BETA TALASEMİDE OKSİDATİF STRES

Transkript

1 T.C. ÇUKUROVA ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ BİYOKİMYA ANABİLİM DALI BETA TALASEMİDE OKSİDATİF STRES Ş. EFSUN ANTMEN YÜKSEK LİSANS TEZİ DANIŞMANI Prof. Dr. Levent KAYRIN ADANA-2005

2 TEŞEKKÜR Yüksek lisans öğrenimim boyunca bilgi ve deneyimleriyle bana yol gösteren, hoşgörü ve sabırla her konuda beni destekleyen tez danışmanım sayın Prof.Dr. Levent KAYRIN a teşekkürü borç bilirim. Eğitim ve tez çalışmama bilgi birikimleri ve görüşleriyle katkıda bulunan Biyokimya Anabilim Dalı öğretim üyelerine, asistanlarına, arkadaşlarıma ve bölüm çalışanlarına teşekkür ederim. Deneysel çalışmalarım boyunca bilimsel ve sosyal desteğini esirgemeyen Doç. Dr. Bülent ANTMEN e ve Pediatrik Hematoloji Bilim Dalı çalışanlarına sonsuz teşekkürler. Tez çalışmamı TF2003YL5 nolu proje olarak destekleyen Ç.Ü Rektörlüğüne ve Araştırma Projeleri Birimi ne teşekkür ederim. Yüksek lisans eğitimim boyunca sabır ve desteğini esirgemeyen aileme ve eşime şükranlarımı sunarım. Biyolog Efsun ANTMEN Adana/2005 iii

3 İÇİNDEKİLER KABUL VE ONAY ii TEŞEKKÜR iii İÇİNDEKİLER iv ŞEKİLLER DİZİNİ vi ÇİZELGELER DİZİNİ vii SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ viii ÖZET ix ABSTRACT x 1. GİRİŞ 1 2. GENEL BİLGİLER OKSİDATİF STRES SERBEST RADİKALLER REAKTİF OKSİJEN TÜRLERİ SÜPEROKSİT RADİKALİ(O 2 ) HİDROJEN PEROKSİT (H 2 O 2 ) HİDROKSİL RADİKALİ ( OH) SİNGLET OKSİJEN ( 1 O 2 ) NİTRİK OKSİT (NO ) SERBEST RADİKALLERİN ETKİLERİ DNA VE NÜKLEİK ASİTLERE ETKİLERİ PROTEİNLERE ETKİLERİ KARBOHİDRATLARA ETKİLERİ LİPİTLERE ETKİLERİ ANTİOKSİDAN SİSTEM REDÜKTE GLUTATYON (GSH) GLUTATYON PEROKSİDAZ ENZİMİ (GSH-PX) GLUTATYON REDÜKTAZ ENZİMİ (GSH-RD) GLUTATYON S TRANSFERAZ ENZİMİ (GST) SÜPEROKSİT DİSMUTAZ ENZİMİ (SOD) KATALAZ ENZİMİ (CAT) TİYOREDOKSİN SİSTEM UBİKİNON (KOENZİM Q-Q10) ASKORBİK ASİT (C VİTAMİNİ) KAROTENLER (A VİTAMİNİ) TOKOFEROLLER (E VİTAMİNİ) FLAVONOİDLER SELENYUM TRANSFERRİN VE LAKTOFERRİN ÜRİK ASİT BİLİRUBİN HAPTOGLOBİN (HP) SERULOPLAZMİN (CP) HEMOGLOBİN YAPISI VE SENTEZİ 23 iv

4 HEM YAPISI GLOBİN YAPISI TALASEMİ SENDROMLARI ALFA TALASEMİ BETA TALASEMİ TALASEMİ VE OKSİDATİF STRES TALASEMİ DAĞILIMI TALASEMİDE TEDAVİ GEREÇLER VE YÖNTEMLER GEREÇLER CİHAZLAR KİMYASAL MADDELER ÖRNEK TOPLAMA ANALİZ YÖNTEMLERİ HEMATOLOJİK ANALİZLER HEMOLİZAT HAZIRLANMASI GLUTATYON PEROKSİDAZ (GSH-PX) 34 ÖLÇÜM YÖNTEMİ GLUTATYON REDÜKTAZ (GSH-RD) 36 ÖLÇÜM YÖNTEMİ KATALAZ (CAT) ÖLÇÜM YÖNTEMİ GLUTATYON S TRANSFERAZ ( GST ) 39 ÖLÇÜM YÖNTEMİ SÜPEROKSİT DİSMUTAZ (SOD ) 41 ÖLÇÜM YÖNTEMİ MALONDİALDEHİD (MDA) ÖLÇÜM YÖNTEMİ HEMOGLOBİN TAYİNİ BULGULAR TARTIŞMA SONUÇLAR KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ 82 v

5 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1. : Oksijen molekülünün orbital yapısı 4 Şekil 2.2. : Vücuttaki major serbest radikaller ve serbest radikal 6 hasarı sonuçları Şekil 2.3. : Radikallerin yol açtığı hücre hasarı 13 Şekil 2.4. : İnsan dokularındaki major antioksidan enzimler ve bağlı yollar 15 Şekil 2.5. : Redükte Glutatyon (GSH) 16 Şekil 2.6. : Glutatyon redoks döngüsü 18 Şekil 2.7. : Hemoglobin A yapısı 23 Şekil 2.8. : Hem molekülü yapısı 24 Şekil 2.9. : Globin sentezi 25 Şekil : Globin gen kümeleri 26 Şekil : Periferik yaymada talasemik eritrositlerin hipokromileri 28 ve mikrositerliği Şekil : Talasemi,orak hücre anemisi ve diğer yaygın hemoglobin 30 hastalıklarının dünya üzerindeki yayılımı Şekil 4.1. : Kontrol grubu ve hasta grubu SOD değerlerinin karşılaştırılması 62 Şekil 4.2. : Kontrol grubu ve hasta grubu CAT değerlerinin karşılaştırılması 63 Şekil 4.3. : Kontrol grubu ve hasta grubu GST değerlerinin karşılaştırılması 63 Şekil 4.4. : Kontrol grubu ve hasta grubu GSH-Px değerlerinin 64 karşılaştırılması Şekil 4.5. : Kontrol grubu ve hasta grubu GSH-Rd değerlerinin 64 karşılaştırılması Şekil 4.6. : Kontrol grubu ve hasta grubu MDA değerlerinin karşılaştırılması 65 Şekil 4.7. : Kontrol grubu ve hasta grubu Wbc verilerinin karşılaştırılması 65 Şekil 4.8. : Kontrol grubu ve hasta grubu Rbc verilerinin karşılaştırılması 66 Şekil 4.9. : Kontrol grubu ve hasta grubu Hb verilerinin karşılaştırılması 66 Şekil : Kontrol grubu ve hasta grubu Hct verilerinin karşılaştırılması 67 Şekil : Kontrol grubu ve hasta grubu MCV verilerinin karşılaştırılması 67 Şekil : Kontrol grubu ve hasta grubu MCH verilerinin karşılaştırılması 68 Şekil : Kontrol grubu ve hasta grubu MCHC verilerinin karşılaştırılması 68 vi

