RIDASCREEN Astrovirüs

Transkript

1 RIDASCREEN Astrovirüs Makale no: C 1301 R-Biopharm AG, Landwehrstr. 54, D Darmstadt, Germany Tel: +49 (0) / Fax: +49 (0) Χ

2 1. Kullanım amacı In vitro diyagnostik kullanım için. RIDASCREEN Astrovirüs bir ELISA testi olup gaitada astrovirüslerin kalitatif tespiti için kullanılır. 2. Özet ve testin açıklaması Astrovirüsler 1975 yılında ilk defa Appleton ve Higgins tarafından bulundu. Onların adı ile adlandırıldı, çocukların gaita numunelerindeki yıldız şekilli görünümleri Madeley ve Cosgrove tarafından electron mikroskopu ile saptandı.calicivirüsler ve bazı virüslerle birlikte, bunlarda küçük yuvarlak şekilli virüslerin grubuna dahil olur. SRV grup parvovirüsleri ve picornavirüsleri içerir.astrovirüs tarafından olan gastroenteretitin epidemik önemi, elektron mikroskopu kullanıldığında ishalin ve kusmalı ishalin sıklığı net değildi.buna sebep elektron mikroskopu hassas olmayıp ve diğer sebep ise SRV partikülleri her zaman net değildir.seroepidomolojik olarak, daha büyük çocukların ve yetişkinlerin % 70 inde spesifik astro virüs antijenleri görüldü. Yeni prosedürler kullanılarak, örneğin ELISA, elektron mikroskopundan 10 kat daha hassas, PCR metodu yüksek hassasiyette gaitada 10 2 partikül/ml kadar tespit edebilir.bu metotlar astro virüsün ishal hastalıklarının teşhisini koymada giderek artan önem taşır. Akut dairelerde bugün astro virüsün oluş derecesi % arasındadır. Bu oluş sıklığı adenovirüse benzerlik gösterir (tip 40/41). Gastroenterit hastalıklarda önemlilik derecesinde rota virüsten sonra ikinci sıradadır. Bugün iki serotipi bilinir. Özellikle 1-5 en ilintili olanlarıdır.astro virüs tarafından olan gastro enterit hastalıkları her yaşta görülür, ama en çok yaşlılarda ve bebeklerde görülür.anaokullarında, okullarda, hastanelerde ve yaşlı insanların evlerinde görülür.aynı zamanda gastroenterit hastalıkları tur grupları ve askerlerde görülür.enfeksiyon gıdalardan, istiridyeden, sudan, fekal-oral yoldan geçer. RIDASCREEN Astrovirus ELISA kiti spesifik antikorlar kullanarak, gaitada olan astro virüs antijenlerini güvenilir bir şekilde tespit eder. RIDASCREEN Astrovirüs

3 3. Test prensibi RIDASCREEN Astrovirüs testi, spesifik antikorları sandviç tip metodunda kullanılır. Astro virüsün tüm bilinen serotiplerinin antikorları ile kuyucuklar kaplanır. Gaita süspansiyonu konjuge edilmiş yaban turbu peroksidazı monoklonal antikorları, pleyte pipetlenir ve oda ısısında (20 25 C) inkübe edilir. Bağlanmayan enzim etiketli antikorlar yıkama ile atılır.önce rensiz olna substrat,eklendikten sonra eğer test pozitif ise mavi renge dönüşür. Stop solüsyonu eklenerek renk maviden sarıya dönüşür.numunedeki rengin şiddeti astrovirüs konsantrasyonu ile doğru orantılıdır. 4. Sağlanan Reaktifler Pakette 96 teste yetecek kadar reaktif bulunur. Pleyt 96 test. Mikro kuyucuklu pleyt, 12 mik rokuyucuklu strip (kırılabilir) strip tutucu; astrovirüslere karşı monoklonal antikor (fare) ile kaplı Diluent ml Numune-dilüsyon buffer, protein-buffer NaCl solüsyonu;% 0.1 Kathon; kullanıma hazırdır; mavi renkli Yıkama 100 ml Yıkama bufer, fosfat bufer NaCl solüsyonu (10-kat konsantre); %0.1 Thimerosal içerir Kontrol ml İnaktive edilmiş maymun astrovirüslere; kullanıma hazırdır. Konjugat 10 ml Peroksidaz -konjugat monoklonal antikor (fare) astrovirüslere karşı stabilize edilmiş protein solüsyonunun içinde ; %0.1 Kathon içerir; kullanıma hazır,mavi renkli Substrat 10 ml Üre peroksidaz/tmb; kullanıma hazır Stop 6 ml Stop reaktifi, 1 N sülfürik asit kullanıma hazır 5. Saklama gereklilikleri Tüm reaktifler 2 8 C de saklanabilir ve etiketin üzerinde basılı tarih kadar kullanılabilir. Dilüe edilen yıkama solüsyonu 2 8 C de saklanır. Maksimum 4 hafta kullanılabilir.mikrobiyal kontaminasyona mutlaka önlenmelidir. Miadı geçtikten sonra kalite garantisi geçerli değildir. Alüminyum çanta kilidinden açılmalı, kilit yırtılmamalı. Kullanılmayan kuyucular çantanın içine geri konulmalıdır ve 2 8 C de inkübe edilmelidir. Renksiz substrat, bozulmasını engellemek ya da okside olarak mavi renge dönüşmesinin önüne geçmek için, direk olarak gün ışığından korunarak saklanmalıdır. Açılan substrat mavi renge dönerse kullanılmamalıdır. RIDASCREEN Astrovirus

4 6. Ek olarak gerekli reaktifler ve ekipmanlar 6.1. Reaktifler - Distile ya da deiyonize su 6.2. Aksesuarlar - Test tüpleri - Tek kullanımlık pipetler (Makale no: Z 0001) - Vorteks mikser (opsiyonel, Bölüm9.3. bakınız) - Mikropipet µl ve 1 ml hacim çekebilen - Mezür (1000 ml) - Saat - Mikropleyt yıkayıcı (300 µl) - Mikropleyt okuyucu (450 nm ve referans filtre 600 nm ) - Filtre kağıdı (laboratuvar havlusu) - %0.5 hipoklorit solüsyonu içeren atık kabı 7. Kullanıcılar için önlemler Sadece in vitro diyagnostik kullanım içindir. Mutlaka eğitimli bir personel tarafından kullanılmalıdır.medikal laboratuvar çalışanları için olan rehber takip edilmeli ve oradaki direktiflere tamamen uyulmalıdır. Kitte bulunan pozitif kontroller inaktive edilmiş astrovirüs içerir. Buna rağmen kontroller ve numuneler mutlaka enfekte materyal gibi, ulusal güvenlik kurallarına göre muamele görmelidir. Numuneler ya da reaktifler ağız ile pipetlememeli ve yaralı deriyle, mukoz membran ile teması önlemelidir. Numuneler, eldiven giyilerek çalışılmalı ve test bittiği zaman eller yıkanmalıdır. Numuneler veya reaktifler ile çalışırken sigara içmeyiniz, yemek yiyip içmeyiniz. Numune dilüsyon buffer, konjugat ve koruyucu olarak % 0.1 Kathon içerir. Bu madde deri veya mukoz membran ile temas edilmesine müsaade edilmemelidir. Yıkama buferı koruyucu olarak, %0.1 Thrimesorol içerir. Deri ve mukoz membran bu madde ile temas ettirilmemelidir. RIDASCREEN Astrovirüs

5 Üre peroksidaz yanmaya sebep olur.dikkatli kullanınız. Stop reaktifi 1 N sülfirik asit içerir. Deri ve elbiselerinizi koruyunuz. Eğer deriye temas ederse bol su ile yıkayınız. Tüm reaktiflere ve materyallere, enfeksiyon kapma riski olan numuneler gibi davranılmalı ve uygun bir dezenfektan veya otoklav ile 121 C de en az 1 saat dezenfekte edilmelidir. DİKKAT: Zehirli gazların oluşumunu önlemek için,stop reaktifi içeren her atık sıvı hipoklorit solüsyonu eklemeden önce nötralize edilmelidir. 8. Numune toplama ve saklama Gaita numuneleri test başlamadan önce 2 8 C de bekletilmelidir.eğer 3 günden fazla saklamak gerekiyorsa, numuneler 20 C de saklanmalıdır. Bu durumda da numuneler test edilmeden önce oda ısısında tamamen çözülmelidir. Tekrar tekrar çözüp dondurmaktan kaçınılmalıdır. Gaita numunesi ve rektal swap taşıma konteynır ile toplanmalıdır, bu transport medyanın içinde koruyucular, hayvan serumu, metal iyonları, oksitleme ajanı ya da deterjan içerir bunlarda RIDASCREEN astrovirüs testine olumsuz etki yapar. Eğer rektal swap kullanıldıysa, test için, yeteri kadar gaita (yaklaşık 100 mg) alındığından emin olunuz. 9. Test prosedürü 9.1. Genel bilgi Tüm reaktifler ve Mikropleyt Pleyt kullanmadan önce oda sıcaklığına getirilmeli (20 25 C) Kuyucuklar oda sıcaklığına gelene kadar alüminyum çantadan çıkarılmamalıdır.reaktifler kullanılmadan önce karıştırılmalıdır.kullanılmayan kuyucuklar ve reaktifler 2 8 C de saklanmalıdır.kullanılan kuyucuklar tekrar kullanılmamalıdır.zarar görmüş paketteki malzemeler kullanılmamalıdır. Çapraz reaksiyonu önlemek için numunelerin kit komponentleri ile temasından sakınılmalıdır.test direk olarak gün ışığına maruz kalmamalıdır. Kuyucuğun üzerini kapatıp buharlaşma kayıplarını engellemenizi tavsiye ederiz Yıkama buferı hazırlama 1 hacim yıkama konsantre bufer ile Yıkama 9 hacim distile suyu karıştırın. Yıkama bufer içinde olan herhangi bir kristalleşme varsa kullanmadan önce 37 C de su banyosunda çözülerek kullanılmalıdır. RIDASCREEN Astrovirus

6 9.3. Numune hazırlama 1 ml RIDASCREEN numune dilüsyon buferı Diluent 1 etiketlediğiniz test tüpüne koyunuz. Tek kullanımlık pipet ile gaitayı çekiniz.(makale no: Z 0001) yaklaşık olarak 100 µl ikinci işareti geçene kadar.numune dilüsyon bufer içine koyunuz.katı gaitalar için, yaklaşık olarak mg kadar spatül ile alınır ve numune dilüenti bufer içine bırakılır.gaita süspansiyonunu pipetle çekip bırakarak ya da alternatif olarak mikser veya Vorteks ile karıştırınız.kısa bir süre partiküllerin çökmesi için bekletilir. Temiz süpernatant kullanılır.eğer test prosedürü ELISA cihazında çalışılacaksa mutlaka süpernatantın temiz olması gerekir.bu durumda,numuneyi 5000 rpm de (yaklaşık olarak g) 5 dakika boyunca santrifüj edilmelidir İlk İnkübasyon Yeteri kadar kuyucuk çalışma çerçevesine yerleştirildikten sonra 2 damla (100 µl) pozitif kontrol Kontrol +, numune dilüsyon buferı Diluent 1 (= negatif kontrol) ve numune süspansiyonu kuyucuklara konur.sonra üzerine, 2 damla (100 µl) enzim-konjugat antikor Konjugat konur ve karıştırılır, oda sıcaklığında (20 25 C) de 60 dakika inkübasyona bırakılır Yıkama Yıkamada tamamen direktiflere uymak doğru sonuç elde etmek için çok önemlidir. Kuyucuklarda inkübe edilen madde mutlaka dezenfeksiyon için hipoklorit içeren atık kabına atılmalıdır. Bundan sonra, kalan damlaları için emici bir kağıt üzerinde vurarak alınız.bundan sonra her seferinde 300 µl olmak üzere, yıkama bufer ile 5 defa yıkayınız.her yıkamadan sonra her yıkamadan sonra, emici kağıda vurarak kalan damlalar emdirilir. ELISA yıkayıcı kullanıyorsanız, cihazın mikropleyt tipine uygun olduğu kontrol edin.daha da ötesi partiküle sahip olan numune süspansiyonu pipetlenmiş ise ilk yıkama manuel olarak yapılmalıdır, yoksa yıkayıcının uçlarını tıkayabilir. Aynı zamanda yıkama işleminde tüm sıvının emildiğinden emin olunuz.her yıkamadan sonra kalan damlaları absorbe edecek bir kağıda veya havluya emdiriniz.optimum yıkama sonucunu elde etmek için kuyucuk başına en az 600 μl yıkama buffer kullanılması önerilir.yıkama sayısı daha iyi sonuç elde etmek için 5 den fazla yapılabilir. RIDASCREEN Astrovirüs

