Renal Transplant Alıcılarında Polyomavirüs (BK ve JC Virüs) DNA sının Real-time PCR ile Saptanması

Transkript

1 flora K L İ N İ K Ç A L I Ş M A/ R E S E A R C H A R T I C L E Renal Transplant Alıcılarında Polyomavirüs (BK ve JC Virüs) DNA sının Real-time PCR ile Saptanması Detection of Polyomavirus (BK and JC Virus) Dna with Real-time PCR in Renal Transplant Recipients Roza ÇAĞLI 1, Ayşın ZEYTİNOĞLU 1, Hüseyin TÖZ 2, Savaş SİPAHİ 2, Sait ŞEN 3, Rüçhan SERTÖZ 1 1 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye 2 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Nefroloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye 3 Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi, Patoloji Anabilim Dalı, İzmir, Türkiye ÖZET Giriş: İnsan polyomavirüsleri (BK virüs ve JC virüs) primer infeksiyon sonrası böbrekte (BKV) ve beyinde (JCV) latent olarak kalır. İmmünsüpresyon durumunda reaktivasyonla klinik tablolara neden olur. Renal transplantasyon alıcılarında latent polyomavirüsün reaktivasyonunun neden olduğu üretral stenoz ve nefropati tanısında kantitatif viremi ve virürinin saptanması altın standarttır. Transplantasyon sonrası immünsüpresyon dozunun ayarlanması açısından polyomavirüse bağlı nefropati tanısının konması organ kaybının önlenmesi için çok önemlidir. Transplantasyon sonrası görülen akut rejeksiyon atağında immünsüpresyon dozu artırılmalı, polyomavirüse bağlı nefropati (PVN) de ise immünsüpresyon dozu azaltılmalıdır. Materyal ve Metod: Çalışmamızda renal transplantasyon alıcısı 65 hastaya ait transplantasyon öncesi 0. ay ve transplantasyon sonrası 3, 6 ve 12. aylarda alınan toplam 273 plazma ve idrar örneğinde polyomavirüs DNA sı kantitatif olarak gerçek zamanlı (real-time) PCR (LightCycler-LC PCR) ile araştırıldı. Gerçek zamanlı PCR de hedef bölge olarak polyomavirüs T antijeni gen bölgesine uygun primer ve problar kullanıldı. BKV ve JCV ayrımı erime eğrisi analizi ile yapıldı. Transplantasyon öncesi 0. ay, transplantasyon sonrası 3, 6 ve 12. aylarda yapılan protokol biyopsi örneklerinden immünhistokimyasal yöntemle BK virüs infekte hücreler araştırıldı. Bulgular: Tüm idrar örnekleri incelendiğinde BKV-DNA 0, 3, 6 ve 12. aylarda sırasıyla %26.79, %31.03, %28.57 ve %23.53, JCV- DNA ise 0, 3, 6, ve 12. aylarda sırasıyla %33.93, %51.72, %39.29 ve %47.06 pozitif bulundu. Sağlıklı kontrol grubu ile sonuçlar karşılaştırıldığında, 0. ayda her iki örnekte polyomavirüs DNA sonuçları, transplantasyon sonrası örneklerde JCV-DNA sonuçları ve 12. ay örneklerinde BKV-DNA sonuçları ile anlamlı bir fark saptanmadı. Transplantasyon sonrası 3. ve 6. ay idrar BKV-DNA sonuçları ile kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulundu (sırasıyla; p= 0.014, p= 0.025). Bu fark BKV nin tranplantasyon sonrası 3. ve 6. ayda immünsüpresyonun yoğun olduğu dönemde reaktivasyonunun göstergesidir. Çalışmamızda 65 olguda klinik, laboratuvar ve histopatoloji ile BKV nefropatisi saptanmadı. Sonuç: BKV nefropatisi renal transplant alıcılarında %1-7 oranında görüldüğü için daha çok sayıda renal transplant alıcısı ile yapılacak bir çalışmanın BKV nefropati görülme sıklığını daha net göstereceğini düşünüyoruz. Anahtar Kelimeler: Renal transplantasyon; BK Virüs; JC Virüs; Kantitatif DNA; Real-time PCR 116 Geliş Tarihi/Received: 07/03/ Kabul Ediliş Tarihi/Accepted: 16/12/2016

2 Çağlı R, Zeytinoğlu A, Töz H, Sipahi S, Şen S, Sertöz R. SUMMARY Detection of Polyomavirus (BK and JC Virus) DNA with Real-time PCR in Renal Transplant Recipients Roza ÇAĞLI 1, Ayşın ZEYTİNOĞLU 1, Hüseyin TÖZ 2, Savaş SİPAHİ 2, Sait ŞEN 3, Rüçhan SERTÖZ 1 1 Department of Microbiology, Faculty of Medicine, University of Ege, Izmir, Turkey 2 Department of Nephrology, Faculty of Medicine, University of Ege, Izmir, Turkey 3 Department of Pathology, Faculty of Medicine, University of Ege, Izmir, Turkey Introduction: Human polyomaviruses (BK virus and JC virus) establish a latent infection in kidney (BKV) and brain (JCV) after primary infection. In case of immunosuppression, reactivation may