T.C KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI

Transkript

1 T.C KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI KAHRAMANMARAŞ İLİ KAĞIT FABRİKALARI ÇEVRESİNDEN İZOLASYONU YAPILAN BACİLLUS SP. SUŞLARINDAN ELDE EDİLEN SELÜLAZ ENZİMİNİN KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİDE KULLANILABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI AYŞE DİLEK ÖZŞAHİN YÜKSEK LİSANS TEZİ KAHRAMAN MARAŞ Şubat-2006

2 T.C KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI KAHRAMANMARAŞ İLİ KAĞIT FABRİKALARI ÇEVRESİNDEN İZOLASYONU YAPILAN BACİLLUS SP. SUŞLARINDAN ELDE EDİLEN SELÜLAZ ENZİMİNİN KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİDE KULLANILABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI AYŞE DİLEK ÖZŞAHİN YÜKSEK LİSANS TEZİ Kod No: Bu tez 10/02/2006 Tarihinde Aşağıdaki Jüri Üyeleri Tarafından Oy Birliği ile Kabul Edilmiştir..... Yrd. Doç. Dr. Doç. Dr. Yrd. Doç. Dr. Özlem EREN KIRAN Metin DIĞRAK Sinan DAYISOYLU BAŞKAN ÜYE ÜYE Yukarıda imzaların adı geçen öğretim üyelerine ait olduğunu onaylarım. Prof. Dr. Özden GÖRÜCÜ Enstitü Müdürü Not: Bu tezde kullanılan özgün ve başka kaynaktan yapılan bildirişlerin, çizelge, şekil ve fotoğrafların kaynak gösterilmeden kullanımı, 5846 sayılı Fikir ve Sanat Eserleri Kanunundaki hükümlere tabidir.

3 İÇİNDEKİLER İÇİNDEKİLER SAYFA İÇİNDEKİLER...I ÖZET...III ABSTRACT...IV ÖNSÖZ...V ÇİZELGELER DİZİNİ...VI ŞEKİLLER DİZİNİ...VII SİMGELER ve KISALTMALAR DİZİNİ...VIII 1. GİRİŞ Enzim Kaynakları Hayvanlar Kaynaklar Bitkisel Kaynaklar Mikrobiyal Kaynaklar Salgılanma Şekillerine Göre Enzimler İntraselüler Enzimler Ekstraselüler Enzimler Bacillus Cinsi Hücre Morfolojisi Hücre Duvarının Yapısı Sporlar Koloni Özellikleri Bazı Mikrobiyal Enzimler ve Kullanım Alanları Mikrobiyal Enzimler ve Kullanım Alanları Ksilenaz Proteaz Amilaz Selülaz Enzim Aktivitesi Üzerine ph ve Sıcaklığın Etkisi Enzim Aktivitesi Üzerine ph nın Etkisi Enzim Aktivitesi Üzerine Sıcaklığın Etkisi Enzim Aktivitesi Üzerine Aktivatör ve İnhibitörlerin Etkisi Enzim Aktivitesi ve Miktarının Tayini Selüloz ve Genel Özellikleri Selülolitik Bakteriler ve Selülaz Enzim Sistemleri Aerobik Selülolitik Bakteriler Sıcaklık ve ph nın Mikroorganizöaların Gelişimi Üzerine Etkisi ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR MATERYAL ve METOT Materyal Çözeltiler Kristal Viyole Lugol Safranin Malachit Yeşili NaOH Kongo Kırmızısı NaCl DNS (Dinitro Salisilik Asit) Aseton I

4 İÇİNDEKİLER Glisin-NaOH Tamponu (ph=9.4) Spesifik Aktivitenin Saptanmasında Kullanılan Solüsyonlar Sol (I) Sol (II) Sol (A) Sol (B) Folin ayıracı Besiyerleri Jelöz Besiyerleri CMC (Carboxymethyl Cellulose) Agar CMC Buyyon (Alkali) Metot Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu Katı Besiyerinde Selülaz Aktivitesinin Araştırılması Sıvı Besiyerinde Selülaz Aktivitesinin Araştırılması Bakterinin Enzim Ürettiği ph Aralığının Saptanması Bakterinin Enzim Ürettiği Sıcaklık Aralığının Saptanması Enzim Üretimi Üzerine CMC Konsantrasyonunun Etkisinin Saptanması Enzim Üretimi Üzerine İnhibitör Maddelerin Etkisinin Saptanması BULGULAR ve TARTIŞMA Topraktan Bacillus sp. Suşlarının İzolasyonu ve Selülaz Üretme Yetenekleri Bacillus sp. C6 Suşunun Sıvı Ortamda Enzim Üretimi, Üreme Gösterdiği ph Aralıkları ve Protein Değerleri Bacillus sp. C6 Suşunun Sıvı Ortamda Ürettiği Enzim Aktivitesi Bacillus sp. C6 Suşunun Sıvı Ortamda Enzim Üretimi ve Üreme Gösterdiği Sıcaklık Aralıkları Bacillus sp. C6 Suşunun Sıvı Ortamda Enzim Üretimi Üzerine İnhibitörlerin Etkisi Bacillus sp. C6 Suşunun Sıvı Ortamda Ürettiği Enzim Aktivitesi Üzerine CMC Konsantrasyonunun Etkisi SONUÇ ve ÖNERİLER KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ II

5 ÖZET T.C KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI YÜKSEK LİSANS TEZİ ÖZET KAHRAMANMARAŞ İLİ KAĞIT FABRİKALARI ÇEVRESİNDEN İZOLASYONU YAPILAN BACİLLUS SP. SUŞLARINDAN ELDE EDİLEN SELÜLAZ ENZİMİNİN KARAKTERİZASYONU VE BİYOTEKNOLOJİDE KULLANILABİLİRLİĞİNİN ARAŞTIRILMASI AYŞE DİLEK ÖZŞAHİN BAŞKAN : Yrd. Doç. Dr. Özlem E. KIRAN Yıl : 2006 Sayfa : 48 Jüri : Yrd. Doç. Dr. Özlem EREN KIRAN : Doç. Dr. Metin DIĞRAK : Yrd. Doç. Dr. Sinan DAYISOYLU Bu çalışmada K.Maraş ili kağıt fabrikaları çevresinden alınan toprak, su ve atık örneklerinden izole edilen Bacillus sp. suşlarının selülaz aktiviteleri araştırılmış ve enzim aktivitesini artırmaya yönelik teknikler uygulanmıştır. En yüksek selülaz aktivitesi gösteren Bacillus sp. C6 suşundan selülaz yoğunlaştırılması yapılarak enzim miktarları saptanmıştır. Bunun yanı sıra enzimin optimum aktivite gösterdiği ph ve sıcaklık aralığı tespit edilmiştir. Selülaz enziminin kısmi saflaştırma yapıldıktan sonra optimum 10 ph ve 40 o C de faaliyet gösterdiği belirlenmiştir. Ayrıca enzim aktivitesi üzerine metal iyonlarının ve CMC konsantrasyonun etkili olduğu gözlenmiştir. Anahtar Kelimeler: Bacillus, Sıcaklık, Selülaz, ph, metal iyonları, CMC III

6 ABSTRACT UNIVERSITY OF KAHRAMANMARAŞ SÜTÇÜ İMAM INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF BIOLOGY MSc THESIS ABSTRACT THE CHARACTERIZATION OF CELLULASE ENZYME OBTAINED FROM BACILLUS SP. STRAINS WHICH HAS BEEN ISOLATED IN THE NEIGHBOURING OF PAPER-MILLS OF KAHRAMAN MARAŞ CITY AND THE INVESTIGATION OF ITS USABLE AYŞE DİLEK ÖZŞAHİN Supervisor : Assist. Prof. Dr. Özlem E. KIRAN Year : 2006 Pages : 48 Jury : Assist. Prof. Dr. Özlem EREN KIRAN : Assoc. Prof. Dr. Metin DIĞRAK : Assist. Prof. Dr. Sinan DAYISOYLU In this study, cellulase activities of Bacillus sp. strains isolated from the samples of soil, water and waste taken from nearby paper-mills in Kahramanmaraş have been researched and techniques to increase enzyme activities have been applied. By performing the intensifying of cellulase from Bacillus sp. strains which show the highest activity of cellulase, enzyme amounts have been determined. In addition, interval of ph and temperature that enzyme has shown optimum activity has been found. It has been determined that cellulase enzyme performs the optimum activity in ph 10 and 40 ºC temperature. Furthermore, it has been observed that metal ions and concentration of CMC have affected enzyme activity. Key Words : Bacillus, Cellulase, Temperature, ph, Metal ions, CMC IV

