KAN GRUPLARININ SAPTANMASI. Dr. Güçhan ALANOĞLU Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı Kan Bankası Isparta

Transkript

1 KAN GRUPLARININ SAPTANMASI Dr. Güçhan ALANOĞLU Süleyman Demirel Üniversitesi Tıp Fakültesi Hematoloji Bilim Dalı Kan Bankası Isparta

2 YÖNTEMLER 1. HEMAGLÜTİNASYON a. Lam (Slide) Yöntemi b. Tüp Yöntemi c. Jel Santrifügasyon Yöntemi d. Mikroplak Yöntemi 2. RIA 3. EIA 4. PCR Tıbbı Kursu 2

3 Hemaglütinasyon Elektrolitli ortamda eritrosit yüzeyindeki antijenlerin ortamda bulunan kendilerine özgü antikorlarla birleşmeleri sonucunda eritrositlerin birbirine yapışarak gözle görülebilecek büyüklükte kümeler oluşturup çökmesine hemaglütinasyon denir Tıbbı Kursu 3

4 Hemaglütinasyonun Oluşumu Antikorların eritrositlere tutunması Antikorlarla kaplı eritrositlerin birbirine tutunması Sedimentasyon (Santrifügasyonla hızlandırılabilir) Tıbbı Kursu 4

5 Hemaglütinasyon Sonuçlarına Etki Eden Faktörler 1. Fiziksel Koşullar 2. Eritrositler 3. Zeta Potansiyel 4. Serum Tıbbı Kursu 5

6 Fiziksel Koşullar 1. İnkübasyon ısısı: IgM tipi antikorlar C (soğuk) IgG tipi antikorlar C (sıcak) 2. İnkübasyon süresi 3. Santrifüj 4. Ortam ph, LISS solüsyonu, enzimler, makromoleküller Tıbbı Kursu 6

7 Eritrositler 1. Eritrositlerin yüzey antijenlerinin tipi 2. Antijenin Sayısı 3. Lokalizasyonu ve immünojenitesi 4. Homozigot veya Heterozigot olmaları 5. (Homozigot : EE, cc vs Heterozigot : Ee, Cc vs.) 6. Homozigot eritrositlerde antijen bağlanma bölgeleri daha fazla ve oluşan agglütinasyon daha kuvvetlidir Tıbbı Kursu 7

8 Zeta Potansiyel 1. Serum fizyolojik içerisinde süspansiyon yapılan eritrositler birbirlerine ortalama 25 nm uzaklıkta dururlar 2. Süspansiyon yapıldıklarında katyonlar (+yüklü sodyum iyonu) eritrosit yüzeyini kaplar. Zeta potansiyel eritrosit yüzeyindeki negatif yük ile onu kuşatan katyonların oluşturduğu potansiyel farkını gösterir Zeta potansiyelin optimal düzeyi n n IgM için mv IgG için ise mv Tıbbı Kursu 8

9 Kompleman Sistemi den fazla proteinden oluşur; hümoral bağışıklık ve iltihabın oluşmasında rol oynar 2. Bakteri ve Hücre lizisi 3. Fagositozda görevli (opsonizasyon) 4. Kemotaktik etki gösterir 5. İmmün kompleksin kandan temizlenmesine yardımcı 6. İki şekilde aktive olur Tıbbı Kursu 9

10 Hemaglütinasyonu Kolaylaştıran Faktörler Eritrositler arası uzaklığı kısaltma 1. Proteolitik enzimler (Papain, bromelin, ficin vs) 2. Albumin 3. Polikatyonlar (Polybrene, protamine) 4. LISS (Low Ionic Strength Solution) 5. Santrifuj Tıbbı Kursu 10

11 Hemaglütinasyonu Kolaylaştıran Faktörler İki eritrosit arasında köprü oluşturma Coombs serumu Tıbbı Kursu 11

12 Aglutinasyon yok Aglutinasyon Tıbbı Kursu 12

13 Eritrosit Tıbbı Kursu 13

14 DEĞERLENDİRME-I Aglütinasyon Değerlendirme ++++ Bir tek aglütinat, serbest hücre yok +++ Birkaç büyük aglütinat, serbest hücre yok ++ Çok sayıda büyük ve küçük küme, serbest hücre yok + Çok sayıda küçük küme, zeminde serbest hücre var Mikroaglütinasyon makroskobik olarak negatif, bazı alanlarda mikroskobik 6-8 hücreli küme Tıbbı Kursu 14

15 DEĞERLENDİRME-II Aglütinasyon Şüpheli Rulo Oluşumu Negatif Mixed field Değerlendirme Makroskobik olarak negatif, çok nadir mikroskobik 6-8 hücreli küme Mikroskobik olarak kümeler para dizisi şeklinde Makroskobik ve mikroskobik küme yok Çok sayıda büyük ve küçük küme, zeminde serbest eritrosit var Tıbbı Kursu 15

16 Eritrosit Süspansiyonu Hazırlama: Yıkama yapılmaması durumunda 1. Fibrinojen ve serumdaki artık trombin 2. Rulo formasyonu oluşma olasılığı 3. Antikomplementer antikoagulanlar 4. Laktoz, neomisin gibi koruyucu maddeler 5. ABO, Lewis, Chido/Rodgers, Ii antijenlerinin plazmada bulunuşu 6. Plazma, albumin otoaglütininleri içerebilir Tıbbı Kursu 16

17 Saklama Koşulları ve Antijenler 1. M ve P1 antijenleri dışında aktivite kaybı minimaldir 2. Pıhtılaşmış olarak saklanan kan örneklerinde antikoagulanlı kanlara göre antijenik aktivite kaybı daha hızlıdır 3. Eritrositler Sitrat Fosfat Gliserol solüsyonunda 20 0 C de bir yıl saklanabilir, sadece P1 antijeni zayıf reaktif bulunur Tıbbı Kursu 17

18 Serum veya Plazma Kullanımı Kan gruplama testlerinde serum tercih edilmelidir Plazma Kullanmanın Sakıncaları : * 37 0 C de inkübe edildiğinde pıhtılaşabilir * Sitrat ve EDTA gibi antikoagulanlar kompleman aktivasyonunu engeller. Tıbbı Kursu 18

19 Antiserumların Saklanması +4 0 C de 1-2 yıl, C de yıllarca saklanabilirler Koruyucu olarak sodyum azid, antibiyotikler kullanılabilir Anti-A ve Anti-B ye genellikle belirleyici olarak boya eklenir Tıbbı Kursu 19

20 ABO (ABH) Sistemi *Transfüzyon ve doku transplantasyonunun en önemli antijen sistemidir. *Reverse gruplamanın yapılabildiği tek kan grup sistemidir Tıbbı Kursu 20

21 Eritrosit hücre tipi Antikor Antijen Tıbbı Kursu 21

22 Eritrositler Serum Tıbbı Kursu 22

23 Lam Yöntemi A pos Tıbbı Kursu 23

24 Tıbbı Kursu 24

25 Lam (Slide) Yöntemi-I ABO Forward Gruplama-I Temiz ve etiketli (anti-a yazılmış) bir lama bir damla anti-a damlatılır İkinci temiz ve etiketli (anti-b yazılmış) bir lama bir damla anti-b damlatılır Bu antiserumlara paralel test yapılacaksa üçüncü bir temiz ve etiketli (anti-a,b yazılmış) bir lama bir damla anti-a,b damlatılır Tıbbı Kursu 25

26 Lam (Slide) Yöntemi-II ABO Forward Gruplama-II Tercihen dördüncü bir temiz ve etiketli (kontrol yazılmış) lam da ayrıca hazırlanır. Bu lama bir damla hasta serumu veya plazması damlatılır Lamlara test edilecek eritrositlerin iyice karıştırılmış birer damla süspansiyonu damlatılır Kullanılacak doğru konsantrasyonu belirlemek için üretici önerilerine bakılır Tıbbı Kursu 26

