Lineer kromozomal uçlarda yer alan ve tekrarlayan DNA dizileri olan telomer

Transkript

1 DERLEME Hacettepe T p Dergisi 2006; 37:49-55 Kanserde telomeraza yönelik tedavi stratejileri Z. Günnur Dikmen 1, Erkan Dikmen 2, Pakize Do an 3 1 Yrd. Doç. Dr., Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Ankara 2 Yrd. Doç. Dr., Kırıkkale Üniversitesi Tıp Fakültesi Göğüs Cerrahisi Anabilim Dalı, Kırıkkale 3 Prof. Dr., Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı, Ankara Lineer kromozomal uçlarda yer alan ve tekrarlayan DNA dizileri olan telomer yapıları, hücrelerin çoğalma kapasitesini ve yaşlanmalarını kontrol eden moleküler bir saat gibi fonksiyon görmektedir. İnsanlarda telomer yapıları genelde 5-15 kb uzunluğunda olup, tekrarlayan dizi TTAGGG dir [1,2]. Hücre bölünmesi sırasında DNA polimerazın kesintisiz zincirin 3 ucunu tamamen replike edememesi nedeniyle kromozomal uçlarda kayıp olmaktadır. Replikasyon sonu problemini kompanse edecek moleküler mekanizmaların yokluğunda, normal somatik insan hücrelerinde her hücre bölünmesinde nükleotidlik kayıp izlenmekte ve hücreler PD (population doubling, hücre bölünmesi) sonrasında yaşlanmaktadır [3-5]. Hücrenin yaşlanmadan kurtulup ölümsüz özellik kazanabilmesi için bu kontrol mekanizmasının aşılması gerekmektedir., kendi RNA alt birimini kalıp olarak kullanarak sentezlediği hekzamerik tekrarları (TTAGGG) n telomer uçlarına ekleyen ribonükleoprotein yapıda bir ters transkriptazdır. reaktivasyonunun, hücrelerin sınırsız çoğalma özelliği kazanmasında rol oynayan en önemli mekanizmalardan biri olduğu ileri sürülmektedir [6,7]. TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol) yönteminin 1994 yılında geliştirilmesiyle telomeraz aktivitesinin kanserlerin %80-90 ında pozitif olduğu, buna karşılık somatik hücrelerin çoğunda bulunmadığı tespit edilmiştir [8]. Bu sonuçlar, telomerazı hem kanser tanısında hem de tedavisinde ilgi çekici bir hedef haline getirmiştir. TELOMERAZ ENZ M ve ALT B R MLER Greider ve Blackburn tarafından 1985 yılında tetrahymena thermophila da, tanımlanan telomeraz enzimi, 550 kda boyutunda olan hücresel bir ribonükleoproteindir [6]. enzimi, ters transkriptaz aktivitesine sahip katalitik bir alt birim (htert) ve bir RNA (htr) alt ünitesine sahiptir, diğer ters transkriptazlardan farkı kendi RNA alt birimini (htr) telomerik DNA sentezinde kalıp olarak kullanmasıdır [9,10]. TELOMERAZ RNA ALT B R M (htr) İnsanlarda htr, RNA polimeraz II tarafından transkripsiyona uğratılmakta ve 451 nükleotidden oluşmaktadır. 5 ucuna yakın olan nükleotidler arasındaki bölge (5 -CUAACCCUAAC-3 ), telomer DNA sına tutunma ve revers transkripsiyon için kalıp olarak kullanılmaktadır, bu nedenle antitelomeraz tedavi için uygun bir hedeftir. htr ekspresyonu, kanser hücrelerine göre daha düşük olmakla birlikte tüm somatik hücrelerde mevcuttur ve telomeraz ekspresyonu olmayan hücrelerde htr nin rolü kesin olarak bilinmemektedir. htr, geni 3q26 kromozomu üzerinde tek kopya olarak bulunmaktadır. Olgun htr 5 -trimetil guanozin şapkası taşımaktadır. htr sekonder yapısı CR2/CR3 domain, CR4/CR5 domain, H/ACA 49

