AESKULISA GAD65 SL Ref 3606

Transkript

1 AESKULISA Ref 3606

2

3 Ürün Ref Ürün Tanımı Manuel Rev. No. 002 : Kullanım Kılavuzu İçindekiler 1 Kullanım amacı Klinik Uygulama ve Test Prensibi Kit İçerikleri Saklama ve Raf Ömrü Kullanım Önlemleri Örnek Toplama, Kullanma ve Saklama Test Prosedürü Kantitatif ve Kalitatif Yorumlama Teknik Veri Performans Verisi Literatür AESKU.DIAGNOSTICS GmbH & Co. KG Mikroforum Ring Wendelsheim, Almanya Tel: Fax: Info@aesku.com

4 Manuel Rev. No. 002 : Kullanım Amacı AESKULISA insan serumunda ki insan GAD65 ye karşı antikorların kantitatif ve kalitatif tespiti için rekombinant insan glutamat dekarboksilaz 65kDa izoform (GAD65) kullanan katı faz enzim immunoassaydir. Bu test tip 1 şeker hastalığının tanısında bir araçtır. 2 Klinik Uygulama ve Test Prensibi İnsüline bağlı şeker hastalığı, tip I diyabet (T1DM), Langerhans` adacıklarının insülin üreten ß- hücrelerinin otoimmün yıkımından kaynaklanan kronik otoimmün hastalıktır. İnsülin üretiminin ve ß- hücresi otoantikorları varlığının çoğunun veya tamamının eksikliği ile karakterize edilir. T1DM otoimmün patogenezi ön-klinik aşamada ß-cells antijenlerine karşı otoantikorlar tarafından eşlik edilir. Bu antikorlar ile tanımlanan antijenler insülin, glutamat dekarboksilaz (GAD65 kda izoform) ve tirozin fosfataz-ilişkili protein islet antijeni 2 (IA2) içerir. GAD sinir dokuları ve pankreatik dokularda glutaminden gamma-aminobutrik asidin (GABA) oluşumunu katalize eden bir enzimdir. İnsanlarda GAD ın iki izoenzimi, molekül ağırlıkları sonrası GAD65 ve GAD67 isimli mevcuttur. Dolayısıyla otoantikorlar her zaman GAD65 karşı yönlendirilir ve çoğunlukla konformasyonel epitoplarla reaksiyona girer. Anti-GAD65 antikorları sadece yeni başlangıç hastalarının %70-80ninde bulunmaz, yetişkinlerde gizli otoimmün diyabet hastalarında (LADA), diyabet-ilişkili poliendokrin hastalıklarında ve bazı nadir nörolojik hastalıklarda, özellikle Stiff Person Sendromunda da (SPS) bulunur. Test prensibi 1:4 seyreltilmiş serum örnekleri spesifik antijenle kaplı mikrotitre plaklarında inkübe edilir. Hastanın antikorları, numunede varsa, antijene bağlanır. Bağlanmayan kısım sonraki aşamada yıkanır. Daha sonra GAD65 biyotini inkübe edilir. Bu aşama esnasında GAD65 otoantikorları plaktaki hareketsiz GAD65 ve sıvı fazdaki GAD65 Biyotini arasında bir köprü oluşturur. Bağlanmayan GAD65 sonraki aşamada yıkanır. Bağlanan GAD65 biyotin miktarı daha sonra biyotine bağlanan streptavidin-peroksidaz (konjugat) eklenmesiyle tanımlanır. Bağlanmayan streptavidin- peroksidaz sonraki aşamada yıkanır. TMB-substratının eklenmesi seyreltilmiş asitle durdurulan bir enzimatik kolorimetrik (mavi) reaksiyon oluşturur (renk sarıya döner). Kromojenden renk oluşum oranı örnekteki ilgili antikorların başlangıç konsantrasyonuyla orantılıdır. Seite 1 von 10

5 Manuel Rev. No. 002 : Kit İçerikleri Öğe Miktar Kapak rengi SULANDIRILACAK Örnek Buffer (5x) 1 x 20ml Beyaz Sarı Solüsyon rengi Yıkama Buffer (50x) 1 x 20ml Beyaz Yeşil GAD65 Biyotin 3 şişe Beyaz - Öğe Miktar KULLANIMA HAZIR Kapak rengi Solüsyon rengi Tanım / İçerikler 5 x konsantre Tris, sodyum klorid (NaCl), bovin serum albumin (BSA), sodyum azid < 0.1% (koruyucu) 50 x konsantre Tris, NaCl, Tween 20, sodyum azid < 0.1% (koruyucu) Rekombinant insan GAD65 e konjuge biyotin; bovin serum albumin (BSA), liyofilize Tanım / İçerikler Sulandırma buffer 1 x 20ml Kırmızı Kırmızı PBS, bovin serum albumin (BSA) Negatif Kontrol 1 x 1ml Yeşil Renksiz Pozitif Kontrol 1 x 1ml Kırmızı Sarı Cut-off Kalibratör 1 x 1ml Mavi Sarı Kalibratörler 6 x 1ml Beyaz Sarı * Konjugat 1 x 15ml Mavi Mavi TMB Substrat 1 x 15ml Siyah Renksiz Durdurma solüsyonu 1 x 15ml Beyaz Renksiz 1M Hidroklorik Asit Mikrotitre plak * Konsantrasyonla artan renk 12 x 8 kuyu stribi N/A N/A GEREKEN AMA SAĞLANMAYAN MATERYALLER Mikrotitre plak okuyucu 450 nm okuyucu filtre ve önerilen 620 nm referans filtre ( nm). Cam eşya (silindir 100- İnsan serumu (seyreltilmiş), bovin serum albumin (BSA), sodyum azid < 0.1% (koruyucu) İnsan serumu (seyreltilmiş), bovin serum albumin (BSA), sodyum azid < 0.1% (koruyucu) İnsan serumu (seyreltilmiş), bovin serum albumin (BSA), sodyum azid < 0.1% (koruyucu) Her kalibratörün konsantrasyonu: 0, 25, 75, 125, 250, 500 IU/ml. İnsan serumu (seyreltilmiş), bovin serum albumin (BSA), sodyum azid < 0.1% Horseradish peroksidaza bağlanmış streptavidin; bovin serum albumin (BSA) Stabilize tetrametilbenzidin ve hidrojen peroksit (TMB/H2O 2) Ayrılabilir mikrokuyularla. Kaplama için paragraf 1 bakın. 1000Ml), dilüsyonlar için test tüpleri. Vortex karıştırıcı, hassas pipetler (10, 100, 200, 500, 1000 µl) veya ayarlanabilir multipipet ( µl). Mikroplak yıkayıcı cihazı (300 µl tekrarlama veya multichannel pipet veya otomatik sistem), emici kağıt. Bizim testlerimiz Amerika Birleşik Devletleri Farmakopesi (USP 26 - NF 21) ve Avrupa Farmakopesi (Eur.Ph.4th ed.) tanımına göre saflaştırılmış suyla kullanılmak üzere tasarlanır. 4 Saklama ve Raf Ömrü Tüm reaktifleri ve mikroplağı orijinal kaplarında 2-8 C/35-46 F da saklayın. Sulandırılmış GAD Biyotini sulandırma gününde kullanılmak zorundadır. Hazırlandığında sulandırılmış solüsyonlar 4 C de 1 ay stabildir. Reaktifler ve mikroplak sadece her bileşende belirtilen son kullanma tarihi içinde kullanılmalıdır. TMB solüsyonunun ışığa yoğun maruziyetinden kaçının. Mikroplakları kurutucu barındıran tasarlanmış folyoda saklayın ve sıkıca kapatın. Seite 2 von 10

6 Manuel Rev. No. 002 : Kullanım Önlemleri 5.1 Sağlık tehlikesi verileri BU ÜRÜN SADECE IN VITRO DIAGNOSTIK KULLANIM İÇİNDİR. Bu nedenle sadece in vitro diagnostik yöntemlerinde eğitimli ve özellikle tavsiye edilen personel kiti kullanabilir. Bu cihaz, özellikle toksik veya amaçlanan kullanım koşullarında tehlikeli olarak kabul edilmemesine rağmen, maksimum güvenlik için aşağıdakilere bakınız: Öneriler ve önlemler Bu kit olası tehlikeli bileşenler içerir. Kit reaktifleri gözler ve cilt için tahriş edici sınıflandırılmasada gözler ve cilt ile temasından kaçınılmasını ve tek kullanımlık eldivenler giyilmesini öneririz. UYARI! Kalibratörler, Kontroller ve Bufferlar koruyucu olarak sodyum azid (NaN 3 ) içerir. NaN 3 yutulursa veya cilt ya da gözler tarafından emilirse toksik olabilir. NaN 3 yüksek oranda patlayıcı metal azidleri oluşturmak için kurşun ve bakır tesisat ile reaksiyona girebilir. Atımda azid birikmesini önlemek için büyük hacimlerde su ile yıkayın. Lütfen CDC ya da diğer yerel/ulusal yönergelerde belirtildiği gibi dekontaminasyon prosedürlerine bakın. Kiti işlerken sigara içmeyin veya birşey yiyip içmeyin. Ağızla pipetleme yapmayınız. Bu kitin bazı reaktifleri için kullanılan tüm insan kaynaklı malzemeler onaylanmış yöntemlerle test edilmiş ve HbsAg, Hepatit C ve HIV 1 için nagatif bulunmuştur. Ancak hiçbir test bu tip malzemelerde viral ajanların tamamen yokluğunu garanti edemez. Bu nedenle kit kontrollerini, standartları ve hasta örneklerini bulaşıcı hastalık geçirme kapasitesine sahipmiş gibi ve ulusal gerekliliklere göre kullanın. Bu kit içerikler tablosunda belirtildiği gibi hayvan kaynaklı malzemeler içerir, ulusal gerekliliklere göre kullanın. 5.2 Kullanım için genel yönergeler Etiketlemede dahil olmak üzere ürün bilgisinin kusurlu veya yanlış olması halinde lütfen test kitinin üreticisi veya satıcısıyla temasa geçin. Farklı lot numaralarına sahip reaktifleri veya mikroplakları karıştırmayın veya birbirlerinin yerine kullanmayın. Bu sonuçlarda değişikliğe yol açabilir. Kullanmadan önce tüm bileşenlerin oda sıcaklığına ulaşmasına izin verin (20-32 C/ F), iyice karıştırın ve en iyi test performansı için önerilen inkübasyon şemasını izleyin. İnkübasyon: Otomatik sistemler için 30 C/86 F da test performansı öneririz. Bileşenleri asla 37 C/ 98.6 F dan daha yüksek sıcaklığa maruz bırakmayın. Substrat solüsyonunu her zaman sadece yeni uçlarla pipetleyin. Bu reaktifi ışıktan koruyun. Konjugatı asla önceden başka reaktiflerle kullanılan uçlarla pipetlemeyin. Kesin klinik tanı sadece test performansının sonuçlarına dayandırılmamalıdır, tüm klinik ve laboratuvar bulguları değerlendirildikten sonra doktor tarafından yapılmalıdır. Bu tanı farklı diagnostik metodlar kullanılarak doğrulanır. Seite 3 von 10

7 Manuel Rev. No. 002 : Örnek Toplama, Kullanma ve Saklama Tercihen taze toplanmış serum örneklerini kullanın. Kanın çekilmesi ulusal gerekliliklere uygun olmalıdır. İkterik, lipemik, hemolize veya bakteriyel olarak kontamine örnekleri kullanmayın. Partikülleri olan serumlar düşük hızda santrifüjleme ile (<1000 x g) temizlenmelidir. Kan örnekleri temiz, kuru ve boş tüplerde toplanmalıdır. Ayrılma sonrası, serum örnekleri ilk 8 saat boyunca kullanılmalıdır, sırasıyla 48 saate kadar 2-8 C/35-46 F da sıkıca kapalı saklanmalı veya daha uzun süreler için -20 C/-4 F da dondurulmalıdır. 7 Test Prosesürü 7.1 Başlamadan önce hazırlıklar Lütfen sadece aynı günde kullanılacak reaktiflerin hazırlanması gerektiğini unutmayın. Konsantre reaktifleri seyreltme: Distile suyla konsantre örnek bufferı 1:5 seyreltin (ör. 20 ml artı 80 ml). Distile suyla konsantre yıkama bufferı 1:50 seyreltin (ör. 20 ml artı 980 ml). Yanlışlardan kaçınmak için farklı kalibratörlerin kapağının işaretlenmesini öneririz. Örnekler: Serum örneklerini örnek buffer (1x) ile 1:4 seyreltin, ör. 225 µl örnek buffer (1x) + 75 µl serum. İyice karıştırın! Sulandırma ve GAD65 Biyotinini seyreltme: Liyofilize GAD65 Biyotinini iki aşamada sulandırın: İlk olarak, bir şişeye 1 ml Sulandırma buffer ekleyin, 5 dakika bekletin ve GAD65 Biyotini tamamen çözülene kadar karıştırın. Kap içinde hiç liyofilize veya sulandırılmış GAD65 Biyotini kalmadığından emin olun. İkinci aşamada 5 ml Sulandırma bufferına 1 ml sulandırılmış GAD65 Biyotini aktarın ve iyice karıştırın. Sulandırılmış GAD65 Biyotin şişesi altı strip için yeterlidir. Eğer bir testte daha fazla strip kullanılacaksa, liyofilize GAD65 Biyotininin iki şişesi sulandırılmalı ve yukarıda belirtildiği gibi seyreltilmeli, daha sonra birleştirilmelidir. İyice karıştırın! Yıkama: 8 kuyu başına 20 ml seyreltilmiş yıkama buffer (1x) veya 96 kuyu için 200 ml hazırlayın, ör.4 ml konsantre artı 196 ml distile su. Otomatik yıkama: Cihazı ayarlamak için gereken fazladan hacmi ve robot pipetinin ölü hacmini hesaba katın. Manuel yıkama: Plağı ters çevirerek kuyulardan sıvıyı atın. Temiz emici kağıt üstünde kuyularla mikrokuyu çerçeveye aşağı taraflı kuvvetlice vurun. Her kuyuya 300 µl seyreltilmiş yıkama buffer pipetleyin, 20 saniye bekleyin. Tüm prosedürü iki kez tekrarlayın. Mikroplaklar: Test için gereken kuyuların sayısını hesaplayın. Kullanılmayan kuyuları çerçeveden çıkartın, sağlanan plastik çantada yerleştirin ve saklayın, kurutucu ile birlikte, sıkıca kapatın (2-8 C/35-46 F). Seite 4 von 10

8 Manuel Rev. No. 002 : Pipetleme Şeması Kalibratörler, kontroller ve örneklerin aşağıdaki gibi pipetlenmesini öneririz: KANTİTATİF yorumlama için KALİTATİF yorumlama için A Kal A Kal E P1 B Kal A Kal E P1 C Kal B Kal F P2 D Kal B Kal F P2 E Kal C PC P3 F Kal C PC P3 G Kal D NC H Kal D NC A NC P2 B NC P2 C CC P3 D CC P3 E PC F PC G P1 H P1 KalA: kalibratör A KalD: kalibratör D PC: pozitif kontrol P1: hasta 1 KalB: kalibratör B KalE: kalibratör E NC: negatif kontrol P2: hasta 2 KalC: kalibratör C KalF: kalibratörf CC: cut-off kalibratör P3: hasta Test Aşamaları Aşam Tanım a 1. Yukarıdaki aşama 7.1 den hazırlıkların pipetleme öncesi yapılmış olmasını sağlayın. 2. İstenen kantitatif/kalitatif yorumlama sonuçlarına uygun olarak aşağıdaki aşamaları kullanın: KONTROLLER & ÖRNEKLER 3. Yukarıda 7.2 de belirtildiği gibi tasarlanan kuyulara pipetleyin, her ikisinden 100 µl: a. KANTİTATİF için kalibratörler (KAL.A - KAL.F) veya b. KALİTATİF yorumlama için Cut-off Kalibratör (CC) ve aşağıdakilerin her birinden 100 µl: 4. Negatif kontrol (NC) ve Pozitif kontrol (PC), ve Hastalar seyreltilmiş serumu (P1, P2...) C/ F da 60 dakika inkübe edin µl yıkama buffer ile 3x yıkayın (seyreltilmiş 1:50). Seite 5 von 10

9 Manuel Rev. No. 002 : GAD65 Biyotin Her kuyuya 100 µl GAD65 Biyotin solüsyonu pipetleyin (yukarıda 7.1 de belirtildiği gibi) C/ F da 30 dakika inkübe edin µl yıkama buffer ile 3x yıkayın (seyreltilmiş 1:50). 9. KONJUGAT 10. Her kuyuya 100 µl konjugat pipetleyin C/ F da 30 dakika inkübe edin µl yıkama buffer ile 3x yıkayın (seyreltilmiş 1:50). 12. SUBSTRAT Her kuyuya 100 µl TMB substrat pipetleyin C/ F da 30 dakika inkübe edin, yoğun ışıktan koruyun. Seite 6 von 10

10 Manuel Rev. No. 002 : DURDURMA Substrat pipetlemedeki gibi aynı sırayı kullanarak her kuyuya 100 µl durdurma solüsyonu pipetleyin. 15. Minimum 5 dakika inkübe edin saniye plağı dikkatlice çalkalayın dakika içinde 450 nm de absorbansı okuyun (önerilen 450/620 nm) Seite 7 von 10

11 8 Kantitatif ve Kalitatif Yorumlama Ürün Ref.: 3606 Manuel Rev. No. 002 : Kantitatif yorumlama için IU/ml cinsinden ilgili konsantrasyon değerlerleriyle ilgili (x-axis) her kalibratörün optik yoğunluğu (OD) (y-axis) işaretlenerek standart eğri belirler. En iyi sonuçlar için log/lin koordinatlarını ve 4-Parameter Fit öneririz. Her örneğin OD sinden IU/mI cinsinden ifade edilen ilgili antikor konsantrasyonlarını okuyun. Standart eğri örneği Normal Aralık Pozitif Sonuçlar < 30 IU/ml > 30 IU/ml Bu örneği hastanın sonucunu yorumlamak için KULLANMAYIN. Kalibratörler IgG OD 450/620 nm CV % (Varyasyon) Hesaplama örneği 0 IU/ml ,5 25 IU/ml ,3 75 IU/ml ,1 125 IU/ml ,2 250 IU/ml ,6 500 IU/ml ,1 Hasta Tekrar (OD) Ortalama Sonuç (IU/ml) P /0.442 (OD) ,39 P / ,09 En yüksek kalibratör aralığının üstündeki örnekler >Max olarak raporlanmalıdır. Uygun şekilde seyreltilmeleri ve tekrar test edilmeleri gerekir. Kalibratör aralığının altındaki örnekler < Min olarak raporlanmalıdır. Lot spesifik verisi için ilişikteki kalite kontrol broşürüne bakın. Medikal laboratuvarlar ulusal düzenlemeler tarafından öngörüldüğü gibi, kendi kontrollerimiz ve/veya dahili toplanmış serumlar kullanılarak in-house kalite kontrol yapabilir. Her laboratuvar kendi teknikleri, kontrolleri, cihazı ve hasta popülasyonuna bağlı olarak, kendi belirlenmiş prosedürlerine göre kendi normal aralığını belirlemelidir. Kontrol değerlerinin kriterleri karşılamadığı durumda test geçersizdir ve tekrarlanmalıdır. Aşağıdaki teknik konular doğrulanmalıdır: (Hazırlanmış) reaktiflerin son kullanma tarihleri, saklama koşulları, pipetler, cihazlar, fotometre, inkübasyon koşulları ve yıkama yöntemleri. Test edilen ögeler anormal değerler veya herhangi sapma türü gösteriyorsa veya açıklanabilir neden olmaksızın doğrulama kriterleri yerine getirilmezse lütfen test kitinin üreticisi veya satıcısıyla temasa geçin. Kalitatif yorumlama için cut-off kalibratör ve hasta örneklerinin optik yoğunluğunu okuyun. Cut-off kalibratörün OD si ile hastanın OD sini kıyaslayın. Daha yüksek OD sahip tüm örnekler pozitif düşünülür, daha düşük OD sahip örnekler negatif düşünülür. Negatif: OD hasta < OD cut-off Pozitif: OD hasta > OD cut-off Seite 8 von 10

12 Manuel Rev. No. 002 : Teknik Veri Örnek materyali: Örnek hacmi: Toplam inkübasyon süresi: Kalibrasyon aralığı: Analitik duyarlılık: Saklama: Tespit sayısı: serum 1x örnek buffer ile 1:4 seyreltilmiş 75 µl örnek C/ F da 150 dakika IU/ml 2 IU/ml 2-8 C/35-46 F da, sadece orijinal şişeler kullanın. 96 test 10 Performans Verisi 10.1 Analitik duyarlılık Tespit sınırı AESKULISA ve 8 kez için 8 düşük negatif örnek üstünde 60 kez örnek buffer test edilmesi 2 IU/ml tespit sınırı verdi Özgüllük ve duyarlılık Mikrotitre plak rekombinant insan GAD65 ile kaplanır. Başka otoantijenler için çaprazreaktiviteler bulunmamıştır. GAD65 otoantikorlarının diagnostik özgüllüğü 97.8% dır. GAD65 otoantikorlarının diagnostik duyarlılığı 76% ye kadardır. [1] 10.3 Doğrusallık Seçilen serumlar bu kitle test edilmiş ve doğrusal olarak seyreltme için bulunmuştur. Ancak, insan otoantikorlarının heterojen doğası nedeniyle bu kurala uymayan örnekler olabilir. Örnek No. 1 Dilüsyon Faktörü 1 / 4 Ölçülen (IU/ml) 401,86 Beklenen (IU/ml) 408,00 Geri Kazanım 98,50 (%) 1 / 8 210,25 204,00 103,06 1 / ,09 102,00 103,03 1 / 32 52,49 51,00 102, / 4 128,71 130,00 99,01 1 / 8 63,76 65,00 98,09 1 / 16 31,36 32,50 96,49 1 / 32 15,09 16,25 92,86 Seite 9 von 10

13 10.4 Kesinlik Ürün Ref.: 3606 Manuel Rev. No. 002 : Testin kesinliğini belirlemek için değişkenlik (intra ve inter-test) standart eğri üzerinde bir aralık temsil etmek üzere seçilen üç serum örneğinde kendi tekrarlanabilirliği incelenerek değerlendirildi. Intra-test Örnek No. Ortalama CV (%) 1 (IU/ml) 812,91 4,4 2 16,60 7,6 3 45,87 7, ,45 7,6 5 64,94 8,3 Inter-test Örnek No. Ortalama CV (%) 1 (IU/ml) 812,91 6,2 2 16,60 8,4 3 45,87 8, ,45 13,9 5 64,94 13, Kalibrasyon AESKULISA, WHO referans reaktifi NIBSC kod 97/550 karşı kalibre edilir. 97/ Literatür Chen S, Willis J, Maclean C, Ananieva-Jordanova R, Amoroso MA, Brooking H, Powell M, Collins A, Bennett S, Mitchell S, Burne P, Furmaniak J, Smith BR (2005). Sensitive nonisotopic assays for autoantibodies to IA-2 and to a combination of both IA-2 and GAD65. Clin Chim Acta.357 (1): Törn C, Mueller PW, Schlosser M, Bonifacio E, Bingley PJ; Participating Laboratories (2008). Diabetes Antibody Standardization Program: evaluation of assays for autoantibodies to glutamic acid decarboxylase and islet antigen-2. Diabetologia 51 (5): Lan MS, Wasserfall C, Maclaren NK, Notkins AL (1996). IA-2, a transmembrane protein of the protein tyrosine phosphatase family, is a major autoantigen in insulin-dependent diabetes mellitus. Proc Natl Acad Sci U S A.; 93 (13): Van den Driessche A, Eenkhoorn V, Van Gaal L, De Block C (2009). Type 1 diabetes and autoimmune polyglandular syndrome: a clinical review. Neth J Med. 67(11): Winter WE, Harris N, Schatz D (2002). Type 1 diabetes islet autoantibody markers. Diabetes Technol Ther 4(6): [1] Winter WE (2015). IASP The current workshop and planning of future workshops. Presented at the 14th International Congress of the Immunology of Diabetes Society (12-16 April 2015, Munich, Germany). [1] Lampasona V, Williams AJK, Schlosser M (2015). Results of the IASP 2015 Workshop. Presented at the 14th International Congress of the Immunology of Diabetes Society (12-16 April 2015, Munich, Germany). Seite 10 von 10

14 - İn vitro diagnostik kullanım içindir Katalog numarası Lot EC Uygunluk Beyanı 96 test Kullanım talimatlarına bakın Tarafından kullanılır 2-8 C de (35-46 F) saklayın Tarafından üretildi

15 Cut off Kalibratör Pozitif Kontrol Negatif Kontrol Kalibratör Geri kazanım Konjugat Kaplı mikrotitre plak Yıkama buffer Substrat buffer Durdurma solüsyonu Örnek buffer GAD65 Biyotini ilavesi