MS besin ortamlarında kültüre alınmıştır. Kültür başlangıcından 5-7 gün sonra sürgünler gelişmeye başlamıştır. Yedi hafta sonra kültüre alınan eksplantlarda (Şekil 4.4) farklı BAP-NAA konsantrasyonlarının sürgün oluşum oranı, eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu üzerindeki etkisine ait veriler toplanmıştır. Bu verilerin varyans analizi Çizelge 4.7 de verilmiştir. 29

41 Şekil 4.4 Gövdeden sürgün rejenerasyonu. 30

42 Çizelge 4.7 de görüldüğü gibi yapılan varyans analizi sonucunda sürgün oluşum oranı bakımından ortamlar arasındaki farklılık 0.01 düzeyinde önemli bulunmuştur. Eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu bakımından ortamlar arasındaki farklılık bulunmamıştır. Bu farklılıkların önem düzeyini belirlemek amacıyla yapılan Duncan testi sonuçları Çizelge 4.8 de verilmiştir. Çizelge 4.7 Farklı BAP ve NAA konsantrasyonlarının gövde eksplantından sürgün rejenerasyonuna etkisine ait varyans analizi Sürgün Oluşum Oranı (%) Eksplant Başına Sürgün Sayısı Sürgün Uzunluğu (cm) V.K. S.D. (Adet) K.O. F K.O. F K.O. F Ortamlar ** Hata Genel Toplam 14 **0.01 düzeyinde önemli Çizelge 4.8 de görüldüğü gibi eksplant başına sürgün yüzdesi bakımından en yüksek yüzde (% 60), 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilerek bu ortamın a grubuna girmesini sağlamıştır. Eksplant başına en az sürgün yüzdesi ise 0.1 mg/l BAP ve (0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg/l) NAA içeren MS ortamlarında gözlemlenmiştir. Eksplant başına sürgün sayısı bakımından en fazla sürgün (3.00 adet) 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren ortamdan elde edilmiştir. 0.1 mg/l BAP ve 0.3 mg/l NAA içeren MS ortamında ise eksplant başına en az sürgün sayısı (0.33 adet) elde edilmiştir. Sürgün uzunluğu bakımından ise en uzun sürgün 1.66 cm olarak, 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilmiştir. 0.1 mg/l BAP ve mg/l NAA içeren MS ortamlardan ise 0.33 cm lik en kısa sürgün elde edilmiştir. 31

43 Çizelge 4.8 Farklı BAP ve NAA konsantrasyonlarının gövde eksplantından sürgün rejenerasyonuna etkisi BAP NAA Sürgün Oluşum Eksplant Başına Sürgün Uzunluğu Oranı Sürgün Sayısı (mg/l) (mg/l) (%) (Adet) (cm) b b b b a Aynı sütunda farklı harflerle gösterilen ortalamalar arasındaki fark 0.01 düzeyinde önemlidir Yapraktan sürgün rejenerasyonu In vitro gelişen bitkiciklerden yaprak kısmı izole edilerek değişik oranlarda BAP (0.1, ve 0.4 mg/l) ve NAA (0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg/l) içeren MS besin ortamlarında kültüre alınmıştır. Kültür başlangıcından gün sonra sürgünler gelişmeye başlamıştır. Yedi hafta sonra kültüre alınan eksplantlarda (Şekil 4.5) farklı BAP ve NAA konsantrasyonlarının sürgün oluşum oranı, eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu üzerindeki etkisine ait veriler toplanmıştır. Bu verilerin varyans analizi Çizelge 4.9 da verilmiştir. 32

44 Şekil 4.5 Yapraktan sürgün rejenerasyonu Çizelge 4.9 de görüldüğü gibi yapılan varyans analizi sonucunda sürgün oluşum oranı, eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu arasındaki istatistiksel farklılık bulunmamıştır. Genel sonuçları Çizelge 4.10 da verilmiştir. Çizelge 4.9 Farklı BAP ve NAA konsantrasyonlarının yaprak eksplantından sürgün rejenerasyonuna etkisine ait varyans analizi Sürgün Oluşum Eksplant Başına Sürgün Uzunluğu V.K. S.D. Oranı (%) Sürgün Sayısı (Adet) (cm) K.O. F K.O. F K.O. F Ortamlar Hata Genel 14 Toplam 33

45 Çizelge 4.10 da görüldüğü gibi sürgün oluşum oranı bakımından en yüksek değer (% 66.33) 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilmiştir. En düşük sürgün oluşumu ise (% 16.66) 0.1 mg/l BAP ve 0.2 mg/l NAA içeren MS ortamında gözlenmiştir. Eksplant başına sürgün sayısı bakımından en fazla sürgün (5.66 adet) 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilmiştir. Eksplant başına en az sürgün sayısı (0.66 adet) ise 0.1 mg/l BAP ve 0.2 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilmiştir. Sürgün uzunluğu bakımından ise en uzun sürgün (4.66 cm), 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilmiştir. En kısa sürgün (0.66 cm) ise 0.1 mg/l BAP ve 0.2 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilmiştir. Çizelge 4.10 Farklı BAP ve NAA konsantrasyonlarının yaprak eksplantından sürgün rejenerasyonuna etkisi BAP NAA Sürgün Eksplant Başına Sürgün Uzunluğu (mg/) (mg/l) Oluşum Oranı Sürgün Sayısı (cm) (%) (Adet)

