Scytalidium thermophilum un Çift Aktiviteli Özgün Katalaz-Fenol Oksidaz Enziminin Üretimi, Yapısının Belirlenmesi ve Mutasyonu

Transkript

1 Scytalidium thermophilum un Çift Aktiviteli Özgün Katalaz-Fenol Oksidaz Enziminin Üretimi, Yapısının Belirlenmesi ve Mutasyonu Y. YÜZÜGÜLLÜ, Z.B. ÖGEL, M.J. MCPHERSON, C. TRINH, A.R. PEARSON, S.E. PHILLIPS, M.A. SMITH, U. BAKıR, D. S.KOCABAŞ

2 Sorular Neden katalaz? Kaç çeşit katalaz vardır? Monofonksiyonel katalazların özellikleri nelerdir? Kaç çeşit katalaz kristal yapısı mevcut? Katalazların aktif bölgesi hakkında neler söylenebilir? Katalazların endüstrideki kullanım alanları nelerdir? S. thermophilum katalaz-fenol oksidazı neden önemli? Enzimin fonksiyonel ve yapısal analizinde nasıl bir yöntem izlendi? Rekombinant suşlar nasıl elde edildi? Neden mutasyonlar yapıldı? Elde edilen değişik katalaz-fenol oksidaz varyantlar arasında biyokimyasal açıdan ne gibi değişiklikler kaydedildi?

3 Neden Katalaz? Popüler Aktivitesi kolay ölçülebilir Substratı (H 2 O 2 ) ucuz, rahat bulunabilir Reaksiyon : 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 (1) Kaynaklar: 1) Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: (2004) 2) Swatala J and Loewen PC. ABB, Archives of Biochemistry and Biophysics. 401: (2002)

4 Sınıflandırma Monofonksiyonel hem grubu içeren katalazlar Katalaz peroksidazlar Mn içeren katalazlar Çok yönlü katalazlar Kaynaklar: 1) Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: (2004) 2) Nicholls P, Fita I and Loewen PC. Advances in organic chemistry. 51 (2001) 3) Swatala J and Loewen PC. ABB, Archives of Biochemistry and Biophysics. 401: (2002)

5 Monofonksiyonel Katalazlar (E.C ) b yada d tipi hem grubu Tetramer Soret bant (406 nm) Büyük alt birimli (75-84 kda) ve küçük alt birimli (55-69 kda) katalazlar Büyük alt birimli katalazlar, yüksek sıcaklığa ve proteolize karşı daha dayanıklılar Kaynaklar: 1) Chelikani P, Fita I and Loewen PC. CMLS, Cell. Mol. Life Sci. 61: (2004) 2) Loewen PC.Cold Spring Harbor Laboratory Pres: (1997) 3) Nicholls P, Fita I and Loewen PC. Advances in organic chemistry. 51 (2001)

6 Monofonksiyonel Katalazlar (E.C ) 11 kristal yapısı mevcut

7 Aktif Bölge Hem grubu (20Å) Korunmuş üç amino asit : Proksimal Tirozin Distal Histidin ve Asparajin Serin-Histidin hydrogen bağı birçok katalazda görülmekte E. coli HPII Katalazı P. mirabilis Katalazı Kaynaklar: 1) Bravo J, Mate MJ, Schneider T, Switala, J, Wilson K, Loewen PC, Fita I. Proteins, 34: (1999) 2) Loewen PC.Cold Spring Harbor Laboratory Pres: (1997) 3) Mate M, Murshudov G, Bravo J, Melik-Adamyan W, Loewen PC, Fita I. Handbook of proteins (2001)

8 Endüstriyel Kullanım Alanları

9 S.thermophilum Katalaz-Fenol Oksidazı Hidrojen peroksidi parçaladığı (katalaz aktivitesi) gibi H 2 O 2 yokluğunda da o-difenoliklerin oksidasyonunu (fenol oksidaz aktivitesi) gerçekleştirmekte 2 H 2 O 2 2 H 2 O + O 2 Katalaz aktivitesi Oksidaz aktivitesi gösteren memeli katalazları literatürdeki tek benzer örnektir Tetramer Fenol oksidaz aktivitesi Kaynaklar: 1) Kocabas DS, Bakir U, Phillips SEV, McPherson MJ and. Ogel ZB. Appl Microbiol Biotechnol. 79: (2008) 2) Kocabas DS, Pearson AR, Phillips, SEV, Bakir U, Ogel ZB, McPherson, MJ and Trinh,CH. Acta Crystallographica F 65 (2009) 3) Ögel ZB, Yüzügüllü Y, Mete S, Bakir U, Kaptan Y, Sutay D, Demir AS. Appl Microbiol Biotechnol. 71: (2006) 4) Vetrano, AM, Heck, DE, Mariano, TM, Mishin, V, Laskin DL, Laskin JD.The Journal of Biological Chemistry 280: (2005)

10 Amaç Enzimin üç boyutlu yapısının belirlenmesi Rekombinant ekspresyon sistemlerinin geliştirilmesi Kataliz mekanizmasının araştırılması

11 Enzim yapısının belirlenmesi S. thermophilum katalazfenol oksidaz üretimi Saflaştırma Karakterizasyon Kristal eldesi Verileri toplama ve üç boyutlu yapının belirlenmesi

12 Katalaz-Fenol Oksidaz Üretimi Zamana karşı katalaz ve fenol oksidaz aktivite eğrileri benzerlik göstermektedir Enzim üretiminin, mantar büyümesinin 5. gününde optimum seviyede olduğu gözlendi

13 Saflaştırma Enzim, iyon değişimi ve ardından jel filtrasyon kromatografi ile saflaştırıldı 3-9 mg/ml saf enzim İyon değişimi Jel filtrasyon Saf protein

14

15 Saf proteinden kristal eldesi X-ışını Radyasyona tabi tutma ve verilerin toplanması Verilerin analiz edilmesi Model oluşturma

16 S.thermophilum Katalaz-Fenol Oksidazı 2.7Å da ışığın kırılma verileri toplandı Birim hücre : a= 185.4Ǻ, b=216.3ǻ, c=68.6ǻ ve α=β=γ=90 o Homotetramer (4 x 80 kda = 320 kda) 1 x hem (d tipi) / monomer 714 amino asit / monomer Aktif bölge

17 Moleküler çalışmalar Rekombinant katalaz-fenol oksidaz enziminin klonlanmasi ve E. coli de ifade edilmesi Mutasyon çalışmaları (His Asn ve Val Phe) Saflaştırma Karakterizasyon

18 Rekombinant Katalaz-Fenol Oksidazı Sentetik catpo geni pet28 vektörüne aktarılarak E. coli BL21(DE3) hücrelerinde ifade edildi 30 C büyüme sıcaklığında yarı-anaerobik koşullarda en iyi protein üretimi sağlandı

19 Mutasyon çalışmaları Katalaz ve fenol oksidaz aktivitelerinin nasıl etkileneceğini görmek amacıyla gerçekleştirildi His101 d tipi hem grubunun oluşması için gerekli Val142 fenolik substratların aktif bölgeye girmesinden sorumlu H101N ve V142F mutasyonlarının katalaz aktivitesini olumsuz etkilemesi beklendi Eğer her iki aktivite aynı aktif bölgede gerçekleşiyorsa fenol oksidaz aktivitesinin de olumsuz etkilenmesi beklendi Kaynaklar: 1) Chelikani P, Carpena X, Fita I, Loewen PC. The Journal of Biological Chemistry, 278: (2003) 2) Loewen PC, Switala J, von Ossowski I, Hillar A, Christie A, Tattrie B, Nicholls P. Biochemistry, 32: (1993) 3) Melik-Adamyan W, Bravo J, Carpena X, Switala J, Maté MJ, Fita I, Loewen PC. PPROTEINS: Structure, Function, and Genetics, 44: (2001)

20 Bağıl aktivitelerin karşılaştırılması Rekombinant enzim ve iki varyantı (H101N ve V142F) afinite kromatografi yardımıyla saflaştırıldı

21 Rekombinant katalaz-fenol oksidaz varyantlarının spektrumlarının karşılaştırılması

22 Elde edilen katalaz-fenol oksidaz varyantlarının spesifik aktivitelerinin karşılaştırılması

23 Sonuçlar Katalaz-fenol oksidazı, mantarlarda tanımlanmış çift aktivite gösteren ilk enzimdir Spektreskopi ve mutasyon analizleri enzimin d tipi hem grubu içerdiğini göstermektedir Her iki aktivitenin (katalaz ve fenol oksidaz) aynı aktif bölgede gerçekleştiği önerilmektedir

24 Hedefler... Katalaz-fenol oksidazının metal içeriğinin tespit edilmesi Kinetik katsayılarinin tayini Kataliz mekanizmasındaki ara ürünlerin belirlenmesi Enzimin üç boyutlu yapısından yola çıkarak farklı mutasyonların denenmesi

25 Teşekkürler... ODTÜ Prof. Dr. Zümrüt B. Ögel Prof. Dr. Ufuk Bakır Dr. Didem S. Kocabaş Mantar Genetik ve Enzimoloji Grubu Leeds Üniversitesi Prof. Dr. Michael J. McPherson Prof. Dr. Simon E. Phillips Dr. Chi Trinh Dr. Arwen R. Pearson Dr. Mark Smith MJM Lab Arwen Pearson Lab Diamond Işınım Kaynağı Destekler Leeds Üniversitesi Biyolojik Bilimler Araştırma Merkezi (MJM) ODTÜ (BAP DPT2002K120510)