27 Lam (Slide) Yöntemi-III ABO Forward Gruplama-III Antiserum ve eritrositler her bir lam için ayrı, temiz bir aplikatör çubuk ile karıştırılır ve çubuk atılır Lamlar sürekli olarak hafifçe öne-arkaya hareketle 2 dakika kadar sallanır Tüm lamlardaki sonuçlar okunur, yorumlanır ve kaydedilir Tıbbı Kursu 27

28 Lam (Slide) Yöntemi-IV Yorum-I 1 Herhangi bir ABO gruplama ajanıyla (antiserumuyla) güçlü eritrosit aglütinasyonu sonucun pozitif olduğu anlamına gelir 2 İki dakika sonunda pürüzsüz eritrosit süspansiyonu negatif sonuçtur 3 Zayıf ya da şüpheli reaksiyon veren örnekler tüp testi ile tekrar edilmelidir Tıbbı Kursu 28

29 Lam (Slide) Yöntemi-V Yorum-II 4 Kontrol lamında aglütinasyon görülmesi nonspesifik bir aglütinasyon olarak değerlendirilir ve otoantikorların varlığını gösterir 5 Değerlendirme tabloya göre yapılır Tıbbı Kursu 29

30 Forward Gruplamada Değerlendirme Kan Grubu Anti-A Anti-B Anti A,B A B AB O Tıbbı Kursu 30

31 İsim soyad Çalışan personel Tarih Tarih A pozitif İmza Tıbbı Kursu 31

32 Lam (Slide) Yöntemi-VI Teknik uyarılar-i 1 Bu yöntem, seramik veya porselen fayans üzerinde asla denenmemelidir 2 Zayıf veya negatif reaksiyon veren tüm antiserumeritrosit karışımları mikroskobik olarak da kontrol edilmelidir. Tıbbı Kursu 32

33 Lam (Slide) Yöntemi-VII Teknik uyarılar-ii 3 Negatif sonuçlar tüp testi ya da mümkünse başka bir yöntemle ( jel santrifügasyon, mikroplak vs ) doğrulanmalıdır 4 Temiz lamların üzerine önce antiserumlar damlatılmalıdır 5 Karıştırıcı çubuklar için cam bagetler tavsiye edilmez Tıbbı Kursu 33

34 Lam (Slide) Yöntemi-VIII Teknik uyarılar-iii 6 Lamların üzerinde oluşabilecek hafif kuruma zayıf pozitif aglütinasyon olarak değerlendirilmemelidir 7 Sonuçların değerlendirilmesi ikinci bir laboratuar uygulayıcısı tarafından da yapılmalıdır 8 Her şeye rağmen ABO grupları tayininde lam testleriyle her zaman doğru sonuçlar alınamaz Tıbbı Kursu 34

35 Tüp Yöntemi 1 Hasta serumu 2 Tarama RBC 3 Lıss 4 İnkübasyon 5 Santrifüj 6 Yıkama 7 AHG eklenir 8 Santrifüj 9 Coombs kontrol hücresi ekle 10 Santrifüj 11 Değerlendirme Tıbbı Kursu 35

36 TÜP YÖNTEMİ-I ABO FORWARD GRUPLAMA-I 1 Temiz ve etiketli (anti-a yazılmış) bir test tüpüne bir damla anti-a damlatılır. 2 İkinci bir temiz ve etiketli (anti-b yazılmış) tüpe bir damla anti-b damlatılır. 3 Bu antiserumlara paralel test yapılacaksa üçüncü temiz ve etiketli (anti-a,b yazılmış) bir tüpe bir damla anti-a,b damlatılır. Tıbbı Kursu 36

37 TÜP YÖNTEMİ-II ABO FORWARD GRUPLAMA-II 4 Dördüncü temiz ve etiketli (kontrol yazılmış) bir tüpe bir damla hasta yada donör serumu veya plazması damlatılır. 5 Her bir tüpe bir damla test edilecek eritrositlerin en az 3 kez yıkanmış %2-5 lik süspansiyonundan damlatılır. Tıbbı Kursu 37

38 TÜP YÖNTEMİ-III ABO FORWARD GRUPLAMA-III 6 Tüp içerikleri yavaşça karıştırılır ve yaklaşık x g de sn. süreyle santrifüj edilir. Alternatif olarak tüpler santrifüj edilmeden 1 saat oda ısısında bırakılır. Tıbbı Kursu 38

39 TÜP YÖNTEMİ-IV ABO FORWARD GRUPLAMA-IV 7 Tüplerin dibindeki eritrosit birikintileri tekrar yavaşça süspanse edilir ve makroskobik olarak aglütinasyon açısından incelenir. 8 Test sonuçları okunur, yorumlanır ve kaydedilir. Eritrosit test sonuçları ABO reverse gruplama prensibi ile karşılaştırarak doğrulanır. Tıbbı Kursu 39

40 TÜP YÖNTEMİ-V YORUM-I 1 Test tüplerinin herhangi birindeki aglütinasyon sonucun pozitif olduğu anlamına gelir. 2 Bir eritrosit birikintisinin yeniden süspanse edilmesinden sonra süspansiyonun pürüzsüz olması negatif test sonucudur. Tıbbı Kursu 40

41 YORUM-II TÜP YÖNTEMİ-VI 3 Kontrol tüpünde aglütinasyon görülmesi nonspesifik bir aglütinasyon olarak değerlendirilir ve otoantikorların varlığını gösterir 4 Değerlendirme tabloya göre yapılır Tıbbı Kursu 41

42 TÜP YÖNTEMİ-VII Teknik Uyarılar-I 1 Zayıf veya negatif reaksiyon veren tüm antiserum-eritrosit karışımları mikroskobik olarak kontrol edilmelidir 2 Anti-A ve Anti-AB de aglütinasyon şiddeti zayıf (+, ++) ise A subgrupları araştırılmalıdır Tıbbı Kursu 42

43 TÜP YÖNTEMİ-VIII Teknik Uyarılar-II 3 Temiz tüplerin üzerine ilk önce antiserumlar damlatılmalıdır. 4 Sonuçların değerlendirilmesi ikinci bir laboratuar uygulayıcısı tarafından da yapılmalıdır Tıbbı Kursu 43

44 TÜP YÖNTEMİ-IX REVERSE GRUPLAMA-I 1.Test tüplerinin üzerine sırası ile A 1, A2, B, O yazılarak etiketlenir. 2. Her tüpe 2-3 damla hasta serumu damlatılır 3. A1 etiketli tüpe bir damla A1 eritrosit süspansiyonu, A2 etiketli tüpe bir damla A2 eritrosit süspansiyonu, B etiketli tüpe bir damla B eritrosit süspansiyonu, O etiketli tüpe bir damla O eritrosit süspansiyonu damlatılır. Tıbbı Kursu 44

45 TÜP YÖNTEMİ-X REVERSE GRUPLAMA-II 4. Tüp içerikleri yavaşça karıştırılır ve yaklaşık x g de sn. süreyle santrifüj edilir. 5 Tüpler hemoliz bulgusu açısından incelenir. Eritrosit birikintileri tekrar yavaşça süspanse edilir ve aglütinasyon açısından incelenir Tıbbı Kursu 45

46 TÜP YÖNTEMİ-XI REVERSE GRUPLAMA-III 6. Test sonuçları okunur, yorumlanır ve kaydedilir. Serum test sonuçları ABO forward gruplama ile saptananlarla karşılaştırarak doğrulanır 7. Zayıf serum reaksiyonlarını güçlendirmek için tüpler 5-15 dk. boyunca oda ısısında inkübe edilir Tıbbı Kursu 46

47 TÜP YÖNTEMİ-XII YORUM 1 Aglütinasyon sonucun pozitif olduğu anlamına gelir 2 Pozitif testlerde beklenen reaksiyonlar +3 ile +4 tür. Zayıf reaksiyon veren örnekler adsorbsiyon ve elüsyon ile doğrulanır. 3 Yeniden süspanse edilen süspansiyonun pürüzsüz olması negatif test sonucudur. 4 Değerlendirme tabloya göre yapılır. Tıbbı Kursu 47

48 Reverse Gruplamada Değerlendirme Kan Grubu Serumdaki Antikorlar Bilinen Eritrosit Süspansiyonları A B O A Anti-B B Anti-A AB O Anti-A, Anti-B Oh (Bombay) Anti-A, Anti-B, Anti-H Tıbbı Kursu 48

49 TÜP YÖNTEMİ-XIII TEKNİK UYARILAR-I 1 Santrifüj yapılmadan değerlendirildiğinde zayıf aglütinasyon oluşur. Bu yüzden reverse gruplama sadece tüp, jel santrifügasyon, mikroplak serolojik yöntemleri ile yapılabilir. Lam yöntemi ile yapılamaz 2 Zayıf (+, ++) veya negatif reaksiyon veren tüm tüp karışımları mikroskobik olarak kontrol edilmelidir Tıbbı Kursu 49

50 TÜP YÖNTEMİ-XIV TEKNİK UYARILAR-II 3 Eğer anti-a ve anti-b antikorları serumda çok az miktarlarda ise reverse gruplama ile ortaya koymak güç ya da olanaksız olabilir. 4 Hastanın kanında A ve B grup antijenleri dışında başka antijenlerle reaksiyon veren atipik antikorlar varsa grup saptanması güçlük gösterebilir. Tıbbı Kursu 50

51 Tüp Yöntemi 1. Güvenilir bir yöntem 2. Fiziksel koşullar ve eleman ihtiyacı 3. Zaman 4. Enfeksiyon riski 5. Ucuz GA 2007 Tıbbı Kursu 51

52 FENOTİP FORWARD GRUPLAMA REVERSE GRUPLAMA (ABO/Rh) (cell A1, A2, B, O) Anti-A Anti-B Anti-AB Anti-H Anti-A1 A1 A2 B O A1* /± A ınt ** /+2 +3/ A2*** / A3 +2 mf ? A m -/+ - -/ A x -/+2 - +/ / A e B B mf +2 mf B m - - -/ B x - -/+ -/ AB A2B ? O Oh(Bom.) * Anti-A1 pozitifliği daima anti-h pozitifliğinden daha kuvvetlidir. ** Anti-A1 ve anti-h da reaksiyon şiddeti aynıdır. *** Anti-H pozitifliği daima anti-a1 pozitifliğinden daha kuvvetlidir. Tıbbı Kursu 52

53 Jel Yöntemi 1986 Molekül çapına göre tutulma prensibi 1 Uygun kartlara numune eklenir 2 İnkübasyon 3 Santrifüj 4 Değerlendirme Çift populasyon gösterilebilir Jel sadece aglütine olmayan eritrositlerin geçişine izin verir Tıbbı Kursu 53

54 O Pos A Neg Ce poz, ce, Kell neg Tıbbı Kursu 54

55 Jel Teknolojisinin Avantajları Laboratuar tekniklerinin standardizasyonu Kolay ve çabuk prosedürler Kolay ve çabuk yorumlama Yıkama işlemine gerek duyulmaması Sonuçların ertesi gün bile kontrol edilebilirliği Tıbbı Kursu 55

56 Tıbbı Kursu 56

57 Mikroplak Yöntemi 1. Duyarlılığı yüksek 2. Ekonomik 3. Büyük kan merkezleri için uygun Tıbbı Kursu 57

58 Forward Gruplamada Uyumsuzluk 1. Yakın dönemde transfüzyon veya kemik iliği transplantasyonu yapılanlarda iki farklı eritrosit popülasyonuna bağlı chimera 2. Varyant A ve B genleri taşıyan kişilerde zayıf antijenlerin varlığı. Lösemi gibi bazı hastalıklarda eritrosit yüzey antijenlerinde zayıflama Tıbbı Kursu 58

59 Forward Gruplamada Uyumsuzluk 3. Kalıtsal yada kazanılmış poliaglütinasyonda membran bozukluğuna bağlı gelişen modifiye eritrositlerin anti-a, anti-b veya her ikisi ile birlikte aglütine olması 4. Anormal konsantrasyondaki serum proteinleri veya makromoleküller nedeni ile oluşan nonspesifik agregasyonun aglütinasyonu taklit etmesi Tıbbı Kursu 59

60 Forward Gruplamada Uyumsuzluk 5. Serumlarında yüksek konsantrasyonda A ve B antijenleri bulunan kişilerde bu antijenlerin antiserumdaki (reagent) antikorları nötralize etmesi 6. Antiserumlardaki boyalara karşı gelişmiş antikorların neden olduğu hatalı pozitiflikler Tıbbı Kursu 60

61 Reverse Gruplamada Uyumsuzluk 1. Tam pıhtılaşmamış serum veya plazmada bulunan küçük fibrin parçacıklarının aglütinasyon sanılması 2. Anormal konsantrasyondaki proteinlerin veya intravenöz kontrast maddelerin neden olduğu nonspesifik agregasyon Tıbbı Kursu 61

62 Reverse Gruplamada Uyumsuzluk 3. Diğer eritrosit antijenlerine karşı gelişmiş antikorların test hücreleri bu antijeni taşıyorsa pozitif sonuç vermesi 4. Yenidoğan döneminde ilk 4-6 ay, yaşlılar ve immün sistemi baskılanmış kişilerde düşük immünglobulin düzeyinin hatalı negatif sonuçlara neden olması Tıbbı Kursu 62

63 Rh Antijenleri Rh Antijenleri Sıklık (%) D 85 C 70 E 30 c 80 e 97 f (ce) 64 Ce 69 Cw 2 Tıbbı Kursu 63

64 D Antijeni 1. A ve B antijenlerinden sonra en yüksek antijeniteye sahiptir 2. En kompleks eritrosit antijenlerindendir 3. Rh sisteminde en güçlü antijen olduğundan Rh tiplendirmesinde rutinde sadece anti-d çalışılır Tıbbı Kursu 64

65 Diğer Rh Antijenleri 1. Bilinmeyen Rh antikorlarının tanımlanması 2. Rh antikorları taşıdığı bilinen alıcılara transfüzyon yapılması 3. Babalık tayini ve diğer aile çalışmaları 4. Çeşitli test panelleri için eritrosit hazırlanması sırasında kullanılır Tıbbı Kursu 65

66 Anti-D Antiserumları 1. Yüksek Proteinli Antiserumlar 2. Düşük Proteinli Antiserumlar Tıbbı Kursu 66

67 Yüksek Proteinli Antiserumlar 1. Yüksek yoğunlukta protein ve makromolekül içerirler 2. Lam, tüp, mikroplak tekniklerinde kullanılırlar 3. Kontrol reagenti her üretici firma için farklıdır 4. Eritrosit süspansiyonları SF, serum veya plazma ile hazırlanabilir 5. Rutinde en sık kullanılan antiserumlardır Tıbbı Kursu 67

68 Düşük Proteinli Antiserumlar Üç farklı türü vardır : a. Geleneksel SF reaktif tüp testi antiserumu: IgM b. Monoklonal IgM antiserumları: IgM ve poliklonal IgG c. Kimyasal olarak modifiye edilmiş poliklonal IgG: Tüm rutin çalışmalarda veya kontrol testi pozitif örneklerde kullanılır Tıbbı Kursu 68

69 Rh Tayininde Lam Yöntemi-I 1 Temiz, işaretlenmiş bir lamın üzerine bir damla anti-d damlatılır 2 İkinci bir lama uygun kontrol solüsyonundan bir damla damlatılır 3 Her bir lama iyi karıştırılmış %40-50 lik test edilecek eritrosit süspansiyonundan birer damla damlatılır Tıbbı Kursu 69

70 Rh Tayininde Lam Yöntemi-II 4 Temiz bir aplikatör çubuk kullanarak iyice karıştırılır ve reaksiyon karışımı her lamda yaklaşık 20x40 mm lik bir alana yayılır 5 Lamlar görüntü kutusuna konur, yavaşça sallanır ve aglitünasyon açısından sürekli olarak gözlenir Tıbbı Kursu 70

71 Rh Tayininde Lam Yöntemi-III 6 Test 2 dakika içinde okunmalıdır 7 Eğer Rh görüntüleme kutusu temin edilememiş ise ısıtılmış (el sırtını yakmayacak ısıya kadar) lamlar kullanılabilir 8 Her iki lamdaki reaksiyon sonuçları okunur ve yorumlanır Tıbbı Kursu 71

72 Rh Tayininde Lam Yöntemi-IV Yorum 1. Anti-D ile aglitünasyon ve kontrol lamında pürüzsüz süspansiyon pozitiftir ve test edilen eritrositlerin D+ olduğunu gösterir 2. Anti-D ve Rh kontrolünde aglütinasyon olmaması eritrositlerin D - olduğunu düşündürür. Eğer eritrositler lam testlerinde D olarak bulunuyor ise antiglobülin test prosedürüyle zayıf bir D (D u ) antijeni taşıdığı gösterilebilir Tıbbı Kursu 72

73 Rh Tayininde Tüp Yöntemi-I 1 Temiz, işaretlenmiş bir test tüpünün içine bir damla anti-d serumu damlatılır 2 İşaretlenmiş (kontrol yazılmış) ikinci bir tüpün içine uygun kontrol ajanından bir damla damlatılır 3 Her tüpe test edilecek %2-5 lik eritrosit süspansiyonundan (SF, serum veya plazma içindeki) birer damla damlatılır Tıbbı Kursu 73

74 Rh Tayininde Tüp Yöntemi-II 4 Nazikçe karıştırılır ve üreticinin önerdiği hız ve zamanda santrifüj edilir 5 Eritrosit birikintisi nazikçe kaldırılır ve aglütinasyon açısından kontrol edilir (Eritrositleri transfer etmek için çubuk kullanılmışsa, eritrosit birikintisi kaldırılmadan önce her tüpe 1 damla SF ilave etmek, resüspansiyona yardımcı olacak daha fazla sıvı sağlayacaktır) Tıbbı Kursu 74

75 Rh Tayininde Tüp Yöntemi-III 6 Reaksiyonlar derecelendirilir ve test ile kontrol sonuçları kaydedilir Tıbbı Kursu 75

76 Rh Tayininde Tüp Yöntemi-IV YORUM 1 Anti-D tüpündeki aglütinasyon > 2+ ve kontrol tüpü nonreaktif ise geçerli bir test oluşturur ve test edilen eritrositlerin D+ olduğunu gösterir 2 Kontrol tüpünde aglütinasyon varsa veya anti-d tüpündeki aglütinasyon < 2+ ise, daha ileri testler olmaksızın Rh tipi pozitif olarak değerlendirilmemelidir Tıbbı Kursu 76

77 Rh Tayininde Tüp Yöntemi-V YORUM Hem anti-d hem de kontrol tüplerindeki düz bir eritrosit süspansiyonu negatif test sonucudur. Hastaların grubu D negatif olarak gözükse de, donör kanı olduğunda mutlaka D antijenin zayıf formları için zayıf D (D u ) testine tabi tutulmalıdır Tıbbı Kursu 77

78 n n n n n n n Zayıf D (Du) Normalden daha az D antijeni mevcuttur ancak yapısı normaldir. Antikor geliştirmesi beklenmez Varyant=Parsiyel D=Kısmi D Epitoplarda eksiklik mevcuttur. Protein yapı normal değildir. Eksik olan epitopa karşı antikor geliştirebilir. Tıbbı Kursu 78

79 Zayıf D Testi (D u Testi)-I 1. Her Anti-D antiserumu zayıf D testi için uygun değildir Yüksek proteinli poliklonal antiserumlar Kimyasal olarak modifiye edilmiş düşük proteinli poliklonal antiserumlar Harmanlanmış IgM/IgG monoklonal/poliklonal düşük proteinli antiserumlar kullanılabilir 2. D u testi mutlaka tüp testi ile çalışılmalıdır. Çünkü lam yöntemi ile D u testi yapılamaz Tıbbı Kursu 79

80 Zayıf D Testi (D u Testi)-II 1 Temiz, işaretlenmiş bir test tüpüne bir damla anti-d serumu damlatılır 2 İşaretlenmiş (kontrol yazılmış) ikinci bir tüpe uygun kontrol ajanından bir damla damlatılır 3 Her tüpe test edilecek %2-5 lik eritrosit süspansiyonundan (SF, serum veya plazma içindeki) birer damla damlatılır Tıbbı Kursu 80

81 Zayıf D Testi (D u Testi)-III 4 Tüpler karıştırılır, 37ºC de dk bekletilir x g de, saniye santrifüj edilir. 6 Nazikçe çalkalanarak aglütinasyon olup olmadığına bakılır. Eğer, anti-d ile test hücrelerinde güçlü bir aglütinasyon varsa ve bu durum kontrolde yoksa, test örneği D+ olarak kaydedilir. Testin antiglobulin fazına geçmeye gerek yoktur. Tıbbı Kursu 81

82 Zayıf D Testi (D u Testi)-IV 1. Test edilen eritrositlerde aglütinasyon yok veya şüpheli bir aglütinasyon varsa eritrositler çok miktarda SF ile 3-4 kez yıkanır. 2. Son yıkamadan sonra SF tamamen dökülür ve tüpün ağız kenarları kurulanır. Tıbbı Kursu 82

83 Zayıf D Testi (D u Testi)-V 1. Üreticinin direktifleri doğrultusunda 1-2 damla anti- IgG damlatılır. 2. Nazikçe karıştırılır ve x g de, saniye santrifüj edilir. 3. Her eritrosit birikintisi nazikçe kaldırılır, aglütinasyon olup olmadığına bakılır, test sonucu derecelendirilir ve kaydedilir. Tıbbı Kursu 83

84 Zayıf D Testi (D u Testi)-VI YORUM 1 Zayıf D testi prosedürüne mutlaka bir diluent kontrol testi veya direkt antiglobulin testi eşlik etmelidir. 2 Anti-D tüpünde aglütinasyon varken kontrol tüpünde olmaması testin pozitif olduğunu gösterir. Kan D + olarak sınıflandırılmalıdır. Bu tür eritrositleri D -, D u + olarak rapor etmek doğru değildir. Tıbbı Kursu 84

85 Zayıf D Testi (D u Testi)-VII 3 Anti-D testinde aglütinasyon olmamışsa sonuç negatiftir. Bu, eritrositlerde D aktivitesi yok demektir ve D ( ) neg olarak sınıflandırılır 4 Kontrol testi pozitif ise, zayıf D testi için geçerli bir yorum yapılamaz. Bu durumda, eğer test edilen eritrositler hastaya ait ise Rh (- )kan verilmelidir; eğer donöre ait ise eritrositler transfüzyon için kullanılmamalıdır Tıbbı Kursu 85

86 Sorular-I 1- Zayıf veya varyant D antijeni, Rh negatif bir kişide antikor yanıtı oluşturabilir mi? 2- Zayıf veya varyant D antijeni taşıyan fetus anneyi immünize edebilir mi? 3- Varyant D antijeni taşıyan bir alıcıya Rh pozitif kan verilirse antikor yanıtı oluşur mu? Tıbbı Kursu 86

87 Sorular-II 4- Varyant D antijeni taşıyan anneyi Rh pozitif fetus immünize edebilir mi? 5- Zayıf D antijeni taşıyan alıcıya Rh pozitif kan verilirse antikor yanıtı oluşur mu? 6- Zayıf D antijeni taşıyan anneyi, Rh pozitif fetus immünize edebilir mi? Tıbbı Kursu 87

88 Eğirdir Tıbbı Gölü KursuIsparta 88