ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ. TÜRKİYE KAYNAKLI Salmonella İZOLATLARININ ANTİBİYOTİK

Transkript

1 ANKARA ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ YÜKSEK LİSANS TEZİ TÜRKİYE KAYNAKLI Salmonella İZOLATLARININ ANTİBİYOTİK DİRENÇ ÖZELLİKLERİNİN GENOMİK ANALİZİ Mine GÜNEŞ BİYOLOJİ ANABİLİM DALI ANKARA 2012 Her hakkı saklıdır

2 ÖZET Yüksek Lisans Tezi TÜRKİYE KAYNAKLI Salmonella İZOLATLARININ ANTİBİYOTİK DİRENÇ ÖZELLİKLERİNİN GENOMİK ANALİZİ Mine GÜNEŞ Ankara Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoloji Anabilim Dalı Danışman: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK Çalışmamızda Türkiye den izole edilen ve White-Kauffmann-Le Minor antijenik şemasına göre S. enterica serovar Typhimurium 4,[5],12:i:1,2 sınıfına dahil edilen iki izolat ve bir Salmonella spp. suşunda, disk difüzyon ve mikrodilüsyon yöntemleri kullanılarak antibiyotik dirençlilik düzeyleri belirlenmiştir. Yapılan çalışma sonucunda tüm suşlar için sulfametaksazol direnci (R>1024), yalnızca bir S. Typhimurium suşu için spektinomisin (R=512 µg/ml), streptomisin (R=128 µg/ml), sulfanilamid (R=512 µg/ml) ve sulfadiazin (R=512 µg/ml) dirençleri saptanmıştır. Antibiyotik dirençliliğin genetik bağının araştırılması amacıyla sınıf I integron analizleri, PZR yöntemi kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sınıf 1 integron varlığı tespit edilen suşlar arasında bant büyüklükleri açısından karşılaştırma yapılmış ve sonuçlar dizi analizi ile de desteklenmiştir. S. Typhimurium spesifik olan IS200 elementinin belirlenmesi amacıyla flja-fljb intergenik bölgelerinde PZR yöntemi kullanılarak analiz yapılmış ve bu analiz sonucunda IS200 elementi taşıyan S. Typhimurium suşlarında 1000 bç büyüklüğünde bir bölge, Salmonella spp. suşunda ise 250 bç büyüklüğünde bir bölge tespit edilmiştir. Dizi analizi sonucunda bu bölgelerin istenilen bölge ile eşleştiği görülmüştür. Ayrıca; evrimsel süreçte kazanılan patojenite adalarının varlığı baz alınarak S. Typhimurium suşlarında; trna bölgelerine özgü primerler ile trna thrw bölgesi PZR yöntemi kullanılarak taranmış ve bu tarama sonucunda S. Typhimurium suşlarında thrw bölgesinin uç kısmında 18 kb büyüklüğünde bir genomik adayla eşleşen bir bölge tespit edilmiştir. Şubat 2012, 59 sayfa Anahtar Kelimeler: Salmonella, çoklu ilaç dirençlilik, genetik karakterizasyon i

3 ABSTRACT Master Thesis GENOMIC ANALYSIS OF ANTIBIOTIC RESISTANCE PROPERTIES OF Salmonella ISOLATES ORIGINATED FROM TURKEY Mine GÜNEŞ Ankara University Graduate School of Natural and Applied Sciences Department of Biology Supervisor: Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK In our studies, antibiotic resistance patterns of three Salmonella isolates originated from Turkey classified as S. enterica serotype Typhimurium 4,[5],12:i:1,2 according to White Kauffmann-Le Minor antigenic formula two isolates and a Salmonella spp. strain were analyzed with disc diffusion and dilution methods. We have determined resistance for sulfamethoxazol in all strains (R>1024 µg/ml), while spectinomycin (R=512 µg/ml), streptomycin (R=128 µg/ml), sulfanilamid (R=512 µg/ml) and sulfadiazine (R=512 µg/ml) resistances determined in only one S. Typhimurium strain. These Class I integron analysis were used to investigate the genetic basis of antibiotic resistance by using polymerase chain reaction (PCR) method. Sizes of amplicons were compared between strains which were determined to have class I integron and these results were verified with sequence analysis. The flja-fljb intergenic region was analyzed to determine S. Typhimurium specific IS200 element with PCR. This analysis revealed a 1000 bp amplicon in S. Typhimurium strains which carried IS200 element and a 250 bp amplicon was detected in Salmonella spp. strain. Sequence analysis confirmed that these regions matched to the estimated regions. Moreover, anticipated pathogenesis islands that occurred during evolution of S. Typhimurium strains were analyzed with PCR using primers specific to the trna and trna thrw regions. Results revealed a region matching to a 18 kb island at the edge of the thrw region of S. Typhimurium strains. February 2012, 59 page Key Words: Salmonella, multi drug resistance, genetic characterization ii

4 TEŞEKKÜR Çalışma konusu ve seçiminde, çalışmanın planlanmasında ve değerlendirilmesinde yardım ve eleştirileri ile bana yol gösteren, bilgi ve tecrübelerini benimle paylaşan danışman hocam sayın Prof. Dr. Mustafa AKÇELİK e (Ankara Üniversitesi Biyoloji Anabilim Dalı) ve çalışmam süresince yardımını esirgemeyen Dr. Nefise AKÇELİK e teşekkür ederim. Ayrıca tezimin deneysel kısımlarında, elindeki tüm imkanları benim için seferber eden, titizlikle ve özenle bana yardımcı olan Ankara Üniversitesi Biyoloji Bölümü Prokaryot Genetiği Laboratuarında çalışmalarına devam eden arkadaşlarıma teşekkürlerimi sunarım. Çalışmam boyunca bana ellerinden gelen yardımı yapan ve destek veren ablam Arzu GÜNEŞ e ve Fatma GÜNEŞ e, annem Tuncay GÜNEŞ e her koşulda yanımda oldukları için teşekkür ederim... Mine GÜNEŞ Ankara, Şubat 2012 iii

5 İÇİNDEKİLER ÖZET. i ABSTRACT... ii TEŞEKKÜR... iii KISALTMALAR DİZİNİ vi ŞEKİLLER DİZİNİ. viii ÇİZELGELER DİZİNİ... ix 1. GİRİŞ KURAMSAL TEMELLER Salmonella Cinsinin Genel Özellikleri Salmonella 4,[5],12:i- nin Serolojik Karakterizasyonu Salmonella 4,[5],12:i:- nin Dünya Genelinde Yayılışı Salmonella 4,[5],12:i:- nin Genetik Karakterizasyonu Salmonella 4,[5],12:i:- deki Monofazik Fenotipin Genetik Temelleri Salmonella da Antimikrobiyal Direnç Mekanizmaları jSalmonella da Antibiyotik Dirençliliğinin Yatay Gen Taransferi ile Aktarımı Plazmidler Transpozonlar İntegronlar Gen Kasetleri Salmonella Patojenitesinin Evrimi Ve Patojenite Adalarının Rolü MATERYAL VE YÖNTEM Materyal Mikroorganizmalar Mikroorganizmaların saklama koşulları Besiyerleri Antibiyotikler Çözeltiler Primerler Yöntem iv

6 3.2.1 Disk difüzyon yöntemi Minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) metodu Genomik DNA izolasyonu flia-flib intergenik bölgelerinin tanımlanması ve DNA dizi analizleri İntegron analizleri Primer dizaynı ve polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) İntegron bantlarının tanımlanması ve DNA dizi analizleri t-rna bölgelerinin analizi ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA S. Typhimurium Suşlarının Antibiyotik Duyarlılıkları Salmonella Suşlarında Sınıf I İntegron Analizleri flja-fljb İntergenik Bölgelerin Analizi t-rna Bölgelerinin Araştırılması SONUÇ.. 45 KAYNAKLAR.. 46 EK 1 PZR Veri Analizi Sonuçları ÖZGEÇMİŞ.. 59 v

7 KISALTMALAR DİZİNİ P Ampisilin Bç Baz çifti C Santigrat CDC Hastalık Koruma ve Korunma Merkezi CHL Kloramfenikol CIP Siprofloksasin CLSI Klinik Laboratuar Standartları Enstitüsü DNA Deoksiribonükleik asit dntp Deoksinükleotidtrifosfat EDTA Etilen Diamin Tetraasetik Asit EFT Seftiofur FFC Florfenikol G Gram GEN Gentamisin KAN Kanamisin Kb Kilo baz L Litre LB Luria Bertani M Molar µg Mikrogram Mg Miligram MHB Müller Hinton Broth MİK Minimal İnhibisyon Konsantrasyonu µl Mikrolitre ml Mililitre mm milimolar NAL Nalidiksik asit NEO Neomisin ORF Açık okuma kalıbı PZR Polimeraz Zincir Reaksiyonu vi

8 S. Salmonella SDS Sodyum Dodesil Sülfat SGI Salmonella Genomik Adası SPE Spektinomisin SPI Salmonella Patojenite Adası STR Streptomisin SUL Sulfonamid SX Sulfametoksazol SXT Trimetoprim/sulfametoksazol TAE Tris Asetat Etilen Diamin Tetraasetik Asit TE Tris Etilen Diamin Tetraasetik Asit TET Tetrasiklin TMP Trimetoprim UV Ultraviyole WHO Dünya Sağlık Örgütü vii

9 ŞEKİLLER DİZİNİ Şekil 2.1 Salmonella da Sınıf I integronun genel şeması Şekil 2.2 Salmonella türleri ve alttürleri arasında filogenetik akrabalılıkları gösteren dendogram Şekil 3.1 Salmonella da fljb-fljc bölgelerinin moleküler organizasyonu. 27 Şekil 3.2 Sınıf I integronların moleküler organizasyonu.. 28 Şekil.4.1.S. Typhimurium suşlarının disk difüzyon yöntemi ile tanımlanan antibiyotik duyarlılıkları Şekil 4.2 Sınıf I integronların bant profilleri.. 38 Şekil 4.3 Salmonella suşlarında flja-fljb intergenik bölgelerin analizi. 40 Şekil 4.4 Salmonella da thrw t-rna lokusu için bant profilleri 42 Şekil 4.5 Salmonella da thrw lokusunun üstakış bölgesinin bant profili Şekil 4.6 Salmonella da thrw lokusunun alt akış bölgesi bant profili viii

10 ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan antibiyotik ve konsantrasyonları Çizelge 3.2 Primer dizilimi ve PZR koşulları Çizelge.3.3..Minimal inhibisyon konsantrasyonu (MİK) kuyucuk test planı ve analizlerinde kullanılan antibiyotik konsantrasyonları 25 Çizelge 4.1 S. Typhimurium suşlarının antibiyotik duyarlılıkları (Disk Difüzyon Sonuçlar). 35 Çizelge 4.2 S. Typhimurium suşlarının antibiyotik duyarlılık düzeyleri (µg/ml) 36 ix

11 1. GİRİŞ Salmonella cinsi; Enterobacteriaceae familyasına ait, Gram-negatif, spor oluşturmayan, fakültatif anaerobik, hareketli ve çubuk şeklinde bakterilerdir. Salmonella ilk olarak 1880 yılında Eberth tarafından tanımlanmıştır ve 1884 yılında Gaffky tarafından kültüre alınmıştır (Burrows 1959). Bu cinsi oluşturan bakteriler üç farklı antijene sahiptir. Aglütinasyon özelliklerine göre somatik O, flagellar H ve kapsüler Vi antijenleri, Salmonella nın 2500 ün üzerinde serolojik olarak farklı tipinin ayrımında kullanılmaktadır. Her yıl White-Kauffman şemasının düzenlenmesiyle yeni serotiplerin ilavesi gerçekleştirilmektedir (Popoff vd. 2001). Belirlenen serotiplerin büyük bir çoğunluğunda, patojenitenin moleküler mekanizması üzerine çok az sayıda çalışma bulunmaktadır (Tindall vd. 2005, Gibson vd. 2006). Salmonella esas olarak insan ve hayvanların bağırsak sisteminde bulunan bir patojendir. Bazı Salmonella üyeleri konağa adapte olmuş ya da konak spesifiktir. Bunun en tipik örneği insanları enfekte edebilen S. Typhi dir. Konak spesifik diğer serovaryeteler: Paratyphi ve Sendai (insan), Pullorum ve Gallinarum (kanatlılar), Dublin (sığırlar), Choleraesuis (domuzlar, ancak insanları da enfekte edebilmektedir), Typhimurium ve Enteritidis (insan, sığır, kanatlılar, koyun, domuz, at ve yabani kemirgenlerde ana hastalık etmenleridir) tir (Singleton ve Sainsbury 1996, Wain vd. 2005). Salmonella enterica enfeksiyonu halk sağlığı için dünya çapında önemli bir risk kaynağıdır. Yalnız Amerika da her yıl hastane vakası ve 585 ölümle sonuçlanan yaklaşık 1. 4 milyon Salmonella enfeksiyonlu hasta olduğu tahmin edilmektedir (Mead vd. 1999, Voetsch vd. 2004). İnsan salmonelloz hastalığının yaklaşık olarak %95 i et, kümes hayvanları, yumurtalar, süt, deniz ürünleri ve hazır gıdalar gibi kontamine ürünlerin tüketimiyle ilişkili bulunmaktadır. Salmonella; gastroenterit, bakteremi, abdominal ağrı, bulantı, kusma, diare ve başağrısı ile karakterize edilen gastroenterite bağlı tifoidal ateşi kapsayan 1

12 birçok farklı hastalık sendromlarına neden olabilmektedir. Enfeksiyonun tedavisinde genellikle antimikrobiyal terapi uygulanmaktadır (Foley vd. 2007). Salmonellozun kontrolü ve tedavisinde karşılaşılan en ciddi sorun, Salmonella suşlarında giderek artan ilaç dirençlilik özelliği ve buna paralel olarak gelişen çoklu ilaç dirençli epidemik tiplerdir. Zira özellikle bakteriyel patojenlerde, tedavide yaygın antimikrobiyel ajan kullanımına bağlı olarak direnç gelişimi teşvik edilmekte ve bu durum salgınların kontrolünü zorlaştırmaktadır. Gerek mutasyonlar ve gerekse de yatay gen transferi ile antimikrobiyel ajanlara karşı direnç kazanan bakteriler, ortamda bulunan antibiyotikten etkilenmeksizin gelişmekte ve populasyonda baskın hale gelmektedir. Özellikle plazmidler, transpozonlar ve integronlar aracılığı ile meydana gelen yatay gen transferi, kazanılan antibiyotik dirençliliğin hızla yayılmasına neden olmaktadır. Bu hareketli DNA elementleri arasında yer alan integronlar birden fazla antibiyotik direnç gen kasetini yapısında bulundurabilmeleri sebebiyle son yıllarda antibiyotik dirençlilik çalışmalarının odak noktasını oluşturmuştur (Foley vd. 2007). Çalışmamızda; Türkiye den izole edilen ve White-Kauffmann-Le Minor antijenik şemasına göre S. enterica serovar Typhimurium 4,[5],12:i:1,2 sınıfına dahil edilen iki izolatın ve bir Salmonella spp. suşunun antibiyotik direnç profilleri belirlenmiş, integron analizlerinin gerçekleştirilerek, bu elementlerin antibiyotik dirençlilik özelliği ile genetik bağı tanımlanmıştır. Ayrıca çalışılan suşlarda t-rna bölgelerinin evrimsel açıdan önem arz eden thrw lokusu ve bu lokus yakınında bulunan 18 kb lık bir genomik adanın varlığı tespit edilmiş ve evrimsel açıdan suşlar arasında karşılaştırma yapılmıştır. 2

13 2. KURAMSAL TEMELLER 2.1 Salmonella Cinsinin Genel Özellikleri Salmonella spp. dünya genelinde bir çok hastalığa ve ölümlere neden olan gıda kaynaklı bakteriyel bir patojendir. Salmonella cinsi üyeleri; Gram negatif, fakültatif anaerobik, spor oluşturmayan, hareketli ve çubuk formunda bakterilerdir. Salmonella cinsi S. enterica ve S. bongori olmak üzere iki tür içermektedir. S. enterica; alt tür I (enterica), II (salamae), IIIa (arizonae), IIIb (diariizonae), IV (houtenae) ve VI (indica) olmak üzere altı alt türe ayrılmaktadır. Salmonella izolatlarının karakterizasyonunda; alt tiplendirme ve suş ayrımı için serotiplendirme; Kauffmann- White şeması esas alınarak yapılmaktadır (Kauffmann 1965b, Center of Diseases and Control (CDC) 2003, Foley vd. 2007). Bu esasa göre Salmonella cinsinde 2500 ün üzerinde serotip tanımlanmıştır. Serotiplendirme; lipopolisakkaritler (O antijeni), flagellar proteinler (H antijeni) ve kapsüler polisakkaritler (V i antijeni) in antijenik çeşitliliği üzerinden gerçekleştirilmektedir. Birçok Salmonella suşu bakteriyel kromozom üzerinde iki farklı flagellin geni (flic ve fljb) tarafından kodlanabilen peritrik flagella ile hareket etmektedir. flic ve fljb nin ifadesi faz varyasyonu olarak adlandırılan bir mekanizmayla regüle edilmektedir. Salmonella serotiplerinin çoğunluğu bifaziktir. Bazı Salmonella suşları ise monofazik yapıda olabilmektedir. Örneğin Salmonella serotip 4,[5],12,i:- faz 2 flagellanın ifadesinden yoksundur (Switt vd. 2009). 2.2 Salmonella 4,[5],12:i- nin Serolojik Karakterizasyonu Salmonella serotiplerinin birçoğu isimlendirilirken (serotip Typhimurium, Newport vb.), yeni izole edilen serotipler; alt tür ismi (örnek; Alt tür I: enterica), O antijeni, faz 1 H antijeni ve faz 2 antijeni olmak üzere 4 özellik esas alınarak; antijenik formülleri ile tanımlanmaktadır (Brenner vd. 2000). Bu şemaya göre I 4,[5],12:i:1,2 olarak formüle edilen Salmonella Typhimurium a bakıldığında; I; enterica alt türünü, 4, 5, 12; O antijenini, i; faz 1 H antijenini ve 1,2; faz 2 H antijenini taşıyan bir serotip olduğunu göstermektedir. Salmonella 4,[5],12:i-; O antijenleri ve faz I H antijenleri bakımından Salmonella Typhimurium ile aynı profile sahiptir. Salmonella Lagos (4,[5],12:i:1,5) da 3

14 Salmonella 4,[5],12:i- gibi aynı O antijenleri ve faz 1 H antijenine sahiptir (Switt vd. 2009). Moleküler alt tip analizleri sonucunda Salmonella 4,[5],12:i:- ile Salmonella Typhimurium arasında önemli benzerliklerin belirlenmesine karşın, Salmonella 4,[5],12:i:- ile Salmonella Lagos arasında herhangi bir benzerlik tanımlanamamıştır (Guerra vd. 2000a, Echeita vd. 2001). Salmonella 4,[5],12:i:- ve Salmonella Typhimurium genetik olarak yüksek derecede benzerdirler ve aynı serotiplere sahiptirler. 4,[5],12:i:- nin faz 2 flagelladan yoksun oluşu, Salmonella 4,[5],12:i:- nin Salmonella Typhimurium un monofazik varyantı olduğu hipotezine öncülük etmektedir (Echeita vd. 2001). 2.3 Salmonella 4,[5],12:i:- nin Dünya Genelinde Yayılışı 1990 yılına dek 4,[5],12:i:- serotipi ile ilgili az sayıda yayın bulunurken; 20. yüzyılın ortalarında bu serotipi temsil eden izolatlar ile ilgili çok sayıda araştırma yayınlanmıştır. Edwards ve Bruner (1946) yaptıkları araştırma sonucunda günümüzde 4,[5],12:iserotipi olarak isimlendirilen ve faz 1 antijenini içeren üç Salmonella Typhimurium izolatını tanımlamışlardır. Kaufmann 1965 yılında yayınladığı H serumunun hazırlanmasında Monofazik Salmonella Kültürleri isimli makalesinde bir adet Monofazik Salmonella Typhimurium izolatı hakkında bilgi vermiştir (Kauffmann 1965a) yılından önce bu serotipin nadir olarak izole edilmesi, bu serotipin son yıllarda ortaya çıktığını ve/veya yayıldığını göstermektedir. 4,[5],12:i- serotipi günümüzde hala hatalı olarak Salmonella Typhimurium grup B ya da alt tür I olarak bilimsel makalelerde karşımıza çıkmaktadır (CDC 2003) yılından günümüze kadar pek çok ülkede Salmonella serotip 4,[5],12:i- izolasyonu gerçekleşmiştir. Asya da ilk olarak 1993 yılında Tayland da dondurulmuş tavuk etinden 8 adet ve klinik hastalardan 52 adet 4,[5],12:i- serotipi izole edilmiştir (Boonmar vd. 1998). Salmonella ile yürütülen bir başka araştırmada ise yine Tayland da yılları arasında septisemili 741 hastanın % 8.2 sinin kanından Salmonella 4,[5],12:iserotipi izole edilmiştir (Komolpis vd. 1999). Yine Asya- Taiwan da araştırıcılar 4

15 tarafından insan kaynaklı örneklerden 4,[5],12:i- serotipinin izole edildiği belirtilmiştir (Chiu vd. 2006). Avrupa daki ilk S.enterica subsp. enterica serovar 4,[5],12:i:- izolatlarından biri 1986/87 de Portekiz de bir tavuk karkasından izole edilmiştir (Machado ve Bernardo 1990). Daha sonra; İspanya da ilk olarak 1997 yılında belirlenmesinin ardından izole edilen 4, [5],12:i- serotipinin sayısı önemli ölçüde artmıştır (Echeita vd. 1999). İlerleyen zamanda serotip 4,[5],12:i-; İspanya da izole edilen domuz etinde en sık rastlanan ikinci serotip haline gelmiştir (De la Torre vd. 2003). Bu gözlem sonucunda domuzların bu serotip için rezervuar olduğu düşüncesi doğmuştur (De la Torre 2003). Ayrıca 4,[5],12:i:- izolatının Almanya (Guerra vd. 2004), Portekiz (Vieira-Pinto vd. 2005) ve Lüksemburg un (Mossong vd. 2007) yanı sıra Danimarka, Bulgaristan, Slovakya dan da izole edildiği rapor edilen bu ülkeler Dünya Sağlık Örgütü (WHO) Küresel Salmonella İzleme Sistemi listesinde yer almaktadır (WHO 2008). Lüksemburg da 2006 yılında serotip 4,[5],12:i:- ile kontamine olmuş domuz eti tüketimine bağlı olan en az iki Salmonella salgını gerçekleşmiştir (Mossong vd. 2007). Amerika da 1995 yılında; serotip 4,[5],12:i:- serotipi insan klinik izolatlarının % 0.2 sini oluştururken, 2004 yılında bu rakamın % 2.1 e çıktığı belirtilmiştir (Grenne vd. 2006). CDC raporlarına göre; serotip 4,[5],12:i:- nin, 2002 yılında hastalarda en sık rastlanan onsekizinci, 2005 yılında ise altıncı serotip olduğu saptanmıştır (CDC 2005). 2.4 Salmonella 4,[5],12:i:- nin Genetik Karakterizasyonu Salmonella 4,[5],12:i:- izolatlarının karakterizasyonu için birçok çalışmada dalgalı jel elektroforezi (PFGE), çoklu lokus dizi tiplendirmesi (MLST), faj tiplendirme gibi çok sayıda farklı yöntem kullanılmıştır (Echeita vd. 2001, Agasan vd. 2002, De la Torre vd. 2003, Amavisit vd. 2005). Bu araştırmaların çoğundan elde edilen bulgular sonucunda Salmonella 4,[5],12:i:- izolatlarının, Salmonella Typhimurium a yakın akraba olduğu belirlenmiş ve 4,[5],12:i:-; serovaryete Typhimurium un monofazik varyantı olduğu öngörülmüştür (Switt vd. 2009). 5

16 İspanya da 13 adet 4,[5],12:i:- izolatının karakterizasyonunda, bu izolatlar iki S. Typhimurium faj tip DT 104 ve iki U 302 izolatı ile birlikte (fljb nin üst sentez bölgesindeki IS200 elementinin varlığını tespit etmek amacıyla) 1000 bç lik bir flja-fljb polimeraz zincir reaksiyon (PZR) ürünü elde edilmiştir. Aynı primerler Salmonella Lagos ve diğer serovaryeteleri temsil eden izolatlarda 250 bç lik bir bölgeyi çoğalttığı saptanmıştır. Bu da fljb geninin üst sentez bölgesinde IS 200 elementinin olmadığını göstermektedir. Birçok ülkede Salmonella 4,[5],12:i:- izolatının karakterizasyonu çalışmaları bu serotipin S. Typhimurium serotipinden son yıllarda evrimleştiği hipotezini desteklemektedir (Switt vd. 2009). 2.5 Salmonella 4,[5],12:i:- deki Monofazik Fenotipin Genetik Temelleri Salmonella genomunda flagellar yapıyı ve fonksiyonunu kodlayan 50 gen bulunmaktadır. Bu flagellar genler toplamda 14 operondan oluşmaktadır. Operonların çoğu kromozom üzerinde 4 bölgede kümelenmiştir. Transkripsiyonel yakınlıkları esas alınarak; flagellar operonlar üç sınıfta toplanmıştır. Sınıf I; sınıf II nin ifadesini sağlayan ürünleri kodlayan flhd operonunu temsil etmektedir. Sınıf II; bazal yapıların fonksiyonundan ve kıvrımlı bazal gövde kompleksinden sorumlu operonları içermektedir. Sınıf III ise; filament yapısı, flagella rotasyonu ve kemotaksiden sorumlu operonlardan oluşmaktadır (Ikebe vd. 1999). S. Typhimurium da flagellar faz varyasyonu, sınıf III operonlardaki genleri kapsamaktadır (Ikebe vd. 1999) ve flagellin proteinlerin kodlanmasından sorumlu flic ve fljb genlerinden birinin transkripsiyonunu sağlamaktadır. flic geninin hücresel ifadesi faz I olarak adlandırılırken; fljb geninin hücresel ifadesi ise faz II olarak adlandırılmaktadır. Flagellar faz varyasyonu fljb promotorunu içeren bir DNA bölgesinin dönüşümlü olarak ifade edilmesi ile oluşmaktadır (Örnek; H segmenti) (Yamamoto ve Kutsukake 2006). H segmenti; ters tekrar dizileri hixl ve hixr nin yanında bulunmaktadır. hixl ve hixr arasındaki bölge spesifik rekombinasyon, H inversiyonuna öncülük etmektedir. Bu rekombinasyon olayı hin geni tarafından kodlanan bir DNA invertaz ile katalizlenmektedir. Hin geni H segmenti içerisinde lokalize olmaktadır. flic nin ifadesinde negatif regülatörü kodlayan flja geni, fljb nin alt akış bölgesinde lokalize olmaktadır. H segmenti açık pozisyonda 6

17 olduğunda; her iki fljb ve flja transkribe edilir ve böylece flic, flja tarafından baskılanmış olur (Aldridge vd. 2006; Yamamoto ve Kutsukake 2006). Bu faz değişimi; hücre jenerasyonu başına oranında gerçekleşmektedir. (Yamamoto ve Kutsukake 2006). Serotip 4,[5],12:i:- izolatları faz II flagellanın ifadesinden yoksun oluşuyla fenotipik olarak karakterize edilmektedir (Switt vd. 2009). 2.6 Salmonella da Antimikrobiyal Direnç Mekanizmaları Salmonella da antimikrobiyal dirençlilikteki artış; halk sağlığını büyük ölçüde tehdit etmektedir. Antimikrobiyal ajanlara karşı Salmonella da antibiyotik direnç gelişimi, degredasyon ya da yapısal modifikasyon yoluyla antimikrobiyal ajanların inaktivasyonunu sağlayan enzimlerin üretimi, bakteriyel hücrelerin antibiyotiklere karşı geçirgenliğini azaltması, antimikrobiyal efluks pompalarının aktivasyonu ve ilaçlar için hücresel hedefin modifikasyonu gibi çoklu mekanizmalardan biri yoluyla gerçekleşmektedir (Sefton 2002). Salmonella spp. izolatları kromozom ve ya plazmid üzerinde lokalize olabilen farklı antibiyotik direnç genlerini taşıyabilmektedir (Micheal vd. 2006, Miriagou vd. 2006, Alcaine vd. 2007). Bunlara ek olarak; kromozomal genlerdeki nokta mutasyonları, seçilmiş antimikrobiyal ajanlara direnç sunabilmektedir (Örnek; Floroquinolon ve Nalidiksik Asit). Birçok çalışmada, farklı Salmonella serotiplerindeki spesifik direnç genleri ve antimikrobiyal ilaç direnç fenotipleri ile bağlantılı genetik mekanizmalar tanımlanmıştır (Alcaine vd. 2007). Salmonella serotipleri içerisinde sefalosporinlere ve penisilinlere direnç gösterenlerin çoğu, antimikrobiyal ajanların biyokimyasal yapısını bozabilen Beta-laktamaz enzimlerini üretmektedir. Beta-laktamazlar, farklı çeşitlerde bulunabilen bir enzim grubudur. Bu enzimlerden bazıları antimikrobiyal ajanların yalnızca bir kısmına karşı ilgiye sahipken, diğerleri antibiyotiklerin geniş bir dizisini parçalayabilme özelliğindedir (Bush 2003). 7

18 Beta-laktamazların Salmonella tarafından üretimi nedeniyle bu bakterilerde Beta-laktam antibiyotiklere direnç çok yaygındır (Revathi vd. 1998, Bush 2003). Beta-laktamaz enzimlerinden AmpC enzimi bla cmy geni tarafından kodlanmakta ve ampisilin, seftiofur ve seftriaksonu kapsayan Beta-laktam antibiyotiklerinin geniş bir dizisine direnç ile ilişkilendirilmektedir (Aarestrup vd. 2004). Bazı enzim yapılarının modifikasyonu yolu ile de antimikrobiyal ajanlar inaktive edilebilmektedir. Salmonella da aminoglikozid direncinin çoğu; belirli aminoglikozidlerin fosforilasyonu, asetilasyonu ve adenilasyonu gibi fonksiyonlara sahip aminoglikozid fosfotransferaz, aminoglikozil asetiltransferaz ve aminoglikozid adeniltransferazı kapsayan modifiye enzimler ile bağlantılıdır (Poole 2005). apha tarafından kodlanan aminoglikozid fosfotransferaz, kanamisin direncinden sorumludur. aacc tarafından kodlanan asetiltransferaz, gentamisin direncini sağlarken, aada ve aadb tarafından kodlanan aminoglikozid adeniltransferaz; streptomisin ve gentamisin direnci ile ilişkilidir (Randall vd. 2004, Welch vd. 2007). İlacın kendi inaktivasyonuna ek olarak diğer dirençlilikler, antibiyotiğin bağlandığı hücresel hedeflerin modifikasyonu sonucu ortaya çıkmaktadır. Kinolon ve florokinolon antibiyotiklerine dirençliliğin çoğu bakteriyel DNA replikasyonu için gerekli topoizomeraz enzimlerini kodlayan genlerdeki mutasyonlarla bağlantılı bulunmuştur (Foley ve Lynne 2008). 2.7 Salmonella da Antibiyotik Dirençliliğin Yatay Gen Taransferi ile Aktarımı Doğal koşullar altında farklı bakteriyel cinslerin ve türlerin üyeleri arasında direnç genlerinin yayılımı; konjugasyon, transformasyon ve transdüksiyon yoluyla yatay gen transferi sonucu gerçekleşmektedir. Etkin bir yatay gen transferi için iki önemli kriter bulunmaktadır. Bunlardan ilki, gen değişimi için uygun bakterilerin aralarında bağlantı sağlanabilmesi için yeterli yoğunlukta olmaları, ikincisi ise transfer edilen genlerin hareketli genetik element üzerindeki yeridir. Bu hareketli elementler; plazmidler, transpozonlar, integronlar, gen kasetleri ve kromozomal genomik adaları kapsamaktadır. Bu elementlerden bir ve ya birkaçı antimikrobiyal dirençli Salmonella suşlarında bulunabilmektedir (Schwarz vd. 2006). 8

19 2.7.1 Plazmidler Plazmidler değişen büyüklüklerde çift iplikli DNA elementleridir. Replikasyon sistemlerine sahip olduklarından bakteriyel hücredeki kromozomal DNA dan bağımsız olarak çoğalma yeteneğindedirler. Plazmidler bakteri hücresinde tekli ve ya çoklu kopyalar halinde bulunabilmektedir. Direnç genleri, virülens genler veya metabolik aktivite için gerekli genleri içerebilirler. Büyük plazmidler; konjugasyon yoluyla yatay olarak plazmidlerin transferine olanak tanıyan tra gen kompleksine sahiptir. Plazmidler; transpozon, integron veya gen kasetleri için temel vektör sistemlerdir (Guerra vd. 2000b, Schwarz vd. 2006) Transpozonlar Transpozonlar, hareketli genetik elementler olup, genellikle genom içerisinde bir bölgeden başkasına ya da farklı genoma hareket etme özelliklerinden dolayı sıçrayan genler olarak adlandırılmaktadır (Snustad vd. 1997). Transpozonlar kendi kendine yer değiştirme özelliği için bazı genlere ihtiyaç duymaktadır (Carattoli 2001). Yapılan çalışmalar sonucunda 3 farklı transpozisyonel element saptanmıştır. Bunlar; insersiyon dizileri (IS) elementleri, birleşik transpozon ve birleşik olmayan transpozonlardır. Transpozonlar; plazmidlerle kıyaslandığında otonom replikasyon sistemine sahip değildir. Bu yüzden kromozomal DNA ve ya plazmid gibi bakteriyel hücredeki replikasyon yeteneği olan moleküllere entegre olmak zorundadırlar. Küçük transpozonlar sadece plazmidin bir parçası olarak konak hücrelerini değiştirebilirken, birleşik transpozonlar konjugatif özelliğe sahiptir. Transpozonlar, bakteriyel hücredeki lokasyonlarını transpozisyon yolu ile değiştirebilmektedir (Schwarz vd. 2006). Transpozonlar, bakteriyel genomlar arasında antibiyotik direnç genlerinin transferini yönlendirme yeteneğine sahiptir (Ochman vd. 2000) İntegronlar İntegronlar; Stokes ve Hall (1989) tarafından gen ifade elementleri olarak tanımlanmıştır. Bu yapılar dirençlilik genlerinin kazanılmasından sorumlu özel genetik 9

20 elementlerdir. İntegronlar; halkasal gen kasetlerini eklemesi ve kazanması için bölge spesifik rekombinasyonu kullanma yeteneği ile diğer bütün genetik elementlerden ayrılmaktadır (Collis ve Hall 1992). İntegronlar, her ikisi de 5 -korunmuş bölgede lokalize olan iki spesifik bölge içermektedir. Bunlar integraz geni (inti) ve atti bölgesidir. Bu iki element integrona, bölge spesifik rekombinasyonu katalizleyen inti geni tarafından gen kasetlerinin eklenmesine ve çıkarılmasına olanak tanır (Collis vd. 1998). inti geni tirozin bölge spesifik rekombinazların bir üyesi olan bir integrazı kodlar. atti bölgesi ise integrona katılan genler için rekombinasyon bölgesi veya birleştirme bölgesi olarak görev almaktadır (Recchia ve Hall 1995). inti, birincil rekombinasyon bölgesi atti ve ikincil hedef attc arasında rekombinasyona aracılık eder. attc bölgesinin tekli açık okuma kalıpları veya gen kasetleri ile bağlantılı olduğu bulunmuştur. İntegronda önemli bölgelerden bir diğeri ise; integron bölgesinin üst sentez bölgesinde lokalize olan güçlü P ant promotorudur (Martinez-Freijo vd. 1998). Kaset genleri bu promotordan ifade edilmektedir ve promotordan doğru yönde ifadeyi gerçekleştirir. Bir integrondaki bütün kasetler, yüksek ifade düzeyine sahip genel bir promotordan ifade edilir (Martinez-Freijo vd. 1998). P 2 promotoru olarak bilinen bu promotor, P ant promotoruyla birlikte integronlarda tanımlanan ikinci bir promotordur. P int promotoru ise integrazların transkripsiyonundan sorumludur (Şekil 2.1, Fluit ve Schmitz 1999). 10

21 Şekil 2.1 Salmonella da Sınıf I integronun genel şeması (Fluit ve Schmitz 1999) İntegronlar, genomunn bir bölgesinden diğer bir bölgeye kendini transfer etmek için gerekli mekanizmayaa sahip değildir. Bu nedenle integronlar; insersiyon dizileri, birleşik transpozonlar veya plazmidlerle bağlantılı bulunmaktadır. Bu bağlantı integronlarınn hareketini sağlar ve böylece sıklıkla gen kasetleri üzerinde bulunan antibiyotik direnç genlerininn tür içi ve türler arasında transferi gerçekleşebilir (Boucher vd. 2007). İntegronlar, fonksiyonel genleri içeren gen kasetlerini yakalayabilmeleri ve yapılarınaa ilave edebilmeleriylee bakterilerin evriminde önemli rol oynamaktadır ve bu nedenlee hücredeki diğer genlerin ifadesini engellemeden ifade olabilen bir populasyondaki birçok birey arasında taşınabilmektedir (Micheal vd. 2004). 11

22 Salmonella da antibiyotik dirençliliğin yayılması temel olarak integronlara dayanır. Direnç integronlarında 5 farklı sınıf tanımlanmıştır (Mazel 2006). Fakat Salmonella cinsi üyeleri sadece sınıf I ve sınıf II integronları barındırmaktadır (Fluit 2005). S. Typhimurium DT104 gibi çoklu ilaç dirençli suşların ortaya çıkması Salmonella enfeksiyonu için başlıca problem haline gelmiştir. Bazı izolatlarda direnç faktörlerinin karakterizasyonu; S.enterica serovar Typhimurium DT104, Paratyphi B ve Agona gibi çoklu ilaç dirençliliği içeren suşlarda yürütülen genomik analizler sonucu gerçekleştirilmiştir. Bu çalışmalarda tanımlanan lokus Salmonella Genomik Adası-1 (SGI-1) olarak adlandırılmıştır ve 43kb büyüklüktedir ve t-rna bölgesi ile ilişkili değildir (Boyd ve Brussow 2002). SGI-1 in baz kompozisyonu serovar Typhimurium un ortalama genomundan düşük ve ya yüksek G+C içeriği ile değişmektedir. SGI-1 içerisinde beşli-ilaç direnci (tetrasiklin, ampisilin, kloramfenikol, streptomisin ve sulfonamid) fenotipini kodlayan genler, çoklu ilaç direnç bölgesinde bir araya gelmiştir. Bu bölge iki integrondan oluşmuştur. Plazmid kaynaklı antibiyotik direnç faktörlerinin aksine; SGI-1 in seçici baskının yokluğunda stabil olduğu tespit edilmiştir. Transpozaz, integraz ve transpozon genlerine dizi benzerliği yanında eksizisyonaz genleri gibi DNA hareketliliği ile ilgili genler, SGI-1 üzerinde tanımlanmıştır. SGI-1 in varyantları diğer serovaryetelerde; yatay gen transferi ve bölge spesifik rekombinasyonu gerektiren bölge ile aynı kromozomal lokasyonda tanımlanmıştır. Son yıllarda yapılan bir araştırma sonucunda SGI-1 in yeni varyantı serovar Albany de tanımlanmıştır (Doublet vd. 2003). Bu varyantta streptomisin direnç genini içeren SGI-1 deki bir integronun; trimetoprim içeren bir integron ile yer değiştirmiş olduğu belirlenmiştir (Hensel 2004) Gen kasetleri Gen kasetleri bilinen en küçük hareketli elementlerdir ve genellikle fonksiyonu bilinmeyen bir bölge (açık okuma kalıbı) ve 59-baz çifti (59-bç) veya attc bölgesinden oluşan bölgede bulunmaktadır (Collis ve Hall 1992). Genin 3 ucunda lokalize olan attc bölgesi; integron bölge spesifik integraz inti tarafından tanınan bir rekombinasyon bölgesidir ve kasetin hareketliliğinden sorumludur (Collis ve Hall 1995). 12

23 Gen kasetleri, integronun bir parçası olarak ya da ayrı küçük halkasal moleküller olarak isimlendirilen iki formda bulunmaktadır. Halkasal formlarında, gen kasetleri; replikasyon orjinleri içermediğinden replikasyon ve ifade yeteneğine sahip değillerdir (Stokes vd. 1997). Her gen kasetinin 59-bç, uzunluk ve DNA dizisi bakımından farklılık gösterir (Collis vd. 1998). Halen bilinen bütün 59-bç leri genel ters tekrar yapılarına sahiptir (Stokes vd. 1997). 2.8 Salmonella Patojenitesinin Evrimi Ve Patojenite Adalarının Rolü Bir patojen, patojen olmayan mikroorganizmadan, virülens gen içeriklerindeki farklılıklara göre ayrılmaktadır (Groisman ve Casadesus 2005). Casadevall ve Pirofski (1999) virülensliği; bir mikrobun duyarlı bir konakta hasara neden olma kapasitesi olarak tanımlamıştır. Türler arasındaki virülens faktörlerin yayılımı varolan patojenlerin evriminde büyük önem taşımaktadır. Evrimsel sürecin altında yatan mekanizmalar ve bakteriyel patojenlerin ortaya çıkışı dikkate değer özelliktedir. Birçok jenerasyon sonrasında, patojenik olmayan bakteriler, birkaç farklı mekanizma sayesinde patojen hale gelebilmektedir. Bu genellikle yatay gen transferi yolu ile gerçekleşmektedir. Son yıllarda çeşitli bakteri türlerinin genom dizileri analiz edilmiştir. Patojenik ve patojenik olmayan türler arasındaki karşılaştırmalar sonucunda, bakteriyel evrime yol gösterecek önemli bilgiler elde edilmiştir (Fitzgerald ve Musser 2001). Patojenite adalarını (PI) kazanmasıyla bakteriyel evrime katkıda bulunan en dikkat çekici örnek Salmonella dır. S. enterica türünün birçok virülens fenotipi PI üzerinde bulunan genler tarafından kodlanmaktadır. Bu patojenite adaları Salmonella Patojenite Adaları (SPI) olarak adlandırılmaktadır. Patojenite adaları; adezyon, invazyon ve toksin genleri gibi virülens faktörleri kodlayan genleri taşıyan genetik elementlerdir (Hacker vd. 1990, 1997). PI lar kromozom üzerinde ve bir plazmid üzerinde lokalize olabilmekte ve tekrar eden dizilere yakın bulunmaktadır. Genomun geri kalan kısmına oranla değişen G/C içeriğine sahiptirler. Bakteriyel genomda PI tipik olarak t-rna bölgeleriyle bağlantılıdır ve hareketlidir. Ayrıca farklı bir t-rna bölgesine 13

24 taşınabilmekedir. Bazı patojenite adaları transpozon, integron ya da insersiyon dizileri gibi genetik yapılar barındırmaktadır (Gal-Mor ve Finlay 2006). Günümüzde Salmonella serovaryetelerinde; 10 adet Salmonella patojenite adasının var olduğu bilinmektedir (Bishop vd. 2005). Bu geniş DNA fragmentleri; invazyon, makrofajlarda yaşam, demir alımı ve düşük magnezyum konsantrasyonlarında hayatta kalma gibi özellikleri kapsayan virülens mekanizmaları için gerekli genleri içermektedir (Mammina vd. 2002). SPI-1 hariç bütün patojenite adaları t-rna bölgesine entegre olmuştur (Hansen-Wester ve Hensel 2002). SPI, genomun diğer kısımlarına kıyasla düşük G+C oranı, integrazların varlığı, insersiyon elementlerinin varlığını kapsayan mobil elementlerin karakteristiğine sahiptir (Mills vd. 1995, Makanera vd. 2003). Virülens ve konak dizgesindeki farklılık Salmonella evrimine üç özellik kazandırmıştır (Baumler vd. 1996a, Baumler vd. 1996b). Bunlardan ilki, bağırsakta kolonize olmasına özgü genlerin kazanılması ve bununla bağlantılı olarak Escherichia cinsinden ayrılmasıdır. Bu genler bütün Salmonella türlerinde bulunurken; E.coli ve farklı akraba bakterilerde bulunmamaktadır. Salmonella Patojenite Adası-1 (SPI-1) bu genleri muhtemel olarak yatay gen transferi yoluyla kazanmıştır. İkinci basamakta; S. enterica ve S. bongori türlerinin derin doku kolonizasyonu için gerekli genlerin kazanmasıyla bağlantılı olarak birbirinden ayrılmasıdır. Bir sonraki evrim aşamasında ise; S.bongori ve S. enterica nın bazı grupları; balık, amfibi ve reptiller gibi soğukkanlı omurgalılar ile, Grup I S. enterica suşlarının sıcakkanlı omurgalıları içeren geniş bir konak dizgesine özelleşmiştir. Sıcakkanlı hayvanları enfekte edebilen Grup I bakteriler, SPI lar tarafından kodlanan birçok virülens faktöre sahiptir ve bu virülens faktörler bakteriyi konağın immün sisteminin etkilerinden korumaktadır. Salmonella evriminin üçüncü basamağı ise multifaktöriyeldir ve virülens genlerin hem kazanılmasını hem de kaybedilmesini içermektedir (Bearson vd. 1998, Cotter ve Dirita 2000). SPI-1 ve SPI-2 benzer büyüklüktedir (her biri yaklaşık 40kb) fakat kromozomal lokasyonları birbirinden farklıdır. SPI-1 Salmonella genom haritasının 63 bölgesinde yer alırken (Mills vd. 1995, Gala n 1996), SPI-2, 31 bölgesinde yer almaktadır (Blanc-Pottard ve Groisman 1997). SPI-1 ve SPI-2 nin her ikisini de farklı tipte Tip III 14

25 salgı sistemi (T3SS) kodlamaktadır. T3SS, diğer protein salgı sistemleriyle kıyaslandığında kendine özgü özelliklere sahiptir (Hueck 1998). Tip III salgı sisteminin en az 15 proteini iç ve dış membrana gömülmüş halde bulunmaktadır. Salgı sistemi, bakteri konak hücre yüzeyi ile bağlantıya geçtiğinde aktive olmaktadır. İç ve dış membran proteinlerine ek olarak bu sistem; iç membran ATPaz ı, salgı proteinleri, efektör proteinleri, sitozolik şaperonlar, transkripsiyonel regülatörleri (Inf F, HilA, InvE) de kapsamaktadır. Spesifik sitozolik şaperonlar salgı proteinlerinin parçalanmasını önlemektedir. Bu sistemin proteinleri, bakteri ile konak hücre arasındaki etkileşimde anahtar rol oynamaktadır. Ayrıca bu sistem SPI-1 tarafından kodlanamayan proteinleri de salgılamaktadır. SPI-2 de farklı bir Tip III salgı sistemini kodlayan yaklaşık 15 gen ve iki bileşenden oluşan bir regülasyon sistemi bulunmaktadır (Hensel vd ). SPI-1 salgı sistemi bağırsak epitel hücrelerinin invazyonu için gerekli iken, SPI-2 salgı sistemi bakterilerin hayatta kalması ve makrofajlarda ve epitel hücrelerde çoğalmasına katkıda bulunmaktadır (Ochman vd. 1996). SPI-1 spesifik bağlanma bölgelerinden yoksundur ve SPI-2 t-rna VAL genine yakın bir bölgede bulunmaktadır (Hensel vd. 1997). Enfeksiyonun farklı aşamalarında gerekliliğine göre; SPI-1 ve SPI-2 genleri konak hücrenin dışında ve içindeki bakteriler tarafından ifade edilir. Bu fonksiyon SPI-1 den SPI-2 ye tamamiyle farklılık göstermez. Bazı SPI-1 proteinleri hala konak hücre içinde salınmaktadır. Yukarıda da belirtildiği gibi; SPI-1 her Salmonella türünün bütün gruplarında bulunmakta ve evrimin başlangıcında kazanıldığı düşünülmektedir (Wong vd. 1998, Blanc-Potard vd. 1999). SPI-2 nin sınırlı yayılımı ve tipik olmayan G+C içeriği, bu patojenite adasının S. enterica da kazanımının, S. bongori den ayrıldıktan sonra gerçekleştiğine işaret etmektedir (Şekil 2.2, Cotter ve Dirita 2000). 15

26 Şekil 2. 2 Salmonella türleri ve alttürleri arasındaki filogenetik akrabalıkları gösteren dendogram (Cotter ve Dirita 2000) SPI-1 lokusunun ikinci bir elemanı olan sit ABCD genleri Salmonella da demir yakalama sistemini kodlamaktadır. SPI-3; yaklaşık 17kb büyüklüğünde ve genom haritasında 82 bölgesinde yer almaktadır. Bakterilerin makrofaj içerisinde hayatta kalması için özel proteinleri ve Mg +2 transportu için mgtb ve mgtc genlerini içermektedir (Blanc-Pottard ve Groisman 1997). SPI-3 ün genetik organizasyonu ve fonksiyonu SPI-1 ve SPI-2 den farklıdır. Bu patojenite adası selc t-rna genine eklenmiştir. SPI-3 tarafından kodlanan başlıca virülens faktörler Salmonella nın hücre içi fenotipi için önemli olan, yüksek afiniteye sahip magnezyum transport sistemi MgtCB dir (Blanc-Pottard ve Groisman 1997). MgtCB genleri; Salmonella bongori de dahil olmak üzere tüm Salmonella serotiplerinde bulunmaktadır (Fierer ve Guiney 2001). SPI-4; 27 kb büyüklüğünde ve genom haritasının 92 bölgesinde bulunmaktadır (Wong vd. 1998). Salmonella nın konak epitel hücrelerine tutunmasından (adezyon) sorumludur (Gerlach vd. 2007). 16

27 SPI-5 ise genetik haritanın 20 bölgesinde lokalize olmuştur ve pip A, B, C ve D; orf X ve sopb olmak üzere altı gen içermektedir (Wood vd. 1998). SPI-5; SPI-1 ve SPI-2 için gerekli efektör proteinleri kodlayan genleri içeren bir lokusa sahiptir. Bu lokus sadece 7 kb büyüklüğündedir. S. enterica çekirdek genomunun % 52 oranında G+C içermesine karşılık, bu lokus % 43.6 G+C içeriğine sahiptir ve sert, t-rna geninin hemen yanında bulunmaktadır. SPI-5; T3SS ni kodlayan SPI-1 in bir efektör proteini olan Sop D genini ve SPI-2 kodlu T3SS için efektör bir proteinini kodlayan pipb genini içermektedir (Wood vd. 1998). SPI lara ek olarak; Salmonella virülensliği E. coli de bulunmayan küçük kromozomal bölgelere sahiptir. Bu küçük bölgeler patojenite adacıkları olarak adlandırılmaktadır (Groisman ve Ochman 1997). Söz konusu bölgeler; adezinleri, invazin benzeri proteinleri ve bazı metabolizma için gerekli genleri kodlamaktadır. Sonuç olarak; Salmonella kromozomu yatay gen transferi sonucu oluşan ve patojenite adası özelliklerine uyan birçok DNA bölgesi içermektedir (Conner vd. 1998). S. Typhi serovaryetesinde 59 kb lık bir lokus olan SPI-6; S. Typhimurium suşu için Salmonella kromozomal adası (SCI) olarak tanımlanmıştır (Parkhill vd. 2001, Folkesson vd. 2002). SPI-6, aspv trna geni yakınına eklenmiştir ve fimbriyal saf (Salmonella tipik olmayan fimbriya) gen kümesini, invazini kodlayan pagn genini ve fonksiyonu bilinmeyen birçok farklı geni içermektedir (Folkesson vd. 2002). SPI-7; S. Typhi, S. Dublin ve S. Paratyphi C için spesifik bir lokustur. Bu lokus 133 kb büyüklüğünde olup, trna fenilalanin (pheu) geni yakınına eklenmiştir (Hansen-Wester ve Hensel 2002). SPI-7 tarafından kodlanan en önemli virülens faktör, kapsüler bir ekzopolisakkarit olan V i antijenidir. SPI-1 tarafından kodlanan T3SS nin efektör proteini olan SopE yi kodlamaktadır. Ayrıca tip IVB pilusu kodlayan pil gen kümesi de yine SPI-7 üzerinde bulunmaktadır. SPI-7 lokusunun oldukça kompleks genetik organizasyona sahip olmasının nedeni; yatay gen transferi yoluyla kazanılmış farklı genetik elementlerden oluşmasıdır. Yapılan araştırmalarda pil, tra ve sam genlerinin SPI-7 lokusu üzerindeki varlığı, bu lokusun orijininde konjugatif plazmid veya konjugatif transpozon olduğuna işaret etmektedir (Hensel 2004). 17

28 SPI-8 lokusu, S. Typhi genom dizisinde tanımlanmış olup 6.8 kb büyüklüğündedir ve phev trna geni yakınında bulunmaktadır (Parkhill vd. 2001). Bu lokus virülens faktör olarak varsayılan bakteriyosin genlerini kodlamaktadır. Ayrıca integrazı kodlayan genin SPI-8 üzerinde bulunması, bu elementin hareketli olduğunun kanıtıdır. Son araştırmalar bu lokusun serovar Typhi ye spesifik olduğunu göstermiştir (Hensel 2004). 16 kb büyüklüğünde olan SPI-9; S. Typhi kromozomundaki lizojenik bir bakteriyofaj yakınında bulunmaktadır. SPI-9 lokusu; tip I salgı sistemi (T1SS) ni kodlamaktadır. SPI-10, yapısal bir gen olan trna leux gen bölgesinde lokalize olan 32.8 kb büyüklüğünde büyük bir lokustur. Bu lokus; sef (Salmonella enteritidis fimbriya) fimbriyal operonunu ve bir bakteriyofajı kodlamaktadır (Hensel 2004). 18

29 3. MATERYAL VE YÖNTEM 3.1 Materyal Mikroorganizmalar Çalışmada kullanılan Salmonella bakteri örneklerinin tamamı Ankara Üniversitesi Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Prokaryot Genetiği Laboratuvarı kültür koleksiyonundan temin edilmiştir Mikroorganizmaların saklama koşulları Bakterilerin geliştirilmesinde; Salmonella suşları için LB broth besiyeri kullanılmıştır. Bakteriler uygun süre ve sıcaklıkta, LB broth besi ortamında geliştirildikten sonra % 30 oranında steril gliserol ilave edilerek -20 C de saklanmıştır Besiyerleri Luria Bertani (LB) Broth ve Agar (Merck, Germany) İçerik Tripton Maya ekstratı NaCl Agar g/l 10 g 5 g 10 g 15 g ph7.0±0.002 (sterilizasyondan önce) Ortam içerikleri 1000mL distile su içerisinde çözülmüş ve sterilizasyon, 121 C de 15 dakika süre ile yapılmıştır. 19

30 Müller-Hinton Broth ve Agar (Oxoid, England) İçerik g/l Et ekstraktı 300g Kazein hidrolizat 17.5g Nişasta 1.5g Agar 17g ph 7. 3 ± 0. 2 (sterilizasyondan önce) Ortam içerikleri 1000mL distile su içerisinde çözülmüş ve sterilizasyon, 121 C de 15 dakika süre ile yapılmıştır Antibiyotikler Çizelge 3.1 Çalışmada kullanılan antibiyotik diskleri ve konsantrasyonları Disk Antibiyotik (sembol) Antibiyotik Grubu Konsantrasyonu (µg) Ampisilin (AMP) Beta-laktam 10 Florfenikol (FFC) Fenikol 30 Gentamisin (GEN) Aminoglikozid 10 Kanamisin (KAN) Aminoglikozid 30 Kloramfenikol (CHL) Fenikol 30 Nalidiksik Asit (NAL) Kinolon 30 Neomisin (NEO) Aminoglikozid 5 Sefaklor (CEC) Beta laktam 30 Seftiofur (EFT) Beta laktam 30 Siprofloksasin (CIP) Kinolon 5 Spektinomisin (SPE) Aminoglikozid 10 20

31 Çizelge 3. 1 Çalışmada kullanılan antibiyotik diskleri ve konsantrasyonları (devam) Streptomisin (STR) Aminoglikozid 10 Sulbaktam/Ampisilin (SAM) Aminoglikozid 20 Sulfadiazin (SD) Sulfonamid 25 Sulfonamid (SUL) Sulfonamid 300 Sulfametoksazol (SX) Sulfonamid 25 Sulfametoksazol/Trimetoprim (SXT) Sulfonamid/Antifolat 25 Tetrasiklin (TET) Tetrasiklin 30 Trimetoprim (TMP) Antifolat Çözeltiler CTAB/NaCl 100 g/ml NaCl 4,1g CTAB 10g dh 2 O 100mL NaCl 80 ml distile su içerisine çözülür. 10 g CTAB yavaş yavaş ortama eklenir. CTAB ın çözünmesi için çözelti aralıklarla 65 C ye kadar ısıtılır. Son aşamada toplam hacim destile su ile 100 ml ye tamamlanır. 21

32 Tris/HCl (0.5 M EDTA ph:8) Tris EDTA dh 2 O g/l 1,21 g 0,37 g 1000 ml Distile su ile 1000 ml ye tamamlanır. Sterilizasyondan önce ph 7.0±0.02 ayarlanır. Sterilizasyon işlemi 121 C de 15 dk süre ile yapılır. %10 luk SDS Çözeltisi SDS dh 2 O g/l 10 g 100 ml Fenol/Koloroform/İzoamil Alkol Çözeltisi Fenol Kloroform İzoamil Alkol 25 ml 24 ml 1 ml Kloroform/İzoamil Alkol Çözeltisi Kloroform İzoamil Alkol 24 ml 1 ml 22

33 3.1.6 Primerler Çalışmada kullanılan primerlerin dizilimi ve Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) koşulları çizelge 3.2 te verilmiştir. Çizelge 3.2 Primer dizilimi ve PZR koşulları Primerler Primer dizisi (ileri/geri) T a /t e PZR ürünü (bç) Kaynaklar Sınıf I İntegron GGCATCCAAGCAGCAAGC/ AAGCAGACTTGACCTGAT 55/30sn Değişken Guerra vd RFLIA/FFLIB GCGGTATACAGTGAATTCAC/ CTGGCGACGATCTGTCGATG 60/5 sn 1000 (STM) 250 Trupschuch vd trna regd GGAAGCGCAAATGGAAAGTA/ CATACGCTGAAGGTGGAAT 56/30sn 1766 Trupschuch vd trna D1 üst sentez bölgesi GATGGTACGATTCGTGCGTA/ TGAGCTATATCGGCCCTGAG 58/30sn 150 Trupschuch vd trna D3 alt sentez bölgesi AACCTCATTTCTCAAAAACACCA/ GGCGCATGGTAAACAAGAAA 58/30sn 118 Trupschuch vd Yöntem Disk Difüzyon Yöntemi Antibiyotik duyarlılık düzeylerinin belirlenmesinde Bauer vd. (1966) tarafından önerilen antibiyotik disk difüzyon yöntemi modifiye edilerek kullanıldı. Kültürler steril öze aracılığı ile 4 ml LB broth ortamına inoküle edildi ve çalkalamalı (200 rpm/min) inkübatörde 37 C de 18 saat inkübasyona bırakıldı. İnkübasyon sonrasında, steril saf su ile 1:100 (hacim/hacim) oranında seyreltilen örneklerden Müller Hinton (Oxoid, UK) agar plakaları üzerine 100 er µl yayma ekim yapıldı. Antimikrobiyel ajanlar 23

34 (Oxoid,UK) emdirilmiş 6 mm lik steril kağıt diskler, agar yüzeyine yerleştirildi ve 37 C de 18 saat inkübe edildi. Disk difüzyon yöntemi ile 19 farklı antimikrobiyel ajana karşı dirençlilik profilleri araştırıldı (Çizelge 3.1). İnkübasyon süresinin sonunda antibiyotik disklerinin etrafında oluşan berrak zonların çapı ölçüldü ve paralel denemeler sonucunda elde edilen verilerin ortalaması alınarak izolatların duyarlılık düzeyleri belirlendi. Sonuçlar; Laboratuar Standartları Enstitüsü (CLSI) nün belirlediği kırılma noktaları ile karşılaştırılmak suretiyle suşlar duyarlı (S), orta dirençli (I) ve dirençli (R) olarak tanımlandı (Anonymous 2008) Minimum inhibisyon konsantrasyonu (MİK) metodu Duyarlılıkları saptanacak olan mikroorganizmaların, LB broth sıvı besiyerinde üretilmiş kültürlerinden steril serum fizyolojik solüsyonu içerisinde McFarland 0.5 (10 8 hücre/ml) yoğunluğunda örnekler hazırlandı ve 1:100 oranında seyreltilmek suretiyle 10 6 hücre/ml içeren mikroorganizma süspansiyonları elde edildi. Bakterilerin üretilmesi amacıyla Müller Hinton Broth (MHB) (Oxoid, UK) besiyerleri kullanıldı. Minimum inhibisyon konsantrasyonlarının (MİK) tespit edilebilmesi için 96 kuyucuklu mikroplaklarda mikrodilüsyon yöntemi, Clinical Laboratory Standards Institute (CLSI) (2008) M27-A protokolüne göre çalışıldı. 100 µl MHB besiyerini içeren kuyuların ilk sırasına her antibiyotik için son konsantrasyon 1024 µg/ml olacak şekilde 2048 µg/ml stok çözeltiden eklendi (Çizelge 3.3). İlk kuyucuktan başlanarak bir sonraki kuyuya 100 µl aktarılarak seri dilüsyonlar gerçekleştirildi. Dilüsyon basamağı tamamlandıktan sonra her kuyuya 10 µl bakteri süspansiyonu (10 6 hücre/ml) eklendi ve mikrodilüsyon plakları 37ºC de 24 saat inkübasyona tabi tutuldu. Mikroorganizma üremesinin gözlemlenmediği en düşük antibiyotik konsantrasyonu o antibiyotik için MİK olarak belirlendi. 24

35 Çizelge 3.3 Minimal inhibisyon konsantrasyonu (MİK) kuyucuk test planı ve analizlerinde kullanılan antibiyotik konsantrasyonları 1.kuyu 2.kuyu 3.kuyu 4.kuyu 5.kuyu STR 1024 µg/ml SD 1024 µg/ml SUL 1024 µg/ml SPE 1024 µg/ml SX 1024 µg/ml STR 512 µg/ml SD 512 µg/ml SUL 512 µg/ml SPE 512 µg/ml SX 512 µg/ml STR 256 µg/ml SD 256 µg/ml SUL 256 µg/ml SPE 256 µg/ml SX 256 µg/ml STR 128 µg/ml SD 128 µg/ml SUL 128 µg/ml SPE 128 µg/ml SX 128 µg/ml STR 64 µg/ml SD 64 µg/ml SUL 64 µg/ml SPE 64 µg/ml SX 64 µg/ml STR 32 µg/ml SD 32 µg/ml SUL 32 µg/ml SPE 32 µg/ml SX 32 µg/ml STR 16 µg/ml SD 16 µg/ml SUL 16 µg/ml SPE 16 µg/ml SX 16 µg/ml STR 8 µg/ml SD 8 µg/ml SUL 8 µg/ml SPE 8 µg/ml SX 8 µg/ml STR 4 µg/ml SD 4 µg/ml SUL 4 µg/ml SPE 4 µg/ml SX 4 µg/ml STR 2 µg/ml SD 2 µg/ml SUL 2 µg/ml SPE 2 µg/ml SX 2 µg/ml STR 1 µg/ml SD 1 µg/ml SUL 1 µg/ml SPE 1 µg/ml SX 1 µg/ml STR 0.5 µg/ml SD 0.5 µg/ml SUL 0.5 µg/ml SPE 0.5 µg/ml SX 0.5 µg/ml STR 0.25 µg/ml SD 0.25 µg/ml SUL 0.25 µg/ml SPE 0.25 µg/ml SX 0.25 µg/ml PK PK PK PK PK PK: Pozitif Kontrol 25

36 3.2.3 Genomik DNA izolasyonu Bakteri örneklerinden genomik DNA izolasyonunda Wilson (2001) tarafından önerilen CTAB (Hekzadezil Trimetil Amonyum Bromit) yöntemi kullanıldı. Çalışılan bakteri 5 ml LB broth ortamına % 1 oranında inoküle edildi ve 37 C de 200 rpm çalkalama hızında 12 saat süre ile geliştirildi. Bu süre bitiminde 1.5 ml kültür mikrosantrifüj tüplerine alındı ve rpm de 2 dk santrifüj edilerek bakteri hücreleri çöktürüldü. Üst svı ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra, hücre çökeltisi 567 ml Tris-EDTA tampon içerisinde çözüldü. Üzerine 30 µl % 10 SDS ve 3 µl proteinaz K (20 mg/ ml, Sigma Chem Co., USA) aktarılıp karıştırıldı ve 37 C de 1 saat tutuldu. İnkübasyon süresi tamamlandığında ortama 100 µl 5M NaCl ilave edilerek karıştırıldı. 80 µl CTAB/NaCl çözeltisinin ilavesinin ardından kesik uçlu mikropipet uçları kullanılarak beyaz partikül yapısı oluşuncaya kadar ortam karıştırıldı ve tüpler, 65 C de 10 dk inkübe edildi. Bu ortam üzerine 0.75 ml kloroform/izoamil alkol (24/1 hacim/hacim) aktarılıp karıştırıldı rpm de 5 dk santrifüj edilen ortamın üst fazı yeni mikrosantrifüj tüplerine alındı. Alınan faz üzerine 0.75 ml fenol/kloroform/izoamil alkol (25/24/1 hacim/hacim) ilave edildi ve rpm de 5 dk santrifüj işlemine tabi tutuldu. Santrifüj işleminin sonunda tüplerdeki üst sıvı yeni mikrosantrifüj tüplerine aktarıldı ve bu sıvının üzerine hacmin 0.6 sı (~350 µl) oranında izopropanol ilave edildi. Tüpler beyaz çökelti oluşuncaya kadar elde yavaşça karıştırıldı. Daha sonra rpm de 5 dk santrifüj basamağı gerçekleştirildi. Üst sıvı döküldükten sonra çökelti üzerine 350 µl % 70 etanol ilave edilerek tekrar rpm de 5 dk santrifüj işlemi uygulandı. Üst sıvı dikkatli bir şekilde ortamdan uzaklaştırıldıktan sonra kromozomal DNA örneği oda sıcaklığında kurutuldu. Son aşamada DNA çözeltisi 100 µl Tris-EDTA (TE) tampon içerisinde yaklaşık 1 saat muamele edilerek çözüldü (Wilson 2001) flja-fljb intergenik bölgelerinin tanımlanması ve DNA dizi analizleri flja-fljb intergenik bölgelerinin (Şekil 3.1) PZR amplifikasyonu için Trupschuch vd. (2010) tarafından önerilen yöntem Finnzymes Phire Hot Start DNA polimeraz kullanılarak yapıldı. Polimeraz Zincir Reaksiyonları GeneAmp9700 Thermocycler (Applied BioSystems, USA) cihazı kullanılarak gerçekleştirildi. 26

37 Şekil 3.1 Salmonella da fljb-fljc bölgelerinin moleküler organizasyonu (Burnens vd. 1997) Amplifikasyon için kullanılan reaksiyon karışımı ve belirtildiğii şekilde hazırlanmış ve uygulanmıştır. amplifikasyon koşulları aşağıdaa PZR karışımı (Tek reaksiyon için): Nükleaz İçermeyen Su. 9,7 µl 5xPZR tampon +MgCl 2 (Phire Hot Start) µl dntp (10 mm, Fermentas)... 0,4 µl İleri Primer (F) 1 µl Geri Primer (R) 1 µl Taq DNA Polimeraz (5u/mL, Phire).. 0,4 µl Kalıp DNA.. 3,5 µl PZR amplifikasyon koşulları: 98 C sn 98 C... 5 sn 60 C 5 sn 72 C... 20sn 72 C... 1dk 4 C.. 35 Döngü 27

38 Bu işlem sonrasında; 10 µl PZR ürünü, 2 µl 6 x yükleme boyası (Fermentas, Finland) karıştırıldı ve % 2 oranında agaroz içeren jel sistemlerinde 100 volt elektrik akımı uygulanarak 1 saat koşturuldu. Elektroforez işlemi sonrasında agaroz jeller, 0,2 µg/ml etidyum bromit (Sigma Chem. Co., USA) çözeltisinde 20 dk süre ile boyandıktan sonra 366 nm dalga boyunda UV ışık altında görüntülenerek fotoğrafları çekildi (Kodak Gel Logic 200 Imaging System). Saflaştırılan DNA örneklerinin dizi analizi REFGEN (ODTÜ Teknokent, Ankara) firması tarafından yapıldı ve sonuçlar PSI-BLAST programı kullanılarak değerlendirildi İntegron analizleri Primer dizaynı ve polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) Sınıf I integronların (Şekil 3.2) PZR amplifikasyonu için Guerra vd. (2004) tarafından önerilen yöntem optimize edilerek uygulandı. Bu amaçla GeneAmp9700 Thermocycler cihazı (Applied BioSystems, USA) kullanıldı. Gen kaseti 5 korunmuş bölge 3 korunmuş bölge Şekil 3.2 Sınıf I integronların moleküler organizasyonu (Le vesque vd. 1995) 28

39 İntegron analizlerinin ilk aşaması olan integron varlığının araştırılması amacıyla; Sınıf I integronların 5 ve 3 korunmuş bölgelere göre dizayn edilen primer çiftinden (5-3 CS, Şekil 3.2) yararlanıldı. Kullanılan primer dizilimi çizelge 3.4 de belirtilmiştir. Amplifikasyon için kullanılan reaksiyon karışımı ve amplifikasyon koşulları aşağıda belirtildiği şekilde hazırlanmış ve uygulanmıştır. PZR karışımı (tek reaksiyon için): Nükleaz İçermeyen Su... 35,5 µl 10X PZR tampon -MgCl 2 (Fermentas) 5 µl dntp (2mM Fermentas). 1 µl İleri primer (F) 1 µl Geri primer (R) 1 µl MgCl 2 (25 mm Promega) 4 µl Taq DNA polimeraz (5U/ml Promega)... 0,5 µl Kalıp DNA... 2 µl PZR amplifikasyon koşulları: 94 o C... 5 dk 94 o C sn 55 o C sn 72 o C 2,5 dk 72 o C... 5 dk 4 o C döngü T a (bağlanma sıcaklığı, o C) her bir primer için ayrı ayrı T a = 2 X (A+T) + 4 X (G+C) formülü kullanılarak hesaplanırken, t e (uzama süresi, s) beklenen PZR ürününün baz çifti (bç) cinsinden uzunluğuna göre tayin edildi. Buna göre beklenen PZR ürünü 500 bç 29

40 ve daha küçük ise 30 saniye, bç arasında ise 40 saniye ve daha büyük PZR ürünleri, örneğin; 1000 bç için ise 1 dakika ya da daha fazla olarak belirlendi İntegron bantlarının tanımlanması ve DNA dizi analizleri İntegron analizi için PZR amplifikasyonu sonrasında, elde edilen üründen 10 µl alınarak 2 µl 6x yükleme boyası (Fermentas, Finland) karıştırıldıktan sonra % 1 oranında agaroz içeren jelde 100 volt elektrik akımı altında 1.5 saat koşturuldu. Elde edilen bantların büyüklüklerinin belirlenebilmesi amacı ile ayrı bir kuyuya yüklenen 1kb DNA Marker dan (Fermentas, Finland) yararlanıldı. Elektroforez işlemi sonrasında agaroz jeller, 0.2 µg/ml etidyum bromit (Sigma Chem. Co., USA) çözeltisinde 20 dk süre ile boyama işleminin ardından 366 nm dalga boyunda UV ışık altında görüntülenerek fotoğrafları çekildi (Kodak Gel Logic 200 Imaging System). Saflaştırılan DNA örneklerinin dizi analizi REFGEN (ODTÜ Teknokent, Ankara) firması tarafından yapıldı ve sonuçlar PSI-BLAST programı kullanılarak değerlendirildi t-rna bölgelerinin analizi Çalışmamızda t-rna thrw bölgesi ve bağlanma bölgelerinin araştırılmasında Trupschuch vd. (2010) tarafından önerilen yöntem optimize edilerek kullanıldı. Bu amaçla GeneAmp9700 Thermocycler (Applied BioSystems, USA) cihazından yararlanıldı. Amplifikasyon için kullanılan reaksiyon karışımı ve amplifikasyon koşulları aşağıda belirtildiği şekilde hazırlanmış ve uygulanmıştır. 30

41 PZR karışımı (t-rna regd ve t- RNA D3 primerleri için): Nükleaz İçermeyen Su.. 8,5 µl 5xTampon (Promega) µl dntp (10 mm, Promega).. 0,4 µl İleri Primer(F)... 1 µl Geri Primer(R) µl MgCl 2 (25 mm, Promega). 1,2 µl Taq DNA Polimeraz (5 U/mL, Promega). 0,4 µl Kalıp DNA.... 3,5 µl PZR karışımı ( t-rna D1 primeri için): Nükleaz İçermeyen Su. 7,7 µl 5xTampon (Promega)... 4 µl dntp(10 mm, Promega).. 0,4 µl İleri Primer (F)... 1 µl Geri Primer (R)... 1 µl MgCl 2 (25 mm, Promega) 2 µl Taq Polimeraz (5U/mL, Promega)... 0,4 µl Kalıp DNA... 3,5 µl PZR amplifikasyon koşulları: 94 C... 5dk 94 C sn T m.. 30 sn 72 C... 2,5 dk 72 C... 5 dk 4 C. 30 döngü 31

42 PZR amplifikasyonu sonrasında, elde edilen üründen 10 µl alınarak 2 µl 6x yükleme boyası (Fermentas, Finland) karıştırıldıktan sonra % 1 oranında agaroz içeren jelde 100 volt elektrik akımı altında 1.5 saat koşturuldu. Bant büyüklüklerinin belirlenebilmesi amacı ile ayrı bir kuyuya 1kb DNA Marker (Fermentas, Finland) yüklendi. Elektroforez işlemi sonrasında agaroz jeller, 0.2 µg/ml etidyum bromit (Sigma Chem. Co., USA) çözeltisinde 20 dk süre ile boyama işleminin ardından 366 nm dalga boyunda UV ışık altında görüntülenerek fotoğrafları çekildi (Kodak Gel Logic 200 Imaging System). Saflaştırılan DNA örneklerinin dizi analizi REFGEN (ODTÜ Teknokent, Ankara) firması tarafından yapıldı ve sonuçlar PSI-BLAST programı kullanılarak değerlendirildi. 32

43 4. ARAŞTIRMA BULGULARI VE TARTIŞMA 4.1 S. Typhimurium Suşlarının Antibiyotik Duyarlılıkları Çalışmamızda kullanılan 5 adet Salmonella suşunun antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesi, 19 farklı antibiyotik diski kullanılarak gerçekleştirildi (Şekil 4.1). Şekil 4.1 S. Typhimurium suşlarının disk difüzyon yöntemi ile tanımlanan antibiyotik duyarlılıkları Bu denemede antibiyotik dirençlilik fenotipi gösteren suşların duyarlılık düzeyleri minimal inhibisyon konsantrasyonlarının (MİK) kritik dilüsyon yöntemi sonucu araştırılması ile saptanmıştır. Suşların antibiyotik duyarlılık sonuçları çizelge de gösterilmiştir. Çalışmamızda S. Typhimurium olduğu bilinen DMC4, DMC95 kodlu suşların ve Salmonella spp. 921C suşunun sulfametaksazol direnci dışında antibiyotiklere duyarlı olduğu belirlenmiş, kontrol suşu olarak kullanılan S. Typhimurium LT2 suşuyla direnç bakımından bir farklılık görülmemiştir. S. Typhimurium SL1344 suşu için CLSI 33

44 standartlarına göre sulfadiazin (R=512 µg/ml), streptomisin (R=128 µg/ml), sulfonilamid (R=512 µg/ml), spektinomisin (R=512 µg/ml) antibiyotiklerine karşı dirençli olduğu belirlenmiştir. Seçici bir baskıya bakteriyel populasyonların verdiği hızlı yanıt için bilinen en iyi örneklerden biri antimikrobiyallere dirençtir. Dirençli suşlarda bu seçici avantaj; yatay gen transferi veya hedef genlerdeki nokta mutasyonlarının birikimi sonucu direnç genlerinin kazanımı olarak açıklanabilmektedir. Salmonella enterica; çiftlik havyanlarında dirençlilik kazanabilen hayvansal suşları içeren bir gruptur. Hayvansal gıda ürünleri, dirençli bakterilerin hayvanlardan insanlara geçişi için önemli vektörlerdir. S. enterica subspecies enterica serotype Typhimurium (4,[5],12:i:1,2) insan ve hayvan salmonellozuna en sık neden olan serotiplerden biridir. S. Typhimurium un birçok suşunun dört ya da daha fazla antimikrobiyal ajana karşı çoklu ilaç direncine sahip bulunmuştur (Guerra vd. 2004). Zoonotik bakterilerde antimikrobiyal direncin ortaya çıkması halk sağlığı için ana tehdit unsurudur. Literatür verileri incelendiğinde; antibiyotiklerin yetersiz ve kötüye kullanımı birçok bakteride dirence neden olduğu görülmüştür. Gıda kaynaklı bakteriyel enterik patojenlerde ilaç direnci; hayvan yetiştiriciliği sırasında antimikrobiyal ilaçların kullanımının kaçınılmaz sonucudur (Threlfall 2000). Günümüzde enfeksiyon hastalıkların önlenmesi ve tedavisinde en önemli sorun bakterilerde çoklu antibiyotik dirençlilik gelişimidir (Schwarz ve Chaslus-Dancla 2001, Sturenburg ve Mack 2003, Batchelor vd. 2005). Bu nedenle özellikle hayvancılıkta, besleme ve koruma amacı ile antibiyotiklerin kontrolsüz kullanımına yönelik önlemler tüm dünyada alınmış ve güçlü takip yöntemleri geliştirilmiştir (Randall vd. 2004, Poirel vd. 2006, Chen vd. 2006, Kehrenberg vd. 2006, Chessa vd. 2008). Çalışmamızda kullanılan Türkiye kökenli iki adet S. Typhimurium suşu ve bir adet Salmonella izolatında çoklu ilaç dirençlilik fenotipinin henüz ortaya çıkmadığı saptanmıştır. Bu durum izolatların evrimsel gelişimi hakkında genel bir bilgi 34

45 vermektedir. Bu bakterilerde çoklu ilaç dirençlilik gelişiminin olasılığı bu çalışmada detaylı genetik analizler yapılarak belirlenmiştir. Çizelge 4.1 S. Typhimurium suşlarının antibiyotik duyarlılıkları (Disk Difüzyon Sonuçları) Antibiyotikler Suşlar DMC4 DMC95 LT2 SL C AMP S S S S S FFC S S S S S GEN S S S S S KAN S S S S S CHL S S S S S NAL S S S S S NEO S S S S S EFC S S S S S EFT S S S S S CIP S S S S S SPE S S S R S STR S S S R S SAM S S S S S SD S S S R S SUL R R R R R SX S S S R S SXT S S S S S TET S S S S S TMP S S S S S S: Duyarlı, R: Dirençli 35

46 Çizelge 4.2 S. Typhimurium suşlarının antibiyotik duyarlılık düzeyleri (µg/ml) 36

47 4.2 Salmonella Suşlarında Sınıf I İntegron Analizleri Sınıf 1 integronlara özgü primerler kullanılarak yürütülen PZR sonucunda; Salmonella suşlarında 3300 bç, 1300 bç, 600bç büyüklüğünde bantlar belirlendi (Şekil 4.2). Bu çalışmada S. Typhimurium LT2 suşu çoklu ilaç dirençlilik için negatif kontrol olarak kullanıldı. S. Typhimurium SL1344 suşunda (pozitif kontrol) belirlenen 1300 bç lik bölgede S. Typhimurium a ait aada2 (spektinomisin/streptomisin) direnç genini içeren sınıf I integron ile eşleşen bir bölgenin bulunduğu dizi analizi sonucunda saptanmıştır (Ek 1). S. Typhimurium DMC4 ve DMC95 kodlu suşlarda direnç gen kaseti içermeyen 3 -korunmuş bölgede çoklu ilaç efluks sistem/transport proteinle eşleşen; sınıf I integron yapısında bulunan korunmuş bölge ile uyumlu sonuçlar elde edilmiştir (Ek-1). Guerra vd. (2004) tarafından yürütülen araştırmada, S. Typhimurium LT2 standart suşunda sınıf I integrona rastlanmamıştır. Bu çalışmada da LT2 suşunda görülen 3300 bç, 1300 bç, 600 bç uzunluktaki bantların sınıf I integronlar ile bağlantılı olmadığı dizi analizi sonuçları ile desteklenmiştir (Ek 1). İntegronlar, başka kaynaklardan gen kasetlerini yapılarına alabilen ve heterolog konakçılarda ifadelerini sağlayabilen genetik elementler olarak tanımlanmaktadır (Duijkeren vd. 2002, Gay vd. 2006). Bu elementler genetik transfer yeteneği içermemekle birlikte, konjugatif plazmidler ya da transpozonlara entegre olmaları halinde, tür içi ya da türler arası yatay gen transferini gerçekleştirebilmektedir (Guerra vd. 2004, Asai vd. 2007, Nógrády vd. 2008, Martinez vd. 2009). Bu yolla gerçekleşen gen transferi ilaç dirençlilik gen kasetlerinin populasyon içi ya da populasyonlar arası gen frekanslarını belirleyen ana unsurlardan biridir. Özellikle Salmonella antibiyotik dirençlilik adalarının evriminde Sınıf I integronların kritik bir role sahip olduğu belirlenmiştir (Clewell vd. 1985, Gebreyes ve Altier 2002, Nógrády vd. 2007, Nógrády vd. 2008, Peron vd. 2008). Türkiye kökenli suşlarda tanımlanan Sınıf I integronların dirençlilik gen kasetine sahip olmayışı, bu suşlarda çoklu ilaç dirençlilik fenotipinin bulunmayışını açıklamaktadır. Ancak sınıf I integronların ilaç dirençlilik gen kasetlerini yakalama yeteneği, ilaç seçici 37

48 baskısını yaratan kontrolsüz antibiyotik kullanımına bağlı olarak bu özelliği kazanabileceğine işaret etmektedir Şekil 4.2 Sınıf I integronların bant profilleri Kuyu Sırası Suş PZR ürünü (bç) 1 Marker DMC DMC LT2 (Negatif Kontrol) SL1344 (Pozitif Kontrol) C Negatif Kontrol (Su) - 38

49 4.3 flja-fljb İntergenik Bölgelerin Analizi flja-fljb intergenik bölgesi için tasarlanan primerler kullanılarak; S. Typhimurium olduğu bilinen 4 suş için 1000 bç büyüklüğünde IS200 elementinin varlığı belirlenmiştir, Salmonella spp. olarak bilinen bir suşta 250 bç büyüklüğündeki bant profilinde IS200 elementi bulunmamaktadır. Yapılan dizi analizi sonucunda bu veriler doğrulanmıştır (Şekil 4.3, Ek-1). IS200, bilinen en küçük bakteriyel insersiyon dizisidir. Bu seriler, uç ters tekrar dizilerinden yoksundur. Yüksek düzeyde stabilite içeren IS200 serilerinin transpozisyon kapasiteleri düşük, ancak mutanejenik aktiviteleri yüksektir. Bu karakteristikleri sayesinde IS200 serileri bakteriyel epidemiyolojik çalışmalarda belirteç olarak kullanılmaktadır (Casadesus ve Roth 1989, Baquar vd. 1993, 1994b). IS200 elementinin hedef spesifitesi ve ortak dizi özellikleri çoklu ilaç dirençlilik çalışmalarının odağı haline gelmiştir. İlk çalışmalarda temel tanımlama kriteri olarak IS200 insersiyon lokusunun klonlanması ve dizi analizi verileri kullanılmıştır. Günümüzde ise bu lokusun fljb ve flja flagellar genleri arasında geniş bir kodlanmayan DNA bölgesinde yer aldığı belirlenmiştir (Casadesus ve Roth 1989). Söz konusu bölgelerin Salmonella serovaryetelerine özgü bir ortaklık göstermesi suşlar arasında evrimsel ilişkinin tanımlanmasında kullanılmaktadır (Threlfall vd. 1993, Stanley vd. 1994). Salmonella da IS200 elementi; gastroenteritle bağlantılı klinik izolatların epidemiyolojik analizleri için etkin bir moleküler marker olduğuna işaret etmektedir. Bazı çalışmalar (Stanley vd. 1994, 1995, Baquar vd. 1994a, Ezquerra vd. 1993) IS200 bantlarının çeşitliliğinin ve frekansının Salmonella nın kısa süreçte evrimini açıklamada bir belirteç olabileceğini göstermiştir. Türkiye kökenli S. Typhimurium suşları ile yürütülen flja-fljb intergenik bölge analizleri sonucunda, izolatlarımızın S. Typhimurium spesifik IS200 bölgesini içerdikleri kanıtlanmıştır (Ek 1). Serovaryete düzeyinde tanımlanmamış bir suşta ise söz konusu intergenik bölgenin belirlenmemiş oluşu, bu izolatın S. Typhimurium olmadığına işaret etmektedir. 39

50 Türkiye kökenli S.Typhimurium suşlarında tipik IS200 serilerinin varlığı çoklu ilaç dirençlilik gelişimi için elzem olan bir diğer genetik alt yapınında bulunduğuna işaret etmektedir. Bu özellikler bakımından bir yüzey tarama ve izleme programı geliştirilmesi halinde, ilaç dirençlilik gelişiminin aşama aşama tanımlanması ve halk sağlığı açısından önemli bir risk teşkil eden salmonellozun büyük ölçüde engellenmesi mümkün olacaktır bç 250 bç Şekil 4.3 Salmonella suşlarında flja-fljb intergenik bölgelerin analizi Kuyu Sırası Suş PZR ürünü (bç) 1 Marker DMC DMC LT SL C

51 4.4 t-rna Bölgelerinin Araştırılması Çalışmada thrw t-rna bölgesi ve bağlanma bölgelerine spesifik primerler kullanılarak, Salmonella suşlarında thrw lokusu için 1766 bç, alt sentez ve üst sentez bağlanma bölgeleri için 118 ve 150 bç lik bölgeler saptanmıştır (Şekil ). Salmonella spp. 92-1C suşunda diğer suşlardan farklı bant büyüklüğünde bir gen bölgesini çoğalttığı ve alt sentez bölgesinde herhangi bir bant görülmediği saptanmıştır. Bant büyüklüğündeki farklılık dizi analizi ile de desteklenmiştir (Ek 1). Son yıllarda yapılan çalışmalar sonucunda, Salmonella virülensliğinin küçük ölçüde yatay gen transferi sonucu kazanılan genler ile ilişkili olduğu saptanmıştır (Baumler 1997, Schmidt ve Hensel 2004). Enterobakteriyel genoma entegre olan bu genler genellikle kümeleşmek suretiyle patojenite adası olarak isimlendirilen yapıları oluşturmaktadır. İlk olarak Hacker vd. (1997) tarafından üropatojenik E. coli de tanımlanan patojenite adaları; toplam genomdaki G+C oranından farklı bir orana sahip olmaları, trna lokuslarının yanında ya da içerisinde yer almaları, integrazlar, insersiyon elementleri, tekrarlanan seriler ve bakteriyofajlarla ilişkili olmalarının yanı sıra, virülens genlerine sahip olmaları ile de karakterize edilmektedir (Hacker ve Kaper 2000). Bu güne dek, Salmonella spp. için serovaryetelere özgü 21 kısmi patojenite adası tanımlanmıştır (Gerlach ve Hensel 2007, Blondel vd. 2009). SPI1 ve SPI2 gibi bazı patojenite adaları oldukça detaylı olarak çalışılmıştır. Bilinen fonksiyonları; invazyon ve enteropatogenezin devamlılığının sağlanmasının yanı sıra, hücre içerisinde canlı kalabilme ve Tip III salgı sistemi ve efektörleri tarafından sağlanan proliferasyondur. Bu bilgilere ilave olarak, genoma entegre olan bazı büyük fragmentler virülenslikten ziyade metabolik faaliyetlere katılmaktadır ki bu fragmentler genomik adalar ya da fitness adaları olarak isimlendirilmektedir (Dobrindt vd. 2004). Zira, Salmonella da yürütülen genomik analizler yatay gen transferi yolu ile kazanılan genlerin genellikle trna gen bölgeleri ile ilişkili olduğunu göstermiştir. Son yıllarda S. Typhimurium da bu bölgenin thrw trna lokusu içinde kb büyüklüğünde bir alanı teşkil ettiği ve serovaryete spesifik olduğu belirlenmiştir (Trupschuch 2010). Bu bulgular Türkiye kökenli suşların yatay gen transferi yolu ile virülens özelliklerin kazanımında uygun bir genetik yapıya sahip olduğunun kanıtıdır. Çalışmamızda thrw lokusu incelenmiş ve S. 41

52 Typhimurium LT2 suşuyla karşılaştırılmıştır. Yapılan dizi analizi sonucunda DMC4 ve DMC95 kodlu suşlarda S. enterica 4,[5],12:i- suşunda bulunan thrw geni ile bağlantılı 18 kb genomik ada ile eşleşen bölgeler tespit edilmiştir. S.Typhimurium LT2 ve 92-1C izolatunda ise böyle bir bölge ile eşleşme tanımlanmamıştır. Bu durum, Türkiye kökenli S. Typhimurium DMC4 ve DMC95 suşlarının evrimsel pozisyon olarak virülens Typhimurium a (S. enterica 4,[5],12:i ) yakın olduğunu; düşük virülens özellik gösteren S. Typhimurium LT2 dan ise daha uzak pozisyonda yer aldığını göstermektedir Şekil 4.4 Salmonella da thrw t-rna lokusu için bant profilleri Kuyu Sırası Suş PZR ürünü (bç) 1 Marker DMC DMC LT SL C Negatif Kontrol (Su) - 42

53 Şekil 4.5 Salmonella da thrw lokusunun üst akış bölgesinin bant profili Kuyu Sırası Suş PZR ürünü (bç) 1 Marker DMC DMC LT SL C Negatif Kontrol (Su) - 43