2 Dikmen, Dikmen ve Do an (CR6/CR8) domain ve CR7 domain olmak üzere dört fonksiyonel eleman içermektedir [11,12]. htr yapısına bağlanan proteinler arasında yer alan diskerin, küçük ribonükleoproteinlerden (snornp) oluşan ve ribozomal RNA nın işlenmesinden sorumlu olan bir proteindir. Diskerin genindeki mutasyonlar; düşük telomeraz aktivitesi, kısa telomerler, erken yaşlanma ve artmış kanser insidansı ile karakterize olan Diskeratosis congenita ya yol açmaktadır [13]. TELOMERAZIN KATAL T K ALT B R M (htert) htert, 127 kda luk büyük bir proteindir. İnsan htert geni 16 ekson ve 15 intron içermekte olup, yaklaşık 40 kb dır. İnsan diploid hücrelerinde htert geni tek kopya olarak 5p15.33 te bulunmaktadır. ın katalitik bölgesinde revers transkriptaz aktivitesinden sorumlu yedi bölge olduğu bilinmektedir [14]. Ters transkriptaz ünitesi proteinin karboksi ucunda, telomeraza özgül bölge olan T-domain ise amino ucunun hemen yanında yer almaktadır. N-ucu oldukça iyi korunmuş olup, domain I, II ve III ü içerir ki bu domainlerin tümü telomerlerin uzatılması için gereklidir. Domain II, III ve T motifindeki mutasyonların, htert nin htr ye bağlanmasında azalmaya yol açarak fonksiyonel olmayan enzime neden olduğu bildirilmektedir [15]. NORMAL ve KANSER HÜCRELER NDEK TELOMERAZ AKT V TES Yüksek çoğalma kapasitesine sahip germ hücreleri, hematopoietik, epidermal, intestinal hücreler ile bazı kök hücre popülasyonları dışındaki diğer somatik hücrelerde telomeraz ekspresyonu izlenmemektedir ve ilerleyen yaşla birlikte mitotik replikasyona bağlı olarak telomerlerde izlenen ilerleyici kısalma, hücresel yaşlanmaya yol açmaktadır. Proliferasyon gösteren hücrelerde izlenen düşük düzeydeki telomeraz ekspresyonunun, kök hücre popülasyonunun yenilenmesi için gerekli olduğu düşünülmektedir. Telomer hipotezi ile uyumlu olarak, yaşlanmadan kaçarak ölümsüz olma özelliği kazanan tümör hücreleri, genetik kararlılığın ve telomer uzunluğunun sağlanabilmesi için telomeraz aktivitesine ihtiyaç duymaktadır (Şekil 1) [16]. tek başına normal bir hücreyi kanser hücresine transforme edebilmek için yeterli değildir, ancak hücrelerin sınırsız büyüme kapasitesi kazanıp ölümsüz hale geçebilmeleri ve telomer uzunluklarını koruyabilmeleri için gereklidir. Fibroblastlar, retinadaki pigment epitel hücreleri ve umblikal kord endotel hücreleri gibi normal hücrelere htert geninin aktarılmasıyla, bu hücrelerin çoğalma potansiyellerinin arttığı, ancak transformasyon göstermedikleri, hücre siklusu a. Normal somatik hücreler Kromozom DNA sı Telomer tekrar dizileri Yaşlanma b. Kanser hücreleri Kromozom DNA sı Ölümsüz kanser hücreleri Şekil 1. Hücrelerin yaşlanmadan kaçarak ölümsüzlük özelliği kazanmaları [16]. 50 H ACETTEPE T IP D ERG S

3 Kanserde telomeraza yönelik tedavi stratejileri kontrol noktalarının çalıştığı, bu hücrelerin yumuşak agarda ve nude farede tümör oluşturamadıkları gösterilmiştir [17]. TELOMERAZ NH B TÖRLER inhibisyonu; htr veya htert nin transkripsiyonu engellenerek, htr veya htert mrna sı parçalanarak, htert nin sentezi ve sentez sonrası modifikasyonları önlenerek, enzimin aktif bölgesi bloke edilerek, htr ile htert nin birleşmesi, enzim kompleksinin çekirdeğe transfer olması veya substratı olan telomerlere tutunması engellenerek sağlanabilir (Şekil 2) [18]. Tablo 1 de bugüne kadar üretilen telomeraz inhibitörleri verilmiştir. Ayrıca, telomeraz inhibitörlerinin kan dolaşımında daha uzun süre kalabilecek şekilde kapsüle edilmesi, yıkıma uğramadan tümörün bulunduğu alana ulaşması ve yüksek oranda malign hücreler tarafından alınması hedeflenmektedir. 1. katalitik alt birimini (htert) hedef alanlar Dominant negatif htert: Dominant negatif htert (DN-hTERT), htr ile bağlanabilmekte, ancak katalitik olarak inaktif olduğundan telomeraz aktivitesini Tablo 1. inhibitörleri 1. katalitik alt birimini (htert) hedef alanlar Dominant negatif htert htert transkripsiyon inhibitörleri Revers transkriptaz inhibitörleri Hammerhead ribozimler 2. ın RNA komponentini hedef alan inhibitörler Hammerhead ribozimler Peptid nükleik asitler (PNA) Antisense oligonükleotidler 2,5-oligoadenilat antisense oligonükletidler 2 -ucu modifiye edilmiş RNA analogları N3 P5 fosforamidatlar, N3 P5 tiyofosforamidat oligonükleotidler 3. a yönelik immün tedavi 4. a yönelik gen tedavisi Sitoplazma Nükleus 1 1 Transkripsiyon 6 Translasyon 2 3 RNA işlenmesi ve katlanma Translasyon sonrası modifikasyonlar 4 Şekil 2. inhibisyon mekanizmaları: 1. Transkripsiyonun inhibisyonu, 2. Translasyonun inhibisyonu, 3. htr nin oligonükleotidler ile katalitik yıkımı, 4. Translasyon sonrası modifikasyonların inhibisyonu, 5. Enzim kompleksinin inhibisyonu, 6. Enzimin telomerik DNA ya bağlanmasının blokajı [18]. 5 51

4 Dikmen, Dikmen ve Do an in vitro ve in vivo olarak inhibe etmektedir. Hahn ve arkadaşları, 710 ve 711. pozisyonlardaki aspartik asit ve valin aminoasitlerini alanin ve izolösin ile değiştirerek DN-hTERT elde etmiş ve retroviral vektör aracılığıyla DN-hTERT ile infekte ettikleri ölümsüz hücrelerde telomeraz inhibisyonu, telomer kısalması, büyüme duraklaması ve hücre ölümü olduğunu tespit etmişlerdir [19]. DN-hTERT nin in vivo etkilerini incelemek amacıyla, 36M yumurtalık kanser hücreleri immünsüpresif nude fareye enjekte edildiğinde, wild-type htert eksprese eden hücreler farede tümör oluştururken, DN-hTERT eksprese eden hücrelerin tümör oluşturamadığı saptanmıştır. Dominant negatif mutantların revers transkriptaz inhibitörlerine üstünlükleri daha özgül inhibisyon yapmalarıdır, ancak tedavi amacıyla kullanılabilmeleri için uygun bir veriliş yoluna ihtiyaç duyulmaktadır [20]. Revers transkriptaz inhibitörleri: Revers transkriptaz inhibitörleri, virüs DNA sına katılarak revers transkriptaz enzimini inhibe edip zincir uzamasını bloke eder. da revers transkriptaz aktivitesine sahip olduğundan bu grup ilaçlar için bir hedeftir. 3 -azido-3 - deoksitimidin (AZT), HIV I proliferasyonunu inhibe eden bir revers transkriptaz inhibitörüdür. AZT, özgül olarak telomerazı hedef almamakla birlikte telomeraz aktivitesinde doza bağlı olarak inhibisyona yol açtığı ve klon oluşturabilme etkinliğini azalttığı dört farklı meme kanseri hücre serisinde gösterilmiştir [21]. İnsan lenfositleriyle yapılan çalışmada da AZT etkisinin sitotoksik olmadığı geçici süre hücre büyümesini baskıladığı ve ilacın ortamdan çekilmesi ile etkinin geri döndüğü bildirilmektedir. Revers transkriptaz inhibitörlerinin telomeraz ya da diğer polimerazlara karşı seçici olmamaları önemli bir problemdir. Hammerhead ribozimler: Hammerhead ribozimler, htert mrna sını parçalayarak telomeraz aktivitesini azaltmaktadır. Özellikle htert nin 5 ucundaki 13 nükleotidlik kısmı hedef alan ribozimler en çok inhibitör etkiyi göstermektedir. htert ye yönelik hazırlanan ribozimler, adenoviral vektör ile verildiğinde htrhtert etkileşiminde rolü olduğu tahmin edilen T motifini hedef almaktadır. Meme kanseri hücre serisinde htert mrna sını parçalayıp telomeraz inhibisyonuna, telomerik kısalmaya ve apopitozise neden olduğu bildirilmektedir [22]. 