İmmünolojik Açıdan Transplantasyon Öncesi Olmazsa Olmazlar. Dr. Fatma Savran Oğuz İ.Ü İstanbul Tıp Fakültesi Doku Tipleme Laboratuvarı

Transkript

1 İmmünolojik Açıdan Transplantasyon Öncesi Olmazsa Olmazlar Dr. Fatma Savran Oğuz İ.Ü İstanbul Tıp Fakültesi Doku Tipleme Laboratuvarı

2 Sunum Planı İmmün yanıt HLA alelleri Anti HLA antikorları CXM (CDC-CXM, Flow CXM) PRA Luminex Virtual XM Non HLA antikorları

3 21. yy da Bireysel Tedavi 21. yüzyılda transplantasyonun önündeki en büyük engel transplante organın sağ kalımını sınırlayan «immun yanıt»tır. Donor spesifik antikorların varlığı (DSA) antikor ilişkili rejeksiyonu başlatan ve allograft sağ kalımı etkileyen ana faktördür.

4 İmmün Tanıma HLA moleküllerince sunulan yabancı peptidin T hücrelerince tanınmasıdır. TCR Yabancı peptid MHC molekülü hücresel hem de hümoral immün cevabı ortaya çıkarırlar.

5 T lenfositlerin tam olarak aktive olabilmesi için, antijen sunan hücre yüzeyinde bulunan, MHC/antijen kompleksinin, T cell reseptör (TCR)/CD3 tarafından tanınması ve ko-stimulatör yolakların aktive olmaları gereklidir.

6 Ch. 17

7 İmmün Tanıma II T hücreleri ve ASH arasındaki etkileşim; B7 Hücre yüzey CD40 molekülleri CD28 CD11a/CD18 ICAM-1 İntersellüler adezyon molekülleri

8

9 Ligand-reseptör çifti ko-stimulatör olarak görev görür. B7/CD28/CTLA-4 ko-stimulatör yoludur. CD28, B7 ligandına bağlanarak T hücrelerini aktive eder Bu aktivasyon T hücre çoğalması, sitotoksik lenfositlerin oluşumu ve lenfokin/sitokinlerin üretimi ile sonuçlanarak immun reaksiyonları potansiyalize eder

10 İmmun Yanıtın İnhibisyon ve Regülasyonu; -TCR sinyalizasyonu inhibe ederek, - IL-2 üretimini bloke ederek, -T hücre siklusunu baskılayarak, -CD4+ CD25+ regülatör T lenfosit (Treg) oluşumunu sağlayarak, -T hücre anerjisine ve T hücre apoptozisine yol açarak sağlanır.

11 HLA Molekülleri HLA antijenlerinin temel rolü : - öz tanıma - sağkalım Serolojik tanımlama: Antijen grupları, antikorlarla verdikleri reaksiyon değerlendirilerek belirlenir. Moleküler tanımlama: Aleller dizilimlerindeki (sekans) benzerliklere göre gruplanır. Bu dizilim serolojik reaksiyonlar ile de ilişkilidir.

12 HLA Tiplendirme Yöntemleri Düşük rezolüsyonlu Allel grubunu belirler ör: HLA-A*01 Orta rezolüsyonlu Sonuçta birkaç allel seçeneği birlikte verilir ör: HLA-A*01:01/01:02/01:03 Yüksek rezolüsyonlu Allelik düzeyde tiplendirme ör: HLA-A*01:01

13 Ön ek ile gen ayrım çizgisi ayırıcı Null (eksprese edilmeyen ) bir allel Alan ayırıcısı HLA ön eki GEN Allel grubu Spesifik HLA proteini Kodlanmayan bölgeler deki Farklılıklar Sinonim mutasyonu olan allel

14 HLA gen bölgesi yüksek oranda polimorfik bir bölge olup, Sınıf I HLA alleleri (n=8.124) ve sınıf II HLA alleleri (n= 2409) olmak üzere toplam farklı alel içermektedir ( 2013). HLA allellerinin sıklıkları ve dağılımları popülasyonlar arasında, etnik kökene göre farklılık gösterir.

15 Farklı HLA proteinleri HLA-A HLA-B HLA-C HLA-DR HLA-DQ HLA-DP Pekçok hasta HLA uyumsuz veriden nakil olmaktadır Her uyumsuz HLA antijeni antikor oluşumuna yol açmaz graft rejeksiyonuna neden olmaz 1. non-immunogenik HLA uyumsuzluğunu ön görebilmek mümkün müdür? 2. Özellikle sensitize hastalar için kabul edileblir veya edilemez uyumsuzlukları antikor testleri yapmadan tespit etmek mümkün müdür?

16 Türkiye deki sağlıklı bireylerle yapılan çalışmalarda, en sık rastlanan doku grupları HLA-A; HLA-B; HLA-DRB1; A2, A24 ve A3 B35, B51, B44 DR11, DR4,DR13 Bazı doku grupları toplumlarda yaygın, bazıları nadir rastlanan bir kalıtım şekli gösterir

17 HLA Alel Sıklıkları 9, ,93 9,95 13,53 9,55 HLA-DQB1*02:01 HLA-DQB1*03:01 HLA-DRB1*07:01 HLA-DRB1*11: ,4 10,3 20,65 11,18 13,21 30,17 HLA-DRB1*11:04 HLA-C*07:01 HLA-C*04:01 HLA-B*35:01 HLA-B*51:01 HLA-A*24:02 HLA-A*02:01

18 Her bir HLA antijeni, polimorfik amino asid residüleri tarafından tanımlanan epitopları sunar ve bunlara karşı da antikor oluşur. Anti-HLA antikoru anti-hla-a1 HLA-A1 HLA-A2 HLA-A3

19 Anti-HLA: HLA antijenine karşı oluşmuş antikor. Antijen havuzu, fenotip paneli=panel reaktif antikor (PRA) Spesifik bir donöre ait hücreler = Cross-match DSA: Donör spesifik antikor Cross-match PRA testi

20 Antikor testleri Bir hastanın antikor durumundaki değişikliği tespit etmenin en iyi yolu hastadan her ay kan alıp, antikor testi yapmaktır. Anti-HLA antikor testi için önerilen aralıklar, 3 ayda bir ya da 6 ayda bir Hastalar, tercihen diyalizlerinin ertesi günü olacak şekilde, 6 aylık aralıklarla anti-hla antikor tayini için kan vermek üzere yönlendirilmelidir.

21 Hastaya kan takılması halinde HLA laboratuarı mutlaka bilgilendirilmelidir. Kan takıldıktan 1 ay sonra antikor testi için kan verilmelidir. Örnek verme esnasında, Enfeksiyon olması testi etkiler.

22 Nakil sonrası dönemde, anti-hla antikor tayini pek çok laboratuarda rutin bir uygulama olmamakla birlikte, merkezler özellikle nakil sonrası 1., 7.,14.,21.,28. gün, 3.ay, 6. ay ve 12. aydaki serum örneklerini toplamak konusunda hassas olmalılardır.

23 Anti HLA antikor tayini ve CXM yöntemleri Hücresel yöntemler CDC Flow sitometri Solid faz immünoassay (soluble HLA molekülleri solid yapıda matrikse bağlıdır) ELISA Luminex (C4 d assay, C1 q assay) Luminex teknolojisi düşük düzeydeki HLA spesifik antikor tayininde hem CDC hem de flow sitometriden daha sensitiftir

24 XM Serolojik Yöntem ( Mikrolenfositotoksisite ) Flow-Sitometri ELISA

25 CDC-XM Yöntem olarak Serolojik HLA tiplendirilmesindeki ile aynıdır Alıcının serumu bu kez vericinin lenfositleri ile inkübe edilir DTT li ve DTT siz olarak iki ayrı plak hazırlanır DTT IgM antikorlarını uzaklaştırır

