GEN EKSPRESYONUNUN KONTROLÜ VE DÜZENLENMESİ GEN İFADESİ

Transkript

1 GEN EKSPRESYONUNUN KONTROLÜ VE DÜZENLENMESİ GEN İFADESİ

2 Bir organizmanın genetik yapısını DNA da bulunan dntp dizileri belirler ve bu bilginin ifade edilmesi ise (Protein sentezi) RNA lar ile sağlanır.

3 1. TRANSKRİPSİYON DNA nın belli bölgelerinden genetik bilgi, kopyalanarak RNA moleküllerine aktarılır. Transkripsiyonda DNA çift sarmalından birisi kalıp olarak kullanılır ve bu kalıbın belli bir bölgesi kopyalanır.

4 TRANSKRİPSİYON Transkripsiyon, DNA da saklanan genetik bilgilerin bir RNA molekülü (mrna, trna, rrna..) şeklinde kopyalanması veya yazılması olayıdır.

5 2. TRANSLASYON Transkripsiyonla RNA ya kopyalanan, bir protein molekülüne ait genetik bilgilerin okunması veya bir protein molekülü haline çevrilmesine translasyon adı verilir.

6 GEN Gen; bir polipeptid ya da RNA çeşidi sentezinden sorumlu bölge olarak tanımlanabilir. Gen, kalıtımdan sorumlu olan ve kendini yenileyerek oğul döllere aktaran biyolojik birimdir. Her gen, kromozom haritası üzerinde belirli bir pozisyona (lokus) sahiptir. İlgili DNA bölgesi transkripsiyon ile RNA sentezler ve bu RNA molekülünden de ribozomların görev aldığı translasyon işlemi ile gerekli proteinler sentezlenir. İşte her bir proteini kodlayan nükleotid bölgesi, gen olarak adlandırılır.

7 Gen, kalıtımın işlevsel birimidir. GEN EXPRASYONU nedir? DNA molekülünde şifrelenen genetik bilginin ifade edilmesi veya bu bilginin kullanılmasına gen ekspresyonu denir. Bir polipeptid zincirini sentezleyen gene protein geni denir.

8 Ökaryotlarda Gen Yapısı (TÜM GEN) 1. Promotor bölge: DNA üzerinden RNA nın sentezlenmesinden görevli olan RNA polimeraz enziminin bağlandığı ve transkripsiyonun başlatıldığı bölgedir. Yapısal genlerin hemen önünde bulunur. 2. Kodlayıcı bölge: RNA ya ilgili kod şifresini veren esas bölgedir. Kodlamadan sorumlu olan ekzon bölgeleri ve ekzonların arasında da kodlamadan sorumlu olmayan intron bölgeleri bulunur. RNA polimeraz tarafından intronlar atlanır ve RNA sentezinde herhangi bir aksaklık olmaksızın ekzonlar okunur. Bu şekilde, Splicing adı verilen bir mekanizma ile ekzonlar, RNA ların yapısından çıkarılmış olurlar. 3. Bitiş bölgesi (Dur Kodonu): Yanyana üç nükleotid bir kodonu meydana getirir. DNA ve RNA üzerinde kodlanmış olarak bulunan her bilgi, bu şekilde üçlü birimler halindedir. RNA sentezinin biteceği yerde, deşifre işlemine dur emri verilmesi gerektiğini belirten kodonlar (UAA gibi) bulunur.

9 GEN YAPISI 4. CAP bağlanma bölgeleri 5 ucunda yer alır. 5. Poli A bölgesi (son kısımda) 3 ucunda yer alır. 6. TATA kutusu (RNA polimerazın promotor bölgeye bağlanmasını kolaylaştırıcı baz dizisi) 7. Operatör bölgeleri (promotor bölgeden hemen sonra), genin koordine edildiği bölgelerdir. RNA polimerazın genlere girmesini kontrol eder.

10 Prokaryotlarda Gen

11 GEN İFADESİ Transkripsiyon ve translasyon olaylarının toplamı, gen ifadesi (gen ekspresyonu) olarak tanımlanır. Prokaryotlar ve ökaryotlar çevresel koşullardaki değişikliklere yanıt vermek için gen ifade şekillerini değiştirirler. Bakteriler çevresel değişikliklere genellikle transkripsiyonu düzenleyerek yanıt verir. Ökaryotik gen ifadesi pek çok evrede düzenlenir. Genlerin farklı ifade olmasını sağlayan program çok hücreli bir organizmada değişik tipte hücrelerin oluşumuna yol açar.

12

13 İfade edilen gen aktif gendir. Bir hücrenin genomunda bulunan genlerin tümü aktif midir? Bir gen bölgesinden transkripsiyon yapılmasına ne zaman ve nasıl karar verilir?

14 Transkripsiyon seviyesinde gen aktivitesinin kontrolü Canlılarda, DNA dan mrna nın sentezlenmesi basamağı yani transkripsiyon, genetik ifadenin denetlenmesi ve düzenlenmesindeki en önemli basamaktır. Tek veya çok hücreli canlılarda her proteine ihtiyaçlar farklı düzeydedir. Aynı canlıda bulunan hücrelerden bir kısmı bir proteine ihtiyaç duyarken diğerlerinin bu proteine ihtiyacı yoktur. Bunun için de bunların düzenlenmesi gerekir, yani baskılanıp veya aktif hale gelmesi gerekir. Ayrıca hücrelerin her proteine, her anda aynı oranda ihtiyacı bulunmaz.

15 Hücrelerde bazı gen ürünleri çok büyük miktarlarda bulunurken, diğer gen ürünleri daha az miktarlarda bulunurlar. Bazı gen ürünlerine olan gereksinim zamanla değişebilir. Bazı metabolik yol enzimlerine gereksinim besin kaynakları değiştikçe ya da tükendikçe azalabilir ya da artabilir. Çok hücreli bir organizmanın gelişimi sırasında, hücresel farklılaşmayı etkileyen bazı proteinler, çok az hücrede yalnızca kısa bir süre bulunabilir. Hücre işlevinin özgünleşmesi, değişik gen ürünlerine olan gereksinimi çarpıcı şekilde etkileyebilir.

16 Ökaryotik ve prokaryotik hücrelerde genetik bilginin en son fonksiyonel ürünlerinden biri olan proteine dönüştürülmesi yani genetik ifadenin denetimi birçok basamakta gerçekleştirilmektedir. Özellikle ökaryotlarda denetim daha fazla safhada gerçekleştirilir. Ancak denetimin en önemli noktası DNA dan RNA nın sentezlendiği transkripsiyon basamağının başlangıç safhasıdır. Prokaryotik hücrelerde organel bulunmadığından transkripsiyon ve translasyon aynı ortamda cereyan eder. Ökaryotik hücrelerde transkripsiyon ve translasyonun hücrenin farklı kompartımanlarında meydana gelmesi, gen ekspresyonunun farklı şekillerde kontrol edilmesine yol açar.

17 Günümüzde gen ekspresyonu; Bugün rekombinant protein üretim teknolojisiyle özellikle ilaç endüstrisi için çok sayıda protein üretilmekte ve ilgili yöntemler optimize edilmektedir. Zira protein sentezinin yüksek maliyeti nedeniyle, en verimli şekilde gen ifadesinin düzenlenmesi gerekir.

18 PROKARYOTLARDA GEN EKSPRESYONUNUN KONTROL VE DÜZENLENMESİ

19 Prokaryotlarda protein sentezinin kontrolü Prokaryotlarda protein sentezinin kontrolü, genellikle transkripsiyon düzeyinde ve daha az olarak translasyon düzeyinde olur. Transkripsiyon düzeyinde kontrol, nitel kontroldür; bir protein sentezlendikten sonra, yeniden gerekene kadar bu proteinin sentezi kısıtlanır veya durdurulur; bu sırada diğer proteinler sentezlenir. Prokaryotlarda mrna yarı ömrü kısadır. Genellikle protein azalması gerektiğinde gen transkripsiyonu kapatılır; mrna yapılmaz.

20 Transkripsiyon düzeyinde regülasyon, transkripsiyonun ne zaman olacağı ve ne kadar RNA molekülü yapılacağının kontrolüdür. Prokaryotlarda translasyon aşamasında kontrolde, proteinler mrna ya bağlanarak olayı durdurabilirler; mrna nın tersiyer yapısı, mrna/30s alt ünitesi bağlanmasını engelleyebilir.

21 Metabolik yolun düzenlenmesi Genlerin ifadesi baskı altına alınabilir. Hızlı yanıt olarak yoldaki ilk enzimin aktivitesini engeller (Geri bildirim yoluyla inhibasyon)

22 Prokaryot hücrede Transkripsiyon düzeyinde gen ifadesinin düzenlenimi, 1. Represyon İle Düzenlenim (trp operonu) 2. indüksiyon İle Düzenlenim (lac operonu) olmak üzere iki şekilde olabilir.

23 Prokaryot hücrede Transkripsiyon düzeyinde gen ifadesinin düzenlenimi Gen Regülasyonu nasıl cevap verdiğine göre özetlenebilir: 1. Sürekli olarak yapılan bir ürünün üretiminin baskılanması BASKILANABİLİR sistem Represyon İle Düzenlenim - genellikle hücre bir ürünü üretir, ancak ürüne ihtiyacı yoksa üretimi durdurur. Örn; triptofan sentezi 2. Sürekli üretilmeyen bir ürünün yapımının indüklenmesi ile olur. İNDUKLENEBİLİR sistem- hücre ürünü yalnızca ihtiyacı olduğunda oluşturur. Örn; laktaz sentezi Gen ekspresyon sistemleri POZİTİF ya da NEGATİF kontol altında çalışabilir ve her tip genelde İNDUKLENEBİLİR ya da BASKILANABİLİR sistemlerle bağlantılıdır.

24 İNDÜKLENEBİLiR GENLER- OPERON MODELİ Operon Nedir? Operatör + Promotör ve bunların kontrol ettiği genler (yapısal genler) Gen ifadesinin transkripsiyon düzeyinde düzenlenmesi için operon modeli tanımlanmıştır. Operon, tek promotorun kontrolü altında bulunan ve çok sayıda genin (cluster) ifadesini düzenleyen bir sistemdir. Bir polisistronik mrna ve onun düzenleyici elementlerinden meydana gelir (!!!bu nedenle sadece prokaryotlarda operon var). Operonda yer alan genler tipik olarak ortak bir metabolik yolda fonksiyon görürler.

25

26 Bir operonun bileşenleri: Promotor; üzerinde RNA polimeraz bağlanma bölgesi ve camp+reseptör protein bağlanma bölgesi olmak üzere iki bölge içerirler. Operatör (kontrol bölgesi); yapısal genlerin fonksiyonunu denetlerler. Yapısal genler; mrna yı oluştururlar. Repressor; operatöre bağlanarak transkripsiyonu baskılayan protein Terminatör ve Düzenleyici genler operon içinde yer almaz ancak özellikle düzenleyici genler operonu uzaktan kontrol ederler.

27 TRİPTOFAN OPERONU E.coli de yapısı aydınlatılan bir modeldir. Protein sentezi için triptofan gerektiğinde bu amino asidin sentezinden görevli beş enzim aynı mrna üzerinden sentezlenir. Kontrol mekanizması lac operonu ndan farklı şekilde gerçekleşir. Atternuatör Promotor Operatör Lider Ptrp Otrp L Baskılayıcı Trp R trpe trpd trpc trpb trpa Düzenleyici bölge Yapısal genler Triptofan bağlanma bölgesi Trp operonu Triptofan (ortak-baskılayıcı) Baskılayıcı protein

28 Baskılama; R geninden mrna ve daha sonra represör protein sentezlenir. Ortamda triptofan varsa represör proteine bağlanır. Bağlanma gerçekleştikten sonra represör proteinin konformasyonunda değişme meydana gelir. Böylece represör protein operatör bölgeye bağlanabilir hale gelir. Oluşan kompleksin bağlanması yapısal genlerin transkripsiyonunu engeller. Ortamda triptofan yoksa represör proteine bağlanıp konformasyonu değiştirecek triptofan olmadığından bağlanma gerçekleşmez. Represör protein, operatör bölgeye bağlanamadığından yapısal genler şifrelenir ve triptofan sentezinden sorumlu beş enzim sentezlenir.

