DAMAR DÜZ KASI PROLİFERASYONUNDA SİNYAL İLETİMİ

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ TIP FAKÜLTESİ MECMUASI Cilt 55, Sayı 4, DAMAR DÜZ KASI PROLİFERASYONUNDA SİNYAL İLETİMİ Aslıhan Aydemir Köksoy* ÖZET Damar düz kası hücrelerinin (DDKH) kontrol dışı proliferasyonu hipertansiyon, by-pass stenozu, ateroskleroz ve ateroskleroza eğilim yaratan diyabet gibi hastalıklar sırasında gözlenen ve damar çeperinin daralması ile sonuçlanan bir tablodur. DDKH nde proliferasyon sinyali iletiminde birçok yolak rol almaktadır. Bu yolakların birbirleriyle etkileşimi ve kontrolleri bu derlemede verilmektedir. Anahtar Kelimeler: Damar Düz Kası, Proliferasyon Sinyali İletimi, Büyüme Reseptörü SUMMARY Signaling For Vascular Smaoth Muscle Cells Uncontrolled proliferation of the vascular smooth muscle cells (VSMC) is the key factor responsible for the obstruction of the vessel lumen observed during hypertensive diseases, by-pass stenosis, atherosclerosis and also diseases with atherosclerotic tendency such as diabetes. Many pathways are involved in signaling for VSMC proliferation. This review focuses on the major pathways of VSMC proliferation, their interaction with each other and mechanisms that control these processes. Key Words: Growth Factor Receptors, Proliferation Signaling, Vascular Smooth Muscle Hipertansiyon, ateroskleroz ve by-pass graft stenozunda damarın fizyolojik kasılma-gevşeme cevabı bozularak anormal davrandığı gözlenir. Sözü edilen durumların patolojisinin temel nedeni damar düz kasındaki düzenin bozulması, normalden farklı fenotipteki düz kas hücrelerinin ortama hakim olması ve kasa benzer hücrelerin bu ortamda azalmasıdır. Bunun sonucunda damar düz kas proliferasyonunda artma, büyüme faktörlerine abartılı cevap verilmesi ve damarda yeniden modellenme gözlenmektedir. Bu derlemede yukarıda sıralanan patolojilerin temelinde yatan mekanizma olan damar düz kasında proliferasyon sinyal iletimi özetlenmeye çalışılacaktır. 1. Damar Düz Kası Damar düz kası hücreleri (DDKH) kapiller damarlar hariç bütün damarların duvarında bulunan ve damarın kasılıp-gevşeme fonksiyonunu sağlayan hücrelerdir. Orta ve büyük çaplı damarlar 3 tabakadan oluşur: intima, medya ve adventisya. DDKH damarların medya tabakasında ve hücredışı matriks içinde yerleşmiş olarak bulunurlar (Şekil 1). Gelişim sırasında DDKH farklı birçok fenotip sergilerler. DDKH ni diğer damar hücrelerinden ayırmak amacıyla kasılmayla ilgili bazı proteinlerin ekpresyonlarına bakılması esas alınmıştır. Damara özgünlükleri azalan sırayla verildiğinde bunlar; düz kas miyozin ağır zinciri, kalponin, kalsiyum ve aktin bağlayan protein-sm22a (1), ve a- düz kas aktinidir (2,3). DDKH nin birden fazla fenotipte bulunduğu ve damar düz kasının olgunlaşması sırasında veya zedelenmesini takiben DDKH nde fenotip modulasyonu olduğu gözlenmektedir (4). Bu konuda yapılan moleküler incelemeler damar duvarından izole edilen düz kas hüc- * Dr., Ankara Üniversitesi Tıp Fakültesi, Biyofizik Anabilim Dalı, Ankara Geliş Tarihi: 08 Mart 2002 Kabul Tarihi: 20 Mayıs 2002

2 298 DAMAR DÜZ KASI PROLİFERASYONUNDA SİNYAL İLETİMİ Şekil 1: Damar kesiti ve damar düz kasının damardaki yerleşimi. Damar düz kası hücreleri damarın medya tabakasında hücre-dışı matriks içinde yerleşmiş olarak bulunurlar. relerinin en az 2 alt gruba ayrılabileceğini göstermektedir(5). Birinci grupta düz kasın tipik yapısını gösteren, uzun ve silindirik görünümde olan, kasılma yeteneğine sahip ve konraktil eleman proteinlerini içeren tip 1 hücreler vardır. Tip 1 hücrelerde proliferasyon, migrasyon veya hücre-dışı matriks sentezleme yeteneği bulunmamaktadır. İkinci grupta ise izolasyon sonrasında küresel biçimde olduğu gözlenen, kasılma yeteneği olmayan ve sadece kültüre edildikten sonra düz kas aktinini eksprese edebilen düz kas hücreleri vardır. Bu hücreler hücre-dışı matriksini oluşturan elastin, fibronektin, kollajen gibi proteinleri sentezleyen, proliferasyon ve migrasyon yeteneğine sahip tip 2 hücrelerdir(6). Belirtilen hücreler arasındaki başka bir fark da tip 2 hücrelerin plastik yüzeylere kolayca tutunmaları ve kolayca kültüre edilebilmeleridir. Yeni damar oluşumu veya damar duvarının tamiri sırasında başlangıçta tip 2 hücrelerin ortama hakim olduğu ve olgunlaşma sonrasında tip 1 hücrelere dönüştükleri düşünülmektedir (7). İntima hiperplazisi damar duvarının en iç tabakasını oluşturan intimada hasar veya patolojik değişimler (ateroskleroz v.s. gibi) nedeniyle buradaki endotel örtüsünün bozulmasıyla ortaya çıkan kontrolsüz hücre proliferasyonudur. Yapılan çalışmalar intima hiperplazisinden sorumlu olan hücrelerin yukarıda tarif edilen tip 2 hücrelerin özelliklerini taşıdıklarını göstermiştir(5). Intima hiperplazisine hemen her zaman intima kalınlaşması eşlik eder. Bunun nedeni ise prolifere olan hücrelerde hücre-dışı matriks sentezinin artmış olmasıdır. Bu konuda öne sürülen ana hipotez ateroskleroz veya by-pass graft stenozu sırasında, etkilenen damar bölümündeki düz kas dokusuna normalden farklı uyarımların (hormonlar, sitokinler, nörotransmitterler gibi) geldiği ve bu uyarımların damarın yeniden modellenmesine yol açtığıdır (8). Bu nedenle örneğin aterosklerotik intima hem hiperplastiktir, hem de degişime uğramış hücreler ve hücre-dışı matriksten oluşmaktadır (9). Bu değişimlerin monoklonal özellik taşıdığının gösterilmesi hiperplazi konusunu çok daha ilginç kılmakta (10) ve DDKH de fizyolojik düzenin korunmasının önemini vurgulamaktadır. Damar düz kası proliferasyonunu anlamak ve kontrol edebilmek intimal hiperplaziyle seyreden damar patolojileriyle ilgili araştırmaların ana hedefi olmuştur. Şimdiki bilgiler proliferasyon sinyal iletiminin; büyüme faktörü, integrin ve G-proteinine bağlı reseptörlere (GPCR) ait yolaklar arasında bir iletişim örgüsü şeklinde gerçekleştiğini göster-

3 ASLIHAN AYDEMİR KÖKSOY 299 mektedir. Bu sayede başlangıçtaki uyarım birkaç kat artırılarak birçok reseptör ve kinazın ortaklaşa görev yaptığı bir sinyal çağlayanına dönüşmektedir. Şekil 2 de DDKH proliferasyonuna ait bazı ana sinyal yolakları gösterilmektedir. Hücre membranı düzeyinde proliferasyon sinyal molekülünün bağlanabileceği 3 tip reseptör tanımlanabilir: reseptör protein tirozin kinazlar (RTK) (11), GPCR (12) ve integrinler (13). Birinci gruptaki reseptörler bireysel olarak enzimatik aktivite (tirozin kinaz) gösterirler. İkinci gruptakilerin sinyal iletimi bir G proteini aracılığıyla,ve integrinler üzerinden sinyal iletimi ise hücre içindeki reseptör-olmayan tirozin kinazların kullanılmasıyla olur. Bundan sonraki bölümde her reseptör grubunun aktivasyonuna ayrıntılı olarak yer verilmiştir. Her 3 grup reseptör de aktive olduklarında birçok ara sinyalci molekülü aktive edebilirler. Bunlar arasında kinaz ve fosfatazlar, fosfolipazlar, GTPase döngüsünü hızlandırıcı proteinler, adaptör proteinler sayılabilir. Bu sinyal ağının başka bir bileşeni de hücre dışından iyon kanalları yoluyla hücre içine alınan veya hücre içi depolardan salınan kalsiyum nedeniyle hücre içi serbest kalsiyum iyonunun (Ca 2+ ) i artmasıdır. Şekil 2: DDKH de proliferasyon sinyali iletimi. TA -transaktivason, GPCR - G proteinine bağlı reseptör, FAk -fokal adezyon kinazı, PLC -fosfolipaz C, PKC -protein kinaz C, PI3K - fosoinozitid-3-kinaz, DAG - diaçilgliserol 2. Büyüme faktörü (GF) reseptörlerinden sinyal iletimi Bu konuda en fazla çalışılmış olan faktörler trombosit kaynaklı büyüme faktörü (PDGF), epidermal büyüme faktörü (EGF), insulin benzeri büyume faktörü (IGF-1) ve bazik fibroblast büyüme faktörüdür (b-fgf). Büyüme faktörü reseptörleri (GFR) membranı bir kez geçen ve hücre içindeki kısımları intrensek kinaz aktivitesine sahip olan proteinlerdir ve bu nedenle reseptör tirozin kinaz (RTK) olarak da bilinirler. Bir GF kendi reseptörüne bağlandığında reseptörün dimerizasyonu sonucunda hem reseptörde konformasyon değişikliğine hem de dimeri oluşturan reseptörlerin hücre-içindeki kinaz bölümlerinin fiziksel olarak yakın konuma gelmesine neden olur. Bu değişim reseptör tirozin kinazı aktive ederek reseptörün hem kendisini (otofosforilasyon) hem de diğer reseptörü (koaktivasyon), tirozin fosforilasyonu yoluyla aktive etmesini sağlar (14). Benzer bir mekanizma yoluyla aktivasyon özdeş olmayan reseptörler arasında da gözlenir ve transaktivasyon olarak adlandırılır (15). Fosfotirozinler karşılıklı reseptörlerin birbirlerini SH2 bağlayan bölgeler yoluyla tanımalarını ve reseptör dimerlerinin oluşmasını sağlarlar (16). Her RTK ın özel sinyalci proteinlerle etkileşmesini sağlayacak, kendisine özgü fosforilasyon ve otofosforilasyon bölgeleri vardır. Sinyalci proteinler, enzimler ve adaptör proteinler olarak iki genel grupta toplanabilir. Adaptör proteinler GDP-GTP dönüşümünü hızlandırarak Ras ve benzeri küçük G-proteinlerini aktive ederler ve dolayısıyla bazı alt kinaz ailelerini (örn. MAPK) harekete geçirirler. Bu mekanizma ilerideki bölümlerde detaylı olarak anlatılacaktır. Reseptörler sinyalin başladıgı ve yayılması için sinyalci moleküllerin toplandıgı odaklar oluştururlar. Birçok sinyalci protein direkt veya indirekt yolla reseptöre bağlanarak aktive olur. Bazı hallerde ise aktif reseptörün hedefi ve birçok sinyalciyi buluşturan iskele görevi yapan proteinlerdir (örn. paksilin, kaveolin). Bu durumda tirozinleri fosforile olmuş bu proteinler hem reseptörü hem de sinyalci molekülleri birleştiren bir platform oluşturur. RTK, üzerlerindeki fosforile olmuş tirozinler aracılığıyla SH2 (src homoloji 2) ve PTB (fosfotirozin bağlama) bölgesi içeren sinyalci proteinlerle bağlanırlar. Bu etkileşim iyice özelleşmiş bir anahtar kilit uyumu gibidir. Örneğin Src nin SH2 bölgesi fosfotirozin - glutamik asit - glutamik

4 300 DAMAR DÜZ KASI PROLİFERASYONUNDA SİNYAL İLETİMİ asit - izolözin motiflerini tanır (17). SH2 içeren diğer proteinler arasında Grb2 adaptör proteini, fosfolipaz C (PLC), fosfoinozitid-3-kinaz (PI3K) ve p120rasgap sayılabilir. Reseptörle biraraya gelen Grb2 ve Sos adaptör proteinleri ve reseptör-olmayan tirozin kinazlar (Src) sayesinde sinyal, akışaşağı proteinlere iletilir. Reseptörler ve sinyalciler, SH2 ve PTB bölgelerine ek olarak geniş bir çerçevedeki lipid ve proteinlerle etkileşimi sağlayan ek motifler de içerirler. Bunlara en iyi iki örnek SH3 (src homoloji 3) ve PH (plekstrin homoloji) bölgeleridir. SH3 bölgeleri prolinden zengin motifleri (prolin-x-x-prolin; X=herhangi bir amino asit) tanırlar (18). PH bölgelerinin ise fosfolipidleri bağladığı gözlenmiştir. Hem GPCR hem de RTK fosfolipid oluşumunu artıran enzimleri (örn PI3K ve PLC) kendilerine çekerek aktive ederler. Oluşan diaçilgliserol (DAG) ve inozitol-3-fosfat (IP3) gibi fosfolipidler ise kalsiyum homeostazı, protein kinaz aktivasyonu ve aktin organizasyonunda önemli rol oynar. 3. G-proteinine Bağlı Reseptörlerden (GPCR) Sinyal İletimi Bu proteinler hücre membranını 7 kez geçen, yılanvari bir yapı içerirler. Sinyal iletimi için RTK lara oranla farklı bir stratejileri vardır ve heterotimerik G proteini kompleksindeki Gα ve Gβγ grubu proteinlerini kullanırlar. Bu sistemin klasik tanımında, uygun bir agonist stimülasyonu sonucu heterotrimerik G proteini α altünitesi üzerindeki GDP, GTP ile değiştirilerek α altünitesi bd dan ayrılır. İlk basamaklardaki farklılığa rağmen DDKH nde RTK veya GPCR aracılı sinyal iletimindeki alt akış sinyalcileri aynıdır (19). Genellikle Ras ve MAPK ailesini aktive eden GPCR ye Gi ve Gq eşlik eder. Gα proteinlerin onkojen gibi davrandıkları ve hem Gα, hem de Gβγ nın proliferasyon sinyali iletiminde rol oynadığı gösterilmiştir (20). DDKH proliferasyonunda rolü en iyi bilinen GPCR ün anjiotensin II (ANGII) reseptörü olduğu söylenebilir. Daha az çalışılmış olan reseptörler arasında endotelin-1, lizofosfatidik asit ve trombin reseptörü sayılabilir. Bu reseptörlerin aktivasyonu da RTK da olduğu gibi PLC, PKC, PI3K fosforilasyonu, reseptör-olmayan kinazlardan Src, Pyk2 ve FAK (fokal adezyon kinazı) aktivasyonuna (21) ve paksilin gibi sinyal molekülleri için bağlanma platformu oluşturan proteinlerin olaya katılmasına neden olur (22). DDKH nde hem GPCR hem de RTK üzerinden proliferasyon sinyali iletiminde Src önemli rol oynar. GPCR sözkonusu olduğunda Pyk2 veya Src gibi protein tirozin kinazlar Ras ın direkt aktivasyonunu sağlarlar (23). Src inhibisyonun ANGII ile uyarılan Ras ve PLC aktivasyonuna engel olduğu bilinmektedir. DDKH nde GPCR uyarımını takiben RTK fosforilasyonu olduğu da gözlenmiştir. Bu da her iki sistemin aynı anda olaya katılmasını sağlayarak proliferasyon sinyalinin kuvvetlendirilmesini ve başarıyla iletilmesini sağladığı gibi aynı zamanda karşı kontrol mekanizmalarını da aktive etmeye yarayan bir mekanizma olarak düşünülmektedir. Örneğin ANGII uyarımı sonrasında aort düz kasında PDGFR, IGFR (15) ve EGFR (24) fosforilasyonu olmaktadır. GPCR aktivasyonuyla indüklenen RTK fosforilasyonunu açıklamada ileri sürülen 2 temel mekanizma vardır. Birinci mekanizmada GPCR aktivasyonunu takiben Src aktive olur ve RTK yı fosforile ederek onun aktivasyonunu sağlar. Bu mekanizmayı destekleyen çalışmalarda Src inhibitörleri ANGII ile uyarılan PDGFR ve EGFR fosforilasyonunu engellemişlerdir (25). İkinci mekanizmada ise GPCR uyarımı matriks metaloproteazlarının (MMP) aktivasyonuna yol açar. Aktif MMP membrana heparinle bağlı bulunan GF ünü bulunduğu yerden koparıp serbest hale getirir. Serbest GF kendi RTK ını aktive eder (26). Bu mekanizma henüz DDKH için gösterilmemekle birlikte epitel yapıdaki hücrelerde var olduğu bilinmektedir. 4. Integrin Üzerınden Sinyal İletimi İntegrinler hücre membranında alfa ve beta alt ünitelerinden oluşan adezyon reseptörleridir. İntegrin ailesinin üyeleri hücre dışı matriksin hücreler üzerindeki etkilerini düzenler. Integrinler üzerinden iki tip sinyal iletimi gerçekleşir. Birinci tipte direkt iletim olur. İkinci tipte ise bir büyüme faktörü ile aktive edilen sinyaller integrin aracılı yol ile modüle edilir. İntegrinler üzerinden sinyal iletimi de RTKda görülen iletime benzer. Buna karşılık integrinlerin intrensek kinaz aktivitesi olmadığından sinyal iletimi tamamen reseptör-olmayan tirozin kinazlardan FAK ve Src aktivasyonuna bağımlıdır (27). İntegrinin uygun agonistle bağlanması FAK ın integrinle eşleşmesine ve otofosforilasyonuna neden olur. Bunu takiben FAK üzerindeki fosforile-tirozinler Src için bağlanma yeri sağlayarak iki molekül arasında interaksiyonu

5 ASLIHAN AYDEMİR KÖKSOY 301 ve Src aktivasyonunu sağlar. İntegrinle sinyal iletiminde FAK üzerinde 6 dan fazla tirozin fosforilasyonu olur; bu tirozinler tyr397, tyr407, tyr576, tyr577, tyr861, tyr925 olarak belirlenmiştir. Tyr397 Src SH2 bağlama bölgesidir (28). Sayılan diğer tirozinlerin Src tarafından fosforile edildiği de düşünülmektedir. İntegrin sinyal iletiminde önemli rol oynayan ve FAK ile etkileşen başka bir enzim de PI3K dır (29). Bu enzim de Src gibi, FAK üzerindeki fosforile olan tirozinlere bağlanır ve FAK tarafından aktive edilir. Bir kere fosforile olduktan sonra FAK üzerindeki tirozinler, SH2 grubu taşıyan pek çok protein için bağlanma yeri haline gelir (30). İntegrinlere bağlanan agonistin niteliğine göre FAK aktivasyonunun bazı büyüme faktörü reseptörlerinin aktivasyonuna veya sinyal modulasyonuna yol açtığı gözlenmiştir (31). DDKH de proliferasyon sinyali iletimi RTK, integrin veya GPCR lerin birbirlerinin aktivasyonlarını modifiye ettikleri, ortak alt-akış sinyalcilerin kullanıldığı karmaşık ama incelikle düzenlenmiş bir sistemdir. 5. Proliferasyon Sinyali Alt-akış Elemanları a. Src Aktivasyonu: Sekiz elemanı olan Src protein tirozin kinazlar ailesinden yaygın olarak bulunan Src, Fyn ve Yes DDKH nde de eksprese edilmektedirler. Src tirozin kinazlar kda büyüklügünde ve bazı özel bölümlerden oluşmuş proteinlerdir. Proteinin N ucundan C ucuna doğru olan yapısı: SH4 bölgesi, bir özel amino asit dizisini takiben gelen SH3, SH2, ara amino asit dizilimi ve kinaz bölgesi şeklindedir (32) (Şekil 3). Src kinazların SH4 bölgesindeki miristollenme yeri membrana mevzilenmelerini sağlar. SH3 ve SH2 bölgeleriyle efektör proteinler arasındaki etkileşimdan yukarıda bahsedilmiştir. Her iki bölgeyi de kullanarak Src ile etkileşen proteinlere örnek olarak p130cas ve Sin gibi yüksek oranda tirozin fosforilasyonu gösteren proteinler sayılabilir. Yukarıda ve burada sayılan efektörlerin Src ile etkileşimleri proteinlerin Şekil 3: Src yapısı ve etkileşim bölgeleri lokalizasyonları, afiniteleri ve o andaki fosforilasyon durumları gibi değişen faktörlere bağlıdır. Proteinin C ucuna yakın bulunan Tyr416 ve Tyr527 nin fosforilasyonu kinaz aktivitesini kontrol etme açısından önemlidir. Dinlenimde inaktif halde bulunan enzimin SH2 ve SH3 bölgelerine ligand bağlanması veya Tyr527 nin defosforilasyonu, enzimi inhibisyon konformasyonundan çıkararak Tyr416 nın fosforile edilebileceği aktif konformasyona sokar. Tyr416 fosforilasyonu aktivasyon için kesinlikle gereklidir. Proteinin kinaz bölgesinin Src ailesine has, korunmuş bir dizilimi vardır (33). Yukarıda belirtildiği şekilde Src nin DDKH proliferasyon sinyali iletimindeki yeri önemlidir. Ayrıca aynı molekül ailelerinin sinyal sırasındaki kombinasyonları moleküle, sinyal sistemine, dokuya ve uyarımın zaman ve yoğunluğuna göre hücrelerde pek çok değişik sonuca neden olabilmektedir. Bunun yanında, yapılan gen iptali (knockout) çalışmalarının gösterdiği sonuç, Src ailesindeki bireylerin birbirlerinin görevini üstlenecek şekilde davranabilmeleridir (34). Src ın aktive olan GFR ile (örn. EGFR) etkileşimi sırasında gerçekleşen karşılıklı fosforilasyon reaksiyonları hem Src yi hem de GFR ünü daha da aktif hale getirir (35). Aynı zamanda sinyal molekülleri için bağlanma yerlerinin meydana gelmesini de sağlar. Birçok tümör dokusunda Src ve EGFR nin fazlaca ekprese edildiği bilinmektedir. Fibroblastlarda Src ekspresyonunun artması EGFR nin mitojenik ve tümörojenik etkisini potansiye eder(36). Src aktivasyonunun GF ile uyarılan DNA sentezi ve proliferasyon için gerekliliği gösterilmiştir (37). Src nin MAPK42/44 aktivasyonunda rol oynaması ve Src inhibitörlerinin GFR ve GPCR uyarımı sırasında gözlenmesi beklenen MAPK42/44 aktivasyonunu engellemeleri de proliferasyon sinyali iletiminde Src nin önemini bir kez daha vurgulamaktadır (38). b. EGFR transaktivasyonu: Transaktivasyon, bir reseptör ailesinden sinyal iletimi sırasında başka reseptör ailelerinin aktive olması fenomenidir. DDKH nde proliferasyonu inceleyen çalışmalarda sinyal iletimi sırasında 180kDa bir proteinin sıklıkla aktive olması ve bu proteinin EGFR olarak belirlenmesi, EGFR ın sadece EGF siyal iletimi için bir ana basamak olmakla kalmayıp diğer membran reseptörlerinin (örn. PDGF, endotelin-1, anjiotensin II ve trombin re-

6 302 DAMAR DÜZ KASI PROLİFERASYONUNDA SİNYAL İLETİMİ septörleri) aktivasyonunu takiben, hücre-içi kinaz ailelerinin aktivasyonunun öncesinde yer alan bir ara sinyal basamağı olarak da rol oynadığını göstermiştir (39). Aslında bu gözlem diğer bazı GFR (örn. PDGFR) için de geçerlidir (20). Transaktivasyonu açıklayabilmek amacıyla pek de benimsenmeyen bir hipotez olarak öne sürülen büyüme faktörlerinin birbirlerinin reseptörlerine bağlanabilecekleri fikri Src inhibitörleriyle yapılan çalışmalardan sonra oldukça zayıflamıştır. Öyle ki EGFR transaktivasyonunda EGFR den önce Src aktivasyonunun olması ve Src inhibitörlerinin EGFR aktivasyonunu engellemesi Src nin buradaki rolünü netleştirmiştir. Src nin transaktivasyondaki rölünün; 1- GFR lerini direkt olarak fosforile etmek ve/veya 2- MMP aktivasyonu yolu ile membrana bağlı bulunan büyüme faktörlerinin serbestleşip kendi reseptörlerine bağlanmalarını sağlamak olabileceği geçerlik kazanmaktadır (40). Birinci mekanizmada aktif Src ile EGFR arasında oluşan fiziksel kompleks EGFR üzerindeki Tyr845 ve Tyr1101 ın fosforilasyonuna, EGFR hiperaktivasyonuna ve takiben Ras aktivasyonu ve diğer reseptör substratlarının fosforilasyonuna neden olur (41). İkinci mekanizma ise henüz DDKH için gösterilememiş bir mekanizma olmakla birlikte MMP aktivasyonundan lokal olarak artan (Ca 2+ ) i sorumlu tutulmaktadır(26). c. Ras, MAPK Aktivasyonu: GPCR veya RTK aktivasyonu sonrasında reseptörle Ras arasındaki köprüyü sağlayan Sos gibi guanin nükleotid değiştirici faktörler (GEF) ve guanin nukleotid serbestleştirici faktörler (GRF) Ras aktivasyonunda rol oynar. Küçük G proteinlerinden Ras ın GDP bağlı formdan ve GTP bağlı aktif forma dönmesi hücre proliferasyon ve diferansiyasyonu için önemli olan efektörlerin aktivasyonunu sağlar. Alternatif olarak yükselen hücre-içi kalsiyum da kalmoduline bağlanarak Ras GTPase ı inhibe etmek yoluyla Ras aktivasyonunu sağlayabilir. Ras ın iki ana efektörü olan Raf ve Rac sırasıyla MAPK aktivasyonu ve hücre iskeletinin regülasyununda görev alırlar. Proliferasyonda hücre iskeletinin rolüne aşağıda değinilecektir. Ras-GTP nin küçük G proteini olan Raf (MEKK) ile bağlanması Raf ın N ucunda bulunan serin/treonin kinazın aktivasyonuna ve kompleksin membranda lokalizasyonuna neden olur. Bunu MAPK ailesi bireylerinin aktivasyonu takip eder (42) (Şekil 4). MAPK42/44 ün aktive olması treonin202 ve tirozin204 ün eş zamanlı olarak fosforilasyonun gerektirir. MAPK42/44(ERK1 ve ERK2) içinde JNK, p38mapk, BMK nin de bulunduğu geniş bir aileye aittir. Bu proteinler birbirinden ayrı ama birbiriyle ilişkili modüller halinde fonksiyon görürler. Bu ailede MAPK42/44 haricindeki diğer kinaz yolları stresle ilintili yollar olarak tanımlanmıştır. Hücrede stress oluşturan ısı şoku, osmolarite değişimleri ve DNA hasarına hemen her zaman JNK ve p38 aktivasyonu eşlik eder (43). Proliferasyon sinyali iletiminin olmazsa olmaz elemanı ise MAPK42/44 tür (44). Proliferasyon sinyali iletiminde MAPK42/44 ve p38mapk arasında bir negatif regülatör etkileşim olduğu bildirilmiştir (45). Aktive olduktan sonra bu kinazların hücre çekirdeğine geçtikleri ve burada bazı transkripsiyon faktörlerini fosforilasyonla aktive ettikleri bilinmektedir (46). MAPK42/44 ün Elk-1 ve TCF yi fosforile etmesi c-fos ekpresyonunda artışa neden olurken, JNK ile oluşan ATF-2 ve Jun fosforilasyonu c-jun ekspresyonunda artışa neden olur (47). Jun ve fos proteinleri DNA bağlayan proteinlerdir ve heterodimerleşerek AP-1 komplekslerini yaparlar. AP-1 kompleksi hızlı-erken gen ekspresyonunun güçlü, dizilime spesifik aktivatörüdür. Bu şekilde membrandaki reseptörlerin aktivasyon durumu çekirdekteki genetik düzenlemeye yansıtılır. DDKH proliferasyonunda MAPK42/44 ün vazge- Şekil 4: MAPK ailesinin aktivasyonu

7 ASLIHAN AYDEMİR KÖKSOY 303 çilmez bir eleman olması onun hemen bütün proliferasyon sinyallerinin iletiminde aktive olmasını gerektirir (48). İnhibisyonunda ise apopitoz ve DNA sentezinde duraklama gözlenir (49). MAPK42/44 aktivasyonu için bu proteinde bulunan treonin-glutamik asit-tirozin dizilimindeki tirozin ve treoninin eş zamanlı olarak fosforilasyonu ve bu fosforilasyonun en az 15 dakika kadar kalıcı olması gerekmektedir (50). Yukarıda anlatılanlara ek olarak MAP42/44 aktivasyonu protein sentezini de (Elf-1 ve 4EBP aktivasyonu ile) aktive eder. MAPK aktivasyonunun ve dolayısıyla proliferasyonun ince ayarı veya önlenmesinde ise MAPK fosfatazları rol oynamaktadır. d. Aktin Ağı ve Hücre İskeleti: Hücre membranı ile çekirdek arasındaki fiziksel teması sağlayan tek yapı hücre iskeleti olduğu için, hücredeki şekil değişiklikleri ve gen ekspresyonu arasındaki ilşkinin hücre iskeletiyle ilgili olabileceği çok eskiden beri düşünülmüştür. Gerçekten de aralarında tirozin kinaz, GTPase ve lipid kinazların bulunduğu birçok enzimle hücre iskeleti arasında karşılıklı bir etkileşim olduğu; hücre iskeletiyle aynı yerleşimli bu enzimlerin iskeletteki değişimler sonucu modüle edildiği (51) ve bu enzimlerin de iskeletin yeniden organizasyonunu sağladığı gösterilmektedir (52). Aktin ağını membrandaki proteinlerle birleştiren spektrin ve spektrin bağlayan proteinlerin enzim modüle etme yetenekleri olduğu gibi kendileri bu enzimlerle fosforile de olmaktadırlar (53) Aktin iskeletindeki yeniden düzenlenme özellikle integrinlerin uyardığı proliferasyonda önem kazanır. Bunun yanında Src substratı olan Rho-GAP ve FAK da bu olayda rol alabilmektedir (54). Src tarafından indüklenen Rho-Gap ile Ras-GAP bağlanması Ras ve Rac aktivasyonuna ve aktin iskeletinin yıkımına yol açar (55). Src bunu dırekt olarak direkt olarak yani, aktin polimerizasyonunu modüle eden kortaktin proteinini fosforile ederek de yapabilir. Aktin iskeletinde yıkımın hücre içi kalsiyum artışına yol açtığı, bunun ise uyarımın şiddetine bağlı olarak apoptoz veya proliferasyonu indükleyebileceği bilinmektedir (56). Bitiriş: Sonuç olarak DDKH nde proliferasyon sinyali iletimi birbirinden bağımsız olarak incelenemeyecek birçok sinyal sisteminin bir toplamı olarak ortaya çıkmaktadır. Güncel olan hipotez büyüme faktörleri ve hücre-dışı matriks proteinleri tarafından uyarılan sinyallerin hücre proliferasyonuna yol açtığı ve bununla birliktelik gösteren hastalıklar olan ateroskleroz ve by-pass stenozunda bu mekanizmanın görev yaptığıdır. Buradaki bilinmeyenler DDKH de fenotip değişimlerinin nasıl ve neden ortaya çıktığı ve normalde sıkı kontrol altında bulunan proliferasyonun kontrolsüz hale dönmesindeki anahtar molekül veya mekanizmaların ne olduğudur. Bu konuda proteinler arası interaksiyonları inceleyen teknolojik sistemlerin gelişmesine ek olarak yeni paradigmaların ortaya çıkması da umut vericidir. Hücre içindeki sistemleri eş zamanlı olarak analiz ve görüntüleme imkanına kavuşabildiğimizde belki bu küçük hücrenin sonsuz dünyasını biraz daha anlayabileceğiz.

8 304 DAMAR DÜZ KASI PROLİFERASYONUNDA SİNYAL İLETİMİ KAYNAKLAR 1. Lees-Miller JP, Heeley DH, Smillie LB, Kay CM: Isolation and characterization of an abundant and novel 22-kDa protein (SM22) from chicken gizzard smooth muscle. J Biol Chem 1987, 262: Price RJ, Owens GK, Skalak TC: Immunohistochemical identification of arteriolar development using markers of smooth muscle differentiation. Evidence that capillary arterialization proceeds from terminal arterioles. Circ Res 1994, 75: Regan CP, Adam PJ, Madsen CS, Owens GK: Molecular mechanisms of decreased smooth muscle differentiation marker expression after vascular injury. J Clin Invest 2000, 106: Thyberg J, Blomgren K, Hedin U, Dryjski M: Phenotypic modulation of smooth muscle cells during the formation of neointimal thickenings in the rat carotid artery after balloon injury: an electron-microscopic and stereological study. Cell Tissue Res 1995, 281: Seidel CL: Cellular heterogeneity of the vascular tunica media. Implications for vessel wall repair. Arterioscler Thromb Vasc Biol 1997, 17: Seidel CL, Helgason T, Allen JC, Wilson C: Migratory abilities of different vascular cells from the tunica media of canine vessels. Am J Physiol 1997, 272:C Aikawa M, Rabkin E, Voglic SJ, Shing H, Nagai R, Schoen FJ, Libby P: Lipid lowering promotes accumulation of mature smooth muscle cells expressing smooth muscle myosin heavy chain isoforms in rabbit atheroma. Circ Res 1998, 83: Delafontaine P: Growth factors and vascular smooth muscle cell growth responses. Eur Heart J 1998, 19 Suppl G:G Lee RM, Owens GK, Scott-Burden T, Head RJ, Mulvany MJ, Schiffrin EL: Pathophysiology of smooth muscle in hypertension. Can J Physiol Pharmacol 1995, 73: Schwartz SM, Majesky MW, Murry CE: The intima: development and monoclonal responses to injury. Atherosclerosis 1995, 118 Suppl:S van der Geer P, Hunter T, Lindberg, RA: Receptor protein-tyrosine kinases and their signal transduction pathways. Ann Rev Cell Biol 1994, Post G, Brown JH: Protein-coupled receptors and signaling pathways regulating growth responses. FA- SEB J 1996, Calderwood D, Shattil, SJ., Ginsberg, MH.: Integrins and actin filaments: Reciprocal regulation of cell adhesion and signaling. J Biol Chem 2000, 275: Lemmon MA, Bu Z, Ladbury JE, Zhou M, Pinchasi D, Lax I, Engelman DM, Schlessinger J: Two EGF molecules contribute additively to stabilization of the EGFR dimer. Embo J 1997, 16: Heeneman S, Haendeler J, Saito Y, Ishida M, Berk BC: Angiotensin II induces transactivation of two different populations of the platelet-derived growth factor beta receptor. Key role for the p66 adaptor protein Shc. J Biol Chem 2000, 275: Heldin C: Dimerization of cell surface receptors in transduction. Cell 1995, 80: Songyang Z, Shoelson SE, Chaudhuri M, Gish G, Pawson T, Haser WG, King F, Roberts T, Ratnofsky S, Lechleider RJ, et al.: SH2 domains recognize specific phosphopeptide sequences. Cell 1993, 72: Sudol M: From src homology domains to other signaling modules: proposal of the protein recognition code. Oncogene 1998, 17: Gutkind J: The pathways connecting G protein-coupled receptors to the nucleus through divergent mitogen-activated protein kinase cascades. J Biol Chem 1998, 273: Pierce KL, Luttrell LM, Lefkowitz RJ: New mechanisms in heptahelical receptor signaling to mitogen activated protein kinase cascades. Oncogene 2001, 20: Berk BC, Haendeler J, Sottile J: Angiotensin II, atherosclerosis, and aortic aneurysms. J Clin Invest 2000, 105: Turner CE: Paxillin and focal adhesion signalling. Nat Cell Biol 2000, 2:E Andreev J, Galisteo ML, Kranenburg O, Logan S, Chiu ES, Okigaki M, Cary L, Moolenaar W, Schlessinger J: Src and Pyk2 mediate G protein-coupled receptor activation of EGFR but are not required for coupling to the MAP Kinase signaling cascade. J Biol Chem 2001, 27: Saito Y, Berk BC: Transactivation: a Novel Signaling Pathway from Angiotensin II to Tyrosine Kinase Receptors. J Mol Cell Cardiol 2001, 33: Bokemeyer D, Schmitz U, Kramer HJ: Angiotensin II-induced growth of vascular smooth muscle cells requires an Src-dependent activation of the epidermal growth factor receptor. Kidney Int 2000, 58: Roudabush FL, Pierce KL, Maudsley S, Khan KD, Luttrell LM: Transactivation of the EGF receptor mediates IGF-1-stimulated shc phosphorylation and ERK1/2 activation in COS-7 cells. J Biol Chem 2000, 275:

9 ASLIHAN AYDEMİR KÖKSOY Cary L, Guan, J: Focal adhesion kinase in integrin mediated signaling. Frontiers in Bioscience 1999, 4: Hanks SK, Polte TR: Signaling through focal adhesion kinase. Bioessays 1997, 19: King WG, Mattaliano MD, Chan TO, Tsichlis PN, Brugge JS: Phosphatidylinositol 3-kinase is required for integrin-stimulated AKT and Raf-1/mitogen-activated protein kinase pathway activation. Mol Cell Biol 1997, 17: Perez Salazar E, Rozengurt E: Src family kinases are required for integrin-mediated but not for G proteincoupled receptor stimulation of FAK autophosphorylation at Tyr J Biol Chem 2001, 15: Morla AO, Mogford JE: Control of smooth muscle cell proliferation and phenotype by integrin signaling through focal adhesion kinase. Biochem Biophys Res Commun 2000, 272: DeMali KA, Godwin SL, Soltoff SP, Kazlauskas A: Multiple roles for Src in a PDGF-stimulated cell. Exp Cell Res 1999, 253: Xu W, Doshi A, Lei M, Eck MJ, Harrison SC: Crystal structures of c-src reveal features of its autoinhibitory mechanism. Mol Cell 1999, 3: Lowell C, Soriano, P.: Knockouts of the src family kinases: Stiff bones, wimpy T cells and bad memories. Genes Dev 1996, 10: Alonso G, Koegl M, Mazurenko N, Courtneidge SA: Sequence requirements for binding of Src family tyrosine kinases to activated growth factor receptors. J Biol Chem 1995, 270: Biscardi JS, Tice DA, Parsons SJ: c-src, receptor tyrosine kinases, and human cancer. Adv Cancer Res 1999, 76: Aydemir-Koksoy A, Abramowitz J, Allen JC: Ouabain-induced signaling and vascular smooth muscle cell proliferation. J Biol Chem 2001, 276: Touyz RM, Wu XH, He G, Park JB, Chen X, Vacher J, Rajapurohitam V, Schiffrin EL: Role of c-src in the regulation of vascular contraction and Ca2+ signaling by angiotensin II in human vascular smooth muscle cells. J Hypertens 2001, 19: Gschwind A, Zwick E, Prenzel N, Leserer M, Ullrich A: Cell communication networks: epidermal growth factor receptor transactivation as the paradigm for interreceptor signal transmission. Oncogene 2001, 20: Leserer M, Gschwind A, Ullrich A: Epidermal growth factor receptor signal transactivation. IUBMB Life 2000, 49: Tice DA, Biscardi JS, Nickles AL, Parsons SJ: Mechanism of biological synergy between cellular Src and epidermal growth factor receptor. Proc Natl Acad Sci U S A 1999, 96: Naor Z, Benard O, Seger R: Activation of MAPK cascades by G-protein-coupled receptors: the case of gonadotropin-releasing hormone receptor. Trends Endocrinol Metab 2000, 11: Chevalier D, Thorin E, Allen BG: Simultaneous measurement of ERK, p38, and JNK MAP kinase cascades in vascular smooth muscle cells. J Pharmacol Toxicol Methods 2000, 44: Day FL, Rafty LA, Chesterman CN, Khachigian LM: Angiotensin II (ATII)-inducible platelet-derived growth factor A-chain gene expression is p42/44 extracellular signal-regulated kinase-1/2 and Egr-1- dependent and mediated via the ATII type 1 but not type 2 receptor. Induction by ATII antagonized by nitric oxide. J Biol Chem 1999, 274: Kusuhara M, Takahashi E, Peterson TE, Abe J, Ishida M, Han J, Ulevitch R, Berk BC: p38 Kinase is a negative regulator of angiotensin II signal transduction in vascular smooth muscle cells: effects on Na+/H+ exchange and ERK1/2. Circ Res 1998, 83: Lenormand P, Sardet C, Pages G, L Allemain G, Brunet A, Pouyssegur J: Growth factors induce nuclear translocation of MAP kinases (p42mapk and p44mapk) but not of their activator MAP kinase kinase (p45mapkk) in fibroblasts. J Cell Biol 1993, 122: Davis RJ: Transcriptional regulation by MAP kinases. Mol Reprod Dev 1995, 42: Bornfeldt K, Campbell, JS.,Koyama, H., Argast, GM., Leslie, CC., Raines, EW., Krebs, EG., Ross, R.: The mitogen activated protein kinase pathway can mediate growth inhibition or proliferation in smooth muscle cells. J Clin Invest 1997, 100: Takahashi E, Berk BC: MAP kinases and vascular smooth muscle function. Acta Physiol Scand 1998, 164: Orsini M, Krymskaya, VP., Eszterhas, AJ., Benovic, JL., Panettieri, RA., Penn, RB: MAPK superfamily activation in human airway smooth muscle: mitogenesis requires pro longed p42/p44 activation. Am J Physiol 1999, 277:L479-L Roychowdhury S, Wang N, Rasenick MM: G protein binding and G protein activation by nucleotide transfer involve distinct domains on tubulin: regulation of signal transduction by cytoskeletal elements. Biochemistry 1993, 32: Polte TR, Hanks SK: Complexes of focal adhesion kinase (FAK) and Crk-associated substrate (p130(cas)) are elevated in cytoskeleton-associated fractions following adhesion and Src transformation. Requirements for Src kinase activity and FAK proline-rich motifs. J Biol Chem 1997, 272:

10 306 DAMAR DÜZ KASI PROLİFERASYONUNDA SİNYAL İLETİMİ 53. Bennet V: Spectrin based membrane cytoskeleton: A Multipotential adaptor between plasma membrane and cytoplasm. Physiol Rev 1990, 70: Roof RW, Haskell MD, Dukes BD, Sherman N, Kinter M, Parsons SJ: Phosphotyrosine (p-tyr)-dependent and -independent mechanisms of p190 Rho- GAP-p120 RasGAP interaction: Tyr 1105 of p190, a substrate for c- Src, is the sole p-tyr mediator of complex formation. Mol Cell Biol 1998, 18: Fincham VJ, Chudleigh. A., Frame. M. C..: Regulation of p190 Rho-GAP by v-src ls linked to cytoskeletal disruption during transformation. J Cell Sci 1999, 112: Huang C, Ni, Y., Wang. T., Gao, Y., Haudenschild. C. C., and Zhan, X.: Downregulation of the filamentous actin cross-linking activity of cortactin by Srcmediated tyrosine phosphorylatlon. J Biol Chem 1991, 272: