ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ

Transkript

1 ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ BALIK YAĞINDAKİ EİKOSAPENTAENOİK ASİT (EPA) VE DOKOSAHEKSAENOİK ASİT (DHA) İN YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİ (HPLC) YÖNTEMİ İLE SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI PATOJENİK BAKTERİLER ÜZERİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ SU ÜRÜNLERİ AVLAMA VE İŞLEME TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI ADANA, 2013

2 ÖZ YÜKSEK LİSANS TEZİ BALIK YAĞINDAKİ EİKOSAPENTAENOİK ASİT (EPA) VE DOKOSAHEKSAENOİK ASİT (DHA) İN YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİ (HPLC) YÖNTEMİ İLE SAFLAŞTIRILMASI VE BAZI PATOJENİK BAKTERİLER ÜZERİNE ETKİSİNİN İNCELENMESİ ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ SU ÜRÜNLERİ AVLAMA VE İŞLEME TEKNOLOJİSİ ANABİLİM DALI Danışman : Prof. Dr. Fatih ÖZOĞUL Yıl: 2013, Sayfa:83 Jüri : Prof. Dr. Fatih ÖZOĞUL : Prof. Dr. Abdurrahman POLAT : Doç. Dr. İsmail AKYOL Bu çalışmada alabalık yağından HPLC tekniği ile esansiyel yağ asitleri olan eikosapentaenoik asit (EPA) ve dokosahekzaenoik asit (DHA) elde edilmesi ve bu yağ asitlerinin P. aeruginosa PR3 suşu tarafından biyodönüşümleriyle üretilen ekstraktların gıda kaynaklı patojen bakterilere karşı antimikrobiyal etkileri (inhibisyon zonu ve minimum inhibitor konsantrasyonu (MIK) değerleri) incelenmiştir. Alabalık yağında bulunan %11.1 oranında EPA ve %15.9 DHA, HPLC optimizasyonu sonucu %58.64 (EPA) ve %40.33 (DHA) seviyelerine yükseltilmiştir. Bu şekilde gıda ve farmasötik amaçlar için değeri yüksek destek maddesi olarak kullanılabilecek EPA ve DHA ca zenginleşmiş ürünler elde edilmiştir. Biyodönüşümlü EPA (bepa) ve DHA (bdha) 2 farklı gram pozitif bakteri (Listeria monocytogenes ATCC 7677 ve Staphylococcus aureus ATCC 29213) ve 6 farklı gram negatif bakteriye (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC700603, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Aeromonas hydrophila NCIMB 1135, Salmonella paratyphii A NCTC 13) karşı antibakteriyel aktivite göstermiştir. Bakteriyel suşlar için inhibisyon zon çapları ve MIK değerleri sırasıyla ham bepa ve bdha ekstraktı için 7-12 mm ve μg/ml aralığında değişmiştir. Sonuç olarak, P. aeruginosa PR3 tarafından EPA ve DHA nın biyodönüşüm ekstraktları, gıda kaynaklı patojenlerin kontrolü için gıda güvenliğinin sağlanmasında gelecek vaad eden alternetif antimikrobiyal ajanlar olarak kullanılabilirliğini göstermektedir. Anahtar Kelimeler: HPLC, DHA, EPA, MIC, Pseudomonas aeruginosa PR3 I

3 ABSTRACT MSc THESIS PURIFICATION OF EICOSAPENTAENOIC ACID (EPA) AND DOCOSAHEXAENOIC ACID (DHA) FROM FISH OIL USING HPLC METHOD AND INVESTIGATION OF THEIR ANTIBACTERIAL EFFECTS ON SOME PATHOGENIC BACTERIA CUKUROVA UNIVERSITY INSTITUTE OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES DEPARTMENT OF SEAFOOD PROCESSING TECHNOLOGY Supervisor : Prof. Dr. Fatih ÖZOĞUL Year: 2013, Pages: 83 Jury : Prof. Dr. Fatih ÖZOĞUL : Prof. Dr. Abdurrahman POLAT : Assoc. Prof. Dr. İsmail AKYOL The aim of this study was to purified EPA and DHA essential oils from trout oil using HPLC method, and bioconverted EPA and DHA into EPA (bepa) and DHA (bdha) extracts by P. aeruginosa PR3. Moreover, in vitro antibacterial activity of bepa and bdha was investigated using disc diffusion methods and minimum inhibitory concentration (MIC). EPA and DHA concentration of 11.1% and 15.9% in trout oil increased in 58.64% and 40.33% after HPLC optimisation, respectively. In this study, EPA and DHA enriched products were obtained which are to be used as valuable supplements for food and pharmaceutical purposes. The bioconverted EPA and DHA exhibited antibacterial activities against two Grampositive bacteria (Listeria monocytogenes ATCC 7677 and Staphylococcus aureus ATCC 29213) and six Gram-negative bacteria (Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Escherichia coli ATCC 25922, Klebsiella pneumoniae ATCC700603, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Aeromonas hydrophila NCIMB 1135 and Salmonella Paratyphi A NCTC 13). Inhibition zones and MIC value of bepa and bdha against bacterial strains ranged from 7 to 12 mm and from 350 to 2350 μg/ml, respectively. Our results suggested that the crude extracts of bioconversion of EPA and DHA by P. aeruginosa PR3 can be considered as promising antimicrobials in improving food safety by controlling foodborne pathogens. Keywords: HPLC, DHA, EPA, MIC, Pseudomonas aeruginosa PR3 II

4 TEŞEKKÜR Tez çalışmam boyunca tez konusunun belirlenmesinde, yürütülmesinde, yazımında geniş bilgi birikimi ve deneyimiyle bana ışık tutan danışman hocam Prof. Dr. Fatih ÖZOĞUL a, çalışmalarımda yardımlarını esirgemeyen Prof. Dr. Yeşim ÖZOĞUL, Doç. Dr. İsmail AKYOL, Dr. Esmeray Küley BOĞA, Öğr. Gör. İlyas ÖZOĞUL, Arş. Gör. Mustafa DURMUŞ, Biyolog Ali Rıza KÖŞKER e, Tez çalışmam sırasında her türlü desteğini esirgemeyen ve büyük sabrından dolayı bölüm ve anabilim dalı başkanımız Prof. Dr. Abdurrahman POLAT a, Çalışmam sırasında yardımlarını esirgemeyen doktora öğrencileri Esra BALIKÇI ve Saadet GÖKDOĞAN ile diğer laboratuvar arkadaşlarıma, Tezin yürütülmesi sırasındaki aşamalarda yardımlarını esirgemeyen Çukurova Üniversitesi, Su ürünleri Fakültesi, İşleme Anabilim Dalı öğretim üyelerine, Hayatımın her aşamasında her zaman varlığını hissettiren ve başta Ufuk EKE olmak üzere değerli aile dostlarım EKE ailesine, Maddi ve manevi destekleriyle bana her zaman yardımcı olan ANNEM, BABAM ve diğer aile üyelerime teşekkürü bir borç bilirim. III

5 İÇİNDEKİLER SAYFA ÖZ. I ABSTRACT..... II TEŞEKKÜR III İÇİNDEKİLER... IV ÇİZELGELER DİZİNİ..... VI ŞEKİLLER DİZİNİ VIII RESİMLER DİZİNİ. X SİMGELER VE KISALTMALAR.... XII 1.GİRİŞ ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ω-3 Doymamış Yağ Asitleri, Metabolizmaları ve Biyolojik Fonksiyonları EPA ve DHA Kaynağı Olarak Balık ve Balık Yağları Balık Yağının Elde Edilmesi Esansiyel Yağ Asitlerinin Elde Edilmesi İçin Uygulanan Yöntemler Kromatografik Yöntemler Distilasyon Yöntemleri Düşük Sıcaklık Fraksiyonlu Kristalizasyon Yöntemi Süperkritik CO 2 Ekstraksiyon Yöntemi Enzimatik Yöntemler ile Zenginleştirme Üre Fraksiyonlama Yöntemi Balık Yağından Yağ Asitlerinin İzolasyonu İle İlgili Yapılan Çalışmalar Doymamış Yağ Asitlerinin Biyodönüşümü İle İlgili Yapılan Çalışmalar MATERYAL VE METOT Materyal Çalışmada Kullanılan Balık Yağı Mikroorganizmalar Gıda Kaynaklı Patojen Bakteriler Biyodönüşüm Bakterisi IV

6 3.2. Metot Kromatografik Koşullar Ekipman ve Kolon Yağ Asitleri Analizi Gaz Kromatografisi/Kütle Spektrometrisi Analizleri Biyodönüşüm Reaksiyonu Patojen Bakteriyel Kültürlerin Geliştirilmesi Yağ Asitlerinin Biyodönüşümü Sonucu Elde Edilen İzolatın 39 Patojenler Üzerindeki Antimikrobiyal Etkinin Belirlenmesi Disk Difüzyon Yöntemi Minimum İnhibisyon Konsantrasyonun (MIK) Belirlenmesi İstatistik Analiz ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Yağ Asitleri Bileşimleri HPLC Analizi HPLC den İzole Edilen EPA ve DHA nın Gaz Kromatografisi (GC) Analizi bepa ve bdha GC-MS Analizleri bepa ve bdha İzolatlarının Patojenler Bakteriler Üzerindeki Antimikrobiyal Etkisi Disk Difüzyon Yöntemi Minimum İnhibisyon Konsantrasyonu (MIK) SONUÇ VE ÖNERİLER KAYNAKLAR. 63 ÖZGEÇMİŞ.. 75 EKLER. 77 V

7 ÇİZELGELER DİZİNİ SAYFA Çizelge 2.1. Dünya balık yağı üretiminin ülkelere göre dağılımı Çizelge 2.2. Bazı balık yağı türlerinin yağ asidi bileşimleri Çizelge 3.1. Kullanılan HPLC gradient profili Çizelge 3.2. Gaz kromotografisi koşulları.. 37 Çizelge 3.3. Gaz kromotografisi-kütle spektrometre koşulları Çizelge 4.1. Araştırmada kullanılan alabalık yağının yağ asitleri bileşimi Çizelge 4.2. bepa ve bdha GC-MS analizi sonuçları.. 51 Çizelge 4.3. bepa ve bdha ekstraktlarının seçilen bakterilere karşı oluşturdukları inhibisyon zonu Çizelge 4.4. bepa ve bdha ekstraktlarının test bakterileri üzerindeki MIK değerleri (μg/ml) 57 VI

8 VII

9 ŞEKİLLER DİZİNİ SAYFA Şekil 2.1. DHA (dokosaheksaenoik asit) kimyasal yapısı Şekil 2.2. EPA (eikosapentaenoik asit) kimyasal yapısı Şekil 2.3. Esansiyel yağ asitlerinin metabolik reaksiyonları Şekil 3.1. Kolon Kromatografisi Sistemi Şeması Şekil 4.1. EPA ve DHA izolatı kromatogramı Şekil 4.2. EPA ve DHA izolatının % miktarı.. 47 VIII

10 IX

11 RESİMLER DİZİNİ SAYFA Resim 3.1. Çalışmada kullanılan alabalık yağı Resim 3.2. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) cihazı.. 34 Resim 3.3. Kullanılan HPLC kolonlari (analitik kolon, preparatif kolon). 34 Resim 3.4. HPLC autosampleri ve örneklerin viallere konulması Resim 3.5. Kullanılan mobil fazlar ve kolon fırını.. 35 Resim 3.6. Gaz kromotografisi genel görünümü (orijinal). 36 Resim 3.7. Gaz kromotografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) genel görünümü Resim 3.8. Patojen bakterilerin nutrient broth içerisinde 24 saat inkübasyon sonunda gelişimi Resim 4.1. EPA ve DHA nın geliş zamanına ait HPLC kromatogrami.. 45 Resim 4.2. İzole edilen EPA ve DHA fraksiyonları 46 Resim 4.3. Salmonella paratyphi A nın P. aeroginosa PR3 suşu tarafından elde edilen bepa ve bdha ekstraktı tarafından oluşturduğu inhibisyon zon görünümü Resim 4.4. E. coli nin P. aeroginosa PR3 suşu tarafından elde edilen bepa ve DHA ekstraktı tarafından oluşturduğu inhibisyon zon görünümü 56 X

12 XI

13 SİMGELER VE KISALTMALAR GC GC-MS HPLC FFA SFA MUFA PUFA EPA DHA ÇDYA TDYA bepa bdha MIC LB SM ω : Gaz Kromatografisi : Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi : Yüksek Performanslı Sıvı Kromatografisi : Serbest Yağ Asitleri : Doymuş Yağ Asitleri : Tekli Doymamış Yağ Asitleri : Çoklu Doymamış Yağ Asitleri : Eikosapentaenoik Asit : Dokosaheksaenoik Asit : Çoklu Doymamış Yağ Asiti : Tekli Doymamış Yağ Asiti : Biyodönüşümü gerçekleşen EPA : Biyodönüşümü gerçekleşen DHA : Minimum İnhibitör Konsantrasyonu : Luria Broth : Screening Medium : Omega XII

14 XIII

15 1. GİRİŞ 1. GİRİŞ Yağ asitleri, yağın doymuşluk derecesini gösteren farklı uzunluktaki karbon zincirlerinden oluşan trigliseridlerdir (Pigott ve Tucker, 1990). Esansiyel yağ asitleri insan ve diğer canlılarda yaşam için mutlak gerekli olan ve vücutta sentezlenemediği için diyetle alınması gereken çoklu doymamış yağ asitleridir. Doğada en yaygın bulunan doymamış yağ asitleri, oleik (ω-9), linoleik (ω-6) ve linolenik (ω-3) asitlerdir. Bütün deniz ürünlerinde bulunan ve diğer besinlerde düşük oranlarda bulunan iki önemli yağ asidi, eikosapentaenoik asit (EPA) ve dokosaheksaenoik asit (DHA), linolenik asitle birlikte en önemli ω-3 yağ asitleridir. EPA ve DHA nın vücutta önemli biyokimyasal ve fizyolojik değişikliklere neden olduğu belirtilmektedir (Gordon ve Ratliff, 1992). Kara ve deniz canlılarının ω-3 yağ asitleri arasındaki farklılıklar zincir uzunluğu ve doymamışlık derecesi ile ilgilidir. Çoğu bitkisel yağlar yüksek miktarda çoklu doymamış yağ asitlerini (PUFA) içermesine rağmen bunların çoğu yalnızca 2 çift bağ içerir ve doymamışlık sınıflandırması bakımından ω-6 serisidir. Kara hayvanlarının yağları ise 4 çift bağa kadar bazı yağ asitlerini içerebilir, ancak doymuş yağ asitleri yüksektir. Sadece su ürünleri 5 ya da 6 çift bağa sahip uzun zincirli yağ asitlerine sahiptir (Pigott ve Tucker, 1990). Balık yağlarının esas farklılığı yüksek derecede doymamış olan uzun zincirli yağ asitlerinin % 40 a kadar çıkmasıdır (Huss, 1995). Balık yağlarındaki en büyük faydayı PUFA lardan ω-3 yağ asitleri sağlamaktadır. ω-3 yağ asitleri, vücutta sentezlenmediği için mutlaka besinlerle dışardan alınmalıdır (Leaf ve Weber, 1988). Üreme sistemi, görme ve sinir sistemi fonksiyonlarının düzenlenmesinde, PUFA ların hayati bir rol oynadığı açıktır. Balık yağ kapsüllerinin tüketimi ile ilişkili olarak sinirlerin, membranların ve kasların oksidatif hasarı E vitaminin eşit miktarda alınması ile önlenebilir. Amerikan Kalp Birliği, koroner kalp hastası olan kişilere günde 1 g balık yağı tüketmelerini tavsiye etmiştir (Eckel ve Krauss, 1998). Balıklardaki yağ oranı ile yağ asit kompozisyonu türlere, bireylere, vücut bölgelerine, beslenmeye, avlama mevsimine ve cinsiyet gibi çeşitli faktöre bağlı 1