6 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 2.1. : Radikal ve radikal olmayan oksijen türleri 1 Çizelge 2.2. : Oksidatif stres ile ilişkili bazı hastalıklar 5 Çizelge 2.3. : Oksijenin indirgenmesi 7 Çizelge 2.4. : Hidrofilik ve lipofilik fazda bazı antioksidanlar 14 Çizelge 2.5. : İnsan hemoglobinlerindeki globin zincirleri 24 Çizelge 2.6. : Beta talasemide eritrosit indeksi değişimi 28 Çizelge 2.7. : Beta talasemide hemoglobin düzeyleri 28 Çizelge 4.1. : Kontrol grubu hematolojik verileri 51 Çizelge 4.2. : Hasta grubu hematolojik verileri 52 Çizelge 4.3. : Kontrol grubu hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları 53 Çizelge 4.4. : Hasta grubu hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları 53 Çizelge 4.5. : Kontrol grubunda bulunan erkek çocukların 54 hematolojik verileri Çizelge 4.6. : Kontrol grubunda bulunan erkek çocukların 54 hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge 4.7. : Kontrol grubunda bulunan kız çocukların hematolojik verileri 55 Çizelge 4.8. : Kontrol grubunda bulunan kız çocukların 55 hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge 4.9. : Hasta grubunda bulunan erkek çocukların hematolojik verileri 56 Çizelge : Hasta grubunda bulunan erkek çocukların 56 hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge 4.11 : Hasta grubunda bulunan kız çocukların hematolojik verileri 57 Çizelge : Hasta grubunda bulunan kız çocukların 57 hematolojik verilerinin istatistiksel sonuçları Çizelge : Eritrositlerde antioksidan sistemde bulunan 58 enzim düzeylerinin ve MDA ölçümünde kullanılan yöntemlerin tekrarlanabilirliği Çizelge : Kontrol grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 59 enzimler ve MDA düzeyleri Çizelge : Hasta grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 60 enzimler ve MDA düzeyleri Çizelge : Kontrol grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 61 enzimler ve MDA düzeylerinin istatistiksel verileri Çizelge : Hasta grubunda eritrositlerde ölçülen antioksidan 61 enzimler ve MDA düzeylerinin istatistiksel verileri Çizelge : Kontrol ve hasta grubunun hematolojik verilerinin 61 ortalama, standart sapma değerleri ve iki grup arasındaki ilişki Çizelge : Kontrol ve hasta grubunun antioksidan enzimleri ve MDA 62 değerlerinin ortalama, standart sapma değerleri ve iki grup arasındaki ilişki vii

7 SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ α β δ ε ζ γ ATP CAT cgs cgcs Cp DNA EDTA FAD GS GSH GSH-Rd GPx e GSH-Px GSSG G6PD GST Hb Hct Hp IgG MCV MCH MCHC MDA MRP NADPH PUFA RBC RES RNS ROS SOD MnSOD ECSOD CuZnSOD Trx TrxR Alfa Beta Delta Epsilon Zeta Gamma Adenozintrifosfat Katalaz Gama Glutamil Transpeptidaz Gama Glutamil Sisteinil Sentetaz Seruloplazmin Deoksiribonükleik asit Etilen diamin tetraasetik asit Flavin adenin dinükleotid Glutatyon sentaz Redükte glutatyon Glutatyon redüktaz Ekstrasellüler glutatyon peroksidaz Glutatyon peroksidaz Okside glutatyon Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz Glutatyon S transferaz Hemoglobin Hematokrit Haptoglobin İmmunglobin G Ortalama eritrosit hacmi Ortalama eritrosit hemoglobini Ortalama eritrosit hemoglobin konsantrasyonu Malondialdehit Multidrug resistans protein Redükte nikotinamid adenin dinukleotid fosfat Çoklu doymamış yağ asitleri Eritrosit Retiküloendotelyal sistem Reaktif nitrojen türleri Reaktif oksijen türleri Süperoksit dismutaz Manganez süperoksit dismutaz Ekstrasellüler süperoksit dismutaz Bakır-çinko süperoksit dismutaz Tiyoredoksin Tiyoredoksin redüktazı viii

8 ÖZET β-talasemide Oksidatif Stres Hücreler metabolik sürecin bir parçası olarak devamlı serbest radikal ve reaktif oksijen türlerini oluştururlar. Bu serbest radikaller ve reaktif oksijen türleri kompleks bir antioksidan sistem tarafından nötralize edilirler. Oksidatif stres, reaktif oksijen türleri veya serbest radikaller ile antioksidan sistem arasında oluşan dengesizliktir ve bu dengesizlik önemli hücre kompartımanlarında geri dönüşümsüz hasara neden olabilir. Talaseminin tüm patofizyolojik özellikleri, globin zincir sentezindeki dengesizlikle ilişkilidir. Globin zincirlerinin yapımındaki şiddetli dengesizlikler farklı talasemi fenotiplerinin ortaya çıkmasına yol açar. Eğer alfa zincir yapımında bozukluk varsa alfa talasemi, beta zincir yapımında bozukluk varsa beta talasemi olarak isimlendirilir. Beta talasemide beta globin zincir yapımındaki dengesizlik nedeniyle artan alfa globin zincirleri, eritrositlerin zar yapılarını bozarak ve eritrosit öncül hücrelerinin erken yıkımını tetikleyerek eritrositlere zarar verirler. Eşleşmemiş, kararsız globin zincirleri oksidatif strese neden olan zincir reaksiyonları başlatan süperoksit ve hidroksil radikallerini oluştururlar. Ülkemizde talasemi yaygınlığı %2 dir. Bu çalışmada beta talasemi hastalarında antioksidan durum ve oksidatif hasarın incelenmesi amaçlanmış olup yaşları 16 nın altında olan beta talasemi hastası çocuklar (n=35) ve sağlıklı kontrol grubu (n=40) örnekleri kullanılmıştır. Tüm örneklerin hematolojik verileri incelendikten sonra eritrosit süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), glutatyon peroksidaz (GSH-Px), glutayon redüktaz (GSH-Rd), glutatyon s transferaz (GST) enzim ölçümleri antioksidan durumun, plazma malondialdehit (MDA) analizi ise lipit peroksidasyonunu gözlemek için yapılmıştır. GSH-Px, GSH-Rd, CAT ölçümü Beutler yöntemiyle, MDA ölçümü tiyobarbitürik asit yöntemiyle ve GST ölçümü ise glutatyonun 1 kloro 2,4 dinitro benzen ile konjugat oluşturma yöntemiyle yapılmıştır. Kontrol grubu ile hasta grubu karşılaştırıldığında hematolojik verilerde anlamlı farklar gözlenmiş ancak antioksidan sistem ve MDA düzeyinde anlamlı fark gözlenmemiştir. Sonuçta oksidatif stres araştırması için talasemi majorlü olgularda yapılan çalışmaların transfüzyon almamış olgularda yapılmasının daha sağlıklı olabileceği düşünülmüştür. Anahtar sözcükler: Antioksidan, lipit peroksidasyonu, oksidatif stres, serbest radikaller, talasemi, ix

9 ABSTRACT Oxidative Stress in β-thalassemia Cells continuously produce free radicals and reactive oxygen species as a part of metabolic process. These free radicals are neutralized by a complex antioxidant system. Oxidative stres is an imbalance between reactive oxygen species or free radicals and antioxidant system and can cause irreversible damage at important cell compartments. All pathophysiological properties of thalassemia are related to imbalance of globin chains. Several imbalance of producing globin chains can cause constitute different thalassemia fenotypes. If the production of alpha chains is impaired, is called alpha thalassemia and if the production of beta chains is impaired is called beta thalassemia. Because of the imbalance with production of beta globin chains excess free alpha globin chains are deleterious to the red cells, damaging the membran structures and triggering premature destruction of the red cell precursors. Unpaired, instabile globin chains generate the superoxide and hydroxyl radicals that start the chain reactions which can cause oxidative stres. Prevalance of Turkey for thalassemia is %2. In this study we aimed to indicate antioxidant status and oxidative damage in beta thalassemia patients. For this purpose the children with beta thalassemia (n=35) and healthy controls (n=40), who ages under sixteen, were used. Erythrocyte superoxide dismutase(sod), catalase(cat), glutathione peroxidase(gsh-px), glutathione redüktase(gsh-rd), glutathione s transferase(gst) were measured to show antioxidant status and plasma malondialdehyde(mda) analyzed to show lipid peroxidation. GSH-Px, GSH-Rd, CAT enzyme activity were assayed according to beutler, MDA were assayed thiobarbituric acid and GST were assayed according to glutathione conjugate with 1 choloro 2,4 dinitrobenzen methods. Control and patient groups when compared, there are significant interaction with hematological results but there are no significant interaction with antioxidant system and MDA level. In this result studying for oxidative stres is reliable in untransfused thalassemia major patients transfused patients. Key words: Antioxidant, free radicals, lipid peroxidation, oxidative stress, thalassemia. x

10 1.GİRİŞ Patolojik bir olayı takiben organizmada meydana gelen fizyopatolojik değişiklikler temelde belirli mekanizmaların harekete geçmesi ile oluşmaktadır. Serbest radikaller, reaktif oksijen türleri veya oksijen metabolitleri olarak da adlandırılabilen bir kısım maddelerin ortaya çıkması ile hücre ölümü, doku hasarı ve nekroz sonucunda, organ veya sistemlerde işlev yetersizliği meydana gelmektedir 1. Serbest radikaller, dış yörüngesinde eşleşmemiş en az bir elektron içeren moleküllerdir. Özellikleri, dengesiz ve tek olan elektronu çiftlemek için diğer moleküller ile tepkimeye girmeye yatkın olmalarıdır. Anyonik, katyonik veya nötral konumda olabilirler 2. Serbest radikaller etkilerini protein, lipit, karbohidrat ve DNA oksidasyonu yaparak; hücre zarında, hücre organellerinde ve DNA larda patolojik değişiklikler oluştururarak gösterirler. Bunların sonucunda işlev bozukluğu veya hücre ölümü olmakta ya da mutant özellikler kazandırarak tümör oluşturabilmektedirler 1. Organizmada essansiyel maddelerin oksidasyonuna neden olabilecek moleküllerin etkilerini önleyen veya geciktirebilen maddelere ise antioksidan denilmektedir. Oksidanlar ve antioksidanlar arasındaki dengesizlik aşırı derecede reaktif oksijen türlerinin yapılmasına ve oksidatif hasara neden olur. Bu durum oksidatif stres olarak belirtilir 3,4. Talasemide genetik bozukluk hemoglobin zincir veya zincirlerinin düşük miktarlarda veya hiç sentezlenememesidir. Bozukluk aynı hastada α, β, γ, δ globin zincirlerini veya bunların bazı kombinasyonlarını da etkileyebilir. Globin zincirlerinin yapımındaki dengesizlik ve çok fazla eşleşmemiş globin zincir içeriği eritrositlerin kemik iliğinde ve dolaşımda yıkımına neden olmaktadır. Beta talasemide, beta globin zincir sentezi yeterli miktarda yapılamaz iken serbest α zincirlerinin yıkım ürünleri ise eritrosit zarlarında hasara neden olur. Aşırı demir, serbest oksijen radikalleri, eritrosit zarındaki lipit ve protein gibi bileşenlere ve hücre içi organellere hasar verir, rijid, dehidrate eritrosit oluşumu, rijit inklüzyonların varlığı, eritrositlerin dalaktan geçiş sırasında da yıkılmasına neden olur 5. 1

11 Oksijen taşınımından sorumlu hemoglobin hücrelerin gereksindiği yaklaşık bütün oksijeni akciğerden dokulara taşımanın yanı sıra, hücresel solunumun iki son ürünü olan H + ve CO 2 yi de dokulardan akciğerlere ve böbreklere taşır. Ayrıca bir hemoglobin alt birimine O 2 bağlanması hemoglobin üç boyutlu yapısında değişikliğe neden olur ve bu durumdan en çok alfa ve beta globin zincirleri etkilenir, dolayısıyla globin zincir bozukluğunda hemoglobinin O 2 bağlaması etkilenecektir. Sonuçta eritrositler sürekli olarak oksitleyici ajanlara maruz kaldıklarından oksidatif hasardan korunmak için enzimatik ve nonenzimatik antioksidan sistemler geliştirmişlerdir 6. Bu çalışmamızda eritrositlerde bulunan antioksidan sistem ve oksidatif stres durumunu araştırmak amacıyla beta talasemi majorlü hasta grubu ve kontrol grubu olarak talasemi tanısı konmamış çocukluk yaş grubu bireyler seçilmiş, her iki grupta da aynı parametrelerin çalışılması planlanmıştır. Talasemik eritrositlerde antioksidan sistem ve oksidatif stresi araştırmak amacıyla yapılan bu çalışmada lipit peroksidasyonu ürünü olan MDA, peroksitleri suya metabolize eden katalaz ve glutatyon peroksidaz, okside glutatyonu redükte glutatyona dönüştürerek glutatyonun hücre içi döngüsünü sağlayan glutatyon redüktaz ve elektrofilik bileşiklerin glutatyon ile konjugasyonunu sağlayan glutatyon s transferaz enzim aktivitelerinin ölçülmesini amaçladık. 2

12 2.GENEL BİLGİ 2.1. Oksidatif Stres Vücuttaki fizyolojik aktivitenin doğal ürünü olan serbest radikalleri, organizma doğuştan kazandığı çok hassas bir donanımla oksidan-antioksidan denge olarak tanımlanabilecek bir çizgide tutmaya çalışır. Bu dengenin bozulması oksidatif strese yol açar 7. Reaktif oksijen türleri (ROS), reaktif nitrojen türleri (RNS) ve sülfür merkezli radikaller oksidan sınıfına girer. Ancak tüm reaktif türleri radikal değildirler. Radikal olan ve olmayan reaktif türleri Çizelge 2.1 de özetlenmiştir 8,9. Çizelge 2.1. Radikal ve radikal olmayan reaktif oksijen türleri 3 Reaktif Türleri Radikal Non-Radikal Hidroksil ( OH) Peroksinitrit (ONOO - ) Alkoksil (L(R)O ) Hipoklorit ( - OCl) Hidroperoksil (HOO ) Hidroperoksit (L(R)OOH) Peroksil (L(R)OO ) Singlet oksijen ( 1 O 2 ) Nitrik oksit (NO ) Hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) Süperoksit (O 2) Ozon (O 3 ) Canlı organizma için önemli olan yapıları, fiziksel ve kimyasal özellikleri, hücresel kaynakları, rol oynadıkları tepkimeler ve etkileri ile çeşitli klinik durumların patogenezinde rol oynayan serbest radikaller, atomik yörüngelerinde eşleşmemiş elektron bulundurarak, bağımsız olarak varolabilen moleküllerdir. Eşleşmemiş elektronun kazandırdığı en önemli özellik birçok radikal ile bu elektronun paylaşılabilinmesidir 10,11,12. 3

13 Serbest radikallerin en önemli tepkimeleri, moleküler oksijen ve onun reaktif türlerinin olduğu tepkimelerdir. Şekil 2.1 de oksijenin orbital yapısı ve oluşan reaktif türleri belirtilmiştir 13. Şekil.2.1. Oksijen molekülünün orbital yapısı 12 Demir, bakır, mangan, molibten gibi geçiş metalleri de dış yörüngelerinde birer elektron taşımalarına rağmen radikal karakter göstermezler. Serbest radikal kabul edilen atom ve moleküller elektron dağılımlarının yanı sıra termodinamik yapıları ve lokal kinetik reaktiviteleri ile değerlendirilir 14,15. Antioksidan ise; okside olabilen substrata göre ortamda daha az derişimde bulunan ve bu substratın oksidasyonunu belirgin şekilde geciktiren veya engelleyen madde olarak tanımlanabilir. Bu tanıma göre antioksidanların fizyolojik rolü, serbest radikalleri içeren kimyasal tepkimelerin sonucunda hücresel bileşenlere gelebilecek zararı önlemektir 16. Aerobik metabolizmada denge, serbest radikal oluşumu ve bunların benzer hızla antioksidan sistemler tarafından uzaklaştırılmasıyla karakterizedir. Geri dönüşümsüz oksidatif hasarın birikimi ile önce hücre daha sonra doku ve organ sistemlerinde yapısal ve işlevsel bozukluklar ortaya çıkabilir. Oksidatif stres ile ilişkili hastalıkların bazıları çizelge 2.2 de belirtilmiştir 17. 4

14 Çizelge 2.2. Oksidatif stres ile ilişkili bazı hastalıklar 17 Astım Ateroskleroz Serebral vaskuler hastalıklar Kronik obstruktif pulmoner hastalık Konjestif kalp yetmezliği Diabet Hipertansiyon Grip Miyokard enfaktüs Pnömoni Hepatit Kanser İnflamasyon hastalıklar 2.2. Serbest Radikaller Serbest radikaller hücrede metabolik dengenin bir parçası olarak devamlı yapılırlar 18. Serbest radikaller 3 yolla meydana gelirler 19, Kovalent bağlı normal bir molekülün, her bir parçasında ortak elektronlardan birisinin kalarak homolitik bölünmesi. X : Y X + Y 2. Normal bir molekülden tek bir elektronun kaybı veya bir molekülün heterolitik bölünmesi. Heterolitik bölünmede kovalent bağı oluşturan her iki elektron atomların birinde kalır. Böylece serbest radikaller değil, iyonlar meydana gelir. X:Y X: + Y + 3. Normal bir moleküle tek bir elektronun eklenmesi A + e - A - 5

15 Organizmada oksidatif strese neden olan radikal yapımı endojen ve çevresel faktörleri içeren çeşitli mekanizmalarla gerçekleşir (Şekil 2.2) 16. Endojen faktörler mitokondriyal sızıntı, solunumsal patlama, enzim reaksiyonları, otooksidasyon tepkimeleridir. Çevresel faktörlerin başlıcaları ise sigara dumanı, hava kirliliği, ultraviyole ışınları, iyonize radyasyon ve ksenobiotiklerdir 16. Örneğin bir nefes sigara dumanında yaklaşık serbest radikal bulunmaktadır, aşırı egzersiz ile mitokondri oksijeninin yaklaşık %2-5 i serbest radikal yapımında kullanılır 18,21. Çevresel Faktörler Serbest radikal yapımı Endojen Faktörler O 2, H 2 O 2 Geçiş Metalleri Fe +2,Cu + OH Lipit peroksidasyonu DNA Hasarı Protein Hasarı Doku Hasarı Şekil 2.2. Vücuttaki önemli serbest radikaller ve serbest radikal hasarı sonuçları Serbest radikallerin aerobik hücrelerde en önemli tepkimeleri moleküler oksijen ve onun reaktif türleri (süperoksit anyonu ve hidroksil radikali), peroksitler ve geçiş metallerinin olduğu tepkimelerdir 13. 6

16 2.3. Reaktif oksijen türleri Normal şartlarda oksijen kararlı, kokusuz, tatsız, renksiz, sudaki çözünürlüğü sınırlı bir gazdır. İnsan hayatı için hem gerekli hem de toksik olan bir moleküldür. Oksijenin iki eşleşmemiş elektronlarının ayrı orbitallerde aynı yönde dönmesi sonucu oksijen bir radikaldir 22. Moleküler oksijen elektron transferiyle suya kadar indirgenir. Bu yol 4 elektron gerektirir ve bu yolda reaktif ara moleküller oluşur ki bunlar süperoksit, hidrojen peroksit ve hidroksi radikalleridir. Bunlar önemli oksidatif stres ajanları olup reaktif oksijen türleri (ROS) olarak adlandırılır (Çizelge 2.3) 23,24. Çizelge 2.3. Oksijenin indirgenmesi O 2 + e + H + HO 2 Hidroperoksil radikali HO 2 H + + O 2 Süperoksit radikali O 2 + 2H + + e H 2 O 2 Hidrojen peroksit H 2 O 2 + e OH - + OH Hidroksil radikali OH + e + H + H 2 O Süperoksit Radikali (O 2 ) Oksijenli ortamda yaşam, oksidatif fosforilasyon ile ATP üretimi açısından önemli ölçüde yarar sağlarken bazı tehlikeleri de beraberinde getirir. Oksidatif fosforilasyonun ana bileşeni olan oksijene bir elektron eklenmesi ile süperoksit radikali oluşur (Şekil 2.1) 4. Süperoksit radikali serbest radikal olmasına karşın reaktifliği yüksek değildir. Kendiliğinden, özellikle elektronca zengin bir ortam olan iç mitokondri zarında solunum zinciriyle birlikte oluşur. Süperoksit ayrıca iskemi-reperfüsyonda aktive olan ksantin oksidaz gibi flavoenzimlerce endojen olarak da oluşturulur. Lipooksijenaz ve siklooksijenaz ise diğer süperoksit oluşturan enzimlerdir 25,26,27. Süperoksit ayrıca yüksek enerjili elektromanyetik dalgalar gibi fiziksel ve kimyasal ajanlar ile, bazı bileşiklerin otooksidasyonunda ve fagositozda oluşur 28. 7

17 Süperoksit kimyası çözelti ortamına bağlı olarak farklılıklar gösterir. Süperoksit sulu çözeltide askorbik asit, tiyol gibi molekülleri oksitleyebilen zayıf bir oksitleyici ajandır. Bunun yanında süperoksit güçlü bir indirgeyici ajan olup sitokrom c ve ferrik-edta gibi çeşitli demir komplekslerini indirgeyebilir 29. Süperoksit, hidrojen peroksit ve moleküler oksijenin oluştuğu dismutasyon tepkimesinden dolayı sulu ortamda hızlıca kaybolur. Diğer taraftan SOD enzimiyle katalizlenen dismutasyon tepkimesi ise spontan dismutasyondan 10 9 kat daha hızlıdır 30. 2O 2 + 2H + H 2 O 2 + O Hidrojen Peroksit (H 2 O 2 ) Hidrojen peroksit serbest radikal olmamasına karşın biyolojik zarlara nüfuz edebilmesi ve daha reaktif oksijen türlerinin yapım aşamasında aldığı rolden dolayı önemlidir. Diğer bir önemli işlevi ise hücre içi sinyal molekülü olarak görev yapmasıdır 24. Hidrojen peroksit süperoksit radikalinin dismutasyon tepkimesi sonucu oluşur. Ürat oksidaz, glukoz oksidaz, d-aminoasit oksidaz gibi birçok enzim oksijene iki elektron transfer ederek direk hidrojen peroksit oluşturabilirler 19. Hidrojen peroksitin redoks özelliği ve geçiş metalleri varlığında yüksek reaktif serbest radikalleri oluşturmasına karşı vücut, savunma sistemi geliştirmiştir. İstenmeyen hidrojen peroksit katalaz, glutatyon peroksidaz ve diğer oksidazlar ile hücreden uzaklaştırılır Hidroksil radikali ( OH) Hidroksil radikalinin major oluşumu suyun yüksek enerji ile iyonizasyonudur. H 2 O OH + H + e aq - H 2 O 2 8

18 Hidrojen peroksit ise süperoksit ile tepkimeye girerek en reaktif ve zarar verici serbest oksijen radikali olan hidroksil radikali oluşturmak üzere kolaylıkla yıkılabilir. H 2 O 2 + O 2 OH + OH + O 2 Bu tepkimeye Haber-Weiss tepkimesi denir ve tepkime katalizörsüz ortamda oldukça yavaşken, demirin katalizörlüğünde çok hızlıdır. O 2 + Fe +3 O 2 + Fe +2 OH Fe +2 + H 2 O 2 Fe +3 + OH + O 2 + H 2 O 2 OH + OH + O 2 Katalizörlü tepkimede demir önce ferrik formdan (Fe +3 ) süperoksit ile ferröz forma (Fe +2 ) indirgenir. Ferröz form Fenton tepkimesi ile ferrik forma tekrar yükseltgenirken OH ve OH üretilir 22, Singlet Oksijen ( 1 O 2 ) Singlet oksijen eşleşmemiş elektron içermediği için serbest radikal değildir. Bununla birlikte dönme yönlerinin farklılığından dolayı oksijenin yüksek reaktif formudur (Şekil 2.1) 29. Moleküler oksijende paylaşılmamış iki dış elektron aynı yönde, ayrı yörüngelerdedir. Singlet oksijende ise elektron dönme yönleri birbirine zıttır ve oluşturdukları delta veya sigma formuna göre aynı veya ayrı yörüngelerde bulunurlar. Aynı yörüngede ise delta singlet oksijen, ayrı yörüngelerde iseler sigma singlet oksijen formu oluşur. Sigma formu delta formuna göre daha enerjetik olup kolayca delta formuna dönüşebilir 12, Nitrik Oksit (NO ) NO enzimatik olarak nitrik oksit sentaz enzimi tarafından L-arjinin den sentezlenir. 9

19 L-arjinin + NADPH + O 2 L-sitrullin + NO + NADP + NO eşleşmemiş elektron bulundurmasına rağmen birçok biyomolekül ile kolayca tepkimeye giremez, öte yandan peroksil, alkil gibi diğer serbest radikallerle kolayca tepkimeye girerek daha az reaktif moleküller oluşturur 24. Yüksek miktarlarda O 2 yapımı NO ile paraleldir ve birbirlerini etkileyerek OH ve NO 2 oluşumuna neden olurlar. Tepkime sırasında ise peroksinitrit (ONOO - ) ve peroksinitröz asit (ONOOH) ara ürünleri oluşur 24. NO + O 2 ONOO - ONOO - + H + ONOOH ONOOH OH + NO Serbest Radikalerin Etkileri DNA ve Nükleik Asitlere Etkileri İyonize edici radyasyona maruz kalınması ile oluşan serbest radikaller DNA yı etkileyerek hücrede mutasyona neden olurlar. Sitotoksik etki, büyük oranda nükleik asit baz modifikasyonlarından kaynaklanan kromozom değişikliklerine veya DNA daki diğer değişikliklere bağlıdır. Hidroksil radikali deoksiriboz ve bazlarla kolayca reaksiyona girer. Hidrojen peroksit zarlardan kolayca geçip hücre çekirdeğine ulaşarak DNA hasarına, hücrede fonksiyon bozukluğuna ve hatta hücre ölümüne neden olabilir 32, Proteinlere Etkileri Proteinler, radikallerin etkilerine lipitlere oranla daha az hassastır ve amino asit dizilişlerine bağlı olarak etkilenirler. Özellikle doymamış bağ ve sülfür içeren moleküllerin serbest radikallerle etkileşimi yüksektir. Bu nedenle triptofan, tirozin, fenil alanin, histidin, metionin ve sistein gibi amino asitleri içeren proteinler serbest radikallerden daha kolay etkilenirler. İmmungulobin G ve albumin gibi disülfit bağı fazla olan proteinlerin ise üç boyutlu yapıları bozulur 22,29,32. 10

20 Karbohidratlara Etkileri Monosokkaritlerin otooksidasyonu sonucu hidrojen peroksit, peroksit ve okzoaldehitler meydana gelir. Açığa çıkan okzoaldehitler proteinlere bağlanabilme özelliklerinden dolayı antimitotik etki göstererek etki eder ve böylece kanser ve yaşlanmaya neden olabilirler 32. Serbest oksijen radikalleri bağ dokunun önemli bir bileşeni olan hiyalüronik asit gibi karbohidratların parçalanmalarına da yol açabilirler Lipitlere Etkileri Serbest radikallerin biyolojik dokulardaki doymamış yağ asitlerine etkileri lipit peroksidasyonu olarak bilinir. Biyolojik zarların yapısı lipit ve proteinden oluşmaktadır, lipit peroksidasyonu lipitlere olduğu kadar zar proteinlerine de zarar verir 12. Lipit peroksidasyonu, çoklu doymamış yağ asitlerinin(pufa) reaktif oksijen türleri tarafından peroksitler, alkoller, malondialdehit, etan ve pentan gibi ürünlere yıkılma tepkimelerine denilmektedir. Yağ asitlerinin peroksidasyonu sonrasında açığa çıkan ürünler zar geçirgenliğini ve akışkanlığını ciddi şekilde etkileyip hücre ve organel içeriklerinin ayrılmasına neden olan kopma ve kırılmalara yol açar. Lipit peroksidasyonu ile meydana gelen zar hasarı geri dönüşümsüzdür 4,29. Zincir reaksiyonu şeklinde olan lipit peroksidasyonu, organizmada oluşan radikal etkisiyle çoklu doymamış yağ asitleri üzerindeki metilen grubundan bir hidrojen atomu uzaklaştırılması ile başlar. Bu reaksiyon başlangıç reaksiyonu olarak isimlendirilir. Hidrojen atomu uzaklaşması ile karbon atomu üzerinde eşleşmemiş elektron kalır ve bunun sonucu yağ asidi zinciri bir lipit radikali(l ) niteliği kazanır. LH + R L +RH Oluşan lipit radikalinin molekül içi çift bağlarının pozisyonunun değişmesiyle konjuge dienler oluşur. Bir alkenin iki çift bağı arasında bir tane tekli bağ varsa bu yapı konjuge dien olarak isimlendirilir. Bu şekilde moleküler düzenleme sağlanmış olur. Lipit radikalinin moleküler oksijen ile etkileşmesi sonucu lipit peroksil radikali(loo ) oluşur. 11

21 L + O 2 LOO Peroksil radikali diğer komşu yağ asitlerini etkileyerek yeni lipit radikallerinin oluşmasına neden olurken kendisi de açığa çıkan hidrojen atomunu alarak lipit hidroperoksitlerine (LOOH) dönüşür. Böylece peroksidasyon başladıktan sonra kendi kendine yayılabilmekte ve çok sayıda yağ asidi zinciri lipit hidroperoksitlerine dönüşebilmektedir. Bu tepkime ilerleme reaksiyonu olarak isimlendirilir 4,29,33,34,35. LH + LOO L + LOOH Oldukça kararlı olan lipit hidroperoksitleri lipit peroksidasyonunun ilk ürünüdür. Lipit peroksidasyonunun sürekli olarak devam ettiği durumlarda E vitamini gibi zincirleme tepkimeyi sonlandırıcı bir antioksidan ile lipit peroksidasyonu sonlanabilir 36. L + E Vit LH + E Vit E Vit + L LH + Okside E Vitamini Geçiş metalleri varlığında lipit hidroperoksitleri bu metallerin redoks döngüsüyle birlikte lipit peroksidasyonunu başlatabilecek radikallerin oluşumuna neden olabilirler. Lipitlerden araşidonik asit metabolizması sonucu serbest radikal üretimine enzimatik lipit peroksidasyonu, diğer radikallerin sebep olduğu lipit peroksidasyonuna ise non-enzimatik lipit peroksidasyonu denir 22. Lipit proksidasyonunun son bileşeni olan malondialdehit (MDA) peroksidasyona uğramış çoklu doymamış yağ asitlerinin bölünmesiyle oluşan üç karbonlu bir dialdehidtir ve oksidatif durumun göstergesi olarak yaygın kullanılır. Bu dialdehid biyolojik ortamda makromoleküllerin NH 2 ve/veya SH gruplarına bağlı veya serbest olarak bulunur. Oluşan MDA; deformasyon, iyon transportu, enzim aktivitesi ve hücre yüzey bileşenlerinin agregasyonu gibi zar özelliklerinin değişmesine yol açar 4,37. 12

22 2.5. Antioksidan Sistem Organizma içindeki radikaller, geri dönüşümsüz hücre hasarına yol açan birçok tepkimeye neden olurlar (Şekil 2.3). Süperoksit ve hidroksil radikalleri hücresel, mitokondrial, nükleer ve endoplazmik zarlarda lipit peroksidasyonunu başlatırlar. Geçirgenlikteki artış mitokondrial hasara neden olan Ca +2 un hücreye akın etmesine neden olur 9. Şekil 2.3. Radikallerin yol açtığı hücre hasarı. Hücre ve organ sistemlerini reaktif oksijen türlerine karşı koruyabilmek için organizma karmaşık bir sistem geliştirmiştir. Bu sistem endojen ve eksojen orjinli, etkileşimli ve birlikte çalışan çeşitli bileşenler içerir 38. Antioksidan sistem hasar öncesi radikal oluşumunu önler, oksidatif hasarı onarır, hasara uğramış molekülleri temizler ve mutasyonları önler. Nötralize olması gereken çeşitli reaktif ara ürünleri ve indirgenmesi gereken okside biyomolekülleri etkileyen hem lipofilik hem hidrofilik fazda pek çok antioksidan çizelge 2.4 de özetlenmiştir

23 Çizelge 2.4. Hidrofilik ve lipofilik fazda bazı antioksidanlar Antioksidan Faz Etki Süperoksit Dismutaz(SOD) Hidrofilik O 2 nin H 2 O 2 ve O 2 e dismutasyonu Katalaz(CAT) Hidrofilik H 2 O 2 nin H 2 O ve O 2 e dismutasyonu Glutatyon peroksidaz(gsh-px) Hidrofilik veya R-OOH nin R-OH indirgenmesi Lipofilik Glutatyon redüktaz (GSH-Rd) Hidrofilik Okside glutatyonun indirgenmesi Glutatyon S Transferaz (GST) Hidrofilik R-OOH nin GSH ile konjugasyonu Metallotieninler Hidrofilik Geçiş metalleriyle nötralizasyon Tiyoredoksinler Hidrofilik R-S-S-R nin R-SH a indirgenmesi Glutatyon Hidrofilik R-S-S-R nin R-SH a indirgenmesi Serbest radikal temizleyicisi GSH-Px ve GST nin kofaktörü Ubikinon Lipofilik Serbest radikal temizleyicisi Lipid peroksidasyonunda korun Askorbik asit Hidrofilik Serbest radikal temizleyicisi Tokoferol kazanımı Enzimlerin redükte formda korunması Karotenler Lipofilik Serbest radikal temizleyicisi O 2 baskılayıcı Tokoferol Lipofilik Selenyum absorbsiyonunu arttırır Serbest radikal temizleyicisi Lipid peroksidasyonunda korun Selenyum Amfifilik Tiyoredoksin, GSH-Px yapıtaşı Antioksidanları hücre içi, hücre dışı ve zar antioksidanları olarak sınıflandırabiliriz. Bunlara örnek vermek gerekirse; Hücre içi antioksidanlar için süperokit dismutazları, katalazı, glutatyon peroksidazı, glutatyon S transferazı, glutatyon redüktazı, 14

24 Zar antioksidanları için E vitaminini, β karoteni, koenzim Q yu, Hücre dışı antioksidanlar da ise transferini, laktoferrini, haptoglobini, hemopeksini, albumini, seruloplasmini, ekstrasellüler süperoksit dismutazı, ekstrasellüler glutatyon peroksidazı, bilirubini, askorbik asiti sayabiliriz 29. Reaktif oksijen türlerine karşı primer savunma enzimatik ve enzimatik olmayan intrasellüler antioksidanlarca yapılır (Şekil 2.4 ) 40. Şekil 2.4. İnsan dokularındaki major antioksidan enzimler ve bağlı yollar. CuZnSOD (bakır-çinko SOD), MnSOD (manganez SOD), ECSOD (ekstrasellüler SOD), CAT (katalaz), GSH-Px (glutatyon peroksidaz), GSH-Rd (glutatyon redüktaz), GSH (redükte glutatyon), GSSG (okside glutatyon), GST (glutatyon S transferaz), MRP (Multidrug resistans protein), G6PD (glukoz-6- fosfat dehidrogenaz), cgs (gama glutamil transpeptidaz), cgcs (gama glutamil sisteinil sentetaz),(glutamat sistein ligaz), GS (glutatyon sentaz), GPx e (ekstrasellüler glutatyon peroksidaz) 41 15

25 Redükte Glutatyon (GSH) Tripeptid yapıdaki GSH (L-γ- glutamil-l-sisteinil-glisin) oksidatif ve elektrofilik stres ve radyasyona karşı hücrelerin korunmasında önemli rol oynar (Şekil 2.5). GSH sitozolik GSH redoks döngüsünde substrat olarak rol alırken, ROS a karşı direkt olarak da savunma yapabilir 42. Şekil 2.5. Redükte Glutatyon (GSH). Hücrede milimolar derişimde bulunan GSH primer olarak redükte formda(gsh) bulunur ancak okside formda disülfüd dimeri (GSSG) olarakta bulunabilir 43,44. GSH ın hücresel seviyesi γ-glutamil transpeptidaz, aminoasit transporterları, glutatyon sentetaz, glutatyon peroksidaz ve glutatyon redüktazı içeren çoklu bir enzim sistemi tarafından korunur Glutatyon Peroksidaz Enzimi (GSH-Px)(EC ) Glutatyon Peroksidaz organik hidroperoksitlerin (lipit hidroperoksitler, DNA hidroperoksitler) veya hidrojen peroksitin GSH tarafından indirgenmesi tepkimesini katalizler de Mills tarafından keşfedilmiştir 42. H 2 O GSH GSH-Px 2 H 2 O + GSSG GSH-Px ROOH + 2 GSH ROH + GSSG + H 2 O Glutatyon Peroksidaz enzimi iki gruba ayrılabilir: selenyum bağlı ve selenyum bağlı olmayan. Selenyum bağlı grupta hidrojen peroksit ve diğer organik peroksitleri indirgeyen beş üye vardır, selenyum bağımsız Glutatyon Peroksidaz ise 16

26 hidrojenperoksit ile ihmal edilebilir bir aktifliğe sahip olup sadece organik hidroperoksitleri redükler 45. Selenyum bağımlı üyelerden, GSH-Px 1 veya hücresel GSH-Px bütün hücrelerde eksprese edilen, tetramerik yapıda, sitozolik bir enzimdir. Eritrosit, böbrek ve karaciğerde yüksek miktarda bulunur. GSH-Px 2 veya gastrointestinal GSH-Px insanlarda karaciğer ve gastrointestinal kanalda eksprese edilir; böbrek, kalp, akciğer, plasenta ve uterusta bulunmaz. GSH-Px 3 veya plazma GSH-Px plazmanın lipit kısmından izole edilmiş bir glikoproteindir, akciğer, plazma ve diğer ekstrasellüler sıvılarda bulunur. GSH-Px 4 veya fosfolipit GSH-Px sitozolde, mitokondri ve hücre zarında bulunur. GSH-Px 5 veya epididimal GSH-Px selenyum bağlı değildir ve yalnız epididimiste eksprese edilir. GSH-Px 6 hücresel GSH-Px ile homoloji gösterir, burun epiteli ve embriyolarda eksprese edilir 42,46, Glutatyon Redüktaz Enzimi (GSH-Rd)(EC ) Okside glutatyon (GSSG) NADPH bağlı flavo enzim olan Glutatyon Redüktaz tarafından redükte formuna (GSH) indirgenir 16,24,42. GSH-Rd GSSG + NADPH 2GSH + NADP Glutatyon redüktazın kalıtımı otozomal dominanttır, 8. kromozom üzerindedir. Glutatyon peroksidaz ile benzer doku dağılımı gösterir. Glutatyon redüktaz flavin adenin dinükleotid (FAD) içerir, NADPH tan bir elektronun GSSG nin disülfüd bağlarına aktarılmasını katalizler. Bu nedenle NADPH serbest radikal hasarına karşı gereklidir ve major kaynağı pentoz fosfat yoludur (Şekil 2.6)

27 Şekil 2.6. Glutatyon redoks döngüsü Glutatyon-S-Transferaz Enzimi (GST)(EC ) GST memeli türlerinde elektrofilik bileşenlerin GSH ile konjugasyonunu katalizleyen izoenzimlerin oluşturduğu çoklu bir gen ailesinden oluşur; alfa,mu, teta, pi, zeta, sigma, kappa ve omega olarak gösterilen 8 esas gen sınıfı ile düzenlenmiştir. Alfa kromozom 6 da, mu kromozom 1 de, teta kromozom 22 de, pi kromozom 11 de, zeta kromozom 14 de, sigma kromozom 4 de, kappa ve omega kromozom 10 da kodlanır 33,48. GST karsinojenleri, çevresel etmenleri, ilaç ve geniş spektrumlu kasenobiotikleri metabolize eder. Mikrozomal GST belirlendiyse de GST aktivitesi esasen sitozoliktir 42. GST iki subüniteden oluşmuş dimerik bir proteindir. Bu subünitelerden her biri glutatyon bağlanma bölgesi (G bölgesi) ve buna komşu elektrofilik substrata bağlanan nispeten hidrofobik olan bölge içerir. Bunun yanında çeşitli izoenzimlerde transport veya düzenleyici fonksiyonu olduğu düşünülen substrat bağlanmayan bölge de belirlenmiştir. GST, hidroksialkenler, lipit peroksidasyonunun ürünlerinden propenaller ve DNA hidroperoksitleri gibi endojen zararlı bileşiklerin detoksifikasyonunu sağlayabildiği için oksidatif strese karşı savunmaya katılır, bunun yanında epoksidler ve kinonlar gibi maddelerin biotransformasyonunda elektrofilik ksenobiotikler ve/veya reaktif ara ürünler oluşabilir 33,45. GST enziminin teta ve alfa sınıfları selenyum bağlı olmayan Glutatyon peroksidaz aktivitesi gösterirler, GST pi formu lipit hidroperoksitleri ve hidroksialkenler, malondialdehitler ve propenalleri inaktive eder. GST pi ayrıca hassas 18

28 SH- grubuyla ROS ile direkt reaksiyona girerek disülfüd yapımının inaktif olmasına neden olur Süperoksit Dismutaz Enzimi (SOD)(EC ) Reaktif oksijen türlerine karşı primer antioksidan enzim Süperoksit Dismutaz dır. Formları arasında aminoasit dizilimi, aktif metal bölgesi ve hücresel dağılım farkı vardır. Prokaryotlarda Fe ve Mn-SOD bulunurken, ökaryotlarda Mn, CuZn ve ekstrasellüler SOD (EC-SOD) bulunur 49. Mn-SOD homotetramer yapıdadır, her subünitesinde bir Mn iyonu bulunur, ve 88 kda ağırlığındadır. Hücresel Mn-SOD içeriği kalp, beyin, karaciğer, böbrek gibi yüksek metabolik aktivitesi olan dokularda daha fazladır. CuZn-SOD 32 kda ağırlığında olup memelilerde en çok karaciğer, böbrek, eritrosit ve santral sinir sisteminde bulunur. İki protein subünitesi içerir her subünitede Cu ve Zn atomları bulunur. EC-SOD ise en çok vaskülatür, akciğer, uterus ve tiroid bezlerinde bulunur 41,50. SOD, süperoksit molekülünün hidrojen peroksite ve moleküler oksijene tepkimesini katalizler 16,22,24. SOD 2 O 2 + 2H + H 2 O 2 + O 2 Tepkimede süperoksit anyonu Cu +2 ve bir arjinin rezidüsünün guanido grubuna bağlanır. Bu şekilde süperoksitten bir elektron Cu +2 a transfer olurken Cu +1 ve moleküler oksijen oluşur. İkinci süperoksit anyonu Cu +1 dan bir elektron,bağlanma ortağından ise iki elektron alarak hidrojen peroksiti oluşturur 22,41. SOD-Cu +2 SOD-Cu +1 + O 2 SOD-Cu +1 + O 2 + 2H + SOD-Cu +2 + H 2 O Katalaz Enzimi (CAT)(EC ) Katalaz çoğu organizmada bulunan ve hem içeren homotetramerik bir enzimdir. Peroksizomlarda yüksek derişimlerde bulunur 51,52. 19

29 Katalaz yapı ve işlevlerine göre bifonksiyoneldir. Tüm prokaryot ve ökaryotlarda bulunur. Her subünite bir hem grubu ve NADPH molekülü içerir. Birçok katalazda NADPH molekülü yüzeye yakın ve sıkıca bağlıdır. Bu kofaktör peroksitin oksijene dönüşümünde katalazın inaktivasyonunu koruduğu ve etkisini arttırdığı gözlenmiştir 52. Katalaz hidrojen peroksitin su ve moleküler oksijene dismutasyonunu katalizler. 2H 2 O 2 CAT O 2 + 2H 2 O Katalaz ayrıca fenol, alkol gibi farklı substratların, hidrojen peroksitin çift redüksiyonu ile detoksifikasyonunu sağlar. H 2 O 2 + RH 2 CAT R + 2 H 2 O Glukoz-6-fosfat eksikliklerinde NADPH ın olgun eritrostlerdeki düşüklüğünün katalazda inhibisyona neden olduğu ve hemolizin GSH-Rd/GSH-Px den çok katalazdan kaynaklandığı düşünülmektedir Tiyoredoksin sistem Tiyoredoksin sistem oksidoredüktaz enzim aktivitesi gösteren tiyoredoksin (Trx) ile tiyoredoksin redüktazı (TrxR) içeren iki antioksidan enzim sistemi içerir. Memeli ve prokaryotik hücrelerde bulunur. Tiyoredoksin redüktaz NADPH kullanarak tiyoredoksinin disülfit aktif bölgesini ve pek çok substratı redükler. Yapılan çalışmalarda, tiyoredoksinin insanda immun sistem düzenlenmesiyle ilişkili olduğu ve farklı genlerce kodlanan üç farklı varyantı gösterilmiştir.tiyoredoksin redüktaz izoenzimleri, her subünitesinde bir FAD bulunduran NADPH bağlı oksidoredüktazlardır. Tiyoredoksin redüktazın ilk saflaştırılması 1977 de yapılmıştır Ubikinon (Koenzim Q) Ubikinon esas olarak mitokondride elektron transport zincirinin bir parçası olarak kullanılmaktır, bunun yanında ubikinon düşük derişimlerde plazmada ve hücre zarlarında lipit peroksidasyonuna karşı koruyucu antioksidan olarak bulunur. 20

30 Ubikinonun yenilenmesi lipoamid dehidrogenaz ve kısmen tiyoredoksin redüktazı da içeren enzim ailesinin diğer üyeleriyle gerçekleştirilir 53, Askorbik Asit (C Vitamini) Askorbik asit insan plazmasında ve hücre zarında bulunan, zarı geçebilen major antioksidanlardan biridir.suda çözünebilir düşük moleküler ağırlıklı bu antioksidan kollojen sentezi, demir absorpsiyonu ve hücrelerin redoks durumunun korunmasında gereklidir. Tokoferoller, peroksidler ve süperoksit gibi reaktif oksijen türlerini redükler. Askorbik asitin antioksidan olarak esas görevi lipit hidroperoksitlerin oluşumunu engellemektir. Bu da aterosklerotik plak oluşumunu engellemede önemli rol üstlendiğini gösterir Karotenler (A Vitamini) Alkoller(retinoller), aldehitler(retinaller) ve retinoik asitler başta olmak üzere A vitamininin çeşitli türleri bulunur. A vitamininin en etkili ve en yaygın türü β- karoten dir. Suda çözünmeyen bu bileşik havada okside olarak inaktif ürünler oluşturur 56. A vitamininin antioksidan etkisi yanında gerekli olduğu sistemik etkiler hücre ve intrasellüler zar dayanıklılığının sağlanması, epitel dokunun bütünlüğünün sürdürülmesi, ve glikoprotein sentezidir Tokoferoller (E Vitamini) α, β, γ, δ olmak üzere dört farklı tokoferol formu bulunur. Biyolojik olarak en yaygın ve en aktif E vitamini şekli olan d-α-tokoferoldür. Yağda çözünen fakat suda çözünmeyen bu bileşikler oksijen bulunmayan ortamlarda asit ve sıcaklığa dayanıklıdır 57. Eşleşmemiş elektronlarla reaksiyona giren ve indirgeyebilen hidroksil grubu içerir. Radikal reaksiyonları sırasında zincir kırıcı etkiye sahiptir. Glutatyon ve askorbik asit ile antioksidan etkisi artar 13,57, Flavonoidler Flavonoidler çeşitli sebze, meyve ve otlarda bulunan polifenol grubu doğal kimyasallardır. Doğada altı binin üzerinde flavonoid vardır. Antioksidan, 21

31 antiarteriyosklerotik, antiinflamatuvar, antitümör, antitrombojenik, antiviral, antialerjik etkileri vardır. Flavonlar, flavonollar, flavanonlar; kateşinler, isoflavonlar, antosiyanidinler olarak altı sınıfa ayrılırlar. Flavonoidler, önemli metal şelatörleri ve serbest radikal temizleyicisi gibi rol oynarlar. Flavonoidler tarafından temizlenebilen ve formasyonları inhibe edilebilen reaktif oksijen ürünleri; süperoksit anyonları, hidroksil radikali, alkol radikali, peroksil radikali ve perhidroksi radikalidir. Flavonoidler, radikallerin reaktif kısımlarıyla etkileşerek, reaktif oksijen ürünlerini stabilize ederler Selenyum Selenyum yiyeceklerde selenosistein öncü maddesi olan selenitler, selenatlar ve selenometiyonin olarak bulunur. İn vitro hayvan deneylerinde Se bileşiklerinin apoptozisi ve transforme hücrelerde hücre siklusunu indirgediği gösterilmiş ve bundan dolayı da kanser hücre gelişimini durduğu ileri sürülmüştür 58, Transferin ve Laktoferrin Transferin kanda demir taşıyan bir β-globindir. Laktoferrin ise dolaşımdaki serbest demiri düşük ph larda bağlar 22, Ürik Asit İnsanlarda pürin nükleozidleri olan adenozin ve guanozin katabolizmasın temel ürünü ürik asittir. Metal bağlayıcı ve serbest radikal temizleyicisi olarak görev alır Bilirubin Bilirubinin büyük bir kısmı ömrünü dolduran eritrositlerin parçalanmasından kaynaklanır ve dolaşımdan karaciğer tarafından alınır ve biyotransformasyona uğrar, safra ve idrarla atılır. Antioksidan olarak peroksil radikalleri toplar Haptoglobin (Hp) Haptoglobin hemoglobini geri dönüşümsüz olarak bağlayan bir α 2 -glikoproteindir. Ekstrasellüler hemoliz sırasında hemoglobin eritrositlerden salınır ve serbest hemoglobin dimerleri tümüyle haptoglobine bağlanır

32 Seruloplazmin:(Cp) Seruloplazmin total serum bakırının yaklaşık %95 ini içeren α 2 -globulindir. Cp nin primer fizyolojik rolü plazma redoks reaksiyonlarıyla ilişkilidir. Serbest ferrik iyonları ve ferritin bağlayan bölgelerin varlığı gibi faktörlere bağlı olarak oksidan veya antioksidan olarak işlev görür. Cp nin demirin iyonik durumunu düzenlemede ve toksik demir ürünleri oluşmaksızın demirin transferine girmesinde. yaşamsal önemi vardır Hemoglobin Yapısı ve Sentezi Hemoglobin eritrositlerin kırmızı rengini sağlayan ve oksijen taşıma yeteneği kazandıran bileşenidir. Protein yapısındaki hemoglobin oksijeni akciğerlerden dokulara, karbondioksiti ise dokulardan akciğerlere taşımaktadır 62. Molekül ağırlığı yaklaşık dalton olup molekülün %96 sını globin proteini, %4 ünü de hem yapısı oluşturmaktadır (Şekil 2.7) 63. Şekil 2.7. Hemoglobin A yapısı Hem Yapısı Hem grubu dört pirol halkasından meydana gelen protoporfirin halka sistemi ile bir demir atomundan oluşmaktadır. Meten köprüleri ile birbirine bağlanan dört pirol halkasından meydana gelen tetrapirol halkasına yan zincir olarak dört metil, iki vinil ve iki propiyonat eklenmiştir.(şekil 2.8) Protoporfirin halkasına zincirler onbeş farklı 23

33 şekilde bağlanabilmektedir. Biyolojik sistemde protoporfirin IX olarak isimlendirilen izomerinin bulunduğu belirlenmiştir 60. Şekil 2.8. Hem molekülü yapısı Molekülde Protoporfirin IX halkasının merkezine prostetik grup olarak demir yerleşir. Hem dönüşümlü olarak oksijenle bağlanması ancak demir ferröz (Fe 2+ ) formunda iken olur. Demir ferrik (Fe 3+ ) duruma okside olduğunda hem oksijene bağlanamaz ve methemoglobin olarak isimlendirilir. Hemoglobinin globin proteininden ayrı olarak demir serbest halde oksijene bağlanamaz Globin Yapısı İki farklı globin zinciri kombine olarak hemoglobini oluşturur. Bu zincirlerden biri alfa iken diğeri non-alfa zinciridir. Embriyogenezin ilk haftaları dışında globin zincirlerinden biri daima alfadır (Çizelge 2.5) 64. Çizelge 2.5. İnsan hemoglobinlerindeki globin zincirleri 65 Embriyonik hemoglobinler gower 1- ζ 2, ε 2 gower 2- α 2, ε 2 Portland- ζ 2, γ 2 Fetal Yetişkin hemoglobin hemoglobinleri hemoglobin F- α 2, γ 2 hemoglobin A- α 2, β 2 hemoglobin A 2 - α 2, δ 2 24

34 Embriyoda ilk sentezlenen globin zinciri zeta (ζ ) ve alfa (α) zincirine benzeyen epsilondur (ε). Beş altı haftalık gestasyon öncesinde Hb Gower 1 (ζ 2, ε 2 ) major hemoglobin olarak gözlenir. Hb Gower 2 (α 2, ε 2 ) 4-13 haftalar arası embriyoda gözlenir, diğer bir erken dönem hemoglobini ise Portland ( ζ 2, γ 2 ) dır.hb F (α 2, γ 2 ) fetal hayatın major hemoglobinidir.(şekil 2.9) Normal erişkin hemoglobininde Hb A %97 oranındadır ve 9 haftalık fetusta gösterilebilir. Hb A 2 erişkin hemoglobininin %2.5 ini oluşturur 66. Şekil 2.9. Globin sentezi Globin komponentlerini şifreleyen α benzeri genler16. kromozomda, β benzeri genler 11. kromozomda yer alır 62. α globin gen kümesi üç fonksiyonel gen içeir; ζ geni, α 1 geni ve α 2 geni. Gen delesyonları veya zincir sentez eksikliği veya yokluğu sonucu α-talasemi oluşur. β globin gen kümesi ise ε geni, γ geni, δ geni ve β geni olmak üzere beş gen içerir (Şekil 2.10) 63. β globin geni, β globin zincirindeki 146 aminoasidi kodlamak için gerekli bilgiyi, 3 ekson, 2 intron ve 5, 3 düzenleyici bölgelerden oluşan yaklaşık 1.8 kb üzerinde taşımaktadır

35 Şekil Globin gen kümeleri 2.7. Talasemi Sendromları Normal bir erişkinde yapısal olarak birbirinden farklı üç hemoglobin vardır; bunlar Hb A, Hb F, ve Hb A 2 dir. Talasemi bu üç farklı hemoglobinin yapısındaki dört (α,β,δ,γ) farklı globin zincirlerinden bir veya birden fazlasının yapım azlığı veya hiç yapılamama durumudur 68. Talasemi ilk kez Detroitli bir çocuk hekimi olan Thomas Cooley tarafından 1925 yılında derin anemisi, dalak büyümesi, büyüme geriliği, ve kemik deformiteleri gibi benzer bulguları olan çocuklarda ayrı bir hastalık olarak tanımlanmıştır 69. Talasemi otozomal resesif geçiş gösteren heterozigot formda taşıyıcılığa, homozigot formda hastalığa yol açan kronik hemolitik bir anemidir 70. Talasemi sınıflandırması yetersiz globin zincir yada zincirlerine göre yapıldığında, α zincir sentezinin yokluğu yada eksikliği α-talasemi, β zincir sentezinin yokluğu yada eksikliği β talasemi olarak adlandırılır Αlfa Talasemi α-talasemide en sık rastlanılan patoloji gen delesyonudur. Dört α geninden bir tanesi delesyona uğradığında α + -talasemi, (sessiz talasemi veya α- talasemi-2), iki α geni delesyona uğradığında α o -talasemi (α-talasemi taşıyıcılığı veya α-talasemi-1) adı verilen taşıyıcılık, üç α-geni delesyona uğradığında ise Hb H (β 4) hastalığı adı verilen hastalık ortaya çıkar. Hb Bart s (γ 4 ) (hidrops fetalis) ise dört α-geni de delesyona uğramıştır, bu durumda intra uterin tedavi yapılmazsa fetal ölüm veya doğumu takiben 1-2 dakika içinde bebek ölümü gerçekleşir 68,71,72. 26