7 9.6. İkinci İnkübasyon Her kuyucuğa 2 damla (100 μl) substrat Substrat eklenir.daha sonra karanlıkta oda sıcaklığında (20-25 C) 15 dakika inkübe edilir.her kuyucuğa, bir damla (50 µl) stop reaktifi Stop eklenerek reaksiyon bitirilir.dikkatlice karıştırılır.(yavaşça pleytin kenarını çarparak karıştırınız.) Oluşan rengi 450 nm de okuyunuz.referans filtre olarak 600 nm (opsiyonel) kullanılır. Sonra mikropleyt olmadan havaya karşı kalibre ediniz. Not: Yüksek pozitif numuneler,substratı siyah sediment olarak çöktürebilir. 10. Kalite Kontrol reaktifin miadı Kalite kontrol amacı için, negatif ve pozitif numune çalışılır; testin doğru çalıştığından ve reaktiflerin stabilitesinden emin olunur.negatif kontrol (O.D.) 450 nm de < 0.2 ise ve pozitif kontrol > 0.8 at 450 nm doğru çalışılmıştır. Eğer negatif kontrol >0.2 ise yıkamanın yetersiz olduğunu ifade eder.eğer bulunan değerler beklenenlerden farklı ise ve substratta bulanıklık varsa ya da maviye dönüşmüş ise reaktifin eskidiğini gösterebilir. Şart koşulan değerlerle sonuçlar çakışmazsa, test tekrar edilmeden önce aşağıdaki noktalar kontrol edilmelidir: Kullanılan reaktiflerin miadı Kullanılan ekipmanların fonksiyonları(örn:kalibrasyon) Test prosedürünü kontrol edin Kit kontaminasyonuna yönelik akma veya herhangi bir gözle görülen bir bozulma substrat maviye dönmüş olmamalıdır. Bunlardan emin olduktan sonra, yeni kaset ile testi tekrar ettiğinizde, eğer kontrol bandı görünür değilse, lütfen üretici ya da R-Biopharm distirübitör ile kontak kurunuz. 11. Değerlendirme ve yorumlama cut-off hesaplama Cut-off oluşturmak için, 0.15 O.D. negatif kontrolün O.D. sine eklenir. Cut-off = negatif kontrol O.D RIDASCREEN Astrovirus

8 11.2. Test sonucu Cut off değerinden % 10 da yüksek O.D. ye sahip numuneler pozitif olarak değerlendirilir. Eğer sonuç Cut of değerinin % ± 10 arasında ise şüpheli olarak değerlendirilir.eğer taze numuneyle testin tekrarı da gri zonda çıkarsa numune negatif olarak değerlendirilmelidir. Cut off değerinin %10 altında çıkan değerler ise negatif olarak değerlendirilir. 12. Metot Limitleri RIDASCREEN Astrovirüs testi gaitadaki astro antijenlerini tespit eder. Testin şiddeti, klinik semptomların şiddetini ortaya çıkarmak için kullanılamaz. Sonuçlar klinik tablo ile birlikte yorumlanmalıdır. Pozitif sonuçlar, diğer bulaşıcı patojenlerin olmadığı anlamına gelmez. Negatif sonuçlar Astrovirüs enfeksiyonu olmadığını göstermez Bu enfeksiyon aralıklı olarak salgılanan patojenler ya da numune olan çok küçük miktardaki patojenler tarafından olabilir.eğer hasta anemik ya da astrovirüs tarafından enfekte olduğu şüphesi varsa, 4 hafta sonra bir başka gaita numunesi alınarak test tekrar edilmelidir. Şüpheli sonuçlara sebep gaitada virüslerin homojen dağılımında olmamasından kaynaklanabilir. Eğer bu olursa, aynı numuneden ikinci bir süspansiyon hazırlanıp test edilmelidir. RIDASCREEN Astrovirüs

9 13. Performans karakterleri Test kalitesi Karşılaştırmalı araştırmalarda, gastro enterit olan 92 çocuktan alınan numunelerle RIDASCREEN Astrovirüs ELISA kiti RT PCR ile karşılıklı çalışıldı.devamında rotavirüs negatif numunelerle astro virüs testi çalışıldı.sonuçlar Tablo 1 de görülür. Tablo 1: RIDASCREEN Astrovirüs testi ile RT PCR karşılaştırması RT PCR pos neg RIDASCREEN pos 33 7 Astrovirüs neg 4 48 AsV-R-Bio Hassasiyet: 89.2 % Özgüllük: 87.3 % PPW: 82.5 % NPW: 92.3 % Çapraz Reaksiyon Boşaltım yolunda olan pek çok patojen organizma RIDASCREEN Astrovirus testi kullanılarak test edildi ve çapraz bir reaksiyon görülmedi.testler içinde organizma /ml gaita süspansiyonu ile yapıldı. Sonuçlar Tablo 2 dedir. RIDASCREEN Astrovirus

10 Tablo 2: Patojenik mikro organizmalarla olan çapraz reaksiyonlar Jerm Test Orijin Süspansiyon Acinetobacter lwoffii DSM Aeromonas hydrophilia anaerogenes DSM Aeromonas hydrophilia hydrophilia DSM Campylobacter coli DSM Campylobacter fetus DSM Campylobacter jejuni DSM Candida albicans ATCC Citrobacter freundii DSM Citrobacter freundii DSM Enterobacter cloacae DSM Enterococcus faecalis DSM Enterococcus faecium DSM Escherichia coli İzole Escherichia coli İzole Escherichia coli İzole Escherichia hermannii DSM Lactococcus lactis DSM Listeria innocua SLCC Proteus mirabilis DSM Proteus mirabilis DSM Proteus vulgaris DSM Providencia stuartii DSM Pseudomonas aeruginosa DSM Pseudomonas fluorescens DSM Pseudomonas fluorescens DSM Pseudomonas putida DSM Salmonella agona İzole Salmonella cholerasuis DSM Salmonella enteritidis DSM Salmonella infantis İzole Salmonella Ohio İzole Salmonella typhimurium İzole Serratia proteamaculans DSM RIDASCREEN Astrovirüs

11 Shigella flexneri DSM Shigella sonnei DSM Staphylococcus aureus DSM Streptococcus agalactiae İzole Streptococcus dysgalactiae İzole Streptococcus uberis İzole Escherichia coli (O157:H-) İzole Escherichia coli (O116:H21) İzole Escherichia coli (O111:H-) İzole Escherichia coli (O26:H8) İzole Orijin Süspansiyon Candida albicans ATCC Salmonella enteritidis DSM Campylobacter jejuni DSM Campylobacter coli DSM Campylobacter fetus DSM Morganella morganii DSM Pozitif kontrol Negatif kontrol Cut-off Presizyon Intra-test 3 farklı konsantrasyon içeren astro virüs numuneleri kullanılarak 24 test yapıldı.sonuçlar Tablo 3 dedir. Tablo 3: Intra-test Intra-test (n = 24) Numune Ortalama OD Standart deviasyon CV (%) A B C Negatif kontrol Ortalama değer 5.4 RIDASCREEN Astrovirus

12 Inter-test 3 farklı konsantrasyonda astro numuneleri kullanılarak 5 farklı grup test edildi.elde edilen data 3 farklı lotta çalışılarak bulundu.sonuçlar Tablo 4 dedir. Tablo 4: Inter-test Inter-test (n = 5) Numune Ortalama O.D. Standart deviasyon C.V. (%) A B C Negatif kontrol Ortalama değer 7.2 RIDASCREEN Astrovirüs

13 Referanslar 1. Appleton, H., Higgins, P.G.: Viruses and gastroenteritis in infants (letter). Lancet i 1297 (1975) 2. Madeley, C.R., Cosgrove, B.P.: 28 nm particles in faeces in infantile gastroenteritis. Lancet ii (1975) 3. Cubitt, W.D.: Historical background and classification of caliciviruses and astroviruses. Arch. Virol. [Suppl.] 12, (1996) 4. Glass, R.I. et. al.: The changing epidemiology of astrovirus-associated gastroenteritis: a review Arch. Virol. [Suppl.] 12, (1996) 5. Carter, M.J., Willcocks, M.M.: The molecular biology of astroviruses. Arch. Virol. [Suppl.] 12, (1996) 6. Abad, F.X. et. al.: Astrovirus survival in drinking water. Appl. Environmental Microbiol. Vol. 63 No. 8, (1997) 7. Belliot, G. et.al.: Outbreak of gastroenteritis in military recruits associated with serotyp 3 astrovirus infection. J. Med. Virol. 51, 101,106 (1997) 8. Gaggero, A. et. al.: Prevalence of astrovirus infection among Chilean children with acute gastroenteritis. J. Clin. Microbiol. 36 No. 12, (1998) 9. Pang, X.L., Vesikari, T.: Human astrovirus-associated gastroenteritis in children under 2 years of age followed prospectively during a rotavirus vaccine trial. Acta paediatr 88, (1999) 10. Bon, F. et. al.: Prevalence of group A rotavirus, human calicivirus, astrovirus type 40 and 41 infections among children with acute gastroenteritis in Dijon, France. J. Clin. Microbiol. 37 No. 9, (1999) RIDASCREEN Astrovirus