occur causing clinical conditions. Quantitative viremia and viruria are gold standarts in diagnosing polyomavirus associated urethral stenosis and nephropathy in renal transplant recipients. In case of posttransplant nephropathy dose of the immunosupressive therapy should be increased. In polyomavirus nephropathy (PVN) on the contrary the dose of immunosupression should be reduced. The cause of nephropathy is important to adjust the dose of immunosupression in posttransplant renal transplant recipients. Materials and Methods: Two hundred seventy three plasma and urine samples of 65 renal tranplant recipients collected posttransplant at months 0, 3, 6, and 12 were investigated for quantitative polyomavirus DNA by a real-time PCR (LightCycler-LC PCR). In real-time PCR primers and probes were designed to target polyomavirus T antigen gene. BKV and JCV were identified by melting curve analysis. At pretransplant month 0, posttransplantation months 3, 6 and 12 renal biopsy specimens were investigated for BK virus infected cells by immunohistochemical methods. Results: In all of the urine samples BKV-DNA was 26.79%, 31.03%, 28.57%, and 23.53% positive, and JCV DNA was 33.93%, 51.72%, 39.29%, and 47.06% positive at months 0, 3, 6, and 12 posttransplant, respectively. When the results were compared with the healthy control group, the results of month 0 for polyomavirus DNA, JCV-DNA results of the post transplant period and BKV-DNA results of the 12 month were statistically not significant. When the results of the healthy control group and posttransplant 3 and 6 months BKV-DNA results of the renal transplant urine samples were compared we found a significant difference statistically (p= and p= respectively). These differences at posttransplant month 3 and 6 for BKV show a reactivation period because of intensive immunosuppression. Conclusion: In our study, BKV nephropathy was not detected in 65 renal transplant recipients with clinical, laboratory and histopathological findings. Because BKV nephropathy is found in 1-7% of renal transplant recipients a greater number of renal transplant recipients should be investigated for BKV nephropathy to find the correct incidence for our renal transplantation recipients. Key Words: Renal Transplantation; BK Virus; JC Virus; Quantitative DNA; Real-time PCR GİRİŞ Polyomavirüsler zarfsız, ikozahedral kapsitli DNA virüsleridir [1]. BK virüs (BKV) ve JC virüsleri (JCV) DNA düzeyinde %75, aminoasit düzeyinde %68 homoloji gösterirken SV-40 ile %70 homoloji gösterirler [1,2]. Yapılan seroepidemiyolojik çalışmalarda dünya genelinde yetişkinlerin %80-90 nından fazlasında seropozitiflik saptandığı bildirilmektedir [3-5]. BKV ve JCV nin bulaşma yolu yakın temas, solunum yolu, oral ve perinatal yoldur [2,6]. İnsanda primer infeksiyon (asemptomatik veya semptomatik) sonrasında BKV böbreklerde ve JCV beyinde latent olarak kalır. Primer infeksiyon çocukluk çağlarında ve genellikle asemptomatik geçirilir. BKV ve JCV infeksiyonları sırasıyla 3 ila 4 ve 10 ila 14 yaşlarında sık görülür. Latent kalan virüs immünsüpresyon durumunda [transplantasyon, insan immünyetmezlik virüsü (HIV) infeksiyonu, onkoloji hastaları] ve gebelikte reaktivasyon ile klinik tablolara neden olur [7]. Renal transplantasyon sonrası latent polyomavirüsün reaktivasyonu; rejeksiyon atağı, hemorajik sistit ve üretral stenoza neden olmaktadır. Renal transplantasyon sonrası görülen akut rejeksiyon atağında immünsüpresif tedavi dozunun artırılması gerekirken, polyomavirüs infeksiyonuna bağlı nefropatide immünsüpresif tedavi dozu azaltılmalıdır. Bu nedenle renal transplant alıcılarında polyomavirüs hastalığı tanısının konması son derece önemlidir [3]. Tanıda virüs DNA sının kanda kantitatif olarak gösterilmesi altın standarttır [8]. 117

3 Renal Transplant Alıcılarında Polyomavirüs (BK ve JC Virüs) DNA sının Real-time PCR ile Saptanması Organ Nakli Merkezi nde izlenen 65 renal transplant alıcısının 273 örneğinde BKV ve JCV infeksiyonlarının durumu ve polyomavirüse bağlı nefropati yönünden değerlendirilmesi amaçlandı. Materyal ve Metod Organ Nakli Merkezi nde izlenen 65 renal transplant alıcısından prospektif olarak pretransplant 0. ay ve transplantasyon sonrası 3, 6 ve 12. aylarda toplam 273 kan (EDTA lı tübe, 5 ml) ve idrar (50 cc) örneği alındı. Kontrol grubu olarak 20 sağlıklı kişiden kan ve idrar örnekleri alındı. Alınan tüm örnekler -80 C de saklandı. Pretransplant (0. ay, n= 65), 3. ayda (n= 30), 6. ayda (n= 31) ve 12. ayda (n= 17) olmak üzere toplam 143 plazma örneği; 0. ayda (n= 56), 3. ayda (n= 29), 6. ayda (n= 28) ve 12. ayda (n= 17) olmak üzere toplam 130 idrar örneği ve sonuç olarak toplam 273 örnek alındı. DNA ekstraksiyonu plazma örneklerinden 200 μl kullanılarak High Pure Viral Nucleic Acid Kiti (Roche Diagnostics, Germany) ve idrar örneklerinden 200 μl kullanılarak İnvitek Kiti (Germany) ile üretici firmanın önerdiği gibi yapıldı. Kantitatif polyomavirüs DNA floresans rezonans enerji transferi (FRET) analizi gerçek zamanlı (real time) PCR yöntemi (Light Cycler-LC Instruments Versiyon 1.2) ile saptandı. FRET yönteminde, amplikonun oluşumu, sürekli olarak iki florofor işaretli prob kullanılarak gerçek zamanlı olarak saptanmaktadır. Çalışmada hedef bölge olarak polyomavirüs T antijeni gen bölgesine uygun primer ve problar kullanıldı (Tablo 1,2). DNA ekstraksiyonu yapılan örneklerin LC PCR çalışmasına uygun 20 µl reaksiyon karışımı hazırlandı. LC-PCR testi reaksiyon karışımı için LightCycler FastStart DNA master hybridization probes kiti (Roche Moleculer Biochemicals) kullanıldı. Kapiller tüpün içine; 7.4 µl su, 1.6 µl MgCl stok solüsyonu, 4.0 µl primer ve hibridizasyon problarını içeren reagen karışımı, 2.0 µl LightCycler FastStart DNA master hybridization probes reageni, 5.0 µl DNA ekstraksiyonu yapılan örnek konuldu. Böylece total olarak 20 µl reaksiyon karışımı (PCR karışımı) hazırlanmış oldu. Hazırlanan reaksiyon karışımları kapiller tüplerin içinde cihaza (LC Instruments Versiyon 1.2) konuldu. Her çalışmada bir negatif kontrol (distile su), BKV standartları ( kopya) ve JCV standartları ( kopya) kondu. Negatif kontrol ve standartlar reaksiyon karışımı içine örnekler gibi 5.0 µl konuldu. Pozitif örneklerin miktarı bilinen standartlar ile karşılaştırılması ile kantitasyon değerlendirilmesi yapıldı. Kantitasyon için kopya BKV ve JCV standartları kullanıldı. LightCycler PCR DNA analizi BKV için F2 (LC 640) ve JCV için F3 (LC 705) kanalında yapıldı. Polyomavirüs DNA sı saptanan örneklerde BKV/JCV ayrımı için yapılan erime eğrisi analizi yapıldı. Erime eğrisi analizinde BKV ortalama C ( C) ve JCV ise ortalama C ( C) de saptandı. Tablo 1. Real time PCR testinde kullanılan primerler Oligonükleotid sekans (5-3 ) Virüs Primerler BKV Forward : ACAGCAAAGCAGGCAAGG Reverse : GGAGTCCTGGTGGAGTTCC JCV Forward : CTGAGGAATGCATGCAGATCTA Reverse : GGAATCCTGGTGGAATACA Amplikon Hedef bölge uzunluğu (bç) T- Ag 219 T- Ag 217 Tablo 2. Real time PCR testinde kullanılan problar Problar BKV LC-Red640-AAGCAACAGCAGATTCTCAA CACTCAACA-PH JCV LC-Red705-AAAACACAGGATCCCAACAC TCTACCCC-PH 118

4 Çağlı R, Zeytinoğlu A, Töz H, Sipahi S, Şen S, Sertöz R. Organ Nakli Merkezi nin hasta izlem protokolüne uygun olarak nefropati düşündürecek klinik ve laboratuvar (üre/kreatinin) bulgular olmasa da, olguların 0, 3, 6 ve 12. aylarda yapılan protokol biyopsi örneklerinden hazırlanan parafin bloklardan hazırlanan 5 mikron kalınlıktaki kesitlerde immünhistokimyasal yöntemle BK virüs ile homolog özellikler taşıyan SV40 large T antijene (SV40 LT-ag, 1/50, Callbiochem) karşı geliştirilmiş antikorlar kullanılarak BK virüs infekte hücreler araştırıldı. Prospektif yapılan çalışmada etik kurul onayı alındı. Çalışma için kan ve idrar örneği alınan renal transplant alıcıları ve kontrol grubu bilgilendirildi ve onayları alındı. Çalışmada istatistiksel değerlendirmeler SPSS programı ve Wilcoxon yöntemi kullanılarak yapıldı. Bulgular Renal transplant alıcısı toplam 65 hastanın 30 u kadın, 35 i erkek, yaş ortalaması yıl idi. Bu hastaların 40 ının vericisi canlı ve 25 inin