Peltigera rufescens (WEĐS) HUMB. ĐSĐMLĐ LĐKENDEN ELDE EDĐLEN

Transkript

1 TC. ATATÜRK ÜNĐVERSĐTESĐ SAĞLIK BĐLĐMLERĐ ENSTĐTÜSÜ ECZACILIK FAKÜLTESĐ BĐYOKĐMYA ANABĐLĐM DALI DENEYSEL OLARAK ENFLAMASYON OLUŞTURULAN RATLARDA Peltigera rufescens (WEĐS) HUMB. ĐSĐMLĐ LĐKENDEN ELDE EDĐLEN METANOL EKSTRELERĐNĐN ANTĐOKSĐDANT ENZĐM AKTĐVĐTELERĐ ÜZERĐNE ETKĐSĐ Sevil TANAS Tez Yöneticisi Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU Yüksek Lisans Tezi Erzurum 2007

2 I ĐÇĐNDEKĐLER TEŞEKKÜR ŞEKĐLLER LĐSTESĐ TABLOLAR LĐSTESĐ KISALTMALAR ÖZET SUMMARY Sayfa No : 1.GĐRĐŞ VE AMAÇ 1 2. GENEL BĐLGĐLER Likenler Peltigera Wild Peltigera Rufescens (Weis)Humb Enflamasyon Akut Enflamasyon Kronik Enflamasyon Antienflamatuvar Đlaçlar Steroidal Antienflamatuvar Đlaçlar (SAEI) Non Steroidal Antienflamatuvar Đlaçlar Antioksidanlar Serbest Radikaller Serbest Radikal Çeşitleri Serbest Radikallerin Kaynakları Serbest Radikallerin Etkileri Antioksidan Savunma Sistemleri Doğal (Endojen) Antioksidan Primer Antioksidanlar (Enzimler) Süperoksit Dismutaz (SOD) Katalaz (CAT) Glutatyon Peroksidaz (GPx) Glutatyon Redüktaz (GR) Glutatyon S-Transferaz (GST): Sekonder Antioksidanlar (Enzim Olmayanlar) 69 I V VI VIII IX XII XIII

3 II Glutatyon (GSH) Diğer Sekonder Antioksidanlar Ekzojen Antioksidanlar Gıda Antioksidanları Antioksidan Etki Tipleri MATERYAL VE METOD Deneylerde Kullanılan Kimyasallar Deneylerde Kullanılan Cihazlar Deneylerde Kullanılan Çözeltiler Ve Hazırlanışları Deney Bitkileri Bitki Ekstresinin Hazırlanması Deney Hayvanları Cotton Pelletler Kullanılarak Kronik enflamasyon Karragenin Kullanılarak Akut enflamasyon Biyokimyasal Ölçümleri Biyokimyasal Analizler Đçin Pençe Doku Homojenatlarının Hazırlanması CAT Aktivitesinin Ölçümü GPx Aktivitesinin Ölçümü Süperoksit Dismutaz Aktivitesinin Ölçümü Total GSH Miktarı Ölçümü LPO Miktarı Ölçümü Bitki Ekstresinin Antioksidant Aktivitesinin Belirlenmesi Bitki Ekstresinin Total Fenolik Bileşiklerin Miktarlarının Belirlenmesi Bitki Ekstresinin Đndirgeme Kuvvetinin Belirlenmesi Đstatistiksel Analizler 4. BULGULAR Makroskopik Bulgular Karragenin (Car) Đle Deneysel Olarak Oluşturulan Pençe Ödemleri Üzerine P. Rufescens ten Elde Edilen Metanol Ekstresi (PRME) nın ve Pozitif Kontrol Olarak Kullanılan Diklofenak (DIC) ile ındometazin (IND) in etkileri 90

4 III Pamuk Bilyeler (Koton Pelletler) Đle deneysel olarak oluşturulan Enflamasyonun Proliferatif Fazı (Kronik Enflamasyon) Üzerine P. Rufescens ten Elde Edilen Metanol Ektresi (PRME) nın ve Pozitif Kontrol Olarak Kullanılan Diklofenak (DIC) Đle Đndometazin (IND) in etkileri Biyokimyasal Bulgular Rat Pençelerindeki Katalaz (Cat) Enzim Aktiviteleri Üzerine Peltigera Rufescens in Metanol Ekstresi (PRME), Đndometazin (IND) ve Diklofenak (DIC) in etkileri Rat Pençelerindeki Glutatyon Peroksidaz (Gpx) Enzim Aktiviteleri Üzerine Peltigera Rufescens in Metanol Ekstresi (PRME), Đndometazin (IND) ve Diklofenak (DIC) in etkileri Rat Pençelerindeki Süperoksit Dismutaz (SOD) Enzim Aktiviteleri üzerine Peltigera Rufescens in Metanol Ekstresi (PRME), Đndometazin (IND) ve Diklofenak (DIC) in etkileri Rat Pençelerindeki Glutatyon (GSH) seviyeleri üzerine Peltigera Rufescens in Metanol Ekstresi (PRME), Đndometazin (IND) ve Diklofenak (DIC) in etkileri Rat Pençelerindeki Lipit Peroksidasyon (LPO) Seviyeleri Üzerine Peltigera Rufescens in Metanol Ekstresi (PRME), Đndometazin (IND) ve Diklofenak (DIC) in etkileri: 4.3. Peltigera Rufescens in Metanol Ekstresi (PRME) nin, Antioksidan Özellikleri TARTIŞMA KAYNAKLAR 118

5 IV TEŞEKKÜR Gösterdiği özveri ve anlayışdan dolayı eğitimimin her aşamasında deneyimlerinden ve bilgisinden yararlandığım değerli hocam Yrd. Doç. Dr. Fehmi ODABAŞOĞLU na, yardımlarını ve desteğini esirgemeyen hocam sayın Doç. Dr. Ahmet ÇAKIR a çalışmalarımın başından sonuna kadar her türlü desteği sağlayan ve bu çalışmanın ortaya çıkmasında çok büyük emekleri olan Okutman Yasin Bayır a her zaman yanımda olan Kimyager Fadime ATALAY a ve katkılarında dolayı Araş. Gör. Mesut B.HALICI ya, Araş. Gör Murat KOÇ a likenlerle çalışmam da katkıları olan Sayın Yrd. Doç. Dr. Ali ASLAN a, Çalışmalarım esnasında kapılarını sonuna kadar açan Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezi ne ve Farmakoloji A.B.D. Başkanı Prof. Dr. Fatma GÖÇER, Doç. Dr. Halis SÜLEYMAN a özellikle de deney aşamasında yardımlarını esirgemeyen Yrd. Doç. Dr. Zekai HALICI ya ve Araş. Gör. Elif ÇADIRCI ya Yüksek lisans tezi olarak sunduğum ve Atatürk Üniversitesi Eczacılık Fakültesi nde gerçekleştirilen bu çalışmanın ortaya çıkmasında desteklerini esirgemeyen Fakültemiz Dekanı sayın Prof. Dr. Yunus KARA, Temel Bilimler Bölüm Başkanı sayın Prof. Dr. Yücel KADIOĞLU ve nezdinde tüm Eczacılık Fakültesi personeline, desteğinden dolayı Araş. Gör Elif KESMEN e sonsuz teşekkür ve şükranlarımı sunarım. Ve tabi ki bu yolda beni sonsuz destekleyen ve yüreklendiren canım Anneme ve Babama sonsuz şükranlarımı ve teşekkürlerimi sunmayı bir borç bilirim.

6 V ŞEKĐLLER LĐSTESĐ Sayfa No : Şekil 1. Peltigera rufescens (Weis)Humb.`un doğal ortamında çekilmiş resimleri. 6 Şekil 2. Araşidonik asit metabolitleri yolu.. 17 Şekil 3. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller. 56 Şekil 4. GSH nin molekül yapısı. 69 Şekil 5. Araştırmada kullanılan ratları gösteren fotoğraf. 78 Şekil 6. GSH miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik Şekil 7. LPO miktarlarının belirlenmesinde kullanılan standart grafik 87 Şekil 8. Toplam fenolik bileşiklerin miktarının belirlenmesinde kullanılan 88 gallik asit standart grafiği.. Şekil 9. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pence hacimleri üzerine saatlere bağlı olarak 93 Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın anti-enflamatuvar etkilerinin değişimi Şekil 10. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pence dokularındaki katalaz (CAT) enzim 96 aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerinin değişimi.. Şekil 11. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pence dokularındaki glutatyon peroksidaz (GPx) 98 enzim aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerinin değişimi. Şekil 12. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pence dokularındaki süperoksit dismutaz (SOD) 100 enzim aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerinin değişimi. Şekil 13. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pence dokularındaki glutatyon (GSH) miktarları 102 üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerinin değişimi.

7 VI Şekil 14. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonda pence dokularındaki lipit peroksidasyonu (LPO) seviyeleri üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın etkilerinin değişimi.. Şekil 15. Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME) nin, trolox un ve askorbik asitin antioksidan aktiviteleri

8 VII TABLOLAR LĐSTESĐ Sayfa No : Tablo 1. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 4. saatinde pence hacimleri üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın anti-enflamatuvar etkileri.. Tablo 2. Ratlarda pamuk bilyeler (koton pellet) kullanılmak suretiyle deneysel olarak oluşturulan kronik (proliferatif faz) enflamasyon üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın anti-enflamatuvar etkileri.. Tablo 3. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki katalaz (CAT) enziminin aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri.... Tablo 4. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki glutatyon peroksidaz (GPx) enziminin aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Tablo 5. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki süperoksit dismutaz (SOD) enziminin aktiviteleri üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri Tablo 6. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki glutatyon (GSH) miktarları üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri. Tablo 7. Rat pençelerine karragenin (CAR) enjekte edilerek deneysel olarak oluşturulan akut enflamasyonun 5. saatinde pence dokularındaki lipit peroksidasyonu (LPO) seviyeleri üzerine Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME), indometazin (IND) ve diklofenak (DIC) ın etkileri. Tablo 8. Peltigera rufescens in metanol ekstresi (PRME) nin total antioksidan aktivitesinin, indirgeme gücünün ve fenolik bileşik miktarının karşılaştırılması

9 VIII KISALTMALAR ADP : Adenozin difosfat AMP ASA BSA CAT CAR CCl 4 CC 3 COX cgmp COX DNA DIC GĐS GPx GR GSH GST H 2 O 2 HO. HO 2 - LO LPO LPS : Adenozin monofosfat : Asetilsalisilik asit : Sığır Serum Albumin : Katalaz : Karragenin : Karbontetraklorür : Triklorometil : Siklooksijenaz : Siklikguanozin monofosfat : Siklooksijenaz enzimi : Deoksiribonükleik asit : Diclofenac : Gastro Đntestinal Sistem : Glutatyon peroksidaz : Glutatyon redüktaz : Glutatyon : Glutatyon S-Transferaz : Hidrojen peroksit : Hidroksil radikali : Peroksil : Lipooksijenaz : Lipit peroksidasyonu : Lipopolisakkarit

10 IX IG IgE IFN γ IL IND MDA MPx NAD + NADPH NO. NO + NO 2 - NO 2 NOS cnos inos enos nnos NSAID NBT O 2 : Đndirgeme gücü : Đmmunglobulin E : Đnterferon : Đnterlökin : Đndometazin : Malondialdehit : Miyeloperoksidaz : Nikotinamid adenin dinükleotid : Nikotinamid adenin dinükleotid hidrojen fosfat : Nitrik oksit : Nitronyum iyonu : Azot protoksit :Azot dioksit : Nitrik oksit sentaz : Yapısal nitrik oksit sentaz : Đndüklenebilir nitrik oksit sentaz : Nitrik oksit sentaz : Nöronal nitrik oksit sentaz : Steroid olmayan antienflamatuar ilaçlar : Nitro blue tetrazolium : Süperoksit radikali 1 O 2 : Singlet oksijen PGE PMN : Prostaglandin : Polimorfo nükleer

11 X PUFA PRME RNA RO. ROO. ROS RSO.. RSO 2 TXA2 TNF α ve β SAĐĐ SOD WHO : Polidoymamış yağ asiti : Peltigera rufescens in metanol ekstresi : Ribo nükleik asit : Alkoksil radikalleri : Peroksil radikalleri : Reaktif Oksijen türleri : Sülfenil : Tiyol peroksil radikali : Trombosit agregan ajan ve vazokonstrüktör : Tümör nekrozis faktör : Steroid antiinflamatuvar ilaçlar : Süperoksit dismutaz : Dünya Sağlık Teşkilatı

12 XI ÖZET Bu çalışmada, ratlarda karregenin (CAR) ile uyarılmış akut ve pamuk bilyeler (Cotton Pellet) ile uyarılmış kronik enflamasyon modeli kullanılarak Peltigera rufescens adlı liken türünden elde edilen metanol ekstresi (PRME) nin in vivo anti-enflamatuvar etkisi araştırıldı ve PRME nin anti-enflamatuvar etkisi ticari anti-enflamatuvar ilaçlar olan diclofenac ve indometazin in anti-enflamatuvar etkileri ile mukayese edildi. Akut enflamasyon deneylerinde PRME in 50, 100, 200 ve 400 mg/kg lık dozları denenirken, kronik enflamasyonda ise akut enflamasyonda en yüksek anti-enflamatuvar etkiyi gösteren 200 mg/kg doz, çalışma dozu olarak belirlendi. Akut enflamasyon çalışmaları PRME nin 50, 100, 200 ve 400 mg/kg lık dozlarının ile diclofenac ve indometazinin (25 mg/kg dozlarda) karregenin inflamasyonunu dördüncü saatte sırası ile % 19.3, 31.6, 42.1, 38.6, 45.6 ve 47.4 oranında azatlığını göstermiştir. PRME nin anti-enflamatuvar etkisi 200 mg/ kg doza kadar doza bağımlı olarak artmasına rağmen, 400 mg/kg dozunda antienflamatuvar aktivitenin azaldığı dikkati çekmektedir. Kronik enflamasyon çalışmalarında ise PRME (200 mg/kg), DIC (25 mg/kg) ve IND (25 mg/kg) in sırasıyla % 63.5, % 76.1 ve % 83.8 oranında anti-proliferatif etkiye sahip oldukları belirlendi. Enflamasyon sürecinde rol oynayan önemli faktörlerden birisi de oksidadif hasara sebep olan serbest oksijen radikalleri olduğu düşünülmektedir. Bu düşünceden yola çıkarak tüm sıçan pençe dokularında lipit peroksidasyonu (LPO) düzeyi belirlendi. Gerçektende, LPO seviyesi CAR ile uyarılmış enflamasyonlu pençe dokularında sağlıklı doku ile mukayese edildiğinde oldukça yüksek düzeyde bulundu. PRME, DIC ve IND tarafından enflamasyonun azaltıldığı dokularda ise LPO düzeyi CAR ın aksine daha düşük düzeyde olduğu tespit edildi. Canlı sistemlerde oksidadif hasara karşı süperoksit

13 XII dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GPx) ve indirgenmiş glutatyon (GSH) gibi antioksidan savunma sistemi mevcuttur. Bu bilgilerden yola çıkılarak tüm sıçan pençe dokularında yukarıda adı geçen antioksidan parametrelerin seviyesi de belirlendi. CAR ile uyarılmış pençe dokularında SOD ve GSH seviyelerinin sağlıklı doku ile mukayese edildiğinde düştüğü gözlendi. Bu sonuçlar bize CAR ın antioksidan savunma sistemini olumsuz etkileyerek LPO ya sebep olduğunu göstermektedir. CAR lı dokuların aksine PRME, DIC ve IND ile enflamasyonun azaltıldığı dokularda bu antioksidanların seviyeleri daha yüksek düzeyde tespit edildi. Diğer taraftan CAR ın GPx aktivitesi üzerine anlamlı bir etkisi gözlenmemiştir. Bununla beraber, IND ve PRME nin 50 ve 100 mg/kg lık dozları çok az oranda da olsa GPx aktivitesini artırmıştır. Đlginçtir ki, CAR CAT aktivitesini sağlıklı dokuya nazaran önemli oran da yükseltmiştir. CAT enziminin aktivitesi anti-enflamatuvar ilaçlar (DIC ve IND) tarafından yeniden azaltılırken, PRME nin tüm dozları tarafından doza bağlı olarak ise önemli oranda artırılmıştır. Sonuç olarak, mevcut çalışma PRME nin anlamlı bir anti-enflamatuar etkiye sahip olmasının yanı sıra, enflamasyon ve enflamasyonun azaltılması sürecinde oksidadif hasarın ve antioksidan savunma sisteminin de önemli rol oynadığını göstermektedir.

14 XIII SUMMARY The effects of methanol extract of Peltigera rufescens on the activities of antioxidant enzymes in experimental inflammated rats. In this study, in vivo anti-inflammatory effect of methanol extract of the lichen species Peltigera rufescens (PRME) was investigated in the carrageenan (CAR)-induced acute, and cotton pellet induced chronic inflammation models and the anti-inflammatory effect of PRME was compared to that of diclofenac (DIC) and indomethacin (IND) which are commercial anti-inflammatory agents. 50, 100, 200 and 400 mg/kg doses of PRME were tested in acute inflammation experiments, whereas 200 mg/kg dose of PRME, showed the highest anti-inflammatory effect in acute inflammation, was selected as test dose in chronic inflammation. In acute inflammation studies 50, 100, 200 and 400 mg/kg doses of PRME, diclofenac (25 mg/kg) and indomethacin (25 mg/kg) decreased the carrageenan induced inflammation by 19.3, 31.6, 42.1, 38.6, 45.6 and 47.4%, respectively. It is interesting to find that the anti-inflammatory effect of PRME increases in a dose dependent manner up to 200 mg/kg dose, whereas the anti-inflammatory activity decreases at 400 mg/kg dose. In chronic inflammation studies, PRME (200 mg/kg), DIC (25 mg/kg) and IND (25 mg/kg) possessed 63.5%, 76.1% and 83.8% anti-proliferative effect, respectively. It is thought that oxidative damage caused by reactive oxygen radicals play an important role in the inflammation process. In the light of this consideration lipid peroxidation (LPO) levels were determined in all rat paw tissues. Really, LPO levels in inflammatory paw tissues induced by carrageenan were found to be very high when compared to healthy paw tissues. However, in the paw tissues in which reduced inflammation by PRME, DIC and IND, LPO levels were found at lower levels in contrast to CAR groups. Living organisms possess an antioxidant defense systems

15 XIV including superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (GPx), and reduced glutathione (GSH). In the light of these data, the levels of antioxidant parameters mentioned above, were also investigated in all rat paw tissues. A decrease was observed in the SOD and GSH levels in the car-induced paw tissues when compared to healthy tissues. These results show that CAR causes a lipid peroxidation by inhibiting the antioxidant defense system. In contrast to CAR treated tissues, the levels of these antioxidants were higher in the paw tissues treated with PRME, DIC and IND. On the other hand, no significant effect of CAR on GPx activity was determined. Nevertheless, 25 mg/kg dose of IND and 50 and 100 mg/kg doses of PRME increased GPx activity even though at very low ratios. It is interesting that CAR strongly increased the CAT activity in comparison to healthy paw tissues. CAT enzyme activity was reduced by antiinflammatory drugs (DIC and IND), whereas it was increased by all doses of PRME in a dose dependent manner. In conclusion, the present study showed that, besides PRME possesses a significant anti-inflammatory effect, oxidative damage and antioxidant defense system plays an important role in the inflammation process and/or to decrease inflammation.

