Dr. Aslınur Özkaya Parlakay

Transkript

1 Son Bir Yılda Pediatrik Febril Nötropeni ve Fungal Enfeksiyonlar Moleküler Alanda Heyecanlandıranlar Dr. Aslınur Özkaya Parlakay

2 Nükleik asit tanı testlerinin kullanımı Güç ve yavaş üreyen mikroorganizmalar Mycobacterium tuberculosis Legionella pneumophilia Kültürü yapılması riskli bazı mikroorganizmalar Francisella tularensis Brucella Canlı olmayan mikrooorganizmalar Kültürün doğrulanması

3 Moleküler Tanı Yöntemleri Plazmit analizi DNA dizi analizi Ribotipleme Polimeraz zincir reaksiyonu Ligaz zincir reaksiyonu MTD HBV DNA hibridizasyon HPV DNA ve tiplendirme

4 Nükleik asit tanı teknikleri Hibridizasyon teknikleri Amplifikasyon metodları kadar sensitif değildir. Amplifikasyon teknikleri Sensitivite artırmıştır. Hedef amplifikasyon Polimeraz zincir reaksiyonu; Polymerase chain reaction(pcr) Prob amplifikasyon Sinyal amplifikasyon Bu tekniklerin kombinasyonları

5 HİBRİDİZASYON YÖNTEMLERİ I. Katı fazlı hibridizasyon Dot blot Southern blot Northern blot II. III. Sıvı fazlı hibridizasyon İn situ hibridizasyon

6 AMPLİFİKASYON TEKNİKLERİ Prob amplifikasyonu QB replikaz Ligaz zincir reaksiyonu Sinyal amplifikasyonu branched DNA (Dallanmış problar) Diğer (enzim, radyoizotop, florokrom boya arttırımı) Hedef nükleik asitin çoğaltılması PZR (polimeraz zincir reaksiyonu) TMA (transkripsiyon aracılı çoğaltma) SDA (İplikçik uzaklaştırarak çoğaltma)

7 Nükleik asit tanı teknikleri Hedef amplikasyon PCR - çeşitli mikroorganizmalar NASBA - CMV, HIV-RNA TMA - M.tuberculosis, HCV SDA - C. Trachomatis Prob amplifikasyon LCR Chlamydia Sinyal amplifikasyon bdna - HBV, HCV, HIV

8 Polymerase Chain Reaction (PCR) PCR tekniği ilk kez Dr.Kary B.Mullis, tarafından 1983 yılında bulundu. Kimya Dalında Nobel ödülü, 1993 Bilim adamı, yazar, sörfcü

9 KLASİK PCR PCR sonundaki ürünler (amplikonlar) saptanır; analiz edilir. REAL TIME PCR (GERÇEK ZAMANLI PCR) PCR devam ederken ortaya çıkan ürünler saptanmaya başladığı anda değerlendirmeğe alınır.

10 Klinik bakteriyoloji laboratuvarı Etken bakterinin; izolasyonu, tanımlaması antibiyotik duyarlılığının ve virülans özelliklerinin belirlenmesi izolatların birbirleriyle karşılaştırılması epidemiyolojik analiz

11

12 Konvansiyonel yöntemler Mikroskopi Düşük duyarlılık Kültür Seroloji Yalancı pozitif-negatif sonuçlar Çapraz-özgül olmayan reaksiyonlar Önceki antikor titreleri Akut enfeksiyon tanısında sorunlar

13 Kültür Avantaj Etken izolasyonu yapılabilir Kantitasyon imkanı sağlar Antibiyotik duyarlılık testi yapılabilir Fenotipik ve genotipik özelliklerin belirlenmesine imkan sağlar Dezavantaj Yavaş Sadece kültürde üreyen bakteriler için uygulanabilir Antibiyotik kullanan hastalarda duyarlılık düşüktür 13

14 Klinik bakteriyolojide moleküler yöntemler Etkenin tanımlanması Antimikrobiyal ilaç direnci Epidemiyolojik analiz Patogenez çalışmaları

15 Klinik bakteriyolojide moleküler tanı yöntemleri Kültür güçlüğü olan etkenlerin tanımlanması Negatif kültür Pahalı kültür Yavaş üreyen bakteriler Güç üreyen bakteriler Hücre bağımlı bakteriler Serolojik testlerin sınırlı olduğu durumlar Antibiyotik kullanımı sonrası etken tanımlanma Kültür ve serolojinin negatif olduğu infeksiyonlarda uygun tedavinin yapılabilmesi

16 Klinik bakteriyolojide moleküler tanı yöntemleri Konvansiyonel tanımlama sonuçlarını doğrulama olanağı Kültür pozitif ve/veya seroloji pozitif Güç üreyen ve hücre bağımlı bakteriler için konvansiyonel yöntemlere göre hızlı tanı olanağı Kültür negatif ve/veya seroloji pozitif Kültür negatif ve seroloji negatif Seroloji sonuçlarının doğrulanması Tüm konvansiyonel testlerin negatif olduğu durumda etkenin tanımlanma olanağı

17 Klinik bakteriyolojide moleküler tanı yöntemleri Maliyet etkinlik Kültür+seroloji negatif iken özel testlerin yapılmasına gerek kalmaması Kültür ve seroloji erken ve doğru sonuç verdiği zaman pahalı Uygun antibiyotiğin erken kullanımına imkan sağlaması Maliyeti yüksek cihaz gerekliliği Mekan sorunu Hastanede kalış süresinin kısalması Özel eğitim gerekliliği 17

18 Etken tanımlama Kültürde üreyen bakterinin tanımlanması Klinik örnekten hızlı tanımlama Geç/güç üreyen bakterilerin tanımlanması Kolay üremesine rağmen biyokimyasal olarak reaktif olmayan bakterilerin tanımlanması

19 Etken tanımlama Hangi yöntem? Hibridizasyon Floresan in-situ hibridizasyon (FISH) Peptid nükleik asit floresan in-situ hibridizasyon (PNA- FISH) Nükleik asit çoğaltma Etkene özgü PCR Multipleks PCR Nested/seminested PCR Broad-range PCR RT-PCR Real-time PCR Dizi analizi Microarray Curr Issues Mol Biol 2007,9:21-40

20 Klinik bakteriyolojide moleküler yöntemler Ticari olarak hazırlanmış kitler Standart test prosedürü var FDA onaylı/değil Hedefe özgül kimyasallar Standart test prosedürü yok Uygulama literatür bilgisine göre In-house protokoller Belirli bir laboratuvar tarafından geliştirilmiş Diğer laboratuvarlara dağılım ve satışı yapılamaz Tenover FC: CID 2007;44:418-23

21 Etken tanımlama Kısıtlayıcı unsurlar Örnek kalitesi Ölü/canlı bakteri ayırımı İnfeksiyon/kolonizasyon ayrımı Floralı vücut bölgeleri için sorun Kantitatif sonuç ile sağlanabilir Geri ödemelerde yaşanan sorunlar Pfaller MA:Emerg Infect Dis, 2001,7(2):312 Tenover F:PLoS ONE 2008,2:e1536 Endimiani et al. Glin Inf Dis, 2011:52,S373 17

22 Klinisyenin beklentisi? 24/7 uygulanabilirlik Kısa test süresi Düşük maliyet Klinik düzelme Toplum sağlığı üzerine olumlu etkili ampirik antibiyotik kullanımı antibiyotik kullanım süresi dirençli bakteri seçimi ilaç giderleri Kolonizasyon/infeksiyon ayırımı CID 2011;52(S4):S384-95

23 Kan dolaşımı infeksiyonları ve sepsis En sık görülen 10 ölüm sebebinden biri Tanıda kültür altın standart Pozitif kültürün gram yayma sonucu; 1-3 gün Kültür/antibiyogram sonucu; 3-5 gün Gram yayma sonuçlarının bir saat içinde bildirilmesi mortaliteyi %17 azaltıyor Mancini et al. CMR, 2010, 23 (1):235-51

24 Etken tanımlama Kan dolaşımı infeksiyonları ve sepsis Kan kültürü şişesinden Pasajlardaki zaman kayıplarını engelliyor Pozitif şişe klinik yararlılığı kültür ve hızlı tanımlanma sistemlerinden çok fazla değil Negatif şişe neonatal sepsis ve infektif endokardit» güç üreyen bakteriler için Hasta örneğinden Tam kan/serum/plazma Mancini et al.cmr 2010,23(1):235-51

25 Etken tanımlama Kan dolaşımı infeksiyonları ve sepsis Etkene yönelik inceleme; Oldukça fazla sayıda patojen etken Klinik yararlılığı kısıtlı Temel antibiyotiklere direnç geni aranıyorsa yararlı meca, van Broad-range inceleme; Negatif kan kültürü ve kuvvetli klinik şüphe varlığında yararlı Ek tanımlama yapılmasının gerekliliği dezavantaj Multipleks inceleme; En sık gözlenen etkenlerin hedeflendiği uygulamalar Mancini et al.cmr 2010,23(1):235-51

26 Etken tanımlama Kan dolaşımı infeksiyonları ve sepsis Mevcut ticari sistemler FDA ONAYI OLANLAR

27 Etken tanımlama Kan dolaşımı infeksiyonları ve sepsis Mevcut ticari sistemler Mancini et al.cmr 2010,23(1):235-51

28 Etken tanımlama Kan dolaşımı infeksiyonları ve sepsis PNA-FISH ve Real-time PCR Uygulama ve laboratuvara adaptasyonu kolay Test menüsü dar Maliyet etkinlik için kültürün yayma sonucu gerekli Çoğul hedefler ilave edilerek daha yararlı hale getirilebilir Anal Bioanal Chem (2009) 394:

29 Etken tanımlama Kan dolaşımı infeksiyonları ve sepsis Pozitif kan kültürleri için PNA-FISH S. aureus/cons ayrımı hastane giderlerinde 4000 $/hasta azalma yatış süresinde 2 gün kısalma YBÜ yatış süresinde 7 gün kısalma» hasta başı $ tasarruf» mortalitede %9 azalma Forrest JAC, 2006,58:

30 Etken tanımlama İNFEKTİF ENDOKARDİT %20-25 mortalite Erken tanı ve tedavi önemli % etken belirlenemiyor Tanı için kültür pozitifliği önemli Kültür negatif endokarditler? Seroloji» Akut dönemde? Fenollar F, Raoult D: Int J Antimicrob Agents, 2007,30S:7-15

31 Etken tanımlama İNFEKTİF ENDOKARDİT Kan kültürü negatif endokarditler Rickettsia spp. Coxiella spp. Bartonella spp. Tropheryma whipplei Kan Kapakçık Fenollar F, Raoult D: Int J Antimicrob Agents, 2007,30S:7-15

32 Etken tanımlama Kan dolaşımı infeksiyonları ve sepsis Kan kültürün analitik duyarlılığı ile karşılaştırılabilecek bir yöntem mevcut değil Çoğul hedefli ve direnç hakkında bilgi veren yöntemler avantajlı Kısıtlı sayıda bakteri için mevcut Genetik hedef bilgisi olmadan etkenleri ayırt eden çözümler en çok arzu edilenler Fenollar F, Raoult D: Int J Antimicrob Agents, 2007,30S:7-15

33 Kültür Etken tanımlama Bakteriyel menenjitler Altın standart BOS PML >1000/mm 3 ve hasta antibiyotik almamışsa duyarlılık %80 H. influenzae %96 S. pneumoniae %87 N. meningitidis %80 J Infect 1983, 7:

34 Etken tanımlama Bakteriyel menenjitler 139 bakteriyel menenjit olgusu 94 kültür pozitif 12 yayma pozitif 33 klinik bulgu Duyarlılık ; Özgüllük ; Multipleks PCR H. influenza % 88 S. pneumoniae % 92 N. meningitidis % 94 %100

35 Etken tanımlama Bakteriyel menenjitler 35

36 Etken tanımlama Bakteriyel menenjitler

37 Etken tanımlama Bakteriyel menenjitler Gram yayma halen hızlı ve önemli bir tanı yöntemi Etken tanımlanmasında PCR kullanımı giderek artıyor Antibiyotik direnci belirlenemiyor Moleküler yöntemler daha kolay ulaşılabilir olursa standart hale gelebilir Daha çok validasyon çalışmalarına gerek var Kültür; etken tanımlama ve direnç belirleme olanakları ile halen altın standart

38 Etken tanımlama Tüberküloz Tanının doğrulamasında kültür altın standart Antibiyotik duyarlılık testi Genotipleme NAAT ile saatte sonuç alınıyor FDA onaylı testler; Amplified M. tuberculosis Direct Test (MTD, Gen-Probe, San Diego, California) 1995 de yayma pozitif solunum yolu örnekleri için onay aldı 1999 da yayma negatif solunum yolu örnekleri için onay aldı Amplicor Mycobacterium tuberculosis Test (Amplicor, Roche Diagnostics, Basel, Switzerland) 1996 yayma pozitif solunum örnekleri için onay aldı. FDA onayı olmamasına rağmen klinik olarak kullanılmakta olan testler de mevcut

39 Etken tanımlama Tüberküloz CDC önerisi; En az bir örnek FDA onaylı bir kit ile çalışılmalı Sonuçları yayma ile değerlendirilmeli Yayma (+) ve NAT (+); tedaviye başla Yayma (+) ve NAT (-); tedaviye başlama veya testin yenilenmesi yönünde karar verilmesi gerekli

40 Etken tanımlama Tüberküloz CDC önerisi; Yayma (+) ve NAT (-) ise; İnhibitörler gözden geçirilmeli» İnhibitör varsa NAAT testlerinin tanısal yararlılığı yok» İnhibitör yoksa, ikinci örnekte aynı sonuç elde edilirse MOTT ile infeksiyon düşünülür Yayma (-) ise; FDA onayı olmayan kitlerin duyarlılığı düşük

41 Etken tanımlama Tüberküloz PLoS ONE 2008;2:e1536

42 Etken tanımlama Tüberküloz 84 farklı çalışma Duyarlılık (% ) ve özgüllük (% ) heterojen Klinik yararlılığı kısıtlıyor Nested PCR ve hedef IS6110 ise tanısal yarar artıyor

43 Etken tanımlama Tüberküloz Moleküler yöntemler tanı hızını arttıyor EZN ve kültürün yerini alabilmiş değil Canlı/ölü bakteri ayırımınınyapılamaması tedavinin değerlendirilmesinde eksik yönü Direnç belirleme olanağı kısıtlı Sonuçların doğru yorumlanması önemli

44 Direnç genlerinin belirlenmesi

45 Hastane İnfeksiyonları

46 Hastane İnfeksiyonları

47 Salgın incelenmesi Random amplifed polymorphic DNA (RAPD) Pulse field gel electrophoresis(pfge) Multilocus sequence typing (MLST)

48 Patogenez çalışmaları Moleküler Koch Postulatı Araştırılan fenotip veya özellik, bir türün patojen suşlarıyla ilişkili olmalıdır Araştırılan virülans özellikleriyle ilişkili gen/genlerin inaktivasyonu, virülansta ölçülebilir azalmaya yol açmalıdır Mutant genin wild type gene geri dönümü ise virülans eski haline dönmelidir

49 1416 hasta 907 sepsis 440 febril nötropeni 222 kontrol dönemi 218 PCR 69 enfektif endokardit 18 üniversite hastanesi, 55 serviste 6 ay müdahale 6 ay kontrol dönemi CE IVD LightCycler SeptiFast test (LSF; Roche Diagnostics, Meylan, France)

50 Primer kazanç: mikrobiyolojik olarak enfeksiyon dokümantasyonu Sekonder kazanç: patojen tespiti Tüm popülasyonda ve ciddi sepsiste mikrobiyolojik olarak enfeksiyon dokümantasyonu anlamlı olarak farklı Febril nötropeni PCR döneminde %32.1, kontrol döneminde %30.2 Gram negatif basil tayini anlamlı düzeyde farklı Ciddi sepsiste patojen saptanması anlamlı olarak farklı Patojen saptanma süresi kısalmış Bakteriyemiye uygun ab tedavisi anlamlı olarak farklı

51 Ocak 2013 Haziran episodda 39 (%45), en sık rinovirüs, ort 28 gün sonra tekrar örnek %78 inde düzelmiş

52 319 çocuk hastanın, 17 respiratuvar virüs çalışma sonucuna göre pozitif saptanan 176 sı, randomize, bakteriyel etken gösterilemediyse, antibiyotikten sonraki 48 saat iyiyse antibiyotik kesilmiş (84 hasta) veya devam edilmiş (92 hasta), yatış, ateş ve bakteriyel enfeksiyon oranları benzer, mortalite yok, sadece 1 hasta sepsis

53 Viral PCR CMV, VZV EBV Parvovirüs B19 HBV HCV HIV BK virus JC virüs Adenovirüsler Herpes virüsler (HHV 6,7,8, HSV 1&2)

54 Fungal enfeksiyonlar PCR arası 262 yayın, Minimum Information for Publication of Quantitative Real Time PCR Experiments guidelines sağlayan 68 yayın 33 yayında Aspergillus sensitivitesi % spesifisite % 6 yayında Candida sensitivitesi % spesifisite % 13 yayında Pneumocystis sensitivite % spesifisite % 14 yayında Diğer fungal enfeksiyonlar için sensitivite % spesifisite Aynı değerlendirme 2012 de yenilendiğinde 512 yayın Mengoli metanalizde, 16 çalışma değerlendirldiğinde PCR sensitivitesi %88, spesifisitesi 75%

55 Arvanitis et al 2014, sensitivite %, spesifisite %, tam kan> serum

56

57

58 Pnömoni varlığında, BAL da PCR bakılması tanıyı %10 30 arttırmaktadır Kadmon G, Nahum E, Sprecher H, Stein J, Levy I, Schiller O, Schonfeld T. Pediatr Pulmonol Oct;47(10):

59 ECIL recommendations for the use of biological markers STRONG EVIDENCE Galactomannan detection in serum (A II) Cryptococcus antigen in serum and CSF (AII) MODERATE EVIDENCE (1 3)-β-D-glucan detection in serum (BII) Combined mannan/anti-mannan testing for hepatosplenic candidiasis (BIII) and candidemia (CII) NO RECOMMENDATIONS PCR Need for randomized controlled studies to define clinical utility in guiding patients management. Role and cost-effectiveness in providing a more rapid and accurate diagnosis of IFI. Early initiation of appropriate antifungal therapy Reducing the empirical use of antifungal drugs in patients without IFI O. Marchetti et al., Bone Marrow Transplantation 2012, 47:

60 SONUÇ Klinik mikrobiyolojide moleküler yöntemler; Son 10 yılda infeksiyonların tanısında önemli hale geldi Çok yakın gelecekte konvansiyonel yöntemlerin yerini alacak gibi değil Array ve real-time PCR teknikleri çoğu patojenin tanımlanmasında önemli yer tutacak Otomasyondaki gelişmeler ve maliyet azalması rutin laboratuvara girmelerini kolaylaştıracak 61

61 Moleküler Yöntemler Avantajlar HIZLI DUYARLI TANI KOYDURUCU Dezavantajlar PAHALI LABORATUVAR DONANIMI DENEYİMLİ PERSONEL

62 TEŞEKKÜRLER TEŞEKKÜRLER