Revizyon çubuğu, önceki versiyonda yapılan güncellemeleri göstermektedir.

Transkript

1 Revizyon çubuğu, önceki versiyonda yapılan güncellemeleri göstermektedir. Kullanım Amacı Enzygnost HBsAg 6.0 insan serum veya plazmasındaki hepatit B (yüzey) antijeninin kalitatif tespiti için kullanılan bir enzim immün testidir. Enzim immün testi ELISA işlemcileri, BEP III Sistemi, BEP 2000 Sistemi ya da BEP 2000 Advance Sistemi ve ayrıca Quadriga ve Quadriga BeFree Sistemleri kullanılarak işlenebilir. Testin otomatik olmayan şekilde çalışılması da mümkündür. Özet ve Açıklama Tip B viral hepatit genellikle serumda hepatit B yüzey antijeni (HBsAg) görünmesine eşlik eder 1,2. Normal olarak HBsAg serumda hastalık başlangıcından önce 2 veya 3 hafta erken saptanabilir ve karakteristik semptomlar göründüğünde tepe titresini yakalar (sarılık, karaciğere spesifik enzimlerin konsantrasyonlarında değişiklikler) 3. Bunu normal olarak antijenin derece derece eliminasyonu izler. Bazı durumlarda ve subklinik hepatit B enfeksiyonlarının bilinmeyen bir yüzdesinde, antijen serumda yaşam boyu veya yıllarca saptanabilir 4. HBsAg içeren kan transfüzyonu 5, sıklıkla transfüzyonu alan kişinin hepatit B enfeksiyonu ile sonuçlandığından, HBsAg testinin özel önemi, post-transfüyon hepatit B sıklığını azaltma yöntemi olarak özellikle kan bağışlarının taranmasıyla ilgilidir 6. Hepatit B virüsünün önceden bilinen sekiz genotipinin (A - H) 7,8 saptanmasına ek olarak, transfüzyon yoluyla tanısal olarak gözden kaçan mutantların taşınmasını engellemek için HBsAg nin değişen formlarının saptanması son yıllarda 9 gittikçe önem kazanmaktadır. Buna ek olarak HBsAg testi ayrıca akut ve kronik hepatit B enfeksiyonu tanısı için kullanılır 5. HBsAg testlerinin yüksek duyarlılığına rağmen, hepatit B nin HBsAg-negatif örnek yoluyla taşınma riski tamamen yok edilemez. Yöntem Prensibi Reaktifler Enzygnost HBsAg 6.0, iki adımlı bir yönteme dayalı bir enzim immun testidir. İlk adımda örnekteki HBsAg eş zamanlı olarak mikrotitrasyon plağı haznelerine bağlı poliklonal anti-hbs antikorları ve Konjügat 1 ile reaksiyona girer (Anti-HBs/Biotin, mavi renkli). İkinci adımda, bağlı olmayan reaktantların çıkarılmasından sonra, Konjügat 2 (Streptavidin/POD, sarı renkli) Konjügat 1 ile reaksiyona girer. Bağlı olmayan reaktantların çıkarılmasından sonra, bağlı Konjügat 2 nin enzim aktivitesi belirlenir (mavi renkli reaksiyon). Kromojenin enzimatik dönüşümü Durdurma Solüsyonu POD un eklenmesiyle tamamlanır (sarı renkli reaksiyon). Renk yoğunluğu örnekteki antijen konsantrasyonuyla orantılıdır. Simgeler Sağlanan Materyaller Enzygnost HBsAg x x x 96 (Q) MTP Enzygnost HBsAg 6.0 test plağı 2 prç 10 prç 10 prç CONJUGATE 1 Konjügat 1 (Anti-HBs/Biotin) 2 x 5 ml 10 x 5 ml 3 x 15 ml OPFMG03C48 Rev. 11 TR /13

2 Simgeler Sağlanan Materyaller CONJUGATE 2 Konjügat 2 (Streptavidin/POD) 2 x 12.5 ml 10 x 12.5 ml 2 x 75 ml CONTROL HBsAg Kontrol Serum, negatif 2 x 2.5 ml 4 x 2.5 ml 3 x 2.5 ml CONTROL + HBsAg Kontrol Serumu, pozitif 2 x 1.5 ml 3 x 1.5 ml 3 x 1.5 ml Etiket Konjügat 1 için boş şişe prç --- Etiket Konjügat 2 için boş şişe prç --- Kullanım Talimatları 1 prç 1 prç 1 prç Değerler barkod tablosu 1 prç 1 prç 1 prç Polietilen torba 1 prç 1 prç 1 prç Test plağı, Konjugat 1, Konjugat 2 ve bunların yanı sıra HBsAg Kontrol Serumu, negatif ve HBsAg Kontrol Serumu, pozitif, ambalaj üzerinde yazılı olarak temin edilmiş ve barkod değerler tablosunda belirtilmiş 6 haneli lot numarası kombinasyonunda kullanılmalıdır. Gerekli olan ancak sağlanmayan materyaller Bileşim Enzygnost /TMB için Ek Reaktifler ( REF OUVP) Kromojen TMB ve Tampon/Substrat TMB reaktifleri ancak Yardımcı Reaktifler Kiti OUVP de belirtilen lot kombinasyonunda kullanılabilir. Geçerli lot numaraları ambalaj üzerinde verilen 6 haneli numaralardır. Enzygnost HBsAg 6.0 test plağı: HBsAg koyun antikorlarıyla kaplanmış mikrotitrasyon plağı. Konjügat 1 (Anti-HBs/Biotin): Monoklonal anti-hbs (fare), konjüge edilmiş biotin, mavi renkli. Koruyucu: fenol ( 1 g/l) Konjügat 2 (Streptavidin/POD): Streptavidin, konjüge edilmiş peroksidaz (POD), sarı renkli. Koruyucu: fenol ( 1 g/l) HBsAg Kontrol Serum, negatif: Stabilize insan serumu, yeşil renkli, nominal absorbans: Koruyucu: fenol ( 1 g/l) HBsAg Kontrol Serum, pozitif: Stabilize insan serumu: 0.15 ile 0.32 U/mL, hedef değer: 0.25 U/mL (Paul Ehrlich Enstitüsünün referans materyali HBsAg Ad ye göre izlenebilir durumdadır), kırmızı renkli, nominal absorbans 0.7. Koruyucu: Uyarılar ve Önlemler fenol ( 1 g/l) In vitro tanı amaçlı kullanım içindir. Test, toplu örnekler için değil ayrı örneklerin test edilmesi için geliştirilmiştir. DİKKAT! POTANSİYEL BİYOLOJİK TEHLİKE HBsAg Kontrol Serumunun (negatif) üretiminde kullanılan her bir donör ya da donör birimi, In Vitro Tanı Amaçlı Tıbbi Cihazlara İlişkin AB Direktifi ile uyumlu veya ABD Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) tarafından onaylanmış testler kullanılarak insan immün yetmezlik virüsü (HIV) 1 ve 2, hepatit B virüsü (HBV) ve hepatit C virüsü (HCV) bakımından test edilmiş ve negatif olduğu bulunmuştur. Bilinen hiçbir test bulaşıcı etkenlerin var olmadığı konusunda tam güvence sunamayacağı için, insanlardan elde edilen tüm örneklerin gerekli dikkat ve özen gösterilerek kullanılması gerekmektedir. Test prosedürünün tamamı boyunca koruyucu gözlük takılması tavsiye edilir. Kullanılan eldivenlerin maruz kalınan materyallere karşı koruma sağlama yeterliliği bilgisi için lütfen üretici talimatlarına uyun. 2/ OPFMG03C48 Rev. 11 TR

3 Atıklar açısından, katı infeksiyöz materyalin en az 1 saat süreyle 121 C de otoklavlanması önerilir. Tüm emilen sıvılar, birbirlerine seri olarak bağlantılı iki kapta toplanmalıdır Haznelerin her ikisi de, insan patojenlerini inaktive etmek açısından uygun bir dezenfektan içermelidir. Üretici tarafından belirtilmiş olan konsantrasyonlara ve reaksiyon sürelerine uyulmalıdır. Tampon/Substrat TMB, Kullanıma Hazır Kromojen Solüsyonu ve Durdurma Solüsyonu POD un ağır metal iyonları ya da okside edici maddeler ile temasından kaçınılmalıdır (sıvı ile doğrudan temasa geçen metal parçaları bulunan pipetler kullanmayın). Substrat reaksiyon aşamaları, hipoklorit içeren dezenfektanların yakınında gerçekleştirilmemelidir. Kromojen Çalışma Kromojen Solüsyonu test plağına aktarılmadan önce bir anda mavi renge dönerse solüsyon kontamine olmuş demektir; bu durumda temiz bir kap içerisinde yeni solüsyon hazırlanmalıdır. Yukarıda bahsedilen solüsyonların ciltle temas etmesinden kaçınılmalıdır. Reaktiflerin Hazırlanması Teste başlamadan önce tüm reaktifleri ve test örneklerini 15 ile 25 C arası ısıya getirin. Bu adımda test plağından folyo torbayı çıkartmayın. Testi işlemeye başlamadan önce gerekmeyen stripleri yuvadan çıkartın ve bunları daha sonra kullanmak üzere ambalajdaki polietilen torbaya koyun. Reaktifler ile reaktif çalışma solüsyonlarının karıştırılması gerekiyorsa, işlem sırasında köpük oluşmasını engelleyin. BEP III Sistem üzerinde çok sayıda örnek dizisiyle çalışırken sıklıkla şırınga değiştirmemek için 10 x 96 (Q) kiti tavsiye edilir. 10 x 96 kitinin varyantını kullanırken, birkaç flakon konjugat daha büyük şişelere aktarılabilir (örneğin Ek Reaktifler REF OUVP 17 kitindeki Kromojen Çalışma Solüsyonu için temin edilen kullanılmamış boş şişelere) ve Konjugat 1 (Anti-HBs/Biotin) veya Konjugat 2 (Streptavidin/POD) için, reaktif kapağına üzerlerine BOŞ ŞİŞE KONJUGAT etiketi koyulmuş olarak yerleştirilebilir. Her test plağı için, Enzygnost /TMB için Yardımcı Reaktifler Kitinde bulunan 20 ml Yıkama Solüsyonu POD u saf su veya deiyonize su ile 400 ml ye seyreltin. Her test plağı için, 1 ml Kromojen TMB yi 10 ml Tampon/Substrat TMB yi, Enzygnost TMB için Yardımcı Reaktifler Kitiyle birlikte verilen boş plastik şişede seyreltin (Kromojen Çalışma Solüsyonu). Işıktan koruyarak saklayın. Kullanılmasının ardından şişeyi distile ya da deiyonize su ile iyice durulayın. Ayrıca, Kromojen TMB şişesinin ve Tampon/Substrat TMB şişesinin tüm içeriğinin boş şişeye birlikte doldurulmasına izin verilir. Enzygnost /TMB, REF OUVP 27 için