26 Serolojik Yöntem Hasta Serumu + Donör Lenfositleri + Kompleman + Boya, Formaldehid DEĞERLENDİRME

27 SEROLOJİK YÖNTEM OTO XM MAJOR DTT li XM NC ; IgG ; IgM Komplemansız

28

29 CDC-XM, nakil sonrası saatler/günler içerisinde meydana gelen ve allogreft rejeksiyonu ile greft kaybı açısından artmış risk ile ilişkili olan düşük seviyedeki DSA ları tespit etmek için yeterli hassasiyete sahip değildir. Gebel HM et al. Am J Transplant, 2003

30 Flow Sitometri Cross-Match Daha hassas olan flow sitometri cross-match (FC-XM), bir çok nakil merkezinde DSA tespitinde kullanılan hücre tabanlı mevcut en iyi test olarak kabul edilmektedir.

31 Neden FCXM? Düşük düzeydeki HLA Sınıf I antikorlarını Sınıf II antikorlarını Antikorun hedef hücresini T- XM ve B XM Tüm IgG alt gruplarını saptar.

32 Ig-G Antikorlar alt grupları vardır: IgG1 ve 3 kompleman aktivasyonunu güçlü IgG2 ve 4 zayıf aktive ederler. 1. ve 3. grup IgG reaktif özellikli 2. ve 4. grup IgG tolerans regüle edici antikorlar denilir.

33 Flow XM Alıcının serumu ile inkübe edilen verici lenfositlerine önce B ya da T hücresine spesifik floresan işaretli marker eklenir daha sonra 2. bir floresan boyaya sahip anti Ig G ilave edilir T FCXM (+) olan testte IgG-FITC histogramının negatif ve pozitif kontrolün IgG-FITC histogramları ile karşılaştırması ---- Negatif kontrol, Pozitif kontrol, ---- CM

34 T hücre ve B hücre pozitif kontrendikasyon anti sınıf I HLA antikorlarını gösterir; anti sınıf II HLA antikoru da var olabilir? T hücre pozitif- kontrendikasyon Yalnızca B hücre pozitifliği-tartışmalı - Sınıf II HLA-DSA - Düşük seviyede Sınıf I HLA-DSA - Enfeksiyon varlığı (1 ay sonra test tekrarlanır) - HLA dışı antikorlar - Spesifik olmayan bağlanmalar (yanlış pozitiflik) -Otoantikorlar (grefte zarar vermezler)

35 Flow Sitometrik XM reaksiyon paternleri T hücre B hücre Yorumlama Negatif Negatif HLA antikoru YOK veya çok düşük titre Negatif pozitif Öncellikle Sınıf II antikoru Negatif Zayıf pozitif Zayıf Sınıf I veya II antikoru pozitif pozitif Kuvvetli Sınıf I antikoru veya Sınıf I ve Sınıf II birlikte pozitif Negatif non-hla reaksiyonu? Transplantation Immunology methods and protocols 2013

36 Solid Faz Immunoassay-Luminex Test serumu önce sınıf I ve sınıf II HLA antijeni kaplı mikroboncuklarla inkübe edilir Test serumundaki mevcut HLA antikorları boncukların üzerindeki antijenlere bağlanır Non HLA antikorlar ve immün kompleksler Luminex sisteminde tespit edilmez.

37

38 DSA saptanması Tek antijen boncuk (SA bead) dayalı Solid faz yöntemleri Virtual Cross Match uygulaması SA bead ler ile saptanan tüm DSA lar klinik etkisi??

39 DSA ların patojenitesi arasında farklılık varsa Zararlı / Zararsız ayırımı nasıl yapılacak? Fonksiyone graft Rejeksiyon Öngörü? Graft kaybı

40 DSA karakterizasyonu yapılabilir mi? Kompleman bağlayıcı DSA IgG alt sınıflaması Çalışma tasarımları ve sonuçlardaki heterojenite nedeni ile bu tekniklerin klinik uygulamalarda nasıl kullanılacağına dair bir konsensus yok Amico P. American Journal of Transplantation 2015

41 Luminex Modifikasyonları C4d assay Kompleman fikse eden ve etmeyen antikorların ayrımında kullanılır. Kompleman aktivasyonu gerekir ve kompleman regüle edici faktörlerden etkilenir CRP ligandlarına bağlandıktan sonra, kompleman 1 q'yu aktive eder, böylece klasik yoldan kompleman aktivasyonu gerçekleşebilir. CRP aynı zamanda kompleman aktivasyonunu regüle eden inhibitör protein olan faktör H'yi de aktive edebilmektedir. C4d+ antikorların varlığının böbrek ve kalp graft ömrü ile ilişkili olduğunu gösteren yayınlar mevcut C4d antikorlarının böbrek graflerinde AMR ile ilişkisi?? De nova DSA kötü graft survi ilişkisinin MFI ve C4d den bağımsız olduğu gösterilmiş

42 Luminex Modifikasyonları C1q assay Komplemana bağlanan ve klasik yolağı aktive etme yeteneğine sahip antikorlar saptanır. Kompleman aktivasyonu gerekmez Kompleman regüle edici faktörlerden etkilenmez. Standart miktarda hc1q hasta serumuna eklenir; sonra SAB ler eklenir; en son PE konjuge anti hc1q antikorları eklenir

43 Luminex Modifikasyonları C1q assay Daha çok IgG antikoru saptar (CDC den ) Kompleman fikse eden IgM leri de saptar. Kardiyak ve renal transplant rejeksiyon ve C1q antikor ilişkisini gösteren yayınlar var.

44 Transplantasyon sonrası De novo DSA ile kötü graft sağkalım ilişkisi HLA uyumu graft rejeksiyonu sonrası yüksek sensitizasyonu önler

45 Uygun olmayan Antijenler Anti-HLA antikorlarının tespitin de tek HLA molekülleri ile kaplı solid faz immün (SFI) test lerin kullanıma girmesi antikor tespitinde öz güllüğü ve hassasiyeti artırmıştır. Solid Faz İncelemeler ile anti HLA antikorları (tek antijen) saptanır

46 Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı (Acceptable mismatch-eurotransplant) Bir hastanın (özellikle yüksek oranda sensitize hastaların) hiç HLA antikoru oluşturmadığı HLA antijenlerinin belirlenmesidir. Eurotransplant ta HLA-A, -B, -C, -DR, -DQ lokusları için kabul edilebilir uyumsuzluklar belirlenmektedir.

47 Acceptable mismatch Kabul edilebilir uyumsuzluklar HLA: A1, A2, B7, B18 acceptable mismatch B18 pozitif negatif PRA %92 HLA: A1, A24, B7, B8 acceptable mismatch A24 Hasta HLA: A1, A2, B7, B8

48 Kabul edilebilir uyumsuz antijenler Kabul edilebilir uyumsuz antijenler hastanın serumunun reaksiyon vermediği, yani antikor oluşturmadığı antijenlerdir. A2, A11, B7, B39, CW4

49 %PRA Yüksek oranda sensitize hastalar, %85 ve üzeri oranda panel reaktif antikora sahip hastalar olarak tanımlanır. Eurotransplant Kalite Kontrol Programı aynı serumun %PRA değerinin farklı laboratuvarlar arasında %5-80 değişiklik gösterdiğini, HLA antikor spesifisitesinin ise oldukça uyumlu olduğunu ortaya koymuştur.

