helena BioSciences Europe Kullanım Talimatları SAS-MX YÜKSEK RESOLÜSYON Katalog No:

Transkript

1 helena BioSciences Europe Kullanım Talimatları SAS-MX YÜKSEK RESOLÜSYON Katalog No:

2 KULLANIM AMACI SAS-1 Plus Yüksek Resolüsyon Kit agaroz jel elektroforezi tarafından serum veya plazma proteinlerini ayırmayı amaçlamıştır. Serum, farklı patolojik koşullarda ve konsantrasyonda belirli varyasyona bağlı olan fonksiyonların belirli bir dizisi 100 den fazla özel protein içerir 1. Tiselius tarafından sınır elektroforez hareketinin girişi ve bölge elektroforezinin sonraki kullanımı için, serum proteinleri kendi yükleri bazında belirli bir ph da fraksiyonlara ayrılmıştır. Yüksek Resolüsyon kiti ayrı fraksiyonlar içinde klasik 5 bant paternine doğru serum proteinlerini ayırır, böylece protein paternlerinin teşhis kullanışlılığı artar. 3-5 Yaklaşık 15 serum proteinini kapsamlı olarak incelenmiştir çünkü kolayca ölçülebilir. 6-9 SAS-1 Plus Yüksek Resolüsyon kiti bufferlanmış bir agaroz jeldeki yüke göre serum/ plazma proteinlerini ayırır. Protein bantları, sonra görüntüleme ve kantitatif yorum için boyanmış ve sabitlenmiştir. UYARILAR VE ÖNLEMLER Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun. COMPOSITION BİLEŞENLER 1. SAS-MX High Resolution Jel Koruyucu olarak sodyum azid ve tiyomersal ile bir Barbital buffer agaroz içerir. Paket içindeki jel kullanım için hazırdır. 2- Konsantre Tris / Barbital Buffer Koruyucu olarak sodyum azid ile konsantre Tris/barbital buffer içerir. Şişe içeriğini 1 litre saf su ile dilüe edin ve iyice karıştırın. 3. Konsantre Yüksek Resolüsyon Boyası Konsantre yüksek resolüsyon boya 5 metanol, 5 su ve 1 glasiyal asetik asit içerir. Şişe içeriği 700ml saf su ile dilüe edilir. Kullanım öncesi karıştırılır. 4. Diğer Kit Bileşenleri Her kit kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda Numune Aplikasyon Kalıbı, Fitil ve kurutma kağıdı A ve C içerir.

3 SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ 1- SAS-MX Yüksek Resolüsyon jel Jeller derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin bozulmasını belirtebilir,1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3)bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun görülür kontaminasyonunu belirtir. 2 - Tris / Barbital Buffer Konsantre buffer derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solüsyonu derecede 2 ay stabildir. Dilüe bufferın bulanık ve zayıf performansı, bozulduğunun göstergesidir. 3-Yüksek Resolüsyon Boyası Konsantre boya derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solüsyonu derecede 6 ay stabildir. Zayıf boyama performansı, boya solüsyonunun bozulduğunun göstergesidir. SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER Katalog No.4063 SAS-MX Oda Katalog No.1525 EPS600 Güç kaynağı Katalog No.3039 Chamber Cooling Device Katalog No High Resolution Protein Marker C hava üfleme kapasiteli kurutma fırını Boya arındırıcı solüsyon: 500 ml saf su ve 500 ml metanolle karıştırın. 100 ml glisial asetik asit ekleyin. Sıkı kapatılmış şişede saklanır. Saf su NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI Tercih edilen numune taze toplanmış plazma veya serumdur. Numuneler maksimum 48 saate kadar 2-6 derecede kapalı olarak saklanmalıdır. Plazma kullanımı beta ve gama fraksiyonları arasında bir fibrinojen bandına sebep olur. Eski numunelerin kullanımı transferrin bölgesinde C3 bandına göçe neden olacaktır. Serum ve plazma numuneleri buffer (1 parça numune +1 parça buffer) ile 1+1 oranında dilüe edilir. İdrar ve CSF numuneleri aşağıda uygun konsantrasyon adımında kullanılabilir:

4 (Total protein=toplam protein, Concetration Factor=Konsantrasyon faktörü) Konsantrasyon ardından, ürine ve CSF numuneleri direk olarak jele uygulanır. ADIM-ADIM PROSEDÜR NOT: Oda soğutma cihazının kullanım öncesi en az 60 dakika C de saklanmış olduğundan emin olun. 1. Jeli paketinden çıkarın ve kağıt havlu üstüne koyun. Ambalajını çıkarın ve kurutucu C ile jel yüzeyini kurutun ve kurutucuyu atın. 2. Jel köşesindeki oklarla numune aplikasyon kalıbını hizalayın ve kalıbın başına kurutucu A yı koyun ve iyi temas sağlaması için yarığın içine parmağınızı sürtün. Kurutucuları alın ve adım 5'te kullanmak için saklayın. 3.Her yarığa 2μl numune uygulayın ve 5 dakika absorbe olması için bırakın (Koyu bantlar tercih edilirse, 4μl bir numune uygulanır.) 4. Numune emiliyorken, SAS-MX odasının her dış bölümüne 150ml buffer dökün. Odanın merkezi çukur içine soğutma cihazı yerleştirin ve bufferın birkaç damlası ile yüzeyi ıslatın. 5. Numune emilimi ardından, adım 2 den kalan kurutucu A ile kalıbı kurutun ve hem kurutucuyu hem de kalıbı alın. 6. Jeli oda içine agoraz tarafı aşağı olacak şekilde yerleştirin. Odanın başına karşılık gelen pozisyonlar ile pozitif (+) ve negatif (-) tarafları hizalayın. Jel altında hava kabarcığı oluşturmamaya dikkat edin kalın fitilleri yapmak için 2 sette 3 fitilleri yerleştirerek jelin her tarafı için bir fitil hazırlayın. Aşırı bufferı yavaşça sıkarak buffera her fitili daldırın ve soğutma cihazının kenarına paralel olarak jele her bir fitili takın. Fitilin bir kenarının buffera batırıldığından emin olun ve iyi temas sağlamak için jelin fitil kısmına doğru parmağınızı sürtün. 8.Elektroforez jel: 250 volt, 25 dakika. 9. Elektroforez ardından, 15 dakikada boyama solüsyonuna jeli daldırın saniye boyunca boya arındırıcı solüsyonunda jeli boyadan arındırın C de jeli kurutun. 12. Boya arındırıcı solüsyon 2 x 30 saniye yıkanana kadar jeli boyadan arındırın. 13. Jeli kurutun. Alternatif Boyama Prosedürleri İki alternatif boyama protokolu kullanıcının istenen boyama gereksinimine bağlı olarak kullanılabilir. 1. Yüksek Resolüsyon Boyama için Amino Siyah Boya yer değiştirmesi (Kat. No. 3048).

5 SADECE SERUM/PLAZMA NUMUNELERİ İÇİN. Aşağıda özetlenmiş boyama protokolunu kullanın. Amino siyah boya koomassie boyadan daha hassastır, fakat daha düzgün boyama kalitesi sağlar ve bant yoğunluğunda farklılıklar daha iyi bir kantitatif değerlendirme verir. 2.Çift boyama tekniği. SADECE CSF VE ÜRİNE NUMUNELERİ İÇİN. Elektroforezden sonra tamamlanmış jel ile amido siyah boyama yapın ve sonra tamamlanmış jel ile koomassie boyama tekniği yapın. Çift boya tekniği idrar protein bantları ve CSF de oligoklonal bantların daha net görüntülenmesini sağlar. NOT: Boya ve boya arındırıcı solüsyon metanol içerdiği için SAS-4 de jeli boyamayın. SONUÇLARIN YORUMLANMASI Jelin değerlendirmesi, her laboratuarda bu yöntem için üretilen normal paternlere karşı yapılması önerilir. Belirli protein bantlarının varlığı veya yokluğu jelde görsel olarak incelenecektir. Şekil 1 de SAS-MX Yüksek Resolüsyon Prosedür kullanılarak belirlenen ana plazma proteinlerin göç paternlerini göstermektedir. Şekil 1 Yüksek Resolsüyon protein elektroforez paternleri öncelikle normal bireyler elde edilen bilinmeyen numunelerin bantlarının relatif yoğunluğu ile karşılaştırılarak yorumlanır. Anormal serum protein paternlerinde en yaygın olanlardan biri spesifik olmayan inflamatuar tepkisi olarak görülmektedir ve bu yanıt azalmış prealbumin, albümin ve transferrin ile haptoglobin ve α1 antitripsin de bir artış ile karakterizedir. Genel bir teşhis kurulmasında yararlı değil iken, tedavi için bir hastanın tepkisinin izlenmesi yararlıdır. Klinik olarak önemli varyasyonların diğer örnekleri şunlardır: 1. Transferrin bandının yüksekliği, demir düşük seviyesini gösterir.

6 2. Monoklonal proteinlerin varlığı, immun sistemde abnormalitesini gösterir. 3.Düşük haptoglobin, yüksek eritrosit turnover veya in-vitro hemoliz gösterir. 4. CRP Vvarlığı, akut enflamatuar yanıt gösterir. 5.Düşük prealbumin, albümin ve yaygın hypergammaglobulinaemia ile transferrin, kronik inflamasyon, enfeksiyon veya antijenik stimülasyon gösterir. 6.Taze numunelerde düşük C3, tamamlayıcı tüketimi gösterir. Yüksek Resolsüsyon protein elektroforezi ürin proteinin geniş bir açıklamasını elde etmek için mükemmel bir analitik araçtır 3,10. Normal ürine normalde albumin bir iz ve bazen hafif bir transferrin bant içerir. Glomerüler-tür proteinüri genellikle geniş bir α1 bölgesinde ve transferrin β1 bölgedesinde hem α1-asit glikoprotein hem de a1- antitrypsinden ve albuminin güçlü bandından oluşur. Serum patern, glomerul tarafından tutulmuş proteinlerde artış ile bu proteinlerde düşüşler gösterir. Tübüler proteinüri de ürine paterni, genellikle α2-mikroglobulin nedeniyle α2 bölgesinde çift bant, zayıf bir albümin bandından, β2-mikroglobulin nedeniyle orta-beta bölgesinde güçlü bir banttan ve bazen serbest hafif zincirlerden dolayı gama bölgesinde yaygın arka plan boyanmasından oluşur. Kronik böbrek hastalığı veya böbrek yetmezliği, hem tübüller hem de glomerul oluşan hasardan kaynaklanan karışık tip paternine yol açabilir. Belirli numunelerdeki bileşenlerin azalması veya yükselmesi veya olağandışı numune bileşenlerinin tespiti daha fazla araştırma gerektirir. Tamamlanmış SAS-MX Yüksek Resolsüyon jeli süresiz bir zaman için stabildir. BİBLİYOGRAFİ 1. Alper, C.A. Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid, N. Eng. J. Med., 1974; 291 : Tiselius, A. A New Approach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures, Trans. Faraday Soc., 1937; 33 : Laurell, C.B. Composition and Variation of the Gel Electrophoretic Fractions of Plasma, Cerebrospinal Fluid and Urine Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972; 29 (Suppl. 24) : Killingsworth, L.M. et al. Protein Analysis, Deciphering Cerebrospinal Fluid Patterns Diag. Med., 1980; March/April : Killingsworth, L.M. et al. Protein Analysis, Finding Clues to Disease in Urine Diag. Med., 1980; May/June : Killingsworth, L.M. Clinical Applications of Protein Determinations in Biological Fluids Other Than Blood Clin. Chem., 1982; 28(5) : Ritzmann, S.E and Daniels, J.C. Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization of Proteins. Qualitative and Quantitative Assays in Laboratory Medicine, Harper & Row, Inc., Hagerstown, Killingsworth, L.M. et al. Protein Analysis Diag. Med., 1980; Jan/Feb : Killingsworth, L.M. Plasma Protein Patterns in Health and Disease CRC Critical Reviews in Clinical Laboratory Sciences, August Peterson, P.A., Ervin, P.E. and Beggard, I. Differentiation of Glomerular, Tubular and Normal Proteinuria: determination of Urinary Excretion of a2-microglobulin, Albumin and Total Protein J. Clin. Invest., 1969; 48 :