vericisi kadavra idi. Hastaların büyük çoğunluğu posttransplant dönemde immünsüpresif tedavi olarak prednizolon + mikofenolat mofetil + siklosporin (n= 41, %63.08), bir kısmı prednizolon + mikofenolat mofetil + takrolimus (n= 14, %21.54), bir kısmı da prednizolon + mikofenolat mofetil + rappamisin (n= 8, %12.31) almaktaydı. Bir hasta prednizolon + siklosporin + azatioprin ve yine diğer bir hasta sadece prednizolon + mikofenolat mofetil kullanmaktaydı. Plazmada BKV ve JCV-DNA sonuçları Tablo 3 te gösterildi. Değerlendirilen 143 plazma örneğinin hiç birisinde JCV-DNA pozitifliği saptanmadı. Plazmada tüm hastalara ait 0. ay örneklerinde (n= 65) BKV-DNA 4 (%6.2) hastada kantitasyonu düşük düzeyde pozitif (ortalama 69 kopya/ml, medyan 42 kopya/ml), 3. ay örneklerinde (n= 30) 3 (%10) hastada düşük düzeyde pozitif (ortalama 50 kopya/ml, medyan 18 kopya/ml) olarak saptandı. Altıncı ve 12. ay örneklerinde (n= 31/17) BKV-DNA negatif bulundu. Tüm pozitif kantitatif değerler polyomavirüse bağlı hastalıklar için tartışılan plazma eşik değerlerin çok altında değerlerdi (< 10 7 kopya/ml) [9]. Sağlıklı kontrol grubunda (n= 20) plazmada BKV ve JCV-DNA pozitifliği saptanmadı. İdrarda BKV ve JCV-DNA sonuçları Tablo 4 te gösterildi. 0. ayda (n= 56) BKV-DNA 15 (%26.79) ve JCV 19 (%33.93) örnekte pozitif bulundu. Bu olguların 3 ünde hem BKV hem de JCV-DNA pozitif (%5.36) saptandı. Yirmi beş örnekte polyomavirüs DNA sı negatif, 31 (%55.36) örnekte ise polyomavirüs DNA sı pozitifti. Pretransplant (0. ay) alınan idrar örnekleri hastaların immünsüpressif ajanlar kullanmadan önceki polyomavirüs varlığını yansıtmaktadır. Bu örneklerden BKV-DNA sı pozitif örneklerin sadece birinde BKV-DNA idrarda kantitatif DNA nın PVN açısından anlamlı kabul edildiği > 10 7 kopya/ ml olarak saptandı. Hastada klinik ve laboratuvar olarak herhangi bir patoloji yoktu ve bu dönem PVN açısından riskli olarak değerlendirilmemektedir [10]. Sağlıklı kontrol grubunda (n= 20) idrarda Tablo 3. Plazmada polyomavirüs DNA Sonuçları Sağlıklı kan donörleri (n= 20) 0. ay (n= 65) BKV-DNA pozitif 0 4 (%6) (< 10 7 kopya/ml) Renal transplant olguları 3. ay (n= 30) 3 (%10) (< 10 7 kopya/ml) 6. ay (n= 31) 12. ay (n= 17) 0 0 JCV-DNA pozitif BKV ve JCV-DNA pozitif Toplam polyomavirüs DNA pozitif (%6) (< 10 7 kopya/ml) 3 (%10) (< 10 7 kopya/ml)

5 Renal Transplant Alıcılarında Polyomavirüs (BK ve JC Virüs) DNA sının Real-time PCR ile Saptanması BKV-DNA hiçbir olguda pozitif değilken, JCV- DNA 6 (%30) olguda pozitif bulundu. JCV-DNA pozitifliği 1.32 x x 10 5 kopya/ml idi (ortalaması 6.1 x 10 4 kopya/ml, ortanca 650 kopya/ml). Üçüncü ayda alınan idrar örneklerinde (n= 29) BKV-DNA 9 (%31.03) ve JCV-DNA ise 15 (%51.72) örnekte saptandı. Bu olguların 4 ünde (%13.79) hem BKV hem de JCV-DNA pozitiftir. Dokuz örnekte polyomavirüs DNA sı negatif ve 20 (%68.97) örnekte polyomavirüs DNA sı pozitifti. BKV-DNA pozitif örneklerden hiçbiri PVN açısından anlamlı kabul edilen > 10 7 kopya/ ml saptanmadı. Hastaların hiçbirinde polyomavirüs hastalığını düşündürecek klinik ve laboratuvar olarak herhangi bir yoktu (Tablo 4). Altıncı ayda alınan idrar örneklerinde (n= 28) BKV 8 (%28.57) ve JCV ise 11 (%39.29) örnekte saptandı. Bu olguların birinde hem BKV hem de JCV-DNA pozitif saptandı (%3.57). BKV-DNA pozitif örneklerden sadece birinde PVN açısından anlamlı kabul edilen 10 7 kopya/ ml üzerinde (3.7 x 10 9 kopya/ml) saptandı. Yine bu olguda da polyomavirüs hastalığını düşündürecek klinik ve laboratuvar olarak herhangi bir patoloji saptanmadı. On örnek polyomavirüs negatif, 18 (%64.29) örnek ise polyomavirüs DNA sı açısından pozitifti (Tablo 4). On ikinci ayda alınan idrar örneklerinde (n= 17) BKV-DNA 4 (%23.53) ve JCV-DNA ise 8 (%47.06) örnekte saptandı. BKV-DNA pozitif örneklerden sadece birinde PVN açısından anlamlı kabul edilen 10 7 kopya/ml üzerinde (3.4 x 10 9 kopya/ml) saptandı (6. ayda da 10 7 kopya/ml üzerinde saptanan tek olgu). Yine bu olguda da bu dönemde polyomavirüs hastalığını düşündürecek klinik ve laboratuvar olarak herhangi