50 Paneldeki hücrelerin %85 i ile pozitif veren Yüksek oranda sensitize hasta Virtual PRA Donör popülasyonundaki antijen frekansına göre

51 Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı X Yüksek oranda sensitize hastalar: PRA %80-85 VPRA- cpra sanal PRA Sensitizasyon derecesini tanımlamanın en iyi şekli, bir hastanın HLA antikorlarının bir donör popülasyonun da ki hedef antijenlerin frekansına göre değerlendirilmesidir ki, buna sanal (virtual) PRA denmektedir (%PRA= % popülasyon reaktif antikorlar). Doxiadis IIN, Claas FHJ.Current Opinion Org Transplant, 2009

52 Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı Bir hastanın anti-hla antikoru geliştirdiği allellerin gen frekanslarının bilinmesi ile geleneksel PRA değerinden daha doğru bir şekilde anti-hla reaktivitesini yansıtan (virtual) PRA yüzdesi hesaplanabilmektedir. Gerçek PRA hesaplama Programına adresinden erişilebilmektedir.

53 Kabul edilebilir uyumsuzluk yaklaşımı

54 Flow sitometri cross-match (FC-XM), bir çok nakil merkezinde DSA tespitinde kullanılan hücre tabanlı mevcut en iyi test olarak kabul edilmektedir. Anlamlı olmayan antikorların, hücre yüzeyine özgül olmayan bağlanmaları nedeniyle yanlış pozitif sonuçlar ortaya çıkabilir!!!!!! Wen R et al. Kidney Int, 2006

55 Yeni teknikler; Cross-match sonuçlarının doğru bir şekilde öngörülmesini sağlama potansiyeline sahiptir. VIRTUAL CROSS-MATCH BİR ÖNGÖRÜDÜR Alıcının önceden karakterize edilmiş antikor spesifitelerine dayanarak, nihai cross-match sonuçlarının tahmin edilmesidir.

56 Virtual Cross-Match Tek antijen boncuklar kullanılarak yapılan HLA- antikor testlerinden elde edilen ayrıntılı HLA spesifitelerinin, potansiyel bir donörün HLA doku tipi ile karşılaştırılarak, ayrıntılı HLA spesifisiteleri ve buna bağlı olarak kabul edilebilir/kabul edilemez antijenlerin tanımlanarak, potansiyel bir donörün HLA fenotipine göre bu donörle yapılacak nihai cross-match sonucunun öngörülmesine VIRTUAL CROSS-MATCH denir.

57 Hasta doku tiplemesi HLA-A, -B, -C, -DR, -DR, -DQ, -DP Antikor tarama negatif pozitif PRA 0 Sensitize değil Luminex/Flow tek antijen boncuklar HLA-A, -B, -C, -DR, -DR, -DQ, -DP Donör HLA tiplemesi HLA-A, -B, -C, -DR, -DRw, -DQ, -DP Kabul edilemeyen antijenlerin belirlenmesi VIRTUAL CROSS MATCH

58 Virtual Cross-Match AKTÜEL CDC-XM vxm Bunun sebebi, CDC-XM in hassasiyet ve özgüllüğünün, vxm için kullanılan antikor testlerininkinden düşük olmasıdır. KORELASYON OLDUKÇA KÖTÜDÜR Vaidya S et al. Transplantation, 2006 Nikaein A et al. Transplantation 2009

59 Virtual Cross-Match AKTÜEL FC-XM vxm Bunun sebebi, FC-XM in hassasiyet ve özgüllüğünün, vxm için kullanılan antikor testlerininkine benzer olmasıdır. KORELASYON >%85 Vaidya S et al. Transplantation, 2006 Nikaein A et al. Transplantation 2009

60 Nakilden 10 önce CDC XM ve Flow XM analizi yapılmalı CDC (pozitif) hiperakut rejeksiyon Flow XM (pozitif) graftı 1 yıl içine kaybetme riski var

61

62 ÖNERİLER Transplantasyon öncesi en az bir kez solid faz immunoassay ile anti HLA sınıf I ve II antikorları araştırılmalıdır. HLA-immünize hastalarda en az bir kez SAB (single antigen bead) immunoassay uygulanmalıdır (özellikle Cw,DQA,DPA ve DPB ye karşı gelişen ve diğer yöntemlerle gösterilemeyen antikorlar için) SPI yöntemle hücre bazlı yöntemlerle desteklenmeli ve SPI ile ölçülen antikor düzeyinin pozitif cross match e yol açıp açmayacağı değerlendirimelidir Luminex teknolojisini kullanırken antijen yoğunluğu ya da boncuklar üzerindeki antijenlerin denatürasyonu gibi teknik faktörlerin sonuçları etkileyebileceği göz önünde bulundurulmalıdır

63 PRETRANSPLANTASYON GRUBU ÖNERİLERİ Antikor ve CXM sonuçlarına göre hastanın risk kategorisi belirlenmelidir Doğru CXM sonuçları doğru HLA tiplendirmesi ile ilişkili olduğundan donörün HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLADRB4, HLA-DRB5, HLA-DQA, HLA-DQB, HLA-DPA, ve HLA-DPB tiplendirmesi yapılmalıdır CDC ile saptanmış DSA ve pozitif CXM (en yakın tarihli serumda) varlığında AMR ve graft kaybı riski yüksek olacağından transplantasyondan kaçınılmalıdır DSA pozitif ancak CDC CXM negatif hastalar yüksek riskli kabul edilmelidirler ancak transplantasyona kontrendikasyon sayılmamalıdır Eğer SAB ile tüm sınıf I ve II antikorlar negatifse prospektif CXM yapılmadan transplantasyon yapılabilir Kalp ve akciğer nakillerinde DSA pozitifliğinden kaçınılmalıdır (erken akut rejeksiyon riski); karaciğer, ince barsak ve adacık hücre nakillerinde DSA varlığı risk olarak algılanmalıdır HLA antikorlarının varlığı farklı zamanlarda alınan 2 serum örneğinde teyit edilmelidir

64 POST TRANSPLANTASYON GRUBU ÖNERİLERİ De novo DSA gelişimini takip edebilmek için tüm donörlerin DNA sı ve alıcının pretransplantasyon serumu saklanmalıdır Düşük riskli hastalarda (nonsensitize, ilk transplantasyon) Transplantasyon sonrası aylar arası en az 1 kez DSA bakılmalı Tedavi değişikliği planlanması, tedaviye uyumsuzluk şüphesi, graft disfonksiyonu gibi durumlarda DSA bakılmalı DSA pozitif ise BİYOPSİ yapılmalı Orta risk grubu ( Önceden DSA + ancak şu an -) İlk 1 ay içinde DSA biyopsi Yüksek risk grubu (DSA+/XM -) Transplantasyondan sonraki 3 ay içinde biyopsi ve DSA takibi Çok yüksek risk (Desensitize edilmiş) Yakın DSA takibi ve 3 ay içinde biyopsi

65 Non HLA antikorları MICA antikorları?? Angiotensin II tip I reseptör aktive edici IgG Self antijenlere karşı gelişen antikorlar (Tubulin, Kollajen, Myosin, Vimentin ) Anti-peroksizomal trans 2 enoly coa redüktaz Endotel prekürsör hücreler ile FLOW XM

66 Cylex ImmunoKnow Cell Function Assay CD4+ Hücre aktivitesini ölçmek Hücrenin bazal ATP ve uyarı sonrası ATP sini ölçüyor Berlung D. Transp Immunol 2011

67 Gelecek Hücre içi sitokinler Tolerojenik Dendritik Hücreler T supresör hücre uyarımı Transkriptomik çalışmaları, ekspresyon analizleri, RNA dizileme HLA tetramer boyama ile HLA spesifik B hücre saptanması

68 HLA TEŞEKKÜRLER