Ek reaktifleri kullanılırken, Kromojen TMB flakonu içerisindeki miktarın tamamı Buffer/Substrate TMB barkod etiketli flakonun içerisine aktarılmalıdır. Saklama ve Stabilite Enzygnost HBsAg 6.0 kitinin tüm bileşenleri, açılmamış halde saklandığı takdirde, etiketlerde verilmiş olan son kullanma tarihlerine kadar kullanılabilir. Açık reaktiflerin tam stabilitesi ve saklama verileri için Tablo 1 e bakın. Tablo 2, reaktiflerin çeşitli analizör sistemlerinde cihaz üzerindeki stabilitesi hakkında bilgi içerir. Gerekli Olan Donanım BEP III: BEP 2000/BEP 2000 Advance : Quadriga : Pipetler: Örneklerin dağıtılmasından sonra testin otomatik olarak gerçekleştirilmesinin yanı sıra değerlendirilmesi için. Testin tam otomatik olarak gerçekleştirilmesi ve değerlendirilmesi için. BEP III ile birlikte testin tam otomatik gerçekleşmesi ve değerlendirilmesi için. Sabit veya değişken hacimli piston tipi pipetler veya hacmi ayarlanabilir hacimli tek ve çok kanallı pipetler. Testin otomatik olarak gerçekleşmemesi durumunda ek olarak aşağıdakiler de gereklidir: OPFMG03C48 Rev. 11 TR /13

4 Örnekler Prosedür İnkübatör: Yıkama cihazı: Fotometre: Kapaklı termostatik su banyosu (37 ±1 C) veya benzer bir inkübasyon yöntemi. Miktotitrasyon plak yıkayıcı. Testte kullanılan tüm ekipman onaylanmış olmalıdır. Mikrotitrasyon plakları için uygun fotometre, ölçüm dalga boyu 450 nm, referans dalga boyu 650 nm (uygun olduğunda 615 nm ile 690 nm arası). SURE ölçümleri için dalga boyunun 405 nm olması da gereklidir. Uygun olan örnekler standart laboratuvar teknikleriyle elde edilmiş olan ayrı ayrı örneklerdir (insan serumları veya CPDA'lı/EDTA'lı/heparinize edilmiş/sitratlı plazma). CPDA, heparinize edilmiş ve sitratlı plazma örnekleri, 3 günden fazla olmamak kaydıyla 2 ile 8 C'de saklanmalıdır, serum ve EDTA plazması ise bu saklama koşullarında 8 güne kadar kullanılabilir. Numuneler bu süre içinde dondurulmuşsa, tekrarlanan dondurma çözdürme döngülerinden kaçınıldığı takdirde -20 C'nin altında en az 2 yıl 8 ay saklanabilir. Otomatik Çalışılmayan Test Prosedürü 1. Test şeması: Gereken test plağı hazne sayısı örnek sayısı alınarak ve buna HBsAg Kontrol Serumu negatif ve pozitif için determinasyon sayısı (n = 5) eklenerek belirlenir. 2. Örneklerin dağıtılması:100 µl of HBsAg Kontrol Serumu, negatifi 3 haznenin (A1-C1) her birine dağıtın, 100 µl HBsAg Kontrol Serumu, pozitifi bir hazneye dağıtın (D1) ve sonraki haznelere 100 µl seyreltilmemiş örnek dağıtın. Serinin sonunda test plağı sırasıyla bir adet hazneyi daha 100 µl HBsAg Kontrol Serumu, pozitif ile doldurun. Önemli: HBsAg Kontrol Serumu, pozitifin ilk olarak örnek serilerinin başında ve sonunda kuyucuklara pipetlenmesine ve sonra örneklerin araya koyulmasına izin verilmez. Alternatif pipetleme şeması:100 µl of HBsAg Kontrol Serumu, negatifi 3 haznenin (A1- C1) her birine dağıtın, 100 µl HBsAg Kontrol Serumu, pozitifi 2 haznenin her birine dağıtın (D1-E1) ve sonraki haznelerin her birine 100 µl seyreltilmemiş örnek dağıtın. Her örnek, kendi pipet ucuyla pipetlenmelidir. Pipetleme adımları test plağı başına 30 dakika içinde gerçekleştirilmelidir. Pipetleme Kontrolü (isteğe bağlı): Kontrollerin ve örneklerin doğru pipetlenmesi kolaylıkla gözle kontrol edilebilir. HBsAg Kontrol Serumu, negatif (yeşil), HBsAg Kontrol Serumu, pozitif (kırmızı), örnek ve boş kuyucuk arasındaki fark net biçimde ayırt edilebilir. Kontrollerin ve örneklerin pipetlemesi, 650 nm'ye karşı 405 nm'de fotometrik ölçümle kalitatif olarak (SURE adlı fonksiyon) kolayca kontrol edilebilir. SURE ölçümünde, 405 nm ve 650 nm'de fotometrik ölçüm, kontrollerle ve örneklerle yüklü test plağı kullanılarak gerçekleştirilir. SURE değeri (A SURE ) aşağıdaki gibi hesaplanır: A SURE = A 405 nm - A 650 nm A SURE ise, söz konusu kuyucuk boş değildir. A SURE < ise, örnek veya kontrolün söz konusu kuyucuğa doğru pipetlenip pipetlenmediği sorgulanabilir. Örnekleri dağıttıktan ve ardından SURE ölçümü tamamlandıktan hemen sonra, Konjügat 1 i dağıtarak devam edin. 3. Konjugat 1 dağıtılması: Her bir hazneye 25 µl Konjügat 1 (Anti-HBs/Biotin) pipetleyin. Ardından folyo ile kapatın ve konjügat dağıtımı adımını tamamladıktan hemen sonra plağı hemen inkübatöre yerleştirin. 4. İnkübasyon: İnkübasyonu 37 ±1 C ısıda 60 ± 2 dakika süreyle yapın, ardından derhal yıkama adımına geçin. 4/ OPFMG03C48 Rev. 11 TR

5 5. Yıkama: Folyoyu çıkartın; tüm hazneleri emdirin ve her hazneyi 10 sn tutarak hazne başına yaklaşık 0.3 ml yıkama solüsyonu ile 4 kez yıkayın. Yıkama döngülerini tamamladıktan sonra, haznelerin kurumasını engellemek için derhal Konjügat 2 nin dağıtılması adımına geçin. 6. Konjugat 2 dağıtılması: Her bir hazneye 100 µl Konjügat 2 (Streptavidin/POD) dağıtın. Ardından folyo ile kapatın ve konjügat dağıtımı adımını tamamladıktan hemen sonra plağı hemen inkübatöre yerleştirin. 7. İnkübasyon: İnkübasyonu 37 ±1 C ısıda 30 ± 2 dakika süreyle yapın, ardından derhal yıkama adımına geçin. 8. Yıkama: Folyoyu çıkartın; tüm hazneleri emdirin ve her hazneyi 10 sn tutarak hazne başına yaklaşık 0.3 ml yıkama solüsyonu ile 4 kez yıkayın. Yıkama işlemini tamamladıktan sonra, kuyucukların kurumasını önlemek için vakit kaybetmeden substrat dağıtımı adımına geçiniz. 9. Sübstratın dağıtılması: Her hazneye 75 µl of Kromojen Çalışma Solüysonu pipetleyin ve mikrotitrasyon plağını yeni folyo ile kapatın. 10. Sübstratın inkübasyonu: Işıktan korunacak şekilde 30 ± 2 dakika boyunca 15 ile 25 C de inkübe ediniz. 11. Reaksiyonun durdurulması: Folyoyu çıkartın. Sübstratın dağıtılması basamağındaki aynı zamanlamayla kuyucukların her birine 75 µl Durdurma Solüsyonu POD ilave edin. 12. Ölçüm: Test plağını bir saat içerisinde 450 nm de okuyun. Önerilen referans dalga boyu 650 nm, veya gerekli durumlarda 615 ile 690 nm arasıdır. Fotometrenin sıfırlanması gerekiyorsa bunun için Durdurma Solüsyonu POD kullanılmalıdır. Üreticinin talimatlarına uyun. BEP III System BEP III Sistemi kullanılırken test plakları örnek dağıtma adımına kadar hazırlanmalıdır ( Otomatik Çalışılmayan Test Prosedürü bölümünde adım 1 ve 2). Kısmen yüklü test plaklarının en az yarı plağa kadar suyla doldurulmuş stripler (6 test stripi) ile desteklenmesini sağlayın. Hemen ardından açık test plaklarını, yani folyo ile kapatılmamış olanları BEP III içine yerleştirin. Takip eden tüm işlem adımları analiz cihazı tarafından otomatik olarak gerçekleştirilir (bkz. BEP III Kullanım Kılavuzu). BEP III yazılımındaki inkübasyon süresi ayarları, teknik nedenlerden (sistem hızı) dolayı Otomatik Çalışılmayan Test Prosedüründe tarif edilen sürelerden farklı olabilir, ancak bunlar BEP III üzerinde Enzygnost için doğrulanmıştır. Tam otomatik sistemler için prosedür (BEP 2000 ve Quadriga ) Örnek dağıtma adımları ve bunu takip eden işlemler analiz cihazı tarafından tamamen otomatik olarak yapılır (ilgili kullanım kılavuzuna bakın). Kısmen yüklü test plaklarının en az yarı plağa kadar suyla doldurulmuş stripler (6 test stripi) ile desteklenmesini sağlayın. Teknik nedenlerle (sistem hızı), bu analizörlerin yazılımındaki inkübasyon süresi ayarları, Otomatik Çalışılmayan Test Prosedüründe belirtilen sürelerden farklı olabilir, ancak bunlar analizör ve kit için doğrulanmıştır. İç Kalite Kontrolü Doğrulama Kriterleri Doğrulamalar BEP III, BEP 2000 ve Quadriga Sistemleri ile otomatik olarak yapılır. Lütfen ilgili kullanım kılavuzlarına başvurun. Aşağıdaki iki kriterin birlikte karşılanması durumunda ortalama değeri hesaplamak için HBsAg Kontrol Serumuna (negatif) ait tekil absorbans değerleri kullanılır: Kriter A: A neg Kriter B: A neg. < eşik değeri OPFMG03C48 Rev. 11 TR /13

6 Analizörleri kullanırken, HBsAg Kontrol Serumu, negatif için üç absorbans değerinden maksimum biri, her iki kriteri de karşılamıyorsa elenebilir. Alternatif olarak, tam otomatik BEP 2000 Sistemi kullanılıyorsa, B kriteri dışında kalan değer, aşağıdaki durumda elenebilir: Kesme-değeri < A neg Kontrollerin ve örneklerin manuel dağıtımı sırasında gerekli pipetleme güvenlik nedenleri yüzünden son seçenek BEP III Sistem için geçerli değildir; test çalışması geçersizdir. Sonuçlar HBsAg Kontrol Serumu, positifin her iki abzorbans değeri de aşağıdaki spesifikasyonları karşılamalıdır: A pos Bu spesifikasyon karşılanmazsa test tekrar edilmelidir. Değerlendirmeler BEP III, BEP 2000 ve Quadriga Sistemleri ile otomatik olarak yapılır. Lütfen ilgili kullanım kılavuzlarına başvurun. Yazılım desteği olmadan değerlendirme işlemi yapılmaktaysa, aşağıda belirtilen noktalar dikkate alınmalıdır. Cut off değerini hesaplamak için, HBsAg Kontrol Serumunun (negatif) geçerli absorbans değerlerinin ortalamasını kullanın ve değerini ekleyin. Ā neg = eşik değeri Test kriterlerine dayanarak örnekler aşağıda belirtildiği gibi sınıflandırılmıştır: HBsAg negatif: HBsAg reaktif: A Örnek < eşik değeri A Örnek eşik değeri Test sonuçlarının bir yorumu A Örnek katsayısı ve kesme değer oluşturularak da yapılır (Oran): A örnek Oran = eşik değeri BEP III, BEP 2000 ve Quadriga Sistemleri kullanıldığında, oran analizör yazılımı tarafından otomatik olarak hesaplanır. Bu yöntemde, farklı işlemlerden alınan sonuçlar standartlaştırılabilir ve birbirine daha yakınlaştırılabilir. Test sonucu şu şekilde yorumlanmalıdır: HBsAg negatif: Oran < 1 HBsAg reaktif: Oran 1 Kesme değerine sırasıyla eşit veya daha yüksek absorbans değerleri sağlayan örnekler 1.0 e eşit veya daha yüksek olan bir oranda iki kopya halinde tekrar test edilmelidir. İki kopya testinin sonuçları kesme değerinin altında absorbans değerleri veya 1.0 dan küçük kesme değeri veriyorsa, örnek, test kriterlerine göre antijen-negatif olarak dikkate alınır. Tekrar test edilen abzorbans değerlerinden en az ikisi kesme değerine eşitse veya üzerindeyse veya oran 1.0'a eşitse veya üzerindeyse, örnek sürekli olarak reaktif kabul edilmelidir. Tüm reaktif örnekler tanınan doğrulama yöntemine göre açıklanmalıdır. Prosedürün Sınırlamaları 1. Heparin, EDTA, sitrat ve CPDA gibi antikoagülanlar test sonuçlarını etkilemez. 2. Lipemik örneklerim testte hiçbir yan etkileri yoktur. 3. İkterik örnekler test edilirken (test edilen konsantrasyonlar: en fazla 600 mg/l bilirubin), test ile etkileşim gözlemlenmemiştir. 4. Gebe kadınlardan alınan örnekler ve aşağıdaki potansiyel etkileşim maddeleri içeren örnekler incelenmiştir: ANA, HAMA, bunun yanı sıra HIV, HCV, CMV, HAV, EBV, HSV'ye karşı antikorlarlar ve parvovirüs. Bu örnekler test sonuçlarını etkilememiştir. 5. Isı uygulanan örnekler (30 dakika, 56 C) Enzygnost HBsAg 6.0'da yüksek spesifik olmayan reaktivite gösterebilir. 6. Artan hemoglobin konsantrasyonları (6 g/l'ye kadar olan konsantrasyonlar) test sonuçlarıyla etkileşmemiştir. 6/ OPFMG03C48 Rev. 11 TR

7 7. Örneklerde biotin içeriğinin yükselmesinin (2.6 µg/l ye kadar kontrol edilen) test sonucu üzerinde etkisi yoktur. 8. HIV, HCV, CMV, HDV, EBV, VZV, HAV, HSV, Toxoplasma gondii, Treponema pallidum (sifilis) ve parvovirüs enfeksiyonları test sonuçlarını etkilemez. 9. Ölü kişilerden alınan kan örnekleri üzerinde yapılan testler Enzygnost HBsAg 6.0'ın kullanım amacının bir parçası değildir ve Siemens Healthcare Diagnostics tarafından desteklenmez. 10. Yetersiz şekilde koagüle olmuş serumlar ve mikrobiyolojik olarak kontamine olmuş örnekler kullanılmamalıdır. Örnekteki her türlü partikül içeren bileşen (örneğin fibrin pıhtısı, eritrositler) test öncesinde çıkartılmalıdır. 11. Eritilmiş örnekleri kullanırken, kullanmadan önce materyalin iyi şekilde homojenize olmasını sağlayın. 12. Önceden dondurulmuş örnekler ve kan pıhtısı üzerinde uzun dönem boyunca saklanmış örnekler Enzygnost HBsAg 6.0 da yükselen spesifik olmayan reaktivite sergileyebilir. 13. Örnekteki romatoit faktörler Enzygnost HBsAg 6.0 da yükselen spesifik olmayan reaktiviteye neden olabilir, ancak testin duyarlılığı üzerinde hiçbir negatif etkileri yoktur. 14. Manuel test yapılması durumunda hatalı reaktif sonuçlarını engellemek için konjugat dağıtılırken haznenin kenarına pipet ucuyla dokunmayın. 15. İnkübasyon evresinde test plağı titreşimden korunmalıdır (örneğin sağlam bir yüzdürme yardımcısı üzerine ya da sirkülasyon bulunmayan bir su banyosuna yerleştirilmelidir); plağın kuyucukları, ısısı termostatla kontrol altında tutulan suyla temas halinde olmalıdır. Suyun mikrobiyal kontaminasyonunu önlemek için stabilizörler kullanıldığı takdirde, bu gibi bir kontaminasyon spesifik olmayan reaksiyonlara neden olabileceğinden, test plağının yüzeyinin ya da yuvaların sıvının temas etmemesi için dikkat edilmelidir. 16. Reaksiyonun durdurulması sırasında, yüksek düzeyde reaktif örneklerde boya çökelebilir. Bu durum fotometrik değerlendirmeyi etkilemez. 17. Kontrol serumları, orijinal insan serumu kullanılarak hazırlanmıştır. Bu nedenle bulanıklık meydana gelebilir, ancak bunun test sonucu üzerinde hiçbir etkisi yoktur. 18. Testin analitik duyarlılığın belirlenmesi için standartların seyreltilmesi gerekiyorsa, sadece kitte bulunan negatif HBsAg Kontrol Serumu seyreltme aracı olarak kullanılmalıdır. 19. Kan, hepatit B ye karşı aşılamadan uzun süre sonra bağışlanmadıysa, testin tüksek duyarlılığı reaktif olaraka yorumlanabilecek sonuçlara neden olabilir. Aşı koruyucu immünojen olarak Enzygnost HBsAg 6.0 yüksek duyarlılığı karşısında aşılamadan sonra bir süre saptanabilir kalan HBsAg içerdiğinden, Hepatit B ye karşı yapılan önceki bir aşılama örnekte geçici olarak HBsAg görünmesine neden olabilir. 20. Ürün performansını optimize etmek ve ürün özelliklerini karşılamak amacıyla Siemens çeşitli analizörlerde bu reaktiflerin kullanımını onaylamıştır. Kullanıcı tarafından belirlenen değişiklikler sistem performansını ve test sonuçlarını etkileyebileceği için Siemens tarafından desteklenmemektedir. Reaktiflerin Siemens Uygulama Kitapçıklarında veya prospektüslerde belirtilenler dışındaki analizörlerde kullanımı veya kullanım talimatlarında yapılan değişikliklerin geçerliliği kullanıcı tarafından onaylanmalıdır. 21. Bu testin sonucu her zaman hastanın tıbbi geçmişi, klinik durumu ve diğer bulgularla birlikte yorumlanmalıdır. Spesifik Performans Özellikleri Duyarlılık ve Spesifiklik Duyarlılık ve spesifikasyon çalışmalarının sonuçları Tablo 3 ve 4 te (Ek) gösterilmektedir. Tanısal kesinlik 607 pozitif örnek kullanılarak belirlenmiştir. Tüm örnekler pozitif olarak test edilmiştir. PEI referans materyalleri HBsAg ye, alt tip Ad ye ve HBsAg ye, alt tip Ay ye referans testin analitik hassasiyeti, her bir standart için U/mL nin altındadır. HBsAg için İkinci Uluslararası Standart kullanıldığında (HBsAg alt tip adw2, genotip A; NIBSC kod numarası: 00/588) WHO 10, Enzygnost HBsAg 6.0 analitik duyarlılığı IU/mL altında olmuştur. OPFMG03C48 Rev. 11 TR /13

8 Serokonversiyon örneklerle ilgili test reaktivitesi 39 serokonversiyon kullanılarak incelenmiştir. Serokonversiyon saptanırken, Enzygnost HBsAg 6.0 nın diğer testlerle karşılaştırılabilir veya onlardan daha iyi bir duyarlılık derecesi gösterdiği bulunmuştur. Bununla birlikte, geniş bir ölçekte kullanıldığında izole örneklerin saptanmaktan kurtulabileceği olasılık dışında bırakılmamalıdır. Kesinlik tayini için, 2 degerlendirme test merkezinde 28,253 HBsAg negatif serum incelenmiştir ve %99.89 (başlangıç testi) ve %99.91 tekrar testten sonra kesinlik elde edilmiştir (bkz. Tablo 4). Plazmada kesinlik tayini için, 3 test merkezinde 11,369 EDTA plazma serum incelenmiştir ve tekrar testten sonra %99,79 (başlangıç testi) ve %99,84 başlangıç kesinliği elde edilmiştir (bkz. Tablo 4). Çeşitli test merkezlerinde kullanılan santrifüj koşulları referans amacıyla Tablo 4 de listelenmiştir. Örnek popülasyonu, test prosedürü ve diğer faktörlere göre farklı değerler elde edilebilir, ancak bunlar Ortak Teknik Spesifikasyonlara (CTS) uygun olmalıdır. Güncel bilgilere göre, pozitif bir sonuç kanda bulaşıcı HBsAg olduğunu kesin olarak belirleyemez ve negatif bir test sonucu HBsAg nin varlığını kesin olarak dışlayamaz. Tüm reaktif örnekler bu nedenle tanınan doğrulama yöntemine göre açıklanmalıdır 11,12. HBsAg Mutantlarının Ölçümü Precision Doğrulama çalışmaları sırasında 272 HBsAg mutantı farklı merkezlerde Enzygnost HBsAg 6.0 ile test edilmiştir. Örnek grubu yerel hastalardan alınan örneklerden (n = 184) ve rekombinant HBsAg örneklerinden (n = 124) oluşmaktaydı. HbsAg nin mutasyona uğramış varyantları hem yaban tipi sekansına karşı tekli amino asit değişimi (ör. G145R veya T123 N) hem de küçük HBsAg nin (shbsag) amino asit pozisyonları 100 ile 160 arasındaki çoklu değişimi (en fazla 25) içermekteydi. Üzerinde çalışılan tüm HBsAg varyantları Enzygnost HBsAg 6.0 tarafından ölçülmüştür. Test içi/arası hassasiyet sonuçları Tablo 5'te listelenmiştir (Ek'te). Sonuçlar sadece örnek amaçlıdır. Test prosedürüne bağlı olarak farklı değerler de elde edilebilir. Bibliyografya 1. Blumberg BS, Alter HJ, Visnich S. A new antigen in leukemia sera. JAMA 1965;191: Dane DS, Cameron CH, Briggs M. Virus-like particles in serum of patients with Australiaantigenassociated Hepatitis. Lancet 1970;295: Koff RS. Hepatitis B today: clinical and diagnostic overview. Pediatr Infect Dis J 1993;12: Hoofnagle JH, Shafritz DA, Popper H. Chronic type B hepatitis and the healthy HBsAg carrier state. Hepatology 1987;7: Frösner G. Viral hepatitis. In: Thomas L, ed. Clinical Laboratory Diagnostics. Frankfurt: THBooks Verlagsgesellschaft, 1998; Purcell RH. Hepatitis viruses: Changing patterns of human disease. Proc Natl Acad Sci USA 1994;91: Norder H, Couroucé AM, Coursaget P, et al. Genetic diversity of hepatitis B virus strains derived worldwide: genotypes, subgenotypes, and HBsAg subtypes. Intervirology 2004;47: Bartholomeusz A, Schaefer S. Hepatitis B virus genotypes: comparison of genotyping methods. Rev Med Virol 2004;14: Levicnik-Stezinar S. Hepatitis B surface antigen escape mutant in a first time blood donor potentially missed by a routine screening assay. Clin Lab 2004;50: WHO Expert Committee on Biological Standardization. Fifty-forth Report. Geneva: World Health Organization. Tech Rep Ser 927 (ISBN ): / OPFMG03C48 Rev. 11 TR

9 11. Mitteilungen des Arbeitskreises Blut des Bundesministeriums für Gesundheit. Verfahren zur Rückverfolgung (Look Back) (gemäß 19 Transfusionsgesetz). Bei der 62. Sitzung des Arbeitskreises Blut am wurde folgendes Votum (V 34) verabschiedet. Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz 2006;49: Mitteilungen des Arbeitskreises Blut des Bundesministeriums für Gesundheit. Ergänzung zum Votum 34 Verfahren zur Rückverfolgung (Look Back) (gemäß 19 Transfusionsgesetz) vom Bei der 63. Sitzung des Arbeitskreises Blut am wurde folgendes Votum (V35) verabschiedet. Bundesgesundheitsbl - Gesundheitsforsch - Gesundheitsschutz 2007;50: Simgelerin Tanımı Tekrar kullanmayınız Son kullanma tarihi LOT Lot Numarası REF Katalog Numarası Dikkat, ekteki dokümanlara başvurunuz Üretici EC REP Avrupa Birliği Yetkili Temsilcisi <n> sayıda test için yeterlidir Biyolojik Tehlikeler IVD In Vitro Diyagnostik Tıbbi Cihaz Saklama derecesi Kullanım talimatlarına başvurunuz Steril değil CE İşareti CONTENTS İçindekiler Sulandırma hacmi LEVEL Seviye Isı ve güneş ışığından uzak tutun BEP, BEP 2000 Advance, Enzygnost ve Quadriga, Siemens Healthcare Diagnostics firmasının ticari markalarıdır Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH. Tüm hakları saklıdır Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Emil-von-Behring-Str Marburg/Germany OPFMG03C48 Rev. 11 TR /13

10 Tab. 1 Saklama ve Stabilite Materyal/Reaktif Durum Saklama Stabilite a Enzygnost HBsAg 6.0 test plağı kalan stripler Konjugat 1 (Anti-HBs/Biotin) Konjügat 2 (Streptavidin/POD HBsAg Kontrol Serum, negatif HBsAg Kontrol Serum, pozitif açıldıktan sonra 2 8 C C kurutucu madde içeren torbada açıldıktan sonra 2 8 C C açıldıktan sonra 2 8 C C açıldıktan sonra 2 8 C C -15 C açıldıktan sonra 2 8 C C -15 C 4 hafta 6 x 6 8 saat b 4 hafta 6 x 6 8 saat b 4 hafta 6 x 6 8 saat b 4 hafta 6 x 6 8 saat b 3 ay 4 hafta 6 x 6 8 saat b 3 ay Kromojen TMB açıldıktan sonra 2 8 C son kullanma tarihi Tampon/Sübstrat TMB açıldıktan sonra 2 8 C son kullanma tarihi Kromojen Çalışma Solüsyonu seyreltilme C C kapalı kap içinde, ışıktan korunarak 5 gün 8 saat Yıkama Solüsyonu POD açıldıktan sonraeeyreltme C 2 25 C C Son kullanma tarihi 1 hafta 1 gün a b Durdurma Solüsyonu POD açıldıktan sonra 2 8 C son kullanma tarihi her komponenti en geç son kullanma tarihine kadar kullanın. Laboratuvarda açık bekleme süresinin döngü sayısı (4 hafta içinde), 2 8 C arasında kapatılmış olarak. Tab. 2 Cihaz Stabilitesine ilişkin ayrıntılar Materyal/Reaktif Saklama Stabilite a Konjugat 1 (Anti-HBs/Biotin) Konjügat 2 (Streptavidin/POD) BEP III, Quadriga BEP 2000 BEP III, BEP 2000, Quadriga BEP III, Quadriga BEP 2000 BEP III, BEP 2000, Quadriga 48 saat açık (plastik şişede veya orijinal kapta toplanmış) 24 saat orijinal kabında 6 x 6 8 saat c 48 saat açık (plastik şişede veya orijinal kapta toplanmış) 24 saat orijinal kabında 6 x 6 8 saat c 10/ OPFMG03C48 Rev. 11 TR

11 c d Materyal/Reaktif Saklama Stabilite a HBsAg Kontrol Serum, negatif BEP 2000, Quadriga 6 x 6 8 saat d HBsAg Kontrol Serum, pozitif BEP 2000, Quadriga 6 x 6 8 saat d BEP III, BEP 2000 Sistemlerinde veya Quadriga Sistemlerinde (ilk açıldıktan sonraki 4 hafta içinde) açık bekleme süresi döngü sayısı, 2 8 C arasında kapalı halde. BEP 2000 Sistemlerinde veya Quadriga Sistemlerinin pipetör alanında (ilk açıldıktan sonraki 4 hafta içinde) açık bekleme süresi döngü sayısı, 2 8 C arasında kapalı halde. Tab. 3 Duyarlılık Duyarlılık değerlendirilirken, 607 HBsAg pozitif örnekler test edilmiş ve aşağıdaki sonuçlar alınmıştır: Örnek popülasyonu Örnek sayısı Reaktif örnekler HBsAg pozitif örnekler, genotip A HBsAg pozitif örnekler, genotip B 8 8 HBsAg pozitif örnekler, genotip C HBsAg pozitif örnekler, genotip D HBsAg pozitif örnekler, genotip E HBsAg pozitif örnekler, genotip F HBsAg pozitif örnekler, genotip G 4 4 HBsAg pozitif örnekler, genotip H 1 1 Tab. 4 Spesifiklik Aşağıdaki veriler HBsAg negatif örnekler spesifikliklerinin belirlenmesi amacıyla test edilirken elde edilmiştir: Yer Örnek tipi Örnek sayısı Santrifüj koşulları Başlangıç reaktif örnekleri (% olarak spesifiklik) Reaktif örnek tekrar testi (% olarak spesifiklik) 1 serum 22,802 4 dakika 3,500 x g 2 serum 5, dakika 3,000 x g 3 EDTA plazma 5,188 4 dakika 3,500 x g 4 EDTA plazma 5,101 4 dakika 3,200 rpm 5 EDTA plazma 1, dakika 2,500 x g 27 (%99.88) 3 (%99.94) 13 (%99.75) 11 (%99.78) 0 (%100) 22 (%99.90) 3 (%99.94) 11 (%99.79) 7 (%99.86) 0 (%100) Tab. 5 Hassasiyet Farklı HBsAg konsantrasyonlarına sahip beş test numunesi, test içi ve testler arası varyasyon katsayılarını (CV) tespit etmek için test edilmiştir (5 çalışmada 8 kat eşleşme). Hesaplamalar varyans analizi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. BEP III'te iki çalışmadan elde edilen örnek sonuçlar aşağıda özetlenmiştir: OPFMG03C48 Rev. 11 TR /13

12 Çalışma 1 Örnek Durum Ortalama absorbans değeri (A) Test içi CV (%) Testler arası CV (%) FP1 Negatif 0,017 10,9 39,8 FP3 FP4 FP5 FP6 Sınır pozitif Pozitif (düşük aralık) Pozitif (orta aralık) Pozitif (üst aralık) 0,139 6,1 13,0 0,614 4,7 10,2 1,308 5,0 9,9 1,992 2,9 6,3 Çalışma 2 Örnek Durum Ortalama absorbans değeri (A) Test içi CV (%) Testler arası CV (%) FP1 Negatif 0,019 16,9 2,3 FP3 FP4 FP5 FP6 Sınır pozitif Pozitif (düşük aralık) Pozitif (orta aralık) Pozitif (üst aralık) 0,186 3,0 6,7 0,697 3,7 6,3 1,411 4,1 6,7 2,121 2,7 5,5 12/ OPFMG03C48 Rev. 11 TR

13 Tab. 6 Test Prosedürü Reaktifleri hazırlayın 3 x 100 μl HBsAg Kontrol Serum, negatif 1 x 100 μl HBsAg Kontrol Serum, pozitif 100 μl seyreltilmemiş örnek 1 x 100 μl HBsAg Kontrol Serum, pozitif Kısmen doldurulmuş plak olduşunda: Plakları yarım doldurmak için suyla doldurulan stripler den ekleyin İsteğe başlı SURE ölçümü: 405 nm vs. 650 nm SURE sonucu 0.1 A: Hazne boş deşil 25 µl Konjügat 1 İnkübasyon: 60 ±2 dakika (37 ±1 C) BEP III otomatik test işleme 4 x yıkayın, durma süresi: en az 10 saniye 100 µl Konjügat 2 İnkübasyon: 30 ±2 dakika (37 ±1 C) BEP / Quadriga Systems tam otomatik test işleme 4 x yıkayın, durma süresi: en az 10 saniye 75 µl Kromojen Çalışma Solüsyonu İnkübasyon (ışıktan korunmuş): 30 ±2 dakika (15 ila 25 C) 75 μl Durdurma Solüsyonu (maks. 60 dakika sonra) ölçüm: 450 nm vs. 650 nm Test sonucu OPFMG03C48 Rev. 11 TR /13