7 ÖNSÖZ ÖNSÖZ Endüstriyel öneme sahip olan selülaz enziminin üretimi ve teknolojide kullanılabilirliğinin arttırılmasına yönelik olarak yapılan bu çalışma, Kahramanmaraş Sütçü İmam Üniversitesi Fen Edebiyat Fakültesi Biyoloji Bölümünde organize edilip başlatılan enzim üretim projesinin bir bölümünü oluşturmaktadır. Bu çalışmada K.Maraş ili kağıt fabrikaları çevresinden alınan toprak, su ve atık örneklerinden izole edilen Bacillus sp. suşlarının selülaz aktiviteleri araştırılmış ve enzim aktivitesini artırmaya yönelik teknikler uygulanmıştır. Bu projeyi tamamlamama yardımcı olan başta danışman hocam Yrd. Doç. Dr. Özlem EREN KIRAN a, Doç. Dr. Metin DIĞRAK a, Arş. Gör. Uğur ÇÖMLEKÇİOĞLU na, Yüksek lisans öğrencisi Oğuz Ayhan KİREÇCİ ye ve desteklerini hiç bir zaman esirgemeyen aileme teşekkürü bir borç bilirim. Şubat 2006 KAHRAMANMARAŞ V

8 ÇİZELGELER DİZİNİ ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 1.1. Bacillus sp. C6 suşunun farklı ph değerlerinde sıvı ortamda ve kısmi saflaştırma uygulandıktan sonra elde edilen enzim aktivitesi ve protein değerleri Çizelge 1.2. Bacillus sp. C6 suşunun farklı sıcaklık değerlerinde sıvı ortamda ürettiği enzim aktivitesi..29 Çizelge 2.1. Bacillus sp. C6 suşunun ph 10 değerinde %0.5 %0.75 %1 CMC konsantrasyonunda sıvı ortamda ürettiği enzim aktivitesi ve total protein miktarı Çizelge 2.2. Bacillus sp. C6 suşunun ph 10 değerinde %0.5 %0.75 %1 CMC konsantrasyonunda kısmi saflaştırmadan sonra elde edilen sıvı ortamda ürettiği enzim aktivitesi ve total protein miktarı VI

9 ŞEKİLLER DİZİNİ ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 1.1. Enzim Aktivitesi Üzerine ph nın Etkisi Şekil 1.2. Enzim Aktivitesinin Total Protein Değerleri Şekil 2. Enzim Aktivitesi Üzerine Sıcaklığın Etkisi Şekil 3. Enzim Aktivitesi Üzerine Metal İyonlarının Etkisi Şekil 4. Enzim Aktivitesi Üzerine CMC Konsantrasyonunun Etkisi Şekil 5. Enzim Aktivitesi Üzerine CMC Konsantrasyonunun Protein Değerleri VII

10 SİMGELER ve KISALTMALAR SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ K M :Enzimi karakterize eden gerçek bir sabit CMC :Carboxymethylcellulose D :Dalton µm : Mikrometre DNS :Dinitrosalisilik asit rpm :Dakikadaki devir sayısı VIII

11 GİRİŞ 1.GİRİŞ Enzimler; karbon, oksijen, hidrojen ve azottan oluşan, kimyasal tepkimelerde katalizör olarak rol alan, yaşayan mikroorganizmalar (bakteriler, virüsler, mantarlar) tarafından salgılanan protein yapısında moleküllerdir. Hücre içerisinde meydana gelen binlerce tepkimenin hızını ve özgüllüğünü kendisi değişikliğe uğramadan düzenlerler. Hemen hemen her metabolik reaksiyon enzimler yardımıyla kontrol edilip hızlandırılır. Reaksiyonun başlangıç aşamasında enzimin etki ettiği madde substrat olarak adlandırılırken, reaksiyon sonucu miktarında artış görülen ve açığa çıkan madde ise ürün olarak adlandırılır. Enzim substratın dış yüzeyinden itibaren etki etmeye başlar, şeklini bozar ve ürünü açığa çıkarır. Ürün açığa çıktıktan sonra enzim başka bir substrat molekülüne işlemi yapmak için hazırlanır. Enzim aktivitesi çok yüksek sıcaklıklarda proteinlerin yapısı bozunmalara uğrayacağından inhibe edilirler (Bhat, 2000). Hücrelerde çok önemli metabolik görevleri olan enzimler, hayatımıza bizim asla fark edemeyeceğimiz derecede girmiş olup çeşitli amaçlarla kullanılmak üzere günlük, ekonomik ve endüstriyel alanlarda yerlerini almışlardır. Bugün enzimler ekmek, bira, peynir gibi gıdaların yapımında, çeşitli deterjan ve temizlik maddelerinin üretiminde, kağıt ve kumaş endüstrisinde yaygın bir şekilde kullanıldığı gibi tıpta teşhis ve tedavide de önemli rol oynamaktadır (Daniels, 1992). Endüstriyel alanda kullanılan enzimler genellikle mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Bunun nedeni mikroorganizma kaynaklı enzimlerin bitkisel veya hayvansal kaynaklı enzimlere göre katalitik aktivitelerinin çok yüksek olması, istenmeyen yan ürün oluşturmamaları, daha stabil ve ucuz olmaları ve fazla miktarda elde edilebilmeleridir (Wiseman, 1987). Enzim teknolojisi; ekonomik, etkili ve biyoteknolojik tekniklere olan büyük ihtiyaç nedeniyle ilerleme kaydetmiştir. Biyoteknoloji sayesinde, yeni tür enzimlerin büyük ölçeklerde ve ekonomik olarak üretilmesi mümkün olmuştur. Buna göre bir enzimin herhangi bir endüstri alanında kullanılabilirliği; maliyet bakımından ucuz olmasını, çok farklı alanlarda kullanılabilme özelliğinde olmasını ve en önemlisi de enzimin alerjik ya da toksik etkiye sahip olmamasını gerektirmektedir (Wiseman, 1987). 1.1.Enzim Kaynakları Endüstride kullanılan enzimler genellikle mikroorganizma kaynaklı olmalarının yanı sıra bitkisel ve hayvansal kaynaklı da olabilmektedir (John, 1987) Hayvansal Kaynaklar Hayvansal kaynaklı enzimler genellikle tavuk yumurtalarının beyazı, domuz midesi, pankreas, geviş getirenlerin karın bölgesi gibi yenilebilen organlardan izole edilebildiği için insan yiyeceklerinin hazırlanmasında da uzun zamandan beri kullanılmaktadır (John, 1987). 1

12 GİRİŞ Bitkisel Kaynaklar Bitkisel kaynaklardan elde edilen biyoteknolojik enzimler, yenilebilir bitkilerden elde edilebilmektedir. Toksik olmayan bu yiyeceklerin kaynaklarının güvenirliği doğrulanmıştır (John, 1987) Mikrobiyal Kaynaklar Mikrobiyal enzimler özel mikroorganizmalar tarafından üretirler. Bu mikroorganizmalar yalnızca enzim üretme yeteneklerine göre değil, ayrıca mikroorganizmaların toksik ve patojen olmamasına göre de belirlenmiştir. Bira, damıtma, fırıncılık ve tekstil endüstrisinde kullanılan enzimler Bacillus ve Aspergillus tarafından üretilen amilaz ve endo β-glukanazlardır. Bacillus ve Aspergillus dan izole edilen proteazlar, deterjan üretimi ve dericilikte derinin yumuşatılması amacı ile kullanılmaktadır (Demain ve Solomon, 1981) Salgılanma Şekillerine Göre Enzimler İntraselüler Enzimler İntraselüler enzimler, sitoplazmaya dağılmış olarak bulunan ribozomlarda sentezlenirler. Genelde bu enzimlerin substratları şekerler, aminoasitler, karboksilik asit gibi küçük molekül ağırlığına sahip, hücre zarından geçebilme yeteneği olan moleküllerdir (John, 1987) Ekstraselüler Enzimler Ekstraselüler enzimler, besiyeri ve hücre duvarının dışı ile bağlantı halinde olan enzimler olarak tanımlanır. Escherichia coli gibi gram-negatif bakterilerde proteinler iç ve dış membran arasındaki periplazmik boşluk arasında kalırlar. Çünkü gram-negatif bakteri duvarları, gram-pozitif bakterilerde bulunmayan bir dış membrana sahiptir. Bu yüzden gram pozitif bakterilerde enzimler direkt besiyerine salgılanır. Çoğu değişken intraselülar enzimlerin aksine, ekstraselüler enzimlerin stabilitesi yüksek olup, çevre koşullarında aktivitelerini uzun süre koruyabilirler (John, 1987) Bacillus Cinsi Bacillaceae familyasının bir üyesidir. Hücreler çomak şekilli, düz veya hemen hemen düze yakın, çoğu olumsuz ortam koşulları için çok dirençli, tek endospora sahip, açık havada spor oluşurması engellenmeyen, gram-pozitif, peritrik kamçılı, aerobik veya fakültatif anaerob bir bakteridir. Birçok türünde hücre duvarı çapraz bağlı mezo-diamino pimelik asitten oluşur (Özçelik, 1995). 2

13 GİRİŞ Hücre Morfolojisi Bacillus zincirleri tek veya çok sayıda uzun zincirler meydana getirebilirler. Hücreler parabazal kısım ve protein kristalleri içerebilir. Ana hücrede bulunan sporun şekli ve sporogonium yeri, Bacillus sp. türlerinde karakteristik bir özellik gösterir. Endosporlar genellikle silindirik, elipsodial, oval ya da yuvarlaktır. Sporlar, sporogonium un içinde merkezde, merkeze yakın, uca yakın, uçta veya lateralde bulunur. Yapılan çalışmalarda, sporogonium un şişmesi ve sporun şekli 3 grup altında toplanmıştır. Birinci grup; elipsodial sporlara sahip olup sporogonium da şişmeye neden olmazlar. İkinci grup ise elipsodial sporlara sahip olup sporogoniumlar da şişmeye neden olurlar. Üçüncü grup sferik sporlar ise sporogonium un şişmesine neden olurlar (Lennete ve ark., 1985) Hücre Duvarının Yapısı Bacillus suşları yoğun halde bulunan mürein tipi direkt birbirine bağlı mezo-diamino pimelik asit şeklindedir. Bazı Bacillus türlerinde ise hücre duvarı taykonik asit yapısına sahiptir (Özçelik, 1995) Sporlar Sporların şekilleri, sporogonium daki durumları sporogonium a bağlı olan büyüklüğü, taksonomide kullanılmaktadır. Bacillus sporları çok kompleks bir yapı göstermekte olup, vejatatif hücrede kolayca görülür (Çetin, 1968) Koloni Özellikleri Bacillus suşlarının koloni yüzeylerinin görüntüsü genellikle çevresel faktörlerle değişir. Bu faktörler arasında en önemlileri kültürün bağlı bulunduğu besiyerinin bileşimi ve inkübasyon sıcaklığıdır. Çevresel faktörlerin değişmesi ile kültürün kendisinde de birtakım değişiklikler olur. Yalnızca küçük koloni formlarını içeren suşların dışında koloni çapı, besiyeri ve içerisindeki agar konsantrasyonuna bağlı olarak değişir (Lennete ve ark., 1985). Bazı Bacillus türleri katı besiyerinde, inokülasyondan önce ortamdaki nem uzaklaştırılmadığı takdirde kümeler halinde bulunma eğilimi gösterir. Çoğu Bacillus türü pigment üretmez. Bacillus megaterium suşları özellikle kazein agarda sarı renkte pigment oluştururlar ( Lennete ve ark., 1985). Bacillus türleri toprakta, suda, fekal materyalde ve çeşitli gıdalarda bulunabilir (Banwart,1983). Endüstri alanında kullanılan, 10 dan fazla mikrobiyal enzimin, Bacillus cinsine ait türler tarafından sentezlendiği bilinmektedir. Enzim üretimi çalışmalarında kullanılan, bu bakterilerde birçok önemli özellik saptanmıştır. Örneğin, büyük bir bölümü kemoorganotrof olduğu için besin istekleri azdır, kolayca kültüre alınabilirler ve yapılarında heterojenlik yoktur (Priest, 1977). 3

14 GİRİŞ 1.4. Bazı Mikrobiyal Enzimler ve Kullanım Alanları Mikrobiyal Enzimler ve Kullanım Alanları Endüstriyel alanda kullanılan enzimler bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kökenli olmakla birlikte, ağırlıklı olarak mikroorganizmalardan elde edilmektedir. Bacillus sp. suşları proteolitik enzimler ve kabonhidrazların önemli bir kaynağını oluşturmaktadır. Bu enzimler içersinde proteazlar deterjan sanayisi gibi geniş uygulama alanlarında kullanıldıkları için önemli endüstriyel enzimlerdir (Austrup, 1981). Diğer bir biyoteknolojik öneme sahip olan α-amilaz enzimi ise Bacillus sp. grubunda oldukça yaygın bir şekilde bulunur. Bu enzimler ekmek ve pastacılık, bira, peynir gibi gıda endüstrilerinde nişastanın maltoza hidroliz edilmesi, maltoz şuruplarının eldesi, nişastadan etanol eldesi ve otomatik çamaşır ve bulaşık makinesı deterjanlarının üretiminde günümüzde artık yaygın bir şakilde kullanılmaktadır (Igarashı ve ark., 1998). Diğer taraftan gıdalarda tatlandırıcı ve kaliteyi artırıcı olarak (Anonim,1988) tekstil endüstrisinde haşıl alma işlemlerinde (Tarakçıoğlu,1979) ve alkol fermentasyonunda yaygın bir kullanım alanı vardır (Bailey ve Ollis,1977) Ksilenaz Bitki hücre duvarları mikroorganizmaların canlı bitki dokusuna geçişini engellemek için bir bariyer meydana getirmektedir (Chen ve ark., 1996). Doğal olarak bulunan lignoselülozik bitki biyokütlesinin içeriğinin %20-30 unu heterojen polisakkaritler olan ve selülozla ilişkili bir şekilde bulunan hemiselülozik materyaller oluşturmaktadır. Biyokütle, dünyanın yakıt ihtiyacını karşılayan ve yeterince kısa bir döngüye sahip olan alternatif doğal kaynaklardır. Ksilan, yüksek bitkilerin hücre duvarının hemiselülozik kısmının temel bileşenidir ve yüksek potansiyelde kullanışlı son ürünlere parçalanabilen ikinci en bol kaynaktır (Christov ve ark., 1996, Gessesse, 1998). Pek çok bakteri ve mantar ksilanı sindirmek için ksilenaza ihtiyaç duyar. Bu nedenle patojenler ve saprofitler hücre duvarını parçalayan enzimler üretmektedirler (Gamerith ve ark., 1992). Son on yıldır, ksilan ve ksilenazın endüstriyel uygulamaları araştırıcıların ilgisini çekmiştir. Bunlara örnek olarak kağıt hamuru ve kağıt endüstrileri, gıda ve yem endüstrileri verilebilir. Ksilenazların, çeşitli kullanışlı ürünlerin üretimini ekonomik bir şekilde arttırmada önemli potansiyelleri olduğu gösterilmiştir (Kulkarni ve ark., 1999). Çevresel düzenlemeler kağıt ve kağıt hamuru endüstrisinde ağartma işleminde klor kullanımını sınırlamıştır (Chen ve ark., 1996). Günümüzde çevreyi endüstriyel atıklardan korumak için kağıt ve kağıt hamuru endüstrisinde mikrobiyal enzim sistemlerinin uygulanması önem kazanmıştır (Jeffries, 1981). Bu nedenle çevre kirliliğini indirgeme yaklaşımlarından biri, kağıt hamurunun ksilanaz kullanılarak ön işlemlerden geçirilmesidir. Bu yaklaşım ağartma kimyasallarının özellikle de klor bileşiklerinin önemli derecede indirgenmesine ve kirliliğin azaltılmasına izin vermektedir (Salles ve ark., 2000). Özellikle Batı Avrupa ülkeleri ve Kuzey Amerika da ksilenazlar, ağaç kabuklarının çıkartılmasında, geri dönüştürülmiş liflerin boyasının çıkarılmasında ve kağıt hamurunun 4