2. ın RNA komponentini hedef alan inhibitörler 52 Hammerhead ribozimler: htr yi hedef alan hammerhead ribozimler, bazlık kısa katalitik RNA dizilerinden oluşur ve özellikle GUC dizilerine karşı ribonükleaz aktivitesine sahip katalitik domainleri vardır. Her iki uçta bulunan özgül tamamlayıcı diziler sayesinde hedef RNA ya tutunurlar ve kesmeye başlarlar. htr nin özellikle kalıp bölgesini ( nükleotidler arası) hedef alan ribozimlerin telomeraz aktivitesini inhibe edici etkilerinin, htr yi başka yerden kesen ribozimlere oranla daha fazla olduğu bildirilmektedir. Endometriyum, melanoma, hepatoselüler karsinoma hücre serilerinde ribozimlerin telomeraz aktivitesini azalttığı gösterilmiştir [23,24]. Peptid nükleik asit (PNA): Peptid nükleik asitler, şeker-fosfat omurgasının N-(2-aminoetil) glisin oligomeriyle değiştirilmiş olduğu DNA-RNA analoglarıdır. Nötral amid omurgaya sahip olduklarından, endo ve ekzonükleazlara dirençli hale gelir ve ayrıca hedef RNA ile hibridize olma ilgileri ve özgüllükleri de artar. Omurgalarının yüksüz olması nedeniyle katyonik lipid ile kompleks oluşturularak hücrelere doğrudan transfer edilemeyen PNA lar, ancak DNA oligonükleotidleri ile hibridize edilerek ya da DNA ya lipidle tutturularak hücre içine transfer edilebilir. PNA lar hücreye girdikten sonra htr yi tanıyarak bağlanır ve pikomolar ile nanomolar düzeydeki IC50 değerlerinde telomeraz aktivitesini inhibe eder. htr kalıbına komplementer olan PNA nın eklenmesiyle DU145 hücrelerinde bir gün sonra telomeraz aktivitesi %90 oranında azalmış ve telomer kısalması izlenmiştir [25]. PNA ların hücre içine alımını kolaylaştırmaya yönelik yeni yöntemler geliştirilmektedir. Antisense oligodeoksinükleotidler: Antisense oligodeoksinükleotidler (ODN) hedef RNA ya bağlanabilen kısa DNA dizileridir. Hedef RNA ya hidrojen bağlarıyla hibridize olur ve RNA nın translasyonunu pasif veya aktif mekanizma ile inhibe eder. Pasif inhibisyon ODN nin RNA ya kompetitif bağlanmasına, aktif inhibisyon ise RNA-ODN hibridi oluştuktan sonra mrna nın RNaz H ile yıkımına bağlıdır. ODN lerin transfeksiyon ajanı olmadan in vitro şartlarda hücre içine alınmaları zordur. İn vivo şartlarda ise, endositik mekanizma ile hücre membranını geçtikleri, hücre içine alındıktan sonra endo ve ekzonüklezlarla parçalandıkları tespit edilmiştir. Parçalanmalarını önlemek için yapılan kimyasal modifikasyonlar ise, hedef dizilere bağlanma özgüllüğünü azaltmaktadır. Yapılan in vitro çalışmalarda kanser hücre serilerinde telomeraz aktivitesinde azalma saptanırken, çoğunda telomer uzunluklarında kısalma olduğu rapor edilmemiştir [26]. Bu hücrelerde büyüme duraklaması veya apopitozisin gecikme fazı izlenmeden oldukça kısa sürede ortaya çıkması bu etkilerin telomeraz inhibisyonuna bağlı olmadığını düşündürmektedir. 2,5-oligoadenilat antisense oligonükleotidler: 2,5-oligoadenilat (2-5A) antisense oligonükleotidler, telomeraz RNA sını hedef alan bileşikler olup, 2-5A nın H ACETTEPE T IP D ERG S

5 Kanserde telomeraza yönelik tedavi stratejileri ODN lere eklenmesi ile elde edilmişlerdir. Böylece ODN lerin telomeraza karşı olan aktivitesinin artırılması hedeflenmiştir. 2-5A nın eklenmesi, RNaz H ile birlikte memeli antiviral savunma sisteminin parçası olan RNaz L nin de ODN ile hibridize olmuş olan hedef RNA nın parçalanmasına katılmasını sağlar. 2-5A, ODN ile bağlandıktan sonra aktif forma dönüşerek hedeflenen tek zincirli RNA yı keser. Glioma hücrelerini 2-5A antisense ODN ile inkübe ettikten beş saat sonra RT- PCR ile htr ekspresyonunun kaybolduğunu, 14 günlük tedavi sonucunda ise hücrelerin %79 unda apopitozis izlendiği saptanmıştır [27]. 2-5A-anti-hTR, prostat kanser hücrelerinde denendiğinde ise, bir-iki haftalık tedaviden sonra hücre canlılığında azalma ve kaspaz aktivasyonuna bağlı apopitozis izlenmiştir. Ayrıca, ksenograft hayvan deneylerinde uygulanan yedi günlük 2-5A-anti-hTR ile tedavisinin, apopitozis indüksiyonu ile tümör gelişimini önlediği de rapor edilmektedir. Ancak çok kısa sürede etki göstermiş olmaları telomerik kısalmanın dışında başka faktörlerin de etkili olabileceğini düşündürmektedir [28]. Bu ODN lerin etki mekanizması ve ne derece telomeraz spesifik oldukları, telomeraz pozitif olan normal somatik hücreler üzerindeki etkileri ve uzun süreli tedavi sonucunda ODN lere karşı direnç gelişip gelişmediği bugün için bilinmemektedir. 2 ucu modifiye edilmiş N3 P5 fosforamidat oligonükleotidler: Onbir-onüç bazlık N3 P5 fosforamidat oligonükleotidler sentezlendikten sonra, nükleozit şeker halkasının 2 -pozisyonunda düzenlemeler yapılarak 2 -floro, 2 -OH veya 2 -O metil gruplarını içeren oligonükleotidler elde edilmiştir. Şeker omurgada yapılan bu düzenlemeler sayesinde oligonükleotidlerin hedef RNA ya özgüllüğü artmış ve nükleazlara dirençli hale gelmişlerdir. 2 -floro fosforamidatlar, tüm 2 -modifiye RNA bileşikleri arasında termodinamik bakımdan en dayanıklı olan bileşiklerdir. Bu bileşikler diziye özgül ve doza bağımlı olarak 1 nm den düşük IC50 değerlerinde antitelomeraz etki göstermektedir. RNaz H yi aktive edemezler ve etkilerini sadece hedef RNA ya kompetitif yolla bağlanarak gösterirler, ancak komplementer RNA ya bağlanma afiniteleri daha düşüktür [29]. Herbert ve arkadaşları, htr kalıp bölgesine komplementer olan 13 bazlık 2-O-metil ODN leri üç ay süreyle meme kanser hücreleri üzerinde denediklerinde, telomeraz inhibisyonuna, telomerlerde kısalmaya ve apopitotik hücre ölümüne yol açtığını saptamışlardır [30]. ODN ler ortamdan uzaklaştırıldığında telomeraz aktivitesinin proliferasyon hızının ve telomerik uzunlukların geri dönmesi ise, bu etkilerin telomerazın kompetitif inhibisyonuna ait olduğu görüşünü desteklemektedir. N3 P5 fosforamidat ve N3 P5 tiyo-fosforamidat oligonükleotidler: N3 P5 fosforamidatlar ve tiyo-fosforamidatlar, 3 -C atomuna bağlı NH 2 grubu içeren 2 -deoksinükleozitlerdir ve yapılarındaki 3 -NH 2 gruplarının varlığı şeker-fosfat omurga ile etkileşen su molekülü sayısını artırmaktadır [31]. Tiyo-fosforamidatların fosforamidatlara en önemli üstünlüğü, oligonükleotidin omurgasında bulunan nükleofilik sülfür ile htr nin kalıp bölgesine komşu olan htert aminoasitleri arasında kararlılığı artırıcı etkileşimlerin bulunmasıdır. N3 P5 tiyo-fosforamidatlar, şeker-fosfat omurga ile hedef RNA ya dizi özgül olarak yüksek ilgiyle bağlanır ve PSgruplarının proteinlerle etkileşimi, htert ile kararlılığı artırıcı sekonder etkileşimler sağlar [32]. N3 P5 fosforamidatlar ve N3 P5 tiyo-fosforamidatlar ise özgül olarak htr nin 11 nükleotidlik kalıp bölgesini hedef alır ve kompetitif enzim inhibitörleri gibi enzimin aktif bölgesine bağlanıp bloke eder. Bu özellikleri sayesinde htr nin dışındaki diğer RNA lara bağlanmaları söz konusu değildir ve bu da potansiyel yan etkilerini azaltmaktadır. Ayrıca, RNaz H aktivasyonu ile hedeflerini parçalamazlar. N3 P5 tiyo-fosforamidat oligonükleotidler, diğer fosforamidatlardan kez daha asite dayanıklıdır, bu özellikleri tiyo-fosforamidat grubuna bağlanan bazik kısmın (-P=S) olmasından kaynaklanmaktadır. Oligonükleotid N3 P5 tiyo-fosforamidatlar, hücreler ve farelerdeki 3 ekzonükleazlar, hücresel endonükleazlar ve fosfodiesterazlar tarafından enzimatik hidrolize dayanıklıdır. Komplementer RNA ve tek zincirli DNA ile oluşturdukları dubleksler de fosfodiester bağlarla oluşturulanlara oranla oldukça dayanıklıdır ve RNaz H ile in vitro şartlarda hidroliz olmazlar. Bu özellikleri, onları biyokimyasal ve biyolojik uygulamalar için uygun kılmaktadır [32,33]. 3. a yönelik immün tedavi ın katalitik komponenti olan htert, evrensel bir tümör antijeni olarak son yıllarda ilgi çekmektedir. htert kaynaklı peptidlerin HLA-2 ile etkileşip işlendiği bilinmektedir. Antijenik peptidler, makrofaj ve dendritik hücreler gibi otolog antijen sunan hücreler (APC) tarafından işlenip endoplazmik retikuluma taşınarak MHC sınıf I lökosit antijen HLA-2 ile birleşmektedir. Ag-MHC kompleksleri, sitotoksik T-lenfositlerinin (CTL) reseptörlerine bağlanarak koruyucu immün yanıtı indüklemektedir. Prostat kanserli hastadan elde edilen periferik kan mononükleer hücrelerinin HLA-2 ile etkileşmiş ve htert ile transdüksiyonu sonucu anti-htert spesifik CTL ler elde edilmiştir. Bu CTL ler HLA-2 ye htert pozitif tümör hücrelerini lizis edebilme kapasitesine sahiptir ve aynı kişinin normal kan hücreleri ise bu immün yanıttan etkilenmemektedir 53

6 Dikmen, Dikmen ve Do an promotor bağımlı adenoviral tedavi Normal hücre negatif hücre Viral replikasyon blokajı Viral ajan: htert Adenovirüs Kanser hücresi pozitif hücre Viral replikasyon Hücre harabiyeti, virüs saçılımı Şekil 3. a yönelik gen tedavisi [37]. [34]. Vonderheide ve arkadaşlarının çalışmasında, htert kaynaklı peptid olan I540 (HLA)-A2 ye bağlanmış ve bu komplekse karşı oluşturulan sitotoksik T-lenfositler ile htert eksprese eden hücreler parçalanmıştır [35]. Bu cevabın, HLA2 negatif veya telomeraz negatif olan hücrelerde izlenmemesi, tedavi yan etkilerinin fazla olmayacağını düşündürmektedir. a yönelik immün tedavinin avantajı, telomerik kısalma ve büyüme duraklaması için gecikme fazının gerekli olmamasıdır. Yapılan araştırmalarda CTL nin prostat, akciğer, meme, kolon ve melanoma tümör hücrelerini öldürdüğü, ancak CD34 pozitif olan hematopoietik hücreler üzerinde etkili olmadığı saptanmıştır ki bu da, htert nin kök hücrelerde zayıf bir otoantijen olabileceğini göstermektedir. İleri evre tümörlerde etkili olması beklenmemekle birlikte, minimal rezidüel hastalığı olan veya kanser gelişimi açısından risk taşıyanlarda koruyucu amaçla immün tedavi uygulanması mümkündür [34,36]. 4. a yönelik gen tedavisi Tüm ileri evre kanserler htert eksprese ederken normal hücrelerde htert ekspresyonu olmaması, htert proksimal promotorunun üniversal bir gen tedavi sistemi kurmak amacıyla kullanılabilmesini düşündürmektedir. htert geni, transkripsiyon düzeyinde kontrol edildiği için sadece telomeraz ekspresyonu gösteren tümör hücreleri promotoru aktive edebilecektir. Bu nedenle plazmidlerin doğrudan tümör içine enjeksiyonu veya telomeraz promotorunu içeren adenoviral vektörler ile gen transferinin yapıldığı suicide gen stratejileri umut vadetmektedir. Tumor-specific Replication competent ADdenoviral (htertp-trad) gen tedavi yaklaşımında, adenoviral vektör hem normal hem de tümör hücrelerini infekte etmekte, ancak sadece telomeraz aktivitesine sahip hücrelerde replike olabilmektedir. eksprese eden hücrelerde çoğalan virüs, bir süre sonra çoğaldığı hücreyi parçalayarak çevreye yayılır ve aktivitesini koruduğu birkaç haftalık sürede komşu hücreleri infekte etmeye devam eder (Şekil 3) [37]. a yönelik gen tedavisinin avantajı, etkilerinin görülmesi için gecikme fazına gerek duyulmamasıdır. Bu nedenle tümör içine uygulanacak htertp-trad enjeksiyonlarının tümör boyutunda kısa sürede küçülme sağlayacağı düşünülmektedir. eksprese eden immün ve hematopoietik hücreler, adenovirüs ile kolayca infekte olmadıklarından bu tedaviden etkilenmeleri beklenmemektedir. Sistemik htertp-trad uygulamasından sonra, proliferasyon gösteren spermatositler, intestinal kriptler, bazal ve suprabazal epidermal hücrelerde görülecek yan etkilerin diğer sitotoksik ilaçların yan etkilerinden daha az olacağı tahmin edilmektedir. Kaynaklar 1. Holt SE, Wright WE, Shay JW. Multiple pathways for the regulation of telomerase activity. Eur J Cancer 1997; 33: Muniyappa K, Kironmai KM. Telomere structure, replication and length maintenance. Crit Rev Biochem Mol Biol 1998; 33: Cong Y, Wright WE, Shay JW. Human telomerase and its regulation. Microbiol Mol Biol Rev 2002; 66: Lindsey J, McGill NI, Lindsey LA, et al. In vivo loss of telomeric repeats with age in humans. Mutat Res 1991; 256: Muniyappa K, Kironmai KM. Telomere structure, replication and length maintenance. Critical Reviews in Biochemistry and Molecular Biology 1998; 33: Greider CW, Blackburn EH. Identification of a specific telomere terminal transferase activity in tetrahymena extracts. Cell 1985; 43: H ACETTEPE T IP D ERG S

7 Kanserde telomeraza yönelik tedavi stratejileri 7. Avilion AA, Piatyszek MA, Gupta J, et al. Human telomerase RNA and telomerase activity in immortal cell lines and tumor tissues. Cancer Res 1996; 56: Kim NW, Piatyszek MA, Prowse KR, et al. Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer. Science 1994; 266: Blackburn EH. Telomerases. Annu Rev Biochem 1992; 61: Feng J, Funk WD, Wang SS, et al. The RNA component of human telomerase. Science 1995; 269: Avilion AA, Piatyszek MA, Gupta J, et al. Human telomerase RNA and telomerase activity in immortal cell lines and tumor tissues. Cancer Res 1996; 56: Mergny J, Riou J, Mailliet P, et al. Natural and pharmacological regulation of telomerase. Nucleic Acids Research 2002; 30: Ford LP, Suh JM, Wright WE, et al. Heterogeneous nuclear ribonucleoproteins C1 and C2 associate with the RNA component of human telomerase. Mol Cell Biol 2000; 20: Lingner J, Hughes TR, Shevchenko A, et al. Reverse transcriptase motifs in the catalytic subunit of telomerase. Science 1997; 276: Armbruster BN, Banik SS, Guo C, et al. N-terminal domains of the human telomerase catalytic subunit required for enzyme activity in vivo. Mol Cell Biol 2001; 21: Keith WK, Bilsland A, Evans TR, et al. Telomerase-directed molecular therapeutics. Expert Rev Mol Med 2002; 22: Bodnar AG, Ouellette M, Frolkis M, et al. Extension of lifespan by introduction of telomerase into normal human cells. Science 1998; 279: Lichtsteiner SP, Lebkowski JS, Vasserot AP. Telomerase: A Target for Anticancer Therapy. Ann NY Acad Sci 1999; 886: Hahn WC, Stewart SA, Brooks MW, et al. Inhibition of telomerase limits the growth of human cancer cells. Nat Med 1999; 5: Zhang X, Mar V, Zhou W, et al. Telomere shortening and apoptosis in telomerase-inhibited human tumor cells. Genes Dev 1999; 13: Melana SM, Holland JF, Pogo BG. Inhibition of cell growth and telomerase activity of breast cancer cells in vitro by 3 - azido-3 -deoxythymidine. Clin Cancer Res 1998; 4: Ludwig A, Saretzki G, Holm PS, et al. Ribozyme cleavage of telomerase mrna sensitizes breast epithelial cells to inhibitors of topoisomerase. Cancer Res 2001; 61: Kanazawa Y, Ohkawa K, Ueda K, et al. Hammerhead ribozyme-mediated inhibition of telomeraseactivity in extracts of human hepatocellular carcinoma cells. Biochem Biophys Res Commun 1996; 225: Yokoyama Y, Takahashi Y, Shinohara A, et al. Attenuation of telomerase activity by a hammerhead ribozyme targeting the template region of telomerase RNA in endometrial carcinoma cells. Cancer Res 1998; 58: Norton JC, Piatyszek MA, Wright WE, et al. Inhibition of human telomerase activity by peptide nucleic acids. Nature Biotechnol 1996; 14: Glukhov AI, Zimnik OV, Gordeev SA, et al. Inhibition of telomerase activity of melanoma cells by antisense oligonucleotide. Biochem Biophys Res Commun 1998; 248: Kondo S, Kondo Y, Li G, et al. Targeted therapy of human malignant glioma in a mouse model by 2-5A antisense directed against telomerase RNA. Oncogene 1998; 16: Kondo Y, Koga S, Komata T, et al. Treatment of prostate cancer in vitro and in vivo with 2-5A-anti-telomerase RNA component. Oncogene 2000; 19: Gryaznov S, Pongracz K, Matray T, et al. Telomerase inhibitors-oligonucleotide phosphoramidates as potential therapeutic agents. Nucleosides Nucleotides and Nucleic Acids 2001; 20: Herbert B, Pits AE, Baker SI, et al. Inhibition of human telomerase in immortal human cells leads to progressive telomere shortening and cell death. Proc Natl Acad Sci USA 1996; 96: Eglia M, Gryaznov S. Synthetic oligonucleotides as RNA mimetics: 2 -modified RNAs and N3 -P5 phosphoramidates. CMLS 2000; 57: Gryaznov S, Asai A, Oshima Y, et al. Oligonucleotide N3 P5 thio-phosphoramidate telomerase template antagonists as potential anticancer agents. Nucleosides Nucleotides & Nucleic Acids 2003; 22: Gryaznov S, Pongracz K. Oligonucleotide N3 P5 thiophosphoramidates: synthesis and properties. Tetrahedron letters 1999; 40: Vonderheide RH, Schultze JL, Anderson KS, et al. Equivalent induction of telomerase-specific cytotoxic T lymphocytes from tumor-bearing patients and healthy individuals. Cancer Res 2001; 61: Vonderheide RH, Hahn WC, Schultze JL, et al. The telomerase catalytic subunit is a widely expressed tumor-associated Ag recognized by cytotoxic T lymphocytes. Immunity 1999; 10: Vonderheide RH, Anderson KS, Hahn WC, et al. Characterization of HLA-A3-restricted cytotoxic T lymphocytes reactive against the widely expressed tumor antigen telomerase. Clin Cancer Res 2001; 7: Shay JW, Wright WE. Telomerase: a target for cancer therapeutics. Cancer Cell 2002; 2: