KULLANIM KLAVUZU. ANA-HEp-2. Döküman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Rev.: 011: Sayfa: 1 / 17

Transkript

1 TÜRKÇE

2

3 Döküman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 1 / 17 KULLANIM KLAVUZU ANA-HEp-2 Standard Ref. Açıklama Test ANA-HEp-2 (12 kuyucuk) ANA-HEp-2 (12 kuyucuk) 120

4 Döküman: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 2 / 17 ANA-HEp-2 Ref. Açıklama Test ANA-HEp-2 (12 kuyucuk) ANA-HEp-2 (12 kuyucuk) Demo ANA-HEp-2 (12 kuyucuk) Demo kit Demo ANA-HEp-2 (12 kuyucuk) Demo kit KULLANIM AMACI AESKUSLIDES ANA-HEp-2 insan serumunda, nükleer ve/veya stoplazmik antikorların tespiti için indirekt immunfloresans tahlilidir. Bu tahlil, lupus erythematosus (SLE), karma bağ dokusu hastalıkları (MCTD), scleroderma, Sjögren s syndrome (SS), polymyositis ve dermatomyositism gibi sistemik romatik hastalıkların ayırıcı tanısında bir araçtır. 2. KLİNİK UYGULAMALAR Sitoplazmik ve nükleer antijen çeşitlerine karşı antinükleer antikorlar (ANA), sistemik romatizmal hastalıklarda yüksek sıklıkta görülür. Örneğin, SS-A (Ro) ve SS-B (La) antikorları Sjögren s syndrome ile ilişkilidir, anti-dsdna (anti-ndna), anti-sm, anti-histone ve antinucleozomlar SLE (systemic lupus erythematosus) ile ilişkilidirler. Anti-RNP antikorları karma bağ dokusu hastalıkları (MCTD) ve SLE ile, anti-scl-70 polymyositis ve dermatomyositis ile, anti-centromere antikorları CREST syndrome ile ilişkilidirler. Detaylı bilgi için aşağıdaki Bölüm 4'e bakınız. Örneğin HEp2 gibi ökaryotik hücreler üzerinde indirekt immünoflüoresans testi (IFT) ANAs tespiti için yerleşmiş bir yöntem olmuştur. IFT hassas bir testtir ancak, test edilecek hasta numune sayılarının çokluğu, insan yorumlamasından ve florasan mikroskop çeşitliliğinden gelen hatalar nedeniyle zahmetlidir. Tek antikor özgünlüğü, ANAs ın güvelilirliği ve basitliği için spesifik hedef antijenler kullanılarak daha spesifik olan ELISA kullanılması ile belirlenmiştir. Antigen Kareskterizasyonu: HEp-2 hücreleri Çapraz reaktivite : Çapraz reaktiviteler bilinmiyor. Antikorların tespiti indirekt immünfloresans tahlil prensibine dayanmaktadır(iifa). Cam mikroskop slaytları, doku kesitleri veya hücreler (HEp-2 hücreleri (ANA), Granülositler(ANCA) veya Crithidia luciliae (ndna) ile kaplıdır. Eğer hasta serumu spesifik antikorları içeriyorsa, ilk inkübasyon esnasında bağlanacaklardır. Yıkama aşamalarındaki bağlanmayan metaryallerin uzaklaştırılmasından sonra, bağlanan antikorlar ikinci inkübasyon esnasında Fluorescein konjuge anti-human immunoglobulinler vasıtasıyla tespit edilirler. Antijen-antikor kompleksinin spesifik yeşil floresan renklenmesi, bir floresan mikroskop yardımıyla gözlenebilir.

5 Döküman: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 3 / KİT PROSEDÜRÜ Ayrıntılı talimatlar için Genel Talimatlarda listelenen Test Prosedürüne, Bölüm 11, bakınız ANA-HEp-2 kitleri için, aşağıdaki ayrıntılar kullanılmalıdır: Boyama süresi sayacı: saniye Önerilen tarama titresi: o Yetişkin numunleri için 1:80 o Pediatrik numuneler için 1:40 4. YORUMLAMA HEp-2 gırtlak kanseri olan hastanın doku kültüründe,insan epitel hücresidir. Substrat, homojen bir hücre büyümesini sunmaktadır ve herhangi bir hücre-dışı yardımcı madde yoktur. Örneklerin mitotik hücrenin değerlendirilmesi için nükleer şablonlar olarak tarif edilirler ve daha kesin olarak tanımlanabilirler. Uygun son titre, basit pozitif floresans gösteren hasta serumundadır. Değerlendirilme, her zaman pozitif ve negatif kontrol ile yapılmalıdır. 1:40 (çocuklar) ve 1:80 (yetişkinler) veya belirsizlik ile, titreli hücre çekirdeğinin zayıf floresan arasındaki klinik sonuçlar kontroller ile kontrol edilmelidir. Böyle bir durumda, numuneler yaklaşık her 6 haftada bir alınmalıdır ve benzer bir şekilde test edilmelidir Membranous nuclear (membranoz nükleer)şablonlar Smooth membranous nuclear (pürüzsüz mebranoz nükleer) şablon Pürüzsüz homojen halka benzeri floresan interfaz hücrelerindedir. Güçlü antikorlar ile bazı numuneler, tam nükleer boyama izlenimi verebilirler. Benzer bir model telofaz hücrelerde görülmektedir. Metafaz hücrelerdeki floresan, sitoplazmada yaygın olarak lokalize olmuştur ve kromozal materyal lekesizdir Punctate membranous nuclear (noktasal membranoz nükleer) şablon Çekirdek zarı boyunca kesintili noktasal floresan verir. Çekirdek noktalı boyama yoluyla odaklanma,tüm çekirdeğin yüzeyi üzerinde görülebilir. Benzer bir model telofazda görülür.metafaz hücrelerdeki floresan, sitoplazmada yaygın olarak lokalize olmuştur. Güçlü antikorlar ile bazı numuneler tam nükleer boyanma izlenimi verebilir. 4.2 Nucleoplasmic şablonlar Homojen nükleer şablonlar Bazen nükleer periferinde vurgulu olan tüm nucleoplasmı kapsayan yaygın floresans formu, farklı antikorlarla ilişkili olabilirler, esas olarak kromozomal bileşenlere yöneliktirler. (DNA, histones v.b.). Bazı durumlarda, çekirdeğin iç kenarında (nuclear rim) daha yoğun bir boyanma görülebilir. Bazı numuneler, ek olarak periferal nükleer boyanma görünümünde görülebilir. Nükleer boyanma değişkendir. Metafazda, homojen ya da periferal kromatin boyanma görülmektedir. İki zayıf farklı boyanma ayırt edilebilir: - Homojen nükleer boyalı,homojen nükleer şablon. -Negatif çedekçikli, homojen nükleer şablon. 1 Wiik A. Scand J Rheumatol 2005; 34:260-8.

