EASE BN-96 (TMB) Kullanım manueli Dok. No.: W7.3IUB5 Yayım tarihi:2007/08/29 英 -2

Transkript

1 Ürün Adı EASE BN-96 (TMB) Ürün Kodu 4BNE3 EC Sertifika Kayıt no. Sınıflandırma Annex II, List A (98/79/EC) Kullanım İnsan serum ya da plazmasındaki HBeAg ve Anti-HBe nin in-vitro belirlenmesi Amacı Yasal Üretici GENERAL BIOLOGICALS CORPORATION Adres #6, INNOVATION FIRST ROAD, SCIENCE PARK, HSIN CHU, TAIWAN, R.O.C. E mail Sales.group@gbc.com.tw Tel Faks Authorized Representative in EC Address Tel. +49 (0) Fax. +49 (0) info@mt-procons.com Medical Technology Promedt Consulting GmbH Altenhofstrasse 80, D St. Ingbert, Germany 1

2 İçerik No İçerik Sayfa 1) Kullanım Amacı 2 2) Test Prensibi 2 3) Özet ve Test Açıklamaları 3 4) Kit İçeriği 4 5) Kullanma Talimatı 5 5.1) Uyarılar 5 5.2) Örnek Toplama ve Hazırlama 6 5.3) Reaktifleri Saklama Koşulları 6 5.4) Plate Yıkama Prosedürü 6 5.5) Test Prosedürü 6 5.6) Sonuçların Değerlendirilmesi 8 5.7) Sonuç Yorumlama 9 5.8) Sorun Giderme ) Sınırlamalar ve Engellemeler ) Performans Özellikleri ) HBeAg Testi ) Anti-HBe Testi ) Test Prosedürü İş Akış Şeması 15 6) Referanslar 16 1) Kullanım Amacı EASE BN-96 (TMB) insan serum ve plazmasındaki HBeAg ve Anti-Hbe leri in-vitro kalitatif olarak belirleyen enzim immunotest diagnostik kitidir. 2) Test Prensibi 2.1) HBeAg Belirlenmesi HBeAg belirlenmesi için EASE BN-96 (TMB) kiti "sandwich prensibi" ne (Antikor Antijen- Antikor) dayalı yöntemi kullanmaktadır. HBeAg içeren örnekler, Anti-Hbe-HRPO konjugat ile birlikte Anti-HBe kaplı kuyucuklara eklenerek inkübe edildiğinde, kuyucuklarda (antikor)-(antijen)-(antikor-hrpo) kompleksleri oluşur. Bağlanmayan materyallerin uzaklaştırılması için pleytin yıkanmasından sonra, TMB substrat solusyonu kuyucuklara eklenir ve HBeAg bağlanma miktarına gore renk oluşumu gözlenir. Renk oluşumunun sonlandırılması için sülfirik asit eklenir. Oluşan rengin optik densitesi uygun bir fotometre ile 450nm de ve nm arasında seçilen referans bir dalga boyunda ölçülür*. Yukarıda tanımlanan test prensibinin özetini aşağıda bulabilirsiniz: A HBeAg İçeren Örnekler: 1. (Plate kuyucukları)-(anti-hbe) + Örnek (HBeAg) + Anti-Hbe-HRPO (plate kuyucukları)-anti-hbe-hbeag-(anti-hbe-hrpo) sandwich kompleksi 2. Sandwich kompleksi + TMB substrat solusyonu Açık maviden maviye 3. Renk oluşumunun durdurulması için 2N H2SO4 eklenmesi 450 nm/ nm de OD okunması* B HBeAg İçermeyen Örnekler: 1. (Plate kuyucukları)-(anti-hbe) + Örnek (HBeAg içermeyen) + Anti-Hbe-HRPO (plate kuyucukları)-anti-hbe 2. (plate kuyucukları)-anti-hbe + TMB substrat solusyonu Renksizden açık maviye 3. Renk oluşumunun durdurulması için 2N H2SO4 eklenmesi 450 nm/ nm de OD okunması* 2

3 2.2) Anti-HBe Belirlenmesi Anti-HBe belirlenmesi için, EASE BN-96 (TMB) kiti " Nötralizasyon Prensibi" ne dayalı yöntemi kullanmaktadır. Örnekler, Anti-HBe kaplı kuyucuklarda Nötralizasyon Solusyonu ile inkübe edildiğinde, Nötralizasyon Solusyonu ile HBeAg, örnek içindeki Anti-HBe ler tarafından nötralize edilecektir. Daha fazla Anti-HBe konsantrasyonu, daha az artık HBeAg konsantrasyonu ve sonuçta azalmış Optik Dansite gözlenir. Yukarıda tanımlanan test prensibinin özetini aşağıda bulabilirsiniz: A Anti-HBe İçeren Örnekler: 1. (plate kuyucukları)-anti-hbe + Örnek (Anti-HBe) + Nötralizasyon Solusyonu (HBeAg) (Plate kuyucukları)-anti-hbe-hbeag ve HBeAg-Anti-HBe Yıkamadan sonra, sadece (Plate kuyucukları)-anti-hbe-hbeag kuyucuklarda kalır. 2. (Plate kuyucukları)-anti-hbe-hbeag + Anti-Hbe-HRPO (Plate kuyucukları)-anti-hbe-hbeag(anti-hbe-hrpo) sandwich kompleksi 3. Sandwich kompleksi + TMB substrat solusyonu Açık maviden renksize 4. Renk oluşumunun durdurulması için 2N H2SO4 eklenmesi 450 nm/ nm de OD okunması*. B Anti-HBe İçermeyen Örnekler: 1. Plate kuyucukları (Anti-HBe) + Örnek (Anti-HBe içermeyen) + Nötralizasyon Solusyonu (HBeAg) (Plate kuyucukları)-anti-hbe-hbeag 2. (Plate kuyucukları)-anti-hbe-hbeag + Anti-HBe-HRPO (Plate kuyucukları) - Anti-HBe HBeAg -(Anti-HBe-HRPO) sandwich kompleksi 3. Sandwich kompleksi + TMB substrat solusyonu mavi renk 4. Renk oluşumunun durdurulması için 2N H2SO4 eklenmesi 450 nm/ nm de OD okunması*. 3) Özet ve Test Açıklamaları EASE BN-96 (TMB) nın katı fazı Anti HBe kaplı polistren kuyucuklardan oluşur. ; Anti-HBe sıvı fazda Anti-HBe-peroxidase (Yaban turpu) konjugat hazırlamak için de kullanılmıştır. HBeAg tespitinde, numuneler, EASE BN-96 (TMB) ile reaksiyon vermemiş ise yani Cut-off indeksi 0.9 dan küçük ise test kriterlerine göre HBeAg negatif olarak kabul edilir. Cut-off indeksi 1.1 den büyük olan numuneler HBeAg sonucu pozitif olarak kabul edilir. Absorbans değerleri tekrar aralığında olan (Cut off değeri ± 10%) numuneler çift çalışılarak tekrarlanır ve yukarıdaki kriterlere göre değerlendirilir. Anti-HBe tespitinde, EASE BN-96 (TMB) kiti ile reaksiyon vermeyen numuneler negatif kabul edilir. Cut-off indeksi 1.1 den büyük olan numuneler kit kriterlerine göre Anti HBe için negatif sayılır. Cut-off indeksi 0.9 dan küçük olan numuneler Anti HBe için pozitif olarak kabul edilir. Absorbans değerleri tekrar aralığında olan (Cut off değeri ± 10%) numuneler çift çalışılarak tekrarlanır ve yukarıdaki kriterlere göre değerlendirilir. 3

4 4) Kit İçeriği Aşağıdaki tabloda 1-8 maddeleri 2-8 C de saklanmalıdır. Yıkama solusyonu D (20X) ve 2N H2SO C de saklanabilir. NO Materyal Kodu Ürünler Açıklama 96 test için miktar (1) 3B040MPEB Anti-HBe Plate HBeAg antikorları(anti-hbe)kaplı mikrotiter 1 plate plate (2) 3B071CONEGE3 Anti-Hbe-Peroxidase Solusyonu 1şişe, 10 ml anti-hbe Peroxidase (horseradish) konjugat, protein stabilizatörleri ile çözülmüş. Koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. (3) 3B090P3HEG3 HBeAg Pozitif Kontrol HBeAg pozitif serum, bufferda protein stabilizatörü ile seyreltilmiş. Koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. (4) 3B090P3HEB3 Anti-HBe Pozitif Kontrol Anti-HBe pozitif serum, bufferda protein stabilizatörü ile seyreltilmiş. Koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. (5) 3B110N4HD3 HB Negatif Kontrol HBeAg, Anti-HBe ve HBsAg içermeyen normal insan serumu, Koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. (6) 3B091N11HEG3 Anti-HBe için Nötralizasyon Solusyonu (7) 3B135TMB-A 3B145TMB-A TMB Substrat Solusyonu A HBeAg pozitif serum, bufferda protein stabilizatörü ile seyreltilmiş. Koruyucular: 0.003% Gentamycin ve 0.01% Thimerosal. 0.6 mg/ml 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine (TMB), organik tabanlı 1 şişe, 1.0 ml 1 şişe, 1.0 ml 1 şişe, 1.5 ml 1 şişe, 5 ml 1 şişe, 10 ml (8) 3B140TMB-B TMB Substrat Solusyonu Sitrik Asit Buffer, 0.03% H2O2 içeren. 1 şişe, 3B150TMB-B B 10 ml (9) 3B112PBS3 Konsantre Yıkama Solusyonu D (20X) Tween-20 ile konsantre fosfat buffer. 1 şişe, 52 ml (10) 3B155SACID2N 3B155SACID5N 2N Sülfirik Asit 2NH 2 SO 4 1 şişe, 12 ml AKSESUARLAR: (ihtiyaç duyulduğunda) NO Materyal Kodu Ürünler (10) 2P Yapışkan Slipler (11) 2P Emici tamponlar (12) 2P Siyah kapak KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER NO Ürünler (1) 50µl, 100µl mikropipetler ve uçlar (2) +37 C ayarlanabilen su banyosu ya da inkübatör. (3) Plate yıkama ekipmanları. (4) ELISA Mikro Plate Okuyucu: İkili dalgaboyu 450nm ile referans dalgaboyu olarak nm, bant genişliği 10nm *1 (5) Opsiyonel olarak tam otomatik EIA mikroplate analizör. Kullanıcı otomatik EIA mikro-plate analizörün kit ile validasyonlarını yapmalıdır. 4

5 4.1) Kit ve İçeriğinin Saklama Koşulları * Kit/İçerik Saklama Sıcaklığı Durum Saklanabilirlik EASE BN-96 (TMB) KIT HBeAg Pozitif Kontrol HBeAg Negatif Kontrol Anti-HBe Pozitif Kontrol HB Negatif Kontrol Anti-HBe Plate Anti-HBe Peroxidase Solusyonu Anti-HBe için Nötralizasyon Solusyonu Konsantre Yıkama Solusyonu D (20X) 20X Seyreltilmiş Yıkama Solusyonu TMB Substrat Solusyonu A TMB Substrat Solusyonu B 2N Sülfirik Asit +2 to +8 C Orjinal 10 ay 15 ay 15 ay 15 ay 15 ay 15 ay 10 ay 15 ay 24 ay Oda Sıcaklığı Seyreltilmiş 2 gün +2 to +8 C Seyreltilmiş 1 hafta 24 ay 24 ay 24 ay Kullanma Talimatı 5.1) Uyarılar: 5.1.1) Bu kit sadece profesyonel kullanım içindir ) Bu kit sadece in-vitro teşhis içindir ) Kullanmadan önce bütün reaktifleri ve numuneleri oda ısısına çıkarın (20-30ºC) ve dikkatlice karıştırın ) Reaktifleri son kullanma tarihinden sonra kullanmayınız ) Farklı lottaki reaktifleri karıştırmayınız )Ağızla pipetleme yapmayınız ) Örneklerin veya reaktiflerin kullanıldığı bölgede yemek yemeyiniz ya da sigara içmeyiniz ) Tüm kit içeriğinin ve örneklerin potansiyel sağlık riski taşıdığını göz önünde bulundurunuz. Kullanımları ve atılımları laboratuvarınızın güvenlik prensiplerine gore yapılmalıdır. Bazı güvenli ürünler koruyucu eldiven giyilmesini ve aerosol kullanımından kaçınılmasını gerektirebilir ) Enfeksiyonlu numuneler ve asit ihtiva etmeyen maddeler döküldüğünde %5 sodyum hipoklorid ile temizlenmelidir ya da sizin daha önceden biyo-zararlı ürünler için uygulamakta olduğunuz uygulamalar ile temizlenmelidir ) Bütün atık materyalleri atılmadan önce uygun olarak dezenfekte edilmelidir. Hem sıvı hem de katı faz en az 1 saat 121ºC de otoklavlanmalıdır. Katı faz aynı zamanda yakılabilir. Asitsiz likit atık %1 son konsantrasyona karşı seyreltilmiş sodium hipoklorid ile kullanılabilir. Asit içeren likit atıklar yukarıda belirtilen şekilde kullanılmadan önce nötralize edilmeli ve etkili dezenfeksiyon elde etmek için 30 dakika beklenmelidir. 5

6 5.1.11) 2N Sülfirik Asit; deri, gözler, solunum yolu ve mukoz membranlar için tahriş edicidir. 2N Sülfirik asitin deri ve mukoz membranlar ile temasından kaçınınız. Temas etmesi halinde bol miktarda su ile yıkayınız. İnhalasyonu olması halinde temiz hava alınız ve ağrı hissetmeniz durumunda mutlaka doktora başvurunuz ) TMB substrat solusyonu A yanıcı organik çözücüler içermektedir. TMB substrat solusyonu A deri ve mukoz membranlar için tahriş edicidir. 5.2) Örnek Toplama ve Hazırlama 5.2.1) Kan alımından önce hastalarda özel bir hazırlık yapılması gerekmemektedir. Kan, kabul görmekte olan medikal yöntemler ile alınmalıdır ) Bu kit ile serum ve plazma kullanılabilir. Tam kan örnekleri hemolizi önelemek için hemen ayrılmalıdır. Pıhtılar (fibrin ağı, eritrositler, ) kullanımdan önce uzaklaştırılmalıdır ) Örnekler kullanılmadan önce 2-8 Cde saklanmalı ve bozulmaları önlemek için ısı inaktivasyonundan kaçınılmalıdır. Uzun süreli saklamalar için -20 C nin altında dondurulmalıdır. Kendi kendine buz çözücü özelliği olan soğutucular kullanılması önerilmez ) Dondurulmuş örnekler çalışılmadan önce tamamen çözdürülmeli ve homojen olarak karıştırılmalıdır ) Arka arkaya dondurup çözdürmekten kaçınınız ) UYARI 1. Örnekler peroksidaz aktivitesini önleyici bir AZIDE içeriği ihtiva etmemelidir. 2. Tam olarak koagüle olmamış serumlar ve mikrobiyal içeriği olan örnekler kullanılmamalıdır. 5.3) Reaktiflerin Saklama Koşulları 5.3.1) Kit 2-8 C de saklanmalıdır. Dondurmayınız ) Plate stripleri orjinal alüminyum folyosu açıldıkan sonra içinde kullanılmalıdır. Kullanılmayan stripler alüminyum folyo içinde saklanmalı ve ağzı sıkıca bantlanmalıdır ) Kullanımdan hemen sonra reaktifleri 2-8 C de saklayınız ) Yıkama solusyonu D (20X) konsantre, kristalleşmeyi önlemek için oda ısısında saklanmalıdır. Eğer kullanımdan önce kristal çökelme oluşursa kristallenme çözülünceye kadar 37 C su banyosu içinde bekletilmelidir. 5.4) Plate Yıkama Prosedürü 5.4.1) Yıkama Solusyonu Hazırlanması: Yıkama Solusyonu D (20X) Konsantreyi distile veya deiyonize su ile 1:20 oranında seyreltiniz. Musluk suyu kullanmayınız ) Plate Yıkanması: (a) Aspire/dağıtım fonksiyonlu cihazlar ile plate yıkanması: Herbir siklusta herbir kuyucuk en az 0.5ml yıkama solusyonu ile 6 kez yıkanmalıdır. Ya da (b) Aspire/dağıtım fonksiyonlu cihazlar kullanılmadan plate yıkanması: Herbir siklusta herbir kuyucuk en az 0.35ml yıkama solusyonu ile 8 kez yıkanmalıdır ) Pleyti tersyüz ederek sıvılarını akıtınız ve absorbent kağıt üzerinde kurutunuz. Çok fazla atık yıkama solusyonu kalması test sonuçlarınızı olumsuz etkileyecektir. UYARI Uygun olmayan yıkamalar hatalı sonuçlara neden olacaktır. 5.5) Test Prosedürü Test işlemleri tam otomatik EIA analizöründe yapılabilir, lütfen program adaptasyonu için ilgili prosedüre uyunuz 5.5.1) Kullanmadan önce tüm reaktifleri ve örnekleri oda ısısına (20-30 C) getiriniz. Su banyosu ya da inkübatörü +37±1 C ye ayarlayın. (A) HBeAg Belirlenmesi 5.5.2a) Blank için 2 tane kuyucuk ayırınız. 3 Negatif kontrol, 2HBeAg Pozitif kontrol ve örnekler için birer kuyucuk ayrınız. Uygun kuyucuklara 100µl kontrollerden ve örneklerden ekleyiniz. 6

7 NOT: a. Çapraz kontaminasyonu önlemek için herbir örneği yüklerken yeni ve temiz pipet ucu kullanınız. b. Herbir pleyt ayrı negatif kontrol, pozitif kontrol ve blank kuyucuğu yüklemesine ihtiyaç duyar. c. Diğer pleytlerin cut-off değerlerini kullanmayınız a) Pleyti yavaşça sallayınız a) Yapışkan slipten arka kısmını ayırın ve sıkıca reaksiyon pleytin üzerini kaplayacak şekilde bastırınız a) Reaksiyon pleytini +37±1 C deki su banyosunda ya da inkübatörde 1 saat inkübe ediniz a) İnkübasyon periyodunun sonunda yapışkan slipi çıkarıp atın ve 5.4)de belirtilen pleyt yıkama prosedürüne gore pleyti yıkayınız a) 2 blank kuyucuğu hariç herbir kuyucuğa 100μ1 Anti-HBe Peroxidase Solusyonu ekleyiniz. NOT: Olası kontaminasyonları önlemek için pleyt duvarlarına değmeden yükleme yapınız a) Pleyti yavaşça sallayınız a) Yapışkan slipten arka kısmını ayırın ve sıkıca reaksiyon pleytin üzerini kaplayacak şekilde bastırınız a) Reaksiyon pleytini +37±1 C deki su banyosunda ya da inkübatörde 1 saat inkübe ediniz a) İnkübasyon periyodunun sonunda yapışkan slipi çıkarıp atın ve 5.4)de belirtilen pleyt yıkama prosedürüne gore pleyti yıkayınız a) Renk gelişimi için aşağıdaki iki yöntemden birini seçiniz: A) Kullanmadan önce temiz bir kapta TMB Substrat Solusyonu A ve B yi eşit miktarlarda karıştırınız. Blank kuyucuğu da dahil olmak üzere herbir kuyucuğa 100 l karıştırdığınız mix solusyondan ekleyiniz. Ya da B) Blank kuyucuğu da dahil olmak üzere herbir kuyucuğa önce 50l TMB Substrat Solusyonu A, sonra 50l TMB Substrat Solusyonu B ekleyiniz. Dikkatlice pleyti çalkalayınız. NOT: TMB Substrat Solusyon A renksiz ya da açık mavi olmalıdır, aksi takdirde dökülmelidir. TMB Substrat Solusyonu A ve B nin karışımı miks hazırlandıktan sonraki 30 dakika içinde uygulanmalıdır. Miks solusyon yoğun ışıktan uzak tutulmalıdır a) Pleytin üzerini siyah kapak ile kapatıp oda sısında 30 dakika bekletiniz a) Reaksiyonu durdurmak için blank de dahil herbir kuyucuğa 100 µl 2N H2SO4 eklenmelidir a) Hassas bir spektrofotometre ile 30 dakika içinde kontrollerin ve test örneklerinin 450/ nm de absorbanslarını ölçünüz *. Blank kuyucuğu için blank spektrometre uygulayınız. NOT: Blank renksiz veya açık sarı olmalıdır; aksi takdirde test sonuçları geçersizdir. (B) Anti-HBe Belirlenmesi 5.5.2b) Blank için 2 tane kuyucuk ayırınız. 3 Negatif kontrol, 2HBeAg Pozitif Kontrol ve örnekler için birer kuyucuk ayrınız. Uygun kuyucuklara 50µl kontrollerden ve örneklerden ekleyiniz. NOT: a. Çapraz kontaminasyonu önlemek için herbir örneği yüklerken yeni ve temiz pipet ucu kullanınız. b. Herbir pleyt ayrı negatif kontrol, pozitif control ve blank kuyucuğu yüklemesine ihtiyaç duyar. c. Diğer pleytlerin cut-off değerlerini kullanmayınız b) 2 blank kuyucuğu hariç tüm kuyucuklara 50 μ1 Anti-HBe Nötralizasyon Solusyonu ekleyiniz. NOT: Çapraz kontaminasyonu önlemek için herbir örneği yüklerken yeni ve temiz pipet ucu kullanınız b) Pleyti yavaşça sallayınız b) Yapışkan slipten arka kısmını ayırın ve sıkıca reaksiyon pleytin üzerini kaplayacak şekilde bastırınız b) Reaksiyon pleytini +37±1 C deki su banyosunda ya da inkübatörde 1 saat inkübe ediniz b) İnkübasyon periyodunun sonunda yapışkan slipi çıkarıp atın ve 5.4)de belirtilen pleyt yıkama prosedürüne göre pleyti yıkayınız. 7

8 5.5.8b) 2 blank kuyucuğu hariç tüm kuyucuklara 100μ1 Anti-HBe Peroxidase Solusyonu ekleyiniz. NOT: Olası kontaminasyonları önlemek için pleyt duvarlarına değmeden yükleme yapınız b) Pleyti yavaşça sallayınız b) Yapışkan slipten arka kısmını ayırın ve sıkıca reaksiyon pleytin üzerini kaplayacak şekilde bastırınız b) Reaksiyon pleytini +37±1 C deki su banyosunda ya da inkübatörde 1 saat inkübe ediniz b) İnkübasyon periyodunun sonunda yapışkan slipi çıkarıp atın ve 5.4)de belirtilen pleyt yıkama prosedürüne gore pleyti yıkayınız b) Renk gelişimi için aşağıdaki iki yöntemden birini seçiniz: A) Kullanmadan önce temiz bir kapta TMB Substrat Solusyonu A ve B yi eşit miktarlarda karıştırınız. Blank kuyucuğu da dahil olmak üzere herbir kuyucuğa 100 l karıştırdığınız mix solusyondan ekleyiniz. Ya da B) Blank kuyucuğu da dahil olmak üzere herbir kuyucuğa önce 50l TMB Substrat Solusyonu A, sonra 50l TMB Substrat Solusyonu B ekleyiniz. Dikkatlice pleyti çalkalayınız. NOT: TMB Substrat Solusyon A renksiz veya açık mavi olmalıdır, aksi takdirde dökülmelidir. TMB Substrat Solusyonu A ve B nin karışımı miks hazırlandıktan sonraki 30 dakika içinde uygulanmalıdır. Miks solusyon yoğun ışıktan uzak tutulmalıdır b) Pleytin üzerini siyah kapak ile kapatıp oda sısında 30 dakika bekletiniz b) Reaksiyonu durdurmak için blank de dahil herbir kuyucuğa 100 µl 2N H2SO4 eklenmelidir b) Hassas bir spektrofotometre ile 30 dakika içinde kontrollerin ve test örneklerinin 450/ nm de absorbanslarını ölçünüz *. Blank kuyucuğu için blank spektrometre uygulayınız. NOT: Blank renksiz veya açık sarı olmalıdır; aksi takdirde test sonuçları geçersizdir. 5.6) Sonuçların Değerlendirilmesi (A) HBeAg Belirlenmesi 5.6.1a) NCx Hesaplanması (Negatif Kontrol Absorbansı). Örnek: Örnek No. Absorbans NCx = ( )/3 = NCx 0.1 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir a) PCx Hesaplanması (Pozitif Kontrol Absorbansı) Örnek: Örnek No. Absorbans PCx = ( ) /2 = PCx 0.4 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir a) P - N Değeri Hesaplanması P - N = PCx NCx Örnek: P - N = = P - N Değeri 0.3 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir a) Cutoff Değeri Hesaplanması Cutoff Değeri = NCx Örnek: Cutoff Değeri = = a) Yeniden Test Aralığı Hesaplanması Yeniden Test Aralığı = Cutoff Değeri ± 10% Yeniden Test Aralığı = ( ) den ( ) = den

9 5.6.6a) Test Sonuçlarının Geçerliliği a) NCx 0.1 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir a) PCx 0.4 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir a) P - N Değeri 0.3 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. (B) Anti-HBe Belirlenmesi 5.6.1b) NCx Hesaplanması (Negatif Kontrol Absorbansı). Örnek: Örnek No. Absorbans NCx =( )/3= NCx 0.4 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir b) PCx Hesaplanması (Pozitif Kontrol Absorbansı) Örnek: Örnek No. Absorbans PCx = ( )/2 = PCx 0.1 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir b) N - P Değeri Hesaplanması N - P = NCx PCx Örnek: N - P = = N P Değeri 0.3 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir b) Cutoff Değeri Hesaplanması Cutoff Değeri = (NCx + PCx) /2 Örnek: Cutoff Değeri = Cutoff Değeri = ( ) / 2 = b) Yeniden Test Aralığı Hesaplanması Yeniden Test Aralığı = Cutoff Değeri ± 10% Yeniden Test Aralığı =( ) den ( ) = den b) Test Sonuçlarının Geçerliliği b) NCx 0.4 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir b) PCx 0.1 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir b) N - P Değeri 0.3 olmalı, aksi takdirde test geçersizidir. 5.7) Sonuç Yorumlama (A) HBeAg Berlirlenmesi 5.7.1a) Absorbans değeri (0.9 X Cutoff Değeri) den düşük olan örnekler HBeAg için NEGATİF olarak kabul edilir a) Absorbans değeri (1.1 X Cutoff Değeri) den büyük olan örnekler HBeAg için POZİTİF olarak kabul edilir a) Absorbans değeri yeniden test aralığı (Cutoff Değeri ± 10%) içinde olan örnekler tekrar test edilmeli ve sonuçları yukarıdaki gibi değerlendirilmelidir. Her iki test sonucu da yeniden test aralığı içinde çıkan örnekler bilinmeyen olarak rapor edilmelidir. Bu hastalardan yeni örnekler alınarak çalışılmalıdır. (B) Anti-HBe Belirlenmesi 5.7.1b) Absorbans değeri (1.1 X Cutoff Değeri) den büyük olan örnekler Anti-HBe için NEGATİF olarak kabul edilir b) Absorbans değeri (0.9 X Cutoff Değeri) den küçük olan örnekler Anti-HBe için POZİTİF olarak kabul edilir. 9

10 5.7.3b) Absorbans değeri yeniden test aralığı (Cutoff Değeri ± 10%) içinde olan örnekler tekrar test edilmeli ve sonuçları yukarıdaki gibi değerlendirilmelidir. Her iki test sonucu da yeniden test aralığı içinde çıkan örnekler bilinmeyen olarak rapor edilmelidir. Bu hastalardan yeni örnekler alınarak çalışılmalıdır. 5.8) Sorun Giderme Eğer sonuç alınamazsa, aşağıdaki sorun giderme maddelerini kontrol ediniz: 5.8.1) Yanlış yıkama prosedürü uygulanması ) Pozitif örnekler ile kontaminasyon ) Örnek, konjugat ya da substrattan yanlış miktarlarda uygulama ) Kuyucuk kenarının konjugat ile kontamine olması ) Örneğin; sediment içeren örnek, hemolize olmuş serum ya da plazma gibi yanlış örneklerin kullanılması ya da kullanımdan önce örneklerin iyi karıştırılmaması ) Yanlış inkübasyon zamanı ya da sıcaklığı uygulanması ) Aspiratör/dağıtıcı cihazların başlıklarının ya da iğnelerinin tıkanması ) Yetersiz aspirasyon. 5.9) Sınırlamalar ve Engellemeler 5.9.1) Bu reaktif kiti sadece insan serumu ve plazması için kullanılır ) Bu reaktif kiti kadavra örnekleri için kullanıma uygun değildir ) Teknisyenden ya da bozuk cihazlardan kaynaklanan büyük teknik hatalardan ötürü her enzim immunotest kiti ile tekrar edilemez yanlış pozitif sonuçlar alınabilir ) Bazen tekrar edilebilir yanlış sonuçlar (2%) görülebilir ) Anti-HBe ya da HBeAg negatif sonuçlar, diğer kanıtlar olmadan, önceki olası Hepatit B virus enfeksiyonundan korunmuş olduğunu göstermez ) EASE BN-96(TMB) Anti-HBe kitinde düşük pozitif sonuçlar hastanın korunduğuna dair kanıt değildir ve Hepatit B virusu ile enfekte olmuş örneklerin dışında bırakılamaz ) Anti-HBe pozitif örnekler standart materyallerin bir seri seyreltilerinde her zaman doğrusal seri dilusyonlarda olmazlar ) Çeşitli Karışımlar: Çeşitli denemeler sonucunda elde edilen sonuçlar aşağıdadır: 1. Lityum heparinli, EDTA lı, sitratlı gibi farklı antikoagülantlar karıştırılmamalıdır. 2. Isı ile muamele edilmiş örneklerin (+60 C, 10 saat) HBsAg titresini azalttığı görülmüştür. 3. Aşağıdaki durumların oluştuğu örnekler kullanılarak yapılan testlerde çapraz reaksiyon oluşmadığı gözlemlenmiştir: a) HAV, EBV, CMV, HSV I, HSV II, Rubella, Toxoplasmosa, HCV, HIV, Anti-HBe(+), ahbe(+) ile enfekte olmuş örnekler. 4. Çeşitli karışımlar içeren örnekler [trigliserit (lipemia), hemoglobin (hemolizis), bilirubin (sarılık), monoklonal immunoglobulin komponentleri, yüksek oranda otoimmun antikorlar (rheumatoid factor-rf, antinuclear antibodies-ana ya da antimitochondrial antibodies-ana)] ve hamile bayanlardan alınmış örnekler ile yapılan çalışmalar EASE BN-96(TMB) kiti ile çalışmalarda kullanılabilir. 5.10) Performans Özellikleri ) HBeAg Testi ) Analitik Özgünlük HBeAg materyali ile yayınlanmış denemeler EASE BN-96(TMB) testinde üç farklı koagülant ile alınan serum ve farklı tiplerdeki plazmalar arasındaki test sonuçları eşit bulunmuştur. Lipemik, hemolitik, ikterik, yüksek monoclonal seviyesine sahip ve artmış otoimmun antikor seviyesine sahip örnekler ile yapılan testlerde, test sonuıçlarına etkili olmadıkları görülmüştür. Hamilelik HbeAg test sonuçlarını etkilememektedir. Bu özellikleri gösteren örnekler yanlış negative ya da yanlış pozitif sonuçlara neden olmamaktadır ) Analitik Duyarlılık 1a) 1b) 10

11 Figure 1a ve b de B55C18PT lot numaralı bir dizi seyreltilmiş PEI HBeAg standart gösterilmiştir. Analitik duyarlılık ve PEI Units/mL olarak ölçülmüştür. 2a) 2b) Figure 2a ve b de B55C19PT lot numaralı bir dizi seyreltilmiş PEI HBeAg standart gösterilmiştir. Analitik duyarlılık ve PEI Units/mL olarak ölçülmüştür. HBeAg için değerler: 0.532; 0.544; 0.656; 0.624: HBeAg duyarlılığı 0.59 PEI units/ml ± ) Antijen Fazlalığı/Yüksek Doz Etkisi Bir serumun antijen fazlalığı/yüksek doz etkisini test etmek için, 10,000 U/mL konsantrasyonda HBeAg ve iki farklı lot numarasına sahip GBC EASE BN-96 ile test yapılmıştır. Heriki lot numarası ile de yüksek doz etkisi tespit edilmemiştir ) Diagnostik Özgünlük GB EASE BN-96 (TMB) HBV Negatif Donor ve Klinik örneklerin HBeAg - Reaktivitesi Avrupa Performans Değerlendirmesi sonuçları HBeAg negative Örnekler GBC Abbott Hastaneye yatırılmış Hastalar Potansiyel Karışımlı Örnekler Toplam Diagnostik Özgünlük=111 /112= % Klinik populasyon için test özgünlüğü 99.12% ) Diagnostik Duyarlılık ) HBV Enfeksiyonlu Kişiler 1. Avrupa Performans Değerlendirmesi tarafından tanımlanan diagnostik duyarlılık sonuçları aşağıdadır: Örnek Örnek Sayısı Reaktif Duyarlılık HBeAg pozitif sera % Diagnostik duyarlılık = 197/200 = 98.5% ) Ticari serokonversiyon paneli 2 ticari geçerli HBV serokonvensiyon paneli Profil Diagnostics RP-016 ve RP-009, akut hepatit B hastalarından aylık ya da haftalık periyotlarla örnek alınmasının takibini yapmaktadırlar. Tüm paneller HBV spesifik serolojik markırlar (HBeAg, Anti-HBe, anti-hbs, anti-hbc, anti-hbc-igm, and HBsAg) için nitelendirilmiştir. Panel-ID EASE BN-96 Abbott AxSym Farklar (TMB) PD 2 pos bleeds 2 pos bleeds Farklılık yok RP-016 (57 ve 60 günler) (57 ve 60 günler) PD 7 pos bleeds, 1 bleed 9 pos bleeds, Abbott Axsym 2 gün 11

12 B55C18PT1 EASE BN-96 (TMB) Kullanım manueli Dok. No.: W7.3IUB5 Yayım tarihi:2007/08/29 英 -2 RP-009 gri zonda (13 (GZ), 29, 31,36, 53, 56, 69, 81 günler) (11, 13, 29, 31,36, 53, 56, 69, 81 günler) önceki veya 2 gün sonraki kan alımında reaktif bulunmuştur ) Kesinlik ) Doğruluk: çalışma içi tekrarlanabilirlik ve çalışmalar arası çoğalabilirlik EASE BN-96 testi pozitif kontrol 44.0 PEI U/ml ve HBeAg seviyesi cutoff değerinin hemen üzerinde ve orta seviyede olan bir serum örneği kullanılmıştır. Aşağıdaki tabloda çalışma içi tekrarlanabilirlik ve çalışmalar arası çoğalabilirlik sonuçları gösterilmiştir. Test No Örnek Test Boyutu Sonuçları Kabul Edilen Aralık N = % Pozitif Kontrol çalışma-içi N = % CV COI 15% N = % Çalışmalar-arası N = % CV COI 25% N = % PC/4 çalışma-içi N = % CV COI 25% N = % Çalışmalar-arası N = % CV COI 30% ) İzlenebilirlik GBC HBeAg Uzman Kalibratörü PEI HBeAg Standartlarına karşı EASE BN-96(TMB) kiti kalibrasyonunu yapmıştır. HBeAg için Paul Ehrlich enstitüsü (PEI) Standartlarının rölatif oranı GBC HBeAg Uzman Kalibratörüne karşı ( % CI) dır. EASE BN-96 (TMB) kitinin Pozitif Kontrol konsantrasyonu GBC HBeAg uzman kalibratörüne karşı 44.0 PEI U/ml bulunmuştur ) Anti-HBe Testi ) Analitik Özgünlük Negatif olan serum örnekleri ile yapılan AntiHBe spike çalışması ve üç antikoagülanlı örnekler ile yapılan çalışmada EASE BN-96(TMB) testi benzer sonuçları vermiştir. Lipemik,hemolitik, ikterik ve yüksek seviyede oto immune antikor içeren serum örnekleri test sonuçlarını etkilemememktedir. Gebelik, test sonuçlarını etkilemez. Bu karakterdeki örnekler yalancı pozitiflik ve yalancı negatifliğe neden olmazlar ) Analitik Duyarlılık 1a) 1b) EASE BN-96 ahbe [S/CO] Analytical Sensitivity = 0,3 PEI Units/mL y = x R 2 = anti-hbe [PEI Units/mL] EASE BN-96 ahbe [S/CO] Analytical Sensitivity = 0,3 PEI Units/mL anti-hbe [PEI Units/mL] B55C18PT1 y = x R 2 = a ve 1b de verilen tablo B55C18PT lot numaralı kit ile PEI Anti-HBe standartının iki seri dilüsyonunu göstermektedir. Hesaplanan analitik duyarlılık 0.30 PEI Units/mL dır. 2a) 2b) 12

13 EASE BN-96 ahbe [S/CO] Analytical Sensitivity = 0,26 PEI Units/mL anti-hbe [PEI Units/mL] B55C19PT1 y = x R 2 = EASE BN-96 ahbe [S/CO] Analytical Sensitiv ity = 0,34 PEI Units /ml anti-hbe [PEI Units/mL] B55C18PT1 y = x R 2 = a ve 2b de verilen tablo B55C18PT lot numaralı kit ile PEI Anti-HBe standartının iki seri dilüsyonunu göstermektedir. Hesaplanan analitik duyarlılık 0.30 PEI Units/mL dır. Anti-HBe için 0.30; 0.30; 0.26; 0.34: değerleri elde edilmiştir. Ortalama Anti-HBe duyarlılığı 0.3 PEI units/ml ± dır ) Antijen Fazlalığı/Yüksek Doz Etkisi Yarışmalı test yapısında olduğu için yüksek doz Hook etkisi ortaya çıkmaz ) Diagnostik Özgünlük HBV negative donör ve klinik örneklerde Avrupa Performans Değerlendirmesine gore GB EASE BN-96 (TMB) sonuçları. Anti-HBe negatif Örnek GBC Abbott Seçilmemiş Örnekler Hastaneye yatırılmış hastalar Diagnostik özgünlük =196 /197= % Klinik populasyon için test özgünlüğü 99.49% ) Diagnostik Duyarlılık ) HBV Enfeksiyonlu Kişiler 1. Avrupa Performans Değerlendirmesi tarafından tanımlanan diagnostic duyarlılık sonuçları aşağıdadır: Örnek Örnek Sayısı Reaktif Duyarlılık HBeAg pozitif sera % Diagnostik duyarlılık = 199/201 = 99.0% ) Ticari serokonversiyon paneli Akut Hepatit B hastalarında, iki ticari HBV serokonversiyon paneli ( Profile Diagnostics RP-016 and RP-009) kullanarak, haftalık veya aylık kan alımları ile yapılan karşılaştırmalı çalışmalar. Panel-ID EASE BN-96 (TMB) Abbott AxSym Farklar RP pos bleeds 10 pos bleeds Abbott AxSym 2 gün (107, 109, 114, 116, 121, (81, 88, 107, 109,114, 116, erken ya da 26 gün 123, 128, 157 günler ) 121, 123, 128,157 günler) erken reaktifleşmiştir. RP pos bleeds (88, 98, 109, 123, 133, 166, 186 günler) 9 pos bleeds, (88, 98, 109, 123,133, 152, 166, 186, 202 günler) Abbott AxSym daha fazla bleeds 152 ve 186 günde reaktifleşmiştir ) Kesinlik Doğruluk: intra-run ve inter run tekrarlanabilirlik EASE BN-96 testinin negative kontrolü, Cut-off değerinin hemen üzerinde pozitif olan bir örnek ve orta düzeyde pozitiflik veren bir serum örneği ile yapılan çalışma. intra-run ve inter run tekrarlanabilirlik değerleri aşağıdaki tabloda verilmiştir. 13

14 Test No Örnek Test Boyutu Sonuçları Kabul Edilen Aralık N = % Negatif Kontrol çalışma-içi N = % CV of COI 15% N = % Çalışmalar-arası N = % CV of COI 15% N = % PC/20 çalışma-içi N = % CV of COI 25% N = % Çalışmalar-arası N = % CV of COI 25% ) İzlenebilirlik GBC Anti-HBe Master Kalibratorü, EASE BN-96(TMB) testi kullanılarak PEI Anti-HBe Standartına gore ayarlanmıştır. EASE BN-96 (TMB) testinin pozitif kontrolü, GBC Anti-HBe Master Kalibrator e gore ayarlanmıştır ve 9.0 PEI U/ml olarak kabul edilmiştir. 5.11) Test Prosedürü İş Akış Şeması HBeAg TESTİ PRENSİBİ İnkübasyon: 37 C, 1saat 37 C, 1saat Blank için 2 kuyucuk ayırınız. Uygun kuyucuklara 100μl kontrollerden ( 3 X NC, 2 X PC) ve 100μl örneklerden ekleyiniz. Pleyti 37 C de 1 saat inkübe ediniz. Pleyti yıkayınız. 2 blank kuyucuğu hariç tüm kuyucuklara 100μl Anti-HBe Peroxidase Solusyonu ekleyiniz. Pleyti 37 C de 1 saat inkübe ediniz. Anti-HBe TESTİ PRENSİBİ İnkübasyon: 37 C, 1saat 37 C, 1saat Blank için 2 tane kuyucuk ayırınız. 50μl kontrollerden ( 3 X NC, 2 X PC) ve 50μl örneklerden ekleyiniz. Sonra her kuyuya 50 μl Neutralizing Solution ekleyiniz. Pleyti 37 C de 1 saat inkübe ediniz. Pleyti yıkayınız. 2 blank kuyucuğu hariç tüm kuyucuklara 100μl Anti-HBe Peroxidase Solusyonu ekleyiniz. Pleyti 37 C de 1 saat inkübe ediniz. Pleyti yıkayınız. (Renk gelişimi için iki enzimatik reaksiyondan birini seçin) 14

15 TMB Substrat Solusyonu A ve B den eşit miktarlarda karıştırın.karışımdan herbir kuyucuğa 100 µl ekleyin. Herbir kuyucuğa önce 50 µl TMB Substrat solusyonu A, sonra 50 µl TMB Substrat Solusyonu B ekleyin. Dikkatlice pleyti sallayın. Pleyti oda ısısında 30 dakika inkübe ediniz. Herbir kuyucuğa 100 µl 2N sülfirik asit ekleyiniz. 450 nm/ nm de absorbans ölçümü yapınız. *1 6) Referanslar *1 Spektrometrenin referans dalga boyu için 620nm ile 690nm kullanılmalıdır. Ayrıca, kullanıcı kullanım öncesi EASE BN-96 (TMB) ile birlikte spektrometre valide edilmelidir. *2 10 saat +60 de ısıtma işlemi sonrası hepatit B virüsü inaktivasyonu tamamlanmaz, J. Infect. Dis. 138: Symbols Key / Symbolschlussel / Explication des Symboles / Interpretazione simboli /Clave dos Simbolos / İşaret Açıklamaları Manufacturer / Hersteller / Fabricante / Fabbricante / Fabricant / Fabricante / Üretici In Vitro Diagnostic Medical Device / In-Vitro-Diagnostikum / Producto sanitario para diagnóstico in vitro / Dispositivo medico-diagnostico in vitro / Dispositif médical de diagnostic in vitro / Dispositivo médico para diagnóstico in vitro / İn-vitro Diagnostik Tıbbi Bakım Batch code / Chargenbezeichnung / Código de lote / Codice del lotto / Code du lot / Código do lote / Parti Kodu Use By / Verwendbar bis / Fecha de caducidad / Utilizzare entro / Utiliser jusque / Prazo de validade / İle kullanım Temperature limitation / Temperaturbegrenzung / Límite de temperatura / Limiti di temperatura /Limites de température / Limites de temperatura / Sıcaklık Limitleri CE Mark / CE-Zeichen / Marquage CE / Marchio CE / CE Marca / Marca CE / CE İşareti Catalogue number / Bestellnummer / Número de catálogo / Numero di catalogo / Référence du catalogue / Referência de catálogo / Katalog Numarası Consult Instructions for Use- / Gebrauchsanweisung beachten / Consulte las instrucciones de uso / Consultare le istruzioni per l'uso / Consulter les instructions d'utilisation / Consulte as instruções de utilização / Kullanım için Danışma Bilgileri 15