bir patoloji saptanmadı. Bu olguların hiçbirinde her iki virüs için birlikte pozitiflik bulunmadı. Beş örnek polyomavirüs negatif, 12 (%70.59) örnek ise polyomavirüs DNA sı açısından pozitifti (Tablo 4). İdrarda BKV-DNA > 10 7 kopya/ml eşik değerini geçen bir hastanın iki örneği (6. ayda 3.7 x 10 9 ve 12. ayda 3.4 x 10 9 ) vardı. Bu hastanın 6. ve 12. aylarında klinik, laboratuvar (üre/kreatinin) ve biyopsi bulgularında polyomavirüs nefropatisini düşündürecek bir sorun olmadı. Diğer olguların bu dönemki gözlemlerinde klinik olarak polyomavirüse ait bir yakınma tanımlanmadı ve laboratuvar izlemlerinde nefropati düşündürecek üre/kreatinin yüksekliği gözlenmedi. Bu alıcı grubunda vireminin olmaması klinik ve laboratuvar bulguları ile uyumlu idi. Pretransplant dönemde (0. ay) tüm idrar örneklerinde BKV-DNA %26.79, JCV-DNA ise %33.93 pozitif bulundu (Tablo 4). Posttranplantasyon dönemde tüm hastaların 3, 6 ve 12 aylarda izlenen virüri oranlarının ortalaması BKV-DNA için %27.71 ve JCV için %46.02 bulundu. Olguların 0, 3, 6 ve 12. aylarda yapılan protokol biyopsi örneklerinde BK virüs infekte hücre saptanmadı. Transplant günü (0. ay) BKV ve JCV-DNA varlığı ile 3, 6, 12 ay sonuçları ve kontrol grubunun sonuçları kıyaslandığında istatistiksel olarak bir fark bulunmadı. Kontrol grubunun plazma ve idrar BKV ve JCV-DNA sonuçları posttransplant döneme ait örneklerin sonuçları ile kıyaslandığında Tablo 4. İdrarda polyomavirüs DNA Sonuçları Sağlıklı kan donörleri (n= 20) 0. ay (n= 56) Renal transplant olguları 3. ay (n= 29) 6. ay (n= 28) 12. ay (n= 17) BKV-DNA pozitif 0 15 (%26.79) 9 (%31.03) 8 (%28.57) 4 (%23.53) JCV-DNA pozitif 6 (%30) 19 (%33.93) 15 (%51.72) 11 (%39.29) 8 (%47.06) BKV ve JCV-DNA pozitif Toplam polyomavirüs DNA pozitif 0 3 (%5.36) 4 (%13.79) 1 (%3.57) 0 6 (%30) 31 (%55.36) 20 (%68.97) 18 (%64.29) 12 (%70.59) 120

6 Çağlı R, Zeytinoğlu A, Töz H, Sipahi S, Şen S, Sertöz R. sadece idrarda BKV DNA nın immünsüpresyonun belirgin olduğu 3 ve 6. ay sonuçlarında istatistiksel olarak bir fark saptandı (sırasıyla p= ve p= 0.025). TARTIŞMA Son yıllarda renal transplant alıcılarına uygulanan daha etkin immünsüpresif ajanlar transplantasyon sonrası viral infeksiyonların görülme sıklığını artırmıştır. Renal transplantasyon sonrası özellikle latent polyomavirüs infeksiyonunun reaktivasyonu nefropati, hemorajik sistit ve üretral stenoza neden olmaktadır [8,11,12]. Renal transplantasyon sonrası görülen akut rejeksiyon atağında immünsüpresif tedavi dozunun artırılması gerekirken, polyomavirüse bağlı nefropatide immünsüpresif tedavi dozu azaltılmalıdır. Bu nedenle renal trasplant alıcılarında polyomavirüs infeksiyonu tanısının konması son derece önemlidir [3]. Ayırıcı tanının yapılamaması organ kaybına neden olabilir. Tanıda virüs DNA sının kanda kantitatif olarak ölçülmesi yani vireminin veya virürinin kantitatif olarak gösterilmesi (virüsün latent varlığı nedeniyle) altın standarttır [8]. Polyomavirüs infeksiyonu tanısında kullanılan, geleneksel yöntemler rutin laboratuvar tanıda yeterince pratik değildir (virüs kültürü) veya yetersiz kalmaktadır (seroloji). Polyomavirüs infeksiyonları tanısında kantitatif nükleik asit testleri diğer yöntemlere göre daha yüksek duyarlılığa sahiptir [8]. Gerçek zamanlı PCR nin amplikon kontaminasyonuna açık olmaması geleneksel PCR yöntemlerine göre önemli bir avantajdır. Testlerin sonucu, örneğin laboratuvara kabulünden yaklaşık üç saat sonra çıkar [8]. Nefropati açısından yüksek riskli renal transplant alıcılarında polyomavirüs viral yükünün saptanması önemlidir [3]. Limaye ve arkadaşları ile Nickeleit ve arkadaşları yaptığı çalışmalarda renal transplant alıcılarında BK virüse bağlı nefropatinin tanısı, plazma veya serumda BKV-DNA nın PCR ile gösterilmesi ile konmuştur [6,13]. Hastaların bir kısmında nefropati gelişmeden önce örneklerde BKV-DNA negatif bulunmuştur. Bir kısmında ise nefropati gelişmeden önce haftalar arasında plazmada BKV-DNA PCR ile pozitif olarak saptanmıştır [6]. Bazı hastalarda immünsüpresif tedavi dozunun