46 4.4.3 Koltukaltı meristemlerinden sürgün rejenerasyonu In vitro gelişen bitkiciklerden 1. koltukaltı meristem eksplantı izole edilerek değişik oranlarda BAP (0.1 ve 0.4 mg/l) ve NAA (0.1, 0.2, 0.3, 0.4 ve 0.5 mg/l) içeren MS besin ortamlarında kültüre alınmıştır. Kültür başlangıcından 8-12 gün sonra sürgünler gelişmeye başlamıştır. Yedi hafta sonra kültüre alınan eksplantlarda (Şekil 4.6) farklı BAP-NAA konsantrasyonlarının sürgün oluşum oranı, eksplant başına sürgün sayısı ve sürgün uzunluğu üzerindeki etkisine ait veriler toplanmıştır. Bu verilerin varyans analizi Çizelge 4.11 de verilmiştir. Şekil 4.6 Koltuk altı meristemden sürgün rejenerasyonu Çizelge 4.11 de görüldüğü gibi yapılan varyans analizi sonucunda sürgün oluşum oranı, eksplant başına sürgün sayısı bakımından ortamlar arasında farklılık bulunmazken, sürgün uzunluğu bakımından ortamlar arasındaki farklılık 0.01 düzeyinde önemli bulunmuştur. Bu farklılıkların önem düzeyini belirlemek amacıyla yapılan Duncan testi sonuçları Çizelge 4.12 de verilmiştir. 35

47 Çizelge 4.11 Farklı BAP ve NAA konsantrasyonlarının koltuk altı meristemlerden V.K. sürgün rejenerasyonuna etkisine ait varyans analizi S.D. Sürgün Oluşum Oranı (%) Eksplant Başına Sürgün Sayısı (Adet) Sürgün Uzunluğu (cm) K.O. F K.O. F K.O. F Ortamlar ** Hata Genel Toplam 14 **0.01 düzeyinde önemli Çizelge 4.12 de görüldüğü gibi sürgün oluşumu oranı en yüksek (% 70) 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilmiştir. En düşük sürgün oluşumu oranı ise (% 20.66) 0.1 mg/l BAP ve 0.2 mg/l NAA içeren MS ortamında gözlemlenmiştir. Eksplant başına en fazla sürgün (3.00 adet) 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren MS ortamından elde edilmiştir. En az sürgün (1.66 adet) ise 0.1 mg/l BAP ve 0.2mg/l NAA içeren MS ortamında gölenmiştir. Sürgün uuzunluğu bakımından ise en uzun sürgün (7.66 cm), 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA içeren ortamdan elde edilmiştir. En kısa sürgün (1.00, 1.66 ve 1.00 cm) ise sırasıyla 0.1 mg/l BAP ile 0.2, 0.3 ve 0.4 mg/l NAA içeren MS ortamlarında gözlemlenmiştir. 36

48 Çizelge 4.12 Farklı BAP-NAA konsantrasyonlarının koltuk altı meristemlerden sürgün rejenerasyonuna etkisi BAP NAA Sürgün Oluşum Oranı Eksplant Başına Sürgün Sayısı Sürgün Uzunluğu (mg/l) (mg/l) (%) (Adet) (cm) c c c b a Aynı sütunda farklı harflerle gösterilen ortalamalar arasındaki fark 0.01 düzeyinde önemlidir. 4.5 Sürgünlerin Köklendirilmesi Sürgün oluşumu açısından en iyi sonuçlar genellikle 0.4 mg/l BAP ve 0.1 mg/l NAA ile 0.1mg/l BAP ve 0.5 mg/l NAA içeren ortamlarda yaprak ve koltuk altı meristemlerinden elde edildiği için başlangıçta bu ortamlara yerleştirilen 1-2 cm uzunluğuna erişen sürgünler 250 mg/l IBA ile 5 dk muamele edildikten sonra ½ MS ortamında köklendirmeye alınmış ve sürgünlerde köklenme oranı % 56 olarak bulunmuştur. In vitro şartlarda sürgün rejenerasyonunun sağlandığı besin ortamlarında köklenmeyi sağlamak mümkün olmamaktadır. Bu nedenle sürgünlerin sitokinin içermeyen, fakat köklenmeyi teşvik edici büyümeyi düzenleyicilerinin (IBA gibi) bulunduğu ortamlara transfer edilmesi gerekmektedir (Gönülsen, 1995). Ancak Capparis spinosa da 37

49 köklenmede sorun bulunduğundan büyüme düzenleyici içermeyen ½ MS besi ortamı tercih edilmiştir. Bu gözlemlere dayanarak 7 hafta sonunda 1-2 cm uzunluğa erişen sürgünler kesilerek köklenmeye 25 mg/l IBA da 5-7 dk muamele edip MS ortama alınmıştır. Tüm muamele edilmiş sürgünlerde kökler gözlenmiştır (Şekil 4.7). Şekil 4.7 Rejenere olmuş sürgünlerin köklendirilmesi 38

Daha göster