Proteomiks Yaklaşımlar Uygulama Alanları ve Hizmetlerimiz. Timuçin AVŞAR Proje Geliştirme Koordinatörü

Ebat: px

Şu sayfadan göstermeyi başlat:

Download "Proteomiks Yaklaşımlar Uygulama Alanları ve Hizmetlerimiz. Timuçin AVŞAR Proje Geliştirme Koordinatörü"

Eser Özbilgin
8 yıl önce
İzleme sayısı:

1 Proteomiks Yaklaşımlar Uygulama Alanları ve Hizmetlerimiz Timuçin AVŞAR Proje Geliştirme Koordinatörü

2 Sunum Başlıkları Proteomiks Nedir? Neden Proteomiks? Nasıl çalışılır? Uygulama Alanları Proteomiks literatüründen örnekler Hizmetlerimiz

3 Proteomiks Proteom: Belli bir anda, bir hücrede (materyalde) ifadelenen proteinlerin tamamı Amaçlar: Protein fonksiyonu Protein miktarı Protein modifikasyonu PTM Protein lokalizasyonu Protein Protein ilişkileri

4 Santral Dogma: Benzerlik DNA Bilgi ~ gen %100 RNA Mesaj ~ mrna %50 - % 60 Protein AKTÖR protein %20 - %30

5 Omiks... Proteom, genomun son ürünü Dinamik, değişen miktar ve içerik Az ifadelenen proteinlerin çalışılması Transkriptomik, yetersiz ve zor! Genomik, fonksiyonel bilgi az!

6 İnsan Proteinlerinin Sınıflandırması

7 Nasıl Yapılır?

8 Nasıl Yapılır? - Özet

9 Nasıl Yapılır?

10 Kütle Spektrometresi

11 Bio- Rad Imaging Por/olio GS- 800 Calibrated Densitometer CCD scanner Colorimetric samples Reflectance and transmivance modes 30 x 40 cm scanning area ChemiDoc MP Imaging System CCD camera CCD based UV/visible, mulkplex fluorescence, colorimetric and chemiluminescent imaging. Stain- free compakble Pharos FX / FX Plus Systems laser scanner/pmt Fluorescent and storage phosphor imaging 488 nm, 532 nm, and 635 nm laser excitakon sources GelDoc EZ CCD camera Stain-free compatible GelDoc XR+ and ChemiDoc XRS+ Imaging System CCD camera CCD based UV/visible, fluorescence, colorimetric and chemiluminescent imaging

12 ph Aralıkları 9 (ph 3-10) (ph 4-7) ( ) ( ) ( )

13 Why Imaging and Analysis? Farkı Görebiliyor musunuz?

14 Spot Analizi PDQuest Quantity One EXQuest Calibration Wizard

15 Why Imaging and Analysis? Zaman Çizelgesi Örnek hazırlanması: IPG strip rehidrasyonu: IEF run: SDS-PAGE: Jel boyama: 2-3 saat 22 saat 24 saat 19 saat 13 saat Toplam: ~ 4 gün

16 Why Imaging and Analysis? MS Prensibi Örnek + _ İyonizer Kütle Analizörü Detektör

17 Why Imaging and Analysis? Western Blot Proteinlerin moleküler ağırlıklarına göre ayrıştırılması ve tespit edilmesi Rölatif olarak protein miktarlarının tespiti Protein çorbası içerisinde hedef proteinin spesifik deteksiyonu SDS-PAGE kullanılarak proteinler ayrıştırılır Proteinler nitroselülöz membrana aktarılır.

18 SDS-PolyAcrylamide Why Imaging and Analysis? Gel Electrophoresis SDS-PAGE, Biyokimya Adli Tıp Genetik Moleküler biyoloji Elektroforetik mobilitelerine göre proteinler ayrıştırılır. polipeptit zinciri uzunluğu moleküler ağırlığı üç boyutlu yapılarına göre DNA-protein bağlanmalarına göre

19 Why Imaging and Analysis? PAGE Negatif yüklü denatüre proteinler elektrik alanı altında pozitif kutuba doğru hareket eder Küçük MW proteinler daha hızlı hareket eder Poliakrilamid jel Proteinlerin primer yapılarına göre büyüklükleri ölçülür

20 Why Imaging and Analysis? Western Blot Membran üzerindeki proteinler öncelikle jenerik proteinler ile inkübe edilir (Bloklama) Süt tozu Albumin (BSA) Hedef protein spesifik antikor uygulanır Monoklonal antikorlar Poliklonal antikorlar Antikor spesifitesi çok önemli! Primer antikor vs sekonder antikor

21 Why Imaging and Analysis? Blotlama Elektro- blot (akkf) vs Kapiler blot (pasif) Hız? Verim? Kalite? Blot kasek: Filtre kağıtları Whatman kağıdı Membran Emme pedleri Islak, yarı- ıslak, kuru

22 Why Imaging and Analysis? Antikor Rhan T et al, 2009 Nelson C. and Kennedy P et al Neurogenesis, LafayeJa, Web, 2012

23 Why Imaging and Analysis? Western Blot Son olarak, sekonder antikora bağlı enzim reaksiyonu ile görüntüleme yapılır Horse radish peroxidase (HRP) konjuge nitro-blue tetrazolium and 5-bromo-4-chloro-3'-indolyphosphate (NBT/BCIP) konjuge Radiolabel - konjuge

24 24

25 ELISA Why Imaging and Analysis? Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay Antijen-antikor ilişkisi Kantitatif Birçok hastalıkta tanı amaçlı Viral ve parazit enfeksiyonlarında Enflamatuar hastalıklarda

26 Why Imaging and Analysis? ELISA Yöntemleri

27 Why Imaging and Analysis? Örnek Çalışmalar ve Literatür Bilgileri

28 AMAÇ: Yan et al. 2004, Use Proteomics to inves;gate molecular mechanisms of aging and gender differences In heart, J. Mol. Cell.Cardiol. Nov;37 (5) 28

29 52 GBM, 13 anap. astro, 10 astro, 10 normal doku Proteom tabanlı sınıflandırma analizi Evre ye özgül protein sınıflandırması Iwadate Y et al. 2004, Molecular Classifica;on and survival predic;on in human gliomas based on proteome analyses, Cancer Research 29

30 OJervald J et al, 2010, Mul;ple sclerosis: Iden;fica;on and clinical evalua;on of novel CSF biomarkers, Journal of Proteomics 30

31 Notch signaling pathway CD4+ ackvakng pathway nöroprotekkf elemanlar! Stoop MP et al, 2011, Proteomics comparison of CSF of RR and PP- MS, PLoS ONE 31

32 Kaushal SG et al, 2011, Novel approaches to detect serum biomarkers for clinical response to Interferon- β treatment in MS, PLoS ONE 32

33 Hizmetlerimiz Proteomik yöntemlerle biyobelirteç tayini Protein tanımlanması Protein miktar tayini Kromotografik ELISA Total protein tayini Western blot 33

34 Biyobelirteç Tayini İki boyutlu jel elektroforezi yöntemi ile proteinlerin hem moleküler ağırlıkları (Mw) hem de izoelektrik (pi) noktalarına göre ayrıştırılarak eş protein spotlarının kantitatif olarak karşılaştırılmalarını sağlayan nicel bir yöntemdir. Bu yöntem ile bir özelliğin/hastalığın ya da karakterin ayırt edici proteinleri spesifik olarak tespit edilebilir. Biyobelirteç tayini servis hizmeti hakkında: Protein izolasyonu ve saflaştırılması (opsiyonel) Total protein miktarının belirlenmesi 2D-PAGE uygulaması Proteinlerin boyanması, görüntülenmesi ve analizi Biyoinformatik analiz (opsiyonel) 34

35 Protein Tanımlanması MALDI-TOF kütle spektrometresi (MS) yöntemi kullanılarak, saflaştırılmış proteinlerin ya da protein spotlarının, kütlelerinin, iyon yüklerinin ve aminoasit dizilerinin belirlenmesi esasına dayanır. Proteinleri elde etmek için SDS-PAGE, 2D-PAGE, kromotografik yöntemler vb. saflaştırma yöntemleri kullanılabilir. Bu yöntemle, elde edilen peptit ya da protein dizileri protein veri bankaları ile karşılaştırılarak en az %99 doğrulukta veri elde edilmesini sağlar. Aşamaları: Proteinlerin saflaştırılması ve temizlenmesi MALDI-TOF MS uygulaması Verilerin biyoinformatik analizi (opsiyonel) 35

36 Protein Miktar Tayini Bir proteinin ya da bir örnekteki total protein miktarını kanktakf olarak yüksek sensikvite (0.1 ng/µl) ile tespit edilmektedir. Farklı örnekler arasındaki spesifik olarak proteinlerin miktarındaki değişimlerin gösterilmesi açısından önemli bir yöntemdir. Spesifik proteinlerin ölçümlerinde kromotografik yöntemler, total protein miktarının tayininde ise Bradford yöntemi kullanılmaktadır. Sunulan Hizmetler: Kromotografik yöntemler ELISA Western Blot 36

Benzer belgeler

WESTERN BLOT. Yrd. Doç. Dr. Eda Becer. Yakın Doğu Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı

WESTERN BLOT. Yrd. Doç. Dr. Eda Becer. Yakın Doğu Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı WESTERN BLOT Yrd. Doç. Dr. Eda Becer Yakın Doğu Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı Northern Blot (RNA) James Alwine George Stark Western Blot (Protein) Eastern Blot (??) George Stark