15 GİRİŞ çözülmesinin hazırlığı için selülozun saflaştırılmasında önemli derecede kullanılmaktadır (Chen ve ark., 1996). Ksilenazlar gıda endüstrisinde de geniş bir kullanım alanına sahiptir. Ksilenazların ekmek ve hamur kalitesinde olumlu etkileri olduğu bilinmektedir. Buğday unundaki ksilenaz için substrat olan arabinoxylan (AX) son on yıldır yoğun çalışmalara konu olmuştur. Ksilenazın ekmek kalitesini arttırmadaki etkinliği ekmek hacmindeki artış ile görülmektedir. Ayrıca ksilenaz, şıra ve meyve suyunun arıtılması, meyve ve sebzelerin suyunun elde edilmesi içinde kullanılmaktadır (Keskin, 1982) Proteaz Proteazlar, doğada bitkisel, hayvansal ve mikrobiyal kalıntıların dekompozisyonunda önemli rol oynamaktadır ve böylece besin döngüsünü sağlamakta ve ayrıca bitkilerin besinleri alabilmelerini sağlamaktadır (Aoki, 1995). Proteazlar, toplam endüstriyel enzim ticaretinin yaklaşık %60 ını oluşturmaktadır. Proteazlar, çamaşır deterjanları, deri, et, süt, ilaç, bira, fotoğraf, organik sentezlerde ve atıkların muamelesinde kullanılmaktadır. Proteazlar arasında bakteriyel proteazlar, hayvan ve fungal proteazlar ile karıştırıldığı zaman daha etkin olduğu görülmektedir (Banerjee ve ark., 1999). Bu nedenle ticari ilgiden dolayı endüstriyel olarak uygun proteazları üreten mikroorganizmlar araştırıcalar tarafından çalışılmıştır (Jasvir ve ark., 1998). Alkali proteazlar, bakteri, küf, maya gibi çeşitli kaynaklardan elde edilse de alkalifilik Bacillus biyoteknolojide en fazla kullanılan mikroorganizmadır (Johnvesly ve Naik 2001). Çünkü çok geniş çeşitli ortamlardan izolasyonu kolaydır, bununla birlikte Bacillus hem kompleks hem de sentetik ortamda gelişebilmektedir. Termofilik ve alkalifilik Bacillus tarafından üretilen alkalifilik proteazlar yüksek sıcaklık ve ph ya dayanmaktadır (Kaur ve ark., 2001). Proteazlar, deterjan sanayisi gibi geniş uygulama alanlarında kullanıldıklarından çok önemli endüstriyel enzimlerdir (Matyar, 2002). Günümüzde deterjan endüstrisi, yıkama sıcaklığının düşürülmesi ve deterjan kompozisyonunun değişmesi yönünde çalışmalar yapılmakta, fosfat tabanlı deterjanları uzaklaştırarak, deterjan uygulamaları için daha uygun yeni proteazlar üzerinde durmaktadır (Mehrotra ve ark., 1999) Amilaz Karbohidrazların en önemli kaynağını Bacillus oluşturmaktadır. Bir karbohidraz olan α-amilaz enzimi ticari olarak kullanılan ilk enzimdir (Radley, 1976). Amilazlar, nişasta ve glikojen moleküllerini hidrolize ederek glikoz, maltoz, maltotrioz ve α-limit deksrinlerin oluşmasını sağlayan ekstraselüler enzimlerdir. Bu enzimler hayvanlar ve bitkiler tarafından da sentezlenmesine rağmen, uygun koşullarda kısa sürede elde edilmesinden dolayı mikroorganizmalar asıl kaynağı oluşturmaktadır. Fungal α-amilazlar sıcaklığa bakteriyel α-amilazlardan daha az stabil olduğundan üzerinde çalışılan asıl enzim kaynağını daha çok bakteriyel; özelliklede Bacillus amilazları oluşturmaktadır (Wiseman, 1987). Termostabil α-amilazın uygulama alanı oldukça genişlemiş ve çeşitlenmiştir. Bu enzimler tekstil ve kağıt endüstrisinde, nişastanın sıvılaştırılmasında, ekmek, glikoz ve 5

16 GİRİŞ fruktoz şurupları ve tutkal üretiminde, alkol fermantasyonunda kullanılmaktadır (Bailey ve Ollis, 1977; Bajpai ve Bajpai, 1989). Bira, damıtma, fırıncılık ve tekstil endüstrisinde kullanılan, Bacillus ve Aspergillus tarfından üretiln, ayrıca arpa ve buğday maltında da bulunabilen enzimler, amilaz ve endo β-glukanazlardır (Demain ve Solomon, 1981). Tekstil endüstrisinde dokuma sırasında ipliklerin sağlam ve düzün olması ve kopmaması için iplikler nişasta içeren bir çözelti ile muamele edilmektedir. Bu işleme haşıllama adı verilir. Kumaş dokunduktan sonra kumaştaki fazla nişastanın uzaklaştırılması gerekir. Haşıl alma ajanı olarak da yaygın olarak α-amilaz enzimi kullanılmaktadır (Tarakçıoğlu, 1979). Amilaz enzimi ekmekçilikte, ekmeğin bayatlamasını geciktirmesinden ve raf ömrünü uzatmasından dolayı yaygın olarak kullanılmaktadır (Anonim, 1988). Meyve suyu endüstrisinde de kullanım alanı bulan enzim, özellikle elma ve armut sularının berraklaştırılmasında kullanılmaktadır. Meyveler tam olgunlaşmadığında toplandığında meyvede halen nişasta bulunduğu için meyve suyunda bulanıklık meydana gelmektedir. Bu sorun ortama amilaz ilave ederek giderilmektedir Selülaz Ticari olarak kullanılan enzimlerin içerisinde selülazlar, proteazlardan ve amilazlardan sonra endüstriyel olarak üçüncü önemli biyoteknolojik enzimlerdir. Selülozu hidrolizde eden enzimler geniş çapta mantar ve bakterilerden elde edilmektedir. Böyle enzimler çeşitli biyoteknolojik uygulamalarda kullanılmaktadır. Ticari olarak en çok kullanılan selülaz Trichoderma sp. (Teeri ve ark., 1998) tarafından üretilmektedir. Ayrıca selülazlar Aspergillus, Penicillium, Basidiomycetes ve Bacillus suşlarından elde edilmektedir (Tomme ve ark., 1995). Selülotik enzimler,sıvı kazancını artırmak ve iyi bir renk elde etmek için alkol üretiminde kullanılmaktadır.deterjanlarda selülazın varlığı renklerin canlanmasına, yumuşamasına ve partikül halindeki toprağın uzaklaşmasına neden olmaktadır. Ayrıca selülaz kot pantolonların biyolojik olarak taşlanmasında kullanılmaktadır (Niehaus ve ark., 1999). Aynı zamanda meyve ve sebze sularının berraklaştırılması için de kullanılmaktadır. Yine bu enzim, zeytinyağlarının ekstraksiyonunda da kullanılmaktadır (Bhat, 2000). Özellikle endo-ksilanlarla beraber fırıncılık ürünlerinin kalitesinin artırılmasında kullanılmaktadır. Öte yandan biyoteknolojik olarak önemli bir yanı da; bira mayalanması ve şarap üretiminde rol almasıdır (Galante ve ark., 1998). Selülazın diğer kullanım alanları, selülozik biyokütlenin ve yemlerin besin değerini ve sindirilebilirliğini artırmak, zirai ve endüstriyel atıkların enzimatik sakkarifikasyonudur (Niehaus ve ark., 1999). Bunların yanında selülaz enzimi kağıt endüstrisinde de kullanılmakta olup kağıt endüstrisi denilince; hammadde olan odun ve hurda kağıdın işlenmesinden, ağartılmasından, kağıdın yapımı ve atık suyun arıtılmasını da içine alan işlemler zinciri kastedilmektedir. Selülaz enzimi de bu işlemler sırasında özellikle kağıdın ağartılması işleminde sıkça kullanılan bir enzimdir (Karademir ve ark., 2002). 6

17 GİRİŞ Selülozik materyallerin enzimatik hidrolizi üzerine gerçekleştirilen biyoteknolojik işlemler günümüzde oldukça artmıştır. Yenilenemeyen kaynakların gittikçe azalması; selülozu gıda, enerji, yakıt ve diğer ürünler için temel ham materyal haline getirmiştir (Krishna ve ark., 2000). Alkalin selülaz, pamuklulardan toprağın uzaklaştırılmasında etkilidir ve pamuk liflerini parçalamaz. Clostridium, Cellulomonas ve Ruminococcus gibi bakterilerin selülotik enzim üretme yetenekleri çalışılmıştır. Bacillus cinsine ait üyelerinde çeşitli ekstrasellüler enzimleri endüstriyel öneme sahiptir (Mawadza ve ark., 2000). Günümüze kadar bildirilen Bacillus a ait alkali selülazların çoğu tam olarak termostabil değildir (Horikoshi ve ark.,1984; Fukumori ve ark., 1985) ve bu nedenle yüksek sıcaklık gerektiren çamaşır endüstrisi için uygun ve ekonomik değildir (Hakamada va ark., 1997). Enzimatik hidroliz, enerjinin idareli kullanılması ve toksik maddelerin veya aşındırıcı asitlerin kullanılmasına ihtiyaç bırakmamasından dolayı oldukça avantajlıdır. Bu nedenle selülozun, selülaz ile hidrolizi geniş ölçüde araştırılan bir konudur. Ön muamelenin ve selülaz üretiminin pahalı olması gibi ekonomik problemler ve hidroliz sırasında enzimin inaktif olması gibi nedenler selülozun, glukoza enzimatik olarak hidrolizi önünde engel oluşturmaktadır. Bu nedenle araştırmalar selülaz aktivitesini artırmak üzerine gerçekleştirilmektedir. Ticari olarak kullanılan enzimlerin %59 unu karbohidrazlar, %3 ünü lipazlar ve %10 unu ise diğer enzimler oluşturmaktadır. Enzim teknolojisinin giderek gelişmesi, ürünlerin kullanım alanlarının çeşitliliği ve ekonomik değerinin çok yüksek olması nedeniyle biyoteknolojinin endüstriyel enzimler ile ilgili alanında yapılan çeşitli araştırmalar daha da önem kazanmaktadır Enzim Aktivitesi Üzerine ph ve Sıcaklığın Etkisi Enzim Aktivitesi Üzerine ph nın Etkisi Her enzim için aktivitelerin maksimum olduğu ph değerleri vardır. Bu değerlerin üzerinde ve altında aktivite düşer. Bir enzimin optimum ph sı normal hücre içi ortamı ph sı ile aynı değildir. Hücrelerde her birinin ph ya karşı davranışı farklı yüzlerce enzim mevcuttur ve ph nın karmaşık hücre içi kontrol mekanizmasında önemli bir yeri vardır (Bhat, 2000) Enzim Aktivitesi Üzerine Sıcaklığın Etkisi Kimyasal tepkimelerin çoğu sıcaklık yükseldikçe daha hızlı gerçekleşir. Moleküllerin yüksek ısıda daha hızlı hareket etmeleri nedeniyle onların reaksiyona girmeleri kolaylaşır. Enzimle katalizlenen tepkime hızı 0-40 ºC arasında yükselir. Ancak 40 ºC den itibaren enzim zarar görmeye başlar. Böylece reaksiyon yavaşlar ve 60 ºC de enzim tamamen protein yapısı denatüre olacağından bozulur (Horikoshi ve ark., 1984, Bhat, 2000, Mawadza ve ark., 2000). 7

18 GİRİŞ Enzim Aktivitesi Üzerine Aktivatör ve İnhibitörlerin Etkisi Kimyasal tepkimelerde katalizör olarak kullanılan enzimlerin aktivitesini büyük oranda etkileyen önemli etmenlerden birisi de aktivatör ve inhibitör maddelerdir. Aktivatör maddeler enzimin etkin olduğu substrat üzerine etkinliğini artırırken, inhibitör maddeler (ağır metaller, zirai ilaçlar, antibiyotikler) genellikle bu etkiye inhibe edici yönde etki ederler. Enzim ile substrat arasına girerek enzimin substrata olan etkisini engeller ve enzim aktivitesini azaltıcı yönde etkide bulunurlar (Nelson ve Cox, 2000) Enzim Aktivitesi ve Miktarının Tayini Bir çözelti veya doku ekstraktı içindeki enzim miktarı, enzimin katalitik aktivitesinden yararlanılarak bulunur. Bunun için enzim hakkında şu bilgiler gerekmektedir; 1. Katalizlenen reaksiyon denkleminin net stokiyometresi, 2. Enzimin kofaktör veya metal iyonuna ihtiyacı olmadığı, 3. Substrat ve varsa kofaktörü için Km değerleri, 4. Optimum ph sı, 5. Enzimin kararlı ve aktivitesinin yüksek olduğu sıcaklık aralığı, 6. Substratın, parçalanma veya ürünün oluşma hızlarının tespit edilebildiği basit bir analitik metot. Bir çözelti içindeki enzim aktivitesi enzim ünitesi (birimi) cinsinden verilir. Her enzimi kapsayacak bir ünite tarifi olmamasına rağmen, 25 ºC de ve optimal şartlarda bir mikromol substratı bir dakikada ürüne dönüştüren enzim miktarına bir enzim ünitesi denilmesi genel olarak kabul edilmiştir (Bhat, 2000) Selüloz ve Genel Özellikleri Selüloz karasal ortamda fazla miktarda bulunan bir biyopolimerdir. Özellikle kuru bitkisel materyalin yapısında fazla miktarda bulunmaktadır (Eriksson ve ark., 1990; Schlesinger, 1991). Selüloz glukoz ünütelerinin β-1,4 bağları ile bağlanması sonucu oluşmuş bir homopolimerdir. Selüloz molekülünün büyüklüğü (polimerizasyon derecesi) bitki hücresinin duvarında bulunan ikincil duvarda her molekülde 500 den daha az glukoz biriminin bulunmasına bağlı olarak değişir (Ljungdal ve Eriksson, 1985). Genellikle selülozun bitki hücre duvarındaki oranı hücre tipine ve evresine göre değişmektedir. Örneğin; birincil duvarın kuru ağırlığının %20-40 ı selülozdan oluşurken, ikincil duvarın %40-60 ı selülozdan oluşur. Pamuk tohumunun ikincil duvarının %100 ü selülozdur. İkincil hücre duvarı mikrofibrilleri birincil hücre duvarının mikrofibrillerine göre daha yoğundur ve daha çok selüloz kristalleri içerir (Marchessault ve Sundararajan, 1983). 8

19 GİRİŞ Selüloz doğada hemen hemen hiçbir zaman tek başına bulunmaz. Genellikle diğer bitkisel maddelerle beraber bulunur. Bu da selülozun doğal ortamda parçalanmasını etkilemektedir. Selüloz fibrilleri öncelikle hemiselüloz, pektin ve proteinlerin dahil olduğu diğer polimerlerin matriksine gömülmüş şekildedirler. Selüloz, hücre duvarına turgor basıncına dayanabilecek gerilebilir bir kuvvet verir. Eğer hücre duvarındaki su lignin ile değiştirilirse yüksek bir kuvvet elde edilir. Bitki dünyasında en fazla bulunan ve en basit yapıya sahip olan, aynı zamanda hücre duvarı yapısında yer alan yapısal polisakkaritlerin en önemlilerinden birisi selülozdur (Anonim, 1969). Selüloz; bütün bitki, ot ve ağaçların temel yapıtaşıdır. Selülozun en önemli görevi bitkilere sağlamlık, diklik ve destek sağlamaktır. Doğada saf halde bulunmaz. Odunun ağırlıkça %40 ını, ketenin %60-85 ini, pamuk liflerinin %85-90 ını selüloz oluşturur. Doğada birkaç çeşit selüloz bulunmaktadır. Bunların hepsi de endüstri açısından önemlidir, fakat değişik amaçlar için kullanılır. Selüloz türleri birbirinden a, b, d harfleriyle ayırt edilir. a selüloz, pamuktaki selüloz türüdür. Bütün türler arasında en önemli olanıdır. Hemi-selüloz adını alan b selüloz ve d selüloz ise asitlere ve bazlara karşı daha az dayanıklı, moleküller dallanmış halde ve daha kolay kopabilme özelliğindedir (Anonim, 1969) Selülolitik Bakteriler ve Selülaz Enzim Sistemleri Bakterilerde selülozun parçalanması hem aerobik hem de anaerobik bakteriler tarafından gerçekleştirilmektedir. Herbivor hayvanlarda ve böceklerde selülozun parçalanması anaerobik bir olaydır. Selülotik bakterilerin seçiminde aerobik ve anaerobik bakteriler çalışılmıştır. İlk fonksiyon selülozun basit şekerlere dönüşmesidir (Hungate, 1950; Bryant ve Robinson, 1961; Miller ve Wolin., 1974) Aerobik Selülolitik Bakteriler Aerobik selülolitik bakterilerin tanımlanması uzun zaman önce yapılmıştır. Selülolitik aerobik bakteriler Bacillus, Cytophaga, Herpetosiphon, Pseudomonas, Cerratia, Streptomyces, Sporocytophaga, Thermoactinomyces ve Thermomonospora dır. Birçok aerobik selülolitik bakteri suşları izole edilmiş olmasına rağmen bunların çoğu tam karakterize edilmemiş ve yalnızca son zamanlarda bu bakterilerin kirliliğe eğilimli olduğu görülmüştür. Selülolitik enzim sistemlerine sahip olan bu bakterilerde eğilim, endüstriyel olarak kullanılabilir olmasıyla ilişkilidir (Humprey ve ark., 1977). Bacillus türlerindeki selülolitik enzimler çok iyi karakterize edilmişlerdir. Türlerin karboksimetilselüloz u sellobioza hidroliz ettikleri söylenmiştir. Daha sonra selülolitik madde ortamdan distile su ile uzaklaştırılmıştır. Bacillus polmyxa nın selülaz üretimi besiyerindeki karbon kaynağının varlığına bağlıdır. Böylece enzim, tuzlu peptonlu besiyerine nişasta, glikoz, selüloz, sellobioz, karboksimetilselüloz, ksilan, maltoz ve sükroz eklenildiği zaman üretilmektedir (Fogarty ve Griffin, 1973) Sıcaklık ve ph nın Mikroorganizmaların Gelişimi Üzerine Etkisi Bütün mikroorganizmaların hayati aktivitelerini devam ettirdikleri üç çeşit sıcaklık vardır; minimum, optimum ve maksimum. En düşük ve en yüksek sıcaklık dereceleri arasındaki aralık çoğalma aralığıdır. Sıcaklık isteklerine göre mikroorganizmalar; psikrofil 9

20 GİRİŞ (soğuğu seven), mezofil (orta derece sıcaklığı seven) ve termofil (sıcağı seven) olarak üç gruba ayrılır. Termofillerin çoğu Actinomyces ve Bacillus cinslerindendir. Az miktarda termofil küf mantarı da vardır. Bacillus stearothermophilus ve Bacillus coagulans v.b bakteriler sıcağa dayanıklı sporlarından dolayı konserve endüstrisinde önemli bir yere sahiptirler. Sıcaklığın yanı sıra ortamda bulunan H + iyonları konsantrasyonu, mikroorganizmaların çoğalma ve gelişmelerini etkileyen en önemli fiziksel faktördür. Maya ve küf mantarları genel olarak asit reaksiyonlu ortamları tercih ederken bakteri ve Streptomyces türlerinin çoğu, ph değeri nötr olan ortamlarda gelişmektedir. Asit üreten Lactobacillus türleri gibi bakteriler asit reaksiyonlu ortamları tercih ederler (Özçelik, 1995). 10

21 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bell ve Burnet (1966), yaptıkları çalışmalarında, Polyporus betulinus mantarı tarafından selülaz üretimi olduğunu ortaya koymuşlardır. Bacillus polmyxa nın selülaz sentezi üzerine yapılan bir çalışmada selülazın ekstrasellüler bir enzim olduğu ve enzimin hücrelerden ekstrat edilebileceği bildirilmiştir (Greaves, 1971). Knosel (1971), Bacillus cinslerinin aerobik ya da fakültatif türlerine ait spor formları karşılaştırmıştır. Bu türlerden Bacillus brevis, Bacillus firmus, Bacillus licheniformis, Bacillus pumilus, Bacillus subtilis, Bacillus polmyxa ve Bacillus cereus un selülolitik aktiviteye sahip olduğunu göstermiştir. Selülaz üretimi üzerine yapılan çalışmalar sonucunda (Stutzenberger, 1972) tarafından Thermomonospora curvata dan selülaz üretimi olduğu ve bu enzimin analizi için gerekli olan sıcaklığın 10 günlük gelişme periyodu içersinde 45 ºC olduğu belirtilmiştir. Berghem ve Pettersson (1973), Trichoderma viride nin selülaz enzimi ürettiğini bildirmişlerdir. Berghem ve ark., (1975) tarafından da bu enzimin karakterizasyonu ortaya konulmuştur. Fungusların selülaz enzimi üretme yetenekleri üzerine (Hurst ve ark., 1977) tarafından yapılan bir diğer çalışmada da Aspergillus niger in selülaz enzimi üretimini yaptığı ve enzimin maksimum aktiviteyi ph 4 de 45 ºC sıcaklıkta gösterdiğini bulmuşlardır. Selülaz aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisinin araştırıldığı bir çalışmada Ca un aktivite üzerine olan etkisinin belirlenmesi amacıyla 2 mm-10 mm olmak üzere hazırlanan iki farklı konsantrasyon sonucunda Ca un enzim aktivitesini inhibe ettiğini belirtmişlerdir (Genin ve ark., 1978). Thayer (1978), Bacillus cereus türünde glikozu sellobioza stimüle eden enzim tiplerini izole etmiştir. Bacillus subtilis in izolasyonu ile ilgili çalışmalarda besiyerinde laktoz, sellobioz, glikoz, maltoz ya da sükrozun varlığıyla karboksimetilselülaz üretiminin değişmediğini göstermiştir. Thomas ve Zeikus (1981), yapmış oldukları çalışmalarında Clostridium thermocellum LQRI ve Trichoderma reesei QM9414 den selülaz enzimi üretimi olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca enzim aktivitesi üzerine metal iyonlarının etkisini araştırmışlar ve Ag, Hg iyonlarının 20 µm dan fazlasının Clostridium thermocellum için inhibitör etkiye sahipken Trichoderma reesei için bu etkiye sahip olmadığını, Ca, Mg, Mn iyonlarının ise 10mM dan fazlasının Trichoderma reesei için inhibitör etkiye sahipken Clostridium thermocellum için etkili olmadığını ortaya koymuşlardır. Metal iyonlarından Cu ve Zn nin ise 1mM dan fazlasının her iki mikroorganizma için olumsuz yönde etki uyguladığını da belirtmişlerdir. 11

22 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Bacterioides succinogenes tarafından üretilen ekstraselüllar selülazın kısmi karakterizasyonunu araştırılmış ve kısmi saflaştırmadan sonra enzimin ph arasında 50 ºC de optimum seviyeye ulaştığını bildirilmiştir (Groleau ve Forsberg, 1983). Robson ve Chambliss (1984), topraktan izole edilen Bacillus brevis bakterisinden sentezlenen selülaz enziminin optimum aktivite gösterdiği sıcaklığın 37 ºC, ph nın ise 5.5 olduğunu göstermişlerdir. Bajpai ve Bajpai (1987), Bacilus licheniformis TCRDC-B13 suşunun üremesinin ph 3-11 arasında olup, besiyerindeki ph ın artırılması ile üremenin azaldığını, enzim üretiminin ph 5 de başladığını ph 10 a kadar devam ettiğini ve maksimum aktivitenin ph 6-9 arasında olduğunu bulmuşlardır. Yine aynı araştırıcılar enzimin üretimi ve üreme sıcaklığının o C arasında olduğunu ve maksimum enzim üretiminin ise 35 o C de gerçekleştiğini bulmuşlardır. Bu veriler sonucunda ise Bacillus licheniformis TCRDC-B13 suşundan elde edilen enzimin yüksek sıcaklıkta ve geniş ph aralığında sıvılaştırıcı nişastada kullanışlı olduğunu sonucuna varmışlardır. Bacillus subtilis in temel karbon kaynağı olan çeşitli karbonhidratların bulunduğu kültür ortamında aviselülaz ve karboksimetilselülaz üretiminde bulunduğunu (Chan ve Au, 1987) tarafından tespit edilmiştir. CMCase aktivitesinin, büyümenin log fazında ve gelişmenin ilk durağan maksimum düzeyinde 10 saatlik süre sonunda meydana geldiğini ve aktivite için optimal sıcaklığın 65 ºC olduğu belirtilirken, enzimin yüksek stabil sıcaklığının ise 60 ºC nin üzerinde olduğunu bulmuştur. CMCase sentezi glikoz ve sellobiyoz tarafından elde edilmiştir. Fukumori ve ark., (1987) tarafından Bacillus sp.1139 dan selülaz enzimi eldesi olduğu ortaya konulmuştur. Ancak enzim üretimi için alkali ortam şartlarının bulunması gerektiği bildirilmiştir. Trichoderma reesei gibi selülolitik mikroorganizmaların kristal selülozu parçalayan ve sinerjistik olarak aksiyon gösteren enzim serisi üretebileceğini (Beguin, 1990) tarafından belirtilmiştir. Kobayashi ve ark., (1990) Clostridium thermocellum un selülaz enzimi ürettiğini bildirmişlerdir. Enzimin optimum aktiviteyi ph arasında ve 70 ºC de gösterdiğini ortaya koymuşlardır. Trichoderma reesei Rut C30 dan sentezlenen selülaz enzimi aktivitesi üzerine sıcaklığın etkisinin araştırıldığı bir çalışmada 10 günlük inkübasyon sonunda ºC de yüksek enzim üretiminin olduğu ortaya konulmuştur (Farid ve El-Shahed, 1993). Selülaz enzimi eldesinin bitkiler ve hayvanlar dışında ayrıca Aspergillus, Penicillium, Basidiomycetes ve Bacillus gibi mikroorganizmalar tarafından da elde edilebileceği (Tomme ve ark., 1995) tarafından gösterilmişdir. Dahot ve Noomrıo (1996), tarafından yapılan bir diğer çalışmada da Aspergillus fumigatus un selülaz ürettiği bildirilmiştir. Hakamada ve ark., (1997), izole ettikleri Bacillus sp. KSM-S237 suşunun ph 9-12 aralığında ve 10 o C ila 40 o C sıcaklıkları arasında geliştiğini bildirmişlerdir. Bu suş 12

23 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR tarafından üretilen selülazın ise 40 o C de ve ph 9 da en iyi aktivite gösterdiğini belirtmişlerdir. Streptomyces albaduncus fungusundan ekstrasellülar selülaz enzimi üretimi olduğunu ve enzimin optimum ph değerinin arasında olduğunu sıcaklığın ise 50 ºC de olduğunu gösterilmiştir(harchand ve Singh, 1997). Ito (1997), yaptığı çalışmada izole ettiği Bacillus sp. KSM-635 suşundan alkali ortamda selülaz aktivitesini araştırmıştır. Yaptığı çalışma sonucunda ph 3 ila 13 değerleri arasında selülaz üretiminin gerçekleştiğini, en yüksek üretim ph sı değerinin ise 9.5 olduğunu bulmuştur. Chrysosporium türlerinin enzim üretimi üzerine yapılan araştırmalar sonucunda Chrysosporium anam, C. keratinophilum, C.tropicum, C. pannorum suşlarının yüksek oranda selülaz enzimi üretme yeteneklerinin olduğunu ortaya konulmuştur (Kavitha ve ark., 1997). Bacilluc brevis VS-1 den selülaz eldesi üzerine (Singh ve Kumar 1998) tarafından yapılan bir çalışma sonucunda enzim aktivitesi için optimum ph nın 5.5 ve sıcaklığın ise 37 ºC olduğu bildirilmiştir. Aynı zamanda enzim aktivitesinin bazı ağır metallerle (Hg ile) inhibe edildiği gözlenmiştir. Trichoderma sp. tarafından üretilen selülaz enziminin ticari alanda en fazla kullanılan enzim olduğu (Teeri ve ark, 1998) tarafından belirtilmiştir. Tian ve Wang (1998), tarafından yapılan bir diğer araştırmada alkalin selülaz alkalofilik Bacillus (N6-27) tarafından üretilmiş ve bu enzim biyo-jel P-150 kromotografisi, seferoz CL-4B hidrofobik interaksiyon kromotografisi, NH 4 2SO 4 fraksiyonu yoluyla homojenik elektroforezde saflaştırılmıştır. Moleküler ağırlık ve PI, SDS-PAGE ve PAGE-IEF tarafından sırasıyla ve 4.2 olarak belirlenmiştir. Optimum sıcaklık 55 o C ve enzim katalizi için ph 8.5 olarak kullanılmıştır. Enzim aktivitesinin bu çalışmada sıcaklık 50 o C nin altında olacak şekilde ve ph da 6-4 arasında olduğu belirlenmiştir. Ayrıca bu araştırmada substrat olarak karboksimethilselüloz kullanılmıştır. Enzim aktivitesinin Fe, Cu ve Hg tarafından güçlü bir şekilde inhibe edildiği belirtilmiştir. Christakopoulos ve ark., (1999) Bacillus pumilus tarafından alkalin selülaz salgılanması olduğunu belirtmişlerdir. Sephacryl S-200 ve Q-Sepharose kolum kromatografisiyle enzim saflaştırılması yapılmış ve enzimin optimum aktiviteyi ph 7-8 ve 60 ºC de gösterdiğini ortaya koymuşlardır. Muscadine grapes den selülaz enzimi eldesi olduğu ve enzim aktivitesinin ph 4 de ve 45 ºC de optimum seviyeye ulaştığı, aktivitenin 10mM Zn ve Mg tarafından inhibe edilirken, Cu ve Fe tarfından ise stimüle edildiği (James ve ark., 1999) nın yapmış oldukları çalışma sonucunda gözlenmiştir. Sanwal (1999), selülazı jel filtrasyonu ve kromatografi ile iyon değişimi yoluyla Catharantus roseus köklerinden homojen olarak saflaştırmıştır. Enzimin bu çalışmada ph 5.2 de ve ºC arasındaki sıcaklıkta optimum aktivite gösterdiğini, ayrıca enzim aktivitesinin Hg ve Teepol tarafından güçlü bir şekilde inhibe edildiğini bulmuştur. 13

24 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Nectria catalinensis tarafından sentezlenen selülaz enzimi aktivitesi üzerine sıcaklık ve ph nın etkisini araştırılmış ve sonuç olarak enzimin aktiviteyi ºC arasında gösterdiğini optimal ph değerini ise arasında gösterdiğini belirtmişlerdir (Pardo ve Forchiassin, 1999). Krishna ve ark.,(2000) selülozun enzimatik hidrolizi için yaptıkları çalışmalarda selülaz salgılayan mikroorganizmaların ortama doğrudan ilave edilmesini denemişler ancak elde edilen verimin düşük olduğu görmüşlerdir. Bununla birlikte, selülazın selüloz ile doğrudan muamelesinin daha iyi bir çözüm olduğunu ortaya koymuşlar ve pek çok mikroorganizmanın selülaz ürettiğini göstermişlerdir. Zimbabve kaplıcalarından izole edilen iki Bacillus türü olan CH43 ve HR68 un selülaz ürettiği, Bacillus sp. CH43 suşunun enzim ürettiği optimum ph aralığının 5-7, HR68 in olduğu, sıcaklığın ise Bacillus sp. CH43 için 70 o C ve HR68 için 65 o C olduğu (Mawadza ve ark., 2000) tarafından yapılan çalışma sonucunda ortaya konulmuştur. Enzimlerin aktivitesi 1mM konsantrasyondan daha yüksek konsantrasyonda metal iyonları tarafından inhibe edilmiştir. Fakat Co da ise yaklaşık olarak %38 oranında aktivite artışı gözlenmiştir. Hg ve Mn tarafından oluşturulan inhibisyon HR68 için olana göre CH43 için daha fazla olduğu belirtilmiştir. Ayrıca Ag iyonu tarafından CH43 inhibe edilirken bu etki HR68 de gözlenmemiştir. Gorska ve ark., (2001) Bacillus polymyxa tarafından selülaz üretiminin olduğunu bildirmişlerdir. Orpinomyces joyonii mantarından üretilen selülaz enziminin optimal aktiviteyi 40 ºC de ph 5 ila 7.5 arasında olduğu belirtilmiştir (Ye ve ark., 2001). Lockington ve ark., (2002) Aspergillus nidulas dan selülaz üretimi aktivitesinin karbon ve nitrojen kaynaklarıyla değiştirilebileceğini ortaya koymuşlardır. Termofilik bir fungus olan Chaetomium thermophile den endoselülaz eldesi olduğu (Lu ve ark., 2002) tarafından bildirilmiştir. Ayrıca enzimin optimal aktiviteyi ph arasında ve 60 ºC de gösterdiği, farklı metal iyonlarının da aktiviteyi etkilediği, bu iyonlardan Na nın aktiviteyi artırıcı yönde etkide bulunduğu Fe, Ag, Cu, Ba ve Zn iyonlarının ise aktiviteyi inhibe edici yönde etkide bulunduğunu belirtilmiştir. De Sousa Pereira Junior ve ark., (2003) yapmış oldukları çalışmalarında Lentinula edodes den karboksimetilselüloz yada mikrokristalin selüloz bulunan ortamda selülaz eldesi olduğunun bildirmişlerdir. Selülaz üretimi için yapılan bir diğer çalışmada kimyasal mutajenlerden sonra Bacillus pumilus un bir mutantını belirlemiştir. BpCRI 6 olarak adlandırılan bu mutant selülaz üretebilme yeteneği için seçilmiştir. Optimum üreme şartları altında (ph ºC ve 1mM. Ca) BpCRI 6 tarafından üretilebilen selülaz miktarının diğer muamelesiz türden dört kat daha fazla olduğunu ortaya konulmuştur (Kotchoni ve ark., 2003). Ojumu ve ark., (2003) Aspergillus flavus fungusu tarfından selülaz üretimi olduğunu bildirmişlerdir. 14

25 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Trichoderma reesei tarafından üretilen selülaz enzimi aktivitesi üzerine karbon kaynaklarının etkisi araştırılmış ve karbon kaynaklarının etkisiyle selülaz enzimi üretiminin artabileceği belirtilmiştir (Olsson ve ark., 2003). Saha (2003), yeni izole edilen bir fungus türü olan Mucor circinelloides in (NRRL26519), laktoz, sellobiyoz, veya sigmasel 50 üzerinde tam selülaz ürettiğini, enzimin optimum aktiviteyi 55 ºC de ve 4-6 arasındaki ph da gösterdiğini belirtmiştir. Bacillus sphaericus JS1 dan yeni bir izolasyon yoluyla alkali selülaz ürününün saflaştırılmasını ve karakterizasyonunu araştırılmıştır. Bu enzimin bir çok alanda ve özellikle deterjan endüstrisinde sıcaklık, ph v.b durumlara karşı oldukça stabil olduğu bildirilmiştir (Singh ve ark., 2004). Viikari ve ark., (2004) Trichoderma reesei tarafından selülaz enzimi üretimi olduğunu ortaya koymuşlardır. Zhang ve ark., (2004) tarafından yapılan çalışmada alkali Bacillus suşundan amilaz ve selülaz enzimi üretimi olduğu belirtilmiştir. Colletotrichum lindemuthianum fungusundan selüloz bulunan ortamda üremesinin ve enzim üretiminin araştırıldığı bir diğer çalışmada selülaz enzimi üzerine diğer karbon kaynaklarının ve nitrojen kaynaklarının bulunduğu ortamda enzim üretiminin arttığı ortaya konulmuştur (Acosta-Rodriguez ve ark., 2005). Grigorevski De Lima ve ark., (2005) Streptomyces drozdowiczi tarafından üretilen selülaz enziminin aktivitesini bulmak için, mikroorganizma 30 ºC de temel karbon kaynakları ve temel nitrojen kaynaklarının bulunduğu kültürde üretilmiş supernatant da maksimum CMCase aktivitesinin 50 ºC de ph 5 de olduğu gösterilmiştir. Bacillus coagulans BL69 tarafından üretilen selülaz enziminin aktivite gösterdiği şartların bulunması amacıyla yapılan bir çalışmada, ph nın sıcaklığının ise ºC arasında olduğu ortam koşullarında aktivitenin optimum olduğu gözlenmiştir. Ayrıca aktivite üzerine Co, Mn ve β-mercaptoethanolun stimüle edici etkisi olduğu ancak Fe, Cu, Ca, Zn, Ba, Mg ve EDTA tarafndan inhibe edici etkisi olduğu ortaya konulmuştur (Heck ve ark., 2005). Kim ve ark., (2005) Bacillus sp. HSH-810 da alkali selülaz eldesini göstermişlerdir. Enzimin ph 10 ve 50 ºC de optimal aktiviteye sahip olduğunu ve aktivite üzerine 1mM Fe ve 0.1 mm Mn nin %50 inhibe etkisinin bulunduğunu ancak bunun yanı sıra aktivitenin 1mM Pb ve Hg tarafından etkilenmediğini belirtmişlerdir. Kudanga ve Mwenje (2005), yapmış oldukları çalışmalarında Aureobasidium pullulans dan selülaz üretimi olduğunun ortaya koymuşlardır. Fomitopsis palustris mantarından üç temel selülazın (ekzoglulanaz, endoglukanaz ve beta-glukonaz) üretimi olduğunu bildirilmiştir. Bunların içersinde ekzoglukanazın optimum aktiviteyi ph 4.5 te 70 ºC de gösterdiğini bulunmuştur (Yoon ve Kim, 2005). Wen ve ark., (2005) Trichoderma reesei ve Aspergillus phoenicis den selülaz üretimi üzerine çalışmışlardır. Çalışmaları sırasında T. reesi nin 25.5 ºC de ve ph 5.76 da, A. phoenicis in ise 28.2 ºC ve ph 5.14 de enzim üretiminin optimal olduğunu 15

26 ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR belirtmişlerdir. Her iki mantarın bulunduğu karışık kültürde ise optimal sıcaklık değerlerin 27 ºC ve ph ın 5.5 olduğunu ortaya koymuşlardır. Selülaz enzimi aktivitesi üzerine yapılan bir çalışmada (Zvereva ve ark., 2005), alkali özelliğe sahip anaerobik Bacterium Z-7026 dan yapılan sentezleme ile bu enzimin optimum ph çalışma aralıkları saptanmış, ph aralığının enzim aktivitesi için uygun olduğu sonucuna varılmıştır. Sehnem ve ark., (2006) Penicillium echinulatum 9A02S1 den selülaz üretimi olduğunu bildirmişlerdir ve enzim üretimi üzerine laktozun etkisinin ise aktiviteyi artırıcı yönde olduğunu göstermişlerdir. 16