16 1 1.GĐRĐŞ VE AMAÇ Enflamasyon organizmada enfeksiyöz, fiziksel, kimyasal ve diğer etkenlerin neden olduğu doku hasarına karşı sellüler ve hümoral düzeyde oluşan güçlü ve abartılmış bir fizyolojik cevaptır 1-3. Böyle bir reaktif cevabın amacı, hasarlayıcı etkeni ve ortaya çıkan ürünleri ortadan kaldırmak ve zararlıyı olduğu yerde sınırlı tutarak kontrol sağladıktan sonra, hasarlanmış dokunun tamir ve yenilenmesini mümkün kılmaktır 1-3. Enflamasyonun oluşmasında histamin, serotonin, bradikinin, nitrik oksit, lipooksijenaz ürünleri, sitokinler, serbest oksijen radikalleri, lizozomal enzimler ve PG ler gibi enflamasyon mediyatörlerinin rolü bilinmektedir 4-7. Enflamasyon akut ve kronik olmak üzere iki şekilde sınıflandırılır. Akut enflamasyon kısa sürelidir, birkaç dakika ile birkaç gün sürer. Akut enflamasyon eksudasyon (vasküler) ve lökosit akümülasyonu (hücresel) ile karakterizedir 1,8,9. Enflamasyonun bu fazında çok sayıda faktör rol oynar ve bu faktörlerden bir grubununda antioksidant sistem olduğu düşünülmektedir. Kronik enflamasyon aktif iltihap ve iyileşme süreçlerinin birlikte görüldüğü uzun süreli bir enflamasyon olarak kabul edilir 3,10,11. Kronik enflamasyon inatçı enfeksiyonlar 12 14, potansiyel toksik ajanlara uzun süre maruz kalma ve otoimmün hastalıklar sırasında oluşabilir. Akut enflamasyonu kronik enflamasyon izleyebilir. Akut enflamasyon oluşumundan çok kısa bir süre sonra proliferatif hücrelerin oluşması ile enflamasyon kronikleşerek devam eder; bu hücreler yaygın veya granüloma şeklinde olur 15. Antiproliferatif etki, ilaçlar tarafından kollajen liflerinin oluşumunun engellenmesi, mukopolisakaridlerin supresse edilmesi şeklindedir 16. Kronik enflamasyonda nötrofil infiltrasyonu ve eksudasyondan daha ziyade monosit infiltrasyonu ve fibroblast

17 2 proliferasyonu rol oynar. Aktive edilmiş monositler ve makrofajlar; antitümör, antimikrobik ve patojenlere karşı fagositoz fonksiyona sahip kan hücreleridir 17. Hem akut hemde kronik enflamasyon araştırmalarında çeşitli deneysel modeller geliştirilmiştir. Karragenin enflamasyon modeli, maddelerin enflamasyonun akut fazına etkilerini araştırmak için, cotton pellet granuloma testi ise enflamasyonun kronik fazına etkilerini araştırmak için kullanılmaktadır 18,19.Akut enflamasyonun oluşmasında eikozanoidlerin (araşidonik asit metabolitleri) rolü bilinmektedir 20. Steroidal ve nonsteroidal anti-enflamatuvar ilaçların etki mekanizması enflamasyonun kimyasal mediyatörlerinin sentezini inhibe etme esasına dayanmaktadır 21. Steroidal antienflamatuvar ilaçlar olarak bilinen glukokortikoidler adrenal kortekste sentez edilirler. Bazı çalışmalar ilaçların anti enflamatuvar etki mekanizmasında adrenal korteks hormonlarının rolünün olduğunu göstermiştir 16. Likenler, mantar ve alglerin bir araya gelerek teşkil ettikleri simbiyotik (ortak yaşayan) bir bitki grubudur. Günümüzde den fazla alt türe sahip olduğu bilinen likenlerin, ülkemizdeki florası henüz tamamlanmamış olup bölgemiz ile ilgili yapılan çalışmalar ise son derece azdır Likenlerin çok sayıda madde sentezlemekte oldukları ve bu maddelerin çoğunun biyolojik aktivitelere sahip oldukları tespit edilmiştir Liken ve liken metobolitlerinin gösterdiği aktivitelerden bir kısmı; antiviral 31, antibakteriyel 32 37, antitümöral 38 40, allerjen 41, bitki büyüme inhibitörü 42, antiherbivor 43, enzim inhibitörü şeklinde sıralanabilir. Parfüm sanayinde 27, kozmetik krem sanayinde 51. Hava kirliliğinin belirlenmesinde faydalanılan likenler pek çok ülkede de besin olarak kullanılmaktadır 28. Likenlerin üstün yaşam mukavemeti kendi bünyelerinde ürettikleri çok özel moleküllerden ileri gelmekte 27 ve yapılan biyolojik aktivite ölçümlerinde liken metabolitlerinin her geçen gün yeni özellikleri

18 3 keşfedilmektedir. Üstelik bu maddelerin genellikle sitotoksik özelliklerinin az olması, ilaç özelliklerinin araştırılmasında önemli yer tutmaktadır. Literatürde liken ekstrelerinin ve liken metabolitlerinin anti-enflamatuvar etkilerinin incelendiği çok az sayıda araştırmaya rastlanmıştır 55,56. Anti-enflamatuvar etki sürecinin mekanizmaları hakkında ise bilgiler oldukça sınırlıdır. Bu açıdan bakıldığında bu çalışma enflamasyonun önlenmesinde oksidatif süreç üzerinde bir liken türü olan Peltigera rufescens (Weis) Humb. kullanılarak elde edilen metanol ekstraktlarının etkili olup olmadığının tespit edilmesi açısından önemli bir eksikliği tamamlayacaktır. Bu araştırmada; sıçanlarda karragenin ile oluşturulan akut enflamasyon ve pamuk bilyeler ile oluşturulan kronik enflamasyon modelleri kullanarak bir liken türü olan Peltigera rufescens den elde edilen metanol ekstraktının nın invivo antienflamatuvar etkileri ve bu etkilerin antioksidant mekanizmalar [CAT, GPx ve SOD enzimleri, GSH ve lipit peroksidasyon (LPO) düzeyleri] ile ilişkisi tespit edilmeye çalışıldı.

19 4 2.GENEL BĐLGĐLER 2.2.LĐKENLER Likenler, en az iki organizmadan (fungus ve alg) oluşan bitkilerdir. Fungus, kendi karbonhitratını üretemez, fotosentez partneri olan yeşil alg ve cyanobakterilerden hazır olarak alırlar. Bunlar da ekosistem için çalışır ve fungus için glukoz üretirler. Đki organizma da tek başlarına yaşayamayacakları yerlerde beraber kolonize olup yaşayabilirler. Likenler, dünyada ve ülkemizde çok eski zamanlardan beri halk hekimliğinde birçok hastalığın tedavisinde kullanılmıştır. Dünya Sağlık Örgütünün (WHO) birçok ülkedeki yayınlara dayanarak hazırladığı bir araştırmaya göre, dünyada tedavi amacıyla kullanılan tıbbi bitkilerin toplam tür sayısı civarındadır 22,23,24. Ülkemizde 9000 e yakın bitki türünün doğal olarak yetiştiği ve bunların kimyasal içerikleri hakkındaki çalışmaların yok denecek kadar az olduğu da vurgulanmaktadır 57. Bitkisel organizmalar içerisinde incelenen likenler de antik çağlardan beri tıbbi özellikleri itibariyle değerlendirilmişlerdir 58. Likenler yavaş üremelerinden kaynaklanan rekabette zayıf kalma dezavantajlarını, ürettikleri özel maddeler sayesinde telafi ederler. Özellikle aromatik yapılı sekonder metabolitler, onların en güçlü antagonistik maddelerini oluşturmaktadır. Diğer taraftan likenlerin boya ve parfümeri sanayisinde ham madde olarak 27,59,60 ve hava kirliliği indikatörü olarak 52-54,61 kullanıldıkları da kaydedilmiştir. Her ne kadar likenlerin global krizlerde besin kaynağı olarak kullanılabileceği teklif edilmişse de, doğal yolla üremeleri çok yavaş olduğundan, bu tür bir değerlendirmenin ekonomik olmadığı ifade edilmiştir 62. Likenler, yeterli nemin bulunduğu kızgın çöllerde, arktik ve antartik bölgelerde yüksek dağların dondurucu soğuklarında, diğer bitkilerin yaşayamadığı taşlar, verimsiz

20 5 topraklar, kuru ağaç kabukları ve kiremitler üzerinde dahi yetişebilmektedirler. Bu özelliklerinden dolayı dünyanın hemen her yerinde yayılış gösterdikleri rapor edilmiştir 30. Türkiye florası likenler bakımından oldukça zengin olmasına rağmen taksonomik, floristik ve kimyasal liken metabolitleri üzerinde çalışmalar son yıllarda başlamıştır. Avrupa ülkelerinde, likenlerin 16. yüzyıldan beri, çeşitli hastalıkların tedavisinde dekoksiyon veya infüzyon şeklinde kullanıldığına dair birçok kayıt bulunmaktadır 36,38. Đkinci Dünya Savaşı ndan sonra mevcut antibiyotiklerin azlığı üzerine, likenler üzerinde antimikrobiyal araştırmaların yapılmasına başlanmıştır. Likenlerde bulunan antimikrobiyal etki, yapılarında bulunan liken asitlerden ileri gelmektedir. Farklı liken türlerinden izole edilmiş protolikesterinik asit, pulvinik asit türevleri, depsid grubundan evernik, olivetorik asit, tridepsid grubundan giroforik asit, depsidon grubundan fisodik, lobarik, fumarprotosetrarik asitler ile dibenzofuran türevlerinden usnik asitin antimikrobiyal etkileri saptanmıştır 63. Likenlerde bulunan maddelerin çoğu asit özelliği gösterdiği için bunlara karakteristik liken asitleri denilmektedir. Likenlerin kayaları parçalama özelliğini sentezledikleri bu asitler vasıtasıyladır. Likenlerin bu asidik maddeleri %1 5 oranında, çoğu zaman da %25 oranında içermeleri bu maddelerin izolasyonunu kolaylaştırmakta, dolayısıyla da likenlerin bu yönüyle tohumlu bitkilerden daha fazla önem kazanmasına neden olmaktadır 24. Uzun zamandır hastalıkların önlenmesinde kullanılan likenlerin iyileştirici özelliklerinin, yapılarında bulunan asitlerden kaynaklandığı düşünülmektedir 64. Liken primer metabolitleri yalnız algler tarafından fotosentezle sentezlenmektedir. Likenlere özgü çeşitli polisakkaritlerin yanı sıra çeşitli amino asit, amin ve proteinler de likenlerden izole edilmiş primer metabolitlerdir 65.

21 6 Likenler tarafından sentezlenen alifatik ve aromatik bileşikler ise sekonder metabolitlerdir. Günümüze kadar 300 den fazla sekonder metobolit saflaştırılmış olup yapısı spektroskopik yöntemlerle aydınlatılarak karakterize edilmiştir 25,26, Peltigera wild. Bu genusa ait türlerde tallus yapraksı ve rozet şeklindedir. Loplar yuvarlak ya da kısmen uzamış kenarları girintili çıkıntılıdır. Thallusun rengi parlak yeşil, mavimsi-gri, gri-kahverengi, ya da kahverengi, düz, hafif dalgalı mat ya da parlak olabilir. Keçimsi ya da unsu, kenarlar tam ya da az çok loblu ya da yapraksı, schizidia ya da soralialı alt yüzey korteksli değil yoğun olarak ağsı - keçemsi yapılıdır. Açıktan koyu damarlı yapıya kadar bu damarlar bariz rhizinlidirler. Cehalodia mevcut olduğu zaman bu cinse ait türlerin üst ya da alt yüzeylerinde yeşil alg içeren noscos türü schizidia ya da soralialı alt yüzey korteksli değil yoğun olarak ağsı - keçemsi yapılıdır. Açıktan koyu damarlı yapıya kadar bu damarlar bariz rhizinlidirler. Cehalodia mevcut olduğu zaman bu cinse ait türlerin üst ya da alt yüzeylerinde yeşil alg içeren noscos türü vardır. Cortex yalancı parankimalıdır. Fotobiont mavi yeşil alg (noscos) ve chlorococcoid (coccomyxa). Medulla beyaz az çok gevşekçe örülmüş hifli yapıda ascomata apotesyumludur. Bu apotesyum semer şeklindedir. Kimyasal olarak 6-diagnostic hopane triterpanoitler ve tridepsitler içerirler 67. Ekolojik olarak çıplak topraklar üzerinde ya da kısa püskül şeklinde yosunlu ağaç gövdeleri ve kütükler üzerinde bulunurlar Peltigera rufescens (Weis) Humb. Açık güneşli alanları seven bir liken türüdür. Bu liken morfolojisi ve rengi ile ekstrem sıcaklık şartlarına dayanıklıdır. Öyle ki maksimum sıcaklıklar yazın +50

22 7 dereceyi, kışın 50 dereceyi bulabilir. Bu kararsız mevsimsel sıcaklık değişimleri Peltigera rufescens in fotosentetik sıcaklığının mevsimsel olarak optimum şartlarda tutulmasını sağlar 68. Bu yüzden; Peltigera rufescens in tallusu mat görünüşlü, gri veya kahverengi renkte: büyük yapraksı yapıdadır. Üst yüzey tomentöz yapıda; lob uçları kal Şekil 1. Peltigera rufescens (Weis)Humb.un doğal ortamında çekilmiş resimleri. kık ve kırılgandır. Alt yüzeydeki damarlar dar ve birbiriyle bağlantılıdır. Rizinler çok dallanmıştır. Apotesium genellikle esmer şekildedir. Çoğunlukla kuru ve kalkerli topraklarda ve ağaç diplerinde nadiren de silisli kayalar üzerinde bulunur. Arktik ten Akdeniz Havzası nın güneyine kadar yayılış göstermektedir 69. Bu liken türünün büyümesinde ısı, ışık ve nem etkilidir 70. Peltigera rufescens Doğu Karadeniz

23 8 ormanlarında ve Türkiyenin birçok bölgesinde bulunmaktadır. Bu likenin sert iklime sahip Erzurumun Oltu Bölgesinde de bulunduğu rapor edilmiştir ENFLAMASYON Enflamasyon çok basit olarak lokalize lökosit akümülasyonu şeklinde tanımlanabilse de, gerçekte çeşitli endojen ve eksojen uyarıların vaskülarize dokularda oluşturduğu kompleks savunma mekanizmasıdır 1,2. Đnflamasyon organizmada enfeksiyöz, fiziksel, kimyasal ve diğer etkenlerin neden olduğu doku hasarına karşı sellüler ve hümoral düzeyde oluşan güçlü ve abartılmış bir fizyolojik cevaptır 1-3. Enflamasyon ilk kez M.S. I. yüzyılda yaşamış olan Celsus tarafından, kızarıklık, sıcaklık artışı, ağrı ve şişme ile tanımlanmış olup; sonraları fonksiyon kaybı da bu özelliklere eklenmiştir 71,72. Böyle bir reaktif cevabın amacı, hasarlayıcı etkeni ve ortaya çıkan ürünleri ortadan kaldırmak ve zararlıyı olduğu yerde sınırlı tutarak kontrol sağladıktan sonra, hasarlanmış dokunun tamir ve yenilenmesini mümkün kılmaktır 1-3. Enflamasyonlarla ilgili birçok sınıflandırma olsa da kabul gören sınıflandırma enflamatuvar prosesin süresi göz önüne alınarak yapılan sınıflandırmadır. Bu sınıflandırmaya göre enflamasyon akut ve kronik olmak üzere ikiye ayrılır 71, Akut enflamasyon: Akut enflamasyon kısa sürelidir, birkaç dakika ile birkaç gün sürer. Akut enflamasyon eksudasyon (vasküler) ve lökosit akümülasyonu (hücresel) ile karakterizedir 1,8,9. Vasküler Değişiklikler: Akut enflamatuvar süreçte kan damarları reaksiyonun merkezini oluşturur. Akut enflamasyonun üç temel komponenti bulunmaktadır;

24 9 1. Vasküler çap değişikliği (vazodilatasyon), kan akımında artış (konjesyon-staz). 2. Mikrovasküler sahada yapısal değişiklikler, permabilite artış Lökositlerin endoteli geçerek zedelenen dokuda toplanması 75. Enflamasyonun en erken fazında çok kısa süreli refleks vazokonstrüksiyon olur 76. Bunu takiben arteriol kapiller yatak ve venüllerde oluşan vazodilatasyon meydana gelir Vazodilatasyon artışı bölgesel kan akımını artırarak, intravasküler hidrostatik basıncı yükseltir. Bu basınç yükselmesi stazı ortaya çıkarır. Staz sonucu ekstravasküler dokuya proteinden zengin sıvı geçerek ödemi oluşturur 2,73,74. Staz sonucu doku aralığında biriken bu sıvının o bölgede birikmiş olan toksik ve irritan maddelerin dilüe edilmesinin yanı sıra, lökosit ve kompleman faktörlerinin taşınmasında da önemli rolleri vardır 71,73. Hücresel Değişiklikler: Akut enflamasyonun ikinci ayağını oluşturan lökosit hareketleri üç aşamada oluşur. Marginasyon denen ilk aşamada lökositler damar içinde perifere doğru yer değiştirerek vasküler endotelle karşı karşıya gelirler. Adezyon kuvvet denilen ikinci aşamada lökositler endotele sıkı bir şekilde yapışırlar. Migrasyon aşamasında ise lökositler kemotaktik ajanlar yardımıyla endotel dışına hasarlı bölgeye göç ederler 71,73,79,80. Lökositler vasküler lümenden ekstravasküler boşluğa çıkarak, hasarlı bölgede mikroorganizmaları öldürüp, nekrotik dokuları ve yabancı antijenleri parçalayıp, kimyasal mediatörleri ve oksijen radikallerini serbestleştirerek doku hasarına yol açar 71,81,82. Lökositlerin bu hakimiyeti ilk 6 24 saat sürerken, takip eden saatte bu tablo monositlerin lehine dönüşür 83.

25 10 Enflamasyonun Kimyasal Mediatörleri: a-vazoaktif Aminler Histamin: Histamin biyolojik sistemlerde belirli hücrelerde sentez edilip depolanan endojen aktif maddedir. Özellikle vücudun iç kısımlarının dış ortamla temas ettiği bölgelerde, (akciğer, gastrointestinal sistem, deri gibi) histamin miktarı nisbeten yüksektir 9,84. Kanda histaminin ana deposu bazofil lökositlerdir. Histaminin en zengin kaynağı bağ dokusu mast hücreleridir. Mast hücreleri histamini sentezler ve salgı granüllerinde depo eder. Antijen-antikor kompleksi, ısı, soğuk, toksinler, travma ve kimyasal ajanlar histaminin salınmasına yol açar. Salgılanan histamin akut hipersensitivite ve allerjik cevapta önemli rol oynar. Histaminin kardiyovasküler sistemdeki en önemli etkisi (vazodilatasyon nedeniyle) arteryal kan basıncını düşürmesidir. Histaminin damarlardaki etkisi, kapiller permabiliteyi artırarak hücre dışı alana plazma, protein ve sıvı sızmasını sağlaması şeklindedir. Lenf dolaşımındaki sıvı miktarı ve protein içeriğindeki artışla ödem oluşur 76,85. Artmış histamin endotelial hücreleri kasar. Bu durumda da plazma proteini ve plazma sıvısı buradan serbestçe geçer. Endotelde bulunan ve bir adhezyon molekülü olan P selektin in varlığı sayesinde lökosit migrasyonu artırılır 86. Cilt içine ufak dozda histamin injekte edilmesi Lewis in üçlü cevabı denilen bir reaksiyonun oluşmasına neden olur 20. Bu reaksiyonda histamin tarafından damarların genişletilmesi, kapiller permeabilitesinin arttırılması ve afferent sinir uçlarının stimüle edilmesi rol oynar 76,85. Đnjeksiyon yerinde önce bir kızarıklık ve daha sonra kan sıvısının sızması sonucu ödem papülü oluşur. Bu kızarıklık ve onun yerini alan papül, üçlü cevabın iki öğesini oluşturur. Üçüncü öğe ise papül çevresinde oluşan nisbeten geniş bir alana yayılan ve dış

26 11 sınırı düzensiz olan hale şeklindeki kızarıklıktır 84. Bu kızarıklık akson refleksi sonucu cilt damarlarının genişlemesine bağlıdır. Histamin damar dışındaki diğer düz kasları nadiren gevşetir, genellikle kasar. Vazodilatatör etkiden H 1 ve H 2 reseptörleri, permeabilite artışından ise sadece H 1 reseptörleri sorumludur. Kasılma çoğunlukla H 1, gevşeme ise H 2 reseptör aktivasyonuyla olur. Đnsan bronş düz kaslarında H 1 reseptörlerinin kasıcı etkileri baskındır. Barsak kaslarında histamin cevapları bölge ve türe göre değişir. Fakat klasik etki kasılmadır 84. Mesane, üreter, safra kesesi, iris ve çoğu diğer düz kas histamin tarafından çok az etkilenir. Histamin çeşitli sinir uçlarını uyarır. Bu yüzden epidermisden salındığında kaşıntıya yol açar, dermiste ağrı hissi uyandırır. Periferik nöronlarda histamin reseptörleri genellikle H 1 tipindedir. Serotonin: Serotonin ya da diğer adıyla 5-HT (5-Hidroksitriptamin) temel bir aminoasit olan triptofandan sentezlenir 87,88. Serotonin sentezinin başlangıç ve hız kısıtlayıcı enzimi triptofan hidroksilazdır 87. Yetişkin bir insanda ortalama 5-10 mg serotonin bulunmaktadır. Đntestinal mukozada bulunan enterokromaffin hücrelerde lokalize olmuştur. Serotonin burada düz kasları stimüle ederek gastrointestinal motiliteyi arttırır 88. Kandaki tüm serotonin trombositlerde depolanır. Trombositlerde serotonin sentez edilmez, trombositler serotonini plazmadan alırlar ve depolarlar. Trombosit agregasyonu ile salınımı uyarılır 2. Serotoninin lokal enjeksiyonu o bölgede enflamasyona yol açar 89. b-plazma Proteazları Kompleman Sistemi: Kompleman, çoğunluğu enzim prekürsörü olan toplam 20 kadar proteini kapsayan genel bir tanımdır. Normalde bu proteinlerin tümü plazma

27 12 proteinleridir ve kapiller damardan dokuya sızan plazmada da bulunurlar. C1 den C9 a kadar sıralanan komponentler normalde plazmada inaktif halde bulunurlar. Aktivasyonları klasik ve alternatif olmak üzere iki yolla olur 88,90,91. C3 ün ayrışması en kritik aşama olup, her iki yolda bu noktadan sonra ortak aktivasyon şeklini izler. Antijen-antikor kompleksleri klasik yolu, mikrobial yüzeyler ve polisakkaritler ise alternatif yolu aktive ederler. 1.Opsonizasyon ve Fagositoz: Kompleman reaksiyon zincirinin bir ürünü olan C3b, nötrofil ve makrofajların fagositozunu uyarır. Bu, hücrelerin antijen-antikor kompleksini bağlamış olan bakteriyi içlerine almalarını sağlar. Bu işlem opsonizasyon adını alır ve yok edilen bakteri sayısını yüzlerce kat artırabilir 1,2,10,90,91. 2.Lizis: Kompleman reaksiyon zincirinin en önemli ürünlerinden biri litik kompleks adını alan, kompleman faktörlerinden birçoğunun oluşturduğu ve C5b6789 olarak gösterilen moleküler komplekstir. Bu kompleksin bakteri ya da diğer istilacı organizmaların membranlarını direkt yırtma etkisi vardır 1,2,10,90,91. 3.Aglütinasyon: Kompleman ürünlerinin istilacı organizmanın yüzeyini değiştirerek birbirlerine yapışmalarını ve aglütinasyonlarını kolaylaştırıcı etkidir 1,2,10,90,91. 4.Virusların Nötralizasyonıı: Kompleman enzimleri ve diğer kompleman ürünlerinin bazı viruslerin yapılarına saldırarak, onları avirulan hale getirmesidir 1,2,10,90,91. 5.Kemotaksi olayı: C5a fragmanı nötrofil ve makrofajların kemotaksisini ve böylece çok sayıda fagositin antijenik ajanın bulunduğu bölgeye göçmesini sağlar 1,2,10,90,91. 6.Mast Hücresi ve Bazofil Aktivasyonu: C3a, C4a ve C5a mast hücresi ve bazofilleri aktifler. Aktiflenen bu hücreler lokal sıvılara histamin, heparin ve diğer maddeleri salgılarlar. Bu maddelerin salgılanması bölgesel kan akımını, dokulara sıvı ve plazma