6 4.2.2 Benekli nükleer şablonlar Döküman: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 4 / 17 Birçok farklı benekli nükleer şablon bulunabilir, ama ayırt etmek zor olabilir. Yedi şablon makul bir doğrulukla ayırt edilebilir. Metafaz kromozomları altısında negatif, sentromer şablonda pozitiftir Büyük benekli nükleer şablon (nuclear matrix) (SC35) Nucleoplasm boyunca değişken büyük benekler, -büyük olasılıkla interchromatin granules boyanması nedeniyle- daha önceleri nuclear matrix boyanma olarak adladırılmışlardır. Çekirdekçik negatiftir. Metafaz ve telofazda sitoplazma, dağınık olarak lokalize olmuş benekler ve negative kromatin plateletler gösterir Kalın benekli nükleer şablon Yoğun dağılmış değişik boyutlu benekler, genellikle interfaz hücrelerinin nucleoplasmı içindeki büyük benekler ile ilişkilidirler. Çekirdekçik negatiftir. Metafaz ve telofaz sitoplazma, kendisi negatif olan kromatin platelet etrafında yoğunlaşması ile benekler içerir. Bu şablon, en sık olarak uç birleştirme boyanması ile ilişkilidir İnce benekli nükleer şablon Muntazam bir dağılım içinde ince benekli boyama, bazen çok yoğun bazen de neredeyse homojen şablonda elde edilmiştir.çekirdekçik pozitif (özellikle anti-ssb/la antikorlar ile) veya negatif. Metafaz sitoplazma hücreleri ince benekler ve kendileri negatif olan kromatin plateletleri etrafında yoğunlaşmayı gösterir. Telofaz hücrelerinin çekirdekçiği pozitif, bazen de İnterfaz hücrelerinden daha güçlü boyanmış olabilir Grenli Scl-70-benzeri şablon Genellikle pozitif çekirdekçik vurgulu, telofaz ve metafaz hücrelerinin koromozomal alanlarının ve nucleoplasm muntazam ince grenli boyanması. Bu boyama düşük büyütmede homojen görübebilir. Bu boyama, yalnızca anti-scl-70 pozitif serumları ile görülmez Pleomorfik benekli nükleer şablon Çoğalan hücrelerin çekirdekçikleri ( S-fazı), nucleoplasmın inceden çok kalına düzensiz beneklerinden gelen benek çeşitliliği gösterirler. (Hücre hazırlamaya bağlı olarak hücrelerin %10-50). Bazı hücrelerdeki çekirdekçik dahi boyanır. Durağan (G-Faz) ve metafaz hücreleri negatiftir. Bu şablon anti-pcna olarak da bilinir (anti-proliferating hücre nükleer antijeni), genel olarak, diğer şablonlar ile birlikte görülmektedir Centromere şablon Tüm nükleus boyunca bulunanların aksine farklı benekler (her nükleusta benek). Telofaz ve metafaz hücreleri her zaman yoğunlaşmış kromozomal materyalde bu benekleri gösterirler.bu şablon, çok sayıda centromere proteinini(cenp-a,b,c,d,e) tanıyabilen Kromozom kinetokor antikorları tafarından üretilir Çoklu nükleer noktalar (NSp-1) Her nükleer taban boyama başına 5-10 nokta, genellikle PML cisimleri diye adlandırılan (promiyelositik lösemili onların bariz ifadeleri nedeni ile), metafaz ve telofaz hücre kromozomları negatiftir.

7 Döküman: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 5 / Sarmal kütle şablonu (birkaç nükleer nokta) Nucleoplasmda bulunan nükleus başına 2-6 nokta, genellikle yalın çekirdekçikde.metafaz veya telofaz kromatin plakalarda boyanma yoktur. 4.3 Nucleolar şablonlar Homojen nucleolar şablon Bu şablon, tüm çekirdekçikte yayın muntazam floresans gösterir, kromozomlarda hiçbir boyanma göstermez Kümeleşmiş nucleolar şablon Parlak kümeleşmiş büyük granüller, sarılmış cisimler olarak çekirdekçik fibriler merkezlerinin yerine tekabül ederler. Mitotik hücrelerde metafaz ve telofaz plaka floresan düzensiz "fan benzeri" kenar görünüme sahiptir Noktasal nucleolar şablon Küçük ayrı taneler, esas olarak çekirdekçik merkezindedirler. Metafaz hücrelerinde 2-5 ayrı benek kromatin formda görülür,nükleolar organize bölgelerine karşılık gelirler. 4.4 İğ (mil) aparat şablonları Centriole (centrosome) iğ şablonu Metafaz iği, birbirine dikey uzanan aks kutuplarının her birinde ayrı bir floresan nokta gösterir.çekirdeğe yakın olan bir veya iki parlak nokta fazlar arası hücrelerin sitoplazmasında görülür İğ kutup şablonu (NuMA) Boyanma sadece metafaz hücrelerinde iğin kutup alanınındadır (üçgen veya muz şeklindeki şablon). İğ lifler, telofaz hücrelerinde daha doğrusal bir şablon ile negatiftir. Negatif çekirdekçikli ince benekli nükleer şablon, genellikle durağan ve telofaz hücrelerinde görülür, ancak bunlar da negative olabilir İğ lif şablonu Metafaz hücrelerindeki kromatin plakasına kutup olan tüm iğ lif aparatlarının boyanması. ve bölünen hücre kromozmlarında boyanma yoktur Midbody şablonu(msa-2) Profaz ve metafaz hücrelerindeki floresans, kromozomal bölgede metafaz plakanın kenarına dik ince çizgiler halinde lokalizedir. Telofazda boyanma, bölünme çizgisi ve cytokinesis tamamlanan hücreler ile sınırlı bağlantılı midboy arasında ile sınırlandırılmıştır. S ve G2 fazı hücreleri farklı veya yamalı nükleer benekler ile boyanamıştır. Bu şablon, MSA-2 antijen (mitotik iğ Antigen2) antikorlarından kaynaklanmaktadır CENP-F şablonu En karakteristik özellik, genellikle bir fermuar gibi görünen, kromozomal metafaz plakayı çevreleyen yoğun büyük granüllerin iki grubu tarafından oluşturulan şablondaki metafaz hücrelerinde görülür. Bu granuller centromerenin bir parçasıdır. Çevreleyen sitoplazma yaygın boyanmıştır. Profaz hücrelerde kromozomlar yoğun noktalı görülür. Çok ince yoğun nükleer benekli şablon, birkaç interfaz hücresinde görülebilir. Bu şablon, centromere proteine(cenp- F) özdeş olabilen MSA-3 antijeni (mitotik iğ Antigen3) antikorlarından kaynaklanmaktadır. 4.5 Cytoplasmic fluorescence patterns İnce benekli cytoplasmic şablon İnce granüller bazen parlak yıldız kümesi gibi bir görünüm üreten, hücrenin çevresine doğru daha belirgin hale gelen, sitoplazma boyunca dağılmışlardır. Çekirdek veya çekirdekçikte boyanma yoktur. Bu şablon trna synthetases antikorlarının karakteristiğidir.metafaz hücrelerde kromozomal materyal negatiftir.

8 Döküman: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 6 / Yaygın cytoplasmic şablon Homojen boyanma veya bulutlu modeli kapsayan kısım veya tam sitoplazmada çok ince yoğun granüler görülmektedirler. Çekirdekte boyanma yoktur, ancak eğer öncüleri çekirdekçikte bulunan ribozomal RNA proteinine yönelik antikorlar ise çekirdek homojen boyanmış olabilir. Metafaz hücrelerde kromozomal materyal negatiftir Mitochondrial benzer şablonu Bir ağsı örgüde, sitoplazma boyunca çekirdekten uzanan daha büyük düzensiz granül. Başlıca ayırt edilen antijen küme M2, dört büyük mitokondri iç membran proteinlerinden oluşmaktadır. Çekirdek ve çekirdekçik negatiftir, fakat kuvvetli pozitif serumlar, benekli nükleer boyanma bir izlenimi verebilirler Lysosomal benzeri şablon Sitoplazma boyunca düzensiz dağılmış orta ya da büyük organeller, lysosomes veya peroxysomes gibi organellere yönelik antikorlar nedeniyle olabilir.çekirdek ve çekirdekçik negatiftir, fakat bölünen hücrelerinin sitoplazması, yaygın boyanma Golgi benzeri şablon Düzensiz büyük granül oluşumu ve çekirdeğe bitişik polar organel boyanması. Çekirdek ve çekirdekçik negatiftir. Kromozomal malzeme etrafında vurgulama ile bölünme hücreleri sitoplazmasınında yaygın boyanma Actin benzeri şablon Sadece plazma membranı altında basit merkez düzlemde yeralan gergin lifler boyalı. Çekirdek, çekirdekçik ve metafaz kromozomlar negatiftir. Plazma membranına yakın hücrenin bütün uzunluğu kapsayan Aktin kabloları, hücre membranında da dendrit benzeri uzantıları görülebilir Vimentin benzeri şablon Bütün sitoplazma boyunca uzanan çok ince liflerin boyanması, bir sarmal şeklinde çekirdeklerin etrafında agregare olmuş yığının yanı sıra radyal lif ağı. Çekirdek ve çekirdekçik negatiftir. 4.6 Negatif Negatif (örnek 1) Fiilen çekirdek veya sitoplazmanın yeşil olmayan floresanı görülebilir. Kongugat agregasonunu temsil eden alanda görünen tek veya düzensiz yeşil noktalar.hücresel yapılar kahverengimsi görünebilir (örn. çekirdek), özellikle eski slayt hazırlıklarında veya anti-fading ajanlar ile mevcutlarda. Hücre atıkları(yıkıntıları) suni yeşilimsi floresan noktalara yol açabilir Negatif (örnek 2) Çekirdeklerin çok soluk yeşilimsi floresanı; sitoplazma veya zayıf pozitif numunenin altında bulunan yoğunluk. Eğer serum zayıf ANA pozitif ise herbir günlük çalışmaya net bir ANA negatif kontrol serumu yanısıra kesin bir ANA pozitif kontrol serumu gibi hassas bir kontrol serumu dahil edildiğinde, en iyi değerlendirmeye ulaşılabilir.

9 Döküman: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 7 / Karara bağlanamayan Taksonomi sınıflandırmasına dahil edilmeyen, hücre içi organeller veya yapılarla ilişkili olan herhangi diğer boyama şablonu. 4.8 EK Laboratuarlar, ANA substrat çoğunlukla gözden kaçan floresan şablonlar için (Örn: pleomorfik benekli nükleer şablon, sentromer şablon, çoklu nükleer noktalar, sarmal yapılı nülkeer noktalar, bazı nükleolar ve çoğu sitoplazmik şablonlar) hayvan dokularının yani kemirgen böbreği veya cigerinin kriyostat kesitlerini kullanırlar. İğ aparatları ile ilişkili şablonlar benzer görülmez. Mitokondrial benzeri şablon, eskiden hayvan böbrek kesitlerinde saptanan, kalın benekli şablon olarak birçok dokuda görülebilir. Pürüzsüz nükleer membran şablon genellikle sıçan karaciğerinde çok net görülür. Pozitif ANA veya HEp-2 hücreleri için cut-off değeri genellikle 1:100 ün üzerindedir, oysaki cut-off değeri doku kesitlerinde genellikle düşük dilüsyondadır. Kesin boyama şablonları, genellikle tek serumda örneğin mitokondrial benzeri şablon ile birlikte çoklu nükleer noktalar ve homojen nükleer, kalın veya ince benekli nükleer şablon (her ikisi de sistemik lupus eriematos için karakteristiktir) ile birlikte pleomorfik benekli nükleer şablon ile birlikte farkedilirler. Ayrıca sentromer şablon, yaygın mitokondrial benzeri şablonu ile birlikte görülür.bazı laboratuar ve kitlerin FITC-konjugat kullanımının, tüm Ig sınıfına yönelik olduğu unutulmamalıdır. Mevcut sözlük IgG-spesifik konjugat bulgularına dayanmaktadır.

10 Döküman: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 8 / SPESİFİK PERFORMANS KARAKTERİSTİKLERİ Yüzotuzsekiz donmuş örnek AESKUSLIDES ın ve diğer başka bir ticari firmanın iki lotunda test edilmiştir. Bu klinik örneklerin 118 i romatizmal hastalıklar için değerlendirilen ve birkaç yıldır saklanan örneklerdir. Geri kalan 20 örnek uygun sağlıklı örneklerdir. Bu sağlıklı numuneler romatizmal hastalık klinik semptomları bilinmeyen popülasyondandır. Bu iki kitin kıyaslanması, iki bağımsız firmanın ANA HEp-2 sistemleri arasında şablon tutarlılığı dahil kıyaslanabilirliğini göstermiştir. a. Table 1: Güven Aralıkları Kombine Veri Seti Doğrulama Pozitif Negatif Toplam Pozitif AESKUSLIDES Negatif ANA HEp-2 Toplam Positif % Uyuşum = 116/116 = 100% (95 th % CI: %) Negatif % Uyuşum = 22/22 = 100% (95 th % CI: %) b. Table 2: AESKU ve doğrulama arasında Kombine Veri Seti Şablon Karşılaştırma N =144 2 Şablon n Doğrulama AESKUSLIDES Homogenous(homojen) Speckled (Benekli) Nucleolar (nükleer) Centromere(sentromer) Peripheral(periferal) Nuclear Membrane (nükleer membran) Klinik örnekler, SLE, Skleroderma, Skleroderma_CREST, Sjogren's, MCTD, Anti-posfolipid Sendromu, Romatoid Artrit, Polimiosit/dermatomiosit, ilaca bağlı SLE dahil olmak üzere otoimmun hastalıklarının tam spektrumundadır. 5.1 Tekrarlanabilirlik ve Kesinlik Üç değişik AESKUSLIDES lotu, şablonları komple kapsayan 15 serum numunesi ile test edildi. Bu örnekeler 1:40 tan 1:10240 kadar dilüe edildi ve herbir dilüsyon, bütün üç lotta iki bağımsız okuyucu tarafından analiz edildi. Kabul kriteri +/- 1 floresan yoğunluk değişimi idi. Kabul kriterleri, bütün numuneler, bütün lotlar, bütün dilüsyonlar ve tüm bağımsız okuyucular için bir araya getirilmiştir. Daha detaylı bilgi için talepte bulunun. 2 Tablo 2 deki N=144 ile Tablo 1 deki N=138 arasındaki tutarsızlık, bazı örneklerin şablona sahip olmaması(örn : örnek #5) ve bazı örneklerin iki şablona (örn: örnek #2) sahip olmasın durumundan kaynaklanmıştır. Tablo 2, sadece şablon sayısını ifade eder.

11 Döküman: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 sayfa: 9 / VERİ YORUMLAMA TABLOSU ANA-HEp2 Tarih: Lot.: Slayt No.: Operator: Kuyucuk No. 1 ID Dilüsyon faktörü F.I. Chromosomes (mitosis) Nucleoplasm Nucleolus cytoplasm autoantibodies düşünceler

12 Döküman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 10 / STANDART KİT İÇERİĞİ 7.1 STANDART KİTLER SLAYTLAR (10x her kitte) KONJUGAT (1x 4 ml) POZİTİF KONTROL (1x 0.5ml) Kit Ref. Kit Açıklaması Ref. Kuyucuk Kaplama mad. Ref. Açıklama Ref. Açıklama ANA-HEp-2 (12 kuyucuk) ANA-HEp-2 (12 kuyucuk) s ANA-Hep-2 Hücreleri C C IgG mavi kapaklı: açık mavi renkli solüsyon. İçerik: BSA, Fluorescein (FITC) etiketlenmiş Anti-human Antibody IgG mavi kapaklı: açık mavi renkli solüsyon. içerik: BSA, Fluorescein (FITC) etiketlenmiş Anti-human Antibody (H+L) PC PC ANA şablon kontrol (Homojen) Kırmızı kapaklı: renksiz solüsyon. içerik: insan serumu (dilute), sodium azide <0.1% (koruyucu) ANA şablon kontrol (Homojen)) Kırmızı kapaklı: renksiz solüsyon. içerik: insan serumu (dilute), sodium azide <0.1% (koruyucu) (H+L) NOT: Geri kalan kit bileşen içerikleri örn : ortak reaktifler (Neg kontr, ortam vasatı, v.s) aşağıda 8. kısımda ORTAK REAKTİF İÇERİKLERİNDE açıklanmıştır. 7.2 DEMO KİTLERİ Demo kit içeriği için, karşılık gelen analiz sertifikasına bakın.

13 Dökünman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 11 / ORTAK REAKTİF İÇERİKLERİ c. Ortak Reaktifler Ref. Reaktif Miktar/hacim Açıklama Kullanıma Hazır NCIFA Negatif Kontrol 1x 0.5ml * EBIFA Evans Mavis 0.2% 1x 3ml MMIFA Ortam Vasatı 1x 8ml Yeşil kapaklı: renksiz solüsyon. İçerik: İnsan serumu(dilute), sodium azide <0.1% (koruyucu) Beyaz kapaklı: Mavi renkli solüsyon İçerik: PBS, Evans Mavisi. Dilute Evans Mavisi 1x WBIFA da0.2% 1:3000 HELMED Ile kullanım için valide edilmiştir Beyaz kapaklı: renksiz solüsyon içerik: PBS, Glycerin. EVET HAYIR EVET Beyaz kapaklı: renksiz solüsyon WBIFA Yıkama tamponu (10x) 1x 100ml Konsantre tamponu 1:10 oranında distile sı ile dilüe edin. (örn.: 100 ml ml). içerik: BSA, PBS,sodium azide (koruyucu). HAYIR SBIFA Numune Tamponu (1x) 1x 100ml Miktarlar kutu başınadır. (*)ayrı sipariş edilmelidir. d. Kit ile sağlanmayan, gerekli malzemeler Beyaz kapaklı: renksiz solüsyon Hasta serumunun dilüsyonu için içerik: BSA, PBS,sodium azide (koruyucu). EVET 1. Distile su 2. Numune dilüsonu için tets tüpü 3. Ölçüm şişesi 4. Volümetrik pipet 5. Zamanlayıcı 6. FITC sistemli Floresans mikroskobu, (490nm uyarı filtresi, 510nm bariyer filtesi) 7. İnkübasyon tepsisi 8. Boyama tablası 9. Pipet ucu 10. Lameller (24x60 mm) 11. Sıkılabilir yıkama şişesi Etiketleme dahil ürün bilgilerinin eksik veya yanlış olması halinde, lütfen üretici firmayla veya kit sağlayıcınızla irtibata geçiniz.

14 Dökünman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 12 / MUHAFAZA VE RAF ÖMRÜ Bütün reaktifleri 2 C-8 C/35-46 Fde, yoğun ışıktan koruyarak muhafaza edin. Her bileşenin son kullanma tarihi, ilgili etiket üzerinde belirtilmiştir. Son kullanma tarihi geçen reaktifleri kullanmayın. Bütün reaktifleri ve slaytları kendi original kaplarında 2-8 C/35-46 F de muhafaza edin.açılmış ve sulandırılmış (işlem görmüş) solüsyonlar 2-8 C/35-46 F de en az bir hafta satabildir. Reaktifler ve slaytlar sadece her bir bileşenin belirtilen son kullanma tarihine içinde kullanılmalıdır. 10. KULLANIM ÖNLEMLERİ e. Sağlık Tehlike verileri BU ÜRÜN SADECE IN VITRO DIAGNOSTIC İÇİNDİR. Bu nedenle, kitin performansı için, sadece eğitimli personel ve özellikle in vitro diagnostic metodları, tavsiye edilir Bu ürün, amaçlanan kullanım koşullarında, özellikle toksik veya tehlikeli olarak kabul edilir olmasa da maksimum güvenlik için aşağıdakilere bakınız: Öneriler ve Önlemler Bu kit potansiyel tehlikeli bileşenler içerir. Kit reaktifleri her ne kadar göz ve cilt için tahriş edici olarak sınıflandırılmamış olsa da, reaktiflerin gözle temasından kaçınılması ve atılabilir eldiven giyilmesi önerilir Kit içerisindeki tüm insan kaynaklı reaktifler (kontroller v.b) onaylı yöntemlerle test edilmiş ve HbsAg, Hepatit C ve HIV 1 için negatif sonuç bulunmuştur. Bununla beraber; hiçbir test bu tür malzemelerin içerisinde viral ajanların tamamen olmadığı garanti edemez. Bu nedenle, ulusal düzenlemelere göre kontroller, standartlar veya hasta numuneler bulaşıcı hastalıkları taşıma riskli olarak ele alınmalıdır. Kit içerik tablosunda belirtilen hayvansal kaynaklı malzemeler (BSA immunoglobulin) ulusal düzelmemelere göre işlenmelidir. f. Genel Kullanım Talimatları 1. Ağzınızla pipetleme yapmayın. Kit çalışırken sigara içmeyin, herhangi bir şey yemeyin veya içmeyin. 2. Farklı lot numaralı reaktifleri karıştırmayın veya virbirinin yerine kullanmayın.bu sonuç farlılığına neden olabilir. 3. Bakteriyal kontaminasyonu önlemek için kullanım sonrası tüm şişeleri sıkıca kapatın. 4. Bütün solüsyonları yeni steril pipet uçlarıyla pipetleyin. 5. Bileşenleri 37 C / 98,6 F tan yüksek sıcaklığa maruz bırakmayın. 6. Tüm prosedür boyunca slayt kuyucuklarının kurumasına izin vermeyin. 7. Slaytları dondurmayın. Her laboratuar kendi normal aralıklarını, kendi prosedürlerine bağlı olarak, kendi kontrollerine, tekniklerine, techizatına ve hasta populasyona bağlı olarak oluşturmalıdır. Kesin klinik tanı, sadece yapılan test sonuçlarına dayandırlmamalı, tüm klinik ve laboratuvar bulguları bir hekim tarafından değerlendirilmiş olmalıdır. Tanının doğrulanması için farklı teşhis metodları kullanılmalıdır.

15 Dökünman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 13 / 17 Kontrol değerlerinin kriterlere uymadığı durumlarda test geçersizdir ve tekrarlanmalıdır. Aşağıdaki teknik konuların doğruluğu kanıtlanmış olmalıdır: Reaktiflerin (hazırlanmış) don kullanım tarihleri, Muhafaza koşulları, pipetler, cihazlar, fotometre, inkübasyon koşulları ve yılama yöntemleri. Test edilen öğeler, açıklanabilir bir sebep olmaksızın, anormal sonuçlar veya herhangi bir sapma gösteriyorsa, lütfen yerel temsilcimiz ile irtibata geçin. 11. NUMUNE TOPLAMA, İŞLEME VE MUHAFAZA Numunelerin Hazırlanması: Tercihen yeni toplanmış( alınmış) serum örnekleri kullanın. Kan almada Ulusal yönergeler takip edilmelidir.kan numunelerini aseptik koşullarda toplayın. Lipemik, ikterik, hemolize veya mikrobiyal kontaminasyonu olan örnekler etkileşime neden olabilirler. Serumdaki partiküller düşük hızlı santrifüjleme ile (<1000 x g) giderilmiş olmalıdır. Kan örnekleri temiz, kuru ve boş tüpler ile toplanmış olmalıdır. Santrifüj işleminden sonra serum numuneleri ilk 8 saat içerisinde kullanılmalıdır veya numuneler ayrı ayrı ve sıkıca kapatılarak, 48 saate kadar kullanım için 2-8 C/35-46 Fde muhafaza edilmeli, veya daha uzun süreli kullanımlar için -20 C/-4 F de dondurulmalıdır. Tekrar tekrar dondurup çözmekten kaçının. 12. TAHLİL PROSEDÜRÜ g. Pipetleme öncesi hazırlık Testin optimum performansı için, tüm bileşenleri kullanım öncesi oda sıcaklığına getirin (20-26 C / 64-78,8 F ), iyice karıştırın ve önerilen inkübasyon şemasını takip edin. 1. Yıkama tamponu hazırlanması: Konsantre tamponu 1:10 oranında distile su ile dilüe edin. 2. Numune hazırlanması: Hasta serumu (Tarama titresi için kullandığınız ürünün referansına göre yukarıdaki Kit Prosedür bölümüne bakın) 1x numune tamponu. HEp-2, ndna, rlks, EMA v.b arasında değişmektedir. 3. Kontroller kullanıma hazırdır. 4. Protokol hazırlığı: Veri yorumlama sayfaları kullandığınız ürünün referansına göre Kit Prosedürü bölümünde mevcuttur.

16 Dökünman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 14 / 17 h. Test Prosedürü No. 1. Basamak Açıklamaları Gereken slaytı(slaytları) torbasından (torbalarından) çıkarın ve işaretleyin.kuyucuklara dokunmayın. Slaytların kurumasına izin vermeyin. İnkübasyon tepsisinin hazırlanması: Küçük bir hacim deiyonize ya da distile suyu inkübasyon tepsisine yerleştirin ne salytı (slaytları) destek üzerinde inkübasyon tepsisine yerleştirin. Slaytı (slaytları) nemli inkübasyon tepsisinde oda sıcaklığında 30 dakika± 10 inkübe edin. Konjugat için uygun inkübasyon sürelerini kullanın İlk İnkübasyon: Yeterli hacimlerde dilüe serumu ve kontrolleri (controller kullanıma hazırdır) uygun kuyucuklara pipetleyin, pipetin slayt yüzeyi ile direct temasından kaçının. Her bir kuyucuğun uyan serum ile tamamiyle kaplanmış olduğundan emin olun. Kuyucukların tamamen kaplanması için gerekli test malzemesinin kullanılması önemlidir. Ancak kuyucuklar arasında bir bulaşma yada benzer temasların olmasından kaçının, bu yalnış sonuçlara neden olabilir. Yıkama:İnkübasyon sonrası slaytları inkübasyon tepsisinden çıkartın ve sıkılabilir yıkama şişesi kullanarak yıkama tamponu ile kısaca durulayın. Tamponu direkt kuyucukların üstüne fışkıtmayın. NOT: Slaytı eğerek ilk sıraya karşı çapraz kontaminasyonu engelleyin ve yıkama tamponunu slaytın ortahattı boyunca dikkatlice akıtın, yıkama tamponunun slaytın alt kenarından çıkmasına izin vermeyin. Sonra diğer sıraya doğru slaytı eğin ve bu prosedürü tekrarlayın ve artık yıkama tamponunun slaytın alt kenarından çıkmasına izin verin.slaytı (slaytları) slayt boyama tablası (tabağı) içinde 10 dakika yıkama tamponu ile yıkayın. Katı öğerlerin substrat ile direkt temasından kaçının. Optimal sonuç için tampon solusyonunu 5 dakikadan sonra bir kez değiştirin. Slaytı (slaytları) boyama tablosundan dışarı çıkartın ve fazla yıkama tamponununu uzaklaştırın. NOT: Slaytın prosedür esnasında kurutmayın bu önemlidir çünkü substaratın zarar görmesine yol açabilir. Slaytı herhangi bir şekilde kurutmayın ya da lekelendirmeyin, veya slaytın birkaç saniyeden uzun bir süre floresan antikor reaktifi olamadan durmasına izin verin. İkinci İnkübason: Yıkama prosedüründen sonra, slaytı hemen inkübasyon tepsisine döndürün ve herbir kuyucuğu yeterli hacimde FITC-konjugat ile kaplayın ve kuyucukların tamamiyle kaplanmış olduğundan emin olun. Slaytı(slaytları) karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika ± 10 dakika inkübe edin. Yıkama: İnkübasyon sonrası slaytları inkübasyon tepsisinden çıkartın ve sıkılabilir yıkama şişesi kullanarak yıkama tamponu ile kısaca durulayın. Tamponu direkt kuyucukların üstüne fışkıtmayın. Slaytı (slaytları) slayt boyama tablası (tabağı) içinde 10 dakika yıkama tamponu ile yıkayın. Optimal sonuç için tampon solusyonunu 5 dakikadan sonra bir kez değiştirin. *Opsiyonel boya sayıcı: Boya sayıcıyı (Evans mavisi) yıkama tamponunda 1:3000 oranında dilüe edin ve iyice karıştırın. Boyasayıcıyı boyama tablasında eğin slaytları içinde inkübe edin. Kullandığınız inkübasyon süresi detayları için ürün referansına göre yukarıdaki Kit Prosedürü kısmına bakın. Evans Mavisi spesifik olmayan arka plan floresanını kapatır. İnkübasyon sonrası slaytları inkübasyon tepsisinden çıkartın ve

17 Dökünman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 15 / sıkılabilir yıkama şişesi kullanarak yıkama tamponu ile kısaca durulayın. Tamponu direkt kuyucukların üstüne fışkıtmayın Ortam vasatı: Her slaytın orta hattı boyunca yeterli hacimde ortam vasatını ekleyin. Baloncuk oluşumdan kaçınarak lameli dikkatlice pozisyonuna yerleştirin Okuma: Slaytı (slaytları) hemen x toplam büyütmeli bir florasan mikroskopta okuyun. (490 nm uyarı filtresi, 510 nm bariyer filtresi).

18 Dökünman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 16 / 17 i. İş akışı

19 Dökünman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 17 / SORUN GİDERME HATA OLABİLECEK SEBEP ÇÖZÜM Low cell density (Düşük hücre Yoğunluğu) -Deiyonize su ile uzun teması takip eden hücre çözünmesi - Kuyucuktaki substrate üzerine doğrudan tampon sıçraması Proteolitik enzimler substrata saldırmış Önerilen yıkama prosedürünü takip edin Inaktive serum Uneven fluorescence (Dengesiz floresan) Diffuse picture (yaygın resim) Little or no fluorescence (az veya olmayan floresans) Backgraound fluorescence (Arka plan floresanı) Serum kuyucuk içinde kurutulmuş, kenarda güçlü floresan Serum test kuyucuğunu kaplamamış Kuyucuklar arası çapraz reaksiyon Wax kalem ile işaretlenmiş slayt,slaytın üzerinde bir film üretir. Mikroskop yalnış ayarlanmış Slayt buzdolabında kapaksız inkübe edilmiş I.F. Microskop kirli. Lens üzerinde çizikler olabilir Konjugat ve slaytlar dondurulmuş ve çözülmüş Kontroller dilüe edilmiş -Serumun veya konjugatın bakteriyal kontaminasyonu -Mikroskop ayarlanmamış -Çok düşük yıkama tamponu ph-değeri (ph value 7.4 ± 0.2) Daima nemli ortamda inkübe edin. Test malzemesini uygun(yeterli) hacimde uygulayın İlk inkübasyonda kuyucuklar arasındaki kaçaklardan kaçının. Standart kalem kullanın (wax olmayan) UV-lamba ayarını kontrol edin Slaytı parafin waxla yada tırnak cilasıyla kapatın Talimatlara ugyun olarak mikroskobu temizleyin Kontrol ve slaytları 2 C-8 C/35-46 F da muhafaza edin Talimatları kontrol edin, kit kontrolleri kullanıma hazırdır Koşulları kontrol edin Işığa maruz kalmış FITC konjugat Konjugatı ışıktan koruyarak muhafaza edin. - Yalnış yıkanma - Kurutulmuş slayt - Lipemik, hemolitik serum - Microskop hatası - Yıkama talimatlarını kontrol edin - Slaytın kurumasına izin vermeyin - Sadece taze serum kullanın - Doğru filtre/objektif olduğunu kontrol edin.

20 Dökünman.: AESKUSLIDES ANA-HEp-2 Sayfa: 18 / 17 - In vitro diagnostic kullanım ro diagnostic use XX - Pour diagnostic in vitro - Para uso diagnóstico in vitro - Ιn Vitro Diagnostikum - In Vitro ιαγνωστικό μέσο - Para uso Diagnóstico in vitro Katalog numarası Cataloge number Référence Catalogue Numéro de catálogo Bestellnummer Αριθμός παραγγελίας Número de catálogo lot Lot Lot Lote Chargen Bezeichnung Χαρακτηρισμός παρτίδας Lote EC uygunluk beyanı EC Declaration of Conformity Déclaration CE de Conformité Declaración CE de Conformidad Europäische Konformität Ευρωπαϊκή συμφωνία Déclaracão CE de Conformidade Rispettare le istruzioni per l uso See instructions for use Voir les instructions d utilisation Ver las instrucciones de uso Gebrauchsanweisung beachten Λάβετε υπόψη τις οδηγίες χρήσης Ver as instrucões de uso Da utilizzarsi entro Use by Utilise avant le Utilizar antes de Verwendbar bis Χρήση μέχρι Utilizar antes de 2-8 C de muhafaza Store at 2-8 C (35-46 F) Conserver à 2-8 C Conservar a 2-8 C Lagerung bei 2-8 C Φυλάσσεται στους 2-8 C Conservar entre 2-8 C imalatçı Manufactured by Fabriqué par Fabricado por Hergestellt von Κατασκευάζεται από Fabricado por Evans Mavisi boyası Evans-Blue Dye coloration au Bleu Evans Colorante Azul de Evans Evans-Blue Färbelösung Evans Blue Evans Blue pozitif kontrol Positive Control Contrôle Positif Control Positivo Positiv Kontrolle Θετικός ορός ελέγχου Controlo positivo Controllo negativo Negative Control negatif kontrol Control Negativo Negativ Kontrolle Αρνητικός ορός ελέγχου Controlo negativo ortam vasatı Mounting media milieu de montage Medio de montaje Mounting Medium Μέσο μονιμοποίησης Meio de montagem konjugat Conjugate Conjugé Conjugado Konjugat Σύζευγμα Conjugado mikroskop slaytı Microscope slide lame de microscope Portaobjetos Objektträger Αντικειμενοφόρο πλακίδιο Lâmina yıkama tamponu Wash Buffer Tampon de Lavage Solucão de lavagem Waschpuffer Ρυθμιστικό διάλυμα πλύσης Solución de lavado numune tamponu Sample Buffer Tampon de Echantillons Solucão de Muestras Probenpuffer Ρυθμιστικό διάλυμα δειγμάτων Solución de Muestras XX test XX tests XX tests XX pruebas XX Bestimmungen XX προσδιορισμοί XX Testes