16 1. GİRİŞ olarak değişebilir. Özellikle derin denizlerde yaşayan ve siyah etli olan balıklarda bu oran daha yüksektir. Somon, sardalye, uskumru, ton balığı gibi balıklar ω-3 yönünden oldukça zengin olmalarına rağmen kültür balıklarında ω-3 seviyesi biraz daha düşüktür. Fakat ω-3 yönünden zengin yemlerle beslenen kültür balıklarında doymamış yağ asitleri miktarı da yüksek olmaktadır (Anonim, 2002). Kabuklu deniz ürünlerinde ise %1 den daha az miktarda bulunmaktadır (Erkoyuncu, 2000). Omega-3 ve omega-6 yağ asitlerinin çeşitli organ ve hastalıklarda yararlı etkileri bulunmaktadır. Esansiyel yağ asit metabolizması obezite, hipertansiyon, diyabetes mellitus, kroner kalp hastalıkları, şizofreni, alzheimer hastalığı, ateroskleroz ve kanseri önlemede önemli rol oynamaktadır. Gerek gıda maddelerini doğrudan bileşimine eklenerek gerekse hayvansal kaynaklı gıdalarda elde edildiği canlı hayvanların rasyonlarına ilave edilerek, gıda maddelerinin omega yağ asitleri açısından zenginleştirilmesi sağlık açısından yaygın hale gelmiş bir uygulama olmaktadır. Gıda sektörünün yanı sıra farmakoloji ve kozmetik sanayinde omega yağ asitleri yaygın bir şekilde kullanıldığı bilinmektedir. Günümüzde obezite, kalp ve damar hastalıkları gibi rahatsızlıklar insanların en büyük sorunlarından biridir. Bu hastalıklarda gözlenen hızlı artış, endüstriyelleşme, şehirleşme, teknolojinin hızlı gelişimi ve gıda marketlerinin globalleşmesi sonucu insanların beslenme tarzının değişimine ve iş koşulları gereği fiziksel aktivitelerinde gözlenen azalmaya bağlanmaktadır. Dünya Sağlık Örgütü ne göre, son yıllarda insanlar yüksek enerjili, fazla miktarda yağ, tuz, protein ve rafine karbonhidrat içeren, buna karşılık vitamin ve mineral değeri düşük gıda maddelerini daha fazla tüketmektedir. Örgüt bu hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde, öncelikle yağ, protein ve karbonhidratca dengeli gıda tüketilmesini, kompleks karbonhidratlar ve özellikle ω-3 çoklu doymamış yağ oranı yüksek yağlar kullanılmasını ve ayrıca yağlarla alınan ω-6 / ω-3 oranının 5: 1 olmasına dikkat edilmesini önemle tavsiye etmektedir. Son yıllarda hastalık riskinin azaltılması, sağlıklı bir yaşam sürdürme isteğinin artması ve sağlıklı beslenme bilincinin gelişmesi gibi nedenlerle tüketiciler gıdalardan beslenmenin yanı sıra sağlık açısından faydalar da beklemektedirler. 2

17 1. GİRİŞ Bilim ve teknolojideki gelişmeler doğrultusunda yeni maddelerin keşfi, bunların sağlıkla ilişkilendirilmeleri, ekonomik nedenler ve tedavi masraflarının artması ile tüketicilerin yeni ürünlere ve kaliteye gösterdikleri ilgiden dolayı fonksiyonel gıdalar, başta gıda sanayi olmak üzere pek çok alanda en hızlı gelişen sektörlerinden birisi olmuştur. Fonksiyonel gıda ürünlerinin üretim maliyetlerinin normal gıda ürünlerininkinden daha yüksek olmasına karşın, sağlığa yaptıkları olumlu etkiler, böylece sağlık giderlerinin azalması ve tüketim miktarlarındaki artış nedeniyle, üretici firmaların fonksiyonel gıdalara ilgisi gün geçtikçe artış göstermektedir. Bu yönde en çok kullanılan fonksiyonel gıda katkı maddesi ise esansiyel yağ asitleri olmaktadır (Alasalvar ve ark., 2002). Tüketilen gıdalardaki yağların, doymamış yağlarca zengin olması çok önemlidir. ω-3 yağ asitlerinin faydalı olduğu ilk olarak Eskimolar üzerinde yapılan araştırmalar sonucu bulunmuştur. Yapılan çalışmalarda Greenland Eskimolarının tükettikleri yağlı balıklardan dolayı kalp krizi riskinin çok düşük olduğu gözlenmiş, bunun üzerine EPA ve DHA nın faydaları üzerine yapılan çalışmalara ağırlık verilmiştir. Çünkü ω-3 serisi yağ asitlerinin vücutta, biyokimyasal ve fizyolojik aktivitelerde önemli görevler üstlendiği artık kesin olarak bilinmektedir. Sonuçta bu yağ asitlerinin kalp krizi, kalp damar hastalıkları, depresyon, migren türü baş ağrıları, eklem romatizmaları, şeker hastalığı, yüksek kolesterol ve tansiyon, bazı alerji türleri ile kanser gibi birçok hastalıktan korunmada önemli etkisi olduğu tespit edilmiştir (Gorga, 1998; Nettleton, 2000). Yağ asitleri, insan vücudunda göz, beyin, testis ve plasentada toplanır. Beyin, retina, testis ve spermin yapısal bir bileşiği olan DHA, doku fonksiyonlarının uygun şekilde işlevi ile ilgilidir. Son çalışmalar prematüre bebeklerin dokularındaki DHA düzeyinin, normal sürede doğan bebeklerden daha az olduğunu göstermiştir. Beslenmelerinde ω-3 yağ asitleri olmayan bebeklerin görme ve sinir dokularının gelişimi yetersizdir. İnsan sütündeki ω-3 yağ asidinin, balık tüketen kadınlarda en yüksek, vejetaryenlerde en düşük olduğu belirtilmektedir (Nettleton, 2000). Amerikan Sağlık Örgütü tarafından beslenme ihtiyacını karşılamak için insanların her öğünde alması gerekli olan g ω-3 PUFA lar yağ bakımından zengin olan balıklardan sağlanabilir. ω-3 PUFA larca en zengin olan balık türleri 3

18 1. GİRİŞ sardalya, atlantik uskumrusu, pasifik ve atlantik ringası, göl alası, salmon, avrupa hamsisi ve lüferdir. Alınacak doymamış yağ asitleri miktarları balık türlerine göre değişmektedir. Levrek, pisi, mezgit gibi balıkların 15 gramında PUFA miktarı 50 mg civarında iken uskumru, ringa, yılan balığı gibi yağlı balıkların 15 gramında 400 mg PUFA bulunmaktadır. Bunun için haftada 300 g kadar yağlı balık yemek veya günde 200 mg EPA ve DHA alınması yeterli olacaktır (Hagstrup, 2001). Yapılan araştırmalar, insanların karşılaştıkları birçok hastalığa besin maddelerinin ve beslenme alışkanlıklarının neden olduğunu ortaya koymaktadır. Bundan dolayı insanlar beslenmelerine dikkat etmek zorundadırlar. Yüksek kolesterolden ileri gelen hastalıkların, önemli oranda kırmızı etten kaynaklandığı artık bütün insanlar tarafından bilinmektedir. Bunun için daha sağlıklı olan doymamış yağ asitleri yönünden zengin olan gıdalar tüketilmesi tavsiye edilmektedir (Sidhu, 2003). Fonksiyonel gıda pazarındaki firma sayısının giderek artması, piyasaya her geçen gün yeni bir ürünün sunulması gibi gelişmeler sektörde büyümenin süreceğinin sinyallerini vermektedir. Ülkemizde ise büyük potansiyeli olan fonksiyonel gıda pazarında gerek yerli gerekse yabancı üreticiler sürekli rekabet içerisindedir. Bu pazarın büyük bir kısmını oluşturan esansiyel yağ asitlerinin neredeyse tamamının ithal ediliyor olması yerli üreticilerimizin rekabet etme şansını azaltmaktadır (Euromonitor, 2006). Yurt dışından ithalatının yapılması nedeniyle yerli sermayenin dışarı akması, bunları kullanan yerli üreticilerin dışa bağımlı olması üretim aşamasında birçok zorluklarla karşı karşıya kalmalarına neden olmaktadır (Türkan, 2005). Son yıllarda EPA ve DHA ile zenginleştirilmiş market potansiyeli yüksek olan özellikle çocuklara yönelik ürünlerin geliştirilmesi konusuna da ilgi artmıştır. Günümüzde, özellikle gelişmiş ülkelerde insanlar, beslenmelerine çok dikkat etmekte ve beslenme rejimlerinde sağlık açısından uygun gıdaları seçmeye özen göstermektedirler. Bu gıdalar içerisinde de ilk sırayı çoklu doymamış yağ asitleri yönünden zengin olan balık ve diğer su ürünleri almaktadır (Anonim, 2004). Gerek gıda maddelerini doğrudan bileşimine eklenerek gerekse hayvansal kaynaklı gıdalarda elde edildiği canlı hayvanların rasyonlarına ilave edilerek, gıda 4

19 1. GİRİŞ maddelerinin ω-3 yağ asitleri açısından zenginleştirilmesi sağlık açısından yaygın hale gelmiş bir uygulama olmaktadır. Gıda sektörünün yanı sıra farmakoloji ve kozmetik sanayinde, katkılı margarinden, katkılı fırın ürünleri, içecekler, et mamulleri, mandıra ürünleri ve yumurtaya kadar ω- yağ asitleri yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Dünyanın gelişmiş ülkeleri, gerek gıda sektöründe gerekse ilaç sektöründe bitkisel kaynaklara yönelmiş durumdadırlar. Tüketicilerin daha sağlıklı ürünlere yönelmeleri, fonksiyonel gıdalar ve besin katkılarına olan ilgilerinin artması doğal ürünlere yönelen sektörlerin hızla büyümesine sebep olmaktadır. Ama dünya besin ve ham madde üretim kapasitesi karasal imkanlar ile bir noktaya kadar sağlanabilmektedir. Ağırlıklı olarak su ürünlerinde bulunan EPA ve DHA gibi yağ asitlerinin kaynağının balık ve diğer deniz ürünlerinin oluşu ise su ürünleri sektörüne de ilginin büyümesine neden olmaktadır (Anonim, 2001). Gıda sektöründe özellikle ω-3 ve ω-6 yağ asitleri önemli oranda kullanılan katkı maddeleridir. Özellikle 2000 li yıllardan itibaren Türkiye pazarında görülmeye başlanan fonksiyonel gıdalar Türkiye piyasasında her geçen yıl önemli ölçüde büyümekte ve pazar payı genişlemektedir. Türkiye Gıda ve İçecek Sanayi Dernekleri Federasyonu (TGDF) verilerine göre 2006 yılında fonksiyonel gıda pazarının 150 milyon dolara ulaştığı ve bu pazarın 42,5 milyon dolarını sütlü fonksiyonel ürünlerin oluşturduğu bildirilmektedir (Anonim, 2007). ω-3 serisinden çoklu doymamış yağ asitlerinin insan sağlığı üzerine olan olumlu etkilerinden dolayı özellikle son yıllarda insanlar tarafından tüketilen hayvansal ürünlerde ω-3/ω-6 oranının artırılması yönünde araştırmalar yapılmaktadır. Yapılan kanatlı besleme çalışmaları da yumurtanın yanı sıra etlik piliç karma yemlerinde yapılacak değişikliklerle tavuk etinin ω-3 yağ asitlerince zenginleştirilebileceğini göstermektedir. ω-3 serisinden çoklu doymamış yağ asitlerince zenginleştirilmiş etlik piliç etlerinin tüketilmesi insanlarda koroner kalp hastalıklarının önlenmesinde oldukça önemli rol oynamaktadır. Böylece insanların sağlığı için oldukça önem taşıyan ω-3 yağ asitlerini gıdalarla almaları sağlanmış olmaktadır (Theron, 2002). 5

20 1. GİRİŞ Son yıllarda içme sütü, yoğurt ve peynir gibi süt ürünlerinin EPA ve DHA katılarak zenginleştirilmesi ve gıda pazarına yeni özel beslenme amaçlı gıdaların sunulması önem kazanmaktadır. Süt ürünlerinin günlük beslenmemizde tüketiminin yaygın olması, düşük sıcaklıkta saklanmaları ve kısa raf ömrüne sahip olmaları, hava ve ışık geçirgenliği olmayan ambalajlarda paketlenmeleri nedeniyle EPA ve DHA ile zenginleştirmesi açısından uygun ürünlerden olduğu belirtilmektedir (Kolanowski ve Laufenberg, 2006; Kolanowski ve ark., 1999; Lovegrove ve ark., 1997). EPA ve DHA ile zenginleştirme aşamasında ürünün duyusal ve fiziksel özelliklerinde ortaya çıkabilecek olumsuz değişimlere engel olmak önemli bir konudur. Bu nedenle her ürün için katılacak uygun miktar mutlaka belirlenmelidir. İstenmeyen balık tadının ortaya çıkması, oksidasyonun oluşması ve zenginleştirilecek gıdanın özelliği (su ve yağ miktarı, aroma ilavesi) kullanılacak yağ asidi miktarını sınırlayan etmenlerdendir (Castro ve ark., 2004; Gibney, 1997; Tautwein, 2001). Esansiyel yağ asitlerinin kullanıldığı bir diğer sanayide ilaç sanayisidir. Alternatif tıp ürünleri olarak kullanılan ürünlere, haplara ve kapsüllere ekleniyor olmasıyla ilaç özdeşi preparat olarak kullanılmaktadır. Kozmetik sektöründe (dermakozmetik) cilt bakım ürünleri, saç bakım ürünleri, vücut bakım ürünleri, makyaj malzemeleri gibi ürünlerin yapımında yağ asitlerini kullanmaktadır. Gelişen dünya da kozmetik sektörünün pazar hacminin büyümesi yağ asitleri kullanımını arttırmaktadır. Biyodönüşüm reaksiyonları, yağ asitlerini antimikrobiyal, endüstriyel ve biyomedikal özelliklere sahip tamamıyla yeni bir kimyasal bileşiğe dönüştüren ve green teknoloji olarakta adlandırılan bir olaydır (Bajpai ve ark., 2008). Doymamış yağ asitlerinin mikrobiyal dönüşümü, katma değerli yeni hidroksi ürünlere dönüşümlerinden dolayı geniş çapta incelenmektedir (Hou, 1995). Doymamış yağ asitleri arasında oleik asit, linoleik asit ve linolenik asit substrat olarak kullanılmak üzere hidroksi yağ asitlerinin mono-,di- ve trihidroksi yağ asitlerine dönüşümü için çok çalışılmıştır. Endüstriyel uygulamalar için çeşitli katma değeri yüksek hidroksi yağ asitleri ve onların türevleri mikrobiyal enzimlere ait spesifik reaksiyon gösterme özelliklerine göre üretilebilir. 6

21 1. GİRİŞ Balık yağından HPLC ile EPA ve DHA nın saflaştırılması ve mikrobiyolojik etkileri ile ilgili literatürlerde çok az sayıda çalışma bulunmaktadır. Günümüzde birçok yağ üretimi yapan tesis bulunmaktadır. Fakat kullandıkları teknoloji sadece yağ üretimine yönelik olduğundan yağ içerisinde bulunan ve insan sağlığı, kozmetik, gıda sanayi, yem sanayisi, ilaç sanayi alanlarında kullanımı önemli olan yağ asitlerinin izolasyonu yapılmamaktadır. Bu sebeple bu tip ürünler yurt dışından ithal edilmekte ve maliyeti de artırmaktadır. Bu nedenle bu fonksiyonel gıdaların ülkemizde ileri teknoloji ile yüksek kalitede elde edilmesi ve ülke ekonomisine katkıda bulunması büyük bir önem arz etmektedir. Bu sebeplerden dolayı çalışmada alabalık yağlarından HPLC tekniği ile esansiyel yağ asitleri olan EPA ve DHA ω-3 yağ asitlerinin elde edilmesi ve bu yağ asitlerinin P. aeruginosa PR3 suşu tarafından biyodönüşümleriyle üretilen ekstraktların antimikrobiyal etkilerinin inhibisyon zonu ve MIC değerleri ile gıda kaynaklı patojen bakterilere karşı incelenmesi amaçlanmıştır. 7

22 1. GİRİŞ 8

23 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2. ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.1. ω-3 Doymamış Yağ Asitleri, Metabolizmaları ve Biyolojik Fonksiyonları Yağlar insan beslenmesinde önemli bir yere sahiptirler ve sağlık açısından son derece faydalı gıda maddelerinin başında gelmektedirler. Fakat sağlığa olan faydalarının yanında, doğru tüketilmediklerinde obezite, kalp ve damar hastalıkları gibi rahatsızlıklara neden olabilmektedirler. Günümüzde obezite, kalp ve damar hastalıkları gibi rahatsızlıklar insanların en büyük sorunlarından biridir. Bu hastalıklarda gözlenen hızlı artış, endüstriyelleşme, şehirleşme, teknolojinin hızlı gelişimi ve gıda marketlerinin globalleşmesi sonucu insanların beslenme tarzının değişimine ve iş koşulları gereği fiziksel aktivitelerinde gözlenen azalmaya bağlanmaktadır (Anonim, 2006; Anonim, 2007). Dünya Sağlık Örgütü ne göre, son yıllarda insanlar yüksek enerjili, fazla miktarda yağ, tuz, protein ve rafine karbonhidrat içeren, buna karşılık vitamin ve mineral değeri düşük gıda maddelerini daha fazla tüketmektedir. Örgüt bu hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde, öncelikle yağ, protein ve karbonhidratca dengeli gıda tüketilmesini, kompleks karbonhidratlar ve özellikle ω-3 çoklu doymamış yağ oranı yüksek yağlar kullanılmasını ve ayrıca yağlarla alınan ω-6/ω-3 oranının 1:5-1:10 arasında olmasına dikkat edilmesini önemle tavsiye etmektedir. Bu bölümde ω-3 yağ asitlerinin kimyasal yapısı, metabolik reaksiyonları ve biyolojik fonksiyonları hakkında genel bilgi verilecektir. Kimyasal yapılarında birden fazla cis konfigürasyonunda çift bağ içeren ω-3 yağ asitleri çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) olarak adlandırılır. Yağ asitlerindeki karbon atomları, karboksil grubundan itibaren numaralandırılır. Karboksil grubuna bitişik karbon atomu 2 nolu karbon atomudur ve bu karbon atomu aynı zamanda α - karbon diye de bilinir. Üç nolu karbon atomu β-karbondur. Son metil grubundaki karbon atomu ise ω veya n-karbon atomu olarak bilinir. Bütün ω -3 yağ asitlerinde, ilk çift bağ ω karbon atomundan sonra gelen üçüncü ve dördüncü karbon atomları arasında yer alır (Dubois ve ark., 2007) (Şekil 2.1 ve Şekil 2.2). 9

24 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Şekil 2.1. DHA (dokosaheksaenoik asit) kimyasal yapısı Şekil 2.2. EPA (eikosapentaenoik asit) kimyasal yapısı İnsanlar ve diğer memeli hayvanlarda, karboksil grubundan itibaren en fazla 9. ve 10. karbonlar arasında çift bağ oluşturabilecek desaturaz enzimi bulunmaktadır. Bundan dolayı insanlar ve hayvanlarda sadece ω-9 sınıfı tekli doymamış yağ asiti olan oleik asit (18:1n-9) sentezlenebilmektedir. ω-3 ve ω-6 yağ asitleri sentezlenemediğinden mutlaka diyet yoluyla dışarıdan alınması gereklidir. İşte organizmada sentezlenemeyen ve besinler yoluyla birlikte alınması gerekli olan 18 karbonlu linoleik (LA, 18:2, ω-6, cis, cis, 9, 12-oktadekadienoik asit) ve linolenik (ALA, 18:3, ω-3, cis,cis,cis,9,12,15-oktadekatrienoik asit) asitlere esansiyel yağ asitleri denir (Waruda ve ark., 2006). Şekil 2.3 te görüldüğü üzere, ω -6 yağ asitlerinin kaynağı olan LA nın metabolitleri dihomo-gamma-linoleik asit (DGLA) ve araşidonik (AA) asittir. DGLA 1. grup prostaglandinlerin oluşumunu sağlar. AA ise proinflamatuar medyatörlerin, 2. grup prostaglandinler ve 4. grup lökotrienlerin sentezlenmesini sağlar. ω-6 tipi eikosanoidler (tromboksanlar, prostaglandinler ve lökotrienler) kan damarlarının 10

25 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR daralmasına, trombosit çökmesine ve pıhtılaşmasına yardım eder, enflamasyon etki gösterir ve düz kasların kasılmasını temin eder (Waruda ve ark., 2006; Aydın, 2004). ω-3 yağ asidi ω-6 yağ asidi α-linolenik asit (ALA) Linoleik asit (LA) 18:3n-3 18:2n-6 Δ-6-desaturaz Stearidonik asit Gamma linolenik asit (GLA) 18:4n-3 18:3n-6 20:4n-3 20:3n-6 Δ-5-desaturaz Eikosapentaenoik asit (EPA) Araşidonik asit (AA) 20:5n-3 20:4n-6 22:5n-3 22:4n-6 Δ-4-desaturaz Dokosaheksaenoik asit (DHA) 22:5n-6 22:6n-3 Şekil 2.3. Esansiyel yağ asitlerinin metabolik reaksiyonları (Waruda ve ark., 2006) ω-3 yağ asitlerinin kaynağı ALA ise insan vücudunda LA nın kullandığı aynı desatüraz ve elongaz enzimleri ile EPA ve DHA gibi metabolitlere dönüşür. EPA dan oluşan prostaglandinlerin ise anti-trombotik, anti-ritmik ve antienflamatuar etkileri vardır. Trombosit agregasyonu ve reaktivitesini azaltır. Plasma viskozitesini azaltır. Pıhtılaşma zamanını arttırır. Membran iyon kanallarını etkiler. Enflamatuar eikosanoidlerin üretimini azaltır. Damarlarda plak oluşumunu önler. Kan basıncını azaltır (İşleroğlu ve Yıldırım, 2005). Uzun zincirli çoklu doymamış yağ asitleri vücuttaki bütün dokuların membranlarındaki fosfolipidlerin temel yapısal bileşenidir ve ayrıca membranın akıcılığını ve iyon transferini etkiler. Bu yağ asitlerinden ω-3 ÇDYA özellikle, 11

26 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR miyokard, retina, beyin ve spermatozoada bol miktarda bulunurlar ve bu dokuların gelişmesi, doğru ve tam çalışması ve düzenleyicisi oldukları bir çok fizyolojik sürecin işlemesi için elzemdirler. Genel olarak ω-3 yağ asitleri (ALA, EPA ve DHA) bu işlevlerine bağlı olarak, kalp ve damar hastalıkları, romatoid artirit, kanser, astım, alzheimer gibi bir çok hastalığın önlenmesi ve tedavisinde ayrıca bebeklerde retina ve beyin gelişiminde etkin rol oynamaktadırlar (Brown, 2000; Lauritzen ve ark., 2001). Beyin ve retina membranının en önemli bileşiği olan DHA, ALA eksikliğinde yeterli miktarda oluşamaz. Diyetle çok yüksek miktarda linoleik asit alındığı zamanda linoleik asit EPA ve DHA nın sentezini inhibe eder. Bundan dolayı linoleik asit içeren mısır ve ayçiçek yağınca zengin ve ALA ca düşük diyetler EPA ve DHA eksikliğine sebep olur. Bu durumlarda EPA ve DHA nın diyet yoluyla alınması gerekmektedir (Calabrase, 1999; Stoll, 1999) İnsan vücudunun sağlıklı şekilde gelişmesi, çalışması ve hastalıklardan korunması için beslenmenin önemi son yıllarda giderek daha da üzerinde durulan bir konu haline gelmiştir. İnsanların yeterli ve dengeli beslenmeleri için gereksinimleri olan enerji, protein, vitamin ve mineral madde ihtiyaçlarının karşılanmasında hayvansal ürünler birinci sırada gelmektedir. Beslenme alışkanlıkları, insan sağlığı üzerinde önemli bir rol oynamaktadır. Vücut için esansiyel besin maddeleri olan aminoasitler, yağ asitleri, bazı vitamin ve mineral kaynaklarının yeterli ve dengeli olması gerekmektedir. Yağ asitleri, yağın doymuşluk derecesini gösteren farklı uzunluktaki karbon zincirinden oluşan trigliseridler olduklarından hem kompleks lipitlerin önemli bir parçası hem de kendisinden kolayca enerji sağlanan bir kaynaktır. Doymuş ve doymamış yağ asitleri olarak iki çeşittirler. Doymamış yağ asitleri de tekli doymamışyağ asitleri (MUFA) ve çoklu doymamış yağ asitleri (PUFA) olarak iki gruba ayrılır (Oğuz, 2000). Temel itibariyle iki gruba ayrılan ω-6, ω-3 yağ asitleri çoklu doymamış yağ asitleri olarak tanımlanmakta, oda sıcaklığında sıvı özellikte ve aynı zamanda insan hayatının devamlılığı için de çok önemlidirler. ω-6 ların ana kaynağı yüksek oranda linoleik asit içeren mısır ve soya fasulyesi yağıdır. ω -3 ise keten tohumu, ceviz ve özellikle plankton ile yağlı balıklarda bol miktarda bulunur. 12

27 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ω -3 yağ asitlerinin en önemlileri olan EPA ve DHA, besin zinciri yoluyla deniz ürünlerinde birikmektedir. Bu yağ asitleri ilk olarak deniz algleri tarafından sentezlenir, sonra da plankton ve diğer küçük deniz hayvanları tarafından tüketilerek onların bünyesine yerleşirler ve böylece besin zincirine katılmış olurlar. ω-3 serisi yağ asiti olan EPA (C20:5, ω-3), dekosapentaenoik asit (DPA- C22:5, ω-3) ve DHA (C22:6, ω-3) balıklarda bol olarak bulunur (Gordon ve Ratliff, 1992). Keten tohumu ve cevizde alfa-linolenik asit, balık yağlarında ise eikosapentaenoik asit (EPA) ve dekosahekzaenoik asit (DHA) en önemli yağ asitleridir. EPA ve DHA nın mutlaka dışarıdan alınması gerekir. İnsan vücudu esansiyel yağ asitlerini sentezleyemediğinden bunların gıdayla dışarıdan alınması gereken elzem yağ asitleri olarak adlandırılırlar (Tayar ve Korkmaz, 2004, Calabrese, 1999; Stoll, 1999). Özellikle hayvansal kökenli yağlar doymuş yağ asitleri bakımından kolesterol riski taşımalarından dolayı insanlar ihtiyaç duydukları yağın en az % 30 unu çoklu doymamış yağ asitleri içeren bitkisel kökenli yağlardan karşılamaları önemlidir (Anonymous, 1994). Koroner kalp hastalıklarında en önemli risk faktörü, kandaki yüksek kolesterol seviyesidir. Bunun yanında damar sertliği ve yüksek tansiyon hastalıklarını artırdığı ifade edilen kolesterol, hem insan vücudunda sentezlenmekte hem de gıdalarla dışarıdan alınmaktadır. Kolesterol seviyesine vücut dışından gelen en güçlü etkinin yağlardan kaynaklandığı bilinmektedir. Ancak, yağların farklı kimyasal özelliklere sahip olmaları nedeniyle, kandaki kolesterol üzerine etkileri, farklı olmaktadır. Özellikle doymuş yağ asidi yüksek yağlarla beslenme, kandaki kolesterol miktarını arttırmaktadır (Anonymous, 1994). Balık yağları, karasal hayvanlardan elde edilenlere göre beslenme açısından daha değerlidir. ω-3 yağ asitlerince zengin gıdalar olarak balık yağı, keten tohumu, soya, kanola ve yeşil yapraklı sebzeler bildirilmektedir. Balık yağı %20 oranında doymuş yağ asitlerini içerirken; doymamış yağ asitlerini ise %80 düzeyinde ihtiva etmektedir. Bu doymamış yağ asitlerinin büyük çoğunluğunu da çoklu doymamış yağ asitleri oluşturmaktadır. Bunlar ω-3 grubu yağ asitleri olan EPA ve DHA asitleridir (Varlık ve ark., 2004). 13

28 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Esas itibariyle ω serisinden çoklu doymamış yağ asitlerinin insanlarda koroner kalp hastalıklarının, kanserin, damar sertliğinin ve şeker hastalığının önlenmesinde etkili oldukları bildirilmektedir (Lopez-Ferrer ve ark. 1999). Ω-3 serisinden çoklu doymamış yağ asitlerinin insan sağlığı üzerine olan olumlu etkilerinden dolayı özellikle son yıllarda insanlar tarafından tüketilen hayvansal ürünlerde ω-3/ω-6 oranının artırılması yönündeki çalışmalara ağırlık verilmektedir. Yapılan kanatlı besleme çalışmaları da yumurtanın yanı sıra etlik piliç karma yemlerinde yapılacak değişikliklerle tavuk etinin de ω-3 yağ asitlerince zenginleştirilebileceğini göstermektedir. ω-3 serisinden çoklu doymamış yağ asitlerince zenginleştirilmiş etlik piliç etlerinin tüketilmesi insanlarda koroner kalp hastalıklarının önlenmesinde oldukça önemli rol oynamaktadır. Böylece insanların sağlığı için oldukça önem taşıyan ω-3 yağ asitlerini gıdalarla almaları sağlanmış olmaktadır (Theron, 2002). İlk insanların diyetindeki ω-6:ω-3 oranı 1:1 iken günümüzde bu değer yaklaşık olarak 10:1 düzeyindedir (Simopoulos, 1999). Bu durum, gıdalarla ω-3 yağ asidi alımının azalması ve bitkisel yağ kullanımının yaygınlaşması nedeniyle ortaya çıkmıştır. (Kris-Etherton ve ark., 2000). Bazı araştırıcılar, fonksiyonel yumurtanın kalitesinin içerdiği doğal antioksidanlar ve yağ asitleri kompozisyonuna bağlı olduğunu bildirmişlerdir. Eğer yumurta DHA ve PUFA (çoklu doymamış yağ asitleri) bakımından zenginleştirilmişse, insan sağlığı açısından müşterinin istediği bir ürün haline gelmektedir (Surai ve ark., 2001). Çoklu doymamış yağ asitlerinin gelişme çağındaki canlılarda büyümenin uyarılması, derinin canlılığının sürdürülmesi ve bazı deri hastalıklarının önlenmesinde etkili oldukları bildirilmektedir. Hatta ω-6 grubu yağ asitlerinin prostaglandin E2 düzeyini artırdığı, bu hormonun da kemik gelişimini baskıladığı bildirilmektedir. Bu nedenle ω-3 yağ asitlerince zenginleştirilmiş bir rasyonla beslemenin prostaglandin E2 nin salınımını baskılayarak, kemik gelişimini teşvik ettiği ileri sürülmektedir. Tüketilen gıdalardaki yağların, doymamış yağlarca zengin olması çok önemlidir. Balık yağlarındaki en büyük faydayı PUFA lardan ω-3 yağ asitleri sağlamaktadır. Balık ve diğer deniz ürünlerinde bulunan iki baskın ω-3 yağ asidi EPA ve DHA nın tedavi edici özelliği ile ilgili iddialar araştırılmaktadır. İnsanlar 14

29 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR üzerinde yapılan araştırmalar sonucunda; balık ağırlıklı beslenen insanlarda kalpdamar rahatsızlıkları ve hipertansiyona, çarpıntıya, kalp ritmi bozukluğuna, şeker hastalığına, eklem romatizmasına, sinir ve bağışıklı sistemine, beyin fonksiyonlarına, depresyona ve kansere karsı önemli etkileri olduğu bildirilmiştir. Bilimsel veriler, balık ya da balık yağlarının ω-3 içeriğinin tüketiminin kroner kalp hastalığı riskini azalttığı, hiper tansiyonu düşürdüğünü, belirli kalp ritmi bozukluklarını ve ani ölümleri azalttığını, şeker hastalıkları oranını düşürdüğünü ve romatizmaya bağlı eklem ağrılarını azalttığını ortaya koymuştur. Üreme sistemi, görme ve sinir sistemi fonksiyonlarının düzenlenmesinde, PUFA ların hayati bir rol oynadığı açıktır. Balık yağ kapsüllerinin tüketimi ile ilişkili olarak sinirlerin, membranların ve kasların oksidatif hasarı E vitaminin eşit miktarda alınması ile önlenebilir. ω-3 yağ asitlerinin faydalı olduğu ilk olarak Eskimolar üzerinde yapılan araştırmalar sonucu bulunmuştur. Yapılan çalışmalarda Greenland Eskimolarının tükettikleri yağlı balıklardan dolayı kalp krizi riskinin çok düşük olduğu gözlenmiş, bunun üzerine EPA ve DHA nın faydaları üzerine yapılan çalışmalara ağırlık verilmiştir. Sonuçta bu yağ asitlerinin kalp krizi, kalp damar hastalıkları, depresyon, migren türü baş ağrıları, eklem romatizmaları, şeker hastalığı, yüksek kolesterol ve tansiyon, bazı alerji türleri ile kanser gibi bir çok hastalıktan korunmada önemli etkisi olduğu tespit edilmiştir (Gorga, 1998; Nettleton, 2000). Amerikan Kalp Birliği, kroner kalp hastası olan kişilere günde 1 g balık yağı tüketmelerini tavsiye etmiştir. ω-3 PUFA larca en zengin olan balık türleri sardalye, Atlantik uskumrusu, Pasifik ve Atlantik ringası, göl alası, salmon, Avrupa hamsisi ve lüferdir. Michigan Ulusal Balıkçılık Araştırma Kurumu balık tüketiminin güvenli olduğunu bildirmektedir. Beslenme ve sağlık faydaları düşünüldüğünde balık tüketimi için halkın bilgilendirilmesi gerekmektedir. Amerikan Sağlık Örgütü beslenme ihtiyacını karşılamak için insanların her öğünde alması gerekli olan g ω-3 PUFA ların yağ bakımından zengin olan balıklardan sağlanabileceğini belirtmiştir (Sidhu, 2003). Alzheimer; beynin iletim sisteminin yapısal olarak bozulması sonucu ortaya çıkan bunama hastalığıdır. Balık yağlarının önemli bileşeni olan DHA retina ve 15

30 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR beyin için çok önemlidir ve buradaki sinirlerde bulunan yapısal yağların %30 dan fazlasını oluşturur. Bunun için DHA disleksia ve alzheimer gibi hastalıkların tedavisinde faydalıdır. Ayrıca Maryland Alkolle Mücadele Enstitüsü nde yapılan bir araştırmada Dr. Hibbeln, balık tüketimi ile ilgili olarak 9 ülkede depresyon vakalarını incelemiş ve balık tüketimi fazla olan ülkelerde diğer ülkelere göre depresyon olaylarının çok düşük olduğunu tespit etmiştir. 20 g/gün balık tüketen Yeni Zelanda da depresyon olaylarında %5.8 oranında artma görülürken, Kore gibi günde 50 g balık tüketen ülkelerde bu oran %2.8 e düşmektedir. Japonya da ise günlük balık tüketimi kişi başına ortalama 100 g olduğu için depresyona yakalanma oranı %0.12 gibi çok düşük bir oranda görülmektedir (Conquer, 2000). Hiperaktiflik; duygusal dengesizlik, düzenli çalışma bozukluğu, dikkat süresi kısalığı, konsantrasyon zayıflığı, aşırı hareketlilik ve öğrenme güçlüğü olarak tanımlanır. Okul çağındaki çocukların %30-40 ında yaygındır. Hiperaktifliğe meditasyon veya masaj gibi aktiviteler faydalı olabilir fakat balık yağları, vitamin ve mineraller çok daha etkilidir. Okul yaşlarındaki çocukların %3-5 inde davranış bozukluğu olduğu, bunun sebeplerinin biyolojik ve çevresel faktörlerden kaynaklandığı düşünülmektedir. Önceden davranış bozukluğu bulunan 6-12 yaş grubundaki çocuklar arasında yapılan araştırmalarda, ω-3 yağ asidi seviyesi düşük olan 53 çocuğun yaklaşık %40 ında hiperaktif düzensizliğe bağlı dikkat eksikliği olduğu tespit edilmiştir (Arnold, 2001). İçerisinde yağ ve yağ asidi içeren gıdalar kan yağ düzeyini ve lipoprotein içeriğini çocuklarda yetişkinlerde olduğu gibi etkiler. Çocuklarda beslenme ile kan lipid içeriği yakından ilişkilidir. Toplam kolesterol ve kardiyovasküler hastalık riskini, çocuk yaşlarda beslenme ile ileriki yaşlarda kalp damar hastalıkları riskinin azalmasına neden olur. PUFA fazla yağ birikimi sonucu ortaya çıkan rahatsızlıkları azaltır. Çocuklarda görülen obesite, yağ miktarının ayarlanması ile kontrol altına alınabilir. MUFA içeren gıdalar %30 enerji verir, LDL-C ile HDL-C seviyesini düşürür (Nicklas ve ark., 2002). Balık yağlarının damar sertliğini önlemede ya da azaltmada etkili olduğu düşünülmektedir. Balık yağlarının ilavesi ile bypass ameliyatlarından sonra damarların tekrar kapanması önlenmiş olur. Haftada en az bir sefer balık yemek ya 16

31 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR da günde 0.5 g balık yağı tüketmek, kalp krizi geçiren hastaların hayatta kalma oranlarını %30 artırmaktadır. 3 hafta süre ile günde 8 g EPA ve DHA alacak kadar balık tüketen kişilerin kanında trigliserid ve kolesterolün azaldığı gözlenmiştir. ω-3 yağ asitleri damar sertliğini önlemekte, tansiyonu düşürmekte, kan akış hızını artırmakta ve böylece daralmış damarların beslendiği dokulara daha fazla oksijen gitmesini sağlamaktadır. Alman araştırmacılar, damar sertliği rahatsızlığı olan hastalara balık yağı ilaveli besinler verilmesiyle acılarının azaldığını kanıtlamışlardır. Yapılan bir çalışmada damar sertliği rahatsızlığı olan 162 hasta seçilmiş ve bunların yarısına 3 ay süreyle günde 6 g balık yağı verilmiş, diğer gruba ise normal diyet uygulanmıştır. 3 aydan sonra ise doz 3 grama indirilmiştir. Sonuçta kalp hastalığı olan 1. grupta ölüm vakasına rastlanmadığı ve damar sertliklerinin de büyük ölçüde azaldığı belirlenmiştir (Schacky, 2000). HIV nedeniyle olan AIDS in tedavisi konusunda halen etkin bir çözüm olmasa da yaşam süresini uzatabilen seçenekler söz konusu olabilmektedir. Esansiyel yağ asitleri ve onların metabolitlerinin bu anlamda yararlı olabildiği belirtilmektedir. Gama linolenk asit (GLA), Araşidonik asit (AA), EPA ve/veya DHA ile AIDS üzerine yapılacak çalışmaların önem taşıdığı belirtilmekte olup, diyete katkı olarak bu yağ asitlerinin kullanımının AIDS konusundaki etkisi dikkate alınması gereken bir konudur (Das, 2005). Kanser; balık yağlarının kanser hastaları üzerinde direkt tedavi edici etkisinden çok, hastalıktan korunma ve ağrıları dindirici etkisi daha yaygın olarak görülmektedir. Bunun yanında kanserli hücrelerle mücadele etmede ω-3 yağ asitlerinin büyük etkisi vardır. Yapılan çalışmalar kanda bulunan EPA ve DHA gibi balık yağlarının seviyesi ile prostat kanseri arasında bir ilişkinin olduğunu ortaya koymuştur. İsviçre de 1886 ve 1925 yılları arasında doğan 3136 erkek üzerinde çalışılmış, katılımcılara 1967 ve 1997 yılları arasındaki 30 yıllık dönemdeki genel beslenme alışkanlıkları ile ilgili sorular sorulmuştur. Bu süre boyunca 466 hasta prostat kanserine yakalanmış ve bunlardan bir kişide ölüm vakası görülmüştür. Bu insanların hiç balık yemedikleri veya çok az balık tükettikleri anlaşılmıştır. Sonuçta balık tüketmeyenlerin tüketenlere göre prostat kanserine yakalanma oranlarının 2-3 kat fazla olduğu belirlenmiştir. Yapılan çalışmalarda prostat kanseri olan insanlara 17

32 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR EPA ve DHA nın etkisinin olduğu kesin olarak kanıtlanmıştır. Gelir seviyesi düşük olan ve ilaç kullanamayan hastaların balık tüketmeleri ile prostat kanserine karşı korundukları açık olarak bulunmuştur. Balık yağlarının meme kanserinden korunmada da önemli etkisi vardır. Bu kanser türü ülkeler arasında büyük farklılık göstermektedir. İngiltere de Fransa ve İspanya dan 2 kat, Japonya da ise 5 kat daha fazla olduğu görülmektedir. Avrupa nın birçok ülkesini kapsayan geniş çaplı bir araştırmada ω-3 yağ asitleri ile beslenen kadınlarda meme kanseri olma riski önemli ölçüde azalmaktadır. Ayrıca EPA, DHA ve LA nın kansere yol açan tüm kötü huylu tümörlerin gelişimini olumlu yönde etkileri ve kanserli hastaların ağrılarının azaltılmasında balığın önemli yerinin olduğu yapılan araştırmalarda ortaya konmuştur (Norrish, 2000) Balık yağlarının kanın pıhtılaşmasına da önemli etkileri vardır. Hayvan ve insan kan hücreleri (trombositler) üzerinde yapılan klinik çalışmalar, ω-3 yağ asitlerinin pıhtılaşmayan kan hücrelerinde önemli etkisinin olduğunu göstermiştir. CHD ye etkisi olduğu bilinen ω-3 yağ asitlerinin trombositleri bir araya getirdiği ve kanın pıhtılaşmasına yardımcı olduğu tespit edilmiştir. Balık yağı ile beslenen hastalarda, kanama olduğu zaman balık yağının etkisi ölçülmüş ve aspirin gibi bir etkiye sahip olduğu anlaşılmıştır. Yüksek kolesterol içeren gıdalar ve balık ile beslenen iki ayrı grup denek üzerinde yapılan çalışmalar, balık yağı ile beslenenlerde kroner damar tıkanıklığının azaldığını, diğer grupta ise damar tıkanıklığının devam ettiğini göstermiştir. Ayrıca balık yağı ile beslenenlerde serum trombosit seviyesi azalmış, EPA seviyesi ise yükselmiştir. Yapılan başka bir çalışmada; balık yağlarının protein yağları (lipoprotein) seviyesini %14 oranında düşürdüğü tespit edilmiştir. Balık yağının CHD olan kadınlarda doku plazma faaliyetini azaltacak şekilde olumlu etkileri vardır. Damar tıkanıklığı sorunu olan 1500 hastadan oluşan 4 farklı grup üzerinde yapılan çalışmada, kanamayı durdurmada 6 faktörünün etkili olduğu bulunmuştur. Bu faktörlerden en önemlisinin de balık yağları olduğu ortaya konmuş, aynı zamanda kroner damar sertliği olan hastalarda da ω-3 PUFA nın damar yüzeylerinin esnekliğinin arttığını gözlemlemişlerdir (Thorgren ve Gustafson, 1981). Türkiye denizlerinden elde edilen ticari öneme sahip 8 balık türünde yağ içeriği ve yağ asitleri kompozisyonlarını araştıran Özoğul ve ark. (2005) bu balık 18

33 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR türlerinin etlerinin % sinin SFA, % sinin MUFA ve % sinin PUFA içerdiğini çalışmalarında belirtmişlerdir. Ayrıca EPA ve DHA değerlerinin ticari önemi büyük olan balıklarda yüksek olduğunu göstermişlerdir. Özoğul ve ark. (2006) bir başka çalışmalarında deniz balıkları ve tatlı su balıklarının yağ asit kompozisyonları açısından kıyaslamışlar ve deniz balıklarının PUFA değerlerinin tatlı su balıklarından daha yüksek olduğunu bulmuşlardır EPA ve DHA Kaynağı Olarak Balık ve Balık Yağları ω-3 yağ asitlerinin en önemlileri olan EPA ve DHA, besin zinciri yoluyla deniz ürünlerinde birikmektedir. Bu yağ asitleri ilk olarak deniz algleri tarafından sentezlenir, sonra da plankton ve diğer küçük deniz hayvanları tarafından tüketilerek onların bünyesine yerleşirler ve böylece besin zincirine katılmış olurlar (Gordon ve Ratliff, 1992). Balık ve diğer deniz ürünleri, insanların en eski besin kaynaklarından biridir. Bitkilerin ekilip yetiştirilmesi ve hayvanların besin olarak kullanımı için evcilleştirilmesinden önceki dönemlerde en kolay elde edilebilen ve bu nedenle de en çok tüketilen besinlerin balık ve diğer deniz ürünleri olduğu bilinmektedir. Bilim ve teknolojinin gelişmesine paralel olarak tarihin ilk dönemlerinde tüketilen bazı canlı türlerinin zaman içinde besin olarak tüketimi tercih edilmemişken, balık ve diğer deniz ürünleri tarihin ilk dönemlerinden günümüze kadar insanların diyetlerinde yer almıştır. Günümüzde dünya sularında den fazla yenilebilen balık, kabuklu deniz hayvanı ve memeli deniz türü yaşamaktadır. Bunların yaklaşık 250 türü insanların diyetlerinde çeşitli şekillerde yer almaktadır (Brown, 2000). Ticari olarak önemli balık yağları balina, morina, ringa, hamsi, sardalye ve menhaden türü balıklardan elde edilmektedir yılı dünya balık üretimi ton dur (FAO, 2007). Genelde balık üretiminde deniz sularının ısınması, kirlilik ve üretim tekniklerinin modernleşmesi sonucu düşme söz konusudur ve dolayısıyla balık yağı üretimi de azalmaktadır. Çizelge 2.1 de balık yağı üretiminin ülkelere göre dağılımı görülmektedir (FAO, 2007). 19

34 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Çizelge 2.1. Dünya balık yağı üretiminin ülkelere göre dağılımı (1000 ton) (FAO, 2007). Ülke Çin Japonya Şili Peru A.B.D. Norveç İzlanda Rusya Endonezya Hindistan Tayland Danimarka Türkiye Balık etinin yağ içeriği büyük çeşitlilik gösterir. Sadece balık türüne göre değil, aynı balık türü içinde mevsimsel koşullar, beslenme özellikleri, suyun tuz oranı ve diğer çeşitli faktörler balık etinin içerdiği yağ miktarını büyük ölçüde değiştirebilmektedir. Bu nedenle balıkların yağ içerikleri ile ilgili genel bir miktar belirtmek zordur. Genel olarak % 1-14 gibi geniş bir aralıkta yağ içerikleri değişebilir. Ancak balıklar aynı miktardaki sığır, domuz, koyun veya kümes hayvanlarının etleri ile karşılaştırıldığında genellikle daha az miktarda yağ içerirler ve bu nedenle de genellikle düşük yağlı besinler olarak kabul edilirler (Baysal, 2002). Balık yağı %95 veya daha fazla trigliserid, %1 kadar fosfolipid, %2-5 arasında ise kolesterol, hidrokarbonlar, yağ alkolleri ve yağda çözünen vitaminlerden oluşan sabunlaşmayan maddeleri içermektedir. 20

35 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR Balık trigliseridleri yağ asidi bileşiminin ve balık yağının balığın yakalanmadan önce tükettiği gıdalardan büyük ölçüde etkilendiği kanıtlanmıştır. Pek çok bilimsel yayında, balık yağının yağ asidi kompozisyonunun balık türü ve yaşı, coğrafik bölge, sene ve yakalanma mevsimine bağlı olarak önemli ölçüde değiştiğini ifade etmektedir. Deniz ürünlerinden elde edilen balık yağları EPA ve DHA gibi çoklu doymamış yağ asitleri bakımından en zengin kaynaktır ve bu çoklu doymamış yağ asitlerinin ω-3 ailesine ait olmasından dolayı diğer bitkisel ve hayvansal yağlara benzememektedir (FAO, 2007). Balık yağının yapısı sayısı arasında değişen, farklı zincir uzunluğunda ve 1-6 çift bağ içeren C8-C26 yağ asitlerinin çeşitli izomerlerinden oluşmaktadır. Bu yağ asitlerinin gliserid yapısındaki dağılımında da bir homojenlik bulunmamaktadır. Balık yağı yağ asitleri doymuş, tekli doymamış ve çoklu doymamış olarak üç ana sınıfa ayrılabilir: Doymuş yağ asitleri özellikle düz zincirli ve 12 ile 24 karbonlu yağ asitleri içermektedir. 16 ile 24 karbonlu zincir uzunluğundaki (n-11, n-9, n-7, n- 5) tekli doymamış yağ asitlerinin pek çok izomeri de bulunmaktadır. 18:1 ve 20:1 için ana izomer n-9 iken, 16:1 için ana izomer 16:1 (n-7) dir. 22:1 için ana izomer 22:1 (n-11) dir. Balık yağının yağ asidi kompozisyonu çok karmaşık olmasına rağmen, toplam yağ asidinin %80-85 ini 8 çeşit yağ asidi (14:0, 16:0, 16:1, 18:1, 20:1, 22:1, 20:5 n-3 ve 22:6 n-3) oluşturur. Çizelge 2.2 ye göre balık yağlarını yağ asitleri içerikleri açısından iki ana kategoriye ayırmak mümkündür. Birincisi yüksek oranda tekli doymamış yağ asitleri (20:1 ve 22:1) ve orta miktarda çoklu doymamış yağ asitleri EPA ve DHA içeren ringa balığı çeşididir. İkincisi ise çok az miktarda tekli doymamış yağ asitleri (C20:1 ve C22:1) ve çok fazla EPA ve DHA içeren hamsi, sardalya ve menhaden gibi balık türleridir. Menhaden balık yağı çok yaygın balık yağıdır. A.B.D. nin Atlantik Okyanusu nun kuzey ve güney kıyılarında ve Meksika Körfez inde yakalanmaktadır. EPA ve DHA içeriği sırasıyla %14-19 ve %5-8 aralığında değişmektedir. En yüksek miktarlar Atlantik Okyanus unun güneyinden elde edilmektedir (Sebedio, 1996). Kültür balıklarında ω-3 seviyesi biraz daha düşüktür. Fakat ω-3 yönünden zengin 21

36 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR yemlerle beslenen kültür balıklarında doymamış yağ asitleri miktarı da yüksek olmaktadır (Helme, 1996). Çizelge 2.2. Bazı balık yağı türlerinin yağ asidi bileşimleri (Sebedio, 1996). Ringa Hamsi G.Afrika Sardalya Menhaden Hamsisi Portekiz A.B.D : dallanmış 15 : 0 16 : 0 16 : 1 16 : 2 (n-7) 16 : 2 (n-4) 16 : 3 (n-4) 16 : 3 (n-3) 16 : 4 (n-4) 16 : 4 (n-1) 17 : dallanmış 17 : 0 17 : 1 18 : dallanmış 18 : 0 18 : 1 18 : 2 (n-9) 18 : 2 (n-6) 18 : 2 (n-4) 18 : 3 (n-6) 18 : 3 (n-3) 18 : 4 (n-3)

37 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 19 : : : : 2 (n-9) : 2 (n-6) : 3 (n-3) : 4 (n-3) : 5 (n-3) : : : 4 (n-3) : 5 (n-3) : 6 (n-3) : : İyot indisi Balık Yağının Elde Edilmesi Balık yağları genel olarak balığın tüm vücut kısımlarından elde edilse de kemiklerindeki iliklerden elde edilen balık yağları da vardır. Balık yağı, balıktaki yağlı kısımların kaynatılması veya buharla pişirilmesi ile elde edilir. Kaynatma süresi ve sıcaklığı, yağı çıkarılacak parçanın büyüklüğüne ve balığın cinsine göre değişir. Kaynatma sırasında, hafif olan yağ üstte toplanır. Balina ve yunus balıklarında tabaka halinde bulunan yağ dokusunun işlenebilmesi için C kaynama sıcaklığına ihtiyaç bulunmaktadır (Pigott, 1995; Aksungur, 2007). Ayrıca balık yağları, balık unu yapımında yan ürün olarak da elde edilebilir. Balık unu presleme işlemi sırasında pres kek ve pres sıvısı olmak üzere başlıca iki ürün ortaya çıkar. Pişirilen balıklardan çıkan pres sıvısında, öncelikle içinden ayrılması gereken büyük partiküller halinde balık ve kemik parçaları vardır. Bu parçaların ayrılmasında vibrasyonlu elekler kullanılır. Bu işlemden sonra pres sıvısı 23

38 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR üç ayırma (seperasyon) işlemine tabi tutulur. Dekantörler ile pres sıvısı içinde kalan katı kısımların ayrılması, seperatörler ile pres sıvısı içindeki yağın ayrılması ve son aşama olan saflaştırma işleminde depolamadan önce yağın içinde kalan iz miktardaki nemin ve yabancı maddelerin yok edilmesi sağlanmış olur. (AOAC, 1990; Korkut ve ark., 2004; Korkut ve ark., 2007) Esansiyel Yağ Asitlerinin Elde Edilmesi İçin Uygulanan Yöntemler Çoklu doymamış yağ asitleri olan alfa-linoleik asit (ALA), eikosapentaenoik asit (EPA), dokosaheksaenoik asit (DHA) ve gamma-linoleik asit (GLA) in gıda ve farmasötik alanda kullanımına olan son yıllardaki talep artışı, bu asitlerce zengin ürünlerin eldesi üzerindeki çalışmaları da hızlandırmıştır. Literatürde, çoklu doymamış yağ asitlerinin konsantre olarak elde edilmesi üzerine çok sayıda yöntemin önerildiği ve uygulandığı görülmektedir. Çalışmalarda yer alan yöntemlerden kromatografik yöntemler, distilasyon yöntemleri, düşük sıcaklık fraksiyonlu kristalizasyon yöntemi, süperkritik CO 2 ekstraksiyon yöntemi, enzimatik hidroliz ve esterleşme yöntemi ile üre fraksiyonlama yöntemi hakkında aşağıda kısa açıklamalarda bulunulmuştur Kromatografik Yöntemler Kromatografik ayırma yöntemlerinde önce yağ asitleri silika, alümina gibi adsorblama kabiliyeti yüksek maddeler üzerinde adsorbe edilir. Genellikle adsorban maddeler bir kolon içerisine doldurulmuş haldedir (kolon kromatografisi). Adsorban üzerine adsorbe olmuş yağ asitleri daha sonra sulu aseton veya metanol ile sistemden elüye edilir. Adsorplanma farklılığına bağlı olarak yağ asitlerinin birbirlerinden ayrılması sağlanır. Gümüş iyonu kromatografisinde ise kolona gümüş nitrat ile emprenye edilmiş silika adsorban olarak kullanılır. Doymamış yağ asitleri gümüş iyonları ile kompleks oluşturur. Kompleks oluşumu çift bağ sayısına ve molekülün zincir uzunluğuna göre değişim gösterdiğinden yağ asitlerinin birbirlerinden 24

39 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR ayrılması ve dolayısıyla saflaştırılması gerçekleştirilebilir (Anonim, 2008a; Anonim, 2008b) Distilasyon Yöntemleri Bu yöntemlerde genellikle yağ asitleri metil esterleri haline dönüştürüldükten sonra 0,2-0,5 mmhg basıncında 250 ºC civarında vakum distilasyonuna tabi tutularak fraksiyonlanır. Bu çalışma koşullarında doymamışlık derecesi yüksek olan yağ asitlerinin termal polimerizasyonunun önüne geçmek zordur. Serbest yağ asitlerinin oksidasyonu da gerçekleşebilir (Anonim, 2008b) Düşük Sıcaklık Fraksiyonlu Kristalizasyon Yöntemi Triaçilgliserollerin ve yağ asitlerinin moleküler yapılarına bağlı olarak çözücülerdeki çözünürlükleri farklıdır. Bu yöntemde genellikle asetonlu ortamda -25 ve -40 ºC da yağ veya yağ asitleri fraksiyonlu kristalizasyona tabi tutulur. Çözücüsüz ortamda da triaçilgliserollerin düşük sıcaklıklarda fraksiyonlanması mümkün olabilmektedir. Endüstriyel olarak palm yağından palmitik asitçe zengin palm stearin ve oleik asitçe zengin palm olein ürünleri bu yolla elde edilmektedir. Yöntem özel soğutma ünitelerine gereksinim duymaktadır ve özellikle düşük sıcaklıklarda hızlı bir şekilde kristallerin süzülmesi gerekmektedir (Timms, 2005) Süperkritik CO 2 Ekstraksiyon Yöntemi Karbon dioksidin kritik sıcaklığının 31 ºC olması dolayısiyle ekstraksiyon işleminin 35 ºC gibi oldukça düşük sıcaklıklarda gerçekleştirilebilmesi bu yöntemin sıcaklığa hassas maddeler için kullanılmasında tercih sebebi yapmaktadır. 200 bar basıncında CO 2 in yoğunluğu hekzanın yoğunluğuna da oldukça yakındır. Bu yüzden hekzan gibi non-polar çözücü özelliği gösterir. Ancak kritik koşullarda triaçilgliserollerin CO 2 deki çözünürlüğü çok düşük olduğundan yağların çoklu doymamış yağ asitlerince zenginleştirilmesi için uygun olamamaktadır. Superkritik 25

40 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR CO 2 ekstraksiyonda yağ asitlerinin doymamışlık derecesinden bağımsız olarak sadece karbon sayısına göre fraksiyonlanabilir olması da direkt olarak yağ asitleri ile çalışmayı engellemektedir. Yağ asitlerinin metil esterlerinin ise bu yöntemle fraksiyonlanması, çoklu doymamış yağ asitlerince konsantre ürünler elde edilebilmesi mümkün olabilmektedir. Bu yöntem henüz pahalı bir yöntem olarak görülmekte ise de yöntemin endüstriyel uygulanabilirliğinin arttırılmasına dönük çalışmalara devam edilmektedir (Anonim, 2008a) Enzimatik Yöntemler İle Zenginleştirme Lipaz enzimleri (E.C ) doğal olarak su-yağ fazı arasındaki iç yüzeyde triaçilgliserolleri diaçilgliserollere, monoaçilgliserollere, gliserol ve serbest yağ asitlerine hidroliz eder. Su ile karışmayan organik çözücülerde ise lipid substratlarının esterifikasyon ve transesterifikasyon reaksiyonlarını katalizlerler. Lipazlar bitki ve hayvanların çeşitli dokularından, küf, maya ve bakteri gibi mikroorganizmaların kullanıldığı fermantasyon prosesleri sayesinde üretilebilmektedir. Mikroorganizma kaynaklı lipazlar kolay, ekonomik ve ayrıca sanayi boyutlarında kullanılabilecek miktarlarda elde edilebilmektedir ve endüstride çok çeşitli uygulama alanlarına sahiptir (Sharma ve ark., 2001; Kuo ve ark., 2002) Üre Fraksiyonlama Yöntemi Üre fraksiyonlama yöntemi 1940 senesinden beri yağ asitlerinin, esterlerinin, alkollerinin ve diğer türevlerinin birbirlerinden, yağlardan ve diğer katılma yapmayan maddelerden ayrılması için geliştirilmiş klasik bir yöntemdir. Burada karbon zincir uzunluğu, moleküldeki doymamışlığın varlığı ve derecesi önemlidir. İyi bir teknikle oluşturulan üre katılım bileşiği yönteminde doymuş yağ asitleri ve tekli doymamış yağ asitleri kolaylıkla elimine edilir. Basit, çabuk ucuz olan bu yöntemin esası ürenin, düz zincirli bileşikler ile kristal yapıda katılım ürünleri vermesi ve bu ürünlerin ortamdan kolaylıkla ayrılmasına dayanır. 26

41 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR 2.5. Balık Yağından Yağ Asitlerinin İzolasyonu İle İlgili Yapılan Çalışmalar Literatürde balık yağlarından konsantre EPA ve DHA elde etmek için pek çok yöntem önerilmiş ve uygulanmıştır. Kromatografik yöntemlerle EPA ve DHA nın konsantre edilmesi üzerine yapılmış çalışmalara örnek olarak Wilson ve arkadaşlarının yaptığı balık yağ asitlerini gümüş iyonu kullanarak ve aminopropil ile modifiye edilmiş silika jel kolon kromatografisi ile zenginleştirmiştir (Wilson ve ark., 1993). Abe ve Tanaka (1984) ise moleküler elek dolgu kolonu kullanarak sardalya yağı yağ asitleri etil esterlerinden %84.5 etil EPA içeren fraksiyon elde etmiştir. Bu çalışmalardan da görüldüğü üzere, kromatografik yöntemlerle yüksek saflıkta EPA ve DHA içeren ürünler elde edilebilmektedir. Nieto ve ark. (1997) yaptığı çalışmada sardalya balığı yağından gümüş reçine kolon kromatografisi tekniği ile EPA ve DHA nın saf fraksiyonlarını elde etmişlerdir. Çalışmalarında Amberlite IR-118H ve Dowex 50 W-HCR-W2 isimli iki tip gümüş bağlanmış reçineler kullanılarak kolon üretmişlerdir. Amberlite-gümüş kolonu EPA nın % 98.5 oranında saf olarak ayrılmasını sağlarken diğer çoklu doymamış yağ asitlerinden DHA yı ayıramamaktadır. Dowex-gümüş kolonu ise Amberlite-gümüş kolonun aksine DHA yı hayli saf halde ayırırken EPA yı ayıramamaktadır. Yapılan bu optimize çalışmaları ile önemli olan iki ω-3 yağ asidi oldukça saf oranda beslenme ve farmakolojik araştırmalarda kullanılmak üzere elde edilebilmiştir. Literatürde, balık yağı yağ asitlerinden EPA ve DHA nın zenginleştirilmesi için düşük sıcaklık kristalizasyonunun olumlu sonuç verdiği belirtilmektedir. Ringa balık yağı, yağ asitlerinin asetonitrildeki çözeltisinin -40 o C da 24 saat bekletilmesi sonucunda ele geçen filtratta EPA, DHA ve toplam ω-3 çoklu doymamış yağ asitlerinin % 28.94, % ve % 60.9 yükseldiği tespit edilmiştir (Chen ve Ju, 2002). Distilasyon ile zenginleştirme üzerine yapılmış bir çalışmada, balık yağı metil esterlerinin 250 o C ve mm Hg basıncında vakum distilasyonu ile EPA ve 27

42 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR DHA ca zengin fraksiyonlar elde edilebilmiştir. Fakat bu sıcaklıkta çoklu doymamış yağ asitlerinin termal polimerizasyonu önlenememiştir (Mishra, 1993). Süperkritik CO 2 ekstraksiyon yönteminin poli-doymamış yağ asitlerinin konsantre edilmesinde kullanımı üzerinde yapılmış bir çalışmada, Nilson ve ark. (1988), ringa balık yağı etil esterlerinden mpa basınç aralığında ve o C sıcaklık intervalinde %70 EPA ve %80 DHA içeren bir ürün elde etmişlerdir. Jachmanian ve ark. (2007) ise barlam balığı yağının etil esterlerini MPa basınçta ve o C da süperkritik CO 2 ile ekstrakte etmişler ve içerisinde % 55 DHA bulunan ekstrakt elde etmişlerdir. Son yıllarda enzimatik hidroliz ve esterleşme reaksiyonu ile balık yağlarından EPA ve DHA ca zengin ürünlerin eldesi üzerinde yoğun çalışmalar sürdürülmektedir (Wanasundara ve Shahidi, 1998; Robles ve ark., 1998; Üstün ve ark., 1997; Okada ve Morrissey, 2007; Lyberg ve Adlercreutz, 2008). Okada ve Morrissey (2007), içerisinde % EPA ve % DHA bulunan pasifik sardalya balık yağından çoklu doymamış yağ asitlerinin zenginleştirilmesinde hidroliz reaksiyonunu kullanmışlar ve Candida rugosa, Candida cylindracea, Mucor javanicus ve Aspergillus niger lipaz enzimlerinin zenginleşme üzerindeki etkinliğini incelemişlerdir. En iyi sonuçları Candida rugosa lipazı ile almışlardır. 250 ünite bu enzim ile 1.5 saat sonunda hidroliz ürününde EPA % değerine yükselmiştir. 500 ünite enzim ile çalışmada ise 9 saat sonunda ürünün DHA % değerine ulaşmıştır. İçeriğinde mol yüzdesi olarak % 19 DHA ve % 12 EPA bulunan mürekkep balığı yağından etanoliz reaksiyonu ile EPA ve DHA ca zengin ürün eldesinde ise Thermomyces lanuginosus, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens ve Rhizomucor miehei lipazları denenmiştir. Thermomyces lanuginosus ile ürün olarak mono ve diaçilgliserollerden ibaret olan karışım elde edilmiştir. Bu karışımda mol yüzdesi olarak % 34 DHA ve % 17 EPA bulunduğu belirlenmiştir (Lyberg ve Adlercreutz, 2008). Schmitt-Rozieres ve ark. (2000) tarafından yapılan diğer bir çalışmada sardalya balığı konservesi hazırlayan bir tesisten temin edilen atık çözeltiden selektif esterleşme yolu ile EPA ve DHA kazanımı üzerinde çalışmalar yapılmıştır. Esterifikasyon işleminde 1-butanol ile Lipozim IM 60 ve immobilize Candida rugosa lipaz enzimleri kullanılmıştır. Lipozim ile EPA 28

43 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR zenginleşmesi olmamış ama DHA konsantrasyonu % 80 lere yükseltilebilmiştir. C. rugosa ile %30 EPA zenginleştirilmesi sağlanabilmiştir. Üre fraksiyonlama yöntemi ile balık yağlarından EPA ve DHA nın konsantre edilmesi ile ilgili literatürde yer alan ilk çalışmada, sardalya yağı yağ asitleri üre ile metanollü ortamda muamele edilmiş ve yağ asitleri iyot indisleri 30,56 ile 304,9 arasında değişen 8 fraksiyona ayrılmıştır (Revankar, 1974). Wille ve ark. (1987) yürüttüğü çalışmada, sardalya yağı yağ asitlerinden (%30 EPA ve DHA) üre ile doymuş ve mono-doymamış yağ asitleri uzaklaştırılmış ve geriye kalan fraksiyonda EPA ve DHA yüzdesi %90 a ulaşmıştır Doymamış Yağ Asitlerinin Biyodönüşümü İle İlgili Yapılan Çalışmalar Doymamış yağ asitlerinin mikrobiyal dönüşümü, katma değerli yeni hidroksi ürünlere dönüşümlerinden dolayı geniş çapta incelenmektedir (Hou, 1995). Doymamış yağ asitleri arasında oleik asit, linoleik asit ve linolenik asit substrat olarak kullanılmak üzere hidroksi yağ asitlerinin mono-,di- ve trihidroksi yağ asitlerine dönüşümü için çok çalışılmıştır. Endüstriyel uygulamalar için çeşitli katma değeri yüksek hidroksi yağ asitleri ve onların türevleri mikrobiyal enzimlere ait spesifik reaksiyon gösterme özelliklerine göre üretilebilir. Clavibacter sp. ALA2 suşu ile 15, 18-dihydroxy-14, 17-epoxy-5(Z), 8(Z),11(Z)-eicosatrienoic acid ve 17, 20-dihydroxy-16, 19-epoxy-4(Z), 7(Z), 10(Z), 13(Z)-docosatetraenoic acid e dönüştürülmüştür (Hosokawa ve ark., 2003). Pseudomonas aeroginosa PR3 suşu tarafından gerçekleştirilen biyodönüşüm reaksiyonları doymamış yağ asitlerinden türetilerek üretilen mono-,di- ve trihidroksi yağ asitleri elde etmede mikrobiyal sistemler arasında geniş çapta incelenmiştir (Hou ve Bagby, 1991; Kuo ve ark., 1998, 2001; Kim ve ark., 2000). ABD de atık su deresinden izole edilen PR3 suşu, oleik asiti yeni bir bileşik olan 7,10-dihydroxy-8(E)-octadecenoic acid (DOD) (Hou ve Bagby, 1991), ve ricinoleik asiti yeni bir bileşik olan 7,10,12-trihydroxy-8(E)- octadecenoic acid (TOD) a dönüştürmüştür (Kuo ve ark., 1998). Eikosapentaenoik asit (EPA) ve dokosaheksaenoik asit (DHA) hayvansal dokularda bulunan (özellikle balık ve kabuklu su ürünleri) fakat bitkisel dokularda 29

44 2.ÖNCEKİ ÇALIŞMALAR bulunmayan yağ asitleridir (18:3 ω-3). DHA, hayvanlardaki sinir sistemi nonmiyelin membranlarının ve retinanın bazı fosfolipid bileşenleri içerisinde oldukça fazla oranda bulunan membran yapısal lipidlerin bir komponentidir. EPA ise thrombozis, arrhythmias ve kroner kalp hastalıklarının korunmasında faydalı etkilerinin olduğu bilinen ω-3 eikosanoidlerin bir prekürsörüdür (Kinsella ve ark., 1990). EPA ve DHA nın mikrobiyal biyodönüşümleri Hosokawa ve ark. (2003) tarafından bildirilmesine rağmen biyodönüşümü gerçekleşen ürünlerin antimikrobiyal aktiviteleri şimdiye kadar nadiren incelenmiştir. Birçok çalışmada hidroksi yağ asitlerinin anti-fungal aktiviteye sahip olduğu rapor edilmiştir (Kato ve ark., 1984; Masui ve ark., 1989; Hou ve Forman, 2000). P. aeroginosa PR3 suşu tarafından elde edilen biyodönüşümü gerçekleşmiş EPA (bepa) nın in vivo ve in vitro anti-fungal potansiyele sahip olduğu incelenmiştir. PR3 suşu tarafından dönüştürülen oleik asit ürünü olan 7,10-dihydroxy-8(E)- octadecenoic acid (DOD), zaman zaman insanlarda tahriş ve diğer enfeksiyonlara yol açan bir mantar olan Candida albicans ın büyümesini inhibe ettiği gözlenmiştir (Hou ve Bagby, 1991). Bu suş ricinoleik asiti diğer bir bileşik olan 7,10,12-trihydroxy- 8(E)-octadecenoic acid (TOD) a dönüştürmekte ve bu bileşikte pirinç tahribatına neden olan mantarı inhibe etmektedir. Buda bu bileşiklerin bu tür patojenlere karşı biyolojik fungusit olarak kullanımının artmasına neden olmaktadır (Kuo ve ark., 2001). Son zamanlarda tanımlanan doymamış yağ asitlerinin mikrobiyal dönüşümlerinden elde edilen bu bileşikler, böylesi patojenleri inhibe edecek potansiyel katma değeri yüksek ürünlerdir. Bir kaç hidroksi yağ asitlerininde ayrıca kanser hücrelerine karşı sitotoksik aktiviteye sahip olduğu bildirilmiştir (Kawagishi ve ark., 1990; Stadler ve ark., 1994). Son zamanlarda mikroorganizmalar tarafından dönüştürülen hidroksi yağ asitlerinin üretimi araştırmaların bu alana odaklanmasına yol açmıştır (Hou, 1995; Hou ve Hosokawa, 2005). 30

45 3.MATERYAL VE METOD 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal Çalışmada Kullanılan Balık Yağı Bu çalışmada kullanılan alabalık yağı Kardelen Tarım Ürünleri Ltd. Şirketi nden temin edilmiştir. Çalışmalarda kullanılan kimyasallar Merck (Darmstadt, Almanya ) ve Sigma firmalarındandan temin edilmiş ürünlerdir (Resim 3.1). Resim 3.1. Çalışmada kullanılan alabalık yağı Mikroorganizmalar Gıda Kaynaklı Patojen Bakteriler Çalışmada kullanılan Staphylococcus aureus ATCC29213, Escherichia coli ATCC25922, Klebsiella pneumoniae ATCC700603, Enterococus faecalis 31

46 3.MATERYAL VE METOD ATCC29212, Pseudomonas aeruginosa ATCC27853 ve Listeria monocytogenes ATCC7677 American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) dan sağlanmıştır. Aeromonas hydrophila NCIMB 1135 ve Salmonella parathypi A NCTC13 sırasıyla NCIMB (National Collections of Industrial Food and Marine Bacteria, Aberdeen, UK ) ve NCTC (National Collection of Type Cultures, London, UK) den temin edilmiştir. Araştırmada bakterileri geliştirmek amacıyla Nutrient Broth kullanılmıştır Biyodönüşüm Bakterisi Substrat olarak kullanılan yüksek saflıktaki EPA ve DHA yağ asitleri elde edildikten sonra biyodönüşümü yapacak olan ve yurt dışından temin edilen standart Pseudomonas aeroginosa PR3 suşu, litrede 4 g dextros, 2 g K 2 HPO 4, 2 g (NH 4 ) 2 HPO 4, 1 g NH 4 NO 3, 0.5 g maya ekstraktı, g ZnSO 4, 0.01 g FeSO 4 7H 2 O ve 0.01 g MnSO 4 7H 2 O içeren besiyerinde 200 rpm de aerobic koşullarda geliştirilmiştir Metot Kromatografik Koşullar Alabalık yağındaki yağ asitlerinin alıkonma zamanı ve saflaştırılması için analitik ve preparatif olmak üzere iki farklı tipte kolon kullanılmıştır. Alabalık yağındaki yağ asitlerinin analizi için mobil faz, etanol (Eluent A) ve ultra saf su (Eluent B) olmuştur. Toplam yağ asitlerinin ayırım süresi 20 dakika olmuştur (Çizelge 3.1). Ayırım işlemi gerçekleştikten sonra başlangıç koşula dönmek için program 1 dakika almaktadır. Enjeksiyon seviyesi ayırma işlemi için kullanılan analitik kolon için 5 µl, saflaştırma işlemi için kullanılan preparatif kolon için ise 2 ml olup, 254 nm de tespit gerçekleşmiştir (Nieto, 2007). 32

47 3.MATERYAL VE METOD Çizelge 3.1. Kullanılan HPLC gradient profili Mobil faz kompozisyonu (%) Süre (dk) Eluent A a (Ethanol) Eluent B b (Ultra Saf Su) Analitik Kolon Akış Oranı Preparatif Kolon Akış Oranı ml/dk (%) (%) ml/dk Ekipman ve Kolon Yağ asitlerinin saflaştırılma işlemi için bir SPD-M20A diode array dedektör, iki kanallı gradient pompa (Shimadzu LC-10AT), autosampler (SIL 20AC), kolon fırını (CTO-20AC), FCV-11AL dalga birimli communication bus module (CBM- 20A) sahip Shimadzu Prominence HPLC cihazı (Shimadzu, Kyoto, Japan) kullanılmıştır (Resim 3.2). EPA ve DHA nın eldesi için GL Science marka SIL-100 A 5um 250x4.6mm analitik kolon ile GL Science marka SIL-100 A 5um 250x7.6mm ebatında preparative kolonlar (Resim 3.3) kullanılarak optimize edilmiştir (Şekil 3.1). Bu işlemler gerçekleştirildiğinde cihaz koşulları şu şekilde olmuştur: Taşıyıcı Faz :Ethanol/Saf su Akış Oranı : 1.2 ve 2.0 ml/dakika Basınç : 2.3 MPa Kolon Sıcaklığı : 40 o C Kullanılan Ultraviyole Dedektörünün Dalga Boyu : 254 nm Enjeksiyon Loop : 2 ml 33

48 3.MATERYAL VE METOD Resim 3.2. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC) cihazı. Resim 3.3. Kullanılan HPLC kolonları (analitik kolon, preparatif kolon). Her grup yağ örneği HPLC cihazı için özel tüplere (2 ml lik vial tüplerine) konduktan sonra cihazın autosampler kısmına yerleştirilip enjeksiyon yapması için analize hazır hale getirilmiştir (Resim 3.4). Resim 3.4. HPLC autosampleri ve örneklerin viallere konulması. 34

49 3.MATERYAL VE METOD Örnekler taşıyıcı fazlar ile (ethanol/ultra saf su) autosamplerden yüksek basınç altında kolonlara enjekte edilip dedektör aracılığı ile 20 dakikalık analiz süresi içerisinde istenilen yağ asitlerinin alıkonma zamanları (retention time) tespit edilmiştir (Resim 3.5). Resim 3.5. Kullanılan mobil fazlar ve kolon fırını. Şekil 3.1. Kolon kromatografisi sistemi şeması Yağ Asitleri Analizi Materyal olarak kullanılan alabalık yağı ve HPLC cihazından saflaştırılan izolatların yağ asidi metil esterleri Ichibara ve ark. (1996) metoduna göre yapılmıştır. 100 µl örnek üzerine 4ml 2M lık KOH ve 2ml n-heptan ilave edilmiştir. Daha sonra 35

50 3.MATERYAL VE METOD oda sıcaklığında 2 dakika vortekste karıştırılmış ve 4000 rpm de 10 dakika süreyle santrifüj edilmiş ve heptan tabakası GC ye enjekte edilerek yapılmıştır (Resim 3.6). Resim 3.6. Gaz kromatografisi genel görünümü Yağ asitleri kompozisyonu alev iyonizasyon dedektörlü (FID) ve 30m x 0.32mm ID x 0.25μm film kalınlığında SGE kolonlu otomatik örneklemeli (Perkin Emler, USA) GC (Gaz kromatografisi) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Enjektör ve detektör sıcaklıkları sırasıyla önce 220 C sonra 280 C ye ayarlanmıştır. Bu esnada fırın sıcaklığı 5 dakikada 140 C de tutulmuştur. Sonrasında 200 C ye kadar, her dakika 4 C arttırılarak, 200 C den 220 ye de her dakika 1 C arttırılarak getirilmiştir. Örnek miktarı 1ml olup, taşıyıcı gazı kontrolü 16 ps de olması sağlanmıştır. Split uygulaması 1:50 oranında gerçekleştirilmiştir (Çizelge 3.2). Yağ asitleri standart 37 bileşenden oluşan FAME karışımının gelme zamanlarına bağlı olarak karşılaştırılmasıyla tanımlanmıştır. Aynı şekilde yapılan iki paralel GC analiz sonuçları ± standart sapma değerleri ile % olarak ifade edilmiştir (Ichibara ve ark. 1996). 36

51 3.MATERYAL VE METOD Çizelge 3.2. Gaz kromotografisi koşulları Cihaz Perkin Elmer Clarus 500(GC) Kolon SGE kolunu(30 m. 0,32mm ID.BPX20 0,25um, USA) Kolon Sıcaklığı 140 o C de 5 dk, 4 o C/dk artışla 200 o C ye, 1 o C/dk artışla 220 o C ye getirilerek sonlandırıldı. Enjeksiyon Sıcaklığı 220 o C Taşıyıcı Gaz 16psi Split Oranı 1:100 Dedektör Alev iyonizasyon dedektörü (FID) Dedektör Sıcaklığı 280 ºC Örnek Miktarı 2µl Gaz Kromatografisi/Kütle Spektrometresi Analizleri Biyodönüşüm reaksiyonu sonunda elde edilen bepa ve bdha ürünlerinin tespiti için Gaz Kromatografisi-Kütle Spektrometresi (GC-MS) cihazı kullanılmıştır (Resim 3.7). 100 µl ekstrakt örneği içerisine 1 ml n-hekzan eklenerek vortekste karıştırılmıştır. Bu örnekler sonrasında enjektörle 1μl alınarak GC-MS e enjekte edilmiştir. Araştırmada kullanılan GC-MS koşulları Çizelge 3.3 te verilmiştir. Çizelge 3.3. Gaz kromotografisi-kütle spektrometre koşulları Cihaz Perkin Elmer Clarus 500(GC-MS) Kolon Kolon Sıcaklığı Enjeksiyon Sıcaklığı 240 o C Taşıyıcı Gaz Split Oranı 0 Elektron Enerjisi Kütle Aralığı SGE kolunu (60 m. 0,25mm ID. BPX5 0,25um, USA) 60 o C de 10 dk, 4 o C/dk artışla 220 o C ye, 220 o C de 10 dk beklenir. 4 o C/dk artışla 250 o C ye, 250 o C de 10 dk beklenir. Helyum (1,5 ml/dk) 70eV m/z Tarama Kütüphanesi Nist ve Wiley 37

52 3.MATERYAL VE METOD Resim 3.7. Gaz kromotografisi-kütle spektrometresi (GC-MS) genel görünümü Biyodönüşüm Reaksiyonu EPA ve DHA nın biyodönüşümü Shin va ark. (2006) nın metoduna göre yapılmıştır. Biyodönüşüm reaksiyonu litresinde 4 g dextrose, 2 g K 2 HPO 4, 2 g (NH 4 ) 2 HPO 4, 1 g NH 4 NO 3, 0.5 g maya ekstraktı, g ZnSO 4, 0.01 g FeSO 4 7H 2 O ve 0.01 g MnSO 4 7H 2 O komponentlerini içeren 50 ml SM ortamında gerçekleştirilmiştir. Substrat olarak kullanılan her 0.5 g EPA ve DHA 24 saatlik kültürlere inkübasyon devam ederken sürekli karıştırma yapılarak eklenmiş ve 200 rpm devirde çalışan sıcaklık kontrollü shaker (Psycro Therm) ile 72 saat boyunca inkübasyonun devam ettirilmesi sağlanmıştır. Bu şekilde biyodönüşümün sağlanması için gerekli ortam hazırlanmıştır. Dönüşüm süresinin sonunda kültür sıvısı 6 N HCl ile ph 2.0 a asidifiye edilmiştir ve eşit hacimde acetate/diethyl ether (1:1) ile iki kez ekstrakte edilmiştir. Solvent daha sonra rotary evaporator ile uçurulmuş ve ham lipid ekstraktı %95 verim ile ortamdan geri kazanılmıştır. 38

53 3.MATERYAL VE METOD Patojen Bakteriyel Kültürlerin Geliştirilmesi Gıda kaynaklı patojen bakteriler Nutrient broth da 37 C de 24 saat inkübe edilerek hazırlanmıştır (Resim 3.8). Kültürler daha sonra taze serum fizyolojik su ortamında seyreltilerek her bir test organizması için optik dansitenin 10 5 kob/ml olacağı yoğunluğa ayarlanmıştır. Resim 3.8. Patojen bakterilerin nutrient broth içerisinde 24 saat inkübasyon sonunda gelişimi Yağ Asitlerinin Biyodönüşümü Sonucu Elde Edilen Ekstraktların Patojenler Bakteriler Üzerindeki Antimikrobiyal Etkilerinin Belirlenmesi Disk Difüzyon Yöntemi Antibakteriyel test disk difüzyon metodu kullanılarak gerçekleştirilmiştir (Murray et al., 1995). Yöntemin esası, 10 5 kob/ml bakteri içeren 10 ml süspansiyon 39

54 3.MATERYAL VE METOD Muller hinton agar yüzeyine yayma metodu kullanılarak gerçekleştirilmiştir. 6 mm çapındaki disklere 1.5 ml (1500 μg ham lipid ekstraktı) bepa ve bdha emdirilmiş ve agarın tam ortasına gelecek şekilde yerleştirilerek 37 C de 24 saat inkübasyona bırakılmştır. Antibakteriyel aktivite test mikroorganizmalarının yapmış olduğu inhibisyon büyüme zonlarının çapları ölçülerek değerlendirilmiştir. Bu çalışmada EPA ve DHA için yapılan her bir deney üç tekrarlı gerçekleştirilmiştir. Negatif kontrolde ise substrat olarak biyodönüşüm reaksiyonuna tabi tutulmayan EPA ve DHA kullanılmıştır Minimum İnhibisyon Konsantrasyonunun Belirlenmesi (MIK) bepa ve bdha nın ham lipid ekstraktlarının minimum inhibitor konsantrasyonu dilüsyon metodu kullanılarak test edilmiştir (Murray et al., 1995). LB eğik katı besi yeri ortamından alınan bakteriyel kültür, bir öze hacminde alınarak Luria broth içerisine inokule edilmiş ve 37 C de 24 saat inkübe edilmiştir. Daha sonra 2 katmanlı dilüsyon metodu aşagıdaki sırayla uygulanmıştır. Ham ekstrakt önce 5% dimethyl sulfoxide (DMSO) içerisinde çözdürülmüştür. Daha sonra LB içerisine son konsantrasyonlar 0, 125, 250, 350, 500, 650, 800, 1000, 2000, 3000, 4000, 5000 μg/ml olacak şekilde eklenmiştir. Test suşlarının bakteriyel süspansiyonları 25 ml test tüpleri içerisindeki LB ortamına inokule edilmiş ve 24 saat 37 C de inkübasyona bırakılmıştır. Hiçbir şekilde gözle görülebilir büyümenin olmadığı gözlemlenen tüp, minimum konsantrasyon (MIK) olarak tanımlanmıştır ve μg/ml olarak ifade edilmiştir. MIK belirlemek için tüm testler üç tekerrürlü olarak yapılmıştır İstatistik Analiz Araştırmanın sonunda elde edilen veriler SPSS 13.0 paket programı kullanılarak değerlendirilmiştir. Araştırmada üç tekerrürlü olarak elde edilen verilerin standart sapma ve ortalamaları hesaplanmıştır. 40

55 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Çalışmamızın giriş bölümünde detaylı açıklandığı üzere, EPA ve DHA insan sağlığı açısından önemli çoklu doymamış yağ asitlerindendir. Bu çalışmada, EPA ve DHA kaynağı olarak alabalık yağı seçilmiştir. Bu yağlardan çoklu doymamış yağ asitlerinin eldesi HPLC yöntemi ile yapılmıştır. Çalışmamızın birinci bölümünde, alabalık yağının yağ asitleri içeriği belirlenmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde, alabalık yağ asitlerinden EPA ve DHA ca zengin ürünler elde etmek amacıyla, alabalık yağ asitleri etanol içeren ortamda yüksek basınç altında kolon kromatografisi tekniğiyle ayırma işlemine tabi tutulmuştur. Deneylerin sonunda elde edilen ürünler tekrardan yağ asitleri bileşim analizine tabi tutulmuş ve alabalık yağından çoklu doymamış yağ asitlerince konsantre ürünler eldesi koşulları optimize edilmiştir. Çalışmanın üçüncü ve dördüncü bölümünde sırasıyla elde edilen bu konsantre ürünler mikrobiyal ortamda biyo-dönüşüm reaksiyonuna tabi tutulmuş, daha sonra elde edilen yeni dönüşüm ürünlerinin GC-MS te tespiti gerçekleştirilmiştir. Daha sonra verim analizi yapılan bu ürünler in-vitro ortamda antibakteriyel teste tabi tutulmuş ve MIK belirlenerek alternatif antimikrobiyal ajanların üretimine katkı sağlayacağı kanaatine varılmıştır. Aşağıdaki bu bölümlerde yürütülen çalışmalara ait veriler ve sonuçlar açıklanmıştır Yağ Asitleri Bileşimleri Çalışmada kullanılan alabalık yağlarının yağ asitleri bileşimleri bölüm de verilen koşullara göre gaz kromatografisi ile belirlenmiştir. Çalışmada kullanılan standart yağ asitleri kromotogramı Ek 1 de verilmiştir. Ek 2, çalışmada kullanılan alabalık yağına ait yağ asitleri kromotogramını göstermektedir. Alabalık yağının yağ asitleri bileşimi Çizelge 4.1 de verilmiştir. Alabalık yağında en yüksek düzeyde bulunan yağ asitleri sırasıyla palmitik asit (%21.2), oleik asit (%17.4), DHA ve EPA olmuştur. Alabalık yağı %11.1 oranında EPA ve 15.9 oranında DHA 41

56 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA içermiştir. Alabalık yağındaki toplam doymuş yağ asitleri (SFA) oranı %33.7 olarak bulunmuştur. Tekli doymamış yağ asitlerinin oranı (MUFA) %31.5 ve çoklu doymamış yağ asitlerinin oranı ise %34.8 olarak bulunmuştur. HMSO (1994) insan besini olarak minimum PUFA/SFA oranını 0.45 olarak önermiştir. Bu araştırmada en düşük PUFA/SFA oranı 1.03 olmuştur. Çizelge 4.1. Araştırmada kullanılan alabalık yağının yağ asitleri bileşimi Yağ Asidi Adı Yağ Asidi Karbon Sayısı % Ortalama ± Std Miristik asit 14:0 7.6 ± 0.55 Palmitoleik asit 16: ± 0.80 Palmitik asit 16: ± 1.45 Linolenik asit 18:3n3 2.2 ± 0.17 Linoleik asit 18:2n6 3.8 ± 0,01 Oleik asit 18:1n ± 1.36 Stearik asit 18:0 4.1 ± 0.21 Eikosapentaenoik asit 20:5n3 (EPA) 11.1 ± 0.96 Araşidonik asit 20:4n6 0.8 ± 0.06 Eikosanoik asit 20:1 1.7 ± 0.02 Araşidik asit 20:0 0.6 ± 0.04 Dekosahekzaenoik asit 22:6n3 (DHA) 15.9 ± 0.79 Dekosapentaenoik asit 22:5 1.0 ± 0.00 Erukik asit 22:1 1.9 ± 0.13 Behenik asit 22:0 0.2 ± 0.01 EPA+DHA 27.0 ± 1.75 SFA 33.7± 2.26 MUFA 31.5 ± 2.31 PUFA 34.8 ± 1.99 SFA : Doymuş yağ asitleri toplamı (14:0, 16:0, 18:0, 20:0 ve 22:0); MUFA : Tekli doymamış yağ asitleri toplamı (16:1, 18:1, 20:1 ve 22:1); PUFA : Çoklu doymamış yağ asitleri toplamı (18:2, 18:3, 20:4, 20:5, 22:5 ve 22:6). 42

57 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Haliloğlu ve ark. (2001), Salvelinus alpinus, Salmo trutta fario ve Oncorhynchus mykiss te toplam doymuş yağ asitleri miktarını (SFA) 26.86±1.04, 25.39±0.93 ve 31.92±0.93 MUFA miktarını 38.37±3.61, 41.90±2.29 ve 30.81±2.28 PUFA miktarını ise 19.81±2.12, 15.48±1.89 ve 22.41±1.89 olarak bulmuştur. Jankowska ve ark. (2003), ise doğal Sander lucioperca da SFA, MUFA ve PUFA miktarlarını 27.84, ve kültürde ise 27.52, ve olarak bulmuşlardır. Blanchet ve ark. (2005) te doğadan aldıkları gökkuşağı alabalığının (Oncorhynchus mykiss) SFA, MUFA ve PUFA miktarlarını 24.4, 17.0 ve 58.6 bulmuş kültür gökkuşağı alabalığında ise 26.9, 32.5 ve 40.6 bulmuştur. Jankowska ve ark. (2003), ise doğal Sander lucioperca da EPA ve DHA miktarını 7.49 ve kültür sudaklarında ise 8.08 ve olarak belirlemişlerdir. Ayrıca Blanchet ve ark. (2005) te doğadan aldıkları gökkuşağı alabalığının (Oncorhynchus mykiss) EPA miktarını %8,1 ve DHA miktarını ise %32,2, kültür gökkuşağında ise EPA miktarını %7,3 ve DHA miktarını ise %18,7 bulmuştur. Blanchet ve ark. (2005), doğadan ve kültürden aldıkları Atlantik Salmonu (Salmo salar) ve gökkuşağı alabalığının (Oncorhynchus mykiss) yağ asidi kompozisyonunu gaz kromotografı kullanarak kıyaslamışlardır. Yağ ve ω-3 doymamış yağ asidi içeriği doğal ve kültürel ortamdan alınan örneklerde benzer sonuçlar bulunmuştur. Atlantik Salmonu nun toplam ω-3 ve ω-6 PUFA oranları doğadan yakalananlarda kültürden alınanlara göre önemli düzeyde farklılık göstermiştir. Kültürel ortamdan alınan gökkuşağı alabalıklarının doğadan avlanan gökkuşağı alabalıklarına göre daha yüksek yağ içeriğine sahip olduğu ancak daha düşük ω-3 PUFA değerine sahip olduğu saptanmıştır. Özoğul ve Özoğul (2007), yaptıkları çalışmada Boops boops, Mugil cephalus, Trachurus mediterraneous, Sardinella aurita, Pagellus erythrinus, Scorpaena scrofa, Scopthalmus maeticus ve Solea solea türlerinin yağ asidi profillerini belirlemişlerdir. Bu çalışma sonucunda doğadan avlanan balık türlerinde doymuş yağ asidi ( SFA) %25,5-38,7 tekli doymamış yağ asidi (MUFA) %13,2-27,0 ve çoklu doymamış yağ asidi (PUFA) miktarı % 24,8-46,4 bulunmuştur. En fazla bulunan yağ asitleri miristik asit (C14:0, % ), palmitik asit (C16:0, % ), palmitoleik asit (C16:1, % ), stearik asit (C18:0, % ), oleik asit (C18:1n9 cis, 43

58 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA % ), linoleik asit (C18:2n6, % ), octadekatetraenoik asit (C18:4n3, % ), cis-5, 8, 11, 14, 17-eikosapentaenoik asit (EPA, C20:5n3, % ) ve cis-4, 7, 10, 13, 16, 19-dokosaheksaenoik asit (DHA, C22:6n3, % ) olmuştur. Akpınar ve ark. (2008), yaptıkları çalışmada Tohma Irmağı nda yaşayan Dağ Alası nın (Salmo trutto magrostigma) karaciğer ve kas yağ asidi profilini çıkarmışlar. Araştırma sonucunda her iki gurupta en çok bulunan yağ asitleri Palmitik asit (C16:0; % ), stearik asit (C18:0; % ), (C18:1 ω-7; % ), oleik asit (C18:1 ω-9 ; % ), eikosapentaenoik asit (EPA; C20:5 w-3; % ) ve dokosahekzaenoik asit (DHA; C22:6 ω-3; % ) dır. Ayrıca ω-3/ω-6 oranı erkek balığın karaciğerinde 2.89 ve dişi de ise 1.97 bulunmuş erkek balığın kasında 2.59 ve dişi balığın kasında da 2.26 olarak bulunmuştur. Balıklarda yağ asidi profillerinin farklı olmasının en önemli sebeplerinden birisi balıkların beslenme şekilleridir. Balıkların beslendiği yemin yağ asidi profili balığın yağ asidi profilinin şekillenmesinde oldukça önemlidir (Yıldız ve ark. 2006; Şener ve Yıldız 2005; Haliloğlu ve ark. 2001). Balık ve balık yağlarının organizma için önemi, yapısındaki doymamış yağ asitlerinden kaynaklanmaktadır. Son yıllarda yağ asitleri analizlerinin bilim ve endüstri alanında yoğun ilginin olması bu doymamış yağ asitlerinin beslenmedeki öneminden, dolayısıyla insan sağlığında oynadığı rollerden kaynaklanmaktadır. ω 3 yağ asidi, özellikle eikosapentaenoik asit ve dekosahekzaenoik asit, insan sağlığıyla birebir ilişkilidir. ω-6 aşırı doymamış yağ asitleri, insan vücudunda çok büyük etkilere sahip olan eikosanoid (prostaglandinler, tromboksanlar ve lekositler) metabolizmasında düzenleyici rollere sahip oldukları gibi omega 3 polienoik yağ asitleri, trigliserit ve kolesterol seviyesini düşürmede, göğüs kanseri semptomlarını hafifletmede, retina ve beyin gelişiminde, ateşli rahatsızlıklarda, kalp ve damar rahatsızlıklarının önlenmesinde oldukça etkilidir. Dolayısıyla insan sağlığı açısından bu derece önemli olan balıkların, değişik dokularındaki yağ asitlerinin ortaya konulması son derece önemlidir (Olgunoğlu, 2007). 44

59 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.2. HPLC Analizi HPLC ile ayırma işlemine tabi tutulan alabalık yağından elde edilen EPA ve DHA fraksiyonları kromatogramları Ek 3 te verilmiştir. İzole etmek istediğimiz omega 3 yağ asitlerinin alıkonma zamanları her 4 grup örnek için aynı koşullar altında 3.5 ila 4.7 dakikaları arasındaki pik içerisinde bulunmaktadır (4.128) ve optimizasyon fraksiyonu aşağıdaki şekildeki gibi elde edilmiştir (Resim 4.1). Resim 4.1. EPA ve DHA nın geliş zamanına ait HPLC kromatogramı Bu aralıktaki fraksiyon toplandıktan sonra verim analizi için gaz kromatografisi (GC) cihazında analizi yapılmak üzere esterleştirilmiştir (Resim 4.2). Esterleştirme reaksiyonu cihazda kullanılan metot gereği yapılmıştır. Ekstrakte edilmiş lipitten, yağ asidi metil esterleri, methanol ve n-heptan içinde 2M lık KOH oluşmuş transmetillendirme yöntemi ile hazırlanmıştır. 10 mg ekstrakte edilmiş yağ örneği üzerine 4 ml 2M lık KOH oluşan 2 ml heptan ilave edilmiştir. Daha sonra oda 45

60 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA sıcaklığında 2 dakika vortekste karıştırılmış ve 4000rpm de 10 dakika süreyle santürfüj edilmiş ve heptan tabakası GC de analiz için alınmıştır. Resim 4.2. İzole edilen EPA ve DHA fraksiyonları 4.3. HPLC den İzole Edilen EPA ve DHA nın Gaz Kromatografisi (GC) Analizi Elde edilen izole yağ asitleri içerisinden EPA ve DHA nın % miktarını belirlemek amacıyla gaz kromatografisi cihazı kullanılmıştır. Gaz kromatografisi ile elde edilen sonuçlara ait kromatogramlar Ek 4 te ve aşağıda verildiği şekilde olmuştur. 46

61 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA EPA C20:5ω3 DHA C22:6ω3 Şekil 4.1. EPA ve DHA izolatı kromatogramı. EPA C22:6 n3 DHA Şekil 4.2. EPA ve DHA izolatının % miktarı. 47

62 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA İşlenmemiş alabalık yağında %11.1 oranında EPA ve %15.9 oranında bulunan DHA yağ asitleri, HPLC optimizasyonu sonucu %58.64 (EPA) ve %40.33 (DHA) seviyelerine yükseltilmiştir. Abe ve Tanaka (1984) ise moleküler elek dolgu kolonu kullanarak sardalya yağ içeriği yağ asitleri etil esterlerinden %84,5 etil EPA bulunduran fraksiyon elde etmiştir. Nieto ve ark. (1997) yaptığı çalışmada sardalya balığı yağından gümüş reçine kolon kromatografisi tekniği ile EPA ve DHA nın saf fraksiyonlarını elde etmişlerdir. Çalışmalarında Amberlite IR-118H ve Dowex 50 W-HCR-W2 isimli iki tip gümüş bağlanmış reçineler kullanılarak kolon üretmişlerdir. Amberlite-gümüş kolonu EPA nın % 98.5 oranında saf olarak ayrılmasını sağlarken diğer çoklu doymamış yağ asitlerinden DHA yı ayıramamaktadır. Dowex-gümüş kolonu ise Amberlite-gümüş kolonun aksine DHA yı hayli saf halde ayırırken EPA yı ayıramamaktadır. Yapılan bu optimize çalışmaları ile oldukça önemli olan iki ω-3 yağ asidi oldukça saf oranda beslenme ve farmakolojik araştırmalarda kullanılmak üzere elde edilebilmiştir. Chen ve Ju (2002), EPA ve DHA nın zenginleştirilmesi için düşük sıcaklık kristalizasyon çalışmasında ringa balık yağı, yağ asitlerinin asetonitrildeki çözeltisinin -40 o C da 24 saat bekletilmesi sonucunda ele geçen filtratta EPA, DHA ve toplam ω-3 çoklu doymamış yağ asitlerinin % 28.94, % ve % 60.9 yükseldiği tespit edilmiştir. Distilasyon ile zenginleştirme üzerine yapılmış bir çalışmada, balık yağı metil esterlerinin 250 o C ve 0,2-0,5 mmhg basıncında vakum distilasyonu ile EPA ve DHA ca zengin fraksiyonlar elde edilebilmiştir. Fakat bu sıcaklıkta çoklu doymamış yağ asitlerinin termal polimerizasyonu önlenememiştir (Mishra, 1993). Süperkritik CO 2 ekstraksiyon yönteminin poli-doymamış yağ asitlerinin konsantre edilmesinde kullanımı üzerine yapılmış bir çalışmada, Nilson ve ark. (1988), ringa balık yağı etil esterlerinden MPa basınç aralığında ve o C sıcaklık aralığında %70 EPA ve %80 DHA içeren bir ürün elde etmişlerdir. Jachmanian ve ark. (2007) ise barlam balığı yağının etil esterlerini MPa 48

63 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA basınçta ve o C da süperkritik CO 2 ile ekstrakte etmişler ve içerisinde % 55 DHA bulunan ekstrakt elde etmişlerdir. Son yıllarda enzimatik hidroliz ve esterleşme reaksiyonu ile balık yağlarından EPA ve DHA ca zengin ürünlerin eldesi üzerinde yoğun çalışmalar sürdürülmektedir (Wanasundara ve Shahidi, 1998; Robles ve ark., 1998; Üstün ve ark., 1997; Okada ve Morrissey, 2007; Lyberg ve Adlercreutz, 2008). Okada ve Morrissey (2007), içerisinde % 26,86 EPA ve % 13,62 DHA bulunan pasifik sardalya balık yağından çoklu doymamış yağ asitlerinin zenginleştirilmesinde hidroliz reaksiyonunu kullanmışlar ve Candida rugosa, Candida cylindracea, Mucor javanicus ve Aspergillus niger lipaz enzimlerinin zenginleşme üzerindeki etkinliğini incelemişlerdir. En iyi sonuçları Candida rugosa lipazı ile almışlardır. 250 ünite bu enzim ile 1,5 saat sonunda hidroliz ürününde EPA % 33,74 değerine yükselmiştir. 500 ünite enzim ile çalışmada ise 9 saat sonunda ürünün DHA % 29,94 değerine ulaşmıştır. İçeriğinde mol yüzdesi olarak % 19 DHA ve % 12 EPA bulunan mürekkep balığı yağından etanoliz reaksiyonu ile EPA ve DHA ca zengin ürün eldesinde ise Thermomyces lanuginosus, Pseudomonas cepacia, Pseudomonas fluorescens ve Rhizomucor miehei lipazları denenmiştir. Thermomyces lanuginosus ile ürün olarak mono ve diaçilgliserollerden ibaret olan karışım elde edilmiştir. Bu karışımda mol yüzdesi olarak % 34 DHA ve % 17 EPA bulunduğu belirlenmiştir (Lyberg ve Adlercreutz, 2008). Schmitt-Rozieres ve ark. (2000) tarafından yapılan çalışmada sardalya balığı konservesi hazırlayan bir tesisten temin edilen atık çözeltiden selektif esterleşme yolu ile EPA ve DHA kazanımı üzerinde çalışmalar yapılmıştır. Esterifikasyon işleminde 1-butanol ile Lipozim IM 60 ve immobilize Candida rugosa lipaz enzimleri kullanılmıştır. Lipozim ile EPA zenginleşmesi olmamış ama DHA konsantrasyonu % 80 lere yükseltilebilmiştir. C. rugosa ile %30 EPA zenginleştirilmesi sağlanabilmiştir. Üre fraksiyonlama yöntemi ile balık yağlarından EPA ve DHA nın konsantre edilmesi ile ilgili literatürde yer alan ilk çalışmada, sardalya yağı yağ asitleri üre ile metanollü ortamda muamele edilmiş ve yağ asitleri iyot indisleri 30,56 ile 304,9 arasında değişen 8 fraksiyona ayrılmıştır (Revankar, 1974). 49

64 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Wille ve ark. (1987) yürüttüğü çalışmada, sardalya yağı yağ asitlerinden (%30 EPA ve DHA) üre ile doymuş ve mono-doymamış yağ asitleri uzaklaştırılmış ve geriye kalan fraksiyonda EPA ve DHA yüzdesi %90 a ulaşmıştır. Görüldüğü üzere HPLC yöntemi kullanılarak yağ asitlerinin saflaştırılması ve optimizasyonu üzerine yapılan çalışmaların sınırlı olduğu görülmektedir. Çalışmamız bu alanda özelliği ile özgün değer taşımakta ve problem çözme niteliğindedir bepa ve bdha GC-MS Analizleri Biyodönüşümü yapılan bepa ve bdha GC-MS analizi sonucunda toplamda 46 farklı biyotransformasyon bileşeni tanımlanmış ve kromatogramlar Ek 5 ve Ek 6 da verilmiştir. Bu ekstraktın bileşenleri Çizelge 4.2 de gösterilmiştir. 50

65 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Çizelge 4.2. bepa ve bdha GC-MS analizi sonuçları Carbonochloridic acid Diethyl carbinol Methoxymethane Hydrazine L-prolin Oxalic acid Luprisol Propionaldehyde Caproaldehyde Propanoic acid Valeric acid 1,1-dimethoxyoctane Cyclooctane Sulfurous acid Butyric acid 1,2,3,4-undecanetetrol 2-propenoic acid Butanedioic acid Cyclohexanone Butanoic acid Decanoic acid 4-pentenyl butyrate 1-heptene Cyclohexanol Silane 1-butyne Birnenoel Trifluoroacetic acid, Dodecane Pentalene-1,5-dione, 3-decen-1-ol, Cyclopentaneundecanoic acid, Ethyl isohexanoate, 1-pentanol, 2,2,3- triethyloxirane Propylphosphonic acid, Acrolein Tetrahydropyrrolo Thaizole Cyclohexanecarboxylic acid 4-heptenoic acid, Hex-4-enoic acid, Butyldimethylsilanol 4-methylhexyl acetate 15,18-dihydroxy-14,17-epoxy- 5(Z),8(Z),11(Z)-eicosatrienoic acid 17,19-dihydroxy-16,18-epoxy- 4(Z),7(Z),10(Z),13(Z)- docosatetoraenoic acid Ana bileşen olarak ise 15,18-dihydroxy-14,17-epoxy-5(Z),8(Z),11(Z)- eicosatrienoic acid (18.2), 17,19-dihydroxy-16,18-epoxy-4(Z),7(Z),10(Z),13(Z)- docosatetoraenoic acid (11.96), carbonochloridic acid (2.99%), methoxymethane 51

66 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA (40.6%), caproaldehyde (7.85%), 2-propenoic acid (8.13%) ve cyclohexanone (2.07%) olarak belirlenmiştir. EPA ve DHA nın mikrobiyal biyodönüşümleri Hosokawa ve ark. (2003) tarafından bildirilmesine rağmen biyodönüşümü gerçekleşen ürünlerin antimikrobiyal aktiviteleri şimdiye kadar nadiren incelenmiştir. Doymamış yağ asitlerinin mikrobiyal dönüşümü, katma değerli yeni hidroksi ürünlere dönüşümlerinden dolayı geniş çapta incelenmektedir (Hou, 1995). Clavibacter sp. ALA2 suşu ile 15, 18-dihydroxy-14, 17-epoxy-5(Z), 8(Z),11(Z)-eicosatrienoic acid ve 17, 20-dihydroxy-16, 19-epoxy-4(Z), 7(Z), 10(Z), 13(Z)-docosatetraenoic acide dönüştürülmüştür (Hosokawa ve ark., 2003). Pseudomonas aeroginosa PR3 suşu tarafından gerçekleştirilen biyodönüşüm reaksiyonları doymamış yağ asitlerinden türetilerek üretilen mono-, di- ve trihidroksi yağ asitleri elde etmede mikrobiyal sistemler arasında geniş çapta incelenmiştir (Hou ve Bagby, 1991; Kuo ve ark., 1998, 2001; Kim ve ark., 2000). ABD de atık su deresinden izole edilen PR3 suşu, oleik asiti yeni bir bileşik olan 7,10-dihydroxy- 8(E)-octadecenoic acid (DOD) (Hou ve Bagby, 1991), ve ricinoleik asiti yeni bir bileşik olan 7,10,12-trihydroxy-8(E)-octadecenoic acid (TOD) a dönüştürmüştür (Kuo ve ark., 1998). P. aeroginosa PR3 suşu tarafından dönüştürülen oleik asit ürünü olan 7,10- dihydroxy-8(e)-octadecenoic acid (DOD), zaman zaman insanlarda tahriş ve diğer enfeksiyonlara yol açan bir mantar olan Candida albicans ın büyümesini inhibe ettiği bildirilmiştir (Hou ve Bagby, 1991). Bu suş ricinoleik asiti diğer bir bileşik olan 7,10,12-trihydroxy-8(E)-octadecenoic acid (TOD) a dönüştürmekte ve bu bileşikte pirinç tahribatına neden olan mantarı inhibe etmektedir. Buda bu bileşiklerin bu tür patojenlere karşı biyolojik fungusit olarak kullanımının artmasına neden olmaktadır (Kuo ve ark., 2001). Doymamış yağ asitlerinin mikrobiyal dönüşümü, katma değerli yeni hidroksi ürünlere dönüşümlerinden dolayı geniş çapta incelenmektedir. Balık yağından HPLC ile EPA ve DHA nın saflaştırılması ve mikrobiyolojik etkileri ile ilgili literatürlerde çok az sayıda çalışma bulunmaktadır. Bu şekilde alternatif antimikrobiyal ajanların tanımlanması literatüre katkı sağlayacaktır. 52

67 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.5. bepa ve bdha İzolatlarının Patojen Bakteriler Üzerindeki Antimikrobiyal Etkisi Gıda kaynaklı patojenik bakterilere karşı EPA ve DHA biyodönüşüm ürünlerinin in-vitro antibakteriyel aktiviteleri inhibisyon zonu ve MIK değerleri ile belirlenmiştir. Çizelge 4.2 ve 4.3 te verilen sonuçlara göre, bepa ve bdha nın ham ekstraktları gram pozitif (L. monocytogenes ATCC 7677 ve S. aureus ATCC 29213) ve gram negatif bakterilere (E. faecalis ATCC 29212, E. coli ATCC 25922, P. aeruginosa ATCC27853, K. pneumonia ATCC700603, A. hydrophila NCIMB1135 ve S. Paratyphi A NCTC13) karşı yüksek oranda antibakteriyel aktivite göstermiştir. Biyodönüşümü yapılmayan ve negatif kontrol olarak kullanılan eikosapentaenoik asit oldukça düşük antimikrobiyal etki göstermesine karşın biyodönüşümü yapılmayan dokosaheksaenoik asit bakteriyel etki gösterememiştir. Bakteriyel suşlar için inhibisyon zon çapları ve MIK değerleri sırasıyla ham bepa ve bdha ekstraktı için 7-12 mm ve μg/ml aralığında değişmektedir (Çizelge 4.3 ve 4.4). Çalışmamızda kullanılan %5 DMSO ile kör kontrol, herhangi bir test bakterisini inhibe etmemiştir Disk Difüzyon Yöntemi Gram pozitif bakteriler bepa ve bdha ya karşı gram negatiflerden daha hassas olmuşlardır ve L. monocytogenes ve S. aureus suşlarına karşı diğer suşlardan nispeten daha yüksek antimikrobiyal aktivite göstermişlerdir (Çizelge 4.2). Staphylococcus aureus ATCC ve Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, 10 mm zon çapı ile aynı antimikrobiyal aktivite gösterirken, Klebsiella pneumoniae ATCC700603, Enterococcus faecalis ATCC 29212, Aeromonas hydrophila NCIMB 1135 ve Salmonella paratyphii A NCTC 13, 7 mm zon çapı ile aynı etkileri göstermişlerdir. Gram negatif bakteriler içerisinde Salmonella paratyphii A NCTC 13 (7 mm) en güçlü antimikrobiyal direnç gösterirken Pseudomonas aeruginosa ATCC (10 mm) en düşük antimikrobiyal hassasiyeti göstermiştir (Resim 4.3). Gram pozitif bakteriler içerisinde ise Listeria monocytogenes ATCC 7677 (12 mm), 53

68 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Staphylococcus aureus ATCC (10 mm) suşundan daha düşük antimikrobiyal etki göstermiştir. Gram pozitif bakterilerden Staphylococcus aureus ATCC ile gram negatif bakterilerden Pseudomonas aeruginosa ATCC suşları aynı antimikrobiyal aktivite (10 mm zon çapı) göstermişlerdir. Escherichia coli ATCC suşu 8 mm zon çapı ile antimikrobiyal aktivite göstermiştir (Resim 4.4). Çizelge 4.3. bepa ve bdha ekstraktlarının seçilen bakterilere karşı oluşturdukları inhibisyon zonu. Bakteri Suşları İnhibisyon Zonu (mm) bepa ve bdha Ekstraktı Listeria monocytogenes ATCC ±0.58 Staphylococcus aureus ATCC ±0.72 Pseudomonas aeruginosa ATCC ±0.66 Escherichia coli ATCC ±0.42 Klebsiella pneumoniae ATCC ±0.35 Enterococcus faecalis ATCC ±0.64 Aeromonas hydrophila NCIMB ±0.53 Salmonella paratyphii A NCTC 13 7±

69 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Resim 4.3. Salmonella paratyphi A nın P. aeroginosa PR3 suşu ile elde edilen bepa ve bdha ekstraktı tarafından oluşturduğu inhibisyon zon görünümü. 55

70 4.ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA Resim 4.4. E. coli nin P. aeroginosa PR3 suşu ile elde edilen bepa ve bdha ekstraktı tarafından oluşturduğu inhibisyon zon görünümü. Antibakteriyel duyarlılık çalışmalarında pek çok esansiyel yağ P. aeruginosa ya karşı kullanılarak rapor edilmiştir (Deans ve Ritehie, 1987; Knobloch ve ark., 1989; Paster ve ark., 1990). Bu sonuçlar diğer araştırmacılar tarafından esansiyel yağlar için bildirilen sonuçlara büyük ölçüde benzerlik göstermiştir (Cosentino ve ark., 1999; Lambert ve ark., 2001; Karaman ve ark., 2003). P. aeruginosa dışındaki diğer organizmalar antimikrobiyal bileşiklerin etkisine daha az hassas olmuşlardır. Bu durum muhtemelen onların hücre duvarı çevresinin dış membrana sahip olmasından kaynaklanmaktadır (Ratledge ve Wilkinson, 1988), ki buda hidrofobik bileşiklerin lipopolisakkarit örtüsü boyunca difüzyonunu sınırlar (Vaara, 1992). 56