29 E. coli de trp Operonu ve Kontrol Mekanizması Anabolik yolda gerekli proteinlerin üretilmesi.

30

31 LAKTOZ OPERONU E.coli, karbon kaynağı olarak laktozu kullanabilir. Bu şekerin metabolizmasında rol alan en önemli enzim, laktozu galaktoz ve glukoza hidrolizleyen -galaktozidaz dır. Laktozlu bir ortamda yaşayan bir E.coli hücresi bu enzimden binlerce molekül ihtiva eder.

32 -galaktozidaz indüklenebilir bir enzimdir. Bu enzim ile birlikte, aynı gen tarafından galaktosit permeaz ve tiyogalaktosit transasetilaz enzimleri de sentezlenir. -galaktozidaz; laktozu galaktoz ve glukoza hidrolizleyen Permeaz, laktozun bakteri hücresi membranından geçişini sağlayan bir transport proteini iken, transasetilazın fizyolojik rolü çok açık olmamakla birlikte laktozun sindirilmesi sırasında ortaya çıkan toksik yan ürünlerin uzaklaştırılmasından sorumlu olabileceği düşünülmektedir.

33 Söz konusu olan laktoz operonunun genetik elemanlarını bir regülatör (düzenleyici) gen, bir operatör gen ve bir seri yapısal genler oluşturmaktadır. Regülatör gen, operatör genle etkileşebilen ve protein yapısında molekül olan bir represör meydana getirir. Operatör gen kontrol ettiği yapısal genlerin bitişiğinde bulunur. Represör proteinin operatör gene bağlanması sonucu yapısal genlerin transkripsiyonu engellenir. Operatör gen ve beraberindeki yapısal genlere bir arada operon adı verilir.

34 i geni regülatör geni, o geni, operatör geni, z, y ve a genleri de yapısal genleri temsil etmektedir. RNA polimerazın bağlanması için p ile gösterilen bir promotor bölgesi vardır. IPTG gibi indükleyici bileşikler represöre bağlanarak onun operatör genle etkileşmesini önler. Bu durumda da z, y ve a genleri sözü edilen üç enzimi şifreleyen bir mrna molekülüne çevrilir. E.coli lac operonu nun indüklenme ve baskılanma mekanizması.

35 E.coli de bu enzimlerin fizyolojik indükleyicisi olarak laktozun transglikasyonu ile oluşan allolaktoz görev yapmaktadır. Bu bileşiğin oluşumu indüksiyon öncesi hücrede mevcut olan az miktarda -galaktozidaz molekülleri tarafından katalizlenmektedir. Yapılan çalışmalar izopropiltiyogalaktosid (IPTG) gibi metabolize olmayan bazı bileşiklerin de indükleyici olduğunu göstermiştir. HO H CH 2 OH H OH H O H OH H O H HO CH 2 H OH O H OH H HO H CH 2 OH H OH S H S H H 3 C C H CH 3 H OH H OH 1,6-Alloaktoz IPTG

36 Lac Operonun bileşenleri; A-YAPISAL GENLER 1. beta galaktosidaz- z geni : laktozu glukoz ve galaktoza ya da allolaktoza katabolize eder. 2. beta galaktosid permeaz- y geni : laktozun hücreye alınmasını sağlar. 3. beta galaktosid asetil transferaz- a geni : hücrede bulunabilecek diğer galaktosid şekerleri asetiller (laktoz metabolizması sonucu açığa çıkan atıkların uzaklaştırılması) Hepsi aynı promotorun kontolündedir. B- REGÜLATOR GEN lac operonunun yukarısında BAĞIMSIZ gen vardır ( i olarak gösterilir), özgül BASKILAYICI (repressör) PROTEİN i kodlar, bu protein lac operonunun operatorüne bağlanabilir. C- OPERATÖR- repressör proteinin bağlandığı bölge D-INDUCER E.coli lac operonunda, indukleyici (gizemli molekül) laktozun izomeridir. ALLOLAKTOZ Laktoz (ALLOLAKTOZ) yukarıdaki 3 farklı enzimin 1000 kat fazla oranda sentezlenmesini (ifade) edilmesini uyarır.

37 Yapısal genler laci Geninin Kodladığı Protein Lac Operonunun Promotorundaki operatör bölgeye bağlanır. Lacl, Lac repressor protein olarak da bilinir. Repressör protein, allosterik (şekil değiştirme) bir proteindir ve inducer olarak bilinen gizemli bir molekül için bağlanma bölgesine sahiptir. Bağlanma olduğunda, İNDUCER- ALLALAKTOZ baskılayıcının bağlanma özelliklerini değiştirir, bu da operonun Operatörünün serbest kalmasına neden olur.

38

39 NEGATİF GEN DÜZENLENMESİ; trp ve lac operonun düzenlenmesi genlerin negatif kontrolünü içerir. Operonlar repressör proteinlerin aktif formu tarafından kapatılır. trp operonu tipik örnektir. lac operonunda da durum aynıdır. Allolaktoz enzim sentezi doğrudan genom üzerinde etki yaratarak değil, lac operonunu repressörün negatif etkisinden kurtararak uyarır. POZİTİF GEN DÜZENLENMESİ; Düzenleyici bir protein, doğrudan genomla etkileşerek gen düzenlenmesi yapılmaktadır. (Repressör yok) Örn; lac operonunu içeren pozitif gen kontrolü

40 POZİTİF GEN DÜZENLENMESİ; Burada laktoz operonu modeli ile anlatılan protein sentezinin kontrolü, daha birçok başka faktörler tarafından da etkilenmektedir. Mesela, memelilerde çok önemli düzenleyici rolleri olan camp bakterilerde "katabolit aktive edici proteine (CAP)" bağlanarak (CAP-cAMP kompleksi, kooperatif bağlanma), bu proteinin laktoz operonunda spesifik bir diziliş bölgesine bağlanmasını ve sonuç olarak genin indüklenmesini sağlamaktadır. E.coli ortamında glukoz varlığında ortamda laktoz olsa bile lac operonu aktif olmamaktadır. Glukoz, adenilat siklaz enzimini inhibe ederek ATP den camp oluşumunu engeller. Bunun sonucu olarak CAP-cAMP kompleksi oluşmaz ve indükleme mekanizması çalışmaz. Ortamda glukoz yoksa adenilat siklaz enzimi inhibe olmaz, camp oluşur; CAP ile kompleks oluşturarak indükleme mekanizması çalışır.

41 Katabolik represyon (Glukoz etkisi)- operonunun Lac pozitif regülasyonu Laktozun tek başına C kaynağı olduğu durumlarda Pozitif kontrol gözlenir. AMP-CAP kompleksi cap site ye bağlandığında lac operonu için süperindükleyici rolü oynar, bu etkileşim tipi POZİTİF REGÜLASYONUN bir tipidir: protein kompleksi iliştirilmesiyle transkripsiyonun induklenmesi (zıt olarak baskılayıcı proteinin bağlanmasıyla transkripsiyonun engellenmesi)

42 Hücrede glukoz konsantrasyonu düştüğünde, hücrede camp konsantrasyonu yükselir (açlık sinyali), camp-cap ile bir kompleks oluşturur. CAP-cAMP kompleksi cap site ye bağlanır ve RNA polimeraz için daha çekici olur. Hücrede glukoz konsantrasyonu yüksekse, camp konsantrasyonu düşüktür. Bu durumda CAP ile kompleks yapmak için uygun az sayıda camp vardır.

43 ATTENÜASYON Prokaryotlarda organel bulunmadığından transkripsiyon ve translasyon aynı anda gerçekleşir. Transkripsiyonun sonlanmadan translasyonun meydana geldiği de görülür. Attenuasyon transkripsiyonun translasyon ile kontrol edilmesinin bir sonucudur. Yüksek triptofan konsantrasyonunda translasyon sırasında triptofana karşılık gelen UGG kodonları hızlı bir şekilde aşılır. Daha sonra stop kodonuna gelindiğinde protein sentezi durur ve mrna saç tokası şeklini alır. Bu noktadan itibaren transkripsiyon engellenir. Bu olaya attenüasyon (güç kaybı anlamındadır) denir. Lider diziden itibaren attenüasyon olana kadar 140 nükleotidlik mrna sentezlendiği belirlenmiştir. Triptofan ortamda yoksa lider diziden itibaren transkripsiyon devam eder. UGG kodonlarına gelindiğinde ortamda triptofan bulunmadığından ribozom duraklar. Bu nedenle mrna saç tokası şeklini almaz ve yapısal genlerin transkripsiyonu gerçekleştirilir.

44