T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ

Transkript

1 T.C. SELÇUK ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ DAPHNE OLEOIDES SUBSP. OLEOIDES VE DAPHNE SERICEA NIN FARKLI ÇÖZÜCÜLERLE ANTİOKSİDAN ÖZELLİKLERİ Tuba ARKAN YÜKSEK LİSANS Biyoloji Anabilim Dalını Haziran-2011 KONYA Her Hakkı Saklıdır

2

3

4

5

6 ÖNSÖZ Selçuk Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü Hayvan Fizyolojisi-Biyokimya araştırma laboratuarında yürütülmüş olan bu yüksek lisans tez çalışmasında Türkiyeflorası için önemli olan Daphne cinsine ait D. oleoidessubsp. oleoides ve D. sericeatürlerinin antioksidan özellikleri araştırılmıştır. Bu çalışma konusunu veren ve çalışmanın oluşmasındaki desteklerinden dolayı başta danışman Hocam Prof. Dr. Abdurrahman AKTÜMSEK e teşekkür ederim. Ayrıca bitkilerin toplanması ve teşhislerinde emeği geçendoç. Dr. Murat Aydın Şanday a teşekkürü borç bilirim. Laboratuarda numunelerin hazırlanmasında, ekstraksiyon çalışmalarındahiçbir zaman desteklerini esirgemeyenöğr.gör.dr. Gökalp Özmen GÜLER e, Arş.Gör Gökhan ZENGİN e ve doktora öğrencisi Yavuz Selim ÇAKMAK ateşekkür ederim. Ayrıca çalışmalarım süresince maddi manevi her türlü konuda yanımda olup desteğini esirgemeyen aileme sonsuz teşekkür ederim. iii

7 İÇİNDEKİLER ÖZET....i ABSTRACT.ii ÖNSÖZ...iii ŞEKİLLER DİZİN... vi ÇİZELGELER DİZİNİ viii KISALTMALAR ix 1. GİRİŞ KAYNAK ARAŞTIRMASI Serbest Radikaller Antioksidanlar Fenolik Bileşikler Antioksidan Kapasite Testleri Folin-Ciocalteu yöntemi (Toplam fenolik madde tayini) Toplam Flavonoid Tayini Total antioksidan kapasite testi (Fosfomolibdat testi) DPPH yöntemi (Serbest radikal süpürme etkinliği) CUPRAC testi β-karoten/linoleik asit emülsiyon sistemi İndirgeme gücü Thymealaceae Familyası ve Daphne Cinsi MATERYAL VE METOT Çalışmada Kullanılan Daphne Türleri ve Özellikleri Daphne oleoides Subsp. oleoides Daphne Sericea Bitkisel Ekstrakların Hazırlanması Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesinde Uygulanan Metotlar Toplam fenolik madde tayini (Folin yöntemi) Toplam Flavonoid Tayini Toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi DPPH süpürme etkinliği β-karoten/linoleik asit emülsiyon sistemi CUPRAC metodu İndirgeme gücü (Reducing power) iv

8 4. SONUÇLAR D. oleoides subsp. oleoides e ait sonuçlar Toplam Fenolik Madde Toplam Flavonoid İçeriği Toplam Antioksidan Kapasite Demir indirgeme Gücü β-karoten/linoleik asit test sistemi Bakır İndirgeme Gücü (CUPRAC Metodu) Serbest Radikal Yakalama Aktivitesi (DPPH Testi) D.sericea ya ait sonuçlar Toplam fenolik Madde Toplam Flavonoid Tayini Toplam Antioksidan Kapasite Demir indirgeme gücü Bakır İndirgeme Gücü (CUPRAC Metodu) Β-karoten/linoleik asit test sistemi Serbest Radikal Yakalama Aktivitesi (DPPH Testi) D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının antioksidan özelliklerinin karşılaştırılması Toplam Fenolik Madde Toplam Flavonoid İçeriği Toplam Antioksidan Kapasite Demir indirgeme Gücü Bakır indirgeme gücü β-karoten/linoleik asit test sistemi Serbest Radikal Yakalama Aktivitesi (DPPH Testi) TARTIŞMA KAYNAKLAR ÖZGEÇMİŞ. 63 v

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.3. Flavonoid gruplarının kimyasal yapıları Şekil 3.1. Daphne Oleoides subsp. Oleoides Şekil 3.2. Daphne sericea Şekil 4.1. Gallik asitin kalibrasyon eğrisi Şekil 4.2. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının toplam fenolik madde içeriklerinin karşılaştırılması Şekil 4.3. Rutinin kalibrasyon eğrisi Şekil 4.4. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının toplam flavonoid içeriklerinin karşılaştrılması.. 26 Şekil 4.5. Askorbik asitin kalibrasyon eğrisi Şekil 4.6. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların toplam antioksidan kapasitelerinin karşılaştırılması Şekil 4.7. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların demir indirgeme güçlerinin karşılaştırılması Şekil 4.8. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının EC 50 değerlerinin karşılaştırılması Şekil 4.9. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların β-karoten/linoleik asit test sisteminde linoleik asit oksidasyonunu inhibe etme yüzdelerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve askorbik asitin bakır indirgeme güçlerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve askorbik asidin CUPRAC metodunda EC 50 değerlerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides in hekzan ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği Şekil D. oleoides subsp. oleoides in etil asetat ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği.. 34 Şekil D. oleoides subsp. oleoides in metanol ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği Şekil D. oleoides subsp. oleoides in etanol ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği Şekil BHT nin konsantrasyon-inhibisyon grafiği Şekil D. oleoides subsp. oleoides ekstrakları ve BHT nin IC 50 değerlerinin karşılaştırılması Şekil D.sericea ekstraklarının toplam fenolik madde içeriklerinin karşılaştırılması Şekil D. sericea ekstraklarının toplam flavonoid içeriklerinin karşılaştırılması Şekil D. sericea ekstraklarının ve standartların toplam antioksidan kapasitelerinin karşılaştırılması Şekil D. sericea ekstraklarının ve standartların demir indirgeme güçlerinin karşılaştırılması Şekil D. sericea ekstraklarının EC 50 değerlerinin karşılaştırılması Şekil D. sericea ekstraklarının ve askorbik asitin bakır indirgeme güçlerinin karşılaştırılması.. 42 vi

10 Şekil D. sericea ekstraklarının ve askorbik asidin CUPRAC metodunda EC 50 değerlerinin karşılaştırılması Şekil 4.25.D. sericea ekstraklarının ve standartların β-karoten/linoleik asit test sisteminde linoleik asit oksidasyonun inhibe etme yüzdelerinin karşılaştırılması Şekil D. sericea nın hekzan ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği Şekil D. sericea nın etil asetat ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği Şekil D. sericea nın metanol ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği Şekil D. sericea nın etanol ekstraktının konsantrasyon-inhibisyon grafiği Şekil D. sericea ekstrakları ve BHT nin IC 50 değerlerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının toplam fenolik madde içeriklerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının toplam flavonoid içeriklerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının toplam antioksidan kapasitelerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının demir indirgeme güçlerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının demir indirgeme gücü metodunda EC 50 değerlerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının bakır indirgeme güçlerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının CUPRAC metodunda EC 50 değerlerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının linoleik asit oksidasyonu inhibe etme yüzdelerinin karşılaştırılması Şekil D. oleoides subsp. oleoides ve D. sericea ekstraklarının serbest radikal yakalama aktivitelerinin (IC 50 ) karşılaştırılması vii

