İÇERİK TABLOSU. Kullanılan Semboller Üretici. In vitro diagnostik medikal gereç. Lot numarası. Katalog numarası. ile Kullanım. Kullanım bilgileri

Transkript

1

2 İÇERİK TABLOSU Kullanılan Semboller... 5 Türkçe Kullanım Amacı... 9 Test Prensibi... 9 Reaktifler... 9 Tanımlama,kullanım için hazırlama ve saklama koşulları.. 9 Kit içeriğinde olmayan gerekli materyaller Güvenlik ve Çevre Koşulları Örnekler Manipulation procedures Yıkama Talimatı Beyanat ve Önlemler Test prosedürü Sonuçlar Kısaltmalar Validasyon Sonuçların Yorumlanması Sınırlamalar Test performansı Duyarlılık Özgünlük Kesinlik Kullanılan Semboller Üretici In vitro diagnostik medikal gereç Lot numarası Katalog numarası ile Kullanım Kullanım bilgileri Biyolojik riskler Sıcaklık sınırlamaları < X > testi için yeterli miktarı içerir Plate Konjugat 1 20x Konjugat 2 100x Konjugat Diluent 1 Konjugat Diluent 2 Negatif Kontrol NP40

3 TMB 100x Substrat buffer Yıkama Solusyonu 5x Kullanım Amacı INNOTEST HIV Antigen mab (96T and 480T) insan serum,plazma ya da hücre kültür supernatantlarında human immunodeficiency virus tip 1 (HIV-1), HIV-1 group O ve tip 2 (HIV-2) nin p24 core antijenlerinin kalitatif belirlemesi için enzim immunotesttir (EIA). Test Prensibi Polistren mikrotiter pleytin kuyucukları HIV insan poliklonal antikorları ile kaplıdır. HIV antijen içeren test örnekleri, biotin işaretli anti-p24 monoklonal antikorlarının karışımı ile birlikte kuyucuklarda inkübe edilir. Biotin, peroxidase konjugatlı streptavidin ile bağlanır. Peroxidase substrat ve kromojen ile inkübasyon test kuyucuklarında mavi renk oluşumunu sağlar ve reaksiyonu durdurmak için sülfirik asit eklendiğinde sarıya döner. Örnekler HIV içermiyor ise, işaretli antikor HIV p24 antijenlerine spesifik olarak bağlanmaz ve sadece düşük arka plan renk gelişimi gözlenir. Reaktifler Tanımlama,kullanım için hazırlama ve saklama koşulları - Tüm test reaktifleri orjinal ambalajında, 2-8 C de saklanırsa son kullanma tarihine kadar bozulmaz. Son kullanım tarihi geçmiş reaktifleri kullanmayınız. Reaktifleri dondurmayınız. - Tüm reaktifler ve poşetlerindeki test kuyucukları kullanımdan yaklaşık 30 dakika önce oda sıcaklığına (18-30 C) getirilmiş olmalı ve kullanımdan hemen sonra buzdolabına (2-8 C) kaldırılmalıdır. - Reaktifleri orjinal şişelerinde kapalı olarak saklayın. - Fiziksel görünüşünde tahribata uğramış kit rekatifleri kararsızlık ya da bozulmalara neden olabilir. Herbir paket içeriği: 1. 1 poşet (96T) ya da 5 poşet (480T) bir pleyt çerçesi ile 12 x 8 insan anti-hiv poliklonal antikorları kaplı stripler ve kurtucu madde olarak silikajel torba. Stripleri içeren alüminyum folyo poşet açıldıktan sonra, kullanılmayan herbir test kuyucuğu, silikajel torba ile birlikte kapalı plastik minigrip poşette 2-8 C de 8 hafta saklanabilir şişe 2.5 ml (96T) ya da 4.5 ml (480T) Negatif Kontrol (HIV-antijenleri için negatif insan serumu, koruyucu olarak 0.1% sodium azide içeren) içerir şişe 10 ml (96T) ya da 40 ml (480T) NP40 (koruyucu olarak 0.05% Proclin 300 içeren, stabilizer olarak bovine casein ve proteaz inhibitor olarak bovine aprotinin içeren) içerir şişe herbiri 4 ml (96T) ya da 4 şişe herbiri 9 ml (480T) Konjugat Diluent 1 (koruyucu olarak 0.05% Proclin 300 içeren phosphate bufferda 0.2% kümelenmiş insan IgG ve ısı ile inaktive edilmiş mouse serum) içerir, Konjugat 1 dilusyonu için kullanılır şişe 0.4 ml (96T) ya da 2 ml (480T) konsantre Konjugat 1 (biotin işaretli murine anti-p24 monoklonal antikorlar, koruyucu olarak 0.049% Proclin 300, stabilizör olarak bovine albumin ve ısı ile inaktive edilmiş mouse serum) içerir, kullanılmadan önce Konjugat Diluent 1 ve NP40 ile 20x seyreltilmelidir. Tablo 1: Konjugat çalışma solusyonu 1 hazırlanması Konjugat 1 (ml) Konjugat Diluent 1 (ml) NP40 (ml) Konjugat çalışma solusyonu 1, 2-8 C de 1 hafta saklanabilir şişe 30 ml (96T) ya da 150 ml (480T) Konjugat Diluent 2 (koruyucu olarak 0.05% Proclin 300, stabilizör olarak bovine casein ve proteaz inhibitor olarak bovine aprotinin içeren phosphate buffer), Konjugat 2 dilusyonu için kullanılır şişe 0.3 ml (96T) ya da 1.5 ml (480T) Konjugat 2 (peroxidase konjugatlı streptavidin) kullanılmadan önce Konjugat diluent 2 ile 100 x seyreltilmelidir. Tablo 2: Konjugat çalışma solusyonu 2 hazırlanması Konjugat 2 (ml) Konjugat Diluent 2 (ml) Konjugat çalışma solusyonu 2 direk günışığından korunarak oda sıcaklığında (15-30 C) 24 saat saklanabilir şişe 30 ml (96T) ya da 150 ml (480T) Substrat Buffer (0.006% hydrogen peroxide içeren phosphate-citrate buffer), Substrat TMB dilusyonu için kullanılır.

4 9. 1 şişe 0.3 ml (96T) ya da 1.5 ml (480T) konsantre Substrat TMB (DMSO içinde çözülmüş tetramethylbenzidin), kullanmadan önce Substrat buffer ile 100x seyreltilmelidir. Tablo 3: Substrat çalışma solusyonu hazırlanması Substrat TMB (ml) Substrat buffer (ml) Substrat solusyonu karanlıkta bekletilirse oda ısısında (15-30 C) 1 gün saklanabilir. konsantre TMB katılaşabilir ve kullanılmadan önce tamamen eritilmelidir (erime noktası 18 C) şişe 45 ml (96T) ya da 200 ml (480T) konsantre Yıkama Solusyonu (koruyucu olarak 0.15% Proclin 300 içeren phosphate buffer), kullanmadan önce distile ya da deiyonize su ile 25x seyreltilmelidir. Table 4: Yıkama solusyonu hazırlanması Yıkama solusyonu (ml) Su (ml) Seyreltilmiş yıkama solusyonu 2-8 Cde 4 hafta saklanabilir. Yıkama Solusyonu 2-8 C de bekledikten sonra tuz kristalleri oluşabilir. Bu kristaller, seyreltme yapmadan önce 37 C de dağıtılmalıdırlar. Yıkama solusyonu kullanılırken oda ısısında (15-30 C) tutulabilir (96T) veya 20 (480T) yapışkan plak kaplayıcı (96T) veya 2 (480T) kullanılmayan striplerin saklanması için plastik torba. INNOTEST HIV Antijen mab (96T) için sfesifik komponentler: şişe 15 ml Matriks (koruyucu olarak 0.05% Proclin 300, stabilizör olarak bovine casein ve proteaz inhibitor olarak bovine aprotinin içeren phosphate buffer) şişe 2.5 ml Konsantre Pozitif Kontrol (matrikste seyreltilmiş rekombinant HIV-1 p24, koruyucu olarak 0.05% Proclin 300, stabilizör olarak bovine casein ve proteaz inhibitor olarak bovine aprotinin içeren). Standartların belirlenebilen konsatrasyonları şişelerin üzerindeki etiketlerde yazmaktadır. Pozitif kontrol hazırlamak için matriks ile standartı 2 defa seyreltin 8 kuyucuklu strip için 120 µl Pozitif kontrol hazırlayın. Birden fazla strip için, en az iki pozitif kontrol içeren yukarıdaki miktarın iki katını kullanın. Tablo 5: Pozitif Kontrol hazırlanması Test sayısı Standard (ml) Matriks (ml) INNOTEST HIV Antigen mab (480T) için spesifik: şişe 3 ml Pozitif Kontrol (phosphate bufferda seyreltilmiş rekombinant HIV-1 p24, koruyucu olarak 0.05% Proclin 300, stabilizör olarak bovine casein ve proteaz inhibitor olarak bovine aprotinin içeren). Zayıf pozitif kontrol:: Pozitif Kontrolü Negatif Kontrol ile 1/6 seyreltin. Stripin herbir pleyti için 240 µl zayıf pozitif kontrol hazırlayın. Tablo 6: Zayıf pozitif kontrol hazırlanması Test sayısı 96 Pozitif kontrol (ml) Negatif kontrol (ml) Kit içeriğinde bulunmayan gerekli materyaller - Distile ya da deiyonize su mol/liter aaralığında analitik grade sülfirik asit µl ve µl pipetler ve tek kullanımlık pipet uçları. - Vorteks mikser C inkübatör. - Emici dokular. - Fotometrik Okuyucu: 450 nm ve opsiyonel olarak 620 nm ya da 690 nm de okuma yapaliben mikroplate okuyucu. - Opsiyonel: Sulfurik asid, konjugat, substrat, yıkama solusyonu ve örnek diluent eklemek için pipet, tek kullanımlık şişeler. örnek ve reaktif eklenmesinden sonra miksin karışması için plate shaker. Mikroplate yıkayıcı. Güvenlik ve Çevre Koşulları - Lütfen Material Safety Data Sheet (MSDS) ve potansiyel tehlikeli komponentler içeren işaretli ürün bilgilerini inceleyiniz.. En son güncellenen MSDS versiyonu websitesinde yer almaktadır. R22-32, S7-23

5 Zararlı! (Xn) Çok toksik gazların oluşumunu önlemek için, sodium azide ile asitlerin temas etmesini önleyiniz. Sodyumazid içeren: Negatif kontrol. R36/37/38, S Tahriş edici! (Xi) Gözler, solunum sistemi ve deri için tahriş edicidir. Buharını solumayınız. Deri ile temasından kaçınınız. Gözler ile temas etmesi halinde hemen bol su ile yıkayınız ve doktorunuza başvurunuz. DMSO içeren: Substrat. - Mikrotiter pleytin kuyucuklarında kaplı olan insan anti-hiv poliklonal antikorları inaktive edilmiş ve anti-hcv ve HBsAg için negatif bulunmuştur. Negatif kontrol ve Konjugat Diluent 1 içinde birleşmiş insan IgG, anti-hiv1, anti-hiv2, anti-hcv ve HBsAg için negatif bulunmuştur. - Örneklerin potansiyel enfeksiyon ajanı olduğu göz önüne alınarak kullanılmalıdır. Tüm biyolojik materyallerinin potansiyel enfeksiyon ajanı olduğu göz önüne alınarak kullanılmalıdır. Hiçbir test metodu kan ürünlerinin enfeksiyon ajanlarını geçirmeyeceğine dair garanti vermemektedir. Sadece yeterince tecrübesi olan personel bu testi çalışmalıdır. Tüm biyolojik materyaller güvenlik koşullarına uygun olarak atılmalıdır. 121 C de 15 dakika otklavlanmalıdır. Tek kullanımlık materyaller yakılmalıdır. Sodyum hipokloritli miks likit atıkların son konsantrasyonu ± 1% sodyum hipoklorit olmalıdır. Atmadan önce bir gece bekletiniz. ÖNLEM: asit içeren likitlere sodium hipoklorit eklemeden önce nötralize ediniz. - Tehlikeli ya da enfeksiyonlu ajanlar ile çalışılırken koruyucu giysiler; eldiven ve koruyucu gözlük kullanılması gereklidir. - Atıklar hastanelerin atılım talimatlarına göre yok edilmelidir. Kamusal ve çevresel düzenlemelere uyulmalıdır. Örnekler - INNOTEST HIV Antijen mab serum, plazma (sitrat, heparin ve EDTA) ya da hücre kültür supernatantları ile kullanılmalıdır. - Isı ile inaktive olmuş örnekleri kullanmayın. - Örnekler mikrobiyal kontaminasyonlu olmamalıdır. - Test yapılmadan önce örneklerin çözülmemiş kısımları santrfüj ile ortadan kaldırılmalıdır. - Devamlı dondurup çözdürülmüş, lipemik ve hemolizli örnekler hatalı sonuçlara neden olabilir. - hücre kültür medyumu, hücrelerin ve debrilerin uzaklaştırılması için önce santrifüj edilmelidir. Test için supernatant kullanılır ve kontrol olarak bir HIV-nagatif hücre kültür süpernatantı kullanılmalıdır. - Örnekleri 2-8 C de saklayınız. 1 haftadan uzun süre saklamak için -20 C de küçük hacimlere ayırarak saklayınız. - Saklamadan önce, serum ya da plazmadan santrifüjle kan pıhtısı ve kan hücreleri ayrılmış olmalıdır. Manipulation procedures Yıkama Talimatı Uygun olmayan yıkama işlemi sonuçları olumsuz etkileyecektir. Yıkama solusyonu ve yıkayıcının kontaminasyonu ciddi problemlere yol açabilir. Bir problem oluştuğunda, yıkama şişesi ve yıkayıcıyı uygun dezenfeksiyon solusyonu ile gece boyu dezenfekte ediniz. Bu nedenle: - Seyreltilmiş yıkama solusyonunu 2-8 C de saklayınız. - Tercihen taze hazırlanmış yıkama solusyonu kullanın. - Seyreltilmiş yıkama solusyonu ile yıkayıcıya önyıkama yaptırınız. Aşağıda manual yıkama adımları bulunmaktadır: Aşağıda manual yıkama adımları bulunmaktadır. Her bir aspirasyondan sonra pleyti ters çevirin ve emici dokular üzerinde sertçe vurun. Kuyucukları 300 µl seyreltilmiş Yıkama Solusyonu ile doldurun. En az 30 saniye ıslanması için bekleyin ve sıvıyı aspire edin. Bu adımları 5 kez tekrarlayın. Beyanat ve Önlemler - Son kullanma tarihi geçmiş kitleri kullanmayınız. - Farklı lot numarasındaki reaktifleri birbirine karıştırmayınız. - Donmuş reaktifler hatalı sonuçlara neden olabilir! - Tüm kanallar Konjugat Çalışma Solusyonu ve Substrat Solusyonu hazırlanmasından sonra distile su ile iyice temizlenmelidir. - Kontaminasyonu önlemek için plate kenarlarına dokunmayınız. - Reaktiflerin mikrobiyal kontaminasyonundan kaçınınız. - Kullanmadan önce örnekler ve kontrollerin homojen olduğundan emin olun. - Herbir örnek için yeni bir pipet ucu kullanın. Kontaminasyonu önlemek için örnek ya da konjugat yüklerken kuyucukların kenarlarına pipet ucu ile değmeyiniz. - İnkübasyon ya da saklama sırasında Substrat Solusyonunu güçlü ışık altında açıkta bırakmayın. Substrat ile inkübasyon sırasında plate karanlıkta bekletilmelidir. Substrat Solusyonu kullanılırken renksiz olmalıdır. Eğer solusyon maviye dönerse değiştirilmelidir. - TMB, sulfurik asid ya da peroxide içeren solusyonlar istenmeyen renk değişimlerini önlemek için metal veya metal iyonları ile temas etmemelidir. - Hava baloncuklarını pleyte hafifçe vurarak yok ediniz.

6 - Eğer yıkamadan hemen sonra kuyucuklar konjugat ya da substrat ile hemen doldurulmayacak ise, 15 dakikadan uzun olmamak kaydı ile emici doku üzerinde başaşağı konulmalıdır. - Pleytler okutulmadan önce, pleytin tabanı kontrol edilmelidir.pleyt tabanı temiz ve kuru olmalıdır. - Reaktif çalışma solusyonlarını hazırlarken kan toplama tüplerini kullanmayınız. Test Prosedürü Tüm test materyallerinin kullanmadan önce oda sıcaklığına (18 to 30 C) getirilmiş olduğundan emin olunuz. 1. Gerekli sayıda stribin üzerindeki koruyucuları alın, herbir strip içinbir negatif ve bir pozitif kontrol içerecek şekilde hazırlayın (Reaktif hazırlamaya bakın). Daha fazla strip için, herbir strip tutacağında en az iki negatif ve iki pozitif kontrol olacak şekilde ayarlayın. Test çalışması sırasında, stripler, pleyt çerçevesi içinde olmalı sıkıca tutturulmalıdır. 2. Herbir test kuyucuğuna 100 µl konjugat çalışma solusyonu 1 ekleyin. Uygun test kuyucuklarına 100 µl örnek ya da kontrollerden ekleyin. Plate dikkatlice sallanarak ya da plate shaker (1000 rpm) kullanılarak karıştırılmalıdır. Stripleri yapışkan kaplayıcı ile kapatın ve 37 C de 60 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda konjugat çalışma solusyonu 2 yi hazırlayın. 3. Herbir kuyucuğu 5 kez yıkayınız (Yıkama Talimatlarına bakınız). 4. Herbir test kuyucuğuna 200 µl konjugat çalışma solusyonu 2 ekleyin. Stripleri yapışkan kaplayıcı ile kapatın ve 37 C de 60 dakika inkübe edin. İnkübasyonun sonunda substrat solusyonu hazırlayın. 5. Herbir kuyucuğu 5 kez yıkayınız (Yıkama Talimatlarına bakınız). 6. Herbir test kuyucuğuna 200 µl substrat solusyonu ekleyin. Oda ısısında (15-30 C) 30 dakika inkübe edin. 7. Reaksiyonu durdurmak için, Substrat Solusyonu ile aynı sekansta ve aynı zaman aralığında herbir kuyucuğa 50 µl Stop Solusyonu ekleyiniz. Strip tutacağını miksin tam üzerini kapattığından emin olacak şekilde dikkatlice kapatınız adımdan sonra 15 dakika içinde kuyucuklardaki solusyonların absorbanslarını 450 nmde mikroplate okuyucu da okutunuz. Tablo 7 de bir örnek verilmiştir. Tablo 7: Single ya da dual dalgaboyu analizi için absorbans değerleri örneği Single dalgaboyu Dual dalgaboyu Farklılık 450 mm (or 620) nm Poz. kontrol Neg. kontrol Sonuçlar Kısaltmalar N = negatif kontrollerin absorbanslarının ortalması P = pozitif kontrollerin absorbanslarının ortalması S = örneklerin absorbansı Validasyon - Negatif kontrollerin 450 nmde absorbansı den düşük olmalıdır den yüksek kontrolleri elimine ederek N hesaplayın. - Pozitif kontrollerin 450 nmde absorbansı den yüksek olmalıdır den düşük kontrolleri elimine ederek P hesaplayın. - Eğer kontrollerin yarısından fazlası elimine oluyorsa, test çalışması hatanın kaynağının dikkatlice araştırılmasından sonra tekrar edilmelidir. - Dual dalgaboyu, single dalgaboyundaki 50 mod den farklı absorbans değerinde analiz edilir. Sonuçların yorumlanması Cut-off değeri N hesaplayın. S < N ise örnek NON-REAKTİF tir. S N ise örnek REAKTİF tir. - Negatif kontrolün 450nm de beklenen absorbans aralığı ± 0.010, sonuçlarda beklenen cut-off değeri: ± = ± Pozitif kontrolün 450nm de beklenen absorbans aralığı ± Tüm reaktif örnekler aynı test metodu kullanılarak son yorumlama için tekrar test edilmelidir. Tekrar edilen reaktif örnekler, INNOTEST HIV Antigen mab Neutralization Reagents kullanılarak HIV antijenlerinin nötralizasyonu ile değerlendirilebilir. Nötralize olan örnekler HIV-antijen pozitif olarak değerlendirilir.

7 - Non-reaktif bir örnek, HIV ile enfeksiyona maruz kalmayacağına dair kesin bir kanıt olarak kullanılamaz. - Bir örneğin yapılmadığı durumlarda optik densite arasında görülecektir. Sınırlamalar - INNOTEST HIV Antijen mab test prosedürü, plazma,serum ya da hücre kültür supernatantları için dizayn edilmiştir. Diğer vucüt sıvıları ile test performansı hakkında yeterli bilgi bulunmamaktadır. Bu nedenle, bu örneklerin çalışılması önerilmez. - INNOTEST HIV Antijen mab kiti ile negatif bulunan bir sonuç, p24 antijeni hastalığın mutlak fazlarında belirlenebilen konsantrasyonlarda görülmemiş olsa da HIV ile enfeksiyona maruz kalmayacağına dair kesin bir kanıt olarak kullanılamaz. - Serokonvesiyon sonrası, p24 antijeni antikorlar ile kompleks yapabilir ve belirlenemez olur. - Romatoid faktör seviyesi artmış olan örnekler, INNOTEST HIV Antijen mab ile yanlış pozitif sonuçlar verebilir. Bu durumda, INNOTEST HIV Antigen mab Neutralization Reagents örneklerin yanlış pozitifliğini teyit eder. Test performansı Duyarlılık INNOTEST HIV Antigen mab belirleme limiti; insan serumunda seyreltilmiş standart, HIV 1 antijen (Sanofi Diagnostics Pasteur) kullanılarak üç farklı lotta ölçülmüştür. Ortalama belirleme limiti 10 pg/ml erişmiştir. Toplamda 82 klinik örnek, alternatif antijen testleri ile birlikte p24 antijeni için INNOTEST HIV Antijen mab testinde pozitif bulunmuştur. 82 örneğin tümü reaktif bulunmuş ve INNOTEST HIV Antigen mab Neutralization Reagents kullanılarak %50 den fazlası nötralize edilebilmiştir. Toplamda 79 HIV-1 ve 2 HIV-2 hücre kültür süpernatantı test edilmiştir. Tüm süpernatantlar reaktif bulunmuş ve INNOTEST HIV Antigen mab Neutralization Reagents kullanılarak nötralize edilebilmiştir. Toplamda 35 serokonversiyon paneli INNOTEST HIV Antijen mab ile ve alternatif antijen testleri ile test edilmiştir. Ortalama antijenemi görülme süresi, alternatif testler ile 14,9 gün olarak bulunurken INNOTEST HIV Antijen mab ile 18,5 gündür. Bir BBI HIV Antijen Miks Titre paneli (PRA203) test edilmiştir ve tüm 18 pozitif örnek reaktif bulunmuştur. Özgünlük Toplamda 2000 sağlıklı kan donoru test edilmiştir. Test sonucunda 7 tanesi reaktif bulunmuştur ve bunlardan 4 tanesi tekrar testi ile reaktif bulunmuştur. Bu örneklerin hepsi INNOTEST HIV Antigen mab Neutralization Reagents ile nötralize edilmemiştir. Nötralizasyon sonrası sonuçların duyarlılığı 100%. Risk grubundan olan toplamda 300 seronegatif hasta örneği ve fırsatçı enfeksiyona sahip 122 seronegatif hasta örneği test edilmiştir. Test sonrasında, 10 örnek reaktif bulunmuştur. Bu 10 reaktif örneğin 8 tanesi INNOTEST HIV Antigen mab Neutralization Reagents ile test edilmiş ve 8 örneğin hiçbiri pozitif olarak teyit edilmemiştir. Toplamda 179 potansiyel karışım örneği test edilmiştir. Bu örneklerin onüçü reaktif bulunmuş ve bunların 4 tanesi tekrar testinden sonra pozitif bulunmuştur. Bu 4 örnek toplamda 34 romatoid faktörlü hastanın dışında bulunmuştur. Bu örneklerin hiçbiri nötralize edilmemiştir. Kesinlik Çalışma-içi varyasyon, bir çalışmada 32 replikatta bir negatif örnek ve 2 (yüksek ve orta) pozitif örnek test edilerek belirlenmiştir. %VK negatif örnekler için 10.4%, yüksek pozitif örnekler için 2.3%, orta örnekler için 3.6% olarak bulunmuştur. Çalışmalar-arası varyasyon, 5 farklı günde 11 negatif ve 14 pozitif örnek ile test edilmiştir. %VK negatif örnekler için 6.5%-14.6% arasında değişkenlik gösterirken pozitif örnekler için 4.6%-10.2% arasındadır. Lotlar arası varyasyon 3 farklı lotta BBI p24 Antijen Miks Titre Performans paneli test edilmesi ile belirlenmiştir. %VK 1.5%-20.3% arasındadır.