azaltılması ile klinik semptomlarda gerileme ve PCR de viral yükte azalma görülmüştür [6,13]. BKV-DNA sının plazma veya serumda PCR ile gösterilmesi invaziv olmayan bir yöntem olması nedeniyle ve BK virüse bağlı nefropatinin tedavi ve izleminde yararlıdır. Kantitatif olarak polyomavirüs hastalıklarının değerlendirilmesi için değişik araştırmacılar tarafından değişik eşik değerleri üzerinde çalışmalar yapılmıştır. Renal transplantasyon alıcılarında BKV nefropatisi için Hirsh ve arkadaşları 2005 yılında bir uzlaşı raporu yayınlamışlardır. Bu grup hastada polyomavirüs için tarama önerilmektedir. Tarama için idrarda sitoloji (Decoy hücresi), kantitatif viral DNA veya kantitatif VP-1 mrna testleri kullanılabilir. İdrarda kantitatif mrna VP1 ve kanda kantitatif DNA nın saptanmasında özgüllük/ duyarlılık her iki test için sırasıyla %93.8/%93.9 ve %85/%100 olarak bildirilmiştir [14]. İdrar sitolojisi ile Decoy hücrelerinin gösterilmesinin negatif prediktif değeri %100 ancak, pozitif prediktif değeri < %30 dur [14]. Olgular ilk iki yılda üçer ayda ve 2-5 yılda ise yılda bir, bu taramanın yanı sıra allograft disfonksiyonu veya biyopsi yapıldığında ek olarak tarama için seçilen yöntemle izlenmelidir. Taramada gözlenen pozitiflik ek kantitatif testlerin yapılmasını gerektirir. Testler idrarda kantitatif DNA nın > 10 7 kopya/ml, idrarda kantitatif VP-1 mrna nın > 6.5 x 10 5 kopya/ng total RNA veya plazma kantitatif DNA nın > 10 4 kopya/ml olması durumunda PVN için anlamlıdır [10,15]. Yukarıda belirtilen eşik değer üzeri durumlarda PVN için risk yüksektir ve tanı için allograft biyopsi yapılır. Kesin tanı renal biyopside polyomavirüse bağlı sitopatik değişikliklerin (tubuler epitel/ glomerüler parietal hücrelerde intranükleer inklüzyonlar, tübüler nekroz, interstisyel inflamatuvar infiltrasyon, interstisyum fibrozu vb.) ve viral proteinlerin gösterilmesi ile konur. PVN de histolojik değerlendirme Bannf şemasına ve PVN histolojik paternlerine (PVN A-C paternleri) göre semikantitatif yapılır. PVN tanısı alan hasta idrar/plazma kantitatif nükleik asit testleri ile 2-4 haftada bir izlenir [10,14,16]. Çalışmamızda izlem sırasında olgularda polyomavirüs infeksiyonuna ait klinik tablo ve yüksek düzey viremi saptanmadı. Bazı olgularda viremi olmadan virürinin saptanması latent olarak böbreklere yerleşen polyomavirüsün reaktive olup idrardan atıldığını göstermektedir. Çalışmamızda kontrol grubunda (n= 20) kanda polyomavirüs DNA sı ve idrarda BKV-DNA saptanmamış sadece idrarda JCV-DNA 6 (%30) olguda pozitif bulunmuştur. JCV-DNA pozitifliği bu 6 olguda 1.3 x x 10 4 kopya/ml arasında ve 121

7 Renal Transplant Alıcılarında Polyomavirüs (BK ve JC Virüs) DNA sının Real-time PCR ile Saptanması ortalaması 1.1 x 10 4 kopya/ml dir. Çalışmamızda hastalara ait 0. ay idrarlarında, immünsüpresif tedaviye başlanmadan önce polyomavirüs DNA sının pozitif saptanması önemlidir (BKV-DNA %24.79, JCV %33.93). Bu pozitifliğin latent virüsün böbreklerde varlığına bağlı olduğu düşünüldü. Değişik yöntemlerle sağlıklı kişilerde polyomavirüsün idrarla atılımı % arasında saptanmıştır [17]. Retrospektif çalışmalarda renal transplant alıcılarında BKV nefropatisi %1-7 olarak bulunmuştur [3,17,18]. BKV nefropatisinde klinik semptom olmadan serum kreatinin düzeyi haftalar içinde artış göstermektedir. Alıcıdaki BKV replikasyonu PCR ile saptanan plazma BKV-DNA düzeyi ile paraleldir [6]. Çalışmamızda 65 olguda klinik, laboratuvar ve histopatoloji ile BKV nefropatisi saptanmadı. Geleneksel yöntemler (virolojik yöntemler, elektron mikroskopi ve sitoloji) ile renal transplant alıcılarında BKV virürisi %0-44 arasında saptanmıştır [4,19]. Yüksek duyarlı nested PCR ile renal transplant alıcılarında BKV virürisi ise %33 olarak saptanmıştır [4]. Çalışmamızda renal transplant alıcılarında posttranplantasyon dönemde 3, 6 ve 12. aylarda izlenen virüri oranlarının ortalaması BKV- DNA için %27.71 ve JCV için %46.02 bulundu. Hirsch ve arkadaşlarının yaptığı prospektif bir çalışmada 78 renal transplant alıcısından 3, 6 ve 12. aylarda plazmada BKV-DNA real-time PCR ile kantitatif olarak ölçülmüştür [3]. İdrarda Decoy hücresi araştırılmış, renal biyopsi ile de greft fonksiyonu değerlendirilmiştir. Renal transplantasyon sonrası 78 hastanın; 10 unda ortalama 23. haftada (4-73 hafta) BKV viremisi, beşinde ortalama 28. haftada (8-86 hafta) BKV nefropatisi, 23 ünde ortalama 16. haftada (2-69 hafta) Decoy hücresi saptandığı bildirilmiştir. BKV replikasyonu (Decoy hücresine bakılarak) %30, viremi %13, nefropati ise %8 bulunmuştur. Plazma BKV viral yükü 7700 kopya/ml nin üstünde olan hastalarda histolojik olarak BKV nefropatisi saptanmıştır. Renal transplant alıcılarında erken greft yetmezliği %1-15 oranında gözükmektedir. Polyomavirüs ilişkili nefropatiye bağlı gelişen bu erken greft yetmezliğine sıklıkla BKV neden olmaktadır [20]. Plazmada tüm hastalara ait 0. ay incelemelerinde (n= 65) BKV-DNA 4 (%6.2) hastada düşük düzeyde pozitif bulunmuştur. BKV-DNA pozitif bu 4 örneğin kantitasyon ortalaması 69 kopya/ml medyan değeri ise 42 kopya/ml dir. BKV-DNA 3. ay izlem örneklerinin (n= 30) 3 (%10) ünde yine düşük düzeyde pozitif (ortalama 50 kopya/ ml, medyan 18 kopya/ml) ve 6./9. ay örneklerinde (n= 31/17) negatif bulunmuştur. Tüm bu değerler polyomavirüse bağlı hastalıklar için tartışılan eşik değerlerin çok altında değerlerdir. Renal transplant alıcılarında nefropatiye sıklıkla BKV neden olmakla beraber JCV de neden olabilmektedir. Renal transplant alıcılarında JCV ye bağlı nefropati konusunda az sayıda çalışma vardır. Çalışmamızda plazma ve idrarda BKV ile birlikte JCV yi de araştırdık. Plazmada JCV viremisi saptamadık. Tüm idrar örneklerinde BKV virürisi 0. ayda 15 (%26.79) hastada, 3. ayda 9 (%31.03) hastada, 6. ayda 8 (%28.57) hastada ve 12. ayda 4 (%23.53) hastada iken, JCV virürisini ise 0. ayda 19 (%33.93) hastada, 3. ayda 15 (%51.72) hastada, 6. ayda 11 (%39.29) hastada ve 12. ayda 8 (%47.06) hastada olarak saptadık. Toplam 8 (%6.15) hastada ise (0, 3 ve 6. aylarda) hem BKV, hem de JCV-DNA birlikte saptandı. JCV pozitif hastalarda klinik/laboratuvar ve histopatolojik olarak nefropati düşündürecek bulgu yoktu. Leung ve arkadaşlarının yaptığı bir araştırmada son dönem böbrek yetmezliği olan renal transplant alıcısı 44 hastadan aralıklı alınan serum ve idrar örneklerinde BKV-DNA real-time PCR ile araştırılmıştır [4]. Bu çalışmada viremi düzeyine göre hastalar iki gruba ayrılmıştır. Otuz beş hastada düşük düzey viremi ( kopya/ml), 9 hastada yüksek düzey viremi (2 x x 10 4 kopya/ ml) saptanmıştır. Düşük düzey viremili hastalarda virüri ortalama 2000 kopya/ml (0-5 x 10 9 kopya/ml), yüksek düzey viremili hastalarda ise virüri ortalama 900 kopya/ml (0-5 x 10 5 kopya/ml) saptanmıştır. BKV virüri saptanmayan 10 hastada 1 x x 10 4 kopya/ml arasında viremi saptanmıştır. Bu sonuçlara göre viremi ile virüri arasında bir paralellik yoktur. Çalışmamızda idrarda polyomavirüs DNA sı (BKV ve/veya JCV- DNA) saptanan olgularda viremi olmadan virüri mevcuttu. Pretransplant (0. ay) BKV ve JCV-DNA varlığı ile 3, 6, 12. ay sonuçları ve kontrol grubunun sonuçları kıyaslığında istatistiksel olarak bir anlam bulunmadı. Kontrol grubunun plazma ve idrar BKV ve JCV-DNA sonuçları posttransplant döneme ait örneklerin sonuçları ile kıyaslandığında sadece idrarda BKV-DNA nın immünsüpresyonun belirgin olduğu 3. ve 6. ay sonuçlarında istatistik- 122

8 Çağlı R, Zeytinoğlu A, Töz H, Sipahi S, Şen S, Sertöz R. sel olarak bir fark saptandı (sırasıyla p= ve p= 0.025). BKV-DNA için 0. ay ve immünsüpresyonun azaltıldığı 12. ayda farkın saptanmayıp 3. ve 6. ayda saptanması renal transplantasyon alıcılarında BKV infeksiyonunun aktivasyonunun önemini vurgulamaktadır. Sonuç olarak renal transplantasyon alıcılarında, özellikle nefropati gibi polyomavirüslerinin (BKV) neden olduğu ciddi tablolara tedavi yaklaşımı için spesifik mikrobiyolojik tanı önemlidir. Latent olarak bulunan virüsün idrarda saptanması sadece virüs replikasyonunu gösterebilir. Vireminin kantitatif gösterilmesi özellikle BKV infeksiyon tablolarının tanısı için altın standarttır. Çalışmamızda 65 renal transplant alıcısının sonuçlarına göre bu grup hastada polyomavirüs hastalığı ve plazmalarında BKV ve JCV DNA da anlamlı düzeyde bir pozitiflik saptanmadı. Olguların idrarda pretransplant 0. ayda BKV/JCV-DNA pozitifliği %26.79/%33.93, posttransplant 3, 6 ve 12. aylarda BKV-DNA için %31.03, %28.07 ve %23.53, JCV-DNA için %51.72, %39.29 ve %47.06 bulundu. Posttransplant 3. ve 6. ay idrar BKV-DNA sonuçları ile kontrol grubu arasında istatistiksel olarak anlamlı bir fark bulundu. Bu fark özellikle BKV nin posttransplant 3. ve 6. ayda immünsüpresyonun yoğun olduğu dönemde reaktivasyonunun bir göstergesidir. BKV nefropatisinin renal transplant alıcılarında %1-7 oranında görüldüğü göz önüne alındığında daha çok sayıda renal transplant alıcısı ile yapılacak bir çalışmanın BKV nefropati görülme sıklığını daha net göstereceğini düşünüyoruz [12]. Kaynaklar 1. Ustaçelebi Ş. Temel ve klinik mikrobiyoloji. 1999; Hirsch HH, Steiger J. Polyomavirus BK. Lancet Infect Dis 2003;3: Hirsch HH, Knowles W, Dickenmann M, Passwegg J, Klimkait T, Mihatsch MJ, et al. Prospective study of polyomavirus type BK replication and nephropathy in renal transplant recipients. N Engl J Med 2002;347: Leung AYH, Chan M, Tang SCW, Liang R, Kwong YL. Realtime quantitave analysis of polyoma BK viremia and viruria in renal allograft recipients. J Virolog Met 2002; Shah KV. Polyomaviruses. Virology. In: Fields BN, Knipe DM, Howley PM (Eds). 3 rd ed. Philadelphia: Lipincott-Raven Publishers, 1996: Nickeleit V, Klimkait T, Binet IF, Dalquen P, Del Zenero V, Thiel G, et al. Testing for polyomavirus type BK DNA in plasma to identify renal-allogreft recipients with viral nephropathy. N Engl J Med 2000;342: Coleman DV, Wolfendale MR, Daniel RA, Dhanjal NK, Gardner SD, Gibson PE, et al. Aprospective study of human polyomavirus infection in pregnancy. J Infect Dis 1980;142: Whiley DM, Mackay IA, Sloots TP. Detection and differentiation of human polyomaviruses JC and BK by LightCycler PCR. J Clin Microbiol 2001;39: Hirsch HH, Randhawa P; AST Infectious Diseases Community of Practice. BK virus in solid organ transplant recipients. Am J Transplant 2009;9(Suppl 4):S Hirsch HH, Brennan DC, Drachenberg CB, Ginevri F, Gordon J, Limaye AP, et al. Polyomavirus -associated nephropathy in renal transplantation: interdisciplinary analyses and recommendations. Transplantation 2005;79: Coleman DV, Mackenzia EF, Gardner SD, Poulding JM, Amer B, Russell WJ. Human polyomavirus (BK) infection and ureteric stenosis in renal allograft recipients. J Clin Pathol 1978;31: Howell DN, Smith SR, Butterly DW, Klassen PS, Krigman HR, Burchette JL Jr, et al. Diagnosis and management of BK polyomavirus interstitial nephritis in renal transplant recipients. Transplantation 1999;68: Limaye AP, Jerome KR, Kuhr CS, Ferrenberg J, Huang ML, Davis CL, et al. Quantitation of BK virus load inserum for the diagnosis of BK virus-associated nephropathy in renal transplant recipient. J Infect Dis 2001;183: Kazorsky A, Ducloux D. Renal tranplantation and polyomavirus infection: recent clinical facts and controversies. Transpl Infec Dis 2003;5: Hirsch HH. VP1 messenger RNA levels in urine for diagnosing BK virus nephropathy. Trasplantation 2003:75; Manon RB, Hoffman SC, Kampen RL, Cheng OC, Kleiner DE, Ryschkewitsch C, et al. Molecular evaluation of BK polyomavirus nephropathy. Am J Transpl 2005:5; Hirsch HH. Polyomavirus BK nephropathy: a (re-)emerging complication in renal transplantation. Am J Transplant 2002;2: Randhawa P, Demetris AJ. Nephropathy due to polyomavirus type BK. N Engl J Med 2000;342: Arthur RR, Shah KV. Occurrence and significance of papovaviruses BK and JC in the urine. Prog Med Virol 1989;36: Hirsch HH, Randhawa P. BK polyomavirus in solid organ transplantation. Am J Transplant 2013;13(Suppl 4):S Yazışma Adresi/Address for Correspondence Uzm. Dr. Roza ÇAĞLI Ege Üniversitesi Tıp Fakültesi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı İzmir-Türkiye E-posta: rozacagli@gmail.com 123