28 13 proteinlerinin sızmasını artırır ve antijenik ajanın hareketsizleştirilmesini ve inaktivasyonunu sağlar. Enflamatuvar Etkiler: Mast hücreleri ve bazofilleri uyararak oluşturdukları enflamatuvar etkilerinin yanısıra, diğer birçok kompleman ürününün de lokal enflamatuvar etkisi vardır. Bu kompleman ürünleri artmış olan kan akımını daha da artırarak kapillerlerden dokuya protein sızmasını sağlarlar. Sızan bu proteinler doku aralıklarında pıhtılaşarak saldırgan organizmaların dokular arasında yayılmasının engellenmesini sağlar. Pıhtılaşma Sistemi: Koagülasyon sıvı olan kanın, pıhtı ya da trombus denilen jel kıvamlı katı bir maddeye dönüşmesidir. Pıhtılaşma plazma proteinlerinden fibrinojenin fibrine dönüştüğü zaman gerçekleşir. Fibrinojen karaciğer tarafından yapılan ve normal insanların serumunda her zaman bulunan çubuk şeklinde bir proteindir 92. Fibrin başlangıçta gevşek ağ gibidir. Oluştuktan hemen sonra kovalent çapraz bağların oluşmasıyla kuvvetlenir. Bu olay faktör XIII denilen bir plazma enzimi sayesinde gerçekleşir. Fibrinojen kanda her zaman bulunur. Trombin normalde kanda bulunmaz, yalnızca pıhtılaşma olayı uyarıldığı zaman oluşur 92. Uyarılmadan önce kanda protrombin denilen inaktif şekilde bulunur. Kan damarının yaralandığı bölgede enzimatik olarak trombine çevrilir. Trombin de faktör XIII ü aktive eder. Pıhtılaşmaya bırakılan kan örneğinde pıhtılaşma sonrası ayrılan sıvıya serum denir 11. Serum plazmadan farklı olarak fibrinojen ve bazı pıhtılaşma faktörlerini kapsamaz. Bunun dışında bileşimi plazma ile aynıdır. Pıhtılaşma olayında rol oynayan trombin

29 14 lökosit adezyonunu kuvvetlendirir. Fibrinojenin fibrine dönmesi sırasında oluşan fibrinopeptidler de vasküler permabiliteyi artırırken lökositler için de kemotaktiktirler. Kinin Sistemi: Hageman faktörün aktivasyonu sonrası oluşan bir sistemdir. Đnflamatuvar reaksiyonlarda önemli rolleri vardır 2,93,94. Kinin sisteminin aktivasyonu dolaşımdaki yüksek moleküler ağırlıklı kininojenin bradikinine dönüşmesini sağlar. Bradikininde histamine benzer şekilde vasküler permeabiliteyi artırır, arterioler dilatasyon yapar. Ekstravasküler düz kas kasılmasına yol açar 95. Ayrıca deriye enjekte edildiğinde ağrı oluşturur 96,97. Bradikininin etkisi kısa sürelidir. Çünkü plazma ve dokularda bulunan kininazlarla hızlı bir şekilde parçalanır. Bradikininler, substans P, ve prostanoidler ağrı yolaklarını stimule ederler ve enflamasyonun dolor' u oluşur. Kininler etkilerini B ı ve B 2 olarak adlandırılan iki tip reseptörle oluştururlar 93,97,98. B ı reseptörleri doku hasarı ve enflamasyon gibi patolojik durumlarda indüklenirken, normal dokularda bulunmaz 96. B 2 reseptörleri afferent sinir uçlarında ve SSS de bulunur, ağrı reseptörlerinin duyarlılığını artırı 96,99,100. Kininler vücutta bulunan enflamasyon veya doku hasarında, aktifleşen çeşitli hücrelerden serbest radikaller ve pro-enflamatuvar etkili maddelerinin de salınımına katkı sağlarlar. Mast hücrelerinden histamin salınımını da artırırlar 94. P Maddesi: P maddesi SSS de yaygın olarak bulunur 101. P maddesinin periferden gelen ve nosiseptif uyarıları santral sinir sistemi (SSS)'ne taşıyan primer duyusal nöronlarda, omuriliğin arka boynuzunda ve duyusal trigeminus çekirdeğindeki akson uçlarında glutamat ile birlikte bulunduğu gösterilmiştir. P maddesi SSS'de ağrının birinci nörondan ikinci nörona taşınmasında rol oynar. Yapılan birçok deneysel çalışma P maddesinin

30 15 enflamatuvar cevaba katkısı olduğunu desteklemektedir 102,103. Lewis in üçlü cevabında vazodilatasyon yapması 104 ve ayrıca karrageninle oluşturulan enflamasyon modelinde (sıçan pençesinde yapılan ölçümlerde 15. dakika ve sonrasında) P maddesinin artması bu kanıtı desteklemektedir 78. c-araşidonik Asit Metabolitleri (AA): Araşidonik asit poliansatüre bir yağ asidi olup hücre membranındaki fosfolipidlerde önemli bir miktarda bulunur. Sellüler fosfolipaz aktivasyonuyla membran fosfolipitlerinden ortaya çıkar 105. Hücresel fosfolipazlar mekanik, kimyasal, fiziksel uyarı veya C5a gibi iltihabi mediatörlerce aktive edilirler. AA metabolizması iki major yoldan biri şeklinde ilerler. AA metabolizmasından kaynaklanan ürünler başta enflamasyon, ateş, ağrı ve hemostaz olmak üzere, birçok biyolojik olay üzerine etkilidir 106,107. Bu ürünler kısa zamanlı hormonlar olarak değerlendirilirler 107. Yapıldıkları yerde lokal olarak etki ederler ve daha sonra çok hızlı bir şekilde spontan veya enzimatik olarak yok edilirler yılında Von Euler prostat bezinde bulduğu bir maddenin düz kasları kastığını farketmiş ve bulduğu yerden esinlenerek bu maddeye Prostaglandin (PG) adını vermiştir 108. Araşidonik asit metabolitlerine Eikozanoidler de denir. Eikozanoidler prekürsör yağ asitlerinden oluşumlarında rol oynayan enzim türüne göre; siklooksijenaz ürünleri, lipooksijenaz ürünleri ve 450 monoksijenaz ürünleri şeklinde 3 ana gruba ayrılır 21,109. Siklooksijenaz Yolu Ürünleri: Burada PGE2, PGD2, PGF2 α, PGI2 ve tromboksan (TXA2) bulunur. Araşidonik asit COX ile siklik endoperoksitlere (PGG 2, PGH 2 ) dönüşür 110,111. PGH 2 çok labil bir madde olup diğer biyolojik ürünlerin öncüsüdür. Prostaglandin E, F ve D'ler doğrudan doğruya siklik endoperoksid ara ürünlerinden

31 16 oluşurlar ve bunlara primer PG'ler adı verilir 112,113. Primer PG'ler enflamasyonda anahtar mediatör olarak rol oynarken, bunların her biri spesifik bir enzim etkisi ile oluşur. Bu enzimlerin bazılarının dokulardaki dağılımı sınırlıdır. Örneğin trombositlerde tromboksan sentetaz enzimi vardır. Dolayısıyla güçlü bir trombosit agregan ajan ve vazokonstrüktör olan TXA2, ana prostaglandin ürün olarak bu hücrelerde bulunur 114,115. Diğer yandan endotel tromboksan sentetaz içermez. Ancak PGI2 oluşumunu sağlayan prostasiklin sentetaz içerir. PGI2 güçlü bir trombosit agregasyon inhibitörü ve ayrıca önemli bir vazodilatatördür 114,115. PGD2, siklooksijenaz yolunun mast hücrelerindeki ana metabolitidir. PGE2, PGF2 ile birlikte bulunur. PGD2 vazodilatasyona neden olur ve ödemi artırır. Aspirin ve ibuprofen gibi nonsteroid anti-enflamatuvar ilaçlar (NSAEĐ) proksimal siklooksijenaz aktivitesini inhibe ederler. Bu anti-enflamatuar ajanlardan lipooksijenaz yolu etkilenmez. Son yapılan çalışmalarda siklooksijenazın (COX) iki formu olduğu gösterilmiştir 114,116. COX 1 ile COX 2 arasındaki en önemli fark COX 1' in esas olarak konstitütif, COX-2'nin ise indüklenebilir olmasıdır 117. Bu iki enzim %60 oranında, homolog aminoasit dizilişine sahip olup farklı genler tarafından kodlanmaktadır 106. Đlginç olarak gastrik mukozada COX 1 mevcutken, COX 2 yoktur. Bu bölgede mukozal prostaglandinler COX 1 etkisiyle oluşurlar ve aside bağlı hasarı engellediklerinden koruyucudurlar. NSAEĐ ve aspirin, siklooksijenazı inhibe ederek prostaglandin sentezini bloke edip, enflamasyonu azaltırken, gastrik ülsere de zemin hazırlar. Anti-enflamatuvar etkilerini korumak ve gastrik mukoza üzerindeki zararlı etkilerinden kaçınmak için birçok oldukça seçici COX 2 inhibitörleri geliştirilmiştir. Bunlardan gastrik mukoza ülserasyonu oluşturmadan anti-enflamatuvar etkiler beklenmektedir. COX-1 ayrıca damar endotelinde, trombositlerde, böbrek glomerül ve tubulüs hücrelerinde ve vezikula

32 17 seminaliste fazla miktarda bulunur. COX-2 nin başta endotoksinler, interlökin 1 α, interlökin 6 ve tümör nekroz faktör α olmak üzere enflamasyona neden olan değişik faktörlerce (bazı büyüme faktörleri, trombosit aktive edici faktör, endotelin, koryonik gonadotropin, serotonin ve ayrıca mekanik bir uyarı olan sürtünme stresi) indüklenir. Bu nedenle COX-2 nin olması, enflamasyon gibi patolojik olaylardan sorumlu olan PG lerin sentezlenmesinde rol aldığını düşündürmektedir 21,106,118. COX-2 nin sentezlenmesinden sorumlu olan gen glukokortikoidler ile baskılanabilir. Sadece dışardan verilen glukokortikoidler değil bazal glukokortikoidlerin de COX 2 yi süprese edebildikleri gösterilmiş olup, COX 1 geni için bu sözkonusu değildir 119. PGE1: Đntradermal injeksiyonu eritem ve hiperaljezi oluşturur. Karragenin, histamin, bradikinin ile oluşan ödematöz cevabı potansiyelize eder. Pirojen olduğu söylenmektedir. PGE2: Hiperaljezi oluşturur. Çok düşük dozlarda bile olsa karegenin, histamin, bradikinin ile oluşan ödematöz cevabı potansiyelize eder. Düşük dozlarda diğer enflamasyon mediatörlerinin etkilerini arttırırken yüksek dozlarda direkt enflamatuvar etki oluşturur. PGG2: Etkileri PGE2 ye benzemektedir.

33 18 Stimulus Hücre membran harabiyeti Fosfolipidler Kortikosteroidlerr Fosfolipaz Araşidonik asit Lipoksijenaz Siklooksijenaz NSAĐ LTB 4 Fagosit aktivasyonu Đnflamasyon Lökotrienler LTC 4 / DP değişiklikleri Bronkokonstriksiyon Sekresyon artışı PG ler TX PGI 2 Lökosit modülasyonu Enflamasyon Şekil 2. Araşidonik asit metabolitleri yolu. Lipooksijenaz Yolu Ürünleri: 5-lipooksijenaz nötrofillerde baskın olarak bulunan AA metabolizması enzimidir. 5-HPETE AA'nın 5-hidroperoksi ürünüdür. 5-HPETE oldukça kararsızdır; ya 5-HETE'ye indirgenir ya da topluca lökotrienler diye adlandırılan bileşiklere dönüşür 120, HPETE den türeyen ilk lökotrien A4 (LTA4) olup bu enzimatik hidrolizle LTB4 e dönüşür veya glutasyon eklenmesiyle LTC4 oluşur 122,123,124. Bunların alt ürünleri olan LTD4 ve LTE4 vazokonstrüksiyon, bronkospazm ve vasküler permeabilite artışına neden olurlar. LTB4 lökosit, monosit ve doğal öldürücü hücrelerin güçlü stimülasyonuna ve kemotaksisine, nötrofil aktivasyonuna, lizozomal enzim ve süperoksit salınımına ve sitokinin üretimine yol açan

34 19 pro-enflamatuvar bir maddedir Özet olarak; ağrı ve ateş mekanizması da dahil olmak üzere eiokosanoidler akut enflamasyonun her aşamasında yer alırlar. d-trombosit Aktive Edici Faktör (PAF): Trombosit aktive eden faktör (PAF) fosfolipid kökenli mediatör olup mast hücresi ve bazofil başta olmak üzere birçok hücreden salınır. Trombosit agregasyonuna ve degranülasyona sebep olması nedeniyle bu şekilde adlandırılmıştır. PAF asetil gliserol eter fosfokolin yapısındadır. Fosfolipaz A 2 etkisiyle nötrofillerin, monositlerin, bazofillerin, endotelin, trombositlerin ve diğer bazı hücrelerin membran fosfolipidlerinden elde edilir 126. Trombositlerin uyarılmasının yanı sıra vazokonstriksiyon ve bronkokonstriksiyona sebep olur. Vazodilatasyonun stimüle edilmesinde ve damar geçirgenliğinin artırılmasında, histaminden 100 ila kez daha güçlüdür. Aynı zamanda lökosit adezyonunu, kemotaksisini, lökosit degranülasyonunu ve oksidatif reaksiyonları artırır. Hedef hücreleri spesifik reseptörleri üzerinden etkiler. Böbrek kan akımını azaltır. Kalpte negatif inotrop etkiye neden olur 126,127. Eikozanoidler başta olmak üzere diğer bazı mediatörlerin sentezini de stimüle eder. e-sitokinler: Sitokinler aktive olmuş lenfositler ve makrofajlar başta olmak üzere birçok hücreden sentezlenen ve diğer hücrelerin fonksiyonlarının düzenlenmesinde rol oynayan polipeptid yapıdaki maddelerdir. Hücresel immün cevap üzerine etkilerinin yanısıra enflamatuvar yanıtın oluşumunda da ilave önemli rolleri vardır 1,9,10,87,90,101 Đnflamasyonun oluşmasında rol alan en önemli sitokinler; interlökin 1 (IL-1, IL-8), tümör nekrozis faktör (TNF α ve β), interferon (IFN γ) ve kemokinlerdir. Sistematik akut faz reaksiyonlarını stimüle eden bu sitokinlerin endotel, lökositler ve fibroblastlar

35 20 üzerine lokal etkileri de bulunmaktadır 9,101. IL 1 ve TNF-α, aktive olmuş makrofajlar tarafından sentezlenir 1,90. Sitokinlerin sekresyonu, endotoksinler, immün kompleksler, fiziksel travma ve bazı enflamasyon mediatörleri tarafından stimüle edilir. IL-1 ve TNF-α, endotelyal aktivasyon olarak isimlendirilen bir grup değişikliği stimüle eder 9. Bu değişiklikler adhezyon moleküllerinin artmış dışa vurumu, bazı sitokinlerin ve büyüme faktörlerinin sekresyonu, eikozanoidlerin ve nitrik oksitin (NO) sentezlenmesi ve endotel trombojenisitesinin artmasıdır. TNF-α, ayrıca nötrofillerin agregasyonu ve aktivasyonunu stimüle eder. Mezenkimal hücrelerden proteolitik enzimlerin salınımını uyararak doku hasarına neden olur 2. IL 1 ve TNF-α enfeksiyonlara ya da yaralanmalara eşlik eden sistemik akut faz reaksiyonlarını uyarır 1,101. Bunun yanı sıra TNF-α septik şokta hipotansif etkilerin ortaya çıkmasına neden olan NO sentezini de indükler. IFN-γ makrofaj ve nötrofiller için güçlü bir aktivatördür. Onların oksidatif yıkımdan sorumlu enzimlerini arttırarak fagosite edilmiş mikroorganizmaların öldürülmesini sağlar. Aynı zamanda önemli bir "NO sentaz" uyarıcısıdır 9. Kemokinler enflamatuvar hücreler için kemotaktik moleküller olmaları ve bazı sitokin etkilerini göstermeleri nedeniyle bu şekilde adlandırılmışlardır. Đlk tanımlanan kemokinlerden birisi olan Interlökin-8 (IL-8), güçlü bir kemotaktik ajandır. Başlıca nötrofilleri aktive eder 1,9,101. IL-1 ve TNF-α ya cevap olarak aktive olmuş makrofajlardan, endotelden ve fibroblastlardan salınır.

36 21 f-nitrik Oksit ve Oksijen Kaynaklı Serbest Radikaller. Nitrik Oksit (NO): Otokrin ve parakrin bir hücresel ajan olan NO, normal fizyolojik koşullar ile birçok patofizyolojik durumda homeostazın sürdürülmesinde önemli bir etkendir. Memelilerde nitrik oksidin varlığı ilk kez 1916 yılında gösterilmiş olup 1985'de aktive olmuş makrofajların NO saldığı bulunmuştur 128. Makrofajlar tarafından mikroorganizmalar ve tümör hücrelerine karşı sitotoksik bir metabolit olarak kullanılır. Siklikguanosin monofosfatın (cgmp) düzeyini yükselterek, damar düz kaslarında gevşemeye yol açan guanil siklazı aktive eder. Nitrik oksit, L-argininden sitrulin oluşumu sırasında, L-argininin guanidin nitrojen grubunun hidroksilasyonu ile oluşan ara üründür. Bu reaksiyon bir dizi nitrik oksit sentaz (NOS) enzimi tarafından katalize edilir Nitrik oksit sentaz enzimleri yapısal nitrik oksit sentaz (cnos) ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz (inos) olmak üzere iki ana gruba ayrılır 132. Yapısal NOS vasküler endotelde, nöronlarda ve trombositlerde bulunur 133. Nöronlarda bulunan, nöronal nitrik oksit sentaz (nnos), endotel hücrelerinde bulunan endotelyal nitrik oksit sentaz (enos) adını alır. cnos kardiyomiyositler, hepatositler, nöronlar, mikroglial hücreler, nötrofiller, vasküler endotel ve düz kas hücrelerinde bulunur. Yapısal NOS tarafından yapılan nitrik oksit hücreler arası ve hücre içi haberleşmede rol oynar. Yapısal NOS enzimleri ortamdaki kalsiyum konsantrasyonlarının artışından etkilenirken, inos etkilenmez 134,135. inos'un enflamasyon olayının fizyopatolojisinde önemi rol aldığı bilinmektedir. Bu enzimler IL 1, TNF-α, IFN-γ; gram negatif bakterilerin duvarında bulunan lipopolisakkarit (LPS) tarafından oluşturulan mediatörler ve çeşitli enflamatuvar sitokinlerle uyarılmaktadır 136. Yapısal NOS çeşitli organ sistemleri için bazal seviyelerde gereklidir 133.

37 22 Arterlerde venlerden daha fazla NO üretilir 137. NO enflamasyonda birçok rol üstlenir Enflamasyondaki bu rolleri: damar düz kas gevşemesi 140,141, trombositlerin çeşitli aşamalarda aktivasyonu 136,142,143, aktive makrofajlarda mikroorganizmaları öldüren ajan olması 136, lökosit endotel ilişkisinin sağlanması 144, endotel hücre adhezyon moleküllerinin salınımı 145, Lenfosit proliferasyonu 146 şeklinde özetlenebilir. Nitrik oksidin serbest oksijen radikalleriyle etkileşimi ve antioksidan özellikleri ile ilgili araştırmalardan elde edilen sonuçlar çelişkilidir. Aktif makrofajların mikrosidal aktivitelerini NO aracılığıyla gösterdikleri ileri sürülmekle birlikte asıl mediatörün NO'dan üretilen nitrojen dioksit (NO 2 ) gibi ikincil bir oksidan madde olabileceği düşünülmektedir 147. Ayrıca nitrik oksidin yara iyileşmesinde de etkili olduğu gösterilmiştir 148. h-lizozomal Unsurlar: Nötrofil ve monositler lizozomal granüller içerirler. Nötrofillerde üç tip granül izlenir. Spesifik granüller laktoferrin, lizozim, defensin, alkalen fosfataz, kollejenaz gibi enzimler içerir. Primer granüller myeloperoksidaz, lizozim, defensin, asit hidrolazlar ve nötral proteazlar içerir. Tersiyer granüllerde ise; asid hidrolazlar ve jelatinazlar bulunur. Bu enzimlerin birçoğu matriks proteinlerini parçalayarak, destrüktif doku hasarına neden olurlar 1,2,4,10,90, Kronik Enflamasyon: Kronik enflamasyon aktif iltihap ve iyileşme süreçlerinin birlikte görüldüğü uzun süreli bir enflamasyon olarak kabul edilir 3,10,11. Kronik enflamasyon akut enflamasyonu izleyebilir. Bu geçiş zedeleyici etkenlerin ısrarla devam etmesi veya iyileşme proçeslerinde bozukluklar nedeniyle ortaya çıkar. Zedelenmenin

38 23 bazı türlerinde ise zedeleyici etkene karşı yanıt başlangıçtan itibaren kronik enflamasyondur. Kronik enflamasyonu ortaya çıkaran zedeleyici etkenler akut enflamasyon yapanlardan daha az toksik olmalarına rağmen, iyileştirme proçeslerinde bir yetersizlik olması daha uzun süren bir zedelenmeye neden olabilir. Fibrozis birçok kronik enflamatuvar hastalığın ortak özelliğidir ve organ disfonksiyonunun önemli nedenlerinden biridir. Kronik enflamasyon; inatçı enfeksiyonlar 12-14, potansiyel toksik ajanlara uzun süre maruz kalma ve otoimmün hastalıklar sırasında oluşabilir. Kronik Đnflamasyon Hücreleri: Kronik enflamasyon proliferatif hücrelerin oluşmasıyla ortaya çıkar. Bunlar makrofajlar, lenfositler ve plazma hücreleridir 71,150. Makrofajlar kemik iliği orijinli hücrelerden oluşan dolaşımdaki monositler ve doku makrofajlarından ibaret mononükleer fagositik sistemin bir komponentidir 151. Kandaki monositlerin yarı ömrü yaklaşık 1 gün kadardır 151. Monositler ektstravasküler dokuya ulaştıkları zaman bir değişim geçirirler ve daha büyük, makrofaj olarak adlandırılan, fagositik hücreleri oluştururlar 152,153. Makrofajların da aktive olabilme özellikleri vardır 154,155. Aktive olduklarında hücrenin büyüklüğü ve lizozomal enzim içeriği artar. Metabolizması daha aktif hale gelir. Fagosite ettikleri organizmaları ve bazı tümör hücrelerini öldürebilme yetenekleri ortaya çıkar. Makrofajları aktive edici sinyaller; hassaslaşmış T lenfositlerden salınan sitokinler (özellikle IFN-γ), bakteriyel endotoksinler, akut enflamasyon sırasında oluşan çeşitli mediatörler ile fibronektin gibi ekstrasellüler matriks proteinlerinden oluşur. Aktive olan makrofajlar çok sayıda biyolojik olarak aktif ürün salgılarlar Bunlar; sitokinler, eikosanoidler, reaktif oksijen ürünleri, nötral proteazlar, kompleman komponentleri ve koagulasyon faktörleridir. Bu mediatörler kronik iltihabın karakteristik özellikleri olan doku

39 24 destrüksiyonunu, anjiogenezisi ve fibrozisi oluştururlar. Akut iltihapta irritan maddenin temizlendiği ve iyileştiği yerlerde makrofajlar ölürler ve lenfaktiklere girerek vücuttan atılırlar. Ancak kronik iltihap odağında makrofaj birikimi kalıcıdır. Lenfosit kökenli faktörlerin devamlı salgılanması iltihabi odakta makrofajların toplanmasını veya immobilize olmasını sağlayan önemli bir mekanizmadır. IL-4 veya IFN-γ da makrofajları uyararak, bu hücrelerin birleşmelerine ve dev hücreler adı verilen büyük, çok nükleuslu hücreleri oluşturmalarına yol açarlar. Uygun koşullarda makrofajlar çoğalma kapasitesine de sahiptirler. Kronik iltihapta rol oynayan diğer hücre tipleri; lenfositler ve plazma hücreleridir 157. Lenfositler non-immün enflamasyonda olduğu gibi herhangi bir immün reaksiyonda da mobilize olurlar. T lenfositler kronik enflamasyonda makrofajlarla karşılıklı bir ilişki halindedir. Plazma hücreleri B lenfosit aktivasyonu sonucunda oluşurlar. Đnflamasyon bölgesindeki antijenlere karşı veya değişen doku komponentlerine karşı antikor oluştururlar. Eosinofiller karakteristik olarak parazitik enfeksiyonlar çevresinde veya allerjilerde olduğu gibi immunglobulin E (IgE) ile oluşturulan immun reaksiyonlarda rol oynarlar. Granülomatöz Đnflamasyon: Granülamatöz iltihap kronik iltihabın ayrı bir paternidir. Büyümüş skuamöz epitel hücresine benzer bir görünümde aktive makrofajların kümelenmesi ile karakterizedir. Granülomlar tüberküloz başta olmak üzere nisbeten az sayıda patolojik durumlarda görülürler 12. Bundan dolayı granülamatöz paterni tanımak sınırlı sayıda ancak bazıları yaşamı tehdit eden hastalıkları belirlemek açısından önemlidir. Granülomlar parçalanması güç olan yabancı cisimlere karşı da oluşabilir ve yabancı cisim granulomları olarak adlandırılır 12. Granülomlar T hücreleri tarafından

40 25 immünolojik yanıt verilen bazı organizmalara (Listeria, Salmonella) karşı veya hazmedilemeyen partiküllere karşı meydana gelebilir Bu durumlarda aktive T lenfositlerden salgılanan sitokinler makrofajların epiteloid hücreye veya dev hücreye dönüşmesini sağlarlar 159. Granülomlar ayrıca sarkoidoz, Wegener granülamotozisi ve crohn hastalığı gibi otoimmün hastalıklarda da görülebilir 160. Đlginç olarak hodgkin ve non-hodgkin lenfoma gibi bazı malignensilerde de granülom formasyonu görülmektedir 161. Kısaca söylemek gerekirse granülom kronik enfeksiyona karşı organizmayı korumaktadır Anti-enflamatuvar Đlaçlar: Ağrı ve enflamasyon tedavisinde kullanılan ilaçların başında, steroid anti-enflamatuvar ilaçlar (SAEĐ) ve steroid olmayan anti-enflamatuvar ilaçlar (Nonstorodial anti-enflammatuar ilaçlar; NSAEĐ) gelir 106,162. NSAEĐ ler antibiyotiklerden sonra en sık reçete edilen ilaçlardandır. Toplumda NSAEĐ kullanım prevalansı %5 olarak hesaplanmaktadır 163. Ayrıca enflamatuvar olaylarda yukarıda belirttiğimiz anti-enflamatuvar ilaçlar haricinde penisilamin, kolşisin, kinin türevleri, altın bileşikleri ve anti-enflamatuvar etkisi kanıtlanmış bazı bitkiler de kullanılmaktadır Steroidal Anti-enflamatuvar Đlaçlar (SAEĐ): Steroidal anti-enflamatuvar ilaçlar NSAEĐ a göre daha belirgin anti-enflamatuvar etki oluştururlar 169. Bu etkileri muhtemelen; lizozomal membran stabilizasyonu, kapiller geçirgenliğin azalması, lökositlerin enflamasyon alanına göçünün önlenmesi, hasarlı hücrelerin fagositozunun (özellikle T lenfosit yapımının azalması) ve lökositlerden IL 1'in salınımının inhibisyonuna bağlıdır. Kortizol; inos, COX ve fosfolipaz A2 nin sentezini

41 26 baskılar 170,171. Fosfolipaz A2 aktivitesini, dolaylı yoldan, bir inhibitör protein olarak bilinen lipokortinin salınımını artırarak baskılar Fosfolipaz A2 inhibisyonu, araşidonik asit salınımını azaltarak, PG ler, tromboksanlar, ve lökotrienlerin oluşumunu da inhibe eder ve SAEĐ ın anti-enflamatuvar etkisinin en önemli mekanizmasını oluşturur Non Steroidal Anti-enflamatuvar Đlaçlar: Klasik NSAEĐ ağrı, ateş, kızarıklık ve ödemin giderilmesinde etkili oldukları için enflamasyonla seyreden hastalıkların tedavisinde en fazla tercih edilen ilaçlardır 176,177. Bu ilaçların anti-enflamatuvar etkileri, SAEĐ ınkinden daha düşüktür. Fakat yukarıda belirttiğimiz üç etkinin bir arada bulunması NSAEĐ ın kullanımını oldukça artırmıştır. Ayrıca günümüzde enflamasyon, ağrı ve ateşte NSAEĐ ın öncelikli kullanılmasının en önemli nedenlerinden biri de narkotik analjezikler gibi bağımlılık yapmaması 178 ve etkilerine karşı tolerans gelişmemesidir 179. NSAEĐ'ın kısa tarihçesine bir göz atıldığında, ilk kez 1820 de kolşisin, 1860 da salisilik asitin tanımlandığı ve ilk Aspirin tabletinin 1898 de sentezlendiği dikkati çeker 180. NSAEĐ isminin 1949 da ilk kullanılışı fenilbutazon' un sentezlenmesi ile eş zamanlıdır de bu serüven Dr. John Wyane' in etki mekanizmaları konusunda yaptığı çalışmalar ve ilk siklooksijenaz enzimini tanımlaması ile yeni bir boyut kazanırken, John Wyane e de Sir ünvanı ve Nobel yolu açılmıştır da ise, serüvende yeni bir durak olan, prostoglandin endoperoksit sentetaz (siklooksijenaz = COX) enzimi elde edilmiş, böylece NSAEĐ'ın etki mekanizmaları, yan etkileri ve güvenlik profili üzerine olan çalışmalar hızlanmıştır. Bu konuda son gelişme 1990 lı yılların başında COX'un tek bir molekül olmadığını birden fazla izomerlerinin

42 27 bulunduğunu ve her bir izomerin farklı işlevlerde rol aldığı gösterilmiştir. Böylece klinik çalışmalar da yeni bir boyut kazanmıştır 182,183. NSAEĐ ın Sınıflandırılması: 1. Salisilatlar a- Asetil salisilik asit, salisilik asit, metil salisilat ve Sodyum salisilat b- Diflunisal 2. Paraaminofenol türevleri a- Asetaminofen b- Fenasetin 3. Pirazolon türevi ilaçlar a- Aminopirin b- Propifenazon c- Metamizol sodyum d- Fenilbutazon e- Oksifenbutazon 4. Profenler (Fenilropionik asid türevleri) a- Đbuprofen b- Naproksen c- Fenbufen d- Tiaprofenik asid e- Ketoprofen f- Fenoprofen kalsiyum g- Flurbiprofen

43 28 h- Đndoprofen k- Zomepirak 5. Fenilasetik asid türevleri a- Nabumeton b- Fenklofenak c- Diklofenak sodyum 6. Đndol asetik asid türevleri a- Đndometazin b- Asemetasin c- Tolmetin d- Ketorolak e- Sulindak 7. Fenamik asid türevleri a- Mefenamik asid b- Flufenamik asid c- Etofenamat 8. Oksikamlar ve diğer ilaçlar a- Piroksikam b- Tenoksikam c- Prokuazon d- Azapropazon e- Metotrimeprazin 9. COX-2 inhibitörleri a- Meloksikam

44 29 b- Nimesulid c- Etodolak d- Selekoksib e- Rofekoksib COX enzim aktivitesi ile membran fosfolipitlerinden prostaglandin sentezine giden yol kontrol edilir. Bu enzimin NSAEĐ ile inhibisyonu, prostaglandin sentezinde azalma oluşturur. Lipooksijenaz yolunun inhibisyonu ise, lökotrienlerin sentezini inhibe eder. NSAEĐ ın Etki Mekanizmaları: NSAEĐ ın anti-enflamatuvar etki mekanizmaları COX ve lipooksijenaz (LO) ürünlerinin sentezinin inhibisyonu, toksik oksijen radikallerinin ve lizozomal enzim salınımının engellenmesi, nötrofil agregasyonu, adezyon ve kemotaksisinin önlenmesi, oksidatif fosforilizasyonun uncoplingi şeklinde sıralanabilir. Prostaglandin sentez yolağındaki enzim COX enzimidir 184. Bu enzim, araşidonik asiti stabil olmayan PGG2 ve PGH2 ye çevirir. Bugün COX 1 ve COX 2 diye adlandırılan iki siklooksijenaz formu olduğu bilinmektedir 185. COX 2 enflamatuvar bölgede sitokinler, enflamatuvar mediatörler, endotoksinler ve mitojenik ajanlar tarafından indüklenir COX 1 dediğimiz temel form ise trombositler, damar endoteli, mide mukozası, böbrek, pankreas langerhans adacıkları, seminal veziküller ve beyin gibi birçok normal hücre ve dokuda bulunur 176,189. Bununla birlikte, COX 2, böbrek ve beynin bazı bölgelerinde üretilebilir 190,191. COX 1 midede bulunurken, COX-2 midede bulunmaz. Bu da selektif COX 2 inhibitörlerinin GĐS üzerindeki yan tesirlerinin daha az olduğunu gösterir.

45 30 Araşidonik asitten 5-lipooksijenaz enzimi aracılığıyla LO ürünleri oluşur. NSAEĐ siklooksijenaz yolunu inhibe ederek prostaglandin sentezini önlerler, ancak lipooksijenaz yolunu inhibe edemezler ve lökotrien oluşumunu önleyemezler. Aspirin kovalent bağ yaparak, hem COX 1 hem de COX 2 enzimini inhibe eder. Geri dönüşlü siklooksijenaz inhibitörü olan tüm diğer NSAEĐ ın primer olarak etkisi ilacın farmakokinetik klirensi ile ilişkilidir. NSAEĐ kabaca yarılanma ömrü 6 saatten kısa ve 10 saatten uzun olan iki gruba ayrılır. Đnsan vücudunda terapötik dozlardaki aspirin ve diğer NSAEĐ ın prostaglandin biosentezini azalttığına ilişkin birçok önemli kanıtlar vardır 21,182,192. Ve bu ilaçların anti-enflamatuvar etkinlikleri ile, siklooksijenazı inhibe edebilme potansiyelleri arasında anlamlı bir korelasyon görülmüştür 71,174. Buna rağmen bazı istisnalar bulunmaktadır, fakat bu istisnalar in vivo ortamı taklit edemeyen deneysel ortamların kullanılmasına bağlanmaktadır 193. Birçok bulgu NSAEĐ ın primer terapötik etkisinin prostaglandin sentez inhibisyonu ile oluşmasına karşın, NSAEĐ ın supresör T lenfositlerini situmüle ederek, yardımcı T lenfositlerin IL 1 salgılamalarını baskıladıkları da tespit edilmiştir. Đnflamasyonda aktive olan makrofaj ve fibroblastlardan, IL 1 den başka sitokinler de salınmaktadır. IL 6, TNF ve interferon da enflamasyonda rol oynarlar. NSAĐ ilaçların, IL 1 ve IL 6 yapımını ve salınımını inhibe ettikleri çeşitli araştırmalarda gösterilmiştir 194. Đnflamatuvar eklem hastalıklarında sinoviyal dokuda ve kartilaj yüzeylerinde polimorf nüveli lökosit sayısı artmakta ve bunlardan diğer mediyatörler gibi proteolitik enzimler de salınmaktadır. Bu enzimler enflamasyonun başlamasına ve aynı zamanda periartiküler kemiğin yıkımına sebep olmaktadır. NSAEĐ lizozomal membran stabilizasyonu sağlayıp, lizozomal enzimlerin salınımını önleyerek de etkilerini

46 31 göstermektedirler. Aynı zamanda camp düzeyini artırarak da, lizozomal enzim salınımını inhibe ettikleri ileri sürülmektedir 194. NSAEĐ ın iltihaplı dokuda serbest oksijen radikallerinin oluşmalarını inhibe ettikleri veya oluşanları bağlayarak inaktive ettikleri çeşitli araştırmalarda gösterilmiştir 195. NSAEĐ ın anti-enflamatuvar etkilerine katkıda bulunan diğer özellikleri ise sırayla; nötrofil agregasyonu, adezyon ve kemotaksisinin önlenmesi, NADPH oksidaz ve fosfolipaz C aktivitesinin antagonizma edilmesi olarak sayılabilir 181,196,197. NSAEĐ ın Kullanıldığı Yerler: Bu ilaçlar, analjezik olarak kullanıldıklarında, genellikle diş ağrısı gibi hafif şiddette ağrılara karşın etkin olurlar 178. Merkezi sinir sistemi üzerinde opiatların istenmeyen etkilerine sahip değildirler (solunum bozukluğu, fiziksel bağımlılıkta artış). NSAEĐ ateşli durumlarda vücut sıcaklığını düşürürler, fakat normal vücut sıcaklığını değiştirmezler. Gerçekte seçkin COX 2 inhibitörleri etkin antipiretik etkilidirler. Romatizmal eklem iltihapları ve kemik eklem iltihaplarının tedavileri NSAEĐ ın temel klinik uygulamaları arasında bulunur 198. Hastaların, rofecoksib ve selekoksible yapılan kronik tedavilerinde, gastrik toksisitesiz bir şekilde enflamasyonun baskı altına alınması, selektif COX 2 inhibitörlerinin diğer NSAEĐ dan daha avantajlı olduğunu göstermektedir. Genel olarak NSAEĐ sadece hastalıktan kaynaklanan enflamasyon ve ağrıların yarattığı semptomlarda rahatlamayı sağlar, hastalığın dokulara verdiği patolojik zararın ilerlemesini engelleyemez. NSAEĐ ın diğer kullanım alanları prostaglandin biyogenezini önleme kapasitelerine bağlıdır. Prostaglandinler duktus arteriosusun gelişiminde de yer edinmektedir. Bu nedenle indometazin ve benzeri ajanlar yeni doğanlarda kapanmamış

47 32 duktusları kapatmak için kullanılmaktadır. Diğer yandan non-selektif NSAEĐ ın hamile kadınlarda kullanımı, intrauterin duktus arteriozusun prematüre kontraksiyonuna sebep olabilir. Fetal hayatta COX 1 ve COX 2 tarafından sentezlenen prostaglandinlerin (vazodilatatör PG), duktus arteriosusun açıklığını sürdürmesinde etkili olduğu belirlenmiştir 199. Fetal duktusun açık kalmasını sağlayan izoformların oluşmasını önlediği için, gebe kadınlarda selektif COX 2 inhibitörlerinin kullanımında tedbirli olmak gerekir. Menstrüasyon esnasında endometrium tarafından salınan prostaglandinler, primer dismenorede ki diğer semptomların ve sert krampların nedeni olabilir ki bu durumun tedavisi NSAEĐ ile sağlanmaktadır. Yeni bir çalışma, selektif COX 2 inhibitörü refekoksibin, dismenore tedavisinde, naproksen sodyum kadar iyi olduğunu ortaya koymuştur. Sistemik mastositozisli hastalardaki hipotansiyon ve şiddetli vazodilatasyonun major mediatörünün, mast hücrelerinden fazla oranda salınan PGD2 olduğu bulunmuştur. Bu hastaların sadece antihistaminiklerle tedavisi etkili değildir, ancak tedaviye NSAEĐ ın eklenmesi ile etkili bir şekilde bu epizotlar önlenebilmektedir 200. PGE2 in bazı kanserlerdeki humoral hiperkalsemi ile ilişkili olduğu da bulunmuştur. NSAEĐ ile tedavi bazı hastalarda serum kalsiyum düzeylerini etkili bir şekilde düşürmektedir 201. NSAEĐ ın önemli bir kullanım alanıda kolon kanserinin önlenmesidir. Epidemiolojik çalışmalar sık olarak aspirin kullanımının kolon kanserinin insidansında önemli ve çarpıcı bir azalma meydana getirdiğini göstermektedir 202. Đlginç olarak bu azalış 325 mg lık tabletlerden haftalık 4 ya da 6 tane alınacak kadar az bir dozla sağlanmaktadır.

48 33 NSAEĐ ın Yan Etkileri: NSAEĐ ın kullanımına bağlı görülen en sık yan etkiler gastrointestinal sisteme ait yan etkilerdir. GĐS semptomları; dispepsi 203. gastrik erozyon, peptik ülser, üst GIS kanaması 203, barsak enflamasyonu gibi geniş bir yelpaze içinde dağılmıştır 204,205. GĐS intoleransı %30, endoskopik ülser prevalansı ise %10 30 arasında rapor edilmektedir. Avrupa'da, üst GĐS kanaması nedeniyle her gün hastaneye yatırılmakta olan 1000 kişiden 400'ün de kanama/perforasyon doğrudan NSAEĐ a bağlanmaktadır. Genitoüriner sistemde; glomerüler filtrasyonda azalma, akut böbrek yetmezliği, papiler nekroz, serum kreatinin seviyesinin yükselmesi, su retansiyonu, proteinüri oluşabilmektedir Solunum sisteminde ise; bronkospazm, astım provakasyonu 211 ve pnömonitis görülmesi nadir değildir. Karaciğerde; toksik hepatit 212, kolestatik sarılık, karaciğer yetmezliği 213, Reye Sendromu 214 gibi çeşitli rahatsızlıklar oluşabilir. Nöropsikiyatrik yan etkileri başağrısı, baş dönmesi, sersemlik, tinnutus, depresyon, konfüzyon, hallusinasyon gibi problemlerin ortaya çıkışıyla görülmektedir 163. Kognitif disfonksiyon, hafıza kaybı, irritabilite, uykusuzluk, konsantrasyon bozukluğu, unutkanlık, kişilik değişiklikleri ve hatta paranoid reaksiyonların da görüldüğü bildirilmektedir 117.Yaşlı hastalarda bu yan etkilerin daha fazla olduğu, yine bu yan etkilerin yüksek doz kullanımında daha sık ortaya çıktığı bilinmektedir. Dermatolojik olarak yan etkiler; ürtiker 215, lökositoklastik vaskülit, eritema multiforme 216,217, ilaç erüpsiyonu, morbiliform erüpsiyonlar, vezikülobüllöz erüpsiyonlar, eksfoliyatif eritrodermi, fotosensitivite 218 şeklinde ortaya çıkabilmektedir. Ayrıca Stevens Johnson Sendromu, toksik epidermal nekroliz gibi toksik etkilerden de bahsedilmektedir. Hematolojik yan etkiler ise kanamaya eğilim 219, aplastik anemi 220, trombositopeni, agranülositozdur 216.

49 34 NSAEĐ, prostaglandin sentezini inhibe etmeleri nedeniyle (antinatriüretik etkileri ve vazokonstriksiyona eğilim yaratmaları) hipertansiyonlu hastalarda kan basıncını yükseltmektedir 221,222. NSAEĐ ın salisilatlarda olduğu gibi glikozaminoglikan sentezini bozduğu ve kıkırdak matriksinin temel maddesi olan proteoglikan kaybını artırdığı çeşitli araştırmalarda gösterilmiştir. enflamasyon ile seyreden eklem hastalıklarında proteoglikan sentezini bozmakta ve ekstrasellüler matriksin rezorbsiyonunu artırmaktadırlar 223. NSAEĐ ın Kontrendikasyonları: NSAEĐ, gastrointestinal kanama hikâyesi veya semptomları bulunan şahıslarda kullanılmamalıdır. Hamilelik süresini uzattığı, düşük doğum ağırlıklı bebek ve doğum öncesi ve sonrası kanama eğilimi arttırdığı için gebelerde de kullanılmamalıdır 179. Özellikle viral enfeksiyon geçiren çocuklarda aspirin başta olmak üzere NSAEĐ ın kullanımı ölümcül olabilen Reye Sendromu oluşturduğu için, çocukluk çağı viral enfeksiyonlarında kullanılmamalıdır 214. Diğer yandan NSAEĐ, astımı proveke ettikleri için astım hikayesi olan şahıslarda kontrendikedir Salisilatlar Asetilsalisilik asit: Aspirin adıyla tanınan, bu grup içinde en fazla kullanılan ve en ucuz olanıdır. Asetilsalisilik asit (ASA) PG, prostasiklin, tromboksan A 2 sentezini inhibe eden COX lara özgül olmayan bir anti-enflamatuvar, analjezik ve antipiretik etkili ilaçtır 224. ASA COX-1 i COX-2 ye göre daha fazla inhibe eder ve bu inhibisyon dönüşümsüzdür 225.

50 35 Farmakokinetiği: ASA mideden kolaylıkla absorbe olabilir. Oral alımdan 20 dakika sonra kanda minumum etkin düzeylere, 1-2 saat sonra ise maksimum düzeylere çıkarak analjezik etkisini gösterir. ASA karaciğer ve kanda salisilata hidrolize edilir. Etki Mekanizmaları: A) Anti-enflamatuvar Etkileri: ASA, eikozanoid mediatörlerinin sentezini inhibe etmesinin yanında kallikrein sisteminin kimyasal mediyatörlerini de engeller. Bunun sonucunda lezyonlu damarlarda granülositlerin yapışmasını inhibe eder, lizozomları stabilize eder ve polimorf nüveli lökositlerin ve makrofajların iltihap odağına göçünü frenler 226. B) Analjezik Etkileri: ASA nın iltihap odağındaki periferik etkileri yanında aynı zamanda subkortikal bölgede ağrı uyarılarını da inhibe ettiği düşünülmektedir. Kasiskelet sistemi ağrıları ve vasküler orijinli ağrılarda etkindir. C) Antipiretik Etkileri:ASA yükselen sıcaklığı düşürür. Normal vücut sıcaklığı üzerine etkisi hafiftir. Sıcaklığın düşmesi yüzeyel damarların vazodilatasyonuna bağlıdır. Ayrıca ısı kaybı terleme yoluyla da olmaktadır 227. D- Platelet Etkileri: ASA nın tromboksan sentezini inhibe eder. Buna bağlı olarak trombosit agregasyonu oluşmaz ve kanama zamanı uzar 228. Tromboksan A 2 trombositlerin şeklini değiştirmesine, granüllerini boşaltmasına ve agrege olmalarına neden olan bir araşidonik asit ürünüdür. ASA siklooksijenaz enziminin dönüşümsüz asetilasyonuyla Tromboksan A 2 sentezini inhibe eder 229. Diğer salisilatlar siklooksijenazı inhibe ederler ancak siklooksijenazı asetilleyemedikleri için inhibitör etkileri kısadır ve yan etkileri reversibldir. ASA nın etkisi irreversibl olduğundan trombosit agregasyonunu yeni trombositler meydana gelinceye kadar bozar.

51 36 Klinikte Kullanımı: ASA anti-enflamatuvar ve analjezik etkilerinden dolayı romatoid artrit, gut, romatizmal ateş, juvenil romatoid artrit, spondiloartropati gibi hastalıkların tedavisinde kullanılır 229,230. Bu hastalıklarda aspirinin tercih edilmesi yüksek dozlarda ortaya çıkan güçlü anti-enflamatuvar etkisinden kaynaklanmaktadır. Bunların dışında artralji, myalji gibi ağrılı durumlarda da kullanılabilmektedir. Antipiretik etkisinin güçlü olması nedeniyle ateş tedavisinde sıklıkla kullanılan ASA, düşük dozlarda da platelet agregasyonunu inhibe ettiği için kardiovasküler alanda 231 ve serebrovasküler trombüsün kronik tedavisinde de kullanılır. Aynı zamanda kesin olmamakla birlikte kolon kanseri profilaksisinde de kullanılmaktadır 224, 232. Yan Etkileri: a) Gastrointestinal Sistem Etkileri: ASA, gastrointestinal sistemde özellikle midede mukoza ile direkt temas sonucu yüzeyel peteşi ve ülser oluşmasına neden olmaktadır. Bunların sonucunda ise gizli kanama, akut kanama veya perforasyon ortaya çıkabilmektedir 233,234. Bu etkileri alınan tabletin mide mukozasını zedelemesi, iyonize olmayan salisilatın mideden absorbsiyonu ya da koruyucu prostaglandinlerin salınımının inhibisyonuna bağlı olarak gelişmektedir 235,236. Araştırmalarda ASA nın peptik ülsere neden olduğu gösterilememişse de; epidemiyolojik araştırmalarda ASA kullananlarda mide ülseri oranının arttığı, daha az olarak da duedonum ülseri sıklığının arttığı görülmüştür. b) Kanama ve Hemostaz Etkileri: Aspirin heparin ve diğer antikoagülan ilaçların etkilerini potansiyalize eder. Yüksek dozda aspirin karaciğerde protrombin ve diğer pıhtılaşma faktörlerinin sentezini doza bağımlı olarak azaltmaktadır. K vitamini ile bu azalma tersine çevrilebilir. Aspirin kullanımı protrombin zamanını ve koagülasyon zamanını uzatmaktadır.

52 37 c) Santral Sinir Sistemi Etkileri ve Salisilizm: Yüksek dozlarda salisilat kullanımı başağrısı, başdönmesi, uyuşukluk, tinnitus, işitme kaybı, bazen bulantı-kusma ve diyareye sebep olabilir 237. Toksisite sınırında olan salisilat düzeylerinde ise ventilasyonun artması, respiratuar alkaloz ve daha sonra da solunum merkezinin depresyonu ve asidoz tablosu gelişir 238. Plazma salisilat düzeylerinin mg/dl olması ile solunum merkezi stimüle olarak solunumun dakika hacmi artar ve böylece derin ve hızlı solunum gelişir. Salisilat düzeyi arttıkça solunum merkezi ve vazomotor merkez deprese edilir. Asidoz, damarlarda dilatasyon ve dolaşım kollapsı meydana getirir. Bu sırada hücre potasyumunun mobilizasyonu sonucu hiperkalemi oluşur. d) Hipersensitivite: Hipersensitivite ASA alanların %15 in de görülebilmektedir. Bronkokonstriksiyon ve bronşial astım şeklinde görüleceği gibi ürtiker, anjionörotik ödem şeklinde de görülebilir. Bu yan etkiler prostaglandin sentezinin inhibisyonu sonucu gelişmektedir. Fetal anaflaktik şok nadirdir 239. e) Diğer Etkileri: ASA diğer NSAĐ ilaçlar gibi prostaglandin sentezi inhibisyonuna bağlı olarak böbrek kan akımını ve glomerül filtrasyon hızını azaltır. Böbrek tübülüslerinde sodyum ve su reabsorbsiyonunu artırarak ıtrahlarını azaltır. Böylece vücutta su ve tuz retansiyonu gelişir. Uzun süre aspirin kullanımı papiller nekroz ve analjezik nefropatisi gibi bazen kalıcı olan böbrek bozukluklarına neden olmaktadır 240. Yüksek dozlarda ASA (4 g veya üstü), ürat ekskresyonunu artırır ürik asit düzeylerini düşürür. Buna karşılık düşük dozlarda (2 g veya altında) hiperürisemiye neden olarak gut atağını provake edebilir 238. ASA bağlı gelişen hepatit genellikle semptom vermez. Nadiren bulantı, iştahsızlık, sigaradan tiksinme, hepatomegali gelişebilir. Transaminaz düzeyleri yükselebilir ancak karaciğer fonksiyon testleri aspirin kesildikten birkaç hafta sonra normale döner.

53 38 Hepatotoksisite daha çok çocuklarda ve karaciğer hastalığı olanlarda görülmektedir. ASA nın glukoz toleransı üzerine etkisi çok azdır. Yüksek dozda salisilat alındığında sempatik bir etkiyle, adrenal medulladan katekolamin salgılanarak glikojenoliz, hiperglisemi ve glikozüri yapabilir. Diabetes mellitusu olan bir hastada yüksek doz salisilat glikoz utilizasyonunu arttırır ve glisemiyi düşürür. Ayrıca insülin gereksinimini azaltır. Diflunisal: Salisilik asidin difluorofenil türevi olan diflunisal ASA ya göre daha yeni bir anti-enflamatuvar ajandır. Anti-enflamatuvar etkisi ile birlikte analjezik ve daha zayıf olan antipiretik etkileri de vardır. Plazma yarılanma ömrü ASA yakın veya daha uzundur. En sık görülen yan etkileri; dispeptik şikayetler, bulantı, kusma, diyare ve karın ağrısıdır. Nefrotoksisite ve hepatotoksisitesi zayıfdır. Oral antikoagülan kullananlarda protrombin zamanını uzatabilir 241. Sodyum Salisilat: Sodyum salisilatın analjezik, antipiretik ve anti-enflamatuvar etkisi ASA ya göre zayıftır. Tromboksan sentazı zayıf inhibe ettiği için antiagregan etkisi belirgin değildir. COX enzimini ASA ya göre zayıf inhibe etmesine rağmen romatizmal hastalıklarda ASA kadar etkili olduğu bilinmektedir. Diğer salisilat türleri sistemik etki oluşturmak için kullanılmazlar. 2. Paraaminofenol Türevleri Parasetamol (Asetaminofen): Bu grupta, günümüzde artık sadece parasetamol kullanılmaktadır. Analjezik ve antipiretik etkinliği bakımından aspirine alternatif bir ilaçtır. Ancak aspirin gibi anti-enflamatuvar etkinliği olmadığı için enflamasyon hadiselerinin tedavisinde kullanılmaz 242. Çok iyi tolore edilir. Çok az yan etkiye sahip olmasına rağmen aşırı doz alınması öldürücü sonuçlar doğurabilir. Asetaminofenin zayıf

54 39 anti-enflamatuvar etkinliği, yüksek peroksit içeren ortamlarda (enflamasyonlu dokularda da olduğu gibi), siklooksijenazı inhibe edememesine bağlıdır 241. Tersine antipiretik etkinliğinin varlığı da beyin gibi peroksitlerin az olduğu ortamlarda siklooksijenaz inhibisyonu sağlamasına bağlanmaktadır. Asit baz dengesini bozmaz. Gastrik irritasyona neden olmaz. Trombositlere, kanama zamanına ve ürik asit atımına etkisi yoktur. Yarılanma ömrü 2 saat olan bu ilacın tamamı GĐS den emilir. Özellikle aspirinin kontrendike olduğu durumlarda analjezik ve antipiretik amaçlı kullanımı uygundur 243. Đntoksikasyonunda ağır karaciğer hasarı oluşur 244. Çok nadir olarak methemoglobinemi, hemolitik anemi, nefropati, larinks ödemi ve bronkospazm yapabilir 238, Pirazolon Türevleri: Bu grupta; metamizol, aminopirin, propifenazon, fenilbutazon ve oksifenbutazon yer alır. Metamizol: Güçlü analjezik ve zayıf antipiretik, anti-enflamatuvar etkili bir ilaçdır 244. Vücutta aktif metaboliti olan 4-metil aminoantipirine dönüşür 245. Bu aktif madde ise COX inhibisyonu yapar. Metamizolun klinik kullanımında hem oral hem de parenteral formları vardır. Yaptığı COX inhibisyonu ve anti-enflamatuvar etkinliği zayıf olmasına karşılık analjezik etkinliği oldukça güçlüdür. Omuriliğe uzanan ve ağrı inhibisyonu yapan yolakları aktive etmesi de analjezik etkisine katkıda bulunur 245. Ateşli durumlarda, enflamasyonlu ağrılarda, dismenore gibi hafif ve orta şiddetteki ağrılarda kullanılır. GĐS ile ilgili yan etkileri nadir değildir. Anemi, trombositopeni ve agranülositoz gibi hematolojik yan etkiler yapabilir. 4. Fenilpropiyonik Asit Türevleri: Bu grup ilaçlar analjezik, anti-enflamatuvar ve antipiretik etki gösterirler. COX un her iki izoformunu da inhibe ederler 246.

55 40 Đbuprofen: Mide barsak kanalından %80 oranında ve çabuk absorbe edilir. Bir saat içerisinde analjezik etkisi başlar. Yüksek oranlarda plazma proteinlerine bağlanır. Yarılanma ömrü 1 2 saat olup sinoviyal dokuda plazmadakinden daha uzun süre kalır. Biyoyararlanımı açısından aç karnına alınması tavsiye edilebilir. Đyi tolere edilen bir ilaçtır. Aspirine göre gastrointestinal sistem yan etkileri daha az olarak ortaya çıkmaktadır 246. Diğer NSAEĐ da görülen renal, hepatik ve hematolojik yan etkiler nadir de olsa beklenebilir. Antikoagülan ilaçlar ile etkileşimi nadirdir. Nadiren allerjik kaynaklı kemik iliği depresyonu yapabilir 242. Son yapılan çalışmalarda ibuprofenin Alzheimer tedavisinde kullanıldığı ve olumlu sonuçlar alındığı gösterilmiştir 247. Yenidoğan ve prematürelerde kullanılması patent ductus arteriozus açıklığını kapatmada oldukça yararlıdır 248. Naproksen: Fenilpropiyonik asit türevleri içinde yarılanma ömrü en uzun olandır. Plazma proteinlerine yüksek oranda bağlanır. Đltihabi dokuda lökosit aktivasyonu ve migrasyonu üzerinde belirgin inhibitör etki meydana getirmektedir 139. Aspirin gibi trombosit agregasyonunu inhibe ederek kanama zamanını uzatır. Anti-enflamatuvar etkisi yeterli dozlarda ( mg) verildiğinde indometazin ve aspirin kadar güçlüdür. Çocuklarda uzun süreli kullanımının güvenilirliği saptanmış bir ilaçtır (10 mg/kg/gün). Yan etkileri açısından aspirine benzerse de bu etkiler daha az ve daha hafiftir. Genel olarak GĐS ile ilgili yan etkiler çoğunluktayken daha az olarak başağrısı, baş dönmesi ve depresyon görülebilir 242,249. Ketoprofen: Fenilpropiyonik asit türevi olup, hem sikloosijenazı hem de lipoksijenazı inhibe etme özelliği göstermektedir. Hem santral hem de periferik analjezi etkisi vardır 250. Ankilozan spondilit, romatoid artrit, gut artriti, bursit, tendinit ve travmatik

56 41 snovitte kullanılır 251. Yan etkileri naproksene benzemekle beraber ketoprofende kontakt ve fotokontak reaksiyonlar daha sık görülür 215. Tiaprofenik asit: Diğer nonsteroidal anti-enflamatuvar ilaçlardan farklı olarak kıkırdak dokusundaki proteoglikan sentezini inhibe etmemesi ile dikkati çekmektedir. Araştırmalarda kıkırdaktaki katabolik etkisinin azaldığını gösterir şekilde stromelysin düzeylerinde belirgin azalma olduğu saptanmıştır. Osteartrozda kıkırdak proteinlerini yıkan kollajenaz ve proteoglikanaz enzimlerini azaltır. Bu enzimlere paralel olarak proteoglikan yıkım enzimleri (metalloproteazları) azalttığı ayrıca sinovial sıvıda PGE2 ve prekürsörlerini de azalttığı gösterilmiştir. Uzun süreli araştırmalarda kıkırdak matriks biyosentezi üzerinde toksik etkisinin gözlenmemesi osteoartit gibi uzun süreli NSAĐ ilaç gereksinimi olan hastaların tedavisinde tercih edilme nedeni olabilir. Yan etkileri diğer propiyonik asit türevlerinde olduğu gibi görülmektedir. 5. Fenilasetik Asit Türevleri: Bu grubun üyeleri; diklofenak, nabumeton ve fenklofenaktır. Diklofenak: Fenilasetik asidin basit bir türevi olup, flurbiprofen ve meklofenamata benzer. Siklooksijenazın güçlü bir inhibitörüdür ve indometazine yakın antienflamatuvar etki gösterir. Diklofenak ile hem COX 1 ve COX 2 hem de lipooksijenazın inhibe edildiği ve ayrıca lökositlerde araşidonik asit konsantrasyonunu azalttığı bildirilmiştir 139,249. Oral yolla alındığında süratle absorbe olur. Hastalar tarafından iyi tolere edilir. Doz alındıktan 1 2 saat sonra maksimum plazma konsantrasyonları elde edilir. Yarılanma ömrü kısadır (1 2 saat kadar). Sinovial sıvıya geçebilmektedir. Aspirin ile birlikte kullanılırsa diklofenak ın plazma düzeyleri azalır. Rektal, parenteral ve topikal kullanımı mümkündür. Yan etkileri diğer NSAĐ ilaçlarda

57 42 görülen yan etkilere benzer. Ancak daha az ve daha hafif bulgularla seyredebilmektedir 243. Nabumeton: Asidik yapıda olmayan naftilalkanon türevidir. Zayıf siklooksijenaz inhibisyonu sağlar. Ön ilaç olarak alındıktan sonra karaciğerde naftil asetik aside dönüşür 252. Bu metabolit naproksene benzer. Nonasidik olan bu ilaç oral yolla alındığında mide mukozasında koruyucu prostaglandin (COX 1) sentezi üzerindeki bozucu etkisini minimuma indirir. Yan etkileri diğer NSAEĐ a göre daha az görülmekte ve hafif seyretmektedir. 6. Đndolasetik Asit Türevleri Đndometazin: Bir indol türevi olan indometazin, nonsteroidal anti-enflamatuvar ilaçlar arasında en etkili anti-enflamatuvar etkiye sahip olanıdır 55. Prostaglandin sentezini güçlü bir şekilde inhibe eder. Serbest oksijen radikallerini bağlayarak inaktive ettiği gösterilmiştir 139. Bazı araştırmalarda da indometazinin kondrosit metabolizması üzerinde olumsuz etkileri olduğu ve proteoglikan sentezini inhibe ettiği belirtilmektedir. Ankilozan spondilit, osteoartrit, romatoid artrit, gut artriti, bursit, tendinit ve travmatik snovitte kullanılır 242,253. Đndometazinin yan etkileri doza bağımlı olarak artış göstermektedir. Günlük dozun (150 mg) artırılması yan etkilerin sıklığını ve şiddetini arttırmaktadır. Yüksek doz uygulamalarda olguların en az 1/3 ün de tedavinin kesilmesini gerektiren reaksiyonlar ortaya çıkabilmektedir. Gastrointestinal sistem yan etkilerinin yanısıra % ye yakın oranlarda vasokonstriktör etki ile birlikte başağrısı, baş dönmesi, konfüzyon, depresyon veya hallusinasyon görülebilir. Kan basıncında yükselmeye neden olabilir. Hematolojik yan etkiler görüleceği gibi yine renal yan etkileri açısından da

58 43 önemsenmelidir. Böbrek fonksiyonları sağlıklı olmayan kişilerde kullanımı sakıncalıdır. Son olarak kemik iliğini deprese edici etkisinden dolayı çocuklarda kullanılmamalıdır. Ketorolak: Trimetamin propiyonik asidin pirolopirol derivesidir. Yapısı itibariyle tolmetine benzer. Güçlü siklooksijenaz inhibitörü özelliği yanında güçlü analjezik etkisi de bulunmaktadır 139. Suda çözünebilir olması nedeniyle daha çok parenteral kullanımlarına yer verilmektedir. Romatizmal hastalıklarda denenmiş olup ancak tercih edilmemiştir. Daha çok postoperatif ağrılı durumlarda kısa süreli (2 5 gün) olarak analjezi için kullanılır. Sülindak: Sulfoksid grubu içeren karaciğerde biyotransformasyonu sonucu sülfide çevrildikten sonra etkin hale gelen bir ön ilaçtır. Sülfid safra ile atıldıktan sonra barsaktan reabsorbe olur. Mideden inaktif halde geçtiğinden gastrik yan etkilerinin oldukça azaldığı düşünülmektedir. Renal prostaglandin ve prostasiklin sentezini fazla inhibe etmediği ve bu nedenle de böbrek üzerine olan yan etkilerinin daha az olduğu düşünülmektedir 248. Araştırmalarda hipertansiyonlu hastalarda tercih edilmesi gerektiği vurgulanmıştır. Çünkü antihipertansif ilaçların etkinliğinde azalmaya neden olmadığı belirtilmektedir. SSS yan etkileri indometazine göre daha çok olarak görülmektedir. Kemik iliği üzerine yan etkiler, gastrointestinal yan etkiler, renal yan etkiler ve hipersensitivite reaksiyonları görülebilir Fenamik Asit Türevleri: Mefanemik asit, flufenamik asit ve etofenamat bu grubun üyeleridir. Mefanemik asit: Fenamatlar gurubunda yer alan mefenamik asit anti-enflamatuvar etkisini prostaglandin sentezini inhibe ederek göstermektedir 249. Analjezik etkisi aspirine eşdeğer, anti-enflamatuvar etkisi ise aspirinden daha zayıftır. Yan etkileri nedeniyle

59 44 uzun süre kullanılmaması gerekmektedir. Araştırmalarda gastrointestinal sistem ve renal yan etkiler ile kemik iliği üzerine önemli yan etkileri rapor edilmektedir 249. Uzun süreli tedavilerde nefrotoksik yan tesirleri görülmüştür. Çocuklarda kullanılmamaktadır. Flufenamik asit: Antiiflamatuvar etkisi mefenamik asitten daha güçlü olamsına rağmen analjezik etkisi daha zayıftır 139. Yan etkileri açısından mefenamik aside benzer özellikler göstermektedir. Etofenamat: Flufenamik asidin lipofilik ester türevidir. Doku içine nüfuz etme özelliği nedeniyle topikal kullanımları tercih edilir. 8. Oksikamlar: Bu grupta; piroksikam, tenoksikam ve meloksikam yer alır. Piroksikam: Enolik asidin oksikam türevidir. Güçlü siklooksijenaz inhibisyonu yapan ancak lipooksijenaz yolunu etkilemeyen bir ilaçtır 175. Eliminasyon yarılanma ömrünün oldukça uzun bir süre (50 saat) olması nedeniyle günde tek doz kullanımı olanak dâhilindedir 254. Oral olarak hızla absorbe olmakta, 3 5 saat içerisinde maksimum etkin plazma düzeylerine ulaşmaktadır. En sık görülen yan etkisi gasrointestinal sistemde olup, ilaç alanların % 20 sin de görülür 241,255. Tenoksikam: Güçlü siklooksijenaz inhibisyonu sağlayan tenoksikam bir oksikam türevidir. Farmakolojik etkileri piroksikama benzer. Tek farkı eliminasyon yarılanma ömrü piroksikamdan daha uzundur (60 70 saat). Günde tek doz kullanımı mümkündür. Daha çok gastrointestinal sistem yan etkileri gözlenmektedir. Diğer yan etkiler açısından ise oksikamlarda bildirilen yan etkilerin ortaya çıktığı görülmektedir. 9. COX 2 Selektif Đnhibitörleri: Bu grup içinde meloksikam, nimesulid, rofekoksib ve selokoksib vardır.

60 45 Meloksikam: Yeni bir enolik asit türevi olarak çıkarılan bu ilacın selektif COX 2 inhibisyonu yaptığı bazı araştırmalarda gösterilmektedir 256,257. Oral yolla alındıktan 5 6 saat sonra maksimum plazma düzeylerine çıkmaktadır. Eliminasyon yarılanma ömrü ortalama 20 saattir. Rektal veya intramuskuler kullanımı da mümkündür. Hastalar tarafından iyi tolere edilir 258. Yüksek oranda plazma proteinlerine bağlanır. Atılımı idrar ve feçesle olur. Zayıf bir PGE2 inhibitörü olması nedeniyle gastrik yan etkilerin az olduğunu gösteren çalışmalar rapor edilmekte ve bu ilaç ile ilgili araştırmalar devam etmektedir. Nimesulid: Sulfonanilid grubu içermesi nedeniyle diğer enol ve karboksil grupları ihtiva eden NSAĐ ilaçlardan farklıdır. Selektif COX 2 inhibitörüdür 258. Nimesulidin COX 2 inhibisyonu doza bağımlıdır. Doz arttıkça COX 2 selektivitesi azalıp daha çok COX 1 inhibisyonu oluşur 259. Ayrıca prostaglandin sentezi inhibisyonundan farklı olarak oksijen radikallerinin oluşumunu ve myeloperoksidaz enziminin serbestleşmesini de inhibe etmektedir 260,261. Bununla paralel olarak nimesulidin beyinde de oksijen kökenli serbest radikallerini azalttığı bildirilmiştir 262. Yan etkileri diğer NSAEĐ ile benzerlik göstermektedir. Ancak gastrointestinal yan etkilerinin daha az olduğu üzerinde durulmaktadır. Hatta steroidlerle beraber nimesulid verilmesi steroidlerin mide dokusuna olan hasarını bile önlemektedir 263. Son yıllarda spesifik olarak COX 2 enzimini inhibe eden ilaçlar gündeme gelmiştir. Bu ilaçlar diğer nonsteroidal anti-enflamatuvarlar gibi analjezik 264, anti-enflamatuvar ve antipiretiklerdir 267. Yapılan araştırmalarda mide dokusunda COX 1 reseptörlerinin çok fazla olduğu, COX 2 reseptörlerinin ise az olduğu bulunmuştur. Buna paralel olarak NSAEĐ ın kullanımına bağlı gelişen mide dokusu hasarının COX 2 inhibitörü kullanılarak en aza indirilebileceği gösterilmiştir. Yapılan birçok çalışma COX 2 inhibitörü ilaçların GĐS üzerindeki yan etkisinin oldukça

61 46 az olduğunu 263,265,266, göstermiştir. Bu grup ilaçlara koksib grubu ilaçlar denilmektedir. Bu ilaçların analjezik ve anti-enflamatuvar etkilerinin diğer NSAĐ ilaçlar kadar olduğu ancak Tromboksan A2 yi inhibe etmedikleri için trombosit fonksiyonlarını, platelet agregasyonunu ve kanama zamanını etkilemedikleri araştırmalarda gösterilmektedir Rofekoksib ve Selokoksib; Bu ilaçlar COX 2 yi nimesulid ve meloksikama göre yüzlerce kat daha fazla inhibe ederler 218. Yiyeceklerle etkileşimleri minimaldir. Gastrointestinal emilimi tama yakındır 272. Yarı ömürleri uzun olduğu için, günlük tek doz yeterlidir. Metabolizması lineer olmadığından ilacın yeterli kan düzeyine ulaşması için belli bir düzeyde birikmesi gerekmektedir. Karaciğerde sitozolik enzimlerle inaktive edildiği için ilaç etkileşiminin az olması en önemli avantajlarından biridir. Đlacın % 72 si idrarla, % 14 ü feçes yoluyla atılır 117,267,272. Akut ağrı ve primer dismenorede yüksek doz önerilirken, romatoid artrit ve osteoartrozda düşük doz kullanımı önerilmekte olup etkisi naproksen sodyumla eşdeğerdir 266,269. Yapılan çalışmalar spesifik COX 2 inhibitörü olan rofekoksib ve selekoksibin aspirin gibi kolon kanserini önlemede etkin olduğunu bu nedenle profilaktik olarak kullanılmasının yarar sağlayabileceğini göstermiştir 273,274. Diğer yeni bir gelişme ise bu ilaçların Alzheimer hastalığının gelişmesini ve ilerlemesini önemli ölçüde azalttığını göstermektedir 275. COX 2 lerin kardiyovasküler sisteme olan etkileri yapılan birçok çalışmayla gösterilmiştir. Đlk olarak bu ilaçların kan basıncını yükselttiği gösterilmiş olup, bu etki selekoksib kullanan hastalarda rofekoksib kullananlara göre daha az görülmektedir 276,277. Vasküler endotelde PGI2 sentezi ağırlıklı olarak COX 2 üzerinden olmaktadır ve bu etki özellikle endotel hücrelerinde çeşitli enflamatuvar olaylar sonucu artış göstermektedir 278. Yapılan çalışmalar kalpte geç faz iskemik hasarda COX 2 mediatörlerinin koruyucu etkili olduğunu göstermiştir 279.

62 47 Teorik olarak vasküler endotelde COX 2 enzimi üzerinden olan PGI2 sentezinin koksibler ile inhibe edilmesi, buna karşın trombositlerde tromboksan üretiminin COX 1 üzerinden devam etmesi koksiblerin özellikle trombojenik açıdan önemli bir risk taşıyabileceğini düşündürmektedir. Bu etkinin klinik anlamı yapılan prospektif ve retrospektif çalışmalarda halen incelenmektedir 280,281. Ayrıca yapılan bir çalışma da COX 2 inhibitörlerinin ovulasyonu bozduğunu ve bu ilaçların potansiyel bir infertilite etkeni olabileceğini göstermiştir 282. COX 2 selektif inhbitörlerinin böbrekler üzerinde etkisi mezanjiolitik hasar, albüminemi ve glomerüler endotelial hücre hasarına bağlı olarak gelişen glomerulonefrittir 283. Bu nedenle kronik kullanılmaları halinde böbrek fonksiyon testleri ile hasta periodik olarak kontrol edilmelidir ANTĐOKSĐDANLAR Serbest Radikaller Serbest radikaller bir veya daha fazla ortaklanmamış elektron ihtiva eden atom veya moleküllerdir. Bu tip moleküller ortaklanmamış elektronlarından dolayı oldukça aktiflerdir ve bu yüzden nüfuz edici özelliğe sahiptirler. Serbest radikaller üç yolla meydana gelirler Kovalent bağlı bir molekülün her bir grubunda ortak elektronlardan birinin kalarak homolotik olarak bölünmesi. X : Y. X + Y. 2 - Bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik bölünmesi. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki elektron atom veya atom gruplarının birinde kalırlar. Böylece serbest radikaller değil iyonlar meydana gelir.

63 48 X : Y X : - + Y Bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi A + e A. Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijenden oluşan radikallerdir. Serbest oksijen radikali biyokimyasında anahtar rolü oynayan maddeler oksijenin kendisi, süperoksit, hidrojen peroksit, geçiş metallerinin iyonları ve hidroksil radikalleridir 285. Bunlardan ilk dördünün çeşitli reaksiyonları sonuncu genellikle hidroksil radikalleri meydana gelir. Oksijen elektronları o şekilde dağılmışlardır ki bu elektronlardan iki tanesi eşleşmemiştir. Bu yüzden oksijen bazen bir di radikal olarak değerlendirilmektedir. Oksijenin bu özelliği onun diğer serbest radikallerle kolayca reaksiyona girmesini sağlarken, radikal olmayan maddelerle ise nispeten daha yavaş reaksiyona girmesini sağlar. Oksijenin son indirgenme ürünü genellikle sudur, ancak kısmi redüksiyonla çok sayıda yüksek derecede reaktif ürünler de oluşturabilmektedir Serbest Radikal Çeşitleri Süperoksit Radikali: Hemen tüm aerobik hücrelerde oksijenin bir elektron olarak indirgenmesi sonucu serbest süperoksit radikal anyonu (O 2 ) meydana gelir. O 2 + e O 2

64 49 Süperoksit bir radikal olmakla birlikte, kendisi direkt olarak zarar vermez. Süperoksitin zararlı etkileri çok iyi anlaşılmamasına rağmen, yüksek derecede toksik olduğuna dair birçok deliller vardır 286,287. Bununla beraber oksidatif hasarda nadiren rol alırlar, çünkü hızlı bir şekilde süperoksit dismutaz (SOD) enzimi tarafından hidrojen perokside (H 2 O 2 ) çevrilirler. Buna ilaveten asidik durumlarda H 2 O 2 ve peroksil (HO - 2 ) radikallerini üreten spontan protonasyona uğrarlar 287. Bu süperoksit radikallerinin asıl zararları, hidrojen peroksit kaynağı ve geçiş metalleri iyonlarının indirgeyicisi olmalarıdır. O 2 + O2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Süperoksit fizyolojik bir serbest radikal olan nitrik oksit ile birleşmesi sonucu reaktif bir oksijen türevi olan peroksinitrit meydana getirir. O 2 + NO. ONOO - Böylece NO. in normal etkisi inhibe edilir. Ayrıca peroksinitritlerin doğrudan - proteinlere zararlı etkileri vardır ve azot protoksit (NO 2 ), hidroksil radikali (. OH ) ve nitronyum iyonu (NO + ) gibi başka toksik ürünlere de dönüşürler. Süperoksit anyonu hem oksitleyici hem de indirgeyici özelliğe sahiptir. Adrenalin, dopamin, askorbat ve hidroksil amini oksitler, nitrobluetetrazolium ve sitokrom c'yi indirger. Redüktan olarak görev yaptığında, ferrisitokrom c nin redüksiyonunda bir

65 50 elektron kaybeder ve oksijene okside olur. Oksidan olarak görev yaptığında ise epinefrinin oksidasyonunda bir elektron alır ve hidrojen perokside indirgenir 284. Süperoksit ile perhidroksil radikali birbirleriyle reaksiyona girince biri okside olurken diğeri indirgenir. Bu dismutasyon reaksiyonu sonucu oksijen ve hidrojen peroksit meydana gelir 288. HO 2. + O 2 + H + H 2 O 2 + O 2 Diğer taraftan indirgenmiş geçiş metallerinin oto oksidasyonu da süperoksit meydana getirebilmektedir 289. Fe 2+ + O 2 Fe 3+ + O 2 Cu + + O 2 Cu 2+ + O 2 Bu reaksiyonlar geriye dönüşlü redoks reaksiyonları olarak kabul edilmektedir ve serbest radikal reaksiyonlarının hızlanmasında çok büyük öneme sahiptir 290. Hidrojen Peroksit: Asidik ortamda moleküler oksijenin çevresindeki moleküllerden iki elektron alması veya süperoksitin bir elektron alması sonucu hidrojen peroksit meydana gelir 288,291. O 2 + e - + 2H + H 2 O 2 O 2 + 2e - + 2H + H 2 O 2

66 51 Ancak biyolojik sistemlerde hidrojen peroksidin asıl üretimi süperoksitin dismutasyonu ile olur. Süperoksit molekülü proton alarak hidrojen peroksit ve moleküler oksijeni oluştururlar 289. Bu dismutasyon ya spontandır ya da süperoksit dismutaz enzimi tarafından katalizlenir. Spontan dismutasyon ph 4.8 'de en hızlıdır. Süperoksit dismutaz tarafından katalizlenen dismutasyon ise daha geniş bir ph aralığında olur. 2 O 2 + 2H + SOD H 2 O 2 + O 2 H 2 O 2 kendi başına serbest radikal değildir, çünkü ortaklanmamış bir elektron içermemektedir 286,292. Hidrojen peroksit serbest bir radikal olmadığı halde, reaktif oksijen türleri içine girer ve serbest radikal biyokimyasında önemli bir rol oynar. Çünkü Fe ve Cu gibi geçiş metalleri varlığında süperoksit ile reaksiyona girerek en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali oluşturmak üzere kolaylıkla yıkılabilir 288. H 2 O 2 + O 2 Fe 2+ veya Cu + OH. + OH - + O 2 Bu reaksiyona Haber - Weiss Reaksiyonu adı verilir. Haber - Weiss Reaksiyonu katalizör varlığında veya katalizörsüz cereyan eder. Fakat katalizörsüz reaksiyon oldukça yavaş ilerler. Demirle katalizlenen ikinci şekli ise çok hızlıdır. Bu reaksiyonda önce ferri demir (Fe 3+ ) süperoksit tarafından ferro demire (Fe 2+ ) indirgenir. Sonra bu ferro demir kullanılarak Fenton reaksiyonu ile hidrojen peroksitten. OH ve OH - üretilir 293. Reaksiyon mekanizması aşağıdaki şekildedir 289.

67 52 O 2 + Fe 3+ O 2 + Fe 2+ Fe 2+ + H 2 O 2 Fe OH + OH - Hidroksil radikali: Hidroksil radikali (. OH) hidrojen peroksidin geçiş metallerinin varlığında indirgenmesiyle (Fenton reaksiyonu) meydana gelir 288. Suyun yüksek enerjili iyonize edici reaksiyona maruz kalması sonucunda da hidroksil radikali oluşur. H - O H H. +. OH Son derece reaktif bir oksidan radikaldir. Oluştuğu yerde büyük hasara neden olur. Hidroksil radikali birçok biyolojik molekülden hidrojen atomu koparır. Bunlardan birisi de tiollerdir. R-SH +. OH RS. + H 2 O. Meydana gelen sülfür radikali oksijenle birleşerek RSO 2 ve RSO. gibi oksisülfür radikallerini meydana getirir. Bu radikaller de biyolojik moleküllerde hasar yapıcı etkiye sahiptir. Belki de hidroksil radikalinin en iyi tanımlanmış biyolojik hasarı lipit peroksidasyonu nu uyarmasıdır. Bu durum hidroksil radikallerinin membranlara yakın bir yerde üretilmesi ve membran fosfolipid zincirinin yağ asidi tabakasına atak yapması

68 53 ile meydana gelir. Bu radikalin araşidonik asit gibi doymamış yağ asitlerine olan ilgisi daha fazladır. Singlet oksijen: Singlet oksijen ( 1 O 2 ) ortaklanmamış elektronu olmadığı için radikal olmayan reaktif oksijen molekülüdür. Serbest radikal reaksiyonları sonucu meydana geldiği gibi serbest radikal reaksiyonlarının başlamasına da sebep olur. Singlet oksijen elektronlarından birinin enerji alarak ters spinli başka bir orbitale uyarılması sonucu oluşur 286. Diğer radikaller: Serbest oksijen radikallerinin etkisi sonucu karbon merkezli radikaller (R. ), peroksil radikalleri (ROO. ), alkoksil radikalleri (RO. ), tiyol radikalleri (RS. ) gibi önemli serbest radikaller de oluşabilir. Bunlardan özellikle polidoymamış yağ asitlerinden meydana gelen peroksil radikali yarı ömrü uzun olan bir radikaldir. Tiyol radikalleri ise oksijenle tekrar reaksiyona girerek sülfenil (RSO. ) veya tiyol peroksil (RSO. 2 ) vb. gibi radikalleri oluşturabilirler Serbest Radikallerin Kaynakları Biyolojik kaynakları: Aktive olmuş fagositler: (Respiratory Burst )283,288. Antineoplastik ajanlar: Nitrofurantoin, bleomisin, doksorubisin ve adriamisin Radyasyon 294. Alışkanlık yapan maddeler: Alkol ve uyuşturucular Çevresel ajanlar: Hava kirliliği yapan fotokimyasal maddeler, hiperoksitler, pestisitler, sigara dumanı, solventler, anestezikler ve aromatik hidrokarbonlar

69 54 Stres: Streste katekolamin düzeyi artar. Katekolaminlerin oksidasyonu ise serbest radikal kaynağıdır. Bu olay, stresin hastalıkların patojenezindeki rolünün serbest radikal üretimiyle ilgili olabileceğini göstermesi bakımından önemlidir. Đntrasellüler kaynakları: Küçük moleküllerin oto oksidasyonu: Tioller, hidrokinonlar, katekolaminler, fiavinler, tetrahidropterinler, antibiyotikler 293, 295,296. Enzimler ve proteinler: Ksantin oksidaz, dioksijenaz, hemoglobin. Birçok enzimin katalitik siklusu esnasında serbest radikaller açığa çıkar. Ksantin oksidaz serbest radikal oluşturan enzimler içinde en çok araştırılmış olanıdır 288. Normalde NAD bağımlı dehidrojenaz olarak etki eder ve herhangi bir serbest radikal üretimine sebep olmaz. Fakat in vivo olarak oluşturulan iskemi, enzimin dehidrojenaz formundan oksidaz formuna dönüşmesine ve süperoksit (O 2 ) radikalinin üretimine sebep olur 292. Aldehit oksidaz yapı itibariyle ksantin oksidaza benzer ve substratlarının çoğu aynı olup, süperoksit radikali üretir. Benzer şekilde triptofan dehidrojenaz gibi enzimler de radikal oluşumuna sebep olurlar 289,297. Mitokondriyal elektron transportu: Normalde hücrelerde en büyük serbest radikal kaynaklarından biri elektron transport zincirinden elektron sızıntısıdır. Mitokondri iç zarında yerleşmiş oksidatif fosforilasyon zinciri bileşenleri büyük oranda indirgendiği zaman mitokondriyal süperoksit radikal üretimi artar 289. Böylece NAD + bağlı substratlar, süksinat, ADP ve oksijen gibi endojen faktörler oksidatif fosforilasyonu regüle ederek mitokondriyal radikal üretimine etki ederler. Endoplazmik retikulum ve nükleer membran elektron transport sistemleri: (Sitokrom P-450, sitokrom b 5 ) Endoplazmik retikulum ve nükleer membranda ise serbest radikal üretimi membrana bağlı sitokromların oksidasyonundan kaynaklanır.

70 55 Membrana bağlı sitokrom P 450 ve b 5, doymamış yağ asitleri ve ksenobiyotikleri redükte ederken dioksijen ve diğer substratları ise okside ederler. Peroksizomlar, oksidazlar, flavoproteinler: Peroksizomlar çok önemli hücre içi H 2 O 2 kaynağıdırlar. Bu organeldeki D-amino asit oksidaz, ürat oksidaz, L-hidroksil asit oksidaz ve yağ asidi açil COA oksidaz gibi oksidazlar süperoksit üretmeden bol miktarda H 2 O 2 üretimine sebep olurlar. Ancak peroksizomlarda katalaz aktivitesi de çok yüksek olduğu için bu organelden sitozole ne kadar H 2 O 2 geçtiği bilinmemektedir 289. Aktive olmuş fagositler: Bakterisidal rollerinin sonucu olarak süperoksit üretirler 288,294, 298. Plazma membranı: Plazma membranı serbest radikal oluşum reaksiyonlarının kritik bir bölgesidir. ekstraselüler olarak üretilen serbest radikaller diğer hücre komponentleri ile reaksiyona girmeden önce plazma membranını geçmek zorundadırlar. Bu geçiş sırasında membranda toksik maddeleri üreten reaksiyonlar başlatabilirler. Membranda yer alan ve fosfolipitler, glikolipitler, gliseridler ile sterollerin bünyesinde bulunan doymamış yağ asitleriyle okside olabilen ve amino asit içeren transmembran proteinleri serbest radikal hasarından çabuk etkilenirler. Lipit peroksidasyonu veya yapısal olarak önemli proteinlerin oksidasyonunun sebep olduğu artmış membran permeabilitesi transmembran iyon gradiyentinin bozulmasına, sekretuar fonksiyonlarının kaybına ve integre sellüler metabolik proseslerin inhibisyonuna sebep olur 291. Hidrojen peroksit, membranları neredeyse su kadar kolay geçebilme özelliğine sahiptir. Saldırgan O 2 radikal anyonu membranları ve transmembranal anyon kanallarını geçerek hücreye girer. Aynı zamanda polianyonik hücre yüzeyi, çevre doku sıvısından 2 3 ph daha düşük olduğu tahmin edilen bir mikro çevre sağlayan çoğu çözünmüş H + den oluşan son derece

71 56 zıt bir konsantrasyonu çeker. Bu pratik çevre O 2 in protonla reaksiyonu sonucu perhidroksil radikalinin oluşumunu sağlar 291. H - + O 2 HO 2 HO 2, O2 den daha güçlü bir oksidandır, bu nedenle lipitlerin ve proteinlerin hidrofobik kısımlarını daha iyi parçalayabileceği ve toksik etkilerinin daha fazla olabileceği düşünülmektedir. Bu sebeple saldırgan oksijen radikallerine karşı bir bariyer oluşturan hücre yüzeyleri, diğer radikal türlerine reaktif bir forma modifiye eden ve daha permeabl bir kapı görevi görür. Serbest radikallerin fagositik hücre plazma membranında, NADPH-oksidaz aracılı üretimi, serbest radikallerin önemli bir biyolojik kaynağıdır 288. Fagosit kökenli serbest radikaller hem oluştukları hücreye, hem de yakınında bulunan hücrelere hasar verirler. Lipoksijenaz ve siklooksijenaz gibi plazma membranıyla bağlantılı enzimler ile mikrozomlar tarafından serbest radikal üretimi, bu enzimlerin predominant substratı olan araşidonik asit metabolizması ile ilişkili pek çok yeni buluş ve biyolojik açıdan önemli ürünlerin meydana gelmesinden dolayı ilginçtir. Bu ürünler prostaglandinleri, tromboksanları, lökotrienleri ve anaflaksinin slow-reakting substratını içerir (Şekil 2). Son zamanlarda araşidonat metabolizmasında yer alan bu enzimatik proseslerin otokatalitik lipit peroksidasyonuna öncülük etmesi bu konuya olan ilgiyi artırmıştır 289. Araşidonik asit metabolizması reaktif oksijen metabolitlerinin önemli bir kaynağıdır 289. Araşidonik asitin biyoaktif ürünlere dönüşümü esnasında geniş spektrumlu oksijen, karbon ve hemoprotein radikalleri oluşur ve bunlar doku hasarına

72 57 yol açar 299. Prostaglandin sentezi esnasında hidroksil radikali veya diğer radikallerin üretimi, siklooksijenazın (COX) feed-back regülasyonuna yol açar, prostaglandin biyosentezinin hız ve süresini modüle eder ve prostaglandin sentezinden sonra ikinci ulak ve sitotoksik etkilerini hızlandırır. COX, ksenobiyotikleri daha toksik türlere metabolize etme yeteneğine de sahiptir 300,301. Trombositlerde tromboksan sentezinin imidazol ve nordihidroguiaretik asit gibi radikal toplayıcılarla inhibe edilmesi, prostaglandin endoperoksitinin tromboksanlara dönüşümünün bir serbest radikal reaksiyonu sonucu olabileceği düşüncesini kuvvetlendirmektedir 287. Lipoksijenaz kaynaklı peroksitler oksidan-sensitif siklooksijenaz aktivitesini modüle edebilir 301. Bu sebeple, prostaglandin ve tromboksanların biyosentezi, biyosentetik enzimin kendisi ve diğer hücre komponentleri ile reaksiyon yeteneğine sahip hemoprotein-oksijen ve karbon merkezli serbest radikallerin oluşmasıyla sonlanır. Araşidonik Asit Siklooksijenaz (COX) 5- Lipooksijenaz Prostaglandin H OH. Porfirin Radikali Peroksitler Serbest radikal ara ürünleri 5-HPETE Prostaglandinler Tromboksan Prostasiklinler Lökotienler Şekil 3. Araşidonik asit metabolizması esnasında üretilen serbest radikaller

73 58 Serbest radikallerle prostaglandin metabolizması birbirleriyle yakından ilişkilidir. Reaktif oksijen metabolitleri fosfolipaz aktivasyonu yolu ile prostaglandin E 2, F 2, 6-keto PGF1 ve TXB 2 sentezini gerçekleştirirler. PGE 2 ve I 2 adenilat siklazı aktive ederek camp sentezini artırırlar ki, süperoksit de camp sentezini artırıcı etkiye sahiptir. Bu bilgiler reaktif oksijen türlerinin prostaglandin sentezi yolu ile camp konsantrasyonunu artırdıklarını doğrulamaktadır 284. Hayvan hücrelerinde süperoksitin bir başka kaynağı da askorbik asit, tioller (glutatyon, sistein gibi) adrenalin ve flavin koenzimleri gibi bazı bileşiklerin oto oksidasyonudur 284. Oksidatif stres yapıcı durumlar: Đskemi, travma, intoksikasyon 284. Hücrelerde serbest radikal üretimi bazı yabancı toksik maddeler tarafından da büyük oranda artırılabilir. Bu tip maddeler dört grupta toplanabilir Toksinin kendisi bir serbest radikaldir. Kirli havanın koyu rengini veren azot dioksit 302. gazını buna örnek verebiliriz. NO. 2 gazı radikalik bir madde olup aynı zaman da iyi bir lipit peroksidasyonu başlatıcısıdır. 2 - Toksin bir serbest radikale metabolize olur. Mesela toksik bir madde olan karbontetraklorür (CCl 4 ) karaciğerde sitokrom P 450 tarafından triklorometil (CCl 3 ) serbest radikaline dönüştürülür. Bu radikalin oksijenle reaksiyonu sonucu meydana gelen peroksil radikali de güçlü bir lipit peroksidasyonu başlatıcısıdır. CCl 3 +O 2 CCl 3 O 2

74 Toksinin metabolizması sonucu serbest oksijen radikali meydana gelir. Bunun tipik bir örneği paraguattır. 4 - Toksin antioksidan aktiviteyi düşürür. Mesela parasetamolün karaciğerde sitokrom P 450 tarafından metabolizması sonucu glutatyon la reaksiyona girerek ve miktarını azaltan bir ürün meydana getirir Serbest Radikallerin Etkileri Serbest radikaller hücrelerin lipit, protein, DNA, karbohidrat ve enzim gibi tüm önemli bileşenlerine etki ederler. Mitokondrideki aerobik solunumu ve kapiller permeabiliteyi bozarlar ve hücrenin potasyum kaybını ve trombosit agregasyonunu artırırlar. Proteaz, fosfolipaz, elastaz, siklooksijenaz, ksantin oksidaz, Lipoksijenaz, triptofan dioksijenaz ve galaktoz oksidaz gibi litik enzimleri aktifleştirirken alfa-1- antitripsin gibi bazı savunma sistemlerini de inaktive ederler 286. Serbest radikallerin etkileri aşağıdaki şekilde gruplandırılabilir: Membran lipitlerine etkileri (Lipit peroksidasyonu): Biyomoleküllerin tüm büyük sınıfları serbest radikaller tarafından etkilenmesine karşın, bunlar arasında en hassas olanı lipitlerdir. Lipit peroksidasyonu bir serbest radikal kaynağıdır, oksijenle karşılaşan lipitlerin peroksidasyona uğraması (oto oksidasyonu) sadece besinlerin bozulmasından (acıma) sorumlu olmayıp aynı zamanda, kanser, yangısal hastalıklar, ateroskleroz, yaşlanma vb. gibi olaylara neden olabilen doku hasarından da sorumludur. Bu yıkıcı etkiler metilenle kesintiye uğramış çift bağlar içeren doymamış yağ asitlerinden, peroksit oluşması sırasında üretilen serbest radikaller (ROO, RO, OH ) tarafından başlatılır. Membranlardaki kolesterol ve yağ asitlerinin doymamış(çift) bağları serbest radikallerle kolayca reaksiyona girerek peroksidasyon ürünleri oluştururlar. Lipit radikallerinin

75 60 hidrofobik yapıda olması yüzünden reaksiyonların çoğu membrana bağlı moleküllerde meydana gelir. Bundan da membran permeabilitesi ve mikro vizkozitesi ciddi bir şekilde etkilenir. Polidoymamış yağ asitlerinin (PUFA) oksidatif yıkımı lipit peroksidasyonu (LPO) olarak bilinir ve oldukça zararlıdır. Çünkü LPO kendi kendini devam ettiren zincir reaksiyonu şeklinde ilerler ve bu oto katalitik reaksiyonu sonucu oluşan lipit peroksit, membranının stabilizasyonunu ortadan kaldırarak, hızlı hücre ve doku bozulmalarına neden olurken lipit, alkol ve aldehitler gibi istenmeyen yan ürünler oluşur 289,303,304. Bu ürünlerin ya hücre düzeyinde metabolize edilirek veya başlangıçtaki etki alanlarından diffüze olup hücrenin diğer bölümlerine hasarı yayarak birçok hastalığa ve doku hasarına neden olular 305. Bu ürünlerden en çok bilineni malondialdehittir (MDA) 306,307. Serbest radikaller tarafından zar lipitlerine direkt saldırı dönüşümlü ve dönüşümsüz kardiyak etkilerin oluşumuna yol açar. LPO sonucunda, bazıları serbest radikal aktivitesinin göstergeleri olarak kullanılan, birçok ürün oluşur. LPO nun başlangıç aşamalarında dien konjugatlarının oluşumu ile bir moleküler düzenlenme oluşur. Đnsanlarda en sık görülen linoleik asitin 9,11 izomeridir. Daha sonraki yayılma evresinde daha ileri LPO ve fragmentasyon(parçalanma) oluşur. Ortaya çıkan son ürünlerden biri yukarıda bahsedildiği gibi MDA dır 308. Olayın tamamı aşağıdaki şekilde özetlenebilir Başlama safhası LOOH + metal (n)+ LOO + metal (n-1)+ + H + X + LH L + XH

76 61 2. Đlerleme safhası L + O 2 LOO LOO + RH LOOH + R, vb 3. Sonlanma safhası LOO + LOO LOOL + O 2 LOO + L LOOL L + L LL Olayı başlatan moleküler öncüller genel olarak hidroperoksit ürün LOOH olduğundan LPO, potansiyel yıkıcı etkileri olan bir zincir tepkimesidir. Gerek insanlar ve gerek doğada LPO yu denetlemek ve azaltmak için antioksidanlar kullanılır. Propil gallat, butillenmiş hidroksianizol (BHA) ve butillenmiş hidroksitoluen (BHT) antioksidan olarak kullanılan gıda katkılarıdır. Doğada görülen antioksidanlar yağda çözünen ß-karoten ile E vitaminini (tokoferol), ve suda çözünen C vitaminini kapsar 286,306. Proteinlere etkileri: Serbest radikallerin doymamış ve sülfür içeren moleküllerle olan reaktivitesi sebebiyle, triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metiyonin ve sistein gibi amino asit içeren proteinler bu serbest radikallerden kolayca etkilenirler. Bu etkilenmenin sonucunda da sülfür radikalleri ve karbon merkezli radikaller oluşur 289. Bu istenmeyen reaksiyonlar sonucu immünoglobulin G ve albümin gibi çok sayıda disülfid bağı bulunduran proteinlerin üç boyutlu yapıları bozulur ve normal fonksiyonlarını

77 62 yerine getiremezler. Nitekim serum proteinlerinde, kataraktlı lens proteinlerinde ve enflamatuar eklem hastalığı olan kişilerin sinoviyal sıvılarındaki IgG lerinde serbest radikal hasarı tespit edilmiştir 284. Sitoplazmik ve membran proteinleri, ozon ve protoporfirin IX gibi okside edici ajanlara maruz kaldıktan sonra çapraz bağlanarak dimerleşir veya daha büyük agregatlara dönüşür. Prolin ve lizin; süperoksit radikali, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali üreten reaksiyonlara maruz kaldıklarında nonenzimatik hidroksilasyona uğrayabilmektedirler 284. Hem proteinleri de serbest radikallerden önemli oranda zarar gören proteinlerdendir. Örneğin; oksi hemoglobinin O 2 veya H2 O 2 ile reaksiyonu methemoglobin oluşumuna sebep olmaktadır 288,289. O 2 + HbFe +2...O 2 2H + Hb-Fe +3 + H 2 O 2 + O 2 2H + H 2 O 2 + 2Hb-Fe +2 -O 2 2Hb-Fe H 2 O + O 2 Nükleik asit ve DNA ya etkileri: Đyonize edici radyasyonla oluşan serbest radikaller DNA yı etkileyerek hücrede mutasyona ve ölüme yol açarlar. Sitotoksite büyük oranda, nükleik asit baz modifikasyonundan doğan kromozom değişikliklerine veya DNA daki diğer bozukluklara bağlıdır 284,309. OH. radikalinin hem prokaryotik hem de ökaryotik hücrelerde, radyasyonun sebep olduğu hücre ölümünden büyük oranda (% 80 oranında) sorumlu bir ajan olduğu düşünülmektedir 289. Aktivite olmuş nötrofillerden kaynaklanan H 2 O 2 membranlardan kolayca geçtikten sonra hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücre disfonksiyonuna ve hatta ölümüne yol açabilir. Bu yüzden DNA serbest radikallerden kolay zarar görülebilen açık bir hedeftir. Süperoksite maruz kalan DNA molekülleri hayvanlara enjekte edildiğinde daha fazla antijenik özellik gösterirler ki bu

78 63 oldukça önemli bir etkidir. Çünkü otoimmün bir hastalık olan sistemik lupus eritematosuz (SLE) ve romatoid artritte (RA) dolaşımında anti-dna antikorları bulunur. Süperoksit ve hidrojen peroksitin enzimatik toplayıcıları, (. OH) prekürsörlerinin konsantrasyonunu azaltarak DNA yı korur 284. Karbohidratlara etkileri: Serbest radikallerin karbohidratlar üzerine de önemli etkileri vardır. Monosakkaritlerin oto oksidasyonu sonucu hidrojen peroksit, peroksitler ve okzalaldehitler meydana gelir. Bu maddeler diyabet ve sigara içimi ile ilişkili kronik hastalıkların patolojik proseslerinde de önemli rol oynarlar 284. Okzalaldehitler DNA, RNA ve proteinlere bağlanabilme ve aralarında çapraz bağlar oluşturabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etkiye sahiptirler. Böylece kanser ve yaşlanma olaylarında da önemli rol oynarlar 284. Serbest radikaller enflamatuar cevap ve sekonder doku hasarının modülasyonunda da önemli rol oynar. Đltihap hücreleri ile ilişkili doku hasarında risk altında bulunan kollagen ve hiyaluronik asit gibi ekstraselüler doku komponentlerinin, enflamatuar osteoatiritle etkilendikleri görülmüştür 289. Kıkırdak dokunun esas öğesi olan kollagen O 2 ile hasarlanır ve jelasyonu önlenir 310. SOD kollagen jelasyonunu süperoksit inhibisyonundan korur. Eklem sıvısının vizkositesinin devamı için gerekli olan hiyaluronik asit O 2 ile depolimerize edilebilir 310,311. O 2, H2 O 2 ve OH. toplayıcıları süperoksit oluşturan sistemden hyaluronik asitin depolimerizasyonunu önler. ekstraselüler sıvının çok düşük seviyede SOD ve CAT aktivitesine sahip olması nedeniyle redükte oksijen türlerinin küçük miktarları bu bölümlerde yaygın hasara sebep olabilirler 289. Revers, pasif Arthus reaksiyonunun, carragenan le indüklenen bacak ödeminin inhibisyonu aktive olmuş lökositlere bağlı akciğer kapiller endotelyal hücre hasarı ve

79 64 pulmoner ödemin azalması süperoksit dismutazın anti-enflamatuar etkilerinin örnekleridir 195, Antioksidan Savunma Sistemleri Reaktif oksijen türlerinin oluşumu ve bunların meydana getirdiği hasarı önlemek için vücutta birçok savunma mekanizmaları gelişmiştir. Bunlar antioksidan savunma sistemleri veya kısaca antioksidanlar olarak bilinir. Antioksidanlar, (doğal)endojen ve ekzojen kaynaklı olabilmektedirler. Antioksidanlar aynı zamanda serbest radikal oluşumunu engelleyen ve mevcut radikalleri etkisiz hale getirenler şeklinde de ikiye ayrılırlar. Ayrıca enzim ve enzim olmayanlar şeklinde de sınıflandırılan antioksidanlar hücrelerin hem sıvı hem de membran kısmında bulunurlar Doğal (Endojen) Antioksidanlar Primer Antioksidanlar (Enzimler) Süperoksit dismutaz (SOD): Süperoksitin, hidrojen peroksit ve moleküler oksijene dönüşümünü katalizleyen bu enzim, beyinde yaygın bir şekilde bulunur ve aktivitesi yaş artışıyla beraber artar. Đnsanlarda iki tipi vardır. Bunlar sitozolde bulunan dimerik Cu ve Zn ihtiva eden CuZnSOD ile mitokondri de bulunan tetramerik Mn ihtiva eden MnSOD 287,306 izomerlerdir. SOD nin Fe ihtiva eden izomeri (FeSOD) ise sadece mikroorganizmalarda ve bazı bitkilerde bulunur. Genel olarak hücrede en bol bulunan izomer sitozolik Cu, Zn-SOD dir. Cu, Zn-SOD ilk defa, 1969'da, Mc Cord ve Fridovic tarafından hayvan, bitki dokuları ve mayadan saflaştırılmış ve tanımlanmıştır. Molekül kütlesi Daltondur. Đki alt ünitesi vardır ve bunların her birinde bir Cu ve bir Zn atomu bulunmaktadır. Ayrıca her alt birimde bir zincir içi disülfür köprüsü, bir sülfidril

80 65 grubu ve bir de asetillenmiş terminal amino grubu bulunmaktadır. Cu/Zn-SOD enziminin ayrı formları bulunmaktadır. Sitoplazmada bulunanın dışında bazı hayvanların plazmasında Dalton molekül kütleli Cu/Zn-SOD bulunduğu tespit edilmiştir 64. Mn-SOD mitokondrial bir enzimdir ve prokaryatların sitozolünden elde edilebilmektedir. Đlk kez 1970 yılında Keele ve arkadaşları tarafından izole edilmiştir. Buradaki mangan +3 değerliklidir ve iki alt birimden oluşmuştur. Her alt birimde bir Mn atomu vardır ve Dalton molekül kütlesine sahiptir. Mitokondrial SOD hemen hemen total SOD'nin % 60 'ını içerir. Zira süperoksit sitozole göre mitokondride hemen hemen iki kat daha fazla oluşur. Tüm SOD'ler fizyolojik şartlarda süperoksite karşı etkin bir koruma sağlarlar 285. Her iki enzimin katalizlediği reaksiyon aynıdır. Enzimin fizyolojik fonksiyonu lipid peroksidasyonunu inhibe ederek oksijeni metabolize eden hücreleri süperoksit serbest radikallerinin zararlı etkilerine karşı korumaktır 289,309. Normalde metabolizma sırasında hücreler tarafından fazlaca süperoksit üretilmesine rağmen bu enzim sayesinde intrasellüler düzeyleri düşük tutulur. SOD fagosite edilmiş bakterilerin intrasellüler öldürülmesinde de rol oynar. Bu yüzden SOD granülosit fonksiyonu için çok önemlidir. Lenfositlerde de granülositlerden daha fazla oranda SOD bulunur Katalaz (CAT): Doğada yaygın bir şekilde mevcut olduğu ilk defa 1901'de O. Leew tarafından bulunmuştur. Yine ilk defa 1937'de Summer ve Dounce tarafından karaciğerden kristal formda izole edilmiştir. Molekül kütlesi Daltondur. Dört alt üniteden oluşmuştur. Peroksizomlarda, lizozomlarda ve mitokondride bulunur. Kandaki katalaz aktivitesi büyük ölçüde eritrositlerden kaynaklanmaktadır. Bu nedenle insan eritrositleri katalaz yönünden çok zengindir. GPx esas olarak mitokondri ve sitozolde bulunurken, katalaz peroksizomlarda bulunur. Eritrositlerde mitokondri olmadığı halde

81 66 yüksek aktivitede CAT ve GPx vardır. Katalaz 4 tane hem grubu bulunan bir hemoproteindir. Peroksizomlarda lokalizedir 309. Büyük moleküllü lipit hidroperoksidlere etki etmezken, hidrojen peroksidi oksijen ve suya parçalar H 2 O 2 CAT 2H 2 O + O Glutatyon peroksidaz (GPx): GPx hidroperoksidlerin indirgenmesinden sorumlu, tetramerik 4 selenyum atomu ihtiva eden sitozolik bir enzimdir. Memeli eritrositlerinden ilk defa Mills ve arkadaşları tarafından karakterize edilmişlerdir. Daha sonra yapılan araştırmalarla enzim hakkındaki bilgiler artırılmıştır. Dominant olarak sitozolik bir enzimdir ve mitokondride düşük düzeylerde bulunur. GPx aktivitesindeki azalma, hidrojen peroksitin artmasına ve bu da hücre hasarına yol açar. GPx'in beyin düzeyleri düşüktür. Prostetik grup olarak selenyum (Se) içeren metalloenzimdir. Beyinde, beyin selenyumunun çok az bir kısmını içerdiğinden dolayı diyetle elde edilebilirliğinden çok fazla etkilenmez. GPx sitozolik hasara karşı etkin koruyucu bir mekanizma sağlar. Bu enzim, H 2 O 2 'i ve lipid peroksitlerini GSH'u kullanarak redüksiyon yoluyla uzaklaştırır. GPx aşağıdaki reaksiyonları katalize eder 311. H 2 O 2 + 2GSH ROOH + 2GSH GPx GPx GSSG + 2H 2 O GSSG + ROH + H 2 O Fosfolipid hidroperoksit glutatyon peroksidaz da (PLGPx) monomerik, selenyum atomu ihtiva eden sitozolik bir enzimdir. Membran fosfolipid hidroperoksitlerini alkollere indirger 284,309.

82 67 Membrana bağlı en önemli antioksidan olan vitamin E yetersiz olduğu zaman, PLGPx membranı peroksidasyona karşı korur. Hidroperoksitlerin redükte olması ile meydana gelen GSSG, glutatyon redüktazın katalizlediği aşağıdaki reaksiyon ile tekrar GSH a dönüştürülür 314. GSSG + NADPH + H + Glutatyon Redüktaz 2 GSH + NADP Glutatyon redüktaz (GR): Glutatyon redüktaz daltonluk alt birimlere sahip bir dimerdir. Görevi yükseltgenmiş glutatyonu (GSSG) indirgenmiş (GSH) hale çevirmektir. Bu indirgenme işlemi sırasında NADPH dan gelen elektronlar okside glutatyonun disülfid bağına direkt olarak transfer edilemezler. Sıklıkla önce NADPH dan sıkıca bağlı bulunan FAD ye transfer edilirler. Daha sonraki alt birimlerdeki 2 sistein arasında bulunan disülfid köprüsüne transfer edilmek suretiyle okside glutatyona aktarılmış olurlar. Her bir subunit 3 tane yapısal alan içerir, bunlar: FAD bağlayıcı olan, NADPH bağlayıcı olan ve ara yüz alanıdır. FAD alanı ve NADP + alanı birbirine benzer ve diğer dehidrojenazlardaki nükleotid bağlayıcı alanlara benzerler. FAD ve NADP + nin izoalloksozin ve nikotinamid halkaları birbirine geçecek şekilde geniş ölçüde aralarında bağlanırlar. Oksidize glutatyon için bağlayıcı alanın bir alt biriminin FAD alanı ile diğer alt birimin ara yüz alanından meydana geldiği belirtmek gerekir 315. GR GSSG + NADPH + H + 2GSH + NADP + Alyuvarlardaki pentoz fosfat yolu ise, GR nin GSSG yi GSH ye çevrimi için gereken NADPH ı sağlar 304.

83 Glutatyon S-Transferaz (GST): GST lar başta araşidonik ve lineolat hidroperoksitleri olmak üzere lipid peroksitlerine karşı Se-bağımsız GSH peroksidaz aktivitesi göstererek bir defans mekanizması oluştururlar 309. ROOH + 2GSH GST GSSG + ROH + H 2 O GST ler, sisteinin sülfür atomu üzerinden çeşitli elektrofillere glutatyonu aktaran proteinlerdir. GST, bunun yanı sıra hem, bilirubin, polisiklik aromatik hidrokarbonlar ve deksametazon gibi hidrofobik bileşiklere de yüksek bir afiniteyle bağlanabilmektedir. E.coli den insana kadar çok çeşitli türlerden GST saflaştırılabilirken ençok da sıçan karaciğerinden saflaştırılmıştır. GST ler en az 7 alt üniteden oluşan homodimer veya heterodimerlerdirler. Spesifik GST alt ünitelerinin fenobarbitol, 3-metilşolantren, transstilben oksit gibi çeşitli ksenobiyotikler tarafından indüklenmesinden ve dokuya spesifik bir tarzda ekspresse olmasından beri, GST gen ailesi gen ekspresyonunun dokuya özel düzenlenmesi ve indüksiyonunun araştırılmasında yararlı bir model sistemi olmuştur 316. GST ler başta araşidonik ve lineolat hidroperoksitleri olmak üzere LPO lara karşı Se-bağımsız GSH peroksidaz aktivitesi koruyucu mekanizma oluştururlar 309. GST ler antioksidan aktivitelerine ilave olarak çok önemli biyokimyasal fonksiyonlara da sahiptirler. Katalitik ve katalitik olmayan çok sayıda fonksiyona sahip GST lerin tüm canlı hücrelerde bulunması hayati önemlerinin bir göstergesidir. Hem detoksifikasyon yaparlar, hem de hücre içi bağlayıcı ve taşıyıcı rolleri vardır. Katalitik olarak, yabancı maddeleri glutatyonda ki sisteine ait -SH grubu ile bağlayarak onların elektrofilik bölgelerini nötralize eder ve ürünün daha fazla suda çözünür hale gelmesini sağlarlar. Oluşan bu GSH konjugatları böylece organizmadan atılabilir ve daha ileri bir

84 69 ürüne metabolize olabilirler. GSH den glutamat ve glisinin koparılmasından sonra sisteinin serbest amino grubu asetillenerek merkaptürik asitlere dönüştürülür 309. Lökotrien C 4 ün sentezi GST tarafından katalizlenmekte olup, GST ler prostaglandin sentezinde PG izomeraz etkisine de sahiptirler Sekonder Antioksidanlar (Enzim Olmayanlar) Lipit fazda bulunanlar antioksidanlar α, β, γ (-) tokoferoller (E vitamini) ve β- karoten dir. Sıvı fazda (hücre sitozolü veya kan plazmasında) bulunanlar ise askorbik asit, miyoglobulin, melatonin, hemoglobin, üre, ferritin, sistein, metionin, seruloplazmin, albümin, laktoferrin, bilirubin ve glutatyondur Glutatyon (GSH): GSH, birçok hücrede bulunur ve bir tripeptiddir: γ-lglutamil-l-sisteinilglisin (şekil 6). GSH L-glutamat, L-sistein ve glisinden iki basamakta sentezlenir. Oluşan her peptid bağı için bir molekül ATP harcanır O O H N O SH O N H O + NH 3 O - Şekil 4. GSH nin molekül yapısı L-Glutamat + L-Sistein + ATP γ-glutamil sistein + Glisin +ATP γ-glutamilsistein sentetaz Glutatyon sentetaz γ-glutamil sistein + ADP +P i GSH + ADP + P i

85 70 GSH, hemoglobin ve diğer eritrosit proteinlerinde bulunan sistein rezidülerini indirgenmiş halde tutarak sülfhidril tamponu görevini görür. Eritrosit hücrelerinde GSH/GSSG oranı yaklaşık 500 dür. Đndirgenmiş glutatyon yani GSH, aktif bölgesinde selenyum iz elementini içeren bir enzim olan GPx enzimi katalizörlüğünde H 2 O 2 ve organik peroksitlerle reaksiyona girerek antioksidan etki sergiler ve H 2 O 2 yi alyuvarlardan uzaklaştırır. H 2 O 2 birikmesi hemoglobinin methemoglobine oksidasyon hızını artırarak alyuvarların yaşama süresini azaltabildiğinden bu tepkime çok önemlidir. Ayrıca alyuvarlarda hemoglobinin methemoglobine otooksidasyonu ile süperoksit oluşurken diğer dokularda ise bu sitokrom P 450 redüktaz ve ksantin oksidaz gibi enzimlerle oluşur 304,317,318. GSH, hidrojen peroksidi veya organik oksitleri kimyasal olarak detoksifiye edebilir. GSH yi peptid bağından dolayı düşük enerjili bileşikler arasında kabul edebiliriz 321. GSH, hücre proteinlerini indirgemiş şekilde tutan disülfit-sülfidril değişimi tepkimelerinde etki gösterir. Belirli oksidaz tepkimeleriyle oluşan hidrojen peroksidi uzaklaştıran enzim GPx e substratlık yaparak proteinlerin sülfidril gruplarını da korur. GSH yokluğunda hidrojen peroksit birikir. GSSG, GR tarafından sürekli GSH ye indirgenerek GSH miktarı düzenlenir 319. Moleküler oksijenden türeyen oksidatif radikaller iki mekanizmayla uzaklaştırılır. Birincisi, toksik radikallerin enzimatik inaktivasyonudur. Örneğin GPx ve CAT, reaktif oksijen ara ürünlerini suya indirger. Đkinci mekanizma ise oksijen radikallerini kimyasal olarak inaktive eden vitamin C, E ve B-karoten gibi diyetle alınan antioksidanlarla ilgilidir 320. Birçok enzimin şayet sistein tiyol grubu ( SH) oksitlenecek olursa inaktive ya da inhibe olur. GSH, Gama-glutamilsisteinilglisin, duyarlı ve esansiyel SH gruplarını

86 71 içeren enzimlerin doğal aktivatörüdür. Glutatyon hücrede bir ko-enzimden ziyade var olan amino asit öncüllerinden kolayca sentezlenen doğal bir antioksidandır. Fenilalanin ve tirozinin oksidatif yıkımında görev alan maleilasetoasetat izomeraz da dahil olmak üzere glutatyon çok az sayıda enzim için spesifik bir koenzimdir. Glutatyonun hücre içi derişimi kontrol edilerek birçok enzimin aktivitesi düzenlenebilir Diğer Sekonder Antioksidanlar: Đnsan vücudunda oldukça az miktarlarda bulunmasına karşın vitaminlerin vücuttaki etkinlikleri oldukça fazladır. Bunların bir bölümü, besinlerle aldığımız karbonhidrat, yağ ve proteinden enerji ve hücrelerin oluşması ile ilgili biyokimyasal olayların düzenlenmesine yardımcı olurlar. A, E ve C vücut hücrelerinin hasarını önleyerek normal işlevlerini sürdürmeleri ve bazı zararlı maddelerin etkilerinin azaltılmasında (Antioksidan etki) yardımcı olurlar. Antioksidanlar, hücremizi, serbest radikalleri nötürleştirerek korurlar. Bunlar uyum içerisinde çalışan bir takım gibi radikalik saldırılara karşı koyarlar. ß-Karotenin, askorbik asitin ve tokoferolün antioksidan etkileri yıllardan beri bilinmektedir. ß- Karoten organizmada A vitaminin parsiyal oksijen öncülü olmasının yanı sıra bir antioksidan olarak görev yapar. Bununla beraber, 15 torr da 150 torr dan daha iyi antioksidan olduğu, 760 torr da ise prooksidan olarak davrandığı bildirilmiştir. Hücrelerin dışında ß-Karoten nöbet tutarken; hücre duvarından, içeri girmek isteyen saldırganlara karşı savunmayı ise eser elementlerden selenyumun da yardımıyla E vitaminini üstlenmiştir. Suda çözünen vitaminlerden birisi olan askorbik asit yapı itibariyle en basit vitaminlerden biridir. Bir şeker asidinin laktonundan ibarettir. Yüksek yapılı hayvanların pek çoğu ve bitkiler kolayca askorbik asidi glukozdan sentezleyebilmektedirler. Hücre içerisindeki C vitamini serbest radikallere son darbeyi vurmakta ve bu şekilde radikallerin tesirleri ortadan kaldırılmaya çalışmaktadır. E

87 72 vitamini yağda çözünen bir vitamin olup temel görevi lipitleri oksidatif hasardan korumaktır. Đnce barsaklardan kolayca emilir ve vücudun tüm dokularına taşınarak hücre membranları etrafında depolanır. Böylece hücre membranında koruyucu bir tabaka oluşturmuş olur Ekzojen Antioksidanlar 1. Ksantin oksidaz inhibitörleri: Tungsten, allopürinol, oksipürnol, folik asit, pterin aldehit 2. Soya fasulyesi inhibitörleri: Ksantin dehidrojenazın proteolitik etki sonucu ksantin oksidaza dönüşümünü inhibe ederler. 3. NADPH oksidaz inhibitörleri: Adenozin lokal anestezikler, kalsiyum kanal blokerleri, non-steroid anti-enflamatuar ilaçlar, cetiedil, difenilin iyodoniyum 4. Recombinant süperoksit dismutaz 5. Troloks-c : E vitamini analoğu 6. Endojen antioksidan aktiviteyi artıran maddeler: Glutatyon peroksidaz aktivitesini artırırlar. Bunlar; Ebselen ve Asetil sisteindir. 7. Diğer nonenzimatik serbest radikal toplayıcıları: Mannitol ve albümin 8. Demir redoks döngüsünün inhibitörleri: Desferroksamin ve seruloplazmin 9. Nötrofil adezyon inhibitörleri 10. Sitokinler: Tümör Nekroz Faktör (TNF) ve Interlökin Barbitüratlar 12. Demir şelatörleri

88 Gıda Antioksidanları - Butillenmiş hidroksitoluen (BHT) - Butillenmiş hidroksianisol (BHA) - Sodyum benzoat - Etoksiguin - Propilgalat - Fe - superoksid dismutaz Antioksidan Etki Tipleri: Antioksidanlar dört ayrı şekilde etki ederler Toplayıcı etki (scavenging etki) : Serbest oksijen radikallerini etkileyerek onları tutma veya reaktif olamayan yeni bir moleküle çevirme işlemine toplayıcı etki denir. 2. Bastırıcı etki (quencher etki) : Serbest oksijen radikalleri ile etkileşip onlara bir hidrojen atarak aktivitelerini azaltan veya inaktif şekle dönüştüren etkiye bastırıcı etki denir. 3. Onarıcı etki (repair etki) : Genellikle DNA daki hasarların tamir edilmesinde bu etki devamlı geçerlidir. 4. Zincir kırıcı etki (chain breaking etki ) : Serbest oksijen radikallerini kendilerine bağlayarak zincirlerini kırıp fonksiyonlarını engelleyici etkiye zincir kırıcı etki denir. Serbest radikaller ve bunları etkisizleştirmek için kullanılan veya üretilen antioksidanlar hakkında mevcut bilgiler arttıkça bunlara olan ilgi de bilim adamları tarafından her geçen gün artmaktadır. Bu bağlamda hemen her sahada yapılan çalışmaların antioksidan özellikler ile birlikte değerlendirme çalışmaları da ön plana çıkmaktadır.

89 74 3. MATERYAL VE METOD 3.1. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar Deneylerde kullanılan bütün kimyasal malzemeler Sigma Chemicals Company (Germany) den temin edilmiştir Deneylerde Kullanılan Cihazlar Soğutmalı santrifüj UV-Visible Spektrofotometre : Hettich Universal 32 R : Thermo Spectronic-HEλIOS β ph metre : Schott CG 842 Hassas terazi : Scaltec SPB 31 Derin dondurucu : Sanyo MDF Magnetik karıştırıcılar : Boeco MSH 300 Otomatik pipetler Buzdolabı : Eppendorf : Profilo Saf su cihazı : GFL 2012 Çalkalayıcılı su banyosu Homojenizatör Döner Buharlaştırıcı (Evaporatör) Kompresör UV Lambası 254nm - 366nm : Memmert : Ika-Werke : BSI : Milipore : Model Mineralight.

90 Deneylerde Kullanılan Çözeltiler ve Hazırlanışları 1. CAT homojenat tamponu (50 mm ph 7.8, %1 Triton x-100 içeren Fosfat Tamponu): 1.7 g KH 2 PO 4 ve 2.5 ml Triton x-100 alınarak 200 ml saf suda çözüldü. ph 7.8 e ayarlanarak son hacim saf su ile 250 ml ye tamamlandı. 2. CAT ölçüm karışımı (40 mm ph 7.0 de H 2 O 2 içeren 50 mm Fosfat Tamponu): 1020 µl H 2 O 2 ve 1.7 g KH 2 PO ml saf suda çözüldü ve ph 7.0 ye ayarlandıktan sonra son hacim 250 ml ye tamamlandı. 3. GPx homojenat tamponu (50 mm ph 7.8, 30 mm KCI içeren Fosfat Tamponu): 0,6804 g KH 2 PO 4 ve g KCI alınarak 1-2 damla 5 M NaOH ile 90 ml saf suda çözüldü ve ph 7.8 ye ayarlandıktan sonra son hacim saf su ile 100 ml ye tamamlandı. 4. GPx ölçüm karışımı : A - 50 mm Fosfat tamponu: 0,6804 g KH 2 PO 4 alınarak hacmi saf su ile 100 ml ye tamamlandı. B - 1 mm EDTA: g EDTA alındı ve hacmi 10 ml ye tamamlandı. (1 damla 5 M NaOH ile çözünür) C 1 mm GSH: g GSH alınarak 10 ml saf suda çözüldü. D 0,2 mm B-NADPH: g alınarak 10 ml saf suda çözüldü. E 1 mm NaN 3 : g tartıldı ve 100 ml saf suda çözüldü. F 1 EU/ml Glutatyon Redüktaz: 5.2 µl Glutatyon Redüktaz alındı ve 10 ml saf suda çözüldü. 5. GPx enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti ( 0.25 mm H 2 O 2 ): µl H 2 O 2 alınarak ve hacmi 1000 ml ye distile su ile tamamlandı.

91 76 6. SOD homojenat tamponu (50 mm ph 7.8, 10 mm EDTA içeren Fosfat Tamponu): 1.7 g KH 2 PO 4 ve 0.73 g EDTA alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve ph 7.8 e ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 7. SOD ölçüm karışımı: A 0.3 mm Ksantine: g ksantine alınarak hacmi distile su ile 40 ml ye tamamlandı. B 0.6 mm EDTA: g EDTA alındı ve hacmi distile su 20 ml ye tamamlandı.(2 damla 5 M NaOH ile çözünür) C 150 µm NBT (Nitro blue tetrazolium): g NBT alınarak 20 ml distile suda çözüldü. D 0.4 M Na 2 CO 3 : 0,5088 g alınarak 12 ml distile suda çözüldü. E 1.2 g / L BSA (Bovine Serum Albumine): g tartıldı ve 6 ml distile suda çözüldü. 8. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti (167 U/L Xanthine oksidaz): Orijinal ambalajından (1 ml sinde 32 mg protein ve 0.3 U enzim ihtiva eden enzim) µl alındı ve üzerine 2 ml soğuk 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 çözeltisi eklendi. 9. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti ( 2 M (NH 4 ) 2 SO 4 ): g (NH 4 ) 2 SO 4 alındı ve 3 ml distile suda çözüldü. (bu çözelti her seferinde taze olarak hazırlandı ve soğuk olarak kullanıldı). 10. SOD enziminin aktivitesini ölçmek için gereken çözelti (0.8 mm CuCl 2 ): g CuCl 2 alındı ve 100 ml distile suda çözüldü. 11. GSH Homojenat Tamponu ( 50 mm ph 7.4, Tris - HCI Tamponu ): g Tris-HCI alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve ph 7.4 e ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml ye tamamlandı.

92 GSH ölçüm tamponu (200 mm ph 8.2, 0.2 mm EDTA içeren Tris-HCI Tamponu): 6.05 g Tris-HCI ve g EDTA alınarak 200 ml saf suda çözüldü ve ph 8.2 ye ayarlandıktan sonra son hacim distile su ile 250 ml ye tamamlandı. 13. GSH miktarını ölçmek için gereken çözelti ( 10 mm DTNB ): g DTNB alındı ve 10 ml ye metanol ile tamamlandı. 14. LPO homojenatı tamponu ( % 10 KCI ): 10 g KCI alınarak 100 ml saf suda çözüldü. 15. LPO ölçüm karışımı: A - % 8 Sodyum lauril sülfat (SLS): 0.8 gr SLS alınıp distile su ile 10 ml de çözüldü. B - % 0.08 Tiyobarbütirik (TBA): 0.48 gr TBA alınarak 1-2 damla 1 M NaOH ilavesi ile hacmi 60 ml ye tamamlandı. C % 20 Asetik asit: 13 ml glasiyel asetik asit alındı üzerine 65 ml distile su eklendi Deney Bitkileri Bu araştırmada çalışma materyali olarak bölgemizde yeterli düzeyde elde edebileceğimiz bir liken türü olan Peltigera rufescens (Weis) Humb. tercih edildi. Liken örnekleri, Erzurum Oltu Đnci köyü Masirik çevresinden enlem, boylamda 1800 m yükseklikte 2002 tarihinde Dr. Ali ASLAN tarafından toplandı ve uluslar arası teşhis yöntemleri kullanılarak tür teşhisi yapıldı 22. Türün herbaryum örneği Atatürk Üniversitesi, Kazım Karabekir Eğitim Fakültesi Herbaryumu nda muhafaza edilmektedir.

93 Bitki Ekstresinin Hazırlanması Liken örnekleri toplandıktan sonra yabancı maddelerden temizlendi ve oda sıcaklığında, gölgede kurutuldu. Kuru örnekler bir havanda sıvı azot ile öğütülerek toz haline getirildi. 100 g öğütülmüş liken örneği çalkalayıcılı bir su banyosunda iki gün süreyle devam ettirilerek metanol ile ekstrakte edildi ( 50 C, 250 ml x 4). Metanol döner buharlaştırıcıda düşük basınç ve düşük sıcaklıkta uzaklaştırıldı. Metanolun uzaklaştırılması ile elde edilen metanol ekstresi suda çözüldü ve su 5 µm-hg basınç altında liyofilize edilerek uzaklaştırıldı ve (% 1.77 verimle) 1.77 g liyofilizat elde edildi. Elde edilen liyofilizat deneyler yapılıncaya kadar -20 o C ta muhafaza edildi. Elde edilen ekstre PRME olarak isimlendirildi Deney Hayvanları Tez çalışmamızda g ağırlıktaki Sprague-Dawley erkek ratlar kullanıldı. Akut enflamasyon deneyleri ve biyokimyasal analizler için toplam 48 adet, kronik enflamasyon deneyleri için ise toplam 24 adet olmak üzere toplam 72 rat kullanılmıştır. Deney hayvanları (Şekil 7), Atatürk Üniversitesi, Tıbbi Deneysel Uygulama ve Araştırma Merkezi Laboratuvarlarından temin edildi. Tez kapsamındaki farmakolojik analizler ve deneyler Tıp Fakültesi, Farmakoloji A.B.D. laboratuvarlarında yapıldı. Hayvanlar deneye alınmadan önce gruplara ayrıldı ve standart şartlar altında muhafaza edildi 322.

94 79 Şekil 5. Araştırmada kullanılan ratları gösteren fotoğraf Cotton pelletler kullanılarak kronik enflamasyon oluşturulması Deneylerin bu serisinde PRME nin 200 mg/kg lık dozunun ve pozitif kontroller (diclofenac ve indometazin) in 25 mg/kg lık dozlarının enflamasyonun proliferasyon fazına etkileri araştırıldı 56. Sıçanların bir grubuna 200 mg/kg lık dozda PRME, diğer iki grubuna da 25 mg/kg lık dozda diklofenak sodyum ve indometazin peroral yoldan sonda ile verildi. Kontrol grubuna ise aynı hacimde çözücü olarak distile su verildi. Đlaçlar verildikten 30 dakika sonra sıçanlar 25 mg/kg ketamin ile anestezi edildi ve steril şartlar altında önceden hazırlanan 7 mg ±1 mg ağırlığında pamuk bilyeler (cotton pellet) interskapuler bölgede cilt altına yerleştirildi. Đlaçlar yedi gün boyunca günde 1 kez olmak üzere aynı yoldan uygulandı. 8. gün sıçanlar yüksek doz tiopentalla (50 mg/kg)