FARKLI BOR DOZLARININ BEZELYE HATLARININ TEMEL FİZYOLOJİK, BİYOKİMYASAL VE ANATOMİK ÖZELLİKLERİ ÜZERİNE ETKİSİNİN BELİRLENMESİ

Transkript

1 TÜRKİYE BİLİMSEL VE TEKNİK ARAŞTIRMA KURUMU THE SCIENTIFIC AND TECHNICAL RESEARCH COUNCIL OF TURKEY FARKLI BOR DOZLARININ BEZELYE HATLARININ TEMEL FİZYOLOJİK, BİYOKİMYASAL VE ANATOMİK ÖZELLİKLERİ ÜZERİNE ETKİSİNİN BELİRLENMESİ Tarım, Ormancılık ve Veterinerlik Araştırma Grubu (TOVAG) Farm, Forest and Sciences Research Grant Group

2 Farklı Bor Dozlarının Bezelye Hatlarının Temel Fizyolojik, Biyokimyasal ve Anatomik Özellikleri Üzerine Etkisinin Belirlenmesi Proje No: 110O527 Yrd. Doç. Dr. Mehmet HAMURCU Yrd. Doç. Dr. Ahmet TAMKOÇ Yrd. Doç. Dr. Tijen DEMİRAL Doç. Dr. Erdoğan E. HAKKI Doç. Dr. Canan ÖZDEMİR Yrd. Doç. Dr. Nilda ERSOY MART 2012 KONYA

3 ÖNSÖZ Bezelye (Pisum sativum L.) insan ve hayvan beslenmesinde kullanılan önemli bir baklagil bitkisi olması ile ülkemizde baklagiller içerinde ekim alanı ve üretim bakımından önemli bir yer tutmaktadır. Bitkiler büyümeleri için dokularında farklı konsantrasyonlarda bulunmak üzere makro (N, K, Ca, Mg, P ve S) ve mikro (Fe, Zn, Mn, Cu, B, Cl, Mo ve Ni) elementlere ihtiyaç duyarlar. Karbon, oksijen ve hidrojenle birlikte bu 14 element tüm bitki dokularının ve generatif kısımlarının büyüme ve gelişmeleri için mutlak gereklidir. Yapılan araştırmalar mikro elementlere tepki bakımından bitkilerin çok geniş bir varyasyon gösterdiklerini ortaya koymaktadır. Mikroelementlerin hem fazlalığı hem de noksanlığı bitki gelişimini sınırlandırmaktadır. Bitkilerde stres faktörlerinin en önemlilerinden biri olan mikro element eksikliği veya toksisitesi; metabolizmanın işlevini engellemekte ve bitkide hasarlara neden olabilmektedir. Bitkiler diğer streslerde olduğu gibi bor ile baş edebilmek için de biyokimyasal ve moleküler mekanizmalar gerçekleştirebilmektedirler. Orta Anadolu Bölge topraklarında büyük oranda mikro element problemleri yaşanmaktadır. Bu elementlerin başında da bor gelmektedir. Bu çalışma ile, bezelye genotiplerinde bor noksan ve toksisite koşullarında meydana gelen fizyolojik değişimler hakkında daha fazla bilgiye ulaşılarak, daha sonra yapılacak olan ıslah ve bitki besleme çalışmalarına ışık tutmak hedeflenmiştir. Bu maksatla daha önce yapılmış olan çalışmalardan faydalanarak bitki materyali olarak Hamurcu ve ark., (2006) tarafından yapılan bir araştırmada bora tepkileri belirlenmiş olan. Pisum sativum L. türüne ait olan meyvesi ve tohumu yenen yemeklik S2 hattı ile Pisum arvense L. türüne ait olan 602 yemlik hat, Taşkent ve Özkaynak yemlik tescilli çeşitleri kullanılarak özellikle Orta Anadolu Bölgesi nde yapılmış ve halen devam eden çalışmaların sonuçlarının değerlendirilmesi, pratik bazı uygulamalara hız kazandırılması, mikroelement-noksan bölgelerde takviyeye en iyi cevap veren genotiplerin çeşit geliştirmede kullanımı veya yüksek i

4 mikroelement içeren alanlarda en iyi yetişen varyetelerin bu özelliğinin de aynı şekilde bir seçim parametresi olarak kullanılması amacı ile bezelye hatlarının bor noksanlığı/toksisitesi koşullarında geliştirdiği savunma mekanizmasının açığa kavuşturulması, bitkilerin patojen zararına karşı dayanıklılığını ve duyarlılığını etkileyen önemli unsurlardan biri olan bor elementinin bitki organlarının dışa yakın hücrelerinde zarların incelmesi veya kalınlaşması, hücre boylarının ve enlerinin artması veya azalması gibi anatomik değişikliklerin belirlenmesi temel hedef olmuştur. Bu amaçlar doğrultusunda hazırlanarak Türkiye Bilimsel ve Teknik Araştırma Grubu na (TÜBİTAK) sunulan bu proje TOVAG-110O527 proje numarasıyla desteklenmiştir. Yrd. Doç. Dr. Mehmet HAMURCU ii

5 İÇİNDEKİLER ÖNSÖZ... i İÇİNDEKİLER... iii TABLO LİSTESİ... v ŞEKİL LİSTESİ... viii RESİM LİSTESİ... x ÖZET... xi ABSTRACT... xiii TEŞEKKÜR... xv 1- GİRİŞ GENEL BİLGİLER Bitkilerde Stres Faktörleri ve Savunma Sistemleri Bor un Bitkiler Üzerindeki Etkileri Enzimlerin ve Hormonların Bor İle İlişkileri Bitkisel Hormonların Bitki Gelişimi Üzerine Etkileri GEREÇ VE YÖNTEM Materyal Bitki materyallerinin temini Metot Deneme serilerinin hazırlanması Analiz yöntemleri Büyüme parametreleri Bağıl su içeriği Bitkilerde bor analizi Biyokimyasal parametrelerin ölçümü Enzim ekstraktlarının hazırlanması Antioksidan enzim aktivite analizleri Süperoksit dismutaz (SOD; süperoksit: süperoksit oksidoredüktaz, EC ) enziminin aktivite tayini Peroksidaz (POX; EC ) enzim aktivitesinin belirlenmesi: Katalaz (CAT; EC ) enzim aktivitesinin belirlenmesi Glutasyon redüktaz (GR; EC ) enziminin aktivite tayini Askorbat peroksidaz (APX; EC ) enziminin aktivite tayini Prolin analizi Lipit peroksidasyonun belirlenmesi iii

6 3.3. Anatomik İnceleme Metotları Gen Ekspresyon Analizleri RNA İzolasyonu cdna Sentezi Prob yöntemi ile Kantitatif Real Time PCR (qrt-pcr) Hormon Analizleri Ekstraksiyon yöntemi Veri Analizleri BULGULAR Büyüme Parametreleri Bulguları Gövde ve kök yaş ağırlığı Gövde ve kök kuru ağırlığı Gövde ve kök boyu Bağıl Su İçeriği Bor Konsantrasyonu Bulguları Gövde ve kök bor konsantrasyonu Prolin Bulguları Lipid Peroksidasyon Bulguları Antioksidan Enzim Aktivite Sonuçları Süper oksit dismutaz enzim aktiviteleri (SOD) Peroksidaz enzim aktiviteleri (POX) Katalaz enzim aktiviteleri (CAT) Glutasyon redüktaz enzim aktiviteleri (GR) Askorbat peroksidaz enzim aktiviteleri (APX) Hormon Bulguları İndol asetik asit (IAA) Düzeylerinde Meydana Gelen Değişimler Giberellik Asit (GA 3 ) Düzeylerinde Meydana Gelen Değişimler Absisik Asit (ABA) Düzeylerinde Meydana Gelen Değişimler Anatomik Bulgular Gen Ekspresyon Analizleri RNA Ekstraksiyonu ve cdna sonuçları: Ekspresyonun optimizasyon çalışmaları: SONUÇLAR VE TARTIŞMA KAYNAKLAR iv

7 TABLO LİSTESİ Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök yaş ağırlık değerleri (g bitki -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök kuru ağırlık değerleri (g bitki -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök boyu (cm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin bağıl su içeriği (%). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama, ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök bor konsantrasyonu (mg kg -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde prolin değerleri (umol/gr FW). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde lipid peroksidasyon düzeyleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen SOD aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı v

8 evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen POX aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen CAT aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen GR aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen APX aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve köklerinde ölçülen IAA miktarları (µg kg -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve köklerinde ölçülen GA 3 miktarları (µg kg -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve köklerinde ölçülen ABA miktarları (µg kg -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin köklerine ait trake çapı anatomik ölçümleri (μm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden vi

9 itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin köklerine ait trakeid çapı anatomik ölçümleri (μm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ait trake çapı anatomik ölçümleri (μm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ait trakeid çapı anatomik ölçümleri (μm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ait palizat parankima çapı anatomik ölçümleri (μm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Tablo Özkaynak çeşidine ait örneklerinin spektrofotometrede okunan değerleri Tablo Bezelye kök örnekleri sonuçları Tablo Bezelye yaprak örnekleri vii

10 ŞEKİL LİSTESİ Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök yaş ağırlık değerleri (g bitki -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök kuru ağırlık değerleri (g bitki -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök boyu (cm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin bağıl su içeriği (%). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök bor konsantrasyonu (mg kg -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde prolin değerleri (umol/gr FW). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde lipid peroksidasyon dzeyleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen SOD aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı viii

11 evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen POX aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen CAT aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen GR aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen APX aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Şekil Bezelye kök örneklerinde S18 ile Normalize PsCP EkspresyonuTablo Bezelye yaprak örnekleri Şekil Bezelye yaprak örneklerinde S18 ile Normalize PsCP Ekspresyonu ix

12 RESİM LİSTESİ Resim 1. Bitki Fizyolojisi Laboratuvarları Resim 2. Bezelye hat ve çeşitlerine ait tohumların çimlendirme işlemleri Resim , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin bor uygulamalarına tepkilerini gösterir resimler Resim bezelye hattı örneklerine ait kök anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) Resim bezelye hattı örneklerine ait gövde anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) Resim bezelye hattı örneklerine ait yaprak anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) Resim 7. S2 bezelye hattı örneklere ait kök anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) Resim 8. S2 bezelye hattı örneklerine ait gövde anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) Resim 9. S2 bezelye hattı örneklerine ait yaprak anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) Resim 10. Taşkent bezelye çeşidi örneklerine ait kök anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) Resim 11. Taşkent bezelye çeşidi örneklerine ait gövde anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) Resim 12. Taşkent bezelye çeşidi örneklerine ait yaprak anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) Resim 13. Özkaynak bezelye çeşidi örneklerine ait kök anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) Resim 14. Özkaynak bezelye çeşidi örneklerine ait gövde anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) 94 Resim 15. Özkaynak bezelye çeşidi örneklere ait yaprak anatomik kesitleri (Ölçek 50µm).. 96 Resim 16. Bitki örneklerine ait köklerde yan kök oluşumu Resim 17. Sağ üstten itibaren örneklerin agaroz jele yükleme sırası Resim 18. Örnek jel görüntüsü (üstte PsCP geni, altta ise S18) Resim 19. Sol: Fermantas 50 kb marker ve PsCP geni / Sağ: Fermentas 200 kb DNA ladder S18 geni x

13 ÖZET Bitkilerde mikroelementlerin hem fazlalığı hem de noksanlığı bitki gelişimini sınırlandırmakta olup önemli stres faktörleri olarak metabolizmanın normal işlevini engellemekte ve bitkide hasarlara neden olabilmektedir. Bitkiler diğer streslerde olduğu gibi bor fazlalığı ve noksanlığı ile baş edebilmek için de bazı biyokimyasal ve moleküler mekanizmalarını harekete geçirebilmektedirler. Bazı antioksidan enzimler aracılığıyla verilen yanıtların bor noksanlığı ve toksisitesinin oluşturduğu hasarı azalttığı rapor edilmiştir. Çalışmamızda, bora tepkileri daha önce belirlenmiş olan Pisum sativum L. türüne ait olan meyvesi ve tohumu yenen yemeklik S2 hattı ile Pisum arvense L. türüne ait olan yemlik hat, Taşkent ve Özkaynak yemlik tescilli çeşitlerine 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 dozlarında uygulanmış olan borun büyüme parametreleri (kök, gövde), bağıl su içeriği, bitkilerde biriken bor miktarları, prolin, malondialdehit miktarları ve süperoksit dismutaz izozimleri (SOD), askorbat peroksidaz (APX), katalaz (CAT), peroksidaz (POX) ve glutasyon redüktaz (GR) gibi antioksidant enzim aktiviteleri, enzim aktivitelerinin belirlenmesi ve bor toksisitesi/noksanlığı koşullarında bitkinin geliştirdiği savunma mekanizmasının incelenmesi, bor eksikliği veya fazlalığının bezelye bitkisinin anatomik yapısında meydana getirdiği muhtemel değişimlerin belirlenmesi ve bezelyede hormonal değişimlerden etkilendiği bilinen serin karboksipeptidaz (PsCP) enzimini kodlayan genin ekspresyon düzeylerinde farklı bor uygulamalarına bağlı olarak meydana gelen değişimler araştırılmıştır. Bezelye hat ve çeşitlerine farklı seviyede uygulanan borun gövde ve kök ün yaş, kuru ağırlık ve uzunlukları bor uygulamasında en fazla azalma oranları S2 hat ve Taşkent çeşidinde, bitkilerde en yüksek bor konsantrasyonu 200 mg B kg -1 dozunda ve S2 hattında tespit edilmiştir. Bor uygulamasına bağlı olarak, hat ve Özkaynak çeşidinde SOD aktivitesinin arttığı askorbat peroksidaz enzim aktivitelerinin de hattında en yüksek seviyede olduğu, katalaz aktivite değerlerinin 3. gün yapılan örneklemede ve S2 bezelye hatlarında azalma gösterirken, 7. günde B uygulamalarıyla artış gösterdiği, POX aktiviteleri genel olarak B dozundaki artışlarla azalma gösterdiği, Glutasyon redüktaz aktivite oranlarının ve S2 bezelye hatlarında Taşkent ve Özkaynak çeşitlerinden daha fazla miktarda olduğu belirlenmiştir. Bezelye hat ve çeşitlerinde 0. gün örneklemelerinde prolin ve malondealdehit değerleri en yüksek ve S2 hatlarında elde edilmiştir. IAA düzeyleri dikkate alındığında; hattı ve Taşkent çeşidinde örnekleme zamanındaki değişimlere bağlı olarak IAA düzeylerinin artış gösterdiği, hat ve çeşitler xi

14 aralarında kıyaslandığında gövde ve kök ekstraktlarında GA 3 ün artışı ve bu artışın Özkaynak çeşidinde daha belirgin olduğu tespit edilmiştir. ABA düzeyleri ise, örnekleme zamanlarına bağlı olarak değişim göstererek gövde ekstraktlarında ABA da meydana gelen artış en fazla hattında belirlenmiş, bor uygulaması ile birlikte gövdede ABA düzeylerinde önemli bir değişme olmaz iken kök aksamında ise ABA düzeylerinde azalma gözlenmiştir. Anatomik özellikler; örneklerin kısımlarına, örnek çeşidine ve uygulamalara göre farklılıkların yanında benzerlikler de gösterirken, bitkilerin gelişim sürecinde etkili olan bir hormon, giberallik asit, tarafından regüle edilen PsCP enzimini kodlayan genin RNA ekspresyon seviyesi ile uygulanan farklı B seviyelerinde genin ifadesindeki değişikliklerde kök ve gövdedeki analizlerde birbirine zıt bir profil ortaya koyduğu gösterilmiştir. Anahtar Sözcükler: Bezelye, bor, prolin, MDA, antioksidan enzimler, IAA, ABA, GA xii

15 ABSTRACT Microelement deficiencies and availability in excess are important stress factors that prohibit metabolic function and by giving damage to plant they delimit normal plant development. Alike with other stress factors, to be able to cope with boron deficiency and toxicity, plants deploy some biochemical and molecular mechanisms. It was reported that plants alleviate the damages of boron toxicity and deficiency via some antioxidative enzyme activities. In the present study, line S2, with edible fruit and seed, from Pisum sativum L., and feeder line 602 as well as the registered feeder lines Taşkent and Özkaynak from the species Pisum arvense L. were investigated under four different (0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 ) boron concentrations. More specifically, the species with a known response to boron were evaluated based on growth parametes (shoot and root), relative water content, boron accumulation within plant tissues, proline and malondialdehyde contents as well as enzyme and antioxidative enzyme activities like superoxide dismutase isoenzymes (SOD), ascorbate peroxidase (APX), catalase (CAT), peroxidase (POX) and glutahione reductase (GR). Furthermore, resistance mechanisms of the plants against boron deficiency/toxicity conditions were evaluated besides the probable anatomical differentiations of the plant tissues and RNA expression levels of the enzyme serine carboxypeptidase (PsCP) that is known to be regulated by hormonal action. The most prominant reductions in the shoot and root dry weights and plant heights were determined from the samples of the pea line S2 and the variety Taşkent that were treated with 200 mg B kg -1 dosages. The samples of the line S2 accumulated the highest boron concentrations within their tissues under the same high B treatment conditions. With the increase on the level of the B applied, the line and the variety Özkaynak presented an elevated SOD activity while the ascorbate peroxidase activity was the highest at the samples of the line While the catalase activities of the samples from the pea lines and S2 were decreased at the samples on day 3, the activities of the samples were increased on day 7 with B treatments. In general, POX activities were reduced in all the samples with increasing B concentrations, whereas the activity of the GR enzyme was sample dependent. That is GR activities of the lines were much higher than the varieties used. Proline and malondialdehyde contents of the lines were the highest at the samples of the lines and S2 on day 0. As of the IAA levels, an increase was presented at the samples of the line and the variety Taşkent based on the sampling time. Likewise, extracts of the shoot and the root xiii

16 samples were posed increased GA 3 levels, most prominent samples being from that of the variety Özkaynak. On the other hand, the ABA levels of the shoot samples exhibited timedependent variations and the samples of the line displayed the maximum levels. However the ABA levels of the shoot samples presented no remarkable variation based on the B treatments, decreases were determined on the root samples. Considering the anatomical features of the plants, differences as well as similarities were detected, based on the material type, root or shoot, the sample type as well as the treatments. The RNA expressions of the gene PsCP, coding an enzyme that is known to be regulated by by a hormone, giberallic acid, effective durig plant development, were highly influenced by the levels of the boron in growing medium while an opposite trend was observed in between the root and the shoot samples analysed. Key Words: Pea, boron, proline and malondialdehyde, antioxidant enzymes, IAA, ABA, GA xiv

17 TEŞEKKÜR Araştırma süresince laboratuar çalışmalarındaki yardımlarından dolayı sevgili arkadaşlarım Uzman Nesim DURSUN, Kimyager Ali KAHRAMAN, Uzman Ayşe ÖZER, Ziraat Mühendisi Hayriye ÇAĞLAR ve Biyolog Zuhal Zeynep AVŞAROĞLU na çalışma süresince bizlerden desteklerini esirgemeyen Sayın Hocam Prof. Dr. Sait GEZGİN e ve projeyi destekleyerek fizyoloji laboratuarının geliştirilmesi ve çalışmaların sağlıklı bir şekilde yürümesine olanak sağlayan, TÜBİTAK a en içten teşekkürlerimi ve şükranlarımı sunarım. Yrd. Doç. Dr. Mehmet HAMURCU Proje Yürütücüsü xv

18 1- GİRİŞ Bitkilerde stres faktörlerinin en önemlilerinden biri olan mikro element eksikliği veya toksisitesi; metabolizmanın işlevini engellemekte ve bitkide hasarlara neden olabilmektedir. Bitkiler büyümeleri için dokularında farklı konsantrasyonlarda bulunmak üzere makro (N, K, Ca, Mg, P ve S) ve mikro (Fe, Zn, Mn, Cu, B, Cl, Mo ve Ni) elementlere ihtiyaç duyarlar. Mikro elementlerin sadece noksanlığı değil, aynı zamanda gereğinden fazla bulunması da bitki gelişimini sınırlandırmaktadır. Bunlar içerisinde yer alan borun kültür bitkileri için mutlak gerekli bir besin elementi olduğu yaklaşık yıldır bilinmesine rağmen bitki bünyesindeki fonksiyonları tam olarak anlaşılmış değildir. Yeterli bora sahip olan topraklarda yetişen bitkilerin bor içerikleri mg kg -1 arasında değişmektedir. Gerek duyulan borun çok az da olsa fazlası bor noksanlığında olduğu gibi pek çok bitki tür veya varyetesinin gelişmesi üzerine olumsuz etki yapmakta ve gelişme çoğu kez durmaktadır. Bitki türleri arasında olduğu gibi aynı türün çeşitleri arasında da bora duyarlılıkta büyük farklılıkların olduğu ve bu farklılıkların nedeninin de bitkilerin bor toksisitesinden aynı derecede fizyolojik olarak etkilenmemesinden kaynaklanmaktadır. Gıda temininin en büyük problem olduğu günümüzde, en önemli gıda kaynağı olan baklagiller familyasının önemli türlerinden biri olan bezelye, insan beslenmesinde de oldukça büyük bir öneme sahiptir. Diğer birçok baklagil gibi bezelye de protein ve amino asit içeriği yönünden hayvansal kaynaklara alternatif niteliktedir. Bileşiminde %18-28 protein bulunan ve ayrıca B ve C vitaminlerince de zengin olan bezelyenin dünyadaki yıllık üretimi milyon tondur. Çok değişik iklim koşullarına uyabilmesinden ve bileşiminde yüksek protein ile pek çok amino asit içermesinden dolayı günümüzün önemli besin kaynaklarından biri durumuna gelmiştir. Dünyada 7.7 milyon hektarlık ve Türkiye de 10.6 bin hektarlık bir alanda ekimi yapılmaktadır (ANONİM, 2005). Bu bitkinin Türkiye de son yıllarda baklagil yetiştirilen alanlar içerisinde ekim alanı hızla artmaktadır. Orta Anadolu Bölgesi nde ve bu 1

19 bölgenin karakteristik özelliğini taşıyan Konya ilinde de bezelye ekim alanları özellikle şeker pancarı ekim alanlarının daraltılması ile her geçen yıl hızla artmaktadır. Mevcut gelişmeler, Güneydoğu Anadolu Projesi (GAP) kapsamında Harran ovasının da yakın gelecekte bezelye üretimi bakımından ilk sıraları alacağını göstermektedir. Bezelye üretim alanlarının giderek artan besin ve hayvansal gıda talebi nedeniyle önümüzdeki yıllarda ha a kadar çıkabileceği tahmin edilmektedir. Bununla birlikte, araştırma ekibimizin son yıllarda bölge tarım toprakları üzerinde yapmakta olduğu detaylı analizlerde en önemli sorunlardan birinin mikro besin elementi eksikliği ya da toksisitesi olduğunu göstermiştir. Bu elementlerden en önemlisi bor olup bölge topraklarında bezelye üretim potansiyelinin tam olarak ortaya konulmasını engellemektedir. Gezgin ve ark., (2002) tarafından araştırmanın yürütüleceği ekolojilerin tarım topraklarının %26.6 sında bor noksanlığı (<0.5 mg kg -1 ), %18 inde ise bor toksisitesi (>3.0 mg kg -1 ) olduğu belirlenmiştir. Bu da yaklaşık tarım arazilerinin yarısına tekabül etmektedir. Noksanlık koşullarının giderilmesinde artık ülkemizde de üretimine başlanan bor katkılı gübreler (BOREN in üretmiş olduğu Tarım Bor etkili olabilir. Diğer yandan, toksisite probleminin çözümü daha zordur. Konvansiyonel yöntemlerle toprağın arındırılması işlemleri çok pahalı olduğu için uygulanabilir olmaktan uzaktır. Çözüm olarak bitki gen kaynaklarının daha etkin bir şekilde kullanımı önerilmektedir. Ülkemizde ve özellikle bölgemizde yaygın olarak üretimi yapılan bezelye hat ve genotiplerinin farklı bor uygulamalarına tepkileri çok farklı olmuştur. Bazı genotipler toksisite koşullarında gelişme ve verim kabiliyetlerini kaybederken, bazıları rahatlıkla gelişebilmektedir. Bitkiler gelişim aşamasında da bor uygulamasına çok farklı tepkiler ortaya koymuşlardır. Daha önce yapılan çalışmalarda, bor noksanlığı koşullarında bor uygulamasına baklagillerin olumlu tepki verdiği, baklagiller içerisinde en farklı tepkinin bezelye tarafından gösterildiği bildirilmiştir (HAMURCU ve ark., 2006b). Ancak ülkemizde şu ana kadar bezelye genotiplerinin bor noksanlığı ve toksisitesine karşı gösterdikleri tepkilerin fizyolojik ve anatomik esasları 2

20 yeterince açıklanmamıştır. Çalışmamızda, ülkemiz tarımında önemli bir yere sahip olan bezelye bitkisinin yetişme ortamlarında bulunan yetersiz ve toksik düzeydeki bor konsantrasyonlarının, bu bitkilerin gelişiminde, fizyolojik ve biyokimyasal yanıtlarında, ayrıca dokuların anatomik yapılarında meydana getirdiği değişim mekanizmaları hakkında bilgiler elde edilmeye çalışılmıştır. Proje sonuçlarının, element alımı, taşınması ve dayanıklılık mekanizmasının anlaşılmasına olduğu gibi üzerinde çalışılan bitki türlerinin genetik olarak geliştirilmesine, mikro element problemli alanlarda ekim alanlarının ve besin değerinin artırılması yolunda önemli katkılarda bulunması beklenmektedir. 3

21 2- GENEL BİLGİLER 2.1. Bitkilerde Stres Faktörleri ve Savunma Sistemleri Topraktaki minerallerin oranları bölgeler arasında büyük değişiklikler göstermektedir. Bitkilerin gelişmeleri esnasında besin elementlerine ihtiyaçları birbirinden çok farklıdır. Mikro elementlerin eksikliğinde, türler arası ve tür içi geniş farklılıklar göstermekle birlikte, tüm bitkiler strese girer. Diğer taraftan, bu mikro elementlerin ortamda bitkinin ihtiyaçlarından fazla bulunması bitkileri yine strese sokar ve toksite belirtileri başlar. Bu genel kuralın dışında yer alan bitkiler de vardır. Belli bazı mikro elementlerin çok yüksek dozlarda bulunduğu ortamlarda rahatlıkla yaşamını sürdürebilen bu bitkiler, hiperakümülatör bitki olarak adlandırılmaktadır. Ayrıca bu bitkiler bulundukları ortama adapte olmuştur ve toksik derecede yüksek konsantrasyondaki bor u bünyelerine almama veya daha da önemlisi, bol miktarda alarak çeşitli organlarında güvenli depolama yeteneği geliştirmişlerdir. Bu tarz bitkiler, hergün biraz daha fazla kirlenen toprakların ucuz bir şekilde temizlenmesi potansiyeline sahiptir ve geniş kullanım alanı bulabileceklerine inanılmaktadır. Bunun da ötesinde kültür bitkilerinden, mikroelement eksikliği görülen topraklarda etkin bir şekilde yetişen ve alım mekanizmasını daha fazla çalıştırarak ihtiyaç duyduğu mikroelementleri rizosferden alan çeşitler geliştirilmesi için bu alım, biriktirme mekanizmalarının anlaşılması gereklidir. Benzer şekilde mikroelement fazlalığı olan alanlarda da uygun kültür bitkilerinin yetiştirilmesi için, bu defa belki mekanizmanın yavaş çalışması ya da bitkinin topraktan aldığı elementleri zararsız bir yerde depolayabilmesi (örn. vakuolde) yönünde bitkinin tasarlanması veya geliştirilmesi gerekecektir. Doğal ortamlarında meydana gelen çevresel değişimlere karşı canlılar çeşitli içsel ve mekanik tepkiler gösterirler (EDREVA, 1998). Herhangi bir stres faktörü ile karşılaşan bitkilerde biyokimyasal ve fizyolojik olarak çeşitli tepkiler oluşmaktadır. Oluşan stres faktörleri; gen/genlerin fizyolojik etkileri ile hücresel metabolizma değişimlerinin, büyüme oranları ve ürün miktarlarının değişimine kadar çok çeşitli tepkilere neden olurlar (BRAY ve ark., 2000). Bitkilerde stres faktörlerinin en önemlilerinden biri olan besin elementlerinin eksikliği veya toksisitesi; metabolizmanın işlevini engellemekte ve bitkide hasarlara neden olabilmektedir. Bitkiler diğer streslerde olduğu gibi borla da baş edebilmek için biyokimyasal ve fizyolojik mekanizmalar geliştirmişlerdir. Biyokimyasal stratejiler; seçici iyon birikimi veya dışlanması, köklerle alınan iyonların kontrolü ve yapraklara taşınımı, tüm hücre düzeyinde veya hücresel boyutta iyonların dağılımı, uyumlu bileşiklerin sentezi, fotosentetik yolun değişmesi, membran yapısındaki değişimler, 4

22 antioksidant enzimlerin ve bitki hormonlarının indüksiyonu olarak sıralanabilirler (SEÇKİN, 2005). Antioksidant savunma sistemi; aerobik canlılar için toksik olan oksijen ara ürünlerinin zararsız hale getirilmesinde enzimatik ve enzimatik olmayan savunma mekanizmaları sayesinde hücreleri oksidatif zararlara karşı korumaktadır. Enzimatik olmayan antioksidantlar mannitol, sistein, hidrokinin, C ve E vitaminleri, flavanoidler, bazı alkoloidler, karotinoidler ve ksantofiller olarak, enzimatik antioksidantlar ise süperoksit dismutaz (SOD), peroksidaz (POX), askorbat peroksidaz (APOX), katalaz (CAT) ve glutasyon redüktaz (GR) lar olarak sayılabilirler (HALLIWELL ve GUTTERIDGE, 1989; BOWLER ve ark., 1992; ÇAKMAK ve ark.,1993; RASCIO ve ark., 1994; LOPEZ ve ark.,1996; RENARD ve ark.,1997; ASADA, 1999). Strese karşı gösterilen tepki; stresin şiddetine, süresine, stresten etkilenmiş olan bitkilerin gelişim aşamasına, doku tipine ve birçok stresin etkileşimlerine bağlıdır (KOCA, 2002). Bitkilerde stresten korunma mekanizmaları, bitki dokularında stres faktörlerinin azaltılmasına veya önlenmesine yönelik olmaktadır. Strese tepki olarak bitkilerde; yaprak ayasının kalınlığı, stomaların büyüklüğü, sıklığı ve kütikulanın kalınlığı değişmektedir (ACAR, 1999). Bitkilerde strese tolerans mekanizması; doku ile organel düzeyinde moleküler seviyede gerçekleşir ve oluşan stres etkisinin azaltılmasını veya tolere edilmesini kapsamaktadır (EDREVA, 1998). Bitkiler için temel bileşenlerden olan oksijen; moleküler oksijenin (O 2 ) suya (H 2 O) indirgenmesi yoluyla bitkiler için enerji kaynağı oluşturmaktadır. Oksijenin indirgenmediği durumlarda ise biyolojik molekülleri okside edebilen aktif oksijen türleri (AOS) oluşmaktadır (SEÇKİN, 2005). Bu aktif oksijen türleri olan hidrojen peroksit (H 2 O 2 ), süperoksit (O - 2 ) radikalleri, hidroksil radikalleri ( - OH) ve tek değerlikli oksijen (O 2 ) türleri bitki hücrelerinde kloroplastlarda, mitokondrilerde ve peroksizomlarda meydana gelen oksidatif reaksiyonlarla üretilebilmektedirler. Moleküler oksijen (O 2 ) oldukça kararlı bir yapıya sahip olmasına karşın, yaşamsal reaksiyonların rastlanabilir bir sonucu olarak veya stresierin teşvikiyle oluşan bu aktif oksijen türleri, koruyucu mekanizmaların işlev görmediği durumlarda, sadece bitkilerin değil, herhangi bir aerobik organizmanın hücre yapı ve işlevlerine zarar verebilmektedirler (DEMİRAL, 2003). Stressiz koşullarda, bitkilerin antioksidant savunma sistemleri, aktif oksijen türlerine karşı gerekli korunmayı sağlamaktadırlar (ÇAKMAK ve ark., 1993). Ancak stres faktörleri ortaya çıktığında meydana gelen stresin; bitki dokularına zarar veren oksijen türlerinin, aktif oksijen türlerinin, 5

23 üretimini arttırma potansiyeline sahip oldukları bildirilmiştir (SAIRAM ve SRIVASTAVA, 2002). Bitkiler kendilerine zarar veren bu oksijen türlerine karşı son derece gelişmiş ve karmaşık bir antioksidant sistemine sahiptirler. Bu sistem sayesinde bitkilerde antioksidant enzimler ile düşük moleküler ağırlıktaki antioksidantlar meydana gelirler (ALLEN, 1995). Antioksidant savunma sistemi; aerobik canlılar için toksik olan oksijen ara ürünlerinin enzimatik ve enzimatik olmayan savunma mekanizmaları sayesinde zararsız hale getirilmesiyle, hücreleri oksidatif zararlara karşı korumaktadır. Süperoksit dismutaz; savunma mekanizmasının ilk basamağı olan süperoksitin oksijen ve H 2 O 2 'ye dönüşümünü gerçekleştirmektedir. Süperoksit radikali kimyasal bakımdan çok kararsız bir moleküldür. Bu radikal hücrede var olan Fe 3+ ve Cu 2+ metal iyonlarını indirger ve kararlı hale geçer (O 2 ). O Fe +3 (Cu) +2 O 2 + Fe +2 (Cu) + Süperoksit radikali bu aşamada etkisiz hale getirilmezse, metabolizmada herhangi bir yok edilme mekanizması bulunmayan hidroksil radikali ( - OH) oluşur. Tilakoid zarında bulunan bir metalloenzim olan süperoksit dismutaz, serbest oksijen radikallerinin, H ve 0 2 'ne dönüşümünü kataliz eden antioksidant savunma sisteminin en önemli enzimidir (BOWLER ve ark., 1992). SOD 2O H + H 2 O 2 +O 2 Katalaz, bitkilerde genellikle peroksizomlarda ve glioksizomlarda bulunmaktadır. Başlıca görevi; fotorespirasyon ya da glioksizomlarda yağ asitlerinin β oksidasyonu sırasında oluşan H 'i su ve oksijene ayrıştırarak zararsız hale getirmektir (LAZAROW ve FUJUKI, 1985). Peroksidaz, biyokimyasal ve fizyolojik süreçlerde etkili olduğu gibi çevresel stresiere cevapla da ilişkilidir (MATAMOROS ve ark., 2003). Bitkiler çevresel stres altında aktif oksijeni uzaklaştıran enzim aktivitelerini arttırırlar. Enzim aktivitilerinin artışına parelel olarak enzimlere ait proteinlerin ve 6

24 mrna'ların miktarları da artar (SATOH ve MURATA, 1998). Bitkiler sahip oldukları yüksek antioksidant enzimler sayesinde farklı çevresel streslere karşı cevap ve tolerans sağlamaktadırlar (ÇAKMAK ve ark., 1993; ACAR ve ark., 2001; SATO ve ark., 2001; BOR ve ark., 2003; TÜRKAN ve DEMİRAL, 2004) Bor un Bitkiler Üzerindeki Etkileri Bitkilerde stres faktörlerinin en önemlilerinden biri de besin elementlerinin eksikliği veya toksisitesidir. Bunlar metabolizmanın işlevini engellemekte ve bitkide çeşitli zararlara neden olabilmektedirler. Bitkiler tarafından eser miktarda gereksinim duyulan, eksikliği ve toksisite sınırı birbirine en yakın element bor'dur (BROWN ve ark., 2002). Yeryüzünün 51. yaygın elementi olan bor toprakta, kayalarda ve suda yaygın olarak bulunan bir elementtir. Toprağın bor içeriği genelde ortalama ppm, deniz suyunda 0,5-9,6 ppm, tatlı sularda ise 0,001-1,5 ppm sınırları içindedir. Yüksek konsantrasyonda ve ekonomik düzeydeki bor kaynakları, bor' un oksijenle bağlanmış bileşikleri olarak daha çok Türkiye (rezervlerin yaklaşık %70 i) ve Amerika'nın kurak volkanik ve hidrotermal aktivitelerinin yüksek olduğu bölgelerde bulunmaktadır (EDİZ ve ÖZDAY, 2001). Kurak ve yarı kurak iklim bölgeleri topraklarının fazla B içermesi, söz konusu bölgelerde yetiştirilen kültür bitkilerinde ve özellikle tahıllarda B toksisitesinin çok yaygın olan bir beslenme problemi olmasına yol açmaktadır. Örneğin, Güney Avustralya'da kurak ve yarı kurak bölgelerden alınan bitki ve toprak örneklerinde çok yüksek B konsantrasyonlarına rastlanmıştır (CARTWRIGHT ve ark., 1984; 1986). Güney Avustralya'da yaygın tahıl üretiminin yapıldığı alanlarda topraklarda doğal olarak bulunan B'un tahıllarda (özellikle arpada) B toksisitesine yol açtığı ve ayrıca söz konusu bölgelerde yetiştirilen buğday, yulaf, bezelye ve mera bitki türlerinde önemli verim düşüşlerine neden olduğu kaydedilmiştir (CARTWRIGTH ve ark., 1984; 1986). Aynı bölgede B toksisitesinin arpa yetiştiriciliğini önemli bir şekilde sınırlandırdığı (arpada bora hassasiyet yüksektir) ve B toksisitesinden kaynaklanan tane verim azalmasının %17'den fazla olduğu saptanmıştır (CARTWRIGHT ve ark., 1984). Gezgin ve ark., (2002) Orta Güney Anadolu tarım bölgesinden toplanan 898 toprak örneğinin analiz sonuçlarına göre, elverişli B miktarı toprakların % 26.6 sında 0.5 mg kg -1 B dan düşük, % 24.9 unda mg kg -1 B, % 30.5 inde 1-3 mg kg -1 B, % 8.1 inde 3-5 mg kg -1 B, % 6.3 ünde 5-10 mg kg -1 B, % 3.6 sında ise >10 mg kg -1 B şeklinde olduğunu tespit 7

25 etmişlerdir. Bu oranlar dikkate alındığında, bölgedeki tarım arazilerinin yaklaşık %18 i tahıllar açısından yüksek B içeriğine sahip olduğu anlaşılmaktadır. Ayrıca bu araştırmada toprakların elverişli B miktarı ile organik madde (r = 0.29**), elektriksel iletkenlik (r = 0.56**) ve kil miktarları (r = 0.23**) arasında pozitif, kireç (r = -0.24**), kum (r = -0.24**) ve Mn miktarları (r = -0.23**) arasında ise negatif ilişkiler belirlemişlerdir. Bor toksitesi dünyada ve Türkiye de özellikle kurak ve yarı-kurak bölge topraklarında yaygın ve genelde lokal olarak görülen bir mineral beslenme problemidir (SILLANPAA, 1982; KALAYCI ve ark., 1999). Bor noksanlığının olduğu alanlarla karşılaştırıldığında B bakımından zengin topraklar daha az yaygın olmasına rağmen çoğu zaman dünyanın farklı bölgelerinde görülen verim düşüşlerinin başta gelen nedenleri arasında gösterilmektedir (CARTWRIGHT ve ark., 1986). Bor toksisitesinin bitkilerin kök ve yeşil aksam büyümesini engelleyen ve tane verimini ciddi bir şekilde sınırlayan bir mikro element problemi olduğu bildirilmiştir. Ayrıca B toksisitesinin buğdayda özellikle bitki boyunun uzamasını ve yeşil aksam gelişimini durduran (PAULL ve ark., 1990), büyümeyi geciktiren (PAULL ve ark., 1988) ve kök gelişimini azaltan (HUANG ve GRAHAM, 1990) bir problem olduğu çeşitli çalışmalarda gösterilmiştir. Torun ve ark., (1999), Konya koşullarında yetiştirilen 22 buğday çeşidinin B toksitesine duyarlılığını sera ve tarla koşullarında araştırmışlardır. Diğer bitki türleriyle karşılaştırıldığında B toksitesinden kaynaklanan verim kayıplarının tahıllarda daha büyük boyutlarda olduğu bildirilmiştir. Bordan kaynaklanan verim kayıplarının ekmeklik çeşitlerle karşılaştırıldığında makarnalık buğdaylarda oldukça fazla olduğu görülmüş, kuru madde veriminde azalmaların makarnalık buğday çeşitlerinde farklı olmamasına karşılık ekmeklik buğday çeşitleri arasında oldukça farklı olduğu saptanmıştır. Topraktaki B fazlalığına karşı bitkilerin farklı reaksiyon gösterme nedenlerinin çeşitten çeşide farklılık gösterdiği saptanmıştır. Bazı çeşitlerin dokularında daha az B biriktirebilme yeteneğine sahip olması ve bazı çeşitlerin ise doku düzeyinde alınan boru tolere edebilme yeteneğine sahip olması veya olmamasından dolayı bora farklı reaksiyon gösterebilmektedirler. Buğday çeşitlerinin bora farklı dayanım göstermelerinin yeşil aksamdaki B konsantrasyonu veya yeşil aksamdaki toplam B miktarı ile doğrudan ilişkili olmadığı görülmüştür. Deneme sonuçlarından ayrıca, B toksisitesine karşı çeşitlerin dayanıklılık sıralamasını sera ve tarla koşullarında hemen hemen benzer olduğu ortaya çıkmıştır. Bu da çok sayıda çeşidin bora karşı reaksiyonlarının tarla 8

26 koşullarında test edilmeden önce sera koşullarında test edilebileceğini göstermektedir. Yüksek B uygulamaları altında veya B toksitesine sahip bir toprakta yetiştirilen genotiplerin B toksitesine duyarlılığı hakkında ön bilgi edinmede, B toksitesinin yaprakta neden olduğu belirtilerin derecesinin belirlenmesi oldukça güvenilir bir parametre olarak bulunmuştur. Furio, Riogrande, Sele, DK 743, Helix, Missouri, Betor ve Poker mısır çeşitlerinin B toksisitesine duyarlılıkları sera koşullarında araştırılmıştır. Toprağa B; 0, 10 ve 30 mg kg -1 düzeylerinde H 3 BO 3 formunda uygulanmıştır. Deneme sonunda bitkilerin yaş ve kuru ağırlıkları ile B konsantrasyonları belirlenmiştir. Yaş ve kuru bitki ağırlıkları ile bitkilerin B konsantrasyonları arasındaki ilişkilerden yararlanılarak mısır çeşitlerinin B toksitesine duyarlılıkları ortaya konulmuştur. Araştırmadan elde edilen sonuçlara göre yaş ve kuru ağırlık bakımından bitkilerin B toksisitesine duyarlılıkları yüksekten düşüğe doğru Helix, Riogrande, Furio, Poker, Sele, Missouri, DK 743, Betor şeklinde sıralanmıştır. Genel olarak yüksek bora duyarlılıkları düşük olan çeşitlerin yüksek olan çeşitlere göre daha fazla B içerdikleri belirlenmiştir (GÜNEŞ ve ark., 2000). Bergmann (1992), bitki bünyesinde kritik bor noksanlık seviyelerini buğdaygillerde (örneğin arpa, buğday vb.) 5-10 mg B kg -1, çift çenklilerde (örneğin üçgül v.b.) mg B kg -1 ve haşhaşta mg B kg -1 olarak bildirmiştir. Taban ve Erdal (2000), bor uygulamasının buğday çeşitlerinin gelişimi ve toprak üstü aksamda bor dağılımının belirlenmesi amacıyla yaptıkları çalışmada, killi tın tekstürlü, %12 kireç içeren, ph sı 7.91 ve bitkiye yarayışlı bor miktarı 1.52 mg kg -1 olan toprak örneğini materyal olarak kullanmışlar. Serada 4 ekmeklik (Triticum aestivum L. cv: Bobal-2973, Bezostaja, Kıraç, Gerek-79) ve makarnalık (Triticum durum L. cv: Çakmak-79 ve Kızıltan- 91) buğday çeşitleri ile yürüttükleri denemede, topraklara bor 0,1 ve 10 mg B kg -1 olacak şekilde borik asit olarak uygulamışlardır. Makarnalık çeşitlerin ekmeklik çeşitlere göre bordan daha fazla etkilenmiş olduğunu ve bor uygulamasının Bolal-2973 ve Gerek-79 çeşitlerinde kuru ağırlık artışına, Çakmak-79 ve Kızıltan-91 çeşitlerinde ise kuru ağırlık azalışına neden olduğunu belirlemişlerdir. Aynı araştırmada bor uygulandığında ve uygulanmadığında, buğday çeşitlerinin tümünde en fazla bor u yaprak ucunda belirlemişlerdir. Toprağa bor uygulanmadığında, çeşitlerin toprak üstü bitki genelinde, yaprak genelinde ve ucu alınan yaprağın kalan kısmında belirlenen bor konsantrasyonları arasında belirgin bir farklılık belirlememişlerdir. Toprağa bor uygulandığında, çeşitlerin bora tepkilerinin ayırımlı olmasından dolayı, toprak üstü bitki genelinde, yaprak genelinde ve ucu 9

27 alınan yaprağın kalan kısmında belirlenen bor konsantrasyonları birbirlerinden farklı olduğunu bulmuşlardır. Soylu ve ark., (2004) ise, tahıllar için düşük B ihtiva eden (0.19 mg kg -1 ) topraklarda, tarla koşullarında yaptıkları çalışmada 6 makarnalık buğday çeşidine (Kızıltan-91, Ç-1252, Selçuklu-97, Kunduru-1149, Yılmaz-98 ve Çakmak-79) 4 farklı B dozu (0, 1, 3 ve 9 kg B ha - 1 ) uygulamışlardır. İki yıl süren araştırma sonucunda, makarnalık buğday çeşitlerinin B dozlarına önemli derecede genotipik farklılık gösterdiğini tespit etmişlerdir. Hektara 3 kg B uygulaması ile Kızıltan-91 çeşidinde % 38 lik oranla en yüksek verim artışı sağlanırken, Çakmak-79 çeşidinde aynı dozda % 11 lik verim artışı kaydedilmiştir. Altı çeşidin ortalama tane verimi incelendiğinde verimde 1 kg ha -1 B uygulaması ile % 11, 3 kg ha -1 ile % 9 ve 9 kg ha -1 ile % 7 artış olduğu görülmüştür. Çeşitlerin bayrak yapraklarındaki B miktarları B dozlarının artışı ile ritmik bir artış göstermiş, kontrol parsellerinde 11.1 mg kg -1 olan B konsantrasyonu 1, 3, 9 kg ha -1 B uygulamalarında sırasıyla 14.67, ve mg kg -1 olmuştur. Sonuç olarak makarnalık buğdayların B eksikliğine karşı hassasiyet gösterdiği tespit edilmiştir. Bora tepki yönünden buğday çeşitleri arasında önemli genotipik farklılıkların ortaya çıkması B eksikliğine hassas veya toleranslı genotiplerin belirlenerek bölge topraklarına uygun çeşitlerin tespit edilmesi gerektiğini ifade etmişlerdir. Rerkasem ve Jamjod (2004), buğdayda B eksikliğinin 1960 yılından beri bilindiğini ve buğdayın B eksikliğine dikotiledon bitkilerden daha fazla eğilimli olduğunu belirtmişlerdir. B fazlalığının buğdayda büyüme ve gelişmeyi etkilediği bilinmekte, eksikliği ise ticari açıdan önemli derecede verim kayıplarına neden olmaktadır. Buğday genotiplerinin bora karşı tepkileri bakımından farklılık gösterdiği, bazı genotiplerin düşük borlu topraklarda yetiştirilirken verimlerinin değişmediği fakat bazı genotiplerin de bu topraklarda B eksikliğinden etkilenerek bu durumun verim kayıplarına neden olduğu belirtilmiştir. Araştırıcılar B eksikliğine tepkilerin belirlenmesinde, en ani tepkinin kök uzamasının durması olarak nitelendirmişler, fakat bu etkinin buğdayda nadir görüldüğünü ifade etmişlerdir. Hamurcu ve ark., ( 2006a), kontrollü sera koşullarında farklı seviyelerde uygulanan bor ve demir dozlarının makarnalık buğdayın kuru madde miktarı, bor konsantrasyonu ve miktarı, demir konsantrasyonu ve miktarı Zn, Cu, Mn konsantrasyonları üzerine etkisini belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada boru yedi (0, 0.5, 1, 2, 4, 8 ve 16 mg kg -1 ), Fe i ise dört (0, 6, 12, 24 mg kg -1 ) farklı seviyede uygulamışlardır. Makarnalık buğday bitkisinin kuru madde miktarı, bor konsantrasyonu ve miktarı, demir konsantrasyonu ve miktarı, Zn, Cu, Mn 10

28 konsantrasyonları üzerine bor ve demir uygulamalarının ve interaksiyonların etkisini istatistiki olarak önemli (p<0.01) bulmuşlardır. Bitkide uygulanan bor miktarı arttıkça bor konsantrasyonunun arttığı, demir miktarı arttıkça demir konsantrasyonunun belli bir noktaya kadar artış gösterdiği, belli bir seviyeden sonra daha fazla artmadığını belirlemişlerdir. Uygulanan bor miktarının bitkinin demir alımı üzerine bir etkisinin olmadığı, ancak demir uygulamasının uygulanan demir miktarının artışına bağlı olarak bitkinin bor alımını azalttığını belirlemişlerdir. Hamurcu ve ark., (2006b), kontrollü sera koşullarında farklı seviyelerde uygulanan bor (B) ve demir (Fe) dozlarının bezelye hatlarında kuru madde miktarı, bitki boyu, B konsantrasyonu ve miktarı ile Fe konsantrasyonu ve miktarı üzerine etkisini belirlemek amacıyla yaptıkları çalışmada B (0, 1, 20 mg kg -1 ) ve Fe (0, 6, 60 mg kg -1 ) üç farklı seviyede uygulanmıştır. Bezelye hatlarının kuru madde miktarı, bitki boyu, B konsantrasyonu ve miktarı ile Fe konsantrasyonu ve miktarı üzerine B ve Fe uygulamalarının ve interaksiyonlarının etkisi istatistiki olarak önemli (p<0.01) bulunmuştur. B toksisitesinden kaynaklanan kuru madde azalmasının uygulanan B dozlarının ortalaması dikkate alındığında B uygulanmayan saksılara göre % 9.22 oranında azaldığı, en yüksek kuru madde miktarına ulaşılan 1 mg kg -1 B uygulamasında %5.86 lık oranda arttığı belirlenmiştir. Bezelye bitkisine uygulanan B miktarındaki artışla birlikte bitki boyunda da artışlar belirlemişlerdir. Bitkiye uygulanan B miktarı arttıkça B konsantrasyonunun arttığı, Fe miktarı arttıkça Fe konsantrasyonunun artış gösterdiği, uygulanan B miktarının bitkinin Fe alımını az da olsa azalttığı, Fe uygulamasının ise uygulanan Fe miktarının artışına bağlı olarak bitkinin B alımını azalttığı belirlemişlerdir. Torun ve ark (2006), toprakta bor toksisitesine karşı genotipik farklılığın boyutunu araştırmak amacıyla 70 makarnalık buğday (Triticum durum) genotipi ile yaptıkları sera denemesinde, bitkiler ekstrakte edilebilir B un 12 mg kg -1 olduğu bir toprakta iki ayrı bor uygulamasına tabi tutulmuştur (+B: 25 mg kg -1 toprak;-b: 0 mg kg -1 ), 30 günlük büyüme evresinden sonra bitkilerin yalnızca yeşil aksamlarını hasat edilmiş ve genotipler kuru madde ağırlığı ve yeşil aksam B konsantrasyonu bakımından değerlendirilmiştir. Genotipler arasında topraktaki B toksisitesine karşı, toksisite belirtilerinin şiddeti ve büyümedeki azalma bakımından büyük bir genotipik varyasyonun olduğunu, test edilen genotiplerden Sabil-l, Stn "S", Aconhi-89 ve Wadelmez-2, B uygulamasından etkilenmeyen ve hatta bu genotiplerde B'dan dolayı büyümede bir artma eğiliminin ortaya çıktığını belirlemişlerdir. Buna karşılık, 11

29 diğer genotiplerin tümünde B uygulaması sonucu kuru madde ağırlığında azalmaların olduğu, bu azalmaların özellikle Lagost-3, Dicle-74. Brachoual134xS-61 ve Gerbrach genotiplerinde olduğunu, genotiplerden Braehoual134xS-61 ve Gerbrach'da B'dan dolayı kuru madde oluşumundaki azalmanın 2 kattan daha fazla olduğunu ifade etmişlerdir. Genel olarak B toleransı yüksek genotipler yüksek miktarlarda B birikimi gösterirken, duyarlı genotiplerde düşük düzeylerde B birikimini belirlemişlerdir. Bu sonuçlar, 70 genotip arasında görülen farklı B toleransının, B'un köklere alınmayarak dışarıda tutulması (dışlama) mekanizması ile ilişkili olmadığını ortaya koymaktadır Enzimlerin ve Hormonların Bor İle İlişkileri Borun hormonlar ile ilişkisinde tam mekanizma bilinmemekle birlikte iki hipotez öne sürülmektedir: Birinci hipotez; borun hücre zarı foksiyonlarında kararlılıkta ya da hücre zarı yapısında rol aldığıdır. Bunu hormonlara etki ederek zar geçiş sinyallerinin ya da zar taşımacılığında katyon ve anyonların geçişinin düzenlenmesi ile gerçekleştirir (NIELSEN ve SHULER, 1992). İkinci hipotez ise; borun bazı anahtar enzim reaksiyonlarını inhibe ederek birçok metabolik etkide bulunduğudur (SAMMAN ve ark., 1998). Hücre metabolizmasının kilit moleküleri olan ATP, NADH veya NADPH a borun bağlanması sonucu, metabolik bozukluklar oluşabileceği, NMR sonuçlarıyla desteklenmiştir. Anılan bileşiklerle ve bağlantılı metabolitlerle borun bağ oluşturması NMR da gözlenmiştir (HUNT, 2002). Bu açıdan, NADH ve NADPH ın malat dehidrogenaz ve izositrat dehidrogenaz enzimlerine substrat olarak kullanıldığı in vitro deneme sonuçları ile NMR sonuçları, genelde birbiri ile uyumlu bulunmuştur. Bu bağlamda, bor miktarında yaklaşık 5mM kadar artış, enzimlerin Km değerinde de artışa neden olmuş ve bu durum bileşik oluşması nedeni ile ortamda substrat konsantrasyonu azalması şeklinde açıklanmıştır (REID ve ark., 2004). Reaksiyonda V max değerinin daha az duyarlı oluşu, borun bağlanmak için enzimden çok substratı hedeflediğini göstermiştir. Bu bakış açısı, bora düşük afinitesi olan asit fosfotaz ile yapılan çalışma ile de desteklenmiştir. Çalışmada, bu enzim etkinliğine ilişkin K m ve V max değerlerinin, 50 mm bor konsantrasyonuna kadar anlamlı derecede etkilenmediği saptanmıştır (REID ve ark., 2004). 12

30 Borun bu gibi substratlara bağlanmasına ilişkin sonuçların in vivo gözlenmesinin çok daha zor olduğunu belirten (REID ve ark.,2004), bu nedenle bitkide fotosentez, solunum ve protein sentezinin bora çok duyarlı olmadıklarını belirtmiştir. Bu bağlamda, arpanın yaprak kesitlerinde incelenen fotosentezin 50 mm bordan etkilenmediği, 100 mm borda sadece %23 azaldığı; fotosenteze göre kısmen daha duyarlı olan solunumun ise, 50 mm bor da %37, 100 mm borda ise 60% azaldığı saptanmıştır. Bitkilerde bor minerali etkinliğinin önemli bir karmaşası da oksin (indol-3-asetik asit, IAA) metabolizmasında yoğunlaşmaktadır. Bu yönüyle borun IAA metabolizmasındaki olası rolü ilk olarak 1940 yılında ortaya atılmıştır. Ancak otsu bitkilerde yapılan birçok araştırmaya karşın, bor ve IAA arasındaki ilişki ortaya çıkarılamamıştır (COKE ve WHITTINGTON, 1968; SMIRNOV ve ark., 1977; HIRSCH ve ark., 1982). Diğer yandan, bitkilerde bor ve IAA miktarı ilişkisi yönünden yapılan çalışmalarda, toksik konsantrasyonda bora maruz bırakılan iki arpa (Hordeum vulgare L.) kültür çeşiti yapraklarında, IAA içeriğinin arttığı (AYVAZ, 2002); buna karşılık, bor yokluğunda yetiştirilen buğday (Triticum durum Desf.) fidelerinde IAA içeriği artmakla birlikte, uygulanan bor konsantrasyonu artışına paralel olarak IAA içeriğinin azaldığı (GEMİCİ ve ark., 2002); yine aşırı bor uygulanan ayçiçeği (Helinanthus annuus L.) bitkilerinde IAA miktarının, kontrole göre azaldığı rapor edilmiştir (AKÇAM-OLUK ve DEMİRAY, 2004). Bu yönüyle, aşırı borun bitkilerde içşel kantitatif IAA miktarı üzerine etkisi yönünden literatürde yer alan çalışmalarda çelişkili sonuçlarla karşılaşılmaktadır. Bazı araştırıcılar, köklerdeki IAA miktarı artışını, şekerlerin kök bölgesine taşınımının artması şeklinde açıklamışlardır (PATRICK ve WAREING, 1973). Bitkilerde mikorizal ilişkiyi irdeleyen araştırıcıların, karbohidratların IAA yönlendirmeli taşınımı ile mikorizal fungusların köklerde kolonize olma olasılığını artırabileceği düşüncesi, bor gübrelemesinin kök karbohidrat miktarına olan etkisiyle bağdaştırılmıştır (SLANKIS, 1973). Bu bağlamda, bor gübrelemesi koşullarında, Pinus echinata Mill. köklerinde yapılan bir araştırmada, Pisolithus tinctorius ile enfekte edilen çam fidelerinin köklerindeki IAA miktarının önemli düzeyde artmasına karşın, mantarla enfekte olmayanlardaki IAA miktarında önemli bir değişimin olmadığı saptanmıştır (MITCHELL ve ark., 1986). Bu sonuç, (LAMBERT ve ark.,1980) tarafından ileri sürülen, bor gübrelemesi IAA oksidaz aktivitesini azaltırken IAA miktarının artırarak karbohidratların mikorizaya daha çok 13

31 yönelmesine neden olmakla mikorizal mantarların köklerdeki enfeksiyonunu olumlu yönde etkilediği görüşüyle çelişmektedir. O halde, eğer bor ile IAA ve karbohidrat taşınımı arasında bir ilişki mevcut ise, bu Lambert ve arkadaşlarının konuya ilişkin açıklamasından daha karmaşık görünmektedir. Diğer yandan, (MIDDELTON ve ark.,1978), Phaseoulus aureus Roxb. bitkisinde, borun IAA ile sinerjistik etkileşim sonucu sukroz taşınımını artırdığını tespit etmiştir. Bu da bize, borun bitki dokularında oksine karşı olan duyarlılığı artırdığını düşündürmektedir. Yine, Pinus echinata Mill. köklerinde yapılan çalışmanın sonucuna göre, borun IAA miktarına olan etkisi türlere ve tür içindeki farklı dokulara göre değişmektedir. Ayrıca bitkinin mikorizal durumu da borun IAA miktarına etkisini değiştirmektedir (MITCHELL ve ark., 1986). Bitkilerde bor eksikliğiyle ilişkili olarak yapılan çalışmalarda, bor etkinliği, sub veya supraoptimal oksin (IAA) düzeylerinin indüklediği olaylar benzeri değişimlerden, doku farklılaşmalarına kadar değişen olaylar dizisiyle ilişkili görülmüştür. Bu yönüyle, lignifikasyon ve ksilem farklılaşması vasküler bitkilere özgü olduğundan, bora olan gereksinim, IAA metabolizmasıyla ilgili lignin biyosentezi ve ksilem farklılaşmasıyla ilişkilendirilmiştir (LEWIS, 1980; LOVATT, 1985). Örneğin, bor kıtlığının, kök uçlarındaki hücre bölünmelerinde, boyuna doğrultudan ışınsala doğru bir yön kayması oluşturarak, kökün uzama büyümesinde bir azalmaya neden olduğu bildirilmiştir (ROBERTSON ve LOUGHMAN, 1974). Bu bağlamda, kambiyal gövde dokusunda hücre bölünmesinin artması ve bozunmuş ksilem farklılaşmasının, doğrudan doğruya bor eksikliği etkileri olmayıp, benzer morfolojik değişimlerin, yeterli bor miktarlarında yetiştirilen bitkilerin apikal meristemlerinin mekanik yolla zarara uğratılması durumunda da gözlenebildiği belirtilmektedir (KROSING, 1978). Bu verilerden, ksilem farklılaşması eksikliği veya engellenmesinin, bor beslemesinin dolaylı etkisiyle ilişkili olduğu sonucuna varılmakta ve bor kıtlığının bitkideki ilk belirtisinin ksilem farklılaşmasında değil, primer hücre çeperindeki değişikliklerde yoğunlaştığı belirtilmektedir (KROSING, 1978). Diğer yandan, bitkilerde bor beslenmesi, oksin miktarı, lignifikasyon ve farklılaşma arasındaki ilişkilerin de çok belirli olmadığı belirtilmekle birlikte, bor kıtlığı olan bitkilerde oksin miktarının normalden daha fazla olduğu ve bitkiye dışarıdan uygulanan IAA nın, bor kıtlığındaki olaylara benzer şekilde, kök uçlarında anatomik değişiklikler oluşturduğu 14

32 göstermiştir (COKE ve WHITTINGTON, 1968). Bu olgu da bizi, bitkide bor kıtlığı semptomlarını artan oksin miktarının oluşturduğu yorumuna götürmektedir (ROBERTSON ve LOUGHMAN, 1974). Bununla beraber, bor kıtlığı ve fazla IAA miktarlarının bitkilerde neden olduğu ultrastrüktürel değişimlerin oldukça farklılık gösterdiği de ortaya konmuştur (HIRSCH ve TORREY, 1980). Ayrıca bitkilerdeki bor kıtlığı belirtileri, dokuların IAA miktarlarında artma olmadan da gözlenebilmektedir (HIRSCH ve ark., 1982). Bu durum, kıtlığın erken safhalarında, apikal dokularda düşük IAA miktarının oluşması şeklinde ortaya çıkmaktadır (FACKLER ve ark., 1985). Bununla birlikte, (SMIRNOV ve ark., 1977) tarafından değişik bitki türleri ve organlarında yapılan çalışmalarda, IAA miktarı ve bor kıtlığı belirtileri arasında önemli bir korelasyon bulunmadığı da gösterilmiştir. Bitki hormonlarının etkinlik mekanizması ışığında, yeterli bor ve kıt bor içeren ortamlarda yetiştirilen bitkilerin dokularındaki toplam IAA miktarı tayinleriyle, borun IAA metabolizmasındaki rolünün aydınlatılması oldukça karmaşık ve güç görünmektedir. Tang ve Dela Fuente (1986), tarafından yapılan daha spesifik araştırmalarda, bor eksikliği olan hipokotil segmentlerinde bazipetal IAA taşınımının engellendiği gösterilmiştir. Bu olay, kalsiyum eksikliğinde ve bor kıtlığında bozulan membran bütünlüğünün belirtilerinde olanlarla benzerdir. Bazipetal IAA taşınımı üzerine olan benzer bir etki, kuersetin gibi belirli flavonoidler tarafından da oluşturulabilmektedir (JACOBS ve RUBERY, 1988). Bor, IAA ve doku farklılaşması arasındaki ilişkiler, borun fenol metabolizması üzerine olan primer etkilerinin sebep olduğu sekonder olaylar da olabilir (LEWIS, 1980; PILBEAM ve KIRKBY, 1983). Belirli fenollerin, sadece kök uzamasını engellemekle kalmayıp, aynı zamanda ışınsal hücre bölünmesini de artırdıkları ve bu durumun IAA'nın neden olduğu anatomik değişimlere benzediği rapor edilmiştir (SVENSSON, 1971). Bitkilerde bor, IAA ve fenol metabolizması arasındaki ilişkiler konusunda, değişik deney koşullarında yapılmış ve sonuçları çelişkili olan pek çok araştırma vardır. Örneğin, bor kıtlığı nedeniyle oluşan yüksek IAA miktarının, sadece kafeik asit (IAA oksidaz aktivitesinin etkili inhibitörü) gibi fenolleri biriktirebilen bitki türlerinde oluştuğu gösterilmiştir (BIRNBAUM ve ark., 1977). Buna karşılık, bitkilerde bor- absisik asit ilişkileri, tam anlamıyla bir sorun olarak kalmaktadır. Abiyotik ve biyotik streslere maruz kalan bitkilerde, hormon metabolizması ve 15

33 içeriğinin değişime uğradığı bilinen bir olgudur. Bu açıdan, absisik asit (ABA) su kıtlığı, tuzluluk, mineral besleme stresleri vb. kötü şartların oluşması durumunda, bitkiyi savunma önlemleri almaya iten, büyüme ve gelişmeyi baskı altına alan bir bitki hormonudur (DAVIES, 1995). Özellikle glikofitlerde, sodyum stresine karşı bir adaptasyon mekanizması olarak bilinen endogen ABA miktarındaki artış, bitki hücre ve dokularının bütününde çok önemlidir LA ROSA ve ark., (1985). Ayrıca ABA, bitkilerde stoma kapanmasına sebep olan en etkin hormon olup, transpirasyonla su kaybını azaltmaktadır (HARRIS ve OUTLAW, 1991). Diğer yandan ABA, bitkide gövde büyümesini (CREELMAN ve ark., 1990) ve yaprak alanı genişlemesini sınırlandıran (VAN VOLKENBURGH ve DAVIES, 1983), kök büyümesini teşvik eden (SHARP ve ark., 1994) ve su eksikliğine karşı bitkiyi korumada da etkin bir bitki hormonudur. Bununla birlikte, literatürde bitkilerde bor ve ABA ilişkisine yönelik çalışmalar çok yetersizdir. Bu açıdan, aşırı bor uygulanan Hordeum vulgare L. bitkilerinde artan bor konsantrasyonlarına paralel olarak ABA konsantrasyonunun arttığı (AYVAZ, 2002); yine bor fazlalığı koşullarında Daucus carota L. kök kalluslarında yapılan bir çalışmada ABA miktarının arttığını gösteren sonuçlar verilmiştir (DEMİRAY ve DEREBOYLU, 2006). Absisik asitin (ABA) de lateral kök başlangıcını etkilediği bildirilmektedir (HOOKERT ve THORPE, 1998). Bor elementi fazlalığında havuç kök kalluslarında ABA miktarının arttığı DEMİRAY ve DEREBOYLU nun,(2006 )çalışmasında bildirilmiştir. Öksinle indüklenmiş ABA lateral kök oluşumunda önemli rol oynamaktadır (DE SMET ve ark., 2006). Yine de çok hücreli organizmada, tek bir hormonal sinyale tepkinin hücre tiplerinin hassaslık ve tepki modu farklılıklarının bir karışımı olacağı akıldan çıkmamalıdır. ABA için de durum böyledir (LIANG ve HARRIS, 2005). Oksidatif strese uğrayan bitkilerde oluşan reaktif oksijen türlerinden hidrojen peroksit (H 2 O 2 ) Halliwel-Asada döngüsünde elimine edilmektedir (MITTLER, 2002). Bu döngüde glutatyon ve askorbat, askorbat peroksidaz (APX) ve glutatyon redüktaz (GR) enzimleri ile oksitlenip, yeniden indirgenmekte olup, antioksidatif yanıt için askorbat ve glutatyonun yenilenme süreci çok önemlidir. Bu süreçte monodehidroaskorbat redüktaz (MDHAR), dehidroaskorbik asit redüktaz (DHAR), APX ve GR enzimleri rol oynamaktadır (BLOKHINA ve ark., 2003; ISHIKAWA ve ark., 2006). Bor stresi koşullarında iki farklı arpa çeşitinde (Hordeum vulgare L.) yapılan GR aktivitesi tayinleri sonuçlarına göre, bora dayanıklı olan çeşitte kök ve yaprak dokularında GR aktivitesi yönünden bir farklılık ortaya çıkmazken, bora duyarlı arpa çeşidinin yaprak dokularında bir artış, kök dokularında ise anlamlı bir GR akitivitesi azalışı bulunmuştur (KARABAL ve ark., 2003). Bor stresine maruz 16

34 kalan Citrus grandis L. bitkilerinde ise GR aktivitesinde artış olduğu bulunmuştur (HAN ve ark., 2009). Bundan başka, bitkilerde oksidatif strese karşı beliren antioksidatif savunma mekanizmasında rol oynayan enzim sistemleri içinde, reaktif oksijen türlerinden hidrojen peroksiti (H 2 O 2 ) askorbat-glutatyon döngüsü içinde yok etme yollarından biri de askorbat peroksidaz (APX) vasıtasıyla gerçekleştirilmektedir (ASADA, 1999). Bu kapsamda, aşırı bor stresine uğratılan domates bitkilerinde (CERVILLE ve ark., 2007), arpada (KARABAL ve ark., 2003) ve greyfrutta (HAN ve ark., 2009) APX enzim aktivitesinin anlamlı şekilde arttığı, buna karşın, asmada (GUNES ve ark., 2006) ise azaldığını gösterir bulgular elde edilmiştir. Diğer yandan, hidrojen peroksiti (H 2 O 2) doğrudan oksitleyen katalaz (CAT) ğibi antioksidan enzimlerin bor toksisitesine yanıtını irdeleyen (MOLASSIOTIS ve ark.,2006), 1 mm den 6 mm e kadar olan bor uyguladıkları elma kök sürgünlerindeki katalaz aktivitesinin, aşırı bor uygulama grubunda azaldığını saptamışlardır. Yine elma kök sürgünlerinde yapılan diğer bir çalışmada ise, katalaz aktivitesinin arttığı görülmüştür (SOTIORPOULOS ve ark., 2006). Bu kapsamda, aşırı bor uygulanan Citrus grandis L. Bitkilerinde gerçekleştirilen bir çalışmada, katalaz aktivitesinde azalma (HAN ve ark., 2009); asmada (Vitis vinifera L.) ise artış belirlenmiştir (GUNES ve ark., 2006). Bor stresi koşullarında yetiştirilen bora duyarlı ve dirençli iki arpa çeşiti ile yapılan bir çalışmada, yaprak ve kök dokularındaki katalaz enzim aktivitesi tayinine ilişkin bulgular, her iki çeşit bitki yapraklarında bu enzim etkinliği yönünden bir farklılık oluşturmazken, bora duyarlı arpa çeşiti kök dokularındaki katalaz aktivitesinin arttığı bulunmuştur (KARABAL ve ark., 2003). Bunun yanı sıra, aşırı bor etkisinde kalan domates bitkilerinde de katalaz etkinliğinin yükseldiği görülmüştür (CERVILLE ve ark., 2007). Bundan başka, bitkilerde oksidatif stres ile oluşan reaktif oksijen türlerinin enzimatik bertaraf yolunda; süperoksiti (O 2-) hidrojen peroksite (H 2 O 2 ) indirgeyen süperoksit dismutaz (SOD; EC ), hidrojen peroksiti askorbat-glutatyon döngüsünde oksitleyip yıkan askorbat peroksidaz (APX; EC ) ve glutatyon redüktaz (GR; EC ), ya da hidrojen peroksiti doğrudan oksitleyen katalaz (CAT, EC ) gibi antioksidan enzimlerin rol oynadıkları saptanmıştır (ASADA, 1999). Bu yönüyle, bitkilerdeki SOD aktivitesi artışının da, stresle nedeniyle reaktif oksijen türleri üretimindeki artışla bağlantılı olabileceği bildirilmiştir (MITTLER, 2002). Bu çerçevede, toksik bor koşullarında yetiştirilen iki arpa çeşitinde yapılan çalışmada, bora dayanıklı nitelenen Anadolu çeşidinde SOD 17

35 aktivitesi yününden anlamlı değişimler görülmezken, bora hassas olan Hamidiye çeşiti kök hücrelerinde SOD aktivitesinde artış, yaprak doku hücrelerinde ise azalma olduğu bildirilmiştir (KARABAL ve ark., 2003). Yine bor stresine uğratılan iki farklı domates çeşitinin, SOD aktivitesi yönünden farklı tepkiler verdikleri görülmüştür. (CERVILLE ve ark., 2007). Öte yandan, aşırı bor uygulanan elma kök sürgünlerinde (MOLASSIOTIS ve ark., 2006; SOTIROPOULOS ve ark., 2006), asma bitkisi yapraklarında (GUNES ve ark., 2006) ve greyfrutta (HAN ve ark., 2009) ölçülen SOD aktivitesinin artış gösterdiği rapor edilmiştir. Bitkilere uygulanan aşırı bor konsantrasyonlarının oksidatif bir strese neden olupolmadığını belirlemek amacıyla, yaprak dokusu hücre membranlarında oluşabilecek olası bir lipit peroksidasyonunun göstergesi olarak, tiyobarbitürik asit reaksiyonu ürünü olan malondialdehit (MDA) miktarındaki değişimlerin irdelendiği araştırmalarda; aşırı bor uygulanan domateste (CERVILLA ve ark., 2007), elma kök sürgünlerinde (MOLASSIOTIS ve ark., 2006) ve ASMADA, (GUNES ve ark., 2006) MDA miktarının arttığı, arpada ise gövdede artış göstermekle birlikte, kökteki MDA miktarının azaldığı rapor edilmiştir (KARABAL ve ark., 2003). Ayvaz ın 2009 yılında yaptığı çalışmada ülkemiz topraklarında tarımı yapılan altı farklı patates (Solanum tuberosum L.) kültür çeşidi materyal olarak kullanılmıştır. Materyale bor uygulaması, kontrol ve 6 farklı aşırı bor konsantrasyonunda) yapılmıştır. On beş gün bor uygulaması sonunda hasat edilen bitkilerde, gövde uzunluğu, gövde ve kök yaş ağırlığı, klorofil floresansı (Fv/Fm), malondialdehit (MDA), askorbat (AA), dehidro askorbat (DA), glutatyon (GSH), oksitlenmiş glutatyon (GSSG), total protein, içsel indol-3-asetik asit (IAA) ve absisik asit (ABA) miktarları, süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT), askorbat peroksidaz (APX), glutatyon redüktaz (GR) enzim aktiviteleri tayin edilmiştir. Elde edilen bulgulara göre, uygulanan bor miktarı artışı ile bitkilerin gövde boyunda istastistiksel önemde olmayan; gövde ve kök yaş ağırlıklarında ise, uygulanan bor miktarı artışı ile anlamlı bir azalmanın olduğu saptanmıştır. Klorofil floresansına ilişkin 12.5, 25 ve 50 mm bor konsantrasyonlarının, patates kültür çeşitlerinde fotosentezi önemli ölçüde ve olumsuz yönde etkilediği bulunmuştur. Malondialdehit (MDA) miktarındaki değişim, uygulanan bor miktarı artışı ile Van Gogh dışındaki tüm kültür çeşitlerinde azalma yönündedir. Total askorbat miktarları, uygulanan bor miktarı artışı ile Van Gogh'da değişim göstermezken, diğer tüm kültür çeşitlerinde, genellikle 2.5 mm bor uygulamasından başlayarak ve artan bor 18

36 konsantrasyonuna zıt şekilde giderek azalmaktadır. Çeşitler arasında oksitlenmiş glutatyon miktarı bir değişim göstermezken; Resy, Sultan, Agatha kültür çeşitlerinde 5mM ve yüksek bor konsantrasyonları, indirgenmiş glutatyon miktarını artırmıştır.total protein içeriği, Van Gogh, Agria ve Granola çeşitlerinde, bor uygulamasıyla önemli bir değişime uğramamış; Resy ve Agatha çeşitlerinde, bor konsantrasyon artışına paralel azalma görülmüş, Sultan çeşitinde artmıştır. İncelenen patates çeşitlerinde, SOD ve GR aktiviteleri, uygulanan aşırı bor konsantrasyonuna ve çeşite bağımlı değişik tepkiler vermiştir. CAT aktivitesi, genel olarak tüm çeşitlerde, bor konsantrasyonu artışına paralel olarak azalmış, APX aktivitesi ise artmıştır. Yapılan bor uygulamaları, tüm çeşitlerde IAA miktarında artışa neden olurken, ABA içeriğinin çeşit ve bor konsantrasyonu ile değişim gösterdiği saptanmıştır (AYVAZ, 2009) Bitkisel Hormonların Bitki Gelişimi Üzerine Etkileri Bitkisel hormonlar, bitkilerin yaşamları boyunca tüm fizyolojik olaylarda görev üstlenerek olağanüstü olayların gerçekleşmesini sağlayan mükemmel kimyasal maddelerdir. Değişik türlerin dokularında bulunan büyüme maddeleri potansiyel olarak yaygın düzenleyici sistemlerdir (CAPPIELLO ve KLING,1994). Büyüme hormonlarının fizyolojik etkileri konsantrasyonlarına, çevresel faktörlere, bitki türlerine ve bitkinin yaşına bağlı olarak değişebilmektedir. Başlıca fizyolojik etkileri olarak, hücre bölünmesi, hücre uzaması ve genişlemesi, morfogenez, tohum ve tomurcuk dormansisi, embriyo gelişimi ve tohum çimlenmesi, çiçeklenme, büyüme, meyve oluşumu, gelişimi ve olgunlaşması, partenokarpik meyve oluşumu, apikal dominansi, senesens, kloroplast gelişimi ve klorofil sentezi, nükleik asit ve protein sentezi, enzim sentezi ve aktivasyonu, tuber oluşumu, kök oluşumu, kambiyal aktivite, absisyon, strese adaptasyon mekanizması, ozmotik düzenleme üzerine etkileri sayılabilir (SALISBURY ve ROSS, 1992; PALAVAN-ÜNSAL, 1993). Bitkisel hormonlar, bitkiler üzerindeki teşvik edici ve geciktirici özellikleri nedeniyle iki ana grupta incelenebilirler. Bitki büyüme ve gelişmesini başlatıp hızlandıranlara uyarıcı (stimülatör), büyüme ve gelişmeyi yavaşlatıp durduranlara da engelleyici (inhibitör) denilir. Bitki büyümesini düzenleyen hormonlar günümüzde altı tiptir. Bunlardan bitkide uyarıcı etki yapan hormonlar, oksinler, gibberellinler, sitokininler ve brassinosteroidlerdir. Bitkide büyümeyi engelleyen hormonlar ise, absisik asit ve etilendir (KAYNAK ve İMAMGİLLER,1997). 19

37 Teşvik edici ve geciktirici olarak etkileri bulunan büyüme hormonları bitki içinde ksilem ve floem dokuları ile taşınmaktadır, ayrıca iletim demetleri dışında, parankima hücrelerinde de taşındıkları belirlenmiştir (PALAVAN-ÜNSAL, 1993). Çoğu bitkilerde, içsel ve dışsal büyüme maddelerinin ksilem özsuyu içinde dağılımı ve akışkanlığıyla, sürgün büyümesi arasındaki ilişkiye dair bilgi mevcut değildir. Yaprak farklılaşması ve erken çiçek tomurcuğu oluşum dönemlerinde, ksilemde salgı akışkanlığı, ergin yeşil yaprak dönemiyle kıyaslandığında fazla olmuştur. Bununla birlikte, ergin yeşil dönemde, akışkanlıkta gözle görülebilir bir azalma görülmüştür. Okhawa tarafından mangoda ksilem salgısının üretiminin çiçeklenme döneminde arttığı, buna karşın üzümlerde ksilem salgısının akışkanlığının tomurcuk dinlenmesinin kırılmasıyla artıp, çiçeklenme döneminde azaldığı bulunmuştur (ÜLGER, 1997). Bitkinin hem generatif hem de vegetatif gelişiminde oldukça büyük etkileri olan ve bitki bünyesinde doğal olarak bulunan hormonların varlığından veya yokluğundan, cinsinden, etkisinden ve varsa miktarından emin olmak gerekir. Bitki bünyesinde bulunan büyüme düzenleyicilerinin, cins ve miktar bakımından, dönemsel olarak değişim gösterdikleri bilinmektedir. İçsel büyüme düzenleyicileri, türler ve çeşitler hatta tipler arasında değişik düzeylerde olabilmektedir. Bitkinin çeşitli organları da içsel büyüme düzenleyicileri bakımından farklı sonuçlar vermektedir. Bünyede bulunan büyüme düzenleyicilerinin, farklı dönemlerdeki değişimleri saptanırsa, dışarıdan yapılacak hormon ilavelerinde, bitkiye uygulanacak dozun sınırlarının belirlenmesi kolaylaşacaktır (KAYNAK ve ERSOY,1998). Bitki bünyesinde bulunan ve dönemsel olarak değişimler sergileyen içsel büyüme hormonları günümüzde bitki dokularından dietileter, metanol veya etil asetat gibi organik çözücülerle ekstre edilerek elde edilmektedir. Ayrıca bitkisel hormonların tespitinde ultraviyole ve infrared spektroskopisi, gaz kromatografisi-kütle spektroskopisi, ince tabaka kromatografisi, vb hassas fizikokimyasal teknikler kullanılmaktadır (ERGÜN, 1997). Yüksek basınçlı sıvı kromatografisi de bu hassas teknikler arasında yer almaktadır. Bitkilerdeki hormonlar (fitohormonlar), çok düşük konsantrasyonlarda bulunmaktadırlar. Bu sebeple, bunları kusursuz bir şekilde doğru olarak belirlemek için, çok özel tekniklere ihtiyaç vardır. Yüksek performanslı sıvı kromatografisi (HPLC), belli bir süreden beri, bitki büyüme ve düzenleyicilerinin analizi için vasıta olmuştur. Bu teknik, son yıllarda bitki büyüme düzenleyicilerinin analizi için sıkça kullanılmaya başlanmıştır (HARDIN ve STUTTE 1981). HPLC, biyolojik materyalde bulunan maddelerin oldukça yüksek bir etkinlikte ayrılması, 20

38 izole edilmesi, belirlenmesi ve ölçülmesine izin veren bir metoddur. Özellikle, HPLC nin gelişmesi sitokinin, gibberellinler, IAA ve ABA nın belirlenmesi ve ayrılması gibi fizikokimyasal metodların da gelişmesini sağlamıştır (BAYDAR ve ÜLGER, 1998). Tekniklerdeki bu gelişmelere bağlı olarak gelecekte büyümeyi düzenleyici maddelerin kullanımı konusunda, hızlı bir gelişmenin olacağı bir gerçektir. Bu tip gelişmeler yaşanırken, yapılacak çalışmalarda dikkate alınması gereken bir nokta da, mümkün olduğu kadar doğal büyüme hormonları üzerine çalışmaların yaygınlaştırılması gerekliliğidir. Tüm dünyada, gün geçtikçe organik tarıma karşı ilginin ve çevre kirleticilerine karşı duyarlılığın artması, bunu zorunlu kılmaktadır (BARUT,1995). Oksin tipindeki BBD ler tarımda en eski kullanılan hormonlardır (HALLORAN ve KASIM, 2002). Bunlar daha ziyade hücre genişlemesine ve büyümeye neden olan maddeler olup, hücre uzaması, doku gelişimi ve kök oluşumu bunlarla teşvik edilmektedir. Bitki hormonu olan oksin bütün yüksek bitkiler tarafından sentezlenir ve en çok bulunan oksin formu ise Indol-3-asetik asit (IAA) tir (GRUNEWALD ve ark., 2009). Araştırıcılar IAA in doğal olarak oluşan tek oksin olduğunu belirtmişlerdir. Doğal oksinler daha ziyade tepe tomurcukları ve yapraklarda meydana gelirler ve bitkide tepeden aşağı doğru inerler. IAA bitkinin büyüme gösteren uç kısımlarında (koleoptil ucu, tomurcuk, yaprak ve kök ucu) oldukça fazla bulunmaktadır. Oksinin kimyasal yapısının aydınlatılmasından sonra, yapı olarak IAA e az veya çok benzeyen birçok kimyasal maddenin bitkilerde oksin gibi etkiler oluşturduğu belirlenmiştir. IAA dışında en yaygın bulunan oksinler; indol bütirik asit (IBA), naftalin asetik asit (NAA), naftoksi asetik asit (NOAA), fenoksi asetik asit (FOAA), 2,4-D, fenil asetik asit (FAA), parakloro fenoksi asetik asit (4- CPA) ve 2,4,5-triklorofenoksi asetik asit (2,4,5-T) lerdir (KUMLAY ve ERYİĞİT, 2011). Çeşitli kaynaklarda oksinin bitkilerde bor elementi bulunduran dokularda birikerek nekrozlara neden olduğundan ve oksin metabolizması ile bor eksikliği arasında yakın bir ilişkinin bulunduğundan söz edilmektedir (SEÇER, 1989). Bu maddelerin bitkilerdeki bazı fonksiyonları şunlardır (RAVEN ve ark., 1992; SALISBURY ve ROSS,1992; KAYNAK ve ERSOY, 1997; KAYNAK ve MEMİŞ, 1997; HALLORAN ve KASIM, 2002), 21

39 a) Oksinler çok yönlü veya polar olarak taşınabildiklerinden hücreden hücreye aktarılması mümkün olabilmektedir. Bitkilerde hücre bölünmesini, büyümeyi ve gelişmeyi hızlandırma yönünden etkilidir. b) Hücrede osmozu artırdığı, hücrenin suya karşı geçirgenliğini kolaylaştırdığı, hücre çeperi esnekliğini ve genişliğini artıran spesifik RNA ve protein yapısındaki enzimlerin sentezini artırarak hücre büyümesinde etkili olduğu tespit edilmiştir. Bu durum tohum kabuğu sert olan bitkilerde tohum çimlenme problemlerine bir çözüm olabilir (SEÇER, 1989). c) Adventif kök gelişimini sağlama; özellikle vejetatif olarak çoğaltılan ağaçsı bitkilerin kesilen yüzeylerinin IAA ile muamelesinden ticari manada önemli sonuçlar alınmıştır. Yani oksin uygulamasıyla, gövde segmentlerinden köklendirme yapılmasında başarı sağlanmıştır. d) Partenokarpik meyvelerin elde edilmesi; Tozlaşma olmadığında genelde çiçek ve meyve de oluşmaz. Bazı bitkilerde normal meyve gelişimi için bir yumurta hücresinin döllenmesi yeterlidir. Ancak, elma veya kavun gibi bazı bitkiler ise yumurtalık duvarının olgunlaşması ve etsi hale gelmesi için çok sayıda tohumun döllenmesine gerek vardır. Bazı bitki türlerine oksin (Naftoksi Asetik Asit=NOA) uygulanmasıyla döllenme (tozlaşma) olmaksızın partenokarpik meyvelerin elde edilmesi mümkündür. Solanaceae familyasına ait çoğu bitkilerde, döllenmemiş ovaryumlarda meyve tutmasını teşvik ederler. Bunlar; çekirdeksiz hıyar, domates, patlıcan, kavun, karpuz gibi bitkilerdir. Ayrıca; patates, fasulye, mısır, şeker pancarı vb gibi tarımsal öneme sahip birçok bitki türünde kuru madde miktarını artırmaktadır (SEÇER, 1989; KAYNAK ve ERSOY, 1997; KAYNAK ve MEMİŞ,1997). e) Yaprak ve meyve dökülmesinin engellenmesi Yaprak, çiçek ve meyvelerin dökülmesinin kontrolü tarımda çok büyük bir önem arz etmektedir. Özellikle her dem yeşil yapraklı kalması istenen süs bitkilerinin taşınmasında ve hasat öncesi narenciye meyvelerinin dökülmesinin engellenmesinde oksin uygulanır. Bunun yanında oksinin fazla uygulanması meyve dökülmesini hızlandırabilir. Elma veya zeytin gibi meyvelerde meyve seyrekleşmesini sağlamak ve geri kalan meyvelerin daha iyi olgunlaşmasına sebep olmak için oksin (NAA) uygulanır. Bu uygulama sonucu, mevsim sonu ham meyve dökülmesi engellenmektedir. f) Bitkilerde yüksek oksin konsantrasyonu, uç kısımlarda büyümenin hızlı olduğu dönemlerde, alt kısımlardaki tomurcukların uyanmaları engellenmekte ve bunlar sürememektedir. Buna apikal dominansi (tepe tomurcuğu baskısı) denir. Oksinler ışığa 22

40 duyarlı olup ışıkta inaktive edilmeleri sonucu, hücre büyümesini yavaşlatırlar ve fototropizm olarak bilinen bitkilerin tek taraflı ışıklandırılmalarında ışığa doğru yönelme olayına neden olurlar. NAA ayrıca pamukta çiçeklenmeyi teşvik etmekte, meyve ağaçlarında açılan yaraların NAA katkılı yara macunu ile kapatılması halinde kesilmiş bölgelerden yeniden sürgün oluşumu görülebilmektedir (WESTWOOD, 1993) ve ayrıca oksinin hücrede morfojen (form oluşturucu) olarak rol oynadığı düşünülmekte, yaprak pozisyonunun belirlenmesinde de iş gördüğü bildirilmektedir (BYRNE, 2005). g) Yabancı otların kontrolünde etkilidir. 2,4-D ve pikloram gibi bazı sentetik oksinler, tarım alanlarındaki yabancı otların kontrolünde geniş oranda kullanılmaktadır. 2,4-D li bileşikler bitkilerde floem taşınımı, absorbsiyon ve fotosentez gibi birçok bitki fonksiyonunda bozukluklara neden olurlar (KAYNAK ve MEMİŞ, 1997). Son yıllarda yapılan çalışmalarda, 2,4-D li bileşiklerin kanserojenik etkisinden dolayı, domates ve patlıcanda kullanımı yasaklanmıştır. Bu bileşiklerin çok yüksek dozda kullanılması, hassas meyve çeşitlerinde koflaşma, lobların irileşmesi ve içi boş bir yapının oluşması, bazı çeşitlerde ise çiçek burnu veya sap çukurunda meme oluşumu ve şekil bozuklukları ortaya çıkmış, meyve etinde kabalaşmalar meydana gelmiştir. İlk defa Japonya da Gibberella fujikuroi mantarlarından izole edilmiş, bu mantarın çeltikte aşırı boy uzamasına neden olmasıyla fark edilmiştir (SEÇER, 1989). Günümüzde 76 kadar değişik gibberellin, bitki türlerinden ve Gibberella fungusundan izole edilerek özellikleri belirlenmiştir. Tarımsal üretimde ve özellikle de bahçe bitkilerinde kullanılan gibberellin hormonu, çoğunlukla Gibberella fungusundan fermantasyon yoluyla elde edilmektedir. Bugün bilinen 100 e yakın GA serisi bulunmakta olup, bunların 50 den fazlası bitki tohumlarında bulunmuştur. Ancak, ticari amaçla en yaygın kullanılan GA 3 tür (GÜLERYÜZ, 1982; WALSH, 2003; WESTWOOD, 1993). Malt sanayinde üretimden ve zamandan avantaj sağlamak için, şeker kamışı, kereviz ve enginarda hasat verimini artırmak için, kabakgillerde cinsiyet özelliğini kontrol etmek ve hibrit tohum üretiminde ebeveyn hatları muhafaza etmek için kullanılırlar. Hücrenin hacim olarak büyümesi ve sonuçta bölünmesinde (meristem oluşumu) etkili maddelerdir. Bu sebeple büyüme ve gelişmede etkilidirler. Ayrıca bazı bitkilerde dormansinin sona ermesinde kullanılır (KUMLAY ve ERYİĞİT, 2011). 23

41 Gibberellinlerin bitkilerdeki bazı fonksiyonları şunlardır (BUDAK, 1994; KAYNAK ve ERSOY, 1997; KAYNAK ve İMAMGİLLER, 1997; KAYNAK ve MEMİŞ, 1997), a) Genetik olarak bodur bitkilerde uzamayı sağlar, gövde büyümesinde kırmızı ışığın engelleyici etkisini tersine çevirerek gövde uzamasını teşvik eder. Bazı bitki türlerinde erken çiçeklenmeyi teşvik ettiğinden çiçeklenme ve melezleme erkene alınabilmekte ve ıslah çalışmalarında sürenin kısaltılması mümkün olabilmektedir. Gibberellin uygulamasıyla büyüme hızlanacağından, bu bölgelerde alınacak parçaların virüssüz olma ihtimali de çok yüksek olacaktır. b) Bazı tomurcuklarda veya yumrularda dormansinin kırılmasını sağlar, apikal tohumlarda da dormansiyi kırararak çimlenmeyi arttırır. c) Uzun gün şartları ve soğuklama ihtiyacı gösteren bitkilerde, giberellin uygulanması halinde bu şartlar sağlanmasa da çiçeklenme sağlanabilir. d) Oksinlerde olduğu gibi bazı meyve türlerinde partenokarpik meyve gelişimini sağlar (özellikle oksinlerin etkili olmadığı türlerde etkili). Gibberellin çiçeklenmeden belirli bir süre önce verildiğinde çekirdeksizliği, çiçeklenmeden sonra verildiğinde ise tane irileşmesini sağlar. Üzümlerde tane ve salkım büyüklüğünü artırmak amacıyla kullanılmaktadır. e) Işığa hassas olan tohumlarda çimlenmeyi teşvik eder ve büyümenin geniş devresini uzatarak bitkilerin uzun süre yeşil kalmasını sağlar. Özellikle yeşil aksamı yenilen sebzelerle çiçekçilikte çok önemlidir. Sesquiterpen yapısındaki bir maddedir. Oksin, gibberellin ve sitokinin gibi büyümeyi hızlandırıcıların doğal antagonistidir. Bitkilerin hemen her yerinde ve her zaman bulunur. Yalnız çevre şartları değiştikçe azalır veya çoğalır. Buna bağlı olarak da fizyolojik olaylardaki etkisi de değişir. Normalde dormansi halindeki tohum ve tomurcuklarda yüksek miktarlarda bulunmakta ve dormansiyi sürdürücü bir etkiye sahip olduğu düşünülmektedir. Ancak, yaprak gövde ve meyvelerde de bulunur. Ticari olarak kullanımı pek olmasa da zaman zaman büyümeyi engelleyici olarak kullanılmaktadır. Bitkiler bünyelerinde ürettikleri ABA yı yaprak dökülmesi olacak bölgelere gönderirler ve bu yolla sonbaharda yaprak dökülmesi görülür. Bitkisel üretimde ABA hem tabi olarak hem de sentetik olarak üretilebilmektedir (KUMLAY ve ERYİĞİT, 2011). 24

42 Bitkilerdeki fonksiyonları şunlardır (SEÇER, 1989; RAVEN ve ark., 1992; KAYNAK ve ERSOY, 1997), a) ABA çoğu bitki türlerinde stomaların kapanmasını teşvik eder. ABA nın RNA ve buna bağlı olarak protein sentezini yavaşlattığı ve su stressi altında bulunan bitkilerde CO 2 ile birlikte stomaların kapanmasına sebep olduğu bilinmektedir. ABA sentezi su yetersizliği ile arttığına göre, terleme sırasında stomaların düzenlenmesindeki etkisi kuvvetle muhtemeldir. b) Tek yıllık bitkilerde tohum, iki ve çok yıllık bitkilerde ise tomurcuk ve yumru gibi depo organlarında büyümeyi engellerler. Danedeki depo proteini üretimini uyarır ve aynı zamanda tohumların erken çimlenmesinin engellenmesinden de sorumludur. Çoğu tohumlarda dormansinin kırılması tanedeki ABA seviyesinin azaltılmasıyla ilişkilidir. 25

43 3- GEREÇ VE YÖNTEM 3.1. Materyal Bitki materyallerinin temini Projede Hamurcu ve ark.,. (2006) tarafından yapılan araştırmada bora tepkileri daha önce belirlenmiş olan. Pisum sativum L. türüne ait olan meyvesi ve tohumu yenen yemeklik S2 hattı ile Pisum arvense L. türüne ait olan yemlik hat, Taşkent ve Özkaynak yemlik tescilli çeşitleri kullanılmıştır Metot Laboratuvar çalışmaları fakülte idaremizin gösterdiği yer ve sağladığı altyapı olanaklarına paralel olarak TÜBİTAK projelerinden temin edilen desteklerle faal hale getirilmiş olan Bitki Fizyolojisi laboratuarlarında yapılmıştır (Resim 1). Resim 1. Bitki Fizyolojisi Laboratuvarları Deneme serilerinin hazırlanması Araştırmada kullanılan bitkiler iklim odasında kontrollü koşullarda yetiştirilmişlerdir (Resim 1). İklim odası; bitkilerin tohum çimlenmesi ve çimlenme sonrası genç fidecikleri, 26

44 büyüme ve gelişme süresince % nem, 16 saat aydınlık ve 8 saat karanlık fotoperyod, 21±1 0 C sıcaklık ile Lüx/Gün ışık intensitesi olacak şekilde ayarlanmıştır. Denemede kullanılan tohumlar önce %5 lik sodyum hipoklorid ile 10 ar dakika muamele edildikten sonra de-iyonize su (di -H 2 O) ile 3 kez yıkanarak sterilize edilmişlerdir. Daha sonra her dört grup için de (Pisum sativum L. S2, Pisum arvense L.602, Taşkent, Özkaynak) ) su kültürü düzeneği kurulmuştur (Resim 1). Bezelye hatlarına ait tohumlar 2 saat deiyonize suda şişirildikten sonra nemli filtre kağıdı içeren petrilere yerleştirilerek 4 0 C de gece boyunca bekletilmiş, çimlenen tohumlar, naylon telin üzerine alınarak 0.5 mm lık CaCl 2 solüsyonunda 25 0 C de karanlıkta inkübe edilmiştir (Resim 2). Daha sonra fideler sürekli havalandırılan 1/5 lik Hoagland solüsyonuna aktarılarak (ph 6.0) bitki büyüme odasında yetiştirilmiştir (Resim 1). İlk üç yapraklı evreye gelen bitkilere 0, 2, 20 ve 200 mg L -1 dozlarında bor içeren 1/5 lik Hoagland solüsyonu tatbik edilmiştir. Bitkiler ilk üç yapraklı evresinde araştırmada belirtilen bor dozlarının uygulanmaya başlandığı 0. günde, daha sonra bor uygulamasını takip eden günden itibaren ilk tepkilerin görülmeye başlandığı gün olan 7. günde son olarak 8. günlerde hasat edilmiş ve hasat edilen örnekler analizlere kadar C de derin dondurucuda saklanmışlardır. Resim 2. Bezelye hat ve çeşitlerine ait tohumların çimlendirme işlemleri. 27

45 Analiz yöntemleri Bor elementinin bezelye bitkilerindeki fizyolojik etkileşimini belirlemek ve amaçta belirtilen hedeflere ulaşabilmek için hasat edilen bezelye örneklerinde aşağıda belirtilen çalışmalar yapılmıştır; Büyüme parametrelerinin ölçülmesi, Bağıl su içeriğinin belirlenmesi, Bitkilerde bor analizi, Büyüme parametreleri Dozlarına göre bor uygulanmış gruplardan; 0, 3 ve 8. günlerde hasat edilen bezelye hat ve çeşitlerinin kök ve gövdeleri birbirinden ayrılmıştır. Kök ve gövdenin uzunlukları ölçülmüş, yaş ve kuru ağırlıkları tartılmıştır. Örnekler 70 0 C de 72 saat etüvde kurutulduktan sonra kuru ağırlıkları da belirlenmiştir Bağıl su içeriği Bor uygulamasına bağlı hasat günlerinde her bir gruptaki bitkilerin en genç sürgünlerinden sonra gelen lateral yaprakların uç kısımlarından seçilen 6 adet yaprak örneği alınarak (6 ayrı bitki örneğinden) yaş ağırlıkları (YA) belirlenmiştir. Sonra 6 saat boyunca di- H 2 0 içinde petri kaplarında bekletilerek turgor haline gelmeleri sağlanmış ve bu durumdaki turgorlu ağırlıkları (TA) alınmıştır. Daha sonra bu yapraklar 70 0 C de 72 saat etüvde kurutulduktan sonra kuru ağırlıkları (KA) saptanmıştır. Bu veriler kullanılarak her bir gruba ait yaprak örneklerinin bağıl su içeriği aşağıdaki formüle göre % olarak hesaplanmıştır; Bağıl Su İçeriği (%) = [(YA KA) / (TA KA)]x100 YA=Yaş Ağırlık KA=Kuru Ağırlık TA=Turgorlu Ağırlık Bitkilerde bor analizi Hasat sonrası kese kağıtları içerisinde laboratuvara getirilen bitkilerin vejetatif aksamı ve kök aksamı musluk suyu ile yıkandıktan sonra sırasıyla bir kez saf su, 0.2 N HCl çözeltisi, iki kez saf su ve bir kez de deiyonize su ile yıkanıp, kaba filtre kağıdı üzerinde fazla suları 28

46 alınmıştır. Daha sonra kese kâğıdına ayrı ayrı konulan bitki kısımları hava sirkülasyonlu kurutma dolabında 70 o C de sabit ağırlığa gelinceye kadar kurutulmuşlardır. Kuruyan bitki örneklerinin ağırlıkları belirlendikten sonra tungsten kaplı bitki öğütme değirmeninde öğütülmüşlerdir. Polietilen kavanozlara konulan öğütülmüş bitki örnekleri analizde kullanılmadan önce 70 o C de sabit ağırlığa gelinceye kadar kurutma dolabında bırakılmış ve kavanozların kapakları sıkıca kapatılmıştır. Kurutulan ve öğütülen bitki örneklerinden 0.3 g tartılmış 5 ml HNO 3 +2 ml H 2 O 2 ile yüksek sıcaklık (210 o C) ve yüksek basınç (200 PSI) altında mikrodalga cihazında (CEM Mars 5) çözündürülmüştür. Daha sonra örnekler 25 ml lik balonjoje ye aktarılarak soğutulmuş, deiyonize su ile derecesine tamamlanmıştır. Bu süzükler hemen ince gözenekli (Whatman No:42 veya mavibant) filtre kağıdı ile süzülerek 25 ml lik polietilen şişelere aktarılmış ve süzükteki bor içerikleri ICP-AES (Inductively Coupled Plasma Atomic Emission Spectrometer) (Varian-Vista, axiel) cihazı ile belirlenmiştir (SOIL SURVEY LABORATORY METHODS MANUAL, 2004) Biyokimyasal parametrelerin ölçümü Bitkilerde aşağıda belirtilen fizyolojik çalışmalar yapılmıştır. Enzim ekstraktlarının hazırlanması, Antioksidan enzim aktivitelerinin tayini; Süperoksit dismutaz (SOD, EC ) enzim aktivitesinin belirlenmesi Peroksidaz (POX; EC ) enzim aktivitesinin belirlenmesi Katalaz (CAT; EC ) enzim aktivitesinin belirlenmesi Glutasyon redüktaz (GR; EC ) enzim aktivitesinin belirlenmesi Askorbat peroksidaz (APX; EC ) enzim aktivitesinin belirlenmesi Lipit peroksidasyonun belirlenmesi Prolin analizi Enzim ekstraktlarının hazırlanması Antioksidan enzimlerin ekstraksiyonu için derin dondurucuda 80 0 C de saklanmakta olan yaprak örnekleri kullanılmıştır. Soğutulmuş havanda 1 gr yaprak örneği sıvı azotta %2 (w/v) polyvinylpolyprrolidone (PVPP) ve 1 mm EDTA içeren ph 7,8'de 50 mm Na-fosfat 29

47 tamponuyla homojenize edilmiştir. Filtrasyon sonrası +4 C'de, rpm'de 30 dakika santrifüj edilmiştir. Elde edilen süpernatant, enzim aktivitesi analizlerinde kullanılmıştır. Ekstraksiyon prosedürünün tümü ±4 C'de gerçekleştirilmiştir Antioksidan enzim aktivite analizleri Süperoksit dismutaz (SOD; süperoksit: süperoksit oksidoredüktaz, EC ) enziminin aktivite tayini SOD aktivitesi, Beauchamp ve Fridowich (1971), in metoduna göre, SOD un fotokimyasal olarak nitro blue tetrazolium (NBT) un indirgenmesini inhibe etme yeteneğinin ölçülmesiyle tayin edildi. 3 ml reaksiyon karışımı; 50 mm fosfat tamponu (ph 7,8), 33 μm NBT, 10 mm L-metionin, 0,66 mm EDTA Na 2, 0,0033 mm Riboflavin içermektedir. Süpernatant seyreltildikten sonra karışım 10 dk 300 μmol m -2 s -1 ışık şiddeti altında bekletildi. Daha sonra reaksiyon karışımının 560 nm de verdiği absorbans değerleri okundu. SOD için 1 enzim birimi; fotoredüksiyonun % 50 inhibisyonuna neden olan protein miktarı (mg) olarak tanımlandığından yaprak örneklerindeki SOD aktiviteleri buna göre belirlendi Peroksidaz (POX; EC ) enzim aktivitesinin belirlenmesi: Peroksidaz (POX) enzim aktivitesi, Herzog ve Fahimi'nin (1973) tanımladığı metoda göre yapılmıştır. Köre karşı 465 nm'de H varlığında okside olan DAB (3'-3'- diaminobenzidin tetrahidroklorit) oluşum miktarına bağlı olarak 3 dakika boyunca absorbans değişimleri okunmuştur. Spesifik enzim aktivitesi dakikada tüketilen µmol/ml H olarak ifade edilmiştir Katalaz (CAT; EC ) enzim aktivitesinin belirlenmesi Katalaz (CAT) enzim aktivitesi, Bergmayer'in (1970) tanımladığı metoda göre yapılmıştır. Analiz UV ışığı bölgesinde köre karşı 240 nm'de H 'nin azalma oranının belirlenmesi ile yapılmıştır. Bu enzim aktivitesi dakikada tüketilen µmol H olarak ifade edilmiştir. Reaksiyon boyunca absorbansta oluşan düşüş 180 sn boyunca takip edilmiştir. CAT aktivitesi dakikada harcanan µmol H olarak ifade edilmiştir. 30

48 Glutasyon redüktaz (GR; EC ) enziminin aktivite tayini Glutatyon redüktaz (GR) aktivitesi, 340 nm'deki absorbans azalmasından yola çıkılarak hesaplanmıştır (FOYER ve HALIWELL, 1976). NADPH varlığında, okside glutasyon miktarındaki azalma, kuvartz küvette köre karşı 180 sn boyunca takip edilmiştir. Hesaplamalar glutatyon redüktaz enziminin ekstinksiyon katsayısı kullanılarak yapılmıştır. Spesifik enzim aktivitesi, dakikada indirgenen 1 mmol/ml GSSG miktarı olarak ifade edilmiştir Askorbat peroksidaz (APX; EC ) enziminin aktivite tayini Askorbat peroksidaz (APX) aktivitesinin tayini Nakano ve Asada'ya (1981) göre yapılmıştır. Askorbat okside oldukça, spektrofotometreden 290 nm'deki absorbansta oluşan azalma okunmuş ve hesaplamalar askorbatın ekstinsiyon katsayısı kullanılarak yapılmıştır. Askorbatın oksidasyonu, enzim ekstraktının katılmasıyla başlanmış ve absorbanstaki azalma 180 sn boyunca takip edilmiştir. Bir birim AP aktivitesi dakikada okside olan 1 mmol/ml askorbat olarak ifade edilmiştir Prolin analizi Serbest prolin içeriğinin belirlenmesi Bates ve ark. 'na (1973) göre yapılmıştır. Sıvı fazdan aspire edilen toluen fraksiyonunun 520 nm'deki absorbansı spektrofotometreden okunmuştur. Prolin konsantrasyonu, kalibrasyon eğrisi kullanılarak hesaplanmış ve µmol prolin g -1 taze ağırlık olarak ifade edilmiştir Lipit peroksidasyonun belirlenmesi Lipit peroksidasyonunun belirlenmesi TBAR reaksiyonu sonucu oluşan malondialdehit (MDA) miktarının belirlendiği Madhava Rao ve Sresty'nin (2000) tanımladığı yönteme göre yapılmıştır. Aktivite için nm aralığında absorbans değişimlerine bakılmıştır Anatomik İnceleme Metotları Anatomik incelemelerinde kullanılmak üzere kontrol ve bor uygulanmış gruplardan bitkiler ilk üç yapraklı evresinde araştırmada belirtilen bor dozları uygulanmadan önce 0. günde, bor uygulamasını takip eden günden itibaren ilk tepkilerin görülmeye başlandığı gün 31

49 olan 3. günde ve bor uygulamasını takip eden eden günden itibaren ölüm evresine yaklaştığı gün olan 8. günde kök, gövde ve yaprak kısımlardan alınan örnekler inceleme için uygun ölçüde parçalara bölünerek %70 lik alkolde tespit edilmiştir. Mikroskobik gözlemler için bitkinin belirtilen kısımlarından Parafin metodu (ALKAN, 1998) uygulanarak mikrotom yardımı ile kesitler alınmıştır. Mikrotom kesitleri almak için Parafin metodu (ALGAN, 1981) uygulanarak %70 lik alkolde küçük parçalar halinde bulunan bitki materyali sırasıyla %96 lık alkolde 4 saat, %100 lük alkolde 1 saat, 1 alkol-1 ksilol de 30 dakika, ksilolde 30 dakika bekletilmiş, ksilolde bekleme süresi tamamlanmış materyalin bulunduğu kaba boncuk halindeki parafin tanecikleri yavaş yavaş ilave edilmiştir. Bu işlem 24 saat içinde tamamlandıktan sonra ksilolün parafine doyurulma işlemi için örnekler 55 ס C deki etüvde 3-4 gün bekletilmiş, ksilol kokusu gidince örneklerin bulunduğu kaba sıvı parafin ilave edilerek, blok yapımında kullanılmak üzere, 58 ס C deki etüvde 3-4 gün tutulmuştur. Daha sonra metal levhalar yardımıyla bloklar hazırlanmış ve bu bloklardan µm kalınlığında şeritler halinde kesitler alınmıştır. Kesitlerin parlak yüzeyleri lama gelecek şekilde, kesitler hafif yapıştırıcı sürülmüş lamlara yerleştirilmiştir. Bu lamlar bir ısıtıcı (hot plate) üzerinde hafifçe ısıtılarak, kesitlerin üzerine %2 lik formalin damlatılmıştır. Ok uçlu iğnelerin yardımıyla kesitler gerdirilerek kesitlerin lama daha iyi yapışması sağlanmış, bir gece bekletilerek boyama işlemine hazırlanan kesitler ksilol, 1 ksilol/1 absolü alkol, absolü alkol, %96 lık alkol, %70 lik alkol, %50 lik alkol serilerinde 5 er dakika bekletildikten sonra %50 lik alkolde hazırlanan safranin boyasında 15 dakika tutulmuştur. Safraninde boyama işlemi tamamlandıktan sonra lamlar sırasıyla %50 lik alkol, %70 lik alkol, %96 lık alkol serilerinde 2 şer dakika bekletilip %96 lık alkolde hazırlanmış olan fast-green boyasında 3 saniye tutulduktan sonra sırasıyla %96 lık alkol, absolü alkol, 1 absolü alkol/1 ksilol, ksilol serilerinde 2 şer dakika tutulmuştur. Ksilolden çıkarılan preparatlar üzerindeki kesitlere 1-1,5 damla entellan damlatılarak lamel kapatılmıştır. Bu şekilde sürekli preparat haline getirilen örnekler mikroskopta (LEICA DM3000 MOTORİZE PC KONTROLLÜ DİJİTAL GÖRÜNTÜLEME SİSTEMLİ ARAŞTIRMA MİKROSKOBU) 10x4, 10x10, 10x20 ve 10x63 büyütmeli objektifler kullanılarak incelenmiştir. İncelenen anatomik kesitlerin fotoğrafları çekilmiştir. İncelenen preparatlarda her bir numune için alınan bitki kısımlarına ait hücrelerin boyutları mikrometrik oküler yardımı ile ölçülerek minimum, maksimum, ortalama ve standart hata değerleri tespit edilmiştir. 32

50 3.4. Gen Ekspresyon Analizleri RNA İzolasyonu Bitki için olumlu sonuç veren bir RNA izolasyon kiti (Qiagen RNeasy Plant Mini Kit) kullanılarak hassas analizlerde kullanılabilecek kalite ve miktarlarda RNA izolasyonları gerçekleştirilmiştir. Alınan yaprak ve kök örnekleri ayrı ayrı sıvı azotta, yüksek ısıda sterilizasyonu gerçekleştirilmiş olan ve önceden azot ortamında soğutulmuş seramik havan/topuz/spatula kullanılarak, toz haline getirilip RNA izolasyonları kit prosedürüne uygun olarak yapılmıştır. RNA okumaları, nükleik asit konsantrasyonu, yüksek protein oranı gibi kalite belirleyici çalışmalar Nanodrop ND-1000 Biyofotometre kullanılarak, RNA örneklerinin konsantrasyonları 260 nm dalga boyunda Nükleik Asitler, 280 nm de protein, 230 nm de içeriğe karışan diğer bileşiklerin miktarları olmak üzere belirlenmiştir cdna Sentezi Komplementer DNA (cdna) sentezi, cdna sentez kitinin protokolüne uygun olarak gerçekleştirilmiştir. Fermantas ın First Strand cdna Synthesis Kiti kullanılarak 1 µg lık RNA ile Standard koşullarda cdna sentezi gerçekleştirilmiştir. Buna göre; 11 µl RNA-ddH 2 O karışımına aşağıdaki 9 µl lık karışım eklenerek total hacim 20 µl ye tamamlanmıştır. Karışımın içeriği: 5X Reaction Buffer: 4 µl RiboLock RNase Inhibitor (20 u/µl) :1 µl 10 mm dntp Mix :2 µl M-MuLV Reverse Transcriptase (20 u/µl) :2 µl Total hacim: 20 µl 1 µg RNA nın ilk zincir cdna ya dönüştürülmesi için uygulanan protokol: Reaksiyonlar Techne TC-512 PCR cihazı ile; 5 dakika 25 o C, 1 saat 37 o C, 5 dakika da 70 o C olacak şekilde gerçekleştirilmiştir. 33

51 Prob yöntemi ile Kantitatif Real Time PCR (qrt-pcr) Hedef gen olan PsCP için primer tasarımı DNAStar programı ile yapılmış, ve NCBI veritabanındaki GenBank: AJ numaralı aksesyondaki DNA dizileri esas alınmıştır. Real Time PCR çalışmalarında normalizasyon için S18 geni (GenBank: AY ) kullanılmıştır. Bu yöntemle kadar baz çiftinden oluşan kısa DNA dizinlerinin eksponansiyel (üstel) olarak çoğaltılması sağlanmış olup, yöntem genlerin expresyonları sonucu ortaya çıkan nispi RNA miktarı tespitinde yaygın olarak kullanılmaktadır. Real Time PCR çalışmalarında tamamlayıcı DNA (cdna) kullanılmakta ve cdna yoğunluğu her bir PCR döngüsünde ortaya çıkan floresan ışığı yoğunluğundaki artışa bağlı olarak belirlenmektedir. Kullanılan prob teknolojisinde ekspresyon verileri, 5-3 Ekzonükleaz aktivitesine bağlı olarak amplifikasyonda kullanılan polimeraz enziminin hedef bölgeye hibridize olan 5 ucunda FAM boyası ile işaretli olup 3 ucuna yakın ise quencher boyasına sahip probu parçalaması sonucu 530 nm de FAM veya SYBR Green I filtresi ile, kullanılan kalıp miktarına bağlı olarak okunabilme özelliğindedir. Proje önerisinde yer aldığı üzere, qrt-pcr çalışmalarının SYBR Green yöntemi ile Stratagene MX3000P cihazı ile gerçekleştirilmesi planlanmış, ancak cihazın bloğu arızalanınca (yüksek maliyetli yeni bir blok ihtiyacı doğmuştur) alternatifler değerlendirilmiştir. Buna göre PsCP (hedef gen) ve S18 (referans gen) için prob tasarımı gerçekleştirilerek Roche firmasından FAM boyalı olarak tedarik edilen özel problar ile qrt- PCR reaksiyonları kapiller sistemli Roche LightCycler sisteminde gerçekleştirilmiştir. Primerler öncelikle 400nM final konsantrasyonunda 20µL reaksiyon hacminde Semiquantitative-RT PCR koşullarında BioRad MyCycler sisteminde optimize edilmiş, daha sonra kantitatif çalışmalara geçilmiştir. Master miksin hazırlanması: PCR işlemlerinde kullanılacak olan tüm solüsyonlar ihtiyaç duyulan miktarlarda çözülüp dikkatlice karıştırıldıktan sonra hafifçe santrifüj edilerek çözünmüş olarak soğuk ortamda, kar halindeki buz üzerinde, bekletilmiştir. Toplam 20µL reaksiyon hacminde gerçekleşen reaksiyon karışımına alttaki sıra ile gerekli miktarlardaki komponentler ilave edilmiştir. 34

52 Bileşenler Konsantrasyon Hacim µl Son konsantrasyon Primer forward 20µM 0.4µL 400nM Primer reverse 20µM 0.4µL 400nM Prob 10µM 0.4µL 200nM LightCycler Probes Master 2x 10 µl 1x PCR hassasiyetinde su TOTAL Hacim µl 15 µl - Pipetleyerek dikkatlice karıştırılan bileşenler üzerine 5 µl kalıp (orijinal cdna nın 1/100 dilüsyonu kullanılmıştır) ilave edilerek karışımı yavaşça 10 sn vorteksleyip kısa santrifüjledikten sonra karışım tekrarlı bir şekilde kapillerleri önceden soğutulmuş santrifüj adaptörüne yerleştirilmiştir. Her kapillere 20 µl master karışım pipetlenmiş, düşük hızda (700 rpm) mikrosantrifüjde çevrilerek reaksiyon karışımının tamamının kapillerin ucunda toplanması sağlanmıştır. Kapiller Roche LightCycler carousel içine transfer edildikten sonra cihaz çalıştırılmıştır. UYGULANAN PCR PROGRAMI Pre-İnkübasyon: 94 o C,10 dakika x1 Döngü Amplifikasyon: 95 o C 10 sn 59 o C 30 sn x45 Döngü 72 o C 1 sn Soğutma: 40 o C 30 sn x1 Döngü KULLANILAN PRİMERLER Proje önerisinde yer aldığı üzere, öncelikle referans olarak kullanılması planlanan aktin genine ait alttaki 1 ve 2 numaralı primer setleri ile 3 numaradaki hedef gene ait primer 35

53 seti hazırlanmış ve semi-quantitatif yöntemlerle reaksiyonların optimize edilmesine çalışılmıştır. Ancak bu primerlerin denemedeki farklı bor konsantrasyonlarında yetiştirilen bezelye bitkilerinden elde edilen RNA dan üretilen cdna ile amplifikasyonlarda yeter kalitede ve hassasiyette sonuç vermediği anlaşılmıştır. Actin geninin bitkinin büyüme ortamındaki farklı B içeriklerine bağlı olarak referans gen olma özelliğini kaybettiği değerlendirilerek yeni primerler (Referans gen S18 için 4 numaralı primer seti) tasarlanmıştır. Reaksiyon koşullarının daha kısa sürelerde ve daha büyük bir hassasiyet ve etkinlikle optimizasyonu için hedef gen PsCP için de daha kısa amplicon üretecek yeni primerler tasarlanmıştır (5 numaralı primer seti). 1. pactin_1f: 5 TGAAGCACAATCCAAAAGAGG 3 pactin_1r: 5 TGACTAACACCATCCCCAGA 3 2. pactin_2f: 5 TCTGGGGATGGTGTTAG 3 pactin_2r: 5 GAAGTGGTGAAAGTGTAG 3 3. PSerincp_F: 5 TTGCGATTTCTCGTCATCAG 3 PSerincp _R: 5 CACCGCTGAAAATCCAAACT 3 4. PSCP-F: 5 GTGAATTTGAAGTACAAGAGATTGTGT 3 PSCP-R: 5 ACACCCTTTTGAGAATCAGCA 3 5. S18-F: 5 TGGTAGGGTGTGCCATGAT 3 S18-R: 5 TGGTAGGGTGTGCCATGAT 3 VERİ ANALİZİ Referans genle birlikte analiz etmeye dayalı olarak geliştirilmiş olan ΔC T Metodu kullanılmıştır. Bu metod yaygın bir şekilde kullanılan 2 ΔΔCT (Livak) metodunun bir başka versiyonudur ve benzer sonuç üretir. Metod referans ve hedef genlerin C T değerleri farkını kullanarak ekspresyonun normalize edilmesini sağlamaktadır. Relatif ekspresyon belirlemede şu formül kullanılır: 36

54 [2 (CT(S18) CT(PsCP)) = Ekspresyon] kullanılarak Normal büyüme ortamında yetişen bitkilere ait verim: 2 (CT(S18) CT(PsCP)) = X Yüksek/Düşük doz [B] ortamında yetiştirilen bitkilere ait verim: 2 (CT(S18) CT(PsCP)) =Y Normal Ekspresyon= Normal/Normal= X/X= 1 Yüksek/Düşük doz [B] ortamında Ekspresyon= Yüksek/Düşük doz [B] /Normal= Y/X= n Böylece, 2 ΔΔCT metodu ile uyumlu bir sonuç elde edilmiş olur Hormon Analizleri Çalışmanın materyalini oluşturan örnekler, C de derin dondurucuda dondurularak C de sıvı azot altında homojenize edilmiş ve ekstraksiyon aşamasına geçilmiştir. Elde edilen ekstraktlar Indol-3 Asetik Asit (IAA), Giberellik asit (GA 3 ) ve Absisik Asit (ABA) hormon analizleri için viallere alınmıştır. Analizler LC-MS/MS cihazında ve doğrulamaları Q-TOF LC/MS cihazında yapılmıştır (PAN ve ark., 2008) Ekstraksiyon yöntemi Yeterli miktarda (8-10 gr) örnek sıvı azot altında -196 C de homojenizasyon cihazında homojenize edilmiştir. 0.1 g homojenize edilmiş örnek 1,5 ml lik viallere alınmış ayrıca hacimsel olarak 1 ml 1-propanol/Su/HCL (1/1/0.002) çözeltisinden eklenmiştir. Üzerine ng internal standart ilavesi de yapılarak vorteksleme işlemine tabi tutulmuştur. 4 C de 30 dk çalkalayıcıda bekletilen örneklere, 1 er ml dichlorometan ilave edilerek, tekrar vorteksleme işlemleri yapılmıştır. Ekstraktlar, bu sürenin sonunda devirde 5 dk santrifüj edilmişlerdir. En alttaki fazdan 1 ml alınarak azot altında uçurulmuş ve 0.3 ml methanol ile tekrar çözülerek LC-MS/MS ve QTOF-LC cihazına enjeksiyon işlemleri gerçekleştirilmiştir. 37

55 3.6. Veri Analizleri Bitki büyüme parametre ve hormon değerleri ile antioksidan enzim aktivite değerleri Minitab (2000) ve Jump 7.0 (KALAYCI 2005) paket programları kullanılarak analiz edilmiştir. 38

56 4. BULGULAR Araştırmada bezelye 602-1, S2, Taşkent ve Özkaynak hat ve çeşitlerine farklı seviyelerde uygulanan borun bitkilerde meydana getirdiği değişimlerle ilgili incelenen özellikler aşağıdaki alt başlıklar halinde verilmiştir Büyüme Parametreleri Bulguları Bezelye hat ve çeşitlerine farklı seviyelerde uygulanan borun bitkilerin yaş ve kuru ağırlık değerleri ile kök ve gövde uzunluğu değerlerine ait ortalamalar Tablo 4.1, 4.2 ve 4.3 te bu değerlere ait grafikler Şekil 4. 1, 2 ve 3 te verilmiştir Gövde ve kök yaş ağırlığı Bezelye hat ve çeşitlerinin 0., 3. ve 7. gününde ölçülen gövde yaş ağırlıklarına ait ortalama değerler Tablo 4.1 de verilmiştir. Varyans analizine göre, gövde yaş ağırlığı bakımından kullanılan hat ve çeşitler, bor uygulamalaması ve çeşit x bor interaksiyonu 0., 3. ve 7. gününde alınan örneklerde % 1 seviyesinde önemli bulunmuştur (Tablo 4.1). Tabloda görüldüğü gibi, araştırmada kullanılan bezelye hat ve çeşitlerinde gövde yaş ağırlık değerlerinde farklılıklar olduğu görülmüştür. Bor uygulamasına bağlı olarak bitkilerin gövde yaş ağırlık değerlerinin değişiklik gösterdiği, özellikle bitkilerde aşırı dozda (200 mg kg -1 ) bor uygulaması sonrasında ilk toksisite belirtisinin görüldüğü 3. günde yapılan örneklemelerde en fazla azalma S-2 hattında belirlenirken diğer hatlardaki azalmalar birbirlerine yakın oranlarda olmuştur (Tablo 4.1). Bor uygulamasının yapılmadığı 0 mg kg -1 ve yeterli seviye olarak kabul edilen 2 mg kg -1 bor dozlarında ve Özkaynak hat ve çeşitlerinde her iki dozda birbirlerine yakın değerler elde edilirken, S-2 ve Taşkent hat ve çeşitlerinde sırasıyla %25 ile %17 oranlarında azalmalar olduğu belirlenmiştir. Bezelye hat ve çeşitlerinde yapılan 3. örneklemede (bor uygulamasının 7. gününde) 2 mg kg -1 dozunda ve S-2 hatlarında sırasıyla %10 ve %7 oranlarında artışlar olurken Taşkent ve Özkaynak hat ve çeşitlerinde azalmalar olduğu belirlenmiştir. En yüksek bor dozu olan 200 mg kg -1 dozunda 7. günde yapılan ölçümlerde en fazla azalma %92 oranı ile Özkaynak çeşidinde belirlenmiştir (Tablo 4.1, Şekil 4.1). Bezelye hat ve çeşitlerinde kök yaş ağırlık değerleri ile ilgili yapılan ölçümlerinde gövde yaş ağırlık değerleri ile benzerlik gösterdiği, hattında 3. ve 7. günde yapılan ölçümlerde 2 mg kg -1 bor dozunda bor uygulaması yapılmayan 0 mg kg -1 bor dozuna göe %4 ve %16 oranlarında artışlar olurken, S-2 hattında 7. günde yapılan 39

57 ölçümde %13 oranında artış olduğu diğer hatlarda artan bor uygulaması ile birlikte kök yaş ağırlık değerlerinin azaldığı belirlenmiştir (Tablo 4.1, Şekil 4.1). Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök yaş ağırlık değerleri (g bitki -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Gövde Yaş Ağırlık Kök Yaş Ağırlık 0. Gün 3. Gün 7. Gün 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar g bitki -1 S S g bitki -1 S S g bitki -1 S S g bitki -1 S S g bitki -1 S S g bitki -1 S S a** ± a** ± a** ± a ± a** ± a** ±1.93 Çeşit S b** ± a** ± b** ± b ± a** ± b** ±1.03 Taşkent 0.93c** ± b** ± b** ± c ± b** ± b** ±1.39 Özkaynak 1.02c** ± b** ± b** ± c ± b** ± b** ± a** ± a** ± a** ± a** ±1.37 B mg kg a** ± a** ± a** ± a** ± b** ± b** ± b* ± b** ± c** ± c** ± c** ± c** ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.44 Çeşit x Bor S - 2 Taşkent ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.60 Özkaynak ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±0.13 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 40

58 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök yaş ağırlık değerleri (g bitki -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Gövde ve kök kuru ağırlığı Bezelye hat ve çeşitlerinin 0., 3. ve 7. gününde ölçülen gövde kuru ağırlıklarına ait ortalama değerler Tablo 4.2 de verilmiştir. Araştırmada kullanılan bezelye hatlarının gövde kuru ağırlık değerleri bor uygulanmamış olan 0 mg B kg -1 dozu ile mukayese edilediğinde, bor uygulamasına tepkilerinin belirlendiği ilk gün olan 3. gün ve ölüm aşamasına yaklaştığı gün olan 7. günde yapılan ölçümlerde her iki örnekleme zamanında sadece hattında 2 mg kg -1 bor dozunda 0 mg B kg -1 uygulamasına göre %4 ve %13 oranlarında artış olduğu, kullanılan diğer hat ve çeşitlerde bor uygulamasına bağlı olarak kuru ağırlık değerlerinin azaldığı belirlenmiştir (Tablo 4.2, Şekil 4.2). Araştırmada kullanılan bezelye hat ve çeşitlerinin kök kuru ağırlık değerleri gövde kuru ağırlık değerleri ile benzerlik göstermiş sadece 2 mg kg -1 dozunda hattında 3. ve 7 gün örnekleme zamanlarında artış olduğu belirlenmiştir. Diğer hat ve çeşitlerde bor uygulamasına bağlı olarak kök kuru ağırlık değerlerinde azalma belirlenmiştir (Tablo 4.2, Şekil 4.2). 41

59 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök kuru ağırlık değerleri (g bitki -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Gövde Kuru Ağırlık Kök Kuru Ağırlık 0. Gün 3. Gün 7. Gün 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar g bitki -1 S S g bitki -1 S S g bitki -1 S S g bitki -1 S S g bitki -1 S S g bitki -1 S S a** ± a** ± a** ± a ± ± a** ±0.10 Çeşit S b** ± a** ± b** ± b ± ± b** ±0.06 Taşkent 0.12c** ± b** ± b** ± c ± ± b** ±0.06 Özkaynak 0.12c** ± b** ± b** ± c ± ± b** ± a** ± a** ± ± a** ±0.07 B mg kg ab** ± a** ± ± a** ± bc** ± b** ± ± b** ± c** ± c** ± ± c** ± ± ab** ± ± ± ± a** ± ± ± ± cd** ± ± ± ± hı** ± ± ± ± def** ± ± ±0.03 Çeşit x Bor S - 2 Taşkent ± cde** ± ± ± ± efg** ± ± ± ± hı** ± ± ± ± cd** ± ± ± ± cde** ± ± ± ± fgh** ± ± ± ± ± ± ± ± bc** ± ± ±0.02 Özkaynak ± cd** ± ± ± ± ghı** ± ± ± ± ± ± ±0.011 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 42

60 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök kuru ağırlık değerleri (g bitki -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Gövde ve kök boyu Farklı B dozlarına bağlı olarak bezelye hat ve çeşitlerine ait ortalama gövde uzunlukları Tablo 4.3 te verilmiştir. Bor uygulamalarının gövde uzunlukları üzerine etkisine bakıldığında B dozunun artırılması ile fide gövde uzunluklarının hatlar arasında farklılıklar gösterdiği hatların ortalaması alındığında 0 mg kg -1 bor uygulaması ile mukayese edildiğinde 2 mg kg -1 dozunda hatların boylarında %4 oranında artış olurken, toksik seviye olan 20 mg kg -1 bor uygulamasında %7, kronik doz olan 200 mg kg -1 bor uygulamasında %64 oranlarında azalmalar olduğu belirlenmiştir. Bezelye hat ve çeşitlerine göre yapılan ölçümlerde, bitkiler bor uygulaması 0 mg kg -1 uygulaması ile mukayese edildiğinde Özkaynak çeşidinde 2 mg kg - 1 dozunda 3. ve 7. gün örnekleme zamanlarında %8 ve % 11 oranlarında gövde boylarının artış gösterdiği, diğer hat ve çeşitlerde bor uygulamasına bağlı olarak bitki boylarının azaldığı belirlenmiştir (Tablo 4.3, Şekil 4.3, Resim 3). Bor uygulamasının kök uzunlukları üzerine etkilerine bakıldığında bezelye hatlarının farklılıklar gösterdiği, dozların ortalaması dikkate alındığında artan bor dozu ile birlikte her iki örnekleme zamanında kök boylarının azaldığı, kullanılan hatlar içerisinde 3. günde yapılan ölçümlerde hattının kök boyunun 2 ve 20 mg kg -1 bor uygulamalarının 0 mg kg -1 uygulaması ile mukayese edildiğinde sırasıyla %12 ve %13 oranlarında kök boylarının artış 43

61 gösterdiğidiğer hatların kök boylarının aynı gün yapılan örneklemede sadece 2 mg kg -1 dozunda Özkaynak çeşidinde artış gösterdiği belirlenmiştir (Tablo 4.3, Şekil 4.3). Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök boyu (cm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Gövde Boy Kök Boy 0. Gün 3. Gün 7. Gün 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar cm S S cm S S cm S S cm S S cm S S cm S S ab** ± a** ± a** ± a* ± a** ± a** ±14.95 Çeşit S c** ± b** ± d** ± ab* ± a** ± b** ±8.22 Taşkent 26.33b** ± a** ± b** ± b* ± b** ± b** ±13.65 Özkaynak 31.00a** ± a** ± c** ± b* ± a** ± b** ± a** ± a** ± a* ± a** ±11.40 B mg kg ab** ± a** ± ab** ± a** ± bc** ± b** ± ab** ± a** ± c** ± c** ± b** ± b** ± ± a** ± ± ± ± a** ± ± ± ± a** ± ± ± ± d** ± ± ± ± d** ± ± ±12.86 Çeşit x Bor S - 2 Taşkent ± d** ± ± ± ± de** ± ± ± ± f** ± ± ± ± b** ± ± ± ± b** ± ± ± ± c** ± ± ± ± e** ± ± ± ± c** ± ± ±10.26 Özkaynak ± c** ± ± ± ± c** ± ± ± ± de** ± ± ±3.014 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 44

62 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök boyu (cm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir S-2 Taşkent Özkaynak Resim , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin bor uygulamalarına tepkilerini gösterir resimler Bağıl Su İçeriği B uygulamasından itibaren 0., 3. ve 7. günde hasat edilen tüm bezelye bitkilerinin yaprak örneklerde bağıl su içerikleri belirlenmiş fakat 7. günde en yüksek B dozu olan 200 mg kg -1 B uygulamasının olduğu grupta tüm bitkilerde değer elde edilemediğinden, tablo ve grafiklerde 7. günde 200 mg kg -1 B uygulamasına ait bağıl su içeriği değerleri bulunmamaktadır. 45

63 Bezelye hat ve çeşitlerinin 0., 3. ve 7. gününde ölçülen bağıl su içeriğine ait ortalama değerler Tablo 4.4 te verilmiştir. Araştırmada kullanılan bezelye hat ve çeşitlerin ortalamalarında en yüksek değer S2 hattında elde edilirken, bor dozlarında en yüksek bağıl su içeriği değerine 200 mg B kg -1 dozunda elde edilmiştir. Bezelye hatlarının bağıl su içerikleri bor uygulanmamış olan 0 mg B kg -1 dozu ile mukayese edilediğinde, bor uygulamasına tepkilerinin belirlendiği ilk gün olan 3. gün ve ölüm aşamasına yaklaştığı gün olan 7. günde yapılan ölçümlerde her iki örnekleme zamanında en üksek bağıl su içeriği 2 mg B kg -1 dozunda ve bezelye hattında belirlenmiştir (Tablo 4.4, Şekil 4.4). Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin bağıl su içeriği (%). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama, ± standart sapma olarak verilmiştir. Bağıl Su İçeriği 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar % S S % S S % S S Çeşit S Taşkent Özkaynak B mg kg Çeşit x Bor S - 2 Taşkent Özkaynak **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 46

64 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin bağıl su içeriği (%). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Bor Konsantrasyonu Bulguları Gövde ve kök bor konsantrasyonu Bezelye fidelerin gövde bor konsantrasyonuna ait ortalama değerler Tablo 4.5 da, verilmiştir. Çeşit, B dozu, ve çeşit x B dozu interaksiyonu yapılan varyans analizi sonucunda 0., 3. ve 7. gün örneklerinde % 1 seviyesinde önemli bulunmuştur (Tablo 4.5). Araştırmada bezelye hatlarının bor konsantrasyonları bor dozundaki artışa bağlı olarak artış gösterdiği belirlenmiştir (Tablo 4. 5, Şekil 4.5). Bezelye hatları değerlendirildiğinde 0. gün ve 7. gün yapılan örneklemelerde Taşkent çeşit ve hattının bor konsantrasyonu değerlerinin diğer hatlara göre daha fazla olduğu, 3. gün örneklemesinde en yüksek bor konsantrasyonu değerlerinin ve S2 hatlarında olduğu belirlenmiştir. Burada bezelye hatları ile bor konsantrasyonu değerleri arasındaki farklılıklar bitki gelişimi ile paralellik göstermekte ve daha önce elde edilen yaş ağırlık, kuru ağırlık ve gövde boyu değerleri göz önünde bulundurulduğunda hattının üç örnekleme zamanında da en yüksek değerlere sahip olurken, diğer hatların daha düşük değerlere sahip olduğu belirlenmiştir (Tablo 4 1, 2, 3 ve 5). Çeşit x B dozu interaksiyonu incelendiğinde gövde B konsantrasyonu değerleri ile mg kg -1 arasında değişim göstermiştir ve en düşük B konsantrasyonu tüm bezelye hat ve çeşitlerde kontrol dozunda elde edilirken, en yüksek bor konsatrasyonu 200 mg kg -1 dozundan elde edilmiştir (Tablo 4.5, Şekil 4.5). 47

65 Fidelerin kök bor konsantrasyonuna ait ortalama değerler Tablo 4.5 de verilmiştir. Çeşit, B dozu, ve çeşit x B dozu interaksiyonu yapılan varyans analizi sonucunda 0.,3. ve 7. gün örneklemelerinde % 1 seviyesinde önemli bulunmuştur (Tablo 4.5). Bor dozu arttıkça köklerde B konsantrasyonu değerleri artmış, 200 mg kg -1 dozunda ve 7. gün örneklerinde B konsantrasyonu en yüksek seviyeye ulaşmıştır (Tablo 4.5). Hem 3. gün hemde 7. gün örneklemelerinde kök B konsantrasyonu değerleri hattında diğer hatlara göre daha yüksek değerlerde olduğu belirlenmiştir.(tablo 4.5, Şekil 5). Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök bor konsantrasyonu (mg kg -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Gövde Bor Konsantrasyonu Kök Bor Konsantrasyonu 0. Gün 3. Gün 7. Gün 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar mg kg -1 S S mg kg -1 S S mg kg -1 S S mg kg -1 S S mg kg -1 S S mg kg -1 S S ab* ± a** ± b** ± a** ± a** ± a** ± Çeşit S b* ± a** ± c** ± b** ± c** ± b** ± Taşkent 36.30a* ± a** ± a** ± c** ± b** ± c** ± Özkaynak 27.11b* ± b** ± c** ± c** ± c** ± c** ± c** ± d** ± c** ± d** ±11.85 B mg kg c** ± c** ± c** ± c** ± b** ± b** ± b** ± b** ± a** ± a** ± a** ± a** ± d** ± hı** ± e** ± f** ± d** ± ghı** ± e** ± de** ± c** ± e** ± d** ± c** ± ± b** ± a** ± a** ± d** ± ghı** ± e** ± f** ±2.44 Çeşit x Bor S - 2 Taşkent d** ± g** ± e** ± ef** ± c** ± e** ± d** ± d** ± ± d** ± c** ± a** ± d** ± hı** ± e** ± f** ± d** ± ghı** ± e** ± f** ± c** ± e** ± d** ± d** ± a** ± a** ± b** ± b** ± d** ± ı** ± e** ± f** ±0.49 Özkaynak d** ± gh** ± e** ± ef** ± c** ± f** ± d** ± d** ± b** ± c** ± c** ± b** ±35.01 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 48

66 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve kök bor konsantrasyonu (mg kg -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Prolin Bulguları B uygulamasından itibaren 0., 3. ve 7. günde hasat edilen tüm bezelye bitkilerinin yaprak örneklerde prolin değerleri belirlenmiş fakat 7. günde en yüksek B dozu olan 200 mg kg -1 B uygulamasının olduğu grupta tüm bitkilerde değer elde edilemediğinden, tablo ve grafiklerde 7. günde 200 mg kg -1 B uygulamasına ait prolin değerleri bulunmamaktadır. Araştırma sonucunda denemede kullanılan bezelye hatlarına ait prolin değerlerini gösterir Tablo 4.6 ve Şekil 4.6 de verilmiştir. Varyans analizine göre çeşit, B dozu ve Çeşit x B dozu interaksiyonunun bitkilerin prolin değerleri üzerine etkileri istatistiksel olarak % 1 seviyesinde önemli bulunmuştur (Tablo 4.6). Denemede bezelye hatları değerlendirildiğinde, 0. gün örneklemelerinde en yüksek prolin değerleri ve Taşkent hatlarında elde edilirken 3. ve 7. gün örneklemelerinde Taşkent ve Özkaynak hatlarında olmuştur. Bor dozlarına göre değerlendirildiğinde prolin içeriklerinin bor dozundaki artışa bağlı olarak arttığı, bu artış oranlarının 0 mg kg -1 dozu ile mukayese edildiğinde sırasıyla %34, %18 ve %315 oranlarında olduğu belirlenmiştir. Çeşit x bor interaksiyonunda 3. ve 7 günde yapılan örneklemelerde 0 mg kg -1 bor dozuna göre yapılan değerlendirmede ve S2 hatlarında en yüksek artış oranları belirlenirken, Taşkent ve Özkaynak hatlarındaki artış oranlarının daha az olduğu tespit edilmiştir (Tablo 4.6, Şekil 4.6). 49

67 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde prolin değerleri (umol/gr FW). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Prolin 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar umol/gr FW S S umol/gr FW S S umol/gr FW S S ± c** ± b** ±0.05 Çeşit S ± bc** ± ab** ±0.04 Taşkent 0.13 ± ** ± a** ±0.03 Özkaynak 0.06 ± b** ± a** ±0.02 B mg kg c** ± b** ± b** ± b** ± bc** ± a** ± a** ± h** ± e** ± fgh** ± e** ± efg** ± a** ± b** ± gh** ± de** ±0.02 Çeşit x Bor S - 2 Taşkent def** ± de** ± def** ± ab** ± c** ± d** ± c** ± d** ± de** ± def** ± abc** ± a** ±0.04 Özkaynak de** ± d** ± d** ± bc** ± def** ± abc** ± c** ±0.03 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 50

68 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde prolin değerleri (umol/gr FW). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Lipid Peroksidasyon Bulguları B uygulamasından itibaren 0., 3. ve 7. günde hasat edilen tüm bezelye bitkilerinin yaprak örneklerde lipid peroksidasyon değerleri belirlenmiş fakat 7. günde en yüksek B dozu olan 200 mg kg -1 B uygulamasının olduğu grupta tüm bitkilerde değer elde edilemediğinden, tablo ve grafiklerde 7. günde 200 mg kg -1 B uygulamasına ait prolin değerleri bulunmamaktadır. Araştırmada kullanılan bezelye hatlarının lipid peroksidasyon oranları malondialdehit miktarında meydana gelen değişimlere göre belirlenmiş ve elde edilen değerler Tablo 4.7 de ve bu değerlere ait grafikler Şekil 4.7 de verilmiştir. Varyans analizine göre çeşit, B dozu ve Çeşit x B dozu interaksiyonunun bitkilerin malondialdehit miktarları üzerine etkileri istatistiksel olarak % 1 seviyesinde önemli bulunmuştur (Tablo 4.7). Bezelye hat ve çeşitlerin ortalamaları dikkate alındığında 0., 3. ve 7 günde yapılan örneklemelerde malondialdehit miktarı Taşkent hattında en yüksek değer belirlenmiştir (Tablo 4. 7, Şekil 4.7). Denemede bor dozlarının ortalamaları değerlendirildiğinde bor dozundaki artışa bağlı olarak malondialdehit miktarlarının 3. gün yapılan örneklemelerde arttığı ve bu artış oranlarının 0 mg kg -1 dozu uygulaması ile mukayese edildiğinde sırasıyla 51

69 %9, %21 ve %255 oranlarında olduğu belirlenmiştir. Bitkilerde 7. günde yapılan örneklemelerde bor dozundaki artışa bağlı olarak malondealdehit miktarlarının azaldığı belirlenmiştir. Bor x çeşit interaksiyonunda 3. günde yapılan örneklemelerde 0 mg kg -1 dozu ile yapılan kıyaslamalarda en yüksek artış oranları ve S2 hatlarında elde edilirken, 7. günde yapılan örneklemelerde Taşkent çeşidinde belirlenmiştir (Tablo 4.7, Şekil 4.7). Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde lipid peroksidasyon düzeyleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Lipid peroksidasyon 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar Ünite mg -1 protein S S Ünite mg -1 protein S S Ünite mg -1 protein S S ± c** ± b** ±3.82 Çeşit S ± ** ± c** ±4.52 Taşkent ± a** ± a** ±2.59 Özkaynak ± c** ± b** ±1.44 B mg kg d** ± a** ± c** ± b** ± b** ± a** ± a** ± h** ± ab** ± fg** ± de** ± f** ± f** ± c** ± h** ± f** ±0.07 Çeşit x Bor S - 2 Taşkent h** ± g** ± fg** ± c** ± a** ± f** ± de** ± f** ± a** ± e** ± bc** ± b** ±4.20 Özkaynak g** ± d** ± g** ± e** ± fg** ± de** ± d** ±0.917 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 52

70 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde lipid peroksidasyon dzeyleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 0, 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde örnekleme yapılmıştır. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir Antioksidan Enzim Aktivite Sonuçları Bezelye 602-1, S2, Taşkent ve Özkaynak hat ve çeşitlerinde farklı seviyelerde bor uygulamalarının antioksidant enzim aktivitelerinin belirlenmesi için; süperoksit dismütaz (SOD), askorbat peroksidaz (APX), katalaz (CAT), peroksidaz (POX), glutasyon redüktaz (GR) ölçümleri yapılmış, bu değerlere ait ortalama antioksidant enzim aktivite değerleri Tablo 4.8, 9, 10, 11 ve 12 de bu değerlere ait grafikler Şekil 4.8, 9, 10, 11 ve 12 de verilmiştir. B uygulamasından itibaren 0., 3. ve 7. günde hasat edilen tüm bezelye bitkilerinin yaprak örneklerde antioksidan enzim aktiviteleri ölçülmüş fakat 7. günde en yüksek B dozu olan 200 mg kg -1 B uygulamasının olduğu grupta tüm bitkilerde aktiviteye rastlanmadığından, grafiklerde 7. günde 200 mg kg -1 B uygulamasına ait enzim aktivite değerleri bulunmamaktadır Süper oksit dismutaz enzim aktiviteleri (SOD) SOD aktivite düzeylerinin B uygulama dozlarına bağlı olarak bezelye hat ve çeşitleri arasında farklılıklar gösterdiği görülmüştür (Tablo 4.8, Şekil 4.8) hattının SOD aktivitesi B stresinin 3. gününde, 2 ppm B uygulamasıyla %18, 20 mg kg -1 B uygulamasıyla %11 azalırken, 200 mg kg -1 B uygulamasının SOD aktivitesini önemli oranda etkilemediği 53

71 görülmüştür. 7. günde ise sadece 2 mg kg -1 B uygulanan grubun SOD aktivitesinde %30 oranında artış görülmüştür. S-2 bezelye hattında B uygulamasının 3. gününde 2 ve 20 mg kg -1 B uygulanan bitkilerin yapraklarındaki SOD aktivitesi sırasıyla %23 ve %29 oranlarında düşüş sergilemiştir. 7. günde ise sadece 20 mg kg -1 B uygulanan bitkilerin SOD aktivitesinde %56 oranında önemli bir artış meydana gelmiştir. Taşkent çeşidinin SOD aktivitesi 7. günde önemli bir farklılık göstermemiş olsa da 3. günde 20 mg kg -1 B uygulamasıyla %37 oranında düşüş, 200 mg kg -1 B uygulamasıyla %60 oranında artış meydana geldiği görülmüştür. Özkaynak çeşidinin SOD aktivitesi 3. günde 200 mg kg -1 B uygulamasıyla %30 artmıştır. 7. günde ise SOD aktivitesinde 2 mg kg -1 B uygulamasıyla %20, 20 mg kg -1 B uygulamasıyla %79 artışlar görülmüştür (Tablo 4.8, Şekil 4.8) Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen SOD aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Çeşit x Bor SOD 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar ünite mg -1 protein S S ünite mg -1 protein S S ünite mg -1 protein S S ± b** ± a** ±1.90 S ± a** ± b** ±2.27 Taşkent 5.20 ± c** ± c** ±1.88 Özkaynak 8.60 ± c** ± b** ± b** ± b** ± bc** ± b** ± c** ± a** ± a** ± ± bc** ± ± a** ± ± bcd** ± ± ± de** ± ± cde** ± ± ab** ± ± ± cde** ± ± e** ± ± cde** ± ± ± e** ± ± cde** ± ± ab** ±1.25 Çeşit B mg kg S - 2 Taşkent Özkaynak 54

72 ±2.20 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen SOD aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. 55

73 Peroksidaz enzim aktiviteleri (POX) Bezelye hat ve çeşitlerinin POX aktiviteleri genel olarak B dozundaki artışlarla azalma göstermiştir (Tablo 4.9, Şekil 4.9). 3. günde hattının POX aktivitesi 2 mg kg -1 B uygulamasıyla %14 artarken, 200 mg kg -1 B ile %29 oranında azalmıştır. 7. günde ise sadece 20 mg kg -1 B uygulamasında anlamlı bir (%53) azalma meydana gelmiştir. S-2 hattının POX aktivitesi 3. günde 20 ve 200 mg kg -1 B uygulamalarıyla sırasıyla %33 ve %93 oranlarında düşüşler sergilemiştir. Benzer şekilde 7. günde de POX aktivitesinde 2 mg kg -1 B ile %21; 20 mg kg -1 B ile %57 oranlarında azalmalar görülmüştür. Taşkent bezelye çeşidinin POX aktivitesi de 3. ve 7. günlerde artan B dozlarına bağlı düşüşler göstermiştir. 3. günde 2 mg kg - 1 B %10, 20 mg kg -1 B %79 ve 200 mg kg -1 B ise % 96 lık azalmalara neden olmuştur. 7. gündeki POX aktiviteleri 2 mg kg -1 B ile %14, 20 mg kg -1 B ile %67 oranında azalmıştır. Özkaynak bezelye çeşidinde 3. günde 20 ve 200 mg kg -1 B uygulamalarıyla sırasıyla POX aktivitelerinde %78 ve %99 oranlarında düşüşler oluşmuştur. 7. günde ise 20 mg kg -1 B uygulamasıyla POX aktivitesi %76 oranında azalmıştır (Tablo 4.9, Şekil 4.9). 56

74 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen POX aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. POX 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar ünite mg -1 protein S S ünite mg -1 protein S S ünite mg -1 protein S S ± a** ± a** ±2.54 Çeşit S ± b** ± b** ±2.32 Taşkent 8.03 ± c** ± b** ±2.48 Özkaynak 6.1 ± c** ± c** ±2.30 B mg kg a** ± a** ± a** ± b** ± b** ± c** ± c** ± abc** ± a** ± a** ± a** ± bcd** ± de** ± ef** ± abc** ± a** ±1.10 Çeşit x Bor S - 2 Taşkent ab** ± bc** ± f** ± ef** ± g** ± cde** ± ab** ± def** ± bc** ± g** ± fg** ± g** ±0.06 Özkaynak ef** ± c** ± f** ± cd** ± g** ± g** ± g** ±0.01 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 57

75 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen POX aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. 58

76 Katalaz enzim aktiviteleri (CAT) hattının CAT aktivitesi 3. günde azalma gösterirken, 7. günde B uygulamalarıyla artmıştır (Tablo 4.10, Şekil 4.10). 3. günde CAT aktivitesi 2, 20 ve 200 mg kg -1 B uygulamalarıyla sırasıyla, %61, %23 ve %33 oranlarında düşüş göstermiştir. 7. günde ise 2 ve 20 mg kg -1 B uygulamaları CAT aktivitesinde %46 ve %254 oranlarında artışlara neden olmuştur. S-2 nin CAT aktivitesi 3. günde 2 mg kg -1 B uygulamasıyla %47 oranında azalırken, 20 mg kg -1 B stresi altında %25, 200mg kg -1 B uygulamasıyla ise %56 oranında artmıştır. 7. günde ise S-2 çeşidinin yapraklarındaki CAT aktivitesi 2 mg kg -1 B stresi altında %110 artış göstermiş fakat 20 mg kg -1 B stresiyle %10 azalmıştır. Taşkent bezelye çeşidinin CAT aktivitesinde 7. günde 20 mg kg -1 B uygulamasıyla % 88 düşüş meydana gelmiştir. 200 mg kg -1 B uygulamasıyla Taşkent çeşidinde CAT aktivitesine rastlanmamıştır. 7. günde Taşkent çeşidinin CAT aktivitesi 2 mg kg-1 B ile %44, 20 mg kg -1 B uygulamasıyla ise %53 oranında azalmıştır. Özkaynak bezelye çeşidinin CAT aktivitesi 3. günde 2 mg kg -1 B uygulamasıyla %53 oranında artarken, 20 mg kg -1 ve 200 mg kg -1 B uygulamalarıyla %70 oranında azalmıştır. 7. günde ise 2 mg kg -1 ve 20 mg kg -1 B, CAT aktivitesini %28 ve %64 oranlarında düşürmüştür (Tablo 4.10, Şekil 4.10). 59

77 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen CAT aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Çeşit x Bor Çeşit B mg kg -1 Uygulamalar S - 2 Taşkent Özkaynak CAT 0. Gün 3. Gün 7. Gün ünite mg -1 protein S S ünite mg -1 protein S S ünite mg -1 protein S S ± a** ± a** ±81.36 S ± b** ± b** ±48.79 Taşkent ± c** ± d** ±25.55 Özkaynak ± c** ± c** ± a** ± b** ± b** ± a** ± c** ± a** ± c** ± a** ± f** ± h** ± d** ± cd** ± a** ± e** ± g** ± e** ± ı** ± b** ± f** ± ef** ± d** ± b** ± cd** ± bc** ± g** ± k** ± h** ± l** ± f** ± c** ± b** ± e** ± j** ± ı** ± j** ±4.1 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 60

78 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen CAT aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. 61

79 Glutasyon redüktaz enzim aktiviteleri (GR) hattının GR aktivitesi 2, 20 ve 200 mg kg -1 B uygulamalarıyla %41, %52 ve %34 oranlarında azalırken, 7. günde 2 ve 20 mg kg -1 B uygulamalarıyla %42 ve %177 oranlarında artışlar göstermiştir (Tablo 4.11, Şekil 4.11). S-2 hattında en yüksek GR aktivitesine (%122 artış), 3. günde 200 mg kg -1 B uygulamasında rastlanmıştır. 3. günde, 2 mg kg -1 B uygulaması %32 aktivite kaybına neden olurken, 20 mg kg -1 B GR aktivitesini %29 arttırmıştır. 7. günde 2 mg kg -1 ve 20 mg kg -1 B uygulamaları S-2 nin GR aktivitesinde %137 ve %125 artışlarla sonuçlanmıştır. Taşkent çeşidinde 2 mg kg -1 B uygulaması GR aktivitesinde 3. ve 7. günlerde %81 ve %15 artışlara neden olmuştur. Fakat 20 mg kg -1 ve 200 mg kg -1 B uygulamaları 3. günde %16 ve %29 aktivite kaybına, 7. günde 20 mg kg -1 B uygulaması ise GR aktivitesinde %9 azalmaya neden olmuştur. Özkaynak çeşidinde GR aktiviteleri B uygulamalarına bağlı olarak azalmıştır. Bu azalmalar 3. günde 2 mg kg -1, 20 mg kg -1 ve 200 mg kg -1 B uygulamalarında sırasıyla %13, %27 ve %20 oranlarında iken, 7. günde 2 mg kg -1 ve 20 mg kg -1 B uygulamalarında %50 ve %31 oranlarında gerçekleşmiştir (Tablo 4.11, Şekil 4.11). 62

80 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen GR aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. GR 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar ünite mg -1 protein S S ünite mg -1 protein S S ünite mg -1 protein S S ± b** ± c** ±48.08 Çeşit S ± a** ± a** ±75.69 Taşkent ± b** ± c** ±14.71 Özkaynak ± a** ± c** ±53.14 B mg kg ab** ± c** ± bc** ± b** ± c** ± a** ± a** ± bcd** ± g** ± g** ± f** ± g** ± c** ± fg** ± def** ± d** ±4.95 Çeşit x Bor S - 2 Taşkent g** ± a** ± bc** ± ab** ± a** ± efg** ± de** ± b** ± d** ± g** ± ef** ± g** ±3.65 Özkaynak b** ± b** ± bc** ± d** ± cde** ± c** ± cd** ±28.55 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 63

81 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen GR aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. 64

82 Askorbat peroksidaz enzim aktiviteleri (APX) hattının APX aktivitesi genel olarak B uygulamasına bağlı olarak artışlar göstermiştir. 3. günde APX aktivitesi 2 mg kg -1, 20 mg kg -1 ve 200 mg kg -1 B uygulamalarına bağlı olarak %233, %47 ve %497 oranında artışlar sergilemiştir (Tablo 4.12, Şekil 4.12). 7. günde ise 2 mg kg-1 B uygulamasıyla APX aktivitesinde %18 lik önemsiz bir düşüşe rağmen, 20 mg kg -1 B uygulaması APX aktivitesinde %99 artışa neden olmuştur. 3. günde, S-2 hattının APX aktivitesi 20 mg kg -1 ve 200 mg kg-1 B uygulamalarıyla %46 ve %111 oranlarında artmıştır. 7. günde ise 2 mg kg -1 B uygulaması %37 lik bir aktivite artışına neden olmuştur. Taşkent bezelye çeşidinde sadece 20 mg kg -1 B uygulaması 3. günde APX aktivitesinde %23 lük azalmaya neden olmuştur. 7. günde 2 mg kg -1 B uygulaması APX aktivitesini %30 azaltırken, 20 mg kg -1 B, %57 arttırmıştır. Özkaynak çeşidinin APX aktivitesi, 3. günde, 20 ve 200 mg kg -1 B uygulamalarıyla %129 ve %167 artışlar göstermiştir. 7. günde ise 2 mg kg -1 B APX aktivitesini %74 arttırmış fakat 20 mg kg -1 B aktiviteyi %43 azaltmıştır (Tablo 4.12, Şekil 4.12). 65

83 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen APX aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. APOX 0. Gün 3. Gün 7. Gün Uygulamalar ünite mg -1 protein S S ünite mg -1 protein S S ünite mg -1 protein S S ± c** ± b** ± Çeşit S ± a** ± a** ± Taşkent ± b** ± b** ± Özkaynak ± c** ± b** ± B mg kg c** ± b** ± bc** ± a** ± b** ± a** ± a** ± f** ± d** ± e** ± de** ± f** ± a** ± b** ± cd** ± c** ±35.20 Çeşit x Bor S - 2 Taşkent c** ± a** ± b** ± bc** ± a** ± cd** ± d** ± cde** ± de** ± de** ± bc** ± cd** ±14.80 Özkaynak f** ± d** ± f** ± ab** ± cde** ± e** ± cde** ± **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 66

84 Şekil , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin yapraklarında ölçülen APX aktiviteleri (Ünite mg -1 protein). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. 67

85 4.7. Hormon Bulguları Araştırmada, Bor (B) mikro elementine tepkileri daha önceden belirlenmiş olan Pisum sativum L. türüne ait olan meyvesi ve tohumu yenen yemeklik S2 hattı ile Pisum arvense L. türüne ait olan 602 yemlik hat, Taşkent ve Özkaynak yemlik tescilli çeşitleri kullanılmıştır. Hat ve varyetelerin bor noksanlığı ve toksisitesi koşullarında bitkilerin geliştirdiği savunma mekanizmasının açıklığa kavuşturulması hedeflenmiştir. Bitkisel hormonlar, bitkilerin yaşamları boyunca tüm fizyolojik olaylarda görev üstlenerek olağanüstü olayların gerçekleşmesini sağlayan mükemmel kimyasal maddelerdir. Değişik türlerin dokularında bulunan büyüme maddeleri potansiyel olarak yaygın düzenleyici sistemlerdir (CAPPİELLO ve KLİNG 1994). Büyüme hormonlarının fizyolojik etkileri konsantrasyonlarına, çevresel faktörlere, bitki türlerine ve bitkinin yaşına bağlı olarak değişebilmektedir. Başlıca fizyolojik etkileri olarak, hücre bölünmesi, hücre uzaması ve genişlemesi, morfogenez, tohum ve tomurcuk dormansisi, embriyo gelişimi ve tohum çimlenmesi, çiçeklenme, büyüme, meyve oluşumu, gelişimi ve olgunlaşması, partenokarpik meyve oluşumu, apikal dominansi, senesens, kloroplast gelişimi ve klorofil sentezi, nükleik asit ve protein sentezi, enzim sentezi ve aktivasyonu, tuber oluşumu, kök oluşumu, kambiyal aktivite, absisyon, strese adaptasyon mekanizması, ozmotik düzenleme üzerine etkileri sayılabilir (SALİSBURY ve ROSS 1992, PALAVAN-ÜNSAL 1993) İndol asetik asit (IAA) Düzeylerinde Meydana Gelen Değişimler Araştırma bulguları değerlendirilerek gövde ekstraktlarında bulunan IAA düzeyleri dikkate alındığında; Pisum arvense L. türüne ait olan 602 yemlik hattında 0. günde 3190 µg kg -1 olan IAA düzeyi periyodik olarak artış göstererek, 7. günde 3220 µg kg -1 düzeyine ulaşmıştır. Aynı düzeydeki periyodik artış Taşkent yemlik çeşidinde de elde edilmiş ve 0. günde 3140 µg kg -1 olan IAA, 7. günde 3210 µg kg -1 düzeyine ulaşmıştır. Pisum sativum L. türüne ait olan meyvesi ve tohumu yenen yemeklik S2 hattı ile Pisum arvense L. türüne ait olan Özkaynak yemlik tescilli çeşitlerinde ise tersi durumun olduğu tesbit edilmiştir. Bu hatlarda 0. günde sırasıyla 3220 ve 3190 µg kg -1 olan IAA, azalarak 7. günde sırasıyla 3200 ve 3210 µg kg -1 düzeylerine inmiştir. Kök aksamı ekstraktlarında ise, 602, S2, Taşkent ve Özkaynak çeşitlerinde 0. günde sırasıyla 3090, 3240, 3080 ve 3150 µg kg -1 ; 7. günde ise sırasıyla 3180, 3200, 3150 ve 2900 µg kg -1 olarak bulunmuştur. Ayrıca B konsantrasyonlarının artışıyla birlikte IAA nın azaldığı belirlenmiştir (Tablo 4.13). 68

86 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve köklerinde ölçülen IAA miktarları (µg kg -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Çeşit x B Dozu Gövde IAA (µg kg -1 ) Kök IAA (µg kg -1 ) Uygulamalar 0. gün 3. gün 7. gün 0. gün 3. gün 7. gün a*± ab**± a**± bc**± b**± a**±63 S a*± b**± a**± a**± ab**± a**±64 Taşkent 3140b*± a**± a**± c**± c**± a**±66 Özkaynak 3190a*± c**± b**± b**± a**± b**± ab**± ± a**± a**± b**± ± b**± b**± c**± ± a**± b**± a**± ± a**± b**± b**± ± b**± ab**± ab**± ±5 3150bc**± a**± ab**±5 3227± b**± b**± ab**± ± bc**± ab**± b**± ±0 3880a**± a**± bc**±0 3210± bc**± ab**± ab**± ± b**± ab**± b**± ± bc**± ab**± ab**± ± c**± ab**± ab**± ± c**± ab**± ab**± ± bc**± ab**± a**± ± bc**± ab**± ab**± ±5 3200b**± ab**± c**± ± bc**± c**± d**± ± a**± c**± bc**± ± a**± c**±73 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir Çeşit B Dozu (mg kg -1 ) S-2 Taşkent Özkaynak Çeşit x Doz interaksiyonlarına ait veriler değerlendirildiğinde; tüm hat ve çeşitlerin 3. güne ait verileri istatistiksel olarak % 1 düzeyinde önemli bulunurken, 7. gün verileri arasında herhangi bir farklılık gözlenmemiştir. Kök ekstraktlarında ise, 3. ve 7. günde elde edilen tüm değerler % 1 seviyesinde önemli olmuştur (Tablo 4.13). 69

87 Giberellik Asit (GA 3 ) Düzeylerinde Meydana Gelen Değişimler Bezelye hatlarının GA 3 hormon sonuçları dikkate alındığında, gövde ekstraklarındaki düzeylerin son derece büyük artışlar gösterdiği dikkati çekmektedir. Şöyleki; 602 hattında 0. günde 3110 µg kg -1 olan GA 3, periyodik bir artışla 3200 µg kg -1 düzeyine ulaşmıştır. S2 hattında 0. günde 1730 µg kg -1 olan GA 3 düzeyi, 3. günde 2660, 7. günde hafif bir düşüşle 2640 µg kg -1 olarak bulunmuştur. Taşkent çeşidinde 0. günde 1510 olan GA 3 miktarı 7. günde 2790 µg kg -1 olmuştur. Özkaynak çeşidinde de 0. günde 1470 µg kg -1 iken 7. günde ise 2 katı bir artışla 2960 µg kg -1 olarak tespit edilmiştir. Gövde ekstraktlarında zamanın ilerlemesiyle birlikte GA 3 düzeylerinin büyük artışlar gösterdiği özellikle de Taşkent ve Özkaynak çeşitlerinde ise bu artışların oldukça dikkat çekici düzeylerde olduğu belirlenmiştir. Hatlara ait kök ekstraktlarında ise çok hafif azalma ve artışların olduğu tespit edilmiştir. 602, S2, Taşkent ve Özkaynak hat ve çeşitlerinde 0. günde sırasıyla 3380, 3130, 2990 ve 3360 µg/kg -1 olan GA 3, 7. günde 3370, 3370 ve 3170 ve 3720 µg kg -1 olarak bulunmuştur. Hat ve çeşitler aralarında kıyaslandığında aynı gövde ekstraktlarında olduğu gibi kök ekstraktlarında da GA 3 ün artışı Özkaynak çeşidinde belirgin olmuştur (Tablo 4.14). Gövde ekstraktlarına uygulanan B konsantrasyonlarının artışına paralel olarak 3. günde GA 3 miktarlarının da doğrusal olarak arttığı, 7. günde ise 20 mg L -1 konsantrasyona kadar artışların olmasına rağmen 200 mg L -1 B konsantrasyonu uygulamasında GA 3 miktarının azaldığı, dolayısıyla 7. günde 20 mg L -1 B uygulamasının 3100 µg kg -1 değeri ile en yüksek düzeyde GA 3 ün gövdede oluştuğu saptanmıştır. Köklerde ise doz artışına bağlı olarak GA 3 sürekli azalma eğiliminde olmuştur (Tablo 4.14). 70

88 Çeşit x B Dozu Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve köklerinde ölçülen GA 3 miktarları (µg kg -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Gövde GA 3 (µg kg -1 ) Kök GA 3 (µg kg -1 ) Uygulamalar 0. gün 3. gün 7. gün 0. gün 3. gün 7. gün a**± a**± a**± a**± a**± ±75 S b**± bc**± d**± b**± b**± ±136 Taşkent 1510b**± b**± c**± c**± b**± ±32 Özkaynak 1470b**± c**± b**± a**± b**± ± b**± b**± a**± ± b**± b**± a**± ± a**± a**± a**± ± a**± b**± a**± ± ab**± ab**± a**± ± ab**± a**± a-d**± ± ab**± ab**± b-e**± ± a**± a**± ab**± ± de**± cd**± efg**± ± de**± cd**± c-f**± ± cd**± ab**± a-d**± ± e**± f**± fg**± ± f**± e**± b-f**± ± bc**± de**± d-g**± ± ab**± a**± b-e**± ± ab**0± ab**± c-g**± ± cd**± cd**± abc**± ± f**± bc**± efg**± ± de**± ab**± g**± ± abc**± ab**± c-f**± ±75 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir Çeşit B Dozu (mg kg -1 ) S-2 Taşkent Özkaynak Çeşit x Doz interaksiyonlarına göre, bezelye hattında en yüksek GA 3 seviyesi hem 3. hem de 7. günde 200 mg L -1 B uygulamasından sırasıyla 3180 ve 3290 µg kg -1 olarak elde edilmiştir. S-2 hattında ise en yüksek GA 3 seviyeleri hem 3. hem de 7. günde 20 mg L -1 B uygulamasından sırasıyla 2800 ve 3050 µg kg -1 değerleri tespit edilmiştir. Özkaymak hattı değerlerinden 3. ve 7. günde 200 ppm mg L -1 B uygulamasından sırasıyla 2990 ve 3080 µg kg -1 düzeylerinde GA 3 ün varlığı belirlenmiştir (Tablo 4.14). 71

89 Absisik Asit (ABA) Düzeylerinde Meydana Gelen Değişimler Denemeye alınan bezelye hatları gövde ve kök ekstraktlarında tespit edilen ABA düzeylerine genel olarak bakıldığında, zamanla artışların olduğu belirlenmiştir ve 0. Günde elde edilen tüm değerler (hem gövde hem de kök ekstraktlarına ait) istatistiki olarak % 1 düzeyinde önemli bulunmuştur. Gövde aksamlarına ait ekstraktlar dikkate alındığında; 602 hattında 0. günde 3233 µg kg -1 olan ABA, 7. günde 207 µg kg -1 lık bir artışla 3440 µg kg -1 düzeyine ulaşmıştır. S2 hattında 0. günde 3306 µg kg -1 olan ABA, 14 µg kg -1 artışla 3320 µg kg -1 olmuştur. Taşkent çeşidinde 3176 µg kg -1 olan ABA, 7. günde 154 µg kg -1 artış göstererek 3330 µg kg -1 olarak elde edilmiştir. Özkaynak çeşidinde ise 0. günde 3310 µg kg -1 olan ABA, 10 µg kg -1 artışla 3330 µg kg -1 olmuştur. Gövde ekstraktlarında ABA da meydana gelen artış en fazla 602 hattından elde edilmiştir. Kök aksamlarına ait analiz sonuçları irdelendiğinde ise; 602 hattında 0. günde 3310 µg kg -1 olan ABA 330 µg kg -1 lık artışla 3640, S2 hattında 410 µg kg -1 lık artışla 3730, Taşkent çeşidinde 37 µg kg -1 lık artışla 3320, Özkaynak çeşidinde de 420 µg kg -1 lık artışla 3470 µg kg -1 ABA nın varlığı belirlenmiştir Hem 3. gün hem de 7. günde elde edilen gövde ve kök ekstraktlarına ait ABA düzeyleri istatistiksel olarak önem arzetmemiştir (Tablo 4.15). Denemede uygulanan B konsantrasyonları dikkate alındığında; gövdede 3. gün örneklerine ait ekstraktlarda kontrolle kıyaslandığında 2 ve 20 mg L -1 B uygulama dozlarında herhangi bir faklılık oluşmamış, 200 mg L -1 B uygulamasında ise 30 µg kg -1 lık çok düşük bir azalma ile 3300 µg kg -1 düzeyi elde edilmiştir. 7. günde ise kontrolle kıyaslandığında 50 µg kg -1 lık bir gerilemeyle 3330 µg kg -1 düzeyinde ABA nın olduğu belirlenmiştir. Kök aksamına ait ekstraksiyonlarda ise kontrolde 3760 µg kg -1 düzeyinde olan ABA nın, 200 mg L -1 B uygulamasıyla 520 µg kg -1 lık bir gerileme gösterdiği tespit edilmiştir (Tablo 4.15). 72

90 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ve köklerinde ölçülen ABA miktarları (µg kg -1 ). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Uygulamalar Gövde ABA (µg/kg -1 ) Kök ABA (µg/kg -1 ) 0. gün 3. gün 7. gün 0. gün 3. gün 7. gün a**± ± ± a**± ± ±611 Çeşit S a**± ± ± a**± ± ±406 Taşkent 3180b**± ± ± a**± ± ±223 Özkaynak 3310a**± ± ± b**± ± ± ± ± c*± ±268 B Dozu (mg kg -1 ) ± ± bc*± ± ± ± a*± ± ± ± ab*± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±5 3320± ±107 Çeşit x Doz S-2 Taşkent ±5 3337±5 3317± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±137 Özkaynak ± ±5 3050± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ± ±241 **%1, *%5 seviyesinde istatistiki olarak önemli olduğunu göstermektedir 73

91 4.8. Anatomik Bulgular Araştırmada hattı örneklerine ait incelenen kök anatomileri karşılaştırıldığında 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg-1, 3. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 grubuna ait kesitlerin anatomik yapılarının benzer olup normal görünüşe sahip oldukları gözlenmiştir; ancak kontrol grupları ve 2 mg kg -1 'lik uygulamalarda ksilem doku anatomisinde belirgin farklılık gözlenmezken 200 mg kg -1 muamelerinde ksilem kollarında azalma ve trake-trakeid hücre çaplarında daralma gözlenmiştir. Ayrıca ksilem dokusunu dolduran parankimatik hücrelerde artış olmasına karşılık bu hücrelerde yapısal bozukluklar tespit edilmiştir. Son hasat (7. gün) 20 mg kg -1 'lik uygulamalarda kök ksilem alanı oldukça daralmış gözükmektedir. Alınan anatomik ölçümlerde 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, 7. gün (son hasat) kontrol, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda trake çaplarının en düşük ve en yüksek çap değerleri µm olarak sırası ile 30-50, 25-62, , 32-57, 42-50, 32-52, 43-78, 30-62, olarak ölçüldü. Örneklerin trakeid çap ölçüleri için bu değerler 10-15, 12-17, 15-25, 12-22, 10-17, 8-15, 8-25, 7-15, 11-21µm şeklindedir (Resim 4, Tablo 4.16, 17). 74

92 Resim bezelye hattı örneklerine ait kök anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 75

93 Resim bezelye hattı örneklerine ait gövde anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 76

94 602-1 bezelye hattı bitki gövde kesitlerinde 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu ve 3. gün 2 mg kg -1 anatomik yapıların normal görünümlü olduğu; ancak 3. gün 20 mg kg -1, 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 grubu ve 7. gün 2 mg kg -1 örneklerde trake çaplarında daralma gözlenmiştir. 200 mg kg -1 'lik uygulama kesit örneklerinde gövde korteks alanında artış görülmesine rağmen iletim dokusu alanında önemli bir daralma ve hücrelerde parçalanma belirgindir. Buna karşılık Son hasat zamanı 20 mg kg -1 'lik kesitlerde gövde iletim demetlerinin normal görünüşlü oldukları gözlenmiştir. Alınan anatomik ölçümlerde 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, 7. gün kontrol, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda trake çaplarının en düşük ve en yüksek çap değerleri µm olarak sırası ile 12-25, 37-67, , 30-50, 17-25, 21-37, 37-62, olarak ölçüldü. Örneklerin trakeid çap ölçüleri için bu değerler 5-10, 12-20, 7-12, 5-7, 7-12, 5-7, , 10-15, 6-15µm şeklindedir (Resim 5, Tablo 4.18, 19). 77

95 Resim bezelye hattı örneklerine ait yaprak anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 78

96 602-1 bezelye hattına ait yaprak kesitleri incelendiğinde 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1 ve kısmende olsa 3. gün 20 mg kg -1 'lik örneklerde mezofilin palizat ve sünger parankima hücre sınırları belirgin görülmektedir; ancak 3. gün 200 mg kg -1, 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 grubu, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 'lik örneklerde mezofilin hücre sınırları kısmen kaybolmuş şekilde görülmektedir. Alınan anatomik ölçümlerde 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1, 7. gün 2 mg kg 1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda yaprak palizat alanlarının en düşük ve en yüksek değerleri µm olarak sırası ile 25-52, 40-62, 25-37, 20-30, 25-37, , 62-87, 50-75, olarak ölçüldü. Örneklerin yaprak sünger alanlarının ölçüleri için bu değerler 70-75, 35-40, , 25-50, 37-62, 37-68, 50-75, 37-75, 62-87µm şeklindedir (Resim 6, Tablo 4.19, 20 ). 79

97 Resim 7. S2 bezelye hattı örneklere ait kök anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 80

98 Çalışmada S2 bezelye hattı örneklerine ait incelenen kök anatomileri karşılaştırıldığında 0.gün kontrol grubu ve 3. gün 0 mg kg -1 grubuna ait kesitlerde bir farklılık gözlenmemiş olup anatomik yapıları normal görünüşlüdür. 3. gün 2 mg kg -1 'lik örneklerde korteks alanının daralmış ve hücre çeperlerinin parçalanmış olduğu görülmüştür. 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1 örneklerinde trake sayılarının azaldığı belirlenmiştir. 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 grubuna dahil kesitlerin anatomik yapıları incelendiğinde ksilem kollarının sayısında belirgin azalmalar gözlenmiştir. Özellikle 7. gün 200 mg kg -1 e ait örneklerde ksilem kollarının sayısının azalması ksilemin radyal yapı özelliğini kaybetmesine sebep olmuştur. Alınan anatomik ölçümlerde 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda trake çaplarının en düşük ve en yüksek çap değerleri µm olarak sırası ile 28-57, 31-61, 15-47, 15-37, 15-50, , 25-47, 15-52, olarak ölçüldü. Örneklerin trakeid çap ölçüleri için bu değerler 17-27, 5-25, 20-40, 5-7, 7-12, 5-7, 5-10, 5-10, µm şeklindedir (Resim 7, Tablo 4.16, 17). 81

99 Resim 8. S2 bezelye hattı örneklerine ait gövde anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 82

100 S2 bezelye hattı gövde kesitlerinin benzer olup 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu ve 3. gün 2 mg kg -1 'lik uygulamalarda anatomik yapıların normal görünümlü olduğu, gövde korteks alanının dar buna karşılık iletim demetlerinin geniş bir yer kapladığı gözlenmektedir; ancak 3. gün 20 mg kg -1 'lik örneklerde gövde korteksinin belirgin şekilde geniş bir alan kapladığı gözlenmiştir. 3. gün 200 mg kg -1 'lik 7. gün (son hasat) 2 mg kg -1 ve 7. gün 0 mg kg -1 grubu örneklerde trake çapları daralmış olarak gözlenmiştir. 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulanan kesit örneklerinde gövde korteks alanında artış görülmesine rağmen iletim dokusu alanında önemli bir daralma ve hücrelerde parçalanma belirgin olarak görülmüştür. Gövde kesitlerinden alınan anatomik ölçümlerde 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, 7. gün (son hasat) kontrol, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda trake çaplarının en düşük ve en yüksek çap değerleri µm olarak sırası ile 15-52, 12-37, 10-20, 5-7, 15-52, 17-27, 32-67, 32-60, olarak ölçüldü. Örneklerin trakeid çap ölçüleri için bu değerler 5-7, 5-12, 2-6, 2-3, 7-10, 5-6, 7-10, , 5-10µm şeklindedir (Resim 8, Tablo 4.18, 19). 83

101 Resim 9. S2 bezelye hattı örneklerine ait yaprak anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 84

102 S2 bezelye hatlarına ait yaprak kesitleri incelendiğinde 0. gün kontrol grubuna ait kesitlerde mezofilin palizat parankima alanının oldukça dar bir alanı kapladığı tespit edilmiştir. Kesitlerde 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1 ve kısmende olsa 3. gün 20 mg kg -1 'lik örneklerde mezofilin palizat ve sünger parankima hücre sınırları belirgin görülmektedir; ancak 3. gün 200 mg kg -1 ve 7. gün (son hasat) 200 mg kg -1 'lik örneklerde mezofilin hücre sınırları kısmen kaybolmuş şekilde görülmektedir. 7. gün 0 mg kg -1 grubu ve 7. gün 2 mg kg -1 e ait örneklerde yaprak mezofilinin normal görünümlü ve benzer olduğu dikkati çekmektedir. Alınan anatomik ölçümlerde 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, 7. gün (son hasat) kontrol, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda yaprak palizat alanlarının en düşük ve en yüksek değerleri µm olarak sırası ile 20-25, , 45-60, 22-37, 15-25, 20-30, 17-25, 35-47, olarak ölçüldü. Örneklerin yaprak sünger alanlarının ölçüleri için bu değerler 10-12, 41-68, , 17-22, 20-22, 12-15, 7-17, 10-17, 22-12µm şeklindedir (Resim 9, Tablo 4.19, 20). 85

103 Resim 10. Taşkent bezelye çeşidi örneklerine ait kök anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 86

104 Çalışmada Taşkent bezelye çeşidi örneklerine ait incelenen kök anatomileri karşılaştırıldığında 0. gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu ve 3. gün 2 mg kg -1 örneklerine ait kesitlerin benzer olup; ksilem elemanları normal görünüşlüdür. 3. gün 20 mg kg -1 ve 3. gün 200 mg kg -1 örneklerinde ksilem kollarının sayısında belirgin azalma görülmüştür. Son hasat (7. gün) zamanı 0 mg kg -1 grubuna ait kesitlerin anatomik yapılarının benzer olup normal görünüşe sahip oldukları ancak kontrol grupları ve 2 mg kg -1 'lik uygulamalarda ksilem doku anatomisinde belirgin farklılık gözlenmezken 200 mg kg -1 uygulamasında ksilem kollarında azalma ve trake-trakeid hücre çaplarının daralma gözlenmiştir. Özellikle Son hasat (7. gün) zamanı 2 mg kg -1 e ait kesitlerin ksilem dokusunun normal görünüşlü olduğu belirgindir. Alınan anatomik ölçümlerde 0. gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, 7. gün (son hasat) kontrol, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda trake çaplarının en düşük ve en yüksek çap değerleri µm olarak sırası ile 10-37, 12-42, 27-50, 25-62, 37-52, 23-50, 30-50, 30-50, 20-45, olarak ölçüldü. Örneklerin trakeid çap ölçüleri için bu değerler 5-10, 5-12, 7-12, 3-7, 6-13, 7-17, 8-17, 6-18, 7-13µm şeklindedir (Resim 10, Tablo 4.16, 17). 87

105 Resim 11. Taşkent bezelye çeşidi örneklerine ait gövde anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 88

106 Taşkent bezelye çeşidine ait gövde kesitlerinde 0. gün kontrol grubuna ait örneklerde gövde korteksininin geniş bir alanı kapladığı gözlenmiştir. Bunun dışında ki kesit örneklerinde korteks alanı yakın ölçülerdedir. 3. gün 0 mg kg -1 grubunda ksilem elemanlarının çaplarında daralma gözlenirken, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, son hasat (7. gün) zamanı 0 mg kg -1 grubu, ve 7. gün 2 mg kg -1 ve 20 mg kg -1 grubunun anatomik yapılarının kısmen normal görünümü olduğu görülmüştür. Özellikle 7. gün 2 mg kg -1 örneklerinde trake hücrelerinin normal görünüşlü ve hücre çeperi kalınlaşmalarının belirgin olduğu görülmüştür. 7. gün 200 mg kg -1 örneklerinde ise trake hücrelerinin daralmış ve hücre çeperlerinin parçalanmış olduğu görülmüştür. Alınan anatomik ölçümlerde 0. gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, son hasat zamanı (7. gün) 0 mg kg -1, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda trake çaplarının en düşük ve en yüksek çap değerleri µm olarak sırası ile 22-62, 17-45, 35-55, 30-62, 17-25, 18-25, 27-45, 32-50, olarak ölçüldü. Örneklerin trakeid çap ölçüleri için bu değerler 12-17, 6-10, 10-17, 3-6, 6-12, 8-13, 11-17, 11-16, 3.7-8µm şeklindedir (Resim 11,Tablo 4.19, 20). 89

107 Resim 12. Taşkent bezelye çeşidi örneklerine ait yaprak anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 90

108 Yaprak anatomilerinden Taşkent bezelye çeşidi örneklerine bakıldığında son hasat zamanı (7. gün) 200 mg kg -1 örnekleri hariç diğer tüm kesitlerde mezofilin palizat ve sünger parankima hücrelerinin kapladığı alan hemen hemen eşittir. 7. gün 0 mg kg -1 grubu ve 7. gün 200 mg kg -1 'e ait örneklerde mezofil hücrelerinin kısmen parçalandığı görülmüştür. 7. gün 20 mg kg -1 'e ait örnekler hücre sınırları belirgin yaprak kesitleri şeklinde görülmektedir. Alınan anatomik ölçümlerde 0. gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, 7. gün 0 mg kg -1, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda yaprak palizat alanlarının en düşük ve en yüksek değerleri µm olarak sırası ile 17-42, 40-62, 62-92, 25-32, 30-55, 32-50, 28-45, 37-55, olarak ölçüldü. Örneklerin yaprak sünger alanlarının ölçüleri için bu değerler 7-22, 32-45, , , , 50-67, , , 20-30µm şeklindedir (Resim 12, Tablo 4.19, 20). 91

109 Resim 13. Özkaynak bezelye çeşidi örneklerine ait kök anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 92

110 Özkaynak bezelye çeşidi örneklerine ait incelenen kök anatomilerinde 0. gün ve 3. gün 0 mg kg -1 grubunun anatomik yapılarının benzer olup normal görünüşe sahip oldukları gözlenmiştir. 3. gün 2 mg kg -1 'lik kesit örneklerinde ksilem elemanlarınında yapısal bozukluk ve sayısal azalma görülmüştür. Özellikle 3. gün 200 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 'lik uygulamalarına ait örneklerde ksilem dokusunun bozulduğu bu bozulmanın ksilem kol sayısı ve ksilem eleman sayısı azalması şeklinde olduğu tespit edilmiştir; ancak 7. gün 20 mg kg - 1 'lik örnek kesitlerde kök anatomik yapısının normal olup ksilem dokusuna ait radial yapı belirgin olarak gözlenmiştir. Alınan anatomik ölçümlerde 0. gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, Son hasat zamanı (7. gün) kontrol, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarında trake çaplarının en düşük ve en yüksek çap değerleri µm olarak sırası ile 27-42, 7-45, 32-60, 30-75, 37-50, 35-50, 15-25, 30-52, olarak ölçüldü. Örneklerin trakeid çap ölçüleri için bu değerler 3-12, 3-11, 6-10, 6-12, 11-15, 6-11, 3-6, 6-11, 8-15µm şeklindedir (Resim 13, Tablo 4.16, 17). 93

111 Resim 14. Özkaynak bezelye çeşidi örneklerine ait gövde anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 94

112 Özkaynak bezelye çeşidi örneklerine ait gövde kesitleri incelendiğinde 0. gün kontrol grubu ve 3. gün 2 mg kg -1 'lik uygulamalara ait kesitlerde öz bölgesinin daraldığı, korteks bölgesinin ise daha geniş bir alanı kapladığı görülmüştür. 3. gün 20 mg kg -1, 7. gün 0 mg kg -1 grubu, 7. gün 20 mg kg -1 'lik örneklerde korteks parankima hücreleri ve ksileme ait hücrelerin kısmen parçalanmış olduğu tespit edilmiştir. Ayrıca bu örneklere ait kesitlerde ksilemin düzensiz dağılışı da dikkati çekmektedir. 7. gün 2 mg kg -1 'e ait örneklerde korteks hücreleri ve iletim elemanları normal görünümlüdür. Alınan anatomik ölçümlerde 0.gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, Son hasat zamanı (7. gün) kontrol, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda trake çaplarının en düşük ve en yüksek çap değerleri µm olarak sırası ile 27-65, 12-7, 25-62, 12-22, 10-22, 16-25, 25-70, 17-45, olarak ölçüldü. Örneklerin trakeid çap ölçüleri için bu değerler 6-10, 6-10, 3-8, 6-11, 2-6, 8-1.5, 5-15, 5-12, 6-8µm şeklindedir (Resim 14, Tablo 4.18, 19). 95

113 Resim 15. Özkaynak bezelye çeşidi örneklere ait yaprak anatomik kesitleri (Ölçek 50µm) A: O.gün kontrol grubu B: 3. gün 0 mg kg -1 C: 3. gün 2 mg kg -1 D: 3. gün 20 mg kg -1 E: 3. gün 200 mg kg -1 F: 7. gün (son hasat) 0 mg kg -1 G: 7. gün 2 mg kg -1 H: 7. gün 20 mg kg -1 I: 7. gün 200 mg kg -1 96

114 Özkaynak bezelye çeşidine örneklerine ait yaprak kesitlerinde yaprak anatomilerinden 3. gün örneklemelerine bakıldığında 7. gün 200 mg kg -1 örnekleri dışında diğer örnek kesitlerde yaprak anatomilernin benzer olup normal görünüşlü şekle sahiptir. Bu kesitlerde hücre çeperleri parçalanmamış belirgin biçimdedir. Bu çeşite ait kesitlerde palizat parankima hücrelerinin kapladığı alanın oldukça dar olduğu dikkati çekmektedir. Alınan anatomik ölçümlerde 0. gün kontrol grubu, 3. gün 0 mg kg -1 grubu, 3. gün 2 mg kg -1, 3. gün 20 mg kg -1, 3. gün 200 mg kg -1, 7. gün (son hasat) kontrol, 7. gün 2 mg kg -1, 7. gün 20 mg kg -1 ve 7. gün 200 mg kg -1 uygulamalarda yaprak palizat alanlarının en düşük ve en yüksek değerleri µm olarak sırası ile 30-40, 42-57, 38-50, 32-55, 20-35, 22-37, 27-47, 37-52, olarak ölçüldü. Örneklerin yaprak sünger alanlarının ölçüleri için bu değerler , 45-62, 50-55, , , 37-52, 25-37, 42-72, 25-75µm şeklindedir (Resim 15, Tablo 4.19, 20). 97

115 Resim 16. Bitki örneklerine ait köklerde yan kök oluşumu A: Özkaynak, 7. gün (son hasat) 20 mg kg -1 B: 602-1, 3. gün 2 mg kg -1 C: 602-1, 7. Gün (son hasat) 20 mg kg -1 D: 602-1, 7. Gün (son hasat) 20 mg kg -1 E: Özkaynak 7. gün 20 mg kg -1 98

116 Anatomi çalışmalarında bitki örneklerine ait kök kesitleri incelendiğinde 602-1bezelye hattı 3. gün 2 mg kg -1 ve 7. gün 20 mg kg -1 grubu uygulamalarında, ayrıca Özkaynak bezelye çeşidi 7. gün 20 mg kg -1 grubu uygulamalarında yan kök oluşumunun yoğun olduğu gözlenmiştir. Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin köklerine ait trake çapı anatomik ölçümleri (μm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Karakte r Uygulama S2 Taşkent Özkaynak O.gün 39.5 ± ±8.2 29± ±5.7 Trake Çap (μm) 3. gün 0 mg kg ± ± ± ± gün 2 mg kg ± ± ± ±10 3. gün 20 mg kg ± ± ± ± gün 200 mg kg ± ± ± ± gün 0 mg kg ± ± ± ± gün 2 mg kg ± ± ± ± gün 20 mg kg ± ± ± ±.8 7. gün 200 mg kg ± ± ± ±9 99

117 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin köklerine ait trakeid çapı anatomik ölçümleri (μm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Karakte r Uygulama S2 Taşkent Özkaynak O.gün 12±1.8 25± ± ±3.1 Trakeid Çapı (μm) 3. gün 0 mg kg -1 15± ± ± ± gün 2 mg kg ± ± ± ± gün 20 mg kg -1 19± ± ± ± gün 200 mg kg -1 20± ±2 9.4± ± gün 0 mg kg ± ± ± ± gün 2 mg kg ± ± ± ± gün 20 mg kg -1 10±3.1 8± ± ± gün 200 mg kg ± ± ± ±2.4 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ait trake çapı anatomik ölçümleri (μm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Karakter Uygulama S2 Taşkent Özkaynak O.gün 20 ± ± ± ±13.5 Trake Çap (μm) 3. gün 0 mg kg ± ±5.2 32± ± gün 2 mg kg ±7.9 15±3.5 44± ± gün 20 mg kg -1 15± ±4 48± ± gün 200 mg kg ± ± ±2.6 17± gün 0 mg kg ±3.2 23± ± ± gün 2 mg kg ± ± ± ± gün 20 mg kg -1 51± ±9.9 42± ± gün 200 mg kg ± ± ± ±

118 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ait trakeid çapı anatomik ölçümleri (μm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Karakter Uygulama S2 Taşkent Özkayna k O.gün 7.3±2.2 6±1.2 15± ±1.5 Trakeid Çapı (μm) 3. gün 0 mg kg -1 17± ± ± ± ± ± ±2. 6.4± gün 2 mg kg gün 20 mg kg ± ±0.2 5± ± gün 200 mg kg -1 10± ± ± ± gün 0 mg kg gün 2 mg kg gün 20 mg kg gün 200 mg kg ± ± ± ± ± ±1 14.3± ± ± ± ±1. 9.2± ±3.3 30± ± ±0.8 Tablo , S-2, Taşkent ve Özkaynak bezelye hat ve çeşitlerinin gövde ait palizat parankima çapı anatomik ölçümleri (μm). Bezelye bitkileri üç yapraklı evreden itibaren 2, 20 ve 200 mg kg -1 B içeren Hoagland solüsyonuyla sulanmaya başlanmış ve uygulamanın ve 7. günlerinde hasat edilmiştir. Sonuçlar ortalama ± standart sapma olarak verilmiştir. Karakter Uygulama S2 Taşkent Özkayna k O.gün 41.5± ±1.8 30± ±3.5 Palizat Parankima Alanı (μm) 3. gün 0 mg kg ± gün 2 mg kg ± ± ± ±5.3 52±5 75.5± ± gün 20 mg kg ±4 30± ±3.5 44± gün 200 mg kg -1 33±4.8 22±3.5 45± ±

119 7. gün 0 mg kg ± ±3.5 42± ± gün 2 mg kg ± ± ± ± gün 20 mg kg -1 62± ±4 48.2±5.8 49± gün 200 mg kg ± ± ±6.7 36± Gen Ekspresyon Analizleri RNA Ekstraksiyonu ve cdna sonuçları: Farklı bor (B) dozlarında yetiştirilen yemlik bezelye çeşidi (Özkaynak) örnekleri kullanılarak QIAGEN RNeasy Mini Kit ile Standard koşullarda gerçekleştirilen Total RNA ekstraksiyonlarının sonuçları Nanodrop ND-1000 Spektrofotometre cihazı ile elde edilmiş olup tablolarda da görüldüğü üzere kantitatif gen ekspresyonlarında kullanılabilir kalitede RNA içerdikleri (260/280 nm deki okuma değerlerinin aralığında oldukları) görülmektedir. Fermantas ın First Strand cdna Synthesis Kiti kullanılarak örneklerden 1 µg total RNA 20 µl hacimde cdna ya dönüştürülmüş, ilk zincir cdna örnekleri Nanodrop ND ile 40 ng a eşitlenmiştir. Total RNA sonuçları: Tablo Özkaynak çeşidine ait örneklerinin spektrofotometrede okunan değerleri KÖK Örnekleme Zamanı / /230 Konsant. Kontrol 7.gün 1.tekerrür ,60 7.gün 2.tekerrür ,50 7.gün 3.tekerrür 21,9 10,1 2,16 2,05 876,37 2 mg kg -1 7.gün 1.tekerrür ,40 7.gün 2.tekerrür ,10 7.gün 3.tekerrür 17,5 8,09 2,17 2,41 700,85 20mg kg -1 7.gün 1.tekerrür ,54 7.gün 2.tekerrür ,70 7.gün 3.tekerrür 7,57 4,02 1,88 0,97 302,83 YAPRAK Örnekleme Zamanı / /230 Konsant. Kontrol 7.gün 1.tekerrür ,4 7.gün 2.tekerrür ,8 7.gün 3.tekerrür 0,27 0,16 1,72 0,82 27,50 2 mg kg -1 7.gün 1.tekerrür ,6 7.gün 2.tekerrür ,5 102

120 7.gün 3.tekerrür 0,12 0,05 2,33 0,1 9,85 20 mg kg-1 7.gün 1.tekerrür ,8 7.gün 2.tekerrür ,9 7.gün 3.tekerrür 19,2 8,99 2,13 2,26 767, Ekspresyonun optimizasyon çalışmaları: Sentezlenen cdna kullanılarak serinkarboksipeptidaz geninin ifadesi bir housekeeping gen olan aktin ile birlikte semi-quantitative olarak optimizasyonuna çalışılmış ancak aktin geninin uygulanan B dozlarından etkilenmesi, hedef genin de primerlerinin yeterince iyi çalışmaması, primer dimeri oluşturması gibi sebeplerle bu primerlerin kullanımından vazgeçilmiştir. Ayrıca, kullanılan üniversal GAPDH housekeeping geni primerleriyle de hem bor dozuna bağlı hem de cdna konsantrasyonuna bağlı PCR denemeleri gerçekleştirilmiş, bu genin de B uygulamalarında ifadesinin farklılık gösterdiği ve bu çalışmalarda referans gen olarak kullanılamayacağı anlaşılmıştır. Örnek olarak, 2mM Mg, 50 pmol GAPDH primeri içeren bir PCR ortamında 0, 2 ve 20 ppm B uygulanan bezelye örneklerinin 25 µl hacimde gerçekleşen çalışmasında cdna örnekleri 1:1, 1:10, 1:100 ve 1:1000 dilüsyon koşullarında çalışılmış ve %1 lik agaroz jel ortamında 75 V ta, Mini Jel Yatay Elektroforez Sisteminde yürütülülerek alttaki görüntü elde edilmiştir. Görüldüğü üzere, amplifikasyon düzenli değildir. Primer dimerleri oluşmuştur. Ayrıca, yüksek dozda amplifikasyon olmamıştır. Yani 20 mg kg -1 bor ortamında gelişen bitkilere ait cdna lardan amplifikasyon gerçekleşememiş ya da gerçekleştirilememiştir. Yeterli B içeren (2 mg kg -1 B) ortamda gelişen bitkilere ait örneklerde ise amplifikasyonda cdna nın dilüsyon etkisi gözlenmiştir. Sonuç olarak bu düzensiz amplifikasyonlara bağlı olarak, yaygın bir şekilde referans gen olarak kullanılan GAPDH bizim çalışma koşullarımızda uygun bir referans gen özelliği gösteremediği için bu amaçla kullanımından vazgeçilmiştir. 103

121 Resim 17. Sağ üstten itibaren örneklerin agaroz jele yükleme sırası Jele yükleme sırası: 1 nolu örnek 20 mg kg -1 kök 1:1000 cdna 2 nolu örnek 20 mg kg -1 kök 1:100 cdna 3 nolu örnek 20 mg kg -1 kök 1:10 cdna 4 nolu örnek 20 mg kg-1 kök 1:1 cdna 5 nolu örnek 2 mg kg -1 kök 1:1000 cdna 6 nolu örnek 2 mg kg -1 kök 1:100 cdna 7 nolu örnek 2 mg kg -1 kök 1:10 cdna 8 nolu örnek 2 mg kg -1 kök 1:1 cdna 9 nolu örnek 0 mg kg -1 kök 1:1000 cdna 10 nolu örnek 0 mg kg -1 kök 1:100 cdna 11 nolu örnek 0 mg kg -1 kök 1:10 cdna 12 nolu örnek 0 mg kg -1 kök 1:1 cdna Optimizasyon çalışmaları esnasında, farklı Mg (1.0, 1.5, 2.0, 2.5 mm) ve farklı T A değerleri denenerek Gradient PCR ortamında amplifikasyonların optimizasyonuna çalışılmıştır. Örnek olarak alttaki jel görüntüsü yer almaktadır. %1.75 agaroz jel görüntüsünde, üstte PsCP geni, altta ise S18 farklı koşullarda denenmiştir. Sonuç olarak, hem belirlenen referans geninin, hem de hedef genin T A değerleri 58 derecenin üzerinde rahatlıkla çalışabildiği gözlenmiştir. 104

122 Jele yükleme sırası: 1 nolu kuyucuk Fermantas 50 kb marker 2 nolu kuyucuk /1. örnek 3 nolu kuyucuk /2. örnek 4 nolu kuyucuk /3. örnek 5 nolu kuyucuk /4. örnek 6 nolu kuyucuk / 5. Örnek 7 nolu kuyucuk /6. Örnek 8 nolu kuyucuk /7. örnek 9 nolu kuyucuk Boş 10 nolu kuyucuk /Negatif kontrol 11 nolu kuyucuk Ferm. 200 kb DNA ladder Resim 18. Örnek jel görüntüsü (üstte PsCP geni, altta ise S18) Sonraki aşamada, kök örneklerinin B uygulaması ertesinde farklı günlerde alınmış RNA örneklerinden üretilmiş olan cdna lar ile farklı B konsantrasyonlarında her iki genin çalışması denenmiş, referans gen olarak belirlenen S18 in farklı doz ve farklı gnlerde hasat edilen örneklerinin semi-quantitatif PCR sonuçlarına göre altta figürde de görülebileceği üzere 70V ta %2 agaroz jel ortamında yürütülen örneklerin homojen bir ekspresyon sağladığına kanaat getirilmiştir. Resim 19. Sol: Fermantas 50 kb marker ve PsCP geni / Sağ: Fermentas 200 kb DNA ladder S18 geni Buna göre; tabloda yer alan deney düzeneği oluşturulmuştur. No: Örnek ismi cdna no Çalışılan gen 1 0.gün kök 2 PsCP 2 3.gün kontrol kök 9 PsCP 3 3.gün 2 ppm kök 17 PsCP 4 3.gün 20 ppm kök 25 PsCP 5 3.gün kontrol kök 33 PsCP 6 3.gün 2 ppm kök 41 PsCP 7 3.gün 20 ppm kök 49 PsCP 8 0.gün kök 2 18S 105

123 9 3.gün kontrol kök 9 18S 10 3.gün 2 ppm kök 17 18S 11 3.gün 20 ppm kök 25 18S 12 3.gün kontrol kök 33 18S 13 3.gün 2 ppm kök 41 18S 14 3.gün 20 ppm kök 49 18S PCR Koşulları: Kullanılan kimyasal adı: Bioron 10x PCR buffer incomplete Bioron 25 mm MgCl 2 Primer F Primer R Fermantas 25 mm dntp Bioron Taq DNA polimeraz PCR suyu **Tek miks için hesaplanmıştır, PsCP ve S18 için koşullar aynıdır. Miktarı 2.5*8=20 mikrolitre 1.5*8=12 mikrolitre 1*8=8 mikrolitre 1*8=8 mikrolitre 0.5*8=4 mikrolitre 0.3*8=2.4 mikrolitre 17.2*8=137.6 mikrolitre 106

124 Uygulanan PCR programı : dakika sn saniye saniye dk 40X Bu aşamada, çalışma planımızda SYBR Green ile qrt-pcr var iken kullandığımız Stratagene cihazının blok arızası oluşması üzerine Real time çalışmalarına tecrübeli olmadığımız Carousel-tabanlı bir sistemle devam etmek zorunda kaldığımız için çalışmanın etkilenmemesini sağlamak maksadı ile daha güvenilir olan problarla çalışmaya devam edilmiştir. Çalışmanın daha hassas bir şekilde devam edebilmesi için daha kısa amplikon (<100 bp) veren intron-spanning Universal Library Probe larının (Roche) kullanılması uygun bulunmuştur. Projede probların tasarımında kullanılan hedef gen PsCP dizini alttadır: >gi emb aj gaaacttctcttcttctatcctttctcattattctctcacactttgtggttgaaatccat ggaaaaaacaaacaagttgaagctcttgacaatcttcacaaagcagaatacatagaaaat tcagaaattgataagagtgaatttgaagtacaagagattgtgtatgacattgatgccatt gctgattctcaaaagggtgtcaaagagaatgatagaatcaaaaagcttcctggtcaaccc tttgtgaaattctctcaatttggagggtatgttacattggataaattgagtggtagtgcg ttttactattactttgttgaagctcatcaatctaaagaaacacctccacttcttctttgg ctcaatggaggtcctggatgttcatctctagcttatggagcaatgcaagaattgggacct tttagagtaaacagtgatggcaaaacacttcaccaaaatagatactcatggaattatgct gcaaatgttttgttcttggagtctccagttggagtaggattttcttactcaaacaaatca acagaatatagtagcaatggagacaagaaaacagctatagataactatttatttttggta aattggttggaaagatttccagaatataaaaatagagatttttatatttctggagaaagc tatgctggacattatgttcctcaacttgcacataccatcctctatcataataaaaaggca aataaaacaatcattaacctcaaaggaatcttgatagggaatgcagtgatccatgatact acagactcaacaggaatgtatgattttcttgctactcatgctatcatctcagacaaagca gcttatgatgtcaacaaagtttgcgatttctcgtcatcagataatctcactgctgaatgc aattcagctgctgatgaagttaatgaagatattgcattcatcgatttgtataacatttat gctccactatgcaagaatgagaatctcacttccaagcccaaaaagaacactattgtgact gatccatgcagtaagaattatgtgtatgcttatcttaatagacaagatgttcaagaggct attcatgctaatgtcacaaaactcaaatatgaatggagtccatgcagtggtgtcattaga aaatgggttgatagctctccaacagttcttcctcttttacatgaattcctcaataatggc cttagagtttggattttcagcggtgacacggatggaagggttcctgttacttcgactaag tattcgattaagaagatgaaccttcctgttaaaactgtttggcacccttggttcgcctat ggagaagttggtggctatactgaagtatacaagggagacctaacatttgttacagtgaga gaagcaggacatcaagtgccaagttatcaaccagcaagagctcttactttgattaaacat ttcttggatggcactcctcttccttctccaaaaataaaagcatagtctaatcaaagcaaa ttcaattgtaattggatttcttagatcctaattatgatctttcattgatcagacttgtat aaataatcataattcttaatgaaatatcaaatttgcattaaaaaaaaaaaaaaaaaa Bu dizin kullanıalrak üretilen primer ve problar: Primer Boyu Pozisyonu T m %GC Sequence Forward PsCP gtgaatttgaagtacaagagattgtgt Reverse PsCP acacccttttgagaatcagca Prob PsCP: ttgatgcc Amplikon PsCP (64 nt) gtgaatttgaagtacaagagattgtgtatgacattgatgccattgctgattctcaaaagggtgt 107

125 Referans gen S18 dizini ise: >gi gb ay gtaggtgaacctgcggaaggatcattgtcgatgccttatatgcagtccaacacgtgaatt agtttgaacacatgcggtgggcttgaggtgtttcacaccccagcttgccattggcatcgg aggggaacgacaaaatgcgttctcttctgtgccaaaactcaaaccccgacgctgaatgcg tcaaggaaatttaactttgctctgagcacatctgcatggcaccggagacggttyccgtgc gggttgtgttttgacacattaatataaaatgactctcggcaacggatatctaggctcttg catcgatgaagaacgtagcgaaatgcgatacttggtgtgaattgcagaatcccgtgaacc atcgagtctttgaacgcaagttgcgcccgatgccattaggttgagggcacgtctgcctgg gtgtcacatattgaagcctcctgccaatttccttttgacaggtattgtgcagggtggatg ttggcctcccgtgagctctctttcgtctcatggttggttgaaaattgagaccttggtagg gtgtgccatgataaatggtggttgtgtgacccacgagaccaatcatgtgttgctctattr aatttgggctcttttacccatttgcgtttctaaacgctcgtgatgagacctcaggtcagg cggg Bu dizin kullanıalrak üretilen primer ve problar: Primer Boyu Pozisyonu T m %GC Sequence Forward S tggtagggtgtgccatgat Reverse S gcaacacatgattggtctcg Prob S18: atggtggt Amplikon PsCP (60 nt) tggtagggtgtgccatgataaatggtggttgtgtgacccacgagaccaatcatgtgttgc Ön çalışmalar dikkate alınarak, en iyi sonucun 7. gün örneklerinden elde edilebileceği anlaşılmıştır. Buna göre; önce kök örnekleri çalışılmıştır. 108

126 Tablo Bezelye kök örnekleri sonuçları No Tüp Örnek Adı Tipi CP Tek 2^(ΔC T ) ORT Stand. Gen Tarih No Sapma adı 1 41B 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 26, , , ,02206 S B 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 25, ,02836 S D/B 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 21, ,01758 S B 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 26, ,05751 S B 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 25, ,02936 S D/B 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 20, ,01408 S B 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 23, , , ,04259 S B 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 27, ,12500 S B 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 21, ,01243 S B 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 23, ,06037 S B 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 27, ,05517 S B 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 20, ,00643 S B 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 24, , , ,06374 S B 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 26, ,10807 S D/B 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 20, ,01951 S B 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 22, ,00530 S B 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 25, ,04737 S D/B 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 23, ,17751 S A 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 30,72 1. PsCP A 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 30,79 2. PsCP D/A 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 27,02 3. PsCP A 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 30,65 1. PsCP A 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 30,67 2. PsCP D/A 7.gün 4.çeşit 0 mg kg 1 KÖK 27,08 3. PsCP A 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 28,08 1. PsCP A 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 30,50 2. PsCP A 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 27,69 3. PsCP A 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 27,96 1. PsCP A 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 31,20 2. PsCP A 7.gün 4.çeşit 2 mg kg 1 KÖK 27,60 3. PsCP A 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 28,91 1. PsCP A 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 29,67 2. PsCP D/A 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 26,67 3. PsCP A 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 29,71 1. PsCP A 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 29,77 2. PsCP D/A 7.gün 4.çeşit 20 mg kg 1 KÖK 26,47 3. PsCP PsCP Negatif kontrol PsCP KÖK 1. PsCP S18 Negatif kontrol S18 KÖK 2. S PsCP Negatif kontrol PsCP KÖK 1. PsCP S18 Negatif kontrol S18 KÖK 2. S

127 Kök örnekleri sonuçlarına göre uygulanan B dozuna bağlı olarak S18 referans genin normalizasyonu koşullarında bezelyede Serin carboxypeptidase (PsCP) geninin ekspresyonunun belirgin bir şekilde artmış olduğu gözlenmiştir. Bor-noksan koşullarda en düşük ekspresyon seviyesi izlenirken, normal büyüme koşullarında bitkinin ihtiyaç duyduğu B miktarı olan 2 mg kg -1 borlu büyüme ortamında PsCP geninin ifadesinde 0,03588/0,05113=1.43 kat bir artış gözlenmiştir. Grafikten de izlenebileceği üzere, toksik seviyede bor içeren (20ppm) hidroponik sistemde yetişen bezelyelerde ise normal büyüme koşullarındaki ΔC T değerlerine göre PsCP genininin ifadesinde0,07004/0,05113= 1.37 kat bir artış gözlenmiştir. Şekil Bezelye kök örneklerinde S18 ile Normalize PsCP Ekspresyonu 110