11 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 4.1. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının toplam fenolik madde içerikleri Çizelge 4.2. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının toplam flavonoid içerikleri Çizelge 4.3. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların toplam antioksidan kapasiteleri Çizelge 4.4. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların demir indirgeme gücü metodunda 700 nm de absorbansları Çizelge 4.5. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının EC 50 değerler Çizelge 4.6. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve standartların β-karoten/linoleik asit test sisteminde linoleik asit oksidasyonunu inhibe etme yüzdeler Çizelge 4.7. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının ve askorbik asitin bakır indirgeme gücü metodunda 450 nm de absorbansları Çizelge 4.8. D. oleoides subsp. oleoides ekstraklarının CUPRAC metodunda EC 50 değerleri Çizelge 4.9. D. oleoides subsp. oleoides ekstrakları ve BHT nin IC 50 değerleri Çizelge D. sericea ekstraklarının toplam fenolik madde içerikleri Çizelge D. sericea ekstraklarının toplam flavonoid içerikleri Çizelge D. sericea ekstraklarının ve standartların toplam antioksidan kapasiteleri Çizelge D. sericea ekstraklarının ve standartların demir indirgeme gücü metodunda 700 nm de absorbansları Çizelge D. sericea ekstraklarının EC 50 değerleri Çizelge D. sericea ekstraklarının ve askorbik asitin bakır indirgeme gücü metodunda 450 nm de absorbansları Çizelge D. sericea ekstraklarının ve askorbik asidin CUPRAC metodunda EC 50 değerleri Çizelge D. sericea ekstraklarının ve standartların β-karoten/linoleik asit test sisteminde linoleik asit oksidasyonun inhibe etme yüzdeleri Çizelge D. sericea ekstrakları ve BHT nin IC 50 değerleri viii

12 KISALTMALAR BHA : Bütillenmiş hidroksianisol BHT :Bütillenmiş hidroksitoluen TBHQ : Tersiyerbutil hidrokinon PG : Propilgallat GAE :Gallik Asit Eşdeğeri AE :Askorbik Asit Eşdeğeri DPPH : 2,2-Difenil-1-pikrilhidrazil IC 50 : %50 İnhibisyon Konsantrasyonu CUPRAC : Bakır(II) İyonu İndirgenme Antioksidan Kapasitesi EC 50 :Absorbansın 0.5 olduğu Etkin Konsantrasyon ix

13 1 1. GİRİŞ Bitkiler insan sağlığının sürdürülmesinde ve insan yaşamının kalitesinin artırılmasında önemli bir rol oynamaktadırlar (Winston, 1999). Tüm dünyada olduğu gibi ülkemizde de çeşitli bitkiler yıllardan beri halk arasında tedavi amaçlı olarak kullanılmaktadır (Tan, 1992). Ülkemiz coğrafi konumu itibarı ile zengin bir bitki örtüsüne sahiptir. Akdeniz, Asya, Avrupa gibi 3 farklı coğrafik alanda ve önemli iklimsel kuşağın ortasında yer alışı, Türkiye yi bitki çeşitliliği ve endemik bitkiler açısından zengin bir ülke haline getirmiştir (Baser, 2006 ). İnsanlar yüzyıllardan beri bitkileri çeşitli hastalıkların tedavisinde kullanmışlar ve başarılı sonuçlar almışlardır (Baytop, 1999). Tedavi amaçlı bitki sayısı, antik çağlardan beri devamlı artış göstermektedir. 19. Yüzyılın başlarında ise bilinen tıbbi bitki miktarı sayısına ulaşmıştır (Tan, 1992 ). 20. yüzyılda Dünya Sağlık Örgütü yaptığı çalışmada tedavi amacıyla kullanılan tıbbi bitkilerin sayısının yaklaşık civarına ulaştığını belirtmiştir (Kalaycıoğlu ve Öner, 1994). Tüm dünyada bitkisel ilaçlarla tedavi giderek artmakta ve simdiye kadar görülmemiş bir popülarite kazanmaktadır(çubukçu ve ark., 2002). Bu uygulama insanların %80 kadarının primer sağlık ihtiyaçları için geleneksel ilaçları kullandıklarını ve bu tedavilerin çoğunun bitki ekstrelerini ve etkin maddelerini kullanarak ortaya çıktığını kanıtlamaktadır (Winston, 1999).Bitkiler yaşam için vazgeçilmez özelliklerinin yanı sıra sahip oldukları sekonder metabolitler ile çeşitli hastalıkların tedavisinde büyük öneme sahiptir (Pokarny, 2007). Günümüzde dünyanın gelişmiş ülkeleri saf, sentetik veya yarı sentetik hammaddelerle üretilmiş ilaçların istenmeyen yan etkilere sahip olması nedeni ile hastalıkların tedavisinde bitkisel kaynaklara yönelmiş durumdadırlar (Baytop, 1999). Dünya Sağlık Örgütünün yaptığı araştırmalar sonucunda; dünya nüfusunun % 60 nın sentetik ilaçları hiç kullanmadığı, 3/4 nün ise kendi geleneksel kültürlerindeki bitkisel kaynaklı olan ilaçlara güvendiği ve bunları kullandığı saptanmıştır. Amerika da reçetelenmemiş ilaçların % 25 i doğal ürünlerden, % 25 i de doğal ürünlerden hareketle türevlenen maddelerden oluşmaktadır. Rusya da kullanılan ilaçlardan 1/3 ünden fazlası bitkisel kökenli olup sentetik birçok ilacın elde edilmesine karşılık bu oran değişmemektedir (Çubukçu ve ark., 2002).

14 2 Canlı hücrelerde normal metabolik yolların işleyişi sırasında veya çevresel ajanlar (pestisidler, aromatik hidrokarbonlar, toksinler, çözücüler vb.), stres ve radyasyon gibi çeşitli dış faktörlerin etkisiyle, her saniye milyonlarca serbest radikal oluşur. Serbest radikaller dış orbitallerinde ortaklanmamış elektron bulunduran, kısa ömürlü, reaktif moleküllerdir. Serbest radikaller stabil hale gelebilmek için elektronlarını paylaşmak üzere diğer moleküllerle reaksiyona girerler. Bu radikallerle reaksiyona giren moleküllerin bir elektronu azaldığı için onlarda reaktif hale gelir ve böylece bu olay zincirleme devam eder (Halliwell ve Gutteridge, 1990). Serbest radikallerin en önemli grubunu teşkil eden reaktif oksijen türleri nötralize edilmezlerse lipitlerin, proteinlerin ve DNA nın oksidatif hasarlarına yol açabilir (Hsu ve ark., 2005).Bu durum insanlarda kanser, diabet, yaşlanma ve dejeneratif hastalıklar gibi birçok kronik hastalıklara neden olur (Harman, 1998). Canlılarda, reaktif oksijen türlerinin meydana getirdiği zararları ortadan kaldırmak için çeşitli antioksidan savunma mekanizmaları mevcuttur (Hsu ve ark., 2005; Salvatore ve ark., 2005).Ancak, her yaşamsal mekanizma olduğu gibi antioksidan mekanizma da dışarıdan alınan diyetle desteklenmelidir (Halliwell ve ark.,1984). Antioksidan madde bakımından zengin sebze, meyve ve tıbbi bitkilerin kullanılması yada antioksidan ilaçların alınması reaktif oksijen türlerinin neden olduğu doku hasarına bağlı hastalıklardan insanları korumaktadır (Acuma ve ark., 2002;Rang ve ark.,2006 ). Bu yüzden dietle antioksidan alımında artma veya antioksidanlarla zenginleştirilmiş gıdalar giderek önem kazanmaktadır (Halvorsen ve ark., 2002). Antioksidanlar, reaksiyon mekanizmalarına göre doğal antioksidanlar ve sentetik antioksidanlar olmak üzere ikiye ayrılılırlar (Antolovich ve ark., 2002). Antioksidanların özellikle doğal kaynaklı olanlarının tercih edilmesi tavsiye edilmektedir (Kranl ve ark., 2005). Doğal antioksidanların alımının kanser, kardiovasküler hastalıklar, diabet gibi diğer hastalıklar ve yaşlanma riskinin azaltılması ile ilgili olduğuna dair bilgiler mevcuttur (Hertog ve ark., 1995). İşlenmiş gıdaların bozunmasını önlediği ve raf ömrünü uzattığı için sentetik antioksidanlar gıdalarda katkı maddesi olarak kullanılmaktadır. Günümüzde BHA (Bütillenmiş hidroksi anisol), BHT (Bütillenmiş hidroksi toluen), PG (propilgallat) ve TBHQ (t-bütilhidrokinon) en çok kullanılan sentetik antioksidan maddelerdir. Ancak, yapılan araştırmalar sentetik antioksidanların karsinojenik etkileri başta olmak üzere çeşitli toksik etkilere sahip

15 3 olduğu ortaya konmuşur (Ito ve ark., 1986). Bu sebeple doğal antioksidanların kullanımı hergeçen gün artmaktadır. Türkiye florasında yer alan halk arasındada kullanılan Thymelaeaceaefamilyasına ait türler tropikal ve ılıman bölgelerde yayılış göstermekte olup, ülkemizde üç cins ve 18 tür ihtiva etmektedir (Baytop, 1984;Davis, 1988). Bu familyaya ait olan DaphneL. cinsi ülkemizde sekiz takson ile temsil edilmektedir. Bu tez çalışmasında, Daphne cinsine ait D. oleiodies subsp. oleiodies ve D. sericea türlerinin toprak üstü kısımlarının antioksidan özelliklerinin farklı çözücüler kullanılarak araştırılması amaçlanmıştır. Bu çalışma sonucunda hem çözücü kullanımının antioksidan kapasite üzerine etkisi belirlenecek hemde kullanılan türlerin çeşitli sektörlerde ham madde kaynağı olarak kullanılıp kullanılmayacağı ortaya çıkarılacaktır.

16 4 2. KAYNAK ARAŞTIRMASI 2.1.Serbest Radikaller Serbest radikaller, bir veya daha fazla eşlenmemiş elektron içeren atom veya moleküllerdir. Serbest radikaller stabil hale gelebilmek için bu elektronlarını paylaşmak üzere diğer stabil moleküllerle hızla reaksiyona girerler. Serbest radikallerle reaksiyona giren moleküllerin bir elektronu azaldığı için, onlar da reaktif hale gelir ve bu reaksiyon zincirleme olarak devam eder (Del Maestro, 1980;Southorn, 1988;Gutteridge, 1994; Aruoma, 1998). Biyolojik sistemlerdeki en önemli serbest radikaller, oksijen kaynaklı olanlarıdır. Bu radikaller, oksijenin suya indirgenmesi sırasında tek elektron aktarması sonucunda süperoksit radikali ( O - 2 ),iki elektronaktarması sonucundahidrojen peroksit radikali (H 2 O 2 ), üç elektron aktarması sonucunda hidroksil radikali ( OH) oluşur (Winston 1991). Normal fizyolojik şartlarda oksijenin %2-5 i reaktif oksijen türlerine (ROT) dönüşmekte ve antioksidan sistem ile ortadan kaldırılmaktadır (Apel ve Hirt, 2004). Reaktif oksijen türlerinin ana kaynağının süperoksit radikali olduğu, onun da ana kaynağının mitokondri olduğu düşünülmektedir (Stadtman, 2002). Çünkü mitokondride oksijene her seferinde sadece bir elektron transfer edilebilmesinden dolayı, elektron transferi sırasında süperoksit radikali oluşumu kaçınılmazdır.süperoksit (O 2 ), dismutasyon reaksiyonu ile bir başka reaktif oksijen türü olan H 2 O 2 i oluşturur. H 2 O 2 ise toksik özelliğinden çok, reaktivitesi yüksek olan hidroksil radikali (OH ) oluşturma potansiyeline sahip olması ile dikkatleri üzerine çekmektedir. İlginçtir ki, mitokondride yaşla beraber istikrarlı bir şekilde O 2 ve H 2 O 2 üretim hızı da artar (Sohal, 2002). Reaktif oksijen türleri (ROT), pekçok redoks işlemlerinde ortaya çıkan başlıca serbest radikallerdir. Bunlar karbohidratlar, proteinler, lipidler ve DNA yı da içine alan biyomoleküllerin oksidatif zarara uğramasına sebep olabilirler. Reaktif oksijen türleri canlı hücrelere etki ederek, aterosklerosis, parkinson, alzheimer, felç, artrit, kronik iltihap hastalıkları, kanser ve diğer dejenere hastalıklar gibi kronik hastalıkların patojenlerine ortam hazırlarlar (Halliwell ve Grootveld, 1987; McDermott, 2000). Bunun yanında insan vücudunda yaşlanma gibi birçok etkiye sebep olmaktadır (Kehrer, 1993; Aruoma, 1994). Reaktif oksijen türleri birçok hastalığın oluşmasında önemli role sahip olduğu gibiaynı zamanda kozmetik ürünlerin, ilaçların (Branen ve Davidson, 1997) ve gıdaların bozulmasına katkıda bulunmaktadır (Sasaki ve ark., 1996).

17 5 Serbest radikallerin dokulardaki zararının, damar sertliği ve kalp hastalıklarının başlıca nedeni olduğu düşünülmektedir. Oksidatif zararla parçalanmış kan hücrelerinin arter duvarına yapışması ve kolesterolun yükselmesi arterlere zarar vermektedir. Bu oluşumların tümü damar sertliğinin ilerlemesine sebep olmaktadır. Daha ileri safhalarda ise kalp ile beyne giden kan ve oksijen azalmakta oksijenden mahrum kalan dokular hastalığın gelişimini ve kalp krizi risk artırmaktadır. Serbest radikaller aynı zamanda hücrenin genetik materyali olan DNA yı da etkilemektedir. Hücrelerin genetik kodları değiştiğinde ölmekte, aşırı hücre ölümü ise erken yaşlanmaya yol açmaktadır. Ayrıca hücrelerin genetik kodları değiştiğinde kanser ve benzeri hastalıkları destekleyen hücre grupları meydana gelebilmektedir (Floyd, 1990). Biyolojik sistemlerde serbest radikal oluşumu normal metabolik olaylar esnasında meydana gelebildiği gibi organizmanın çesitli dış etkenlere maruz kalmasıyla da meydana gelebilir. Bu nedenle serbest radikal kaynakları endojen ve ekzojen olarak iki ana gruba ayrılmaktadır (Dündar, 2000). Vücutta serbest radikal meydana getiren ana kaynaklar aşağıdaki gibi gruplandırılabilir (Southorn, 1988; Morelli, 2003): Endojen kaynaklar Mitokondrial sızıntı Solunumsal patlama Enzim reaksiyonları Otooksidasyon reaksiyonları Eksojen kaynaklar Sigara dumanı, Alkol UV ışını İyonize radyasyon Ksenobiyotikler Çevresel kirlenme İlaçlar Diet faktörleri

18 6 2.2.Antioksidanlar Yakın zamanda bulunan birçok kanıt, oksidatif stresin pekçok bozukluk ve hastalıkların patojenlerinin ortaya çıkmasında etkili olduğunu göstermiştir. Bu durum bilim adamlarının ve kamuoyunun ilgisini, hastalıkların engellenmesi, tedavisi ve insan sağlığının korunmasında antioksidanların rolüne çevirmiştir (Papas, 1999;Halliwell ve Gutteridge,2007). Antioksidanlar, oksitlenebilen substratlardan daha düşük konsantrasyonda bulundukları zaman, substratın oksitlenmesini durduran veya geciktiren maddeler olarak tanımlanabilirler( Halliwell, 1997). Vücudumuzdaki ve besinlerdeki lipitler, proteinler, karbohidratlar, nükleik asitler oksidasyona uğrayabilmekte ve böylece canlı organizma için zararlı olabilecek oksidasyon ürünleri oluşabilmektedir. Bu durum Oksidatif Stres şeklinde ifade edilmektedir (Zhao ve ark., 2006). Oksidatif stres durumunda reaktif türlerin miktarında artış olur ve bu türler başta biyomoleküllerde olmak üzere vücudumuzun bir çok sistemine zarar verirler (Lambeth, 2004). Olumsuz etkilenen sistemler, ilişkili oldukları diğer sistemleri de etkiler ve bu durum zincirleme olarak devam eder. Bu zincirleme reaksiyonlar Antioksidan Savunma Sistemleri tarafından sonlandırılır. Reaktif oksijen ve azot türlerine karşı özellikle aeroblar antioksidan savunma sistemlerine sahiptirler. Organizmada sürekli oksidanlar üretilmekte, buna karşılık antioksidan sistem tarafından bu oksidanlar ve bunların olumsuz etkileri bertaraf edilmektedir.antioksidan savunmanın yetersiz olması durumunda bu reaktif türler hücrenin doğrudan ya da dolaylı olarak ölümüne sebep olurlar (Moldovan ve Moldovan, 2004). Antioksidanlar, oksidasyon zincir reaksiyonlarının ileri dönemini veya başlangıcını engelleyerek, diğer moleküllerin oksidasyonun durduran veya erteleyen bileşenlerdir. Antioksidanlar genel olarak doğal ve sentetik antioksidanlar olmak üzere ikiye ayrılır. Genellikle sentetik antioksidanlar alkil şubesinin çeşitli derecelerinin fenolik yapılarını içeren bileşiklerdir. Doğal antioksidanlarsa fenolik bileşikler (tokoferoller, flavonoidler, ve fenolik asitler), nitrojen bileşikler (alkoloidler, klorofil türevleri, amino asitler ve aminler), polifenoller, karetonoidler, askorbik asit ve selenyumdur (Larson, 1988; Hundson, 1990;Hall ve Cuppertt, 1997). Kozmetik ve eczacılığa ait ürünlere ilave edilen antioksidanlar kadar yiyeceklerdeki sentetik antioksidanlara da önem verilmektedir. BHA (bütillenmiş hidroksianisol), BHT (bütillenmiş hidroksitoluen), TBHQ (tersiyerbutil hidrokinon) ve PG (propilgallat) en çok kullanılan sentetik antioksidanlardır (Kırca ve Arslan, 2008). Bunlardan BHA

19 7 (bütillenmiş hidroksianisol), BHT (bütillenmiş hidroksitoluen) gibi sentetik antioksidanlar ekonomik oldukları için kullanımları oldukça yaygındır, fakat BHA ve BHT nın bazı karsinojenik ve yan etkileri olduğu kaydedilmiştir (Branen, 1975; Ku ve Mun, 2007). Bunedenle sentetik antioksidanların kullanılması sağlık sorunlarına neden olabileceği bulunduktan sonra, pek çok ülkede kısıtlamalar getirilmiştir ( Branen, 1975; Ito, 1983; Kahl ve Kappus, 1993). Son yıllarda kamuoyunda doğal antioksidanlara olan ilginin artmasıyla, sanayide sentetik antioksidanların yerine kullanılabilecek veya en azından gıdalardaki katkıları azaltabilecek doğal antioksidanları araştırma ihtiyacı ortaya çıkmıştır (Shahidi, 2000). Bu nedenle doğal üretilmiş organik antioksidanların izole edilmesiyle ilgili araştırmalar artmıştır. Sebzeler, meyveler, yağlı tohumlar, tahıl ürünleri, ağaç kabukları, kökler, baharatlar ve bitkilerin potansiyel antioksidan kaynakları olduğu kaydedilmiştir (Rababah ve ark., 2004). Doğal antioksidanların pekçoğu (özellikle flavonoidler) antibakterial, antiviral, antiflamatuar, antialerjik ve antitrombotik özellikleri de içine alan, geniş bir biyolojik etki alanı sergilerler (Cook ve Sammon, 1996). Antioksidan aktivitesi hayat için temel bir özelliktir. Antimutajenik, antikarsinojenik ve antiaging in de aralarında bulunduğu pekçok biyolojik fonksiyon bu özellikten meydana gelmektedir (Huang ve ark., 1992; Cook ve Samman, 1996). Antioksidan ajanlar oksidan moleküllere karşı etkilerini dört yolla gösterirler. Bunlar: 1.Süpürme (Scavenging) etkisigösterenler: Radikal oluşumunu engellerler ve oluşmuş olan radikalleri daha az zararlı hale getirirler. Örnek olarak, süperoksit dismutaz (SOD) ve glutatyon peroksidaz (GPx) gibi enzimler ve metal bağlayıcı bazı proteinler verebilir. 2. Giderme/Söndürme (Queching) etkisi gösterenler: Oksidanlarla etkileşip, onlara bir hidrojen aktararak aktivitelerini söndüren ve inaktif hale getiren bileşiklerdir. Örnek olarak, vitaminler (A, C ve E vitaminleri), flavonoidler, mannitol ve antosiyanidinler verilebilir. 3. Zincir reaksiyonlarını kırma (Chain Breaking) etkisi gösterenler: Zincirleme olarak devam eden tepkimeleri belli yerlerinden kırarak,oksidan molekülleri kendilerine bağlayarak etkisiz hale getirirler. Örnek olarak ürik asit, bilirubin ve albümin verilebilir.

20 8 4. Onarma (Repair) etkisi gösterenler:hasara uğramış olan biyomolekülü onararak oksidan moleküllerin zararlı etkilerini ortadan kaldırır (Gökpınar ve ark., 2006). Örnek olarak DNA tamir enzimleri, metionin sülfoksit redüktaz gösterilebilir. Canlılarda mekanizmalar sonucu oluşan serbest radikaller, çoğu zaman lipidoksidasyonuna ve buna bağlı olarak da hücre ölümlerine neden olmaktadır. Antioksidanbir madde bu oksidasyonun çeşitli aşamalarında yukarıda özetlenen mekanizmalaryoluyla koruyucu özelliğe sahip maddelerdir. 2.3.Fenolik Bileşikler Serbest radikaller besinlerde kalite kaybı, bozulma, besin değerinde azalma, aroma, kıvam, sertlik derecesi, görünüş gibi pekçok önemli gıda parametresinde istenmeyen değişimler olmasına sebep olabilirler. Böyle problemlerle başaçıkmak için; oksidasyona sebep olan faktörleri engelleme, yada gıdalara antioksidan ilave etmek gibi yöntemler kullanılır ( Sims ve Fioriti, 1991). Lipidler, gıda lezzeti konfigürasyonu açısından gereklidir ve gıda bozulmalarının başlıca nedeni doymamış yağ asidinin oksidasyonuyla ilgilidir. Yapılan araştırmalar sonucunda bazı fenoliklerin lipid oksidasyonunu durdurduğu saptanmış, buda ilaç ve kozmetik sanayisinde olduğu gibi gıda muhafazasında BHT, BHA, TBHQ ve PG sentetik antioksidanların kullanılmasına katkı sağlamıştır (Combs, 1992; Halliwell ve ark.; 1992, Giese; 1996). Fenolik bileşiklerin antioksidanlar gibi davranma kabiliyeti literatürlerde gösterilmiştir. Pekçok araştırmacı, fenolik bileşiklerin antioksidan aktivitesini araştırmış ve aktivitelerine yardım eden flavonoidlerin yapısal karakteristik özelliklerini tanımlamaya çalışmışlardır (Das ve Pereira, 1990; Nieto ve ark., 1993; Foti ve ark., 1996). Fenolik bileşikler, fenolik asitler ve flavonoidler olarak iki ayrı gruba ayrılırlar. Fenolik asitler yaygın olarak bitkilerin taç kısmında bulunur ve antioksidan karaktere sahiptir. Başlıca fenolik asitler gallik asit, protokatekuik asit, p-hidroksibenzoik asit ve vanilik asit gibi hidroksibenzoik asitler ile ferulik asit, kafeik asit ve kumarik asit gibi hidroksisinnamik asitleri içerir. Flavonoidler çeşitli besin ve tıbbi bitkilerde bulunan sekonder metabolitlerin en yaygın grupları arasında olan fenolik bileşiklerdir. Bu bileşikler renk, tat ve koku gibi organoleptik özelliklerden sorumlu oldukları için bu tür ürünlerin kalitesiyle yakından ilgilidirler (Fabre ve ark., 2001; Borbalán ve ark., 2003). Flavonoidlerin antioksidan olarak davranma kapasiteleri onların molekül yapılarına bağlıdır. Hidroksil gruplarının pozisyonu ve sayısı ve flavonoidlerin kimyasal

21 9 yapılarındaki diğer özellikler onların antioksidan ve serbest radikal temizleme aktiviteleri için önemlidir (Suschetet ve ark., 1998). Fenoller hidroksil grupları nedeniyle radikal giderme yeteneğine sahip oldukları için önemli bitki bileşenleridir (Hatano ve ark., 1989). Fenolik bileşiklerin antioksidan aktiviteyle ilişkilendirildiği ve lipid peroksidasyonunda önemli bir rol oynadığı rapor edilmiştir (Yen ve ark., 1993). Fenolik maddelerin insan sağlığı üzerindeki etkilerine bakıldığında, meyve ve sebzelerde zengin olarak bulunan polifenolik bileşiklerin günlük bir gramın üzerinde alındığında mutagenez ve karsinogenez üzerine inhibitör etki gösterdiğikanıtlanmıştır. Flavonollerin polimerizasyon derecesi yükseldikçe süperoksit giderim aktiviteleri de artmaktadır (Yamaguchi ve ark., 1999). Genel bir eğilim olarak fenoksil radikallerinin kararlılığının arttırılması istenilen bir şeydir ancak lipidler için moleküllerin lipofilik yapıları ve antioksidanların benzerliği belirleyici olmalıdır (Von Gadow ve ark., 1997). Aynı zamanda anti-peroksidan etki hem benzen halkasındaki metoksi ve hidroksil gruplarının sayısına, pozisyonuna; hem de çift bağlardaki elektron delokalizasyonuna bağlıdır (Milic ve ark., 1998). Farklı sebzelerden elde edilen flavonların şeker grupları ihtiva etmesi, flavonların antioksidan aktivitesini önemli derecede etkilemektedir (Plumb ve ark., 1999). Polifenoller, bitkilerde çeşitli meyve, sebze, kuruyemiş, tohum, çiçek, kök ve gövde kısımlarında doğal olarak sentezlenen maddelerdir. (Wollgast ve Anklam, 2000). Son yıllarda pek çok araştırma çalışmaları polifenoller bakımından zengin besinlerin tüketimiyle onların antioksidan özellikleri sayesinde kardiovasküler hastalıklar, belli kanser tipleri ve diğer yaşlanmayla ilgili hastalıklardan korunmayı ilişkilendirmişlerdir (Rise-Evans ve Packer,1998; Fabre ve ark., 2001;Chang ve Kinghorn, 2001; Borbalán ve ark., 2003). Sekiz binin üzerinde doğal olarak meydana gelen fenolik bileşik bilinmektedir (Balasundram ve ark., 2006). Bu bileşikler en azından bir aromatik halka ile buna bağlı bir veya daha fazla OH grubu ile ek diğer grupları içermektedir ve bunlar çok sayıda yapısal sınıfa ayrılabilir (Harborne ve Simmonds, 1964). Bu sınıfların başlıcaları şu şekilde gruplandırılabilir; C 6 basit fenoller (resorsinol), C 6 -C 1 fenolik asitler (phidroksibenzoik asit), C 6 -C 2 asetofenon ve fenilasetik asit, C 6 -C 3 hidroksisinnamik asit (kaffeik asit), C 6 -C 4 hidroksiantrakinonlar, C 6 -C 2 -C 6 stilbenler (resveratrol), C 6 -C 3 -C 6 flavonoidler (kuersetin), (C 6 -C 3 ) 2 lignanlar (mateiresinol), (C 6 -C 3 -C 6 ) 2 bioflavonoidler

22 10 (agatisflavon), (C 6 -C 3 ) n ligninler, (C 6 -C 3 -C 6 ) n ve taninler (prosiyanidin) (Robards ve Antolovich, 1997). Flavonidler bitkiler aleminde geniş bir dağılıma sahip olup oldukça önemli fenolik bileşikleridir. Genel olarak halkasal yapı ve özel hidroksil grupları içermektedir. Flavonoidler yapılarına göre altı grupta toplanabilirler. Bunlar: Flavanollar, Flavononlar, Flavonollar, Flavonlar, İzoflavonlar ve Antosiyaninlerdir (Feredioon ve ark. 1992; Rice Evans ve ark., 1996). Flavonol Flavon Flavanon Flavanol İzoflavon Antosiyanidin Şekil2.3. Flavonoid gruplarının kimyasal yapıları Kimyasal olarak flavonoidlerin güçlü antioksidan özellikleri üç özellikten kaynaklanır. Aromatik halka yapılarındaki hidroksil grupları sayesinde hidrojen vererek redoks reaksiyonlarına girebilirler. Bu sayede serbest radikalleri yok edebilirler. Aromatik heterosiklik ve çoklu doymamış bağlardan oluşan yapılarıyla dayanıklı bir kimyasal yapı oluştururlar. Metal şelatlama kapasitesine sahip yapısal grupları vasıtasıyla hidroksil ve süperoksit radikalleri gibi reaktif oksijen türlerinin oluşumunu engelleyebilirler (Cam ve Hışıl 2003; Naczk ve Shahidi, 2004).

23 Antioksidan Kapasite Testleri Bitkilerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesine için çok sayıda metot olmasına rağmen kullanışlı ve antioksidan kapasiteyi tümüyle yansıtan standart bir metot henüz geliştirilememiştir. Antioksidan kapasite tayin yöntemleri, kullanılan kimyasal reaksiyon açısındantemel olarak iki sınıfta toplanabilir. 1. Hidrojen atomu transferi reaksiyonuna dayananlar (HAT) 2. Elektron transferi reaksiyonlarına dayananlar (ET) Hidrojen transferine dayanan analiz yöntemleri hidrojen atomu vererek serbest radikalleri yakalama aktivitesidir. Bu analiz yöntemlerinin çoğu azo bileşiklerinin bozunması sonucu oluşan peroksi radikallerinin antioksidan ve substrat tarafından yarışmalı bir şekilde giderilmesi prensibine dayanır. β karoten/linoleik asit emülsiyon yöntemi hidrojen transferine dayalı testlere örnektir (Apak ve ark., 2007).Elektron transferi temelli analiz yöntemleri antioksidan maddenin, indirgendiğinde renk değiştiren bir oksidan maddeyi, indirgeme kapasitesinin ölçümüne dayanır. Renk değişimininderecesi örneğin antioksidan derişimi ile bağlantılandırılır.elektron transferine dayalı testlere Folin-Ciocalteu ve DPPH yöntemleri örnek olarak verilebilir. Bitkilerde antioksidan kapasite, test sisteminin şartları ve ekstrakların komposizyonu gibi birçok faktöre bağlı olarak değişiklik göstermektedir. Araştırıcılar bu yüzden bitkilerin antioksidan kapasitelerinin belirlenmesi çalışmalarında tek bir metotun antioksidan kapasiteyi tümüyle yansıtmadığını ve birkaç farklı antioksidan kapasite tayin metodu kullanarak bu durumun doğrulanması gerektiğini belirtmektedirler (Wong ve ark., 2006) Folin-Ciocalteu yöntemi (Toplam fenolik madde tayini) Toplam fenolik madde miktarlarının hesaplanmasında genellikle tercih edilen Folin-Ciocalteu metodu, yönteme adını veren reaktif vasıtasıyla oluşan renk yoğunluğunu göre absorbans ölçümüne dayanmaktadır (Huang ve ark., 2005). Bu yöntem, suda ve diğer organik çözücülerde çözünmüş olan fenolik bileşiklerin Folin reaktifi ile alkali ortamda renkli kompleks oluşturması esasına dayanır (Slinkard ve Singleton, 1977). Metot kolaylığı, tekrarlanabilirliği ve diğer metotlarla gösterdiği korelasyondan dolayı oldukçasık uygulanmaktadır. Ancak metot, ortamda bulunan

24 12 ekstrakte proteinleri de ekstrakte ettiği için gıdaların yapısında bulunan bütün fenolik grupları ortaya çıkarır. Bu nedenle spesifik bir metot kabul edilmemektedir. Ayrıca metodun en önemli dezavantajı analiz sırasında ortamda bulunan askorbik asit gibi indirgen maddelerle etkileşime uğramasıdır (Huang ve ark., 2005). Bu duruma uygun olarak metotun total fenolik içeriği tümüyle yansıtmadığı belirtilmektedir. Metot sonuçları standart bir fenolik madde, genellikle de gallik asit ve kateşine eş değer olarak verilmektedir Toplam Flavonoid Tayini Bitkilerde bulunan flavonoidler bitki sekonder metaboliti olan ve antioksidan kapasiteye katkıda bulunan en önemli bileşiklerdendir (Matkowski, 2006). Flavonoid tayini bitkisel ekstraktların toplam flavonoidmadde içeriğini ortaya koymaktadır.kullanılan bu yötem, flavonoid alüminyum oluşumuna dayanmaktadır ve 415nm de UV- visible spektrofotometrede maksimum absorbansa sahiptir. Flavonoid içerik g başına mg rutine eşdeğer (RE) olarak ifade edilir (Djeridane ve ark., 2006) Total antioksidan kapasite testi (Fosfomolibdat testi) Fosfomolibdat testi olarak da isimlendirilen bu metod, fenolik bileşiklerin asidik ortamda Mo (VI) yı Mo (V) e indirgemesi ve bunu takiben oluşan yeşil renkli fosfat/mo (V) kompleksinin oluşmasına dayanmaktadır. Oluşan bu kompleks 695 nm de maksimum absorbans göstermektedir. Bu testin sonuçları antioksidan etkinliği bilinen maddelere eşdeğer olarak (mg/g, mg/ml) verilmektedir. Bu amaçla özellikle askorbik asit ve α-tokoferol kullanılmaktadır. Bu metot özellikle basitliği ve kullanılan reaktiflerin ucuzluğundan dolayı total antioksidan kapasitenin tayininde alternatif bir metot olarak kullanılmaktadır (Prieto ve ark., 1999) DPPH yöntemi (Serbest radikal süpürme etkinliği) DPPH metodu, DPPH ın kullanıldığı en iyi bilinen ve en sık kullanılan metodlardan biridir(molyneux, 2004). DPPH (2,2-difenil-1-pikrilhidrazil)azot köprüsünde eşleşmemiş bir elektron taşıyan stabil bir serbest radikaldir (Eklund ve ark., 2005). Yöntemde antioksidan kapasitesi tayin edilecek ekstrakta DPPH çözeltisi ilave edilir. DPPHantioksidan madde ile reaksiyona girdiği zaman redüklenerek koyu menekşe olan rengi sarı renkli difenilpikrilhidrazine dönüşmekte ve bu renk değişimide UV/visible spektrofotometrede 517 nm de belirlenebilmektedir(molyneux, 2004). Yöntemin sonunda IC 50 adı verilen ve ekstrakın DPPH radikalinin yarısını süpürebildiği

25 13 konsantrasyon elde edilir. Bu IC 50 değeri ekstrakların serbest radikal süpürme etkinliğini gösterir (Brand-Williams ve ark., 1995). IC 50 değerinin düşük olması antioksidan kapasitenin oldukça güçlü olduğunu gösterir. Difenilpikrilhidrazil (DPPH) RadikaliDifenilpikrilhidrazin DPPH yöntemi antioksidanların radikalleri süpürme kabiliyetlerini gösteren kolay ve geçerli bir yöntem olarak kabul edilmektedir (Sanchez ve ark., 1998).Ancak metot reaktif oksijen ve azot türlerinin fizyolojik şartlarda süpürülme yeteneğini bire bir yansıtmaz CUPRAC testi Cu(II)-neokuproin reaktifi ılımlı bir yükseltgen olduğundan gıda maddelerinde bolca bulunan sitrat ve glukoz gibi bileşenlerle tepkime vermeksizin sadece antioksidanları yükseltger ve reaksiyon ürünü Cu(I)-neokuprin kelatının 450 nm deki absorbansı okunarak sonuç verilir. Yöntem, tiyol (-SH) tipi antioksidanlarla çabuk ve net sonuçlara ulaşır. CUPRAC, fizyolojik ph lara yakın olan ph=7 ortamında yürütülür; dolayısıyla fizyolojik koşulları yansıtma şansı daha fazladır. Uygun çözücü seçimiyle hem hidrofilik, hem de lipofilik antioksidanlar tayin edilebilir (Apak ve ark., 2005). +2 Cu(Nc) 2 + Ar(OH) n ncu(nc) + 2 +Ar(=O) n + nh +

26 β-karoten/linoleik asit emülsiyon sistemi β-karoten-linoleik asit test sistemi, yüksek sıcaklıkta linoleik asit oksidasyonundan ileri gelen konjuge dien hidroperoksitlerin inhibisyonunun ölçülmesine ve β-karoten molekülünde renk açılmasına dayanmaktadır (Krishnaiah ve ark., 2010).Ölçümler sonucunda linoleik asidin oksidayonunu inhibe etme oranının yüksek olması bu numunenin güçlü bir antioksidan kapasiteye sahip olduğunu gösterir. (Apak ve ark., 2007) İndirgeme gücü Bu metodun esası doğal antioksidantların ve standart antioksidant maddelerin[k 3 Fe(CN) 6 ] içindeki Fe +3 ün Fe +2 ye indirgenmesi esasına dayanır. 50 ºC de20dakika inkübasyondan sonra indirgeme reaksiyonu sonucu oluşan Prusya mavisi renkli kompleks 700 nm de maksimum absorbans göstermektedir. Absorbans artışı bitki ekstraktlarının indirgeme gücünün yüksek oldugunun belirtisidir (Benzie ve Strain, 1996) Thymelaceae Familyası ve Daphne Cinsi Türkiye florası yaklaşık bitki türü içerir ve bunların yaklaşık %34.5 i endemiktir. Türkiye florasının yaklaşık 3000 aromatik bitki türünü kapsadığı belirtilmektedir. Ancak bunların çoğu hakkında yeterli bilgi yoktur (Baser, 2002). Thymelaeaceae familyası tropikal ve ılıman bölgelerde yayılış göstermekte ve ülkemizde ise üç cins ve 18 tür içermektedir (Davis, 1988). Bu familyaya ait olan Daphne cinsi ülkemizde 8 takson ile temsil edilmektedir. Daphne cinsine ait taksonlar Anadolu da çıtlak, develik otu, ezente ve tasma olarak bilinmektedir (Yeşilada ve ark., 1999;Sezik ve ark., 2001). Eski tarihi literatürlerde Daphne türlerinin kanser tedavisinde kullanıldığı (Kupchan ve Baxter, 1974), geleneksel Çin tıbbında D. genkwa çiçek tomurcuklarının meme kanserine karşı koruyucu olarak kullanıldığı (Zhan ve ark., 2005;Zheng ve ark., 2006), D. acutiloba nın adenomlara karşı kullanıdığı rapor edilmiştir (Taniguchi ve ark., 1998). Daphne türlerinin fitokimyasal bileşimlerinin belirlenmesi bu türler üzerine yapılan çalışmaların en önemli kısmını oluşturmaktadır. Bu çalışmalarda D. genkwa (Zheng ve ark., 2007; Li ve ark., 2010), D. giraldii (Zhang ve ark., 2008;Wu ve ark., 2009), D. odora var. marginata (Zhang ve ark., 2006), D. oleoides (Ullah ve ark., 1999), D. tangutica (Pan ve ark., 2010), D. gnidium (Cottiglia ve ark., 2001; Deiana ve

27 15 ak., 2003; Maistrello ve ark., 2005) ve D. pedunculata (Xu ve ark., 2008) türlerinin etken fitokimyasal bileşimleri ortaya çıkarılmıştır. Etnofarmokolojik çalışmalar Daphne türlerinin ülkemizde geleneksel halk hekimliğinde çeşitli amaçlarla kullanıldığını göstermiştir. Örneğin, D. oleoides subsp. oleoides romatizma, yaraların iyileştirilmesi, apse, hayvanlarda ağrının dindirilmesinde ve topal hayvanların tedavisinde, D. pontica ise ishal tedavisinde kullanılmaktadır (Yeşilada ve ark., 1999; Baytop, 1999;Sezik ve ark., 2001; Kargıoglu ve ark., 2008; Kargıoglu ve ark., 2010). Ülkemizde D. mezereum un sulu-alkol ekstraktı kanser tedavisi için rapor edilmiştir (Ulubelen ve ark., 1986). Ülkemizde Daphne türleri üzerine yapılan çalışmalar genel olarak aktif bileşiklerinin, anti-inflamatuar ve analjezik aktivitelerinin değerlendirilmesine odaklanmıştır fakat türlerin invitro antioksidan kapasitelerine dair herhangi bir literatür bulunmamaktadır (Yesilada ve ark., 2001; Tosun, 2006; Küpeli ve ark., 2007). Bu çalışma ile Daphne cinsine ait iki taksonun antioksidan kapasiteleri belirlenerek gıda ve farmakoloji endüstrisinde kullanılabilecek doğal antioksidanlar olarak değerlendirilebilmesine imkan sağlayacaktır.

28 16 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Çalışmada Kullanılan Daphne Türleri ve Özellikleri Çalışmada kullanılan Daphne türleri Konya ve çevresi ile Karaman ve çevresinden çiçeklenme dönemlerinde toplanılmıştır ( Daphne oleoides subsp. oleoides Taksonomik Hiyerarşi Kingdom Plantae Subkingdom Tracheobionta Division Magnoliophyta Class Magnoliopsida Subclass Rosidae Order Myrtales Family Thymelaeaceae Genus Daphne Species Daphne oleoidesschreber Subsp. Daphne oleoides subps. oleoides

29 17 Ömür Yapı İlk çiçeklenme zamanı Son çiçeklenme zamanı Habitat Minimumm yükseklik Maksimum yükseklikk Endemiklik Element Türkiye dağılımı Genel dağılımı Çok yıllık Çalı Mayıs Eylül Kireçtaşı, yamaçlar ve kayalar, meşee çalılığı, Pinus nigra ormanları, Astragalus stepleri Endemik değil? Dış ve Orta Anadolu Avrupa, KB Afrika, Lübnan Taksonun Türkiye Üzerinde Dağılımı Şehirler:Bolu, Kastamonu, Antalya, Balıkesir, Burdur, Bursa, Denizli, Erzincan, Gümüşhane, Isparta, Konya, Kütahya, Kahramanmaraş, Niğde, Sivas, Aksaray.

30 18 Şekil 3.1. Daphne oleoides subsp. oleoides Daphne sericea Taksonomik Hiyerarşi Kingdom Plantae Subkingdom Tracheobionta Division Magnoliophyta Class Magnoliopsida Subclass Rosidae Order Myrtales Family Thymelaeaceae Genus Daphne Species Daphne sericea VAHL

31 19 Ömür Yapı İlk çiçeklenme zamanı Son çiçeklenme zamanı Habitat Çok yıllık Çalı Şubat Mayıs kireçtaşı üzerinde, serpantin ve şişt, seyrek Pinus brutia ormanları, Quercus coccifera Minimum yükseklik 0 Maksimum yükseklik 1500 Endemik Element Türkiye dağılımı Genel dağılımı Endemik değil D. Karadeniz KB., B. ve G. Anadolu İtalya, Sicilya, Girit, Latakya ve Lübnan Taksonun Türkiye Üzerinde Dağılımı Şehirler: Adana, Antalya, Bilecik, Bursa, Denizli, Hatay, Isparta, İçel, Kocaeli, Muğla, Samsun.

32 20 Şekil 3.2. Daphne sericea 3.2. Bitkisel Ekstrakların Hazırlanması Bitkisel örnekler toplanıp gölgede kurutulduktan sonra değirmende iyice toz haline getirildi. Toz haline gelen örneklerden yaklaşık 15 g tartılıpsokselet düzeneğinde 6 saat süreyle sırasıyla hekzan, etilasetat, metanol ve etanol ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Ekstraksiyon sonunda ekstraklar filtre kağıdından (Whatman mavi band) süzüldü. Daha sonra çözücü rotary evaporatorde 40 C de tamamen buharlaştırıldı. Ele geçen ham ekstreler antioksidan kapasite testleri uygulanıncaya kadar -20 C de saklandı Antioksidan Kapasitenin Belirlenmesinde Uygulanan Metotlar Toplam fenolik madde tayini (Folin yöntemi) Bitki ekstraklarının konsantrasyonu 2 mg/ml olacak şekilde hazırlandı. Standart olarak kullanılacak olan gallik asidin ise 100 µg/ml konsantrasyonu stok olarak hazırlandı ve bu konsantrasyondan seyreltme ile beş farklı konsantrasyon elde edildi. Bitkisel drogların her bir konsantrasyonundan 200 µl ayrı deney tüpülerine alındı. Daha sonra her bir tüpe 1 ml Folin-Ciocalteu reaktifi ilave edildi. Ardından her bir tüpe 2 ml %7.5 lik Na 2 CO 3 çözeltisinden eklendi ve toplam hacim 7 ml olacak şekilde saf su ilave edildi. Karışım oda sıcaklığında karanlıkta 2 saat bekletildikten sonra 765 nm de absorbansları ölçüldü. Tüm antioksidan kapasite tayin testlerinde spektrofotometrik ölçümler Shimadzu UV-1800 spektrofotometre cihazı kullanılarak gerçekleştirildi. Aynı işlemler standart olarak kullanılan gallik asit için de tekrarlandı. Bitkilerin fenolik madde içeriği gallik asit eş değeri olarak verildi (mg GAE/g) (Slinkard ve Singleton, 1977).

33 Toplam Flavonoid Tayini 2 mg/ml konsantrasyonda hazırlanan bitki ekstrakları (1 ml) aynı miktarda %2 lik AlCl 3 ile karıştırıldı ve daha sonra 10 dakika oda sıcaklığında inkube edildi. Örneklerin absorbansları 415 nm de okundu. Aynı işlemler standart olarak kullanılan rutin içinde yapıldı ve örneklerin flavonoid içerikleri rutine eşdeğer olarak hesaplandı (mgre/g) (Arvouet-Grand ve ark., 1994) Toplam antioksidan kapasitenin belirlenmesi Metodun esası Mo(VI) nın Mo(V) e indirgenmesi ve asidik ortamda yeşil renkli fosfat/mo(v) kompleksinin oluşumuna dayanır. Metotta öncelikle bitki ekstraklarının konsantrasyonları 1 mg/ml olacak şekilde çözeltileri hazırlandı. Standart olarak ise askorbik asit 0.5 mg/ml ile mg/ml arasında beş farklı konsantrasyonda kullanıldı. Metotta kullanılacak reaktif çözeltisi aşağıdaki gibi hazırlandı: 0.6 M H 2 SO 4 çözeltisi: ml H 2 SO 4 alınır ve ml saf su üzerine sızdırılarak ilave edildi. 28 mm Na 2 HPO 4.12H 2 O çözeltisi: g Na 2 HPO 4.12H 2 O tartılıp hacmi saf su ile 25 ml ye tamamlandı. 4 mm Amonyum molibdat çözeltisi: g amonyum molibdat tartılıp hacmi saf su ile 25 ml ye tamamlandı. Bu şekilde hazırlanan çözeltiler bir mezürde karıştırılarak reaktif çözeltisi hazırlanmış oldu. 1 mg/ml konsantrasyonunda bitkisel çözeltilerden 0.3 ml bir tüpe alınıp ve bunun üzerine reaktif çözeltisinden 3 ml eklendi. Tüpler kuvvetlice karıştırılıp 95 C de 90 dakika inkübe edildi. İnkübasyon sonunda çözeltilerin absorbansı 695 nm de okundu. Aynı işlemler standart antioksidan olarak kullanılan askorbik asit için de yapıldı. Antioksidan aktivite askorbik asit eşdeğeri (mgae/g) olarak hesaplandı (Prieto ve ark., 1999) DPPH süpürme etkinliği Bitkisel drogların farklı konsantrasyonlarda çözeltileri hazırlandı. Bunun için öncelikle 0.4 mg/ml konsantrasyonluk çözelti hazırlandı. Bu konsantrasyon seyreltme ile farklı konsantrasyonda çözeltiler hazırlandı (hekzan: µg/ml; diğer

34 22 ekstraklar: µg/ml). Sentetik antioksidan olan BHT ise 3.125µg/ml ile 200µg/ml konsantrasyonları arasında farklı konsantrasyonda hazırlandı. Farklı konsantrasyonlardaki bu bitkisel çözeltilerden 0.5 ml alınıp bunun üzerine 6x10-5 M konsantrasyondaki DPPH çözeltisinden 3 ml ilave edildi. Tüpler ağızları kapatılıp kuvvetlice karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika bekletildi. Bu süre sonunda absorbanslar 517 nm de okundu. Bitkisel çözeltilerin ve standart maddelerin inhibisyonu aşağıdaki denklemden hesaplandı: İnhibisyon(%)=((A kontrol -A örnek )/ A kontrol )x100 Bitkisel çözeltiler ve standart maddelerin konsantrasyon inhibisyon grafiği çizilerek buradan DPPH radikalinin yarısını süpürebilen konsantrasyon hesaplandı (IC 50 ). IC 50 değerinin düşük olması antioksidan kapasitenin yüksek oluşunu göstermektedir (Sarıkürkçü ve ark., 2008) β-karoten/linoleik asit emülsiyon sistemi Bitkisel materyal ve standart antioksidanlar 2 mg/ml konsantrasyonda hazırlandı. Metotta öncelikle emülsiyon çözeltisi hazırlandı. Bunun için 0.5 mg β-karoten 1 ml kloroformda çözüldü. Bu karışıma 25 µl linoleik asit ve 200 mg Tween 40 eklendi. Karışım iyice karıştırıldı. Kloroform rotary evaporatörde 40 C de iyice uçuruldu. Kalan kısım üzerine 100 ml saf su eklendi. Böylece emülsiyon çözeltisi hazırlanmış oldu. 2 mg/ml konsantrasyonundaki bitkisel droglar ve standart maddelerden 350 µl alındı ve bunların üzerine 2.5 ml emülsiyon çözeltisinden ilave edildi. Emülsiyon çözeltisi eklenir eklenmez absorbansları 490 nm de okundu. Daha sonra tüpler oda sıcaklığında 48 saat inkübe edildi. Ayrıca bitkisel materyalin yerine 350 µl metanol eklenip bunun üzerine de 2.5 ml emülsiyon çözeltisi ilave edilerek kontrol çözeltisi hazırlandı. Kontrol çözeltisinin absorbansı da emülsiyon çözeltisi eklenir eklenmez okundu ve aynı şekilde 50 C de 120 dakika inkübe edildi (Sökmen ve ark., 2004) CUPRAC metodu 10-2 M Cu(II) klorür çözeltisi: CuCl 2.2H 2 O den g tartılarak su ile 250 ml ye tamamlanarak hazırlandı. Amonyum asetat tamponu: 1 M (ph=7). NH 4 Ac dan g tartılarak su ile 250 ml ye tamamlanarak hazırlandı.

35 23 Neokuproin çözeltisi: 7.5x10-3 M, Neokuproin (2,9 dimethyl 1-10 phenantroline) den g tartılarak %96 lık etil alkolle 25 ml ye tamamlanarak hazırlandı. Bitki ekstraklarının 50 mg/ml ile 400µg/ml arasındaki beş farklı konsantrasyonları kullanıldı. Metotta öncelikle her bir deney tüpüne 1 ml 10nM CuCl 2, 1 ml 7.5 mm neokuproin, NH 4 Ac buffer (1M, ph 7.0) çözeltisi eklenir. Daha sonra her bir tüpe farklı konsantrasyonlardaki ekstraktlardan 0.5 ml eklenip, toplam havim 4.1 ml olucak şekilde saf su ilave edildi. Tüpler ağızları kapalı bir biçimde oda sıcaklığında karanlıkta 30 dakika beklendi. Aynı işlemler aynı konsantrasyonlarda hazırlanan askorbik asit çözeltileri içinde yapıldı. Bu süre sonunda absorbansları 450 nm de okundu. Testin sonuçlar EC 50 değeri kullanılarak değerlendirildi (Apak ve ark., 2006) İndirgeme gücü (Reducing power) Bu metotta bitkisel ekstrakların 50µg/ml ile 1000µg/ml konsantrasyonları kullanıldı. Standart olarak aynı konsantrasyonlarda gallik asit ve BHT hazırlandı. Farklı konsantrasyonlardaki bitkisel çözeltilerden 2.5 ml alındı. Bunun üzerine 0.2 M ph ml fosfat tamponu ve %1 lik 2.5 ml potasyum ferrisiyanür eklendi. Tüpler 50 C de 20 dakika inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrası tüplerin üzerine 2.5 ml %10 luk TCA ilave edildi. Tüpler iyice karıştırıldıktan sonra üst kısımlarından 2.5 ml başka bir tüpe aktarıldı. Bu tüpün üzerine de 2.5 ml saf su ve 0.5 ml %0.1 lik FeCl 3 çözeltisi eklendi. Çözeltilerin absorbansları 700 nm de okundu (Oyaizu, 1986). Absorbans arttıkça indirgeme gücü de artış göstermektedir. Bitkilerin ve standartların EC 50 değerleri ayrı ayrı hesaplandı. EC 50 değeri absorbansın 0.5 olduğu etkin konsantrasyonu ifade etmektedir ve EC 50 değerinin düşük olması indirgeme